数字测定
阅读：355发布：2021-08-09
专利汇可以提供数字测定专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了一种用于分隔 流体 样本的方法和装置。该装置包含含有微孔的板。该方法包括当板是开放构造时将样本沉积在一个或两个板上，其中该沉积是样本的单个或多个液滴的形式，其中至少五分之一个所述液滴具有占据两个以上微孔的体积，并且将板闭合至闭合构造以将样本分隔在微孔中。，下面是数字测定专利的具体信息内容。
1.一种用于执行数字测定的装置，包含：
第一板、第二板和微孔，其中：
(g)所述第一板和所述第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含分析物的流体样本的样本接触区域；
(h)所述第二板在所述样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)预定和已知的几何形状，(ii)200μm或更小的孔深度，和(iii)具有基本上小于所述流体样本的体积，其中所述构造之一是开放构造，其中：所述第一板的内表面与所述第二板中的所述微孔的边缘之间的平均间距大于所述孔的深度，并且所述样本沉积在所述一个或两个板上；
以及
其中所述构造中的另一个是闭合构造，所述闭合构造是在所述样本沉积在所述开放构造中之后的构造；在所述闭合构造中，所述样本的至少一部分在所述微孔内，并且所述第一板的内表面和所述第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于1μm或小于所述微孔深度的1/
10(十分之一)。
2.一种设备，包含热循环仪和如权利要求1所述的装置。
3.一种设备，包含热循环仪、如权利要求1所述的装置和用于实时PCR的读取器。
4.一种用于分隔流体样本的方法，包含：
获得如前述任一权利要求所述的装置或设备，
当所述板是开放构造时，将所述样本沉积在所述一个或两个板上，其中所述沉积是所述样本的单个或多个液滴的形式，其中所述液滴中的至少一个具有占据两个以上微孔的体积；以及
将所述板闭合至所述闭合构造以将所述样本分隔在所述微孔中。
5.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述分析物是蛋白质、肽、核酸、病毒、细菌、细胞、纳米颗粒、分子、合成化合物或无机化合物。
6.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含间隔件，所述间隔件经构造以调节所述第一板和所述第二板之间的间隔。
7.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含位于所述一个或两个板的内表面上的结合位点，其中所述结合位点包含固定在所述位点处的捕获剂，且所述捕获剂经构造以特异性捕获所述样本中的分析物。
8.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含表面扩增层，所述表面扩增层位于所述一个或两个板的所述内表面上，其中所述表面扩增层包含固定在所述位点处的捕获剂，且所述捕获剂被构造成特异性地捕获所述样本中的分析物，其中所述表面扩增层扩增来自所述分析物或附着于所述分析物的标记的光信号，当它们在所述表面扩增层附近时比在微米或更远外时扩增得更强。
9.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使得来自直接或间接结合到所述捕获剂的单个标记的所述光学信号可见。
10.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使得来自直接或间接结合到所述捕获剂的单个标记的所述光学信号可见。
11.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含处于所述板的闭合构造中的所述微孔中的试剂，其中当所述分析物与检测剂之间存在结合时，所述试剂将在所述孔中产生多个发光组分，而所述检测剂特异性地结合到所述分析物。
12.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中所述第一板与所述第二板之间的所述间隔经构造以使得所述目标分析物与所述捕获剂的饱和结合时间为300秒或更短。
13.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中所述第一板与所述第二板之间的所述间隔经构造以使得所述目标分析物与所述捕获剂的饱和结合时间为60秒或更短。
14.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使来自单个标记的所述光信号可见。
15.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是核酸。
16.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是蛋白质。
17.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是抗体。
18.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是适体。
19.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是适体。
20.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含存储位置，所述存储位置位于所述一个或两个板的所述内表面上，其中所述存储位置包含可溶于液体中的试剂。
21.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述试剂用于扩增所述样本中的分析物。
22.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述试剂通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述分析物。
23.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述试剂是检测剂。
24.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中针对预期目标分析物浓度构造每一孔的体积，使得在填充有所述样本的每一孔中的目标分析物的分布遵循泊松分布。
25.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中针对预期目标分析物浓度构造每一孔的体积，使得在填充有所述样本的每一孔中的目标分析物的分布平均为每2个孔、3个孔、5个孔、10个孔、20个孔、0个孔、50个孔、75个孔、100个孔、150个孔、200个孔、300个孔、
500个孔、1000个孔、2000个孔、10000个孔、100,000个孔，或在任何两个值的范围内一个目标分析物。
26.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中优选针对预期目标分析物浓度来构造每一孔的体积，使得填充有所述样本的每一孔中的目标分析物的分布平均为每10个孔、20个孔、0个孔、50个孔、75个孔、100个孔，或在任何两个值的范围内一个目标分析物。
27.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，所述第一板的内表面与所述第二板中的微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/11(十一分之一)、1/20、1/30、1/40、1/50、1/100、1/300、1/500，或在任何两个值的范围内。
28.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，所述第一板的内表面与所述第二板中的微孔的边缘显著接触。
29.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，两个相邻孔之间的平均间隔小于5nm、10nm、30nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm，或在任何两个值的范围内。
30.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述微孔具有选自圆形、矩形、六边形和/或具有正方形、六边形和/或任何其他网格的任何其他多面体的形状。
31.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的所述孔具有至少1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或所述值中的任两者之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的间隔(平均孔到孔中心距离)。
32.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的孔具有1nm、
10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm，或所述值中的任两者之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的孔尺寸(平均长度或直径)。
33.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的所述孔具有至少1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或所述值中的任两者之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的深度。
34.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述孔具有(i)无金属涂层，(ii)在所述孔的底部(所述柱的顶部)上的金属涂层，(iii)在所述孔的侧壁(所述柱的侧部)上的金属涂层和/或(iv)在所述孔的底部和侧壁两者上的金属涂层。
35.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述金属是金、铝、银、铜、锡和/或其任何组合。
36.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，孔面积比(孔的面积与所述表面的总面积的比)为40％到50％、50％到60％、60％到70％、70％到80％、80％到90％、90％到
99％。
37.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中孔边缘到孔边缘的距离大于孔深度，这确保孔边缘到孔边缘的扩散时间长于孔边缘到孔底部的扩散时间。
38.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述孔的尺寸经设计以确保在所述分析过程期间不发生交叉反应。
39.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的孔的数目远大于所述样本中的分子数目。
40.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1fM/μL，那么所述第一板上的总孔数为600的1到2倍、2到5倍、5到10倍、10到100倍、100到1000倍、
1000到10000倍。
41.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1pM/μL，则所述第一板上的总孔数为600,000的1至2倍、2至5倍、5至10倍、10至100倍、100至1000倍、1000至10000倍。
42.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1nM/μL，那么所述第一板上的总孔数为600,000,000的1到2倍、2到5倍、5到10倍、10到100倍、100到1000倍、1000到10000倍。
43.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述孔的数目允许在闭合所述装置之后将不多于一个目标分子放置在孔中。
44.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述板中的至少一者包含扩增表面。
45.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含位于所述第一板与所述第二板之间的薄密封层，其中在闭合构造中，所述密封层经构造以防止一个微孔中的样本或分析物移动到其他微孔。
46.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含夹具，其中在闭合构造中，所述权利要求经构造以防止一个微孔中的样本或分析物移动到其他微孔。
47.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述信号扩增层包括金属材料层。
48.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述信号扩增层包括金属材料层和位于所述金属材料层顶部的介电材料层，其中所述捕获剂位于所述介电材料上。
49.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述金属材料层是均匀金属层、纳米结构化金属层或组合。
50.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述扩增层包括金属材料层和在所述金属材料层顶部上的介电材料层，其中所述捕获剂在所述介电材料上，且所述介电材料层具有厚度为0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm、00nm、200nm、500nm、1000nm、2μm、3μm、
5μm、10μm、20μm、30μm、50μm、100μm、200μm、500μm或在任何两个值的范围内。
51.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述样本整体沉积在所述一个或两个板上，且所述闭合步骤将所述样本扩散没过并进入微孔中的至少一些微孔中。
52.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含将所述样本沉积在一块板上、按压所述第二板并将所述样本分离到孔中、对填充有所述样本的所述孔进行计数、计算所述样本的体积、对有信号的所述孔进行计数，以及计算所述样本中所述分析物的浓度。
53.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含识别哪些孔未填充有所述样本。
54.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含在所述板处于闭合构造时测量与每一个所述微孔中的目标分析物相关的信号的步骤。
55.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含扩增，其中所述扩增使所述分析物比未经所述扩增的分析物更可观察到，且其中所述扩增包含化学发光、发光、核酸扩增、ELISA(酶联免疫吸附测定)、使用等离子体结构的光增强或化学反应。
56.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含对包含所述目标分析物的孔的数目进行计数。
57.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中统计上每个孔将具有不多于一个目标分析物分子。
58.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中每一个填充有所述样本的孔中的目标分析物的分布遵循泊松分布。
59.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含确定所述样本中的所述目标分析物的浓度。
60.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述目标分析物是蛋白质、核酸、小分子、细胞或颗粒。
61.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述目标分析物是核酸，且所述方法包含扩增所述核酸。
62.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
63.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中使用结合分析来分析所述目标分析物。
64.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，进一步包含从所述装置洗涤未结合的目标分析物。
65.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法进一步包含：在所述两个板已闭合之后部分或完全分离所述两个板；冲洗所述原始样本或添加另一试剂；以及接着使所述板进入闭合构造的步骤。
66.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中使用海绵进行所述洗涤。
67.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法进一步包含对所述样本接触区域进行成像。
68.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像是测量与来自所述样本接触区域的所述分析物相关的所述一次性总信号。
69.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像是测量由捕获剂与捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的个别信号。
70.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像是测量(a)来自所述样本接触区域的与所述分析物相关的所述一次性集总信号和(b)由捕获剂与捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的个别信号两者。
71.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中通过检测由捕获剂与所述捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的所述个别信号来确定所述样本中目标分析物的存在或浓度。
72.如前述任一权利要求所述的装置、设备或方法，其中所述方法包括由(i)通过在明场图像中成像孔和/或通过在所述扩增步骤之前成像来识别所述空孔，以及(ii)通过在体积计算中减去所述空孔来量化所述分析物浓度，从而在确定所述实际样本体积时减去空孔。
数字测定
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年2月9日提交的临时申请序列号62/457,009(ESX-040PRV)、于2017年2月16日提交的临时申请序列号62/460,076(ESX-040PRV2)、于2018年1月24日提交的临时申请序列号62/621,475(ESX-040PRV3)、于2017年2月8日提交的临时申请序列号62/
456,603(ESX-033PRV)、于2017年2月15日提交的临时申请序列号62/459,337(ESX-
033PRV2)、于2017年2月8日提交的临时申请序列号62/456,504(ESX-045PRV)、于2017年2月
16日提交的临时申请序列号62/460,062(ESX-045PRV2)和于2017年2月9日提交的临时申请序列号62/457,133(ESX-046PRV)的权益，所有这些申请的全部内容通过引用并入本文。
456,603(ESX-033PRV)、于2017年2月15日提交的临时申请序列号62/459,337(ESX-
033PRV2)、于2017年2月8日提交的临时申请序列号62/456,504(ESX-045PRV)、于2017年2月
16日提交的临时申请序列号62/460,062(ESX-045PRV2)和于2017年2月9日提交的临时申请序列号62/457,133(ESX-046PRV)的权益，所有这些申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
背景技术
[0004] 其中，本发明提供了允许比某些现有技术更准确、更简单和更快地分析样本中的分析物的装置和方法。在某些实施方案中，本发明将样本分隔到具有预定几何形状和体积的分离的或几乎分离的微孔中，和将每个孔中的样本与其相邻孔分离或几乎分离的盖板。本发明可用于数字PCR(聚合酶链式反应)。
发明内容
[0005] 提供了一种用于执行数字测定的装置，包含：
[0006] 第一板、第二板和微孔，其中：
[0008] (b)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)预定和已知的几何形状，(ii)200μm或更小的孔深度，和(iii)具有基本上小于流体样本的体积，
[0009] 其中，构造之一是开放构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距大于孔的深度，并且样本沉积在一个或两个板上；以及
[0010] 其中构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在样本沉积到开放构造之后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于1μm或小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0011] 一种用于分隔流体样本的方法，包含：
[0013] 当板是开放构造时，将样本沉积在一个或两个板上，其中沉积是样本的单个或多个液滴的形式，其中液滴中的至少一个具有占据两个以上微孔的体积；以及
[0015] 本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图不旨在以任何方式限制本发明的范围。附图不是完全按比例绘制的。在给出实验数据点的图中，连接数据点的线仅用于引导观察数据，而没有其他含义。
[0016] 图1(a)两个板的示意图：板1具有平的内表面，而板2在其样本接触表面上具有孔阵列。(b)将样本液体沉积在孔阵列板(板2)的中心，用平板(板1)覆盖并将两个板压在一起。(c)加压后将液体分离进入孔阵列。
[0017] 图2(a)在175μm厚的PMMA基板上制造的微孔板的照片；(b)孔直径为30μm，孔深度为8μm和孔中心到中心距为34μm的六方晶格微孔阵列的显微镜照片；(c)孔直径为20μm，孔深度为8μm和孔中心到中心距为24μm的六方晶格微孔阵列的显微镜照片。
[0018] 图3.将两个板(微孔板和如图1所述的平板)压在一起(用人的手指)之后分离进入孔阵列的液体的(a)放大10倍和(b)放大20倍的显微镜照片。在该装置中，板1(平板)是厚度为50μm的平坦PET膜，而板2(微孔板)是厚度为175μm的PMMA板，并且表面上的微阵列具有30μm的孔直径，8μm的孔深度和34μm的孔中心到中心距。液体是2μL体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。注意，在沉积液体样本并使板处于闭合构造之后，一些微孔被填充而一些微孔是空的。我们的测量显示，在板的闭合构造中，在板1的内表面和所述板的所述孔边缘之间存在薄的液体残余层(-0.5μm厚或更薄)。
[0019] 图4是像素化测定QMAX装置(Q：量化；M：扩增；A：加入试剂；X：加速；也称为可用于像素化测定的压缩调节开放流(CROF)装置。在图4中，所述QMAX装置是开放构造。(a)一种装置，其包含第一板、第二板和第二板上的微孔。(b)第二板上微孔的顶视图,具有(i)正方形点阵圆形，(ii)具有正方形点阵的矩形，(iii)具有六边形点阵的三角形，(iv)非周期性圆形。
[0020] 图5是示出使用QMAX装置进行像素化测定的示例性过程中的基本步骤的示例性流程图。
[0021] 图6示出了在0.25mm厚的丙烯酸基板上制造的QMAX第一板上的隔离孔阵列的显微示例，具有(a)20μm×20μm的正方形孔，100μm的间隔，30μm的深度；(b)20μm×20μm的正方形孔，200μm的间隔，30μm的深度；(c)10μm直径的圆孔，200μm的间隔，20μm的深度。
[0022] 图7示出了用于执行像素化测定QMAX的示例性实施方案的结合位点板(第一板)和存储板(第二板)的制备的示意图。
[0023] 图8示出了用于孵育过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0024] 图9示出了用于扩增过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0025] 图10示出了具有分离孔的像素化测定的代表性测量图。(a)通过在捕获步骤中计数加样的孔来估计样本体积。(b)通过在扩增步骤之后用信号计数孔数目来估计样本中的分子数目。通过将分子数除以样本体积反算样本中分析物的最终浓度。
[0026] 图11示出了用于像素化测定QMAX的示例性实施方案的结合位点板(第一板)和储存板(第二板)的制备示意图。实验过程遵循图5的流程图。
[0027] 图12示出了用于捕获过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图
[0028] 图13示出了用于扩增过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0029] 图14示出了用于数字核酸扩增测定的开放构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0030] 图15示出了在用于数字核酸扩增测定的样本引入之后处于闭合构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图
[0031] 图16示出了在数字核酸扩增过程中处于闭合构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
具体实施方式
[0032] 以下详细描述通过示例而非限制的方式示出了本发明的一些实施例。本文使用的章节标题和任何副标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。章节标题和/或副标题下的目录不限于章节标题和/或副标题，而是适用于本发明的整个描述。
[0033] 任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开，并且不应当被解释为承认本权利要求由于在先发明而不能先于这种出版物。此外，所提供的公开日期可以不同于可能需要被独立地确认的实际的公开日期。
[0034] A.微孔阵列像素化测定(MAPA)原理。
[0035] GD1如图4所示，称为MAPA或“微孔阵列像素化测定”的使用微孔阵列的像素化测定装置包含第一板、第二板和微孔；
[0036] (c)第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触流体样本的样本接触区域；
[0037] (d)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)预定和已知的几何形状，(ii)200μm或更小的孔深度，和(iii)具有基本上小于流体样本的体积，
[0038] 其中该构造之一是开放构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距大于该孔的深度，并且该样本沉积在该一个或两个板上；以及
[0039] 其中该构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在样本以开放构造沉积之后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于1μm或小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0040] GM1一种用于像素化测定流体样本的方法，包含：
[0041] i.获得第一板，
[0042] ii.获得第二板，
[0043] 其中
[0044] (a)第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含目标分析物的流体样本的样本接触区域；
[0045] (b)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)200μm或更小的孔深度，和(ii)体积基本上小于样本体积的孔；
[0046] iii.当板是开放构造时，将样本沉积在一个或两个板上；以及
[0047] iv.将板制成闭合构造；
[0048] 其中开放构造是这样的构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距大于孔的深度，并且样本沉积在一个或两个板上；
[0049] 其中，闭合构造是指样在开放构造中沉积后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于1μm或小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0050] 在任何前述实施方案的方法中，其中还包含在板处于闭合构造时测量与分析物相关的信号的步骤。
[0052] 在任何前述实施方案的装置或方法中，其中分析物是分子。在一些实施方案中，分析物是蛋白质和/或核酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，分析物是小分子。
[0053] 在任何前述实施方案的装置或方法中，其中进一步在一个或两个板的内表面上有结合位点，其中所述结合位点包含固定在位点的捕获剂，并且捕获剂被构造成特异性捕获分析物。
[0054] 在任何前述实施方案的装置或方法中，其中进一步在一个或两个板的内表面上有储存位点，其中所述该储存位点在该位点包含试剂，并且该试剂可以溶解在液体中。
[0055] 在任何前述实施方案的方法中，其中方法还具有扩增步骤，其中扩增使得分析物比没有扩增的情况更可观察到，并且其中孔中的分析物信号扩增包括但不限于化学反应或物理增强(例如，等离子结构)或两者。实施例包括但不限于：(a)针对核酸，各种类型的PCR(聚合酶链式反应)、LAMP(环介导等温扩增)等，(b)针对蛋白质，ELISA(酶联免疫吸附测定)、使用等离子结构(例如，等离子金属结构)的光增强，和(c)针对小分子，化学反应。所述化学反应包括但不限于化学发光或其他发光。
[0056] 在任何先前实施例的方法中，其中其进一步具有在确定实际样本体积时减去空孔的步骤，这是由(i)通过在明场图像中成像孔和/或通过在扩增步骤之前成像来识别空孔，和(ii)在体积计算中减去空孔以量化分析物浓度。
[0057] 图1-3示意性地示出了该方法的实施例的一些原理。
[0058] 间隔件
[0059] 在本发明的某些实施例中，先前实施例中的装置进一步包含间隔件，其经构造以保持第一板的内表面与孔底部之间的距离大体上均匀(即，在整个孔上大体上相同)。在一些实施方案中，这些间隔件被固定在这些孔内，或在该第一板的内表面上，或两者上。间隔件的实施例在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT/US2016/045437号和PCT/US0216/051775号中被描述，出于所有目的将其全部内容并入本文。
[0060] 用于具有低分析物浓度的样本的像素化测定
[0061] 对于给定的分析物浓度(特别是低浓度)，可以构造每个孔的体积，使得孔具有一种分析物或没有分析物。在这种情况下，当板处于闭合构造时，可以扩增与孔(具有分析物)中的分析物相关的信号，而不受其他孔的影响或显著影响。
[0062] 在分析物信号扩增之后，可以通过检查具有与分析物相关的可观察信号的孔的存在来检测分析物。通过计数具有与分析物相关的可观察信号的孔的数目和通过使用板确定相关的样本体积，可以确定样本中分析物的浓度。
[0063] 在分析低分析物浓度样本时，可以在像素处观察每个孔，并且通过计数具有信号的像素的数目来确定分析物浓度。这种测定也称为数字测定。
[0064] 样本的体积可以通过孔体积和孔的数目以及孔内的样本占据来确定。
[0065] B.核酸的像素化检测
[0066] 在任何前述实施方案的装置或方法中，其中分析物是核酸，并且装置或方法被构造成进行核酸扩增技术，包含但不限于不同的聚合酶链式反应(PCR)方法，例如，作为热启动PCR、巢式PCR、降落PCR、逆转录PCR、RACEPCR、数字PCR、实时PCR等，以及诸如环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切刻酶扩增、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增等等温扩增方法。
[0067] 数字聚合酶链式反应(数字PCR、数字PCR、dPCR或dePCR)可用于直接定量和克隆扩增核酸链，包含DNA、cDNA或RNA。dPCR与传统PCR的主要区别在于测定核酸量的方法，前者是比PCR更精确的方法，但在经验不足的用户手中更容易出错。[1]:217A“数字”测量定量且离散地测量某一变量，而“模拟”测量基于所测量的模式推断某些测量。PCR每单个样本进行一个反应。dPCR也在样本中进行单一反应，然而所述样本被分离成大量的部分，所述反应在每个部分中单独进行。这种分离允许更可靠地收集和灵敏地测量核酸量。该方法已被证明可用于研究基因序列中的变异，例如，拷贝数变异和点突变，并且其通常用于下一代测序的样本的克隆扩增。
[0068] dPCR通过将反应分成多个更小的反应而改进了目前的PCR实践。分隔样本，使得样本中的单个核酸分子定位并集中在许多分离的区域内。微孔板、毛细管、油乳液和具有核酸结合表面的小型化室阵列可用于分隔样本。类似于TaqMan测定制备PCR溶液，该PCR溶液由模板DNA(或RNA)、荧光猝灭剂探针、引物和PCR预混物组成，PCR预混物含有DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和最佳浓度的反应缓冲液。将PCR溶液分成更小的反应，然后分别进行PCR。多次PCR扩增循环后，用二进制读数“0”或“1”检查样本的荧光。记录荧光液滴的分数。样本的分隔允许人们通过假定分子群体遵循泊松分布来估计不同分子的数目，从而考虑多个靶分子居于单个分子的可能性。使用泊松小数定律，可以精确地近似样本中靶分子的分布，从而允许定量PCR产物中的靶链。基于由函数CPD＝-ln(1-p)表示的荧光液滴的分数(p)，该模型简单地预测随着包含至少一种靶分子的样本的数目增加，包含多于一种靶分子的样本的概率增加。在常规PCR中，PCR扩增循环的数目与起始拷贝数成比例。然而，dPCR不依赖于扩增循环数来测定初始样本量，消除了对不确定指数数据定量靶核酸的依赖，因此提供了绝对定量。
[0069] 在任何先前实施例的装置或方法中，其中装置进一步经构造以在PCR中进行快速热循环，其中构造包含，但不限于，在所述装置上或邻近所述装添加加热器和冷却器以及其他额外装置、材料和/或方法公开于于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456，596、于
2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456,504、于2017年2月15日提交的美国临时申请号62/459,496、于2017年4月21日提交的美国临时申请号62/488,684和于2017年5月23日提交的美国临时申请号62/510,063，出于所有目的将所有这些申请的全部内容并入本文。
2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456,504、于2017年2月15日提交的美国临时申请号62/459,496、于2017年4月21日提交的美国临时申请号62/488,684和于2017年5月23日提交的美国临时申请号62/510,063，出于所有目的将所有这些申请的全部内容并入本文。
[0070] 图11示出了用于像素化测定QMAX的示例性实施方案的结合位点板(第一板)和储存板(第二板)的制备示意图。实验过程遵循图5的流程图。
[0071] 具体地，该实施例中的第一板是在0.25mm厚的丙烯酸基板上制造的尺寸为20μm×20μm，间隔为100μm，深度为30μm的正方形孔阵列。首先将基板在45℃下用1M氢氧化钠处理2小时，然后用水漂洗3次。然后在室温下用含8mg/mlEDC和11.2mg/mlNHS的MES缓冲液
(pH4.7)包被基板2小时。20然后在室温下将μg/ml链霉抗生物素蛋白包被在第一板上2小时，然后用PBS漂洗3次。然后在室温下用4％BSA闭合基板1小时，然后用PBS冲洗3次。在室温下，将1μm生物素化捕获探针包被在第一板上2小时，然后用PBST洗涤三次。除去过量的液体并将板在室温下干燥。
(pH4.7)包被基板2小时。20然后在室温下将μg/ml链霉抗生物素蛋白包被在第一板上2小时，然后用PBS漂洗3次。然后在室温下用4％BSA闭合基板1小时，然后用PBS冲洗3次。在室温下，将1μm生物素化捕获探针包被在第一板上2小时，然后用PBST洗涤三次。除去过量的液体并将板在室温下干燥。
[0072] 该实施例中的第二板是0.175mm厚的平坦丙烯酸膜。将200μL的与HRP缀合的1uM检测探针均匀地印刷在第二板上并且在37℃下干燥2小时。
[0073] 如图11所示，在一些实施方案中，第一板包括完全或部分涂覆在第一板的内表面上的捕获探针。在一些实施方案中，捕获探针完全或部分位于第一板上的孔的底部或侧壁或两者上。
[0074] 在一些实施方案中，捕获探针可通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀或部分试剂层的方法涂覆到表面。在某些实施方案中，捕获探针直接涂覆在第一板上。还应当注意，在一些实施方案中，捕获探针涂覆在第一板的内表面上，而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，捕获探针涂覆在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，捕获探针涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，包被的捕获探针的浓度范围为1fM-1mm。
[0075] 在一些实施方案中，捕获探针的长度通常为10-50bp，并且3’末端被修饰以促进在基板上的包被。常用的3’末端修饰包括但不限于硫醇、二硫醇、胺、生物素等，可用于捕获探针固定的基板包括但不限于丙烯酸膜、金表面、PS等。
[0076] 如图11所示，在一些实施方案中，第一板包括涂覆在第一板的内表面上的阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂阻断可在测定中引起不需要的非特异性结合的固体表面上的任何未占据位点。在某些实施方案中，阻断剂减少非特异性结合。在某些实施方案中，阻断剂可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，阻断剂在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，阻断剂涂覆在第一板的内表面上，而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，阻断剂涂覆在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，阻断剂涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，阻断剂是牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或来自全脂乳的总蛋白等。在一些实施方案中，阻断剂是小分子，比如6-巯基-己醇。
[0077] 如图11所示，在一些实施方案中，第一板包括涂覆在第一板的内表面上的稳定剂。在一些实施方案中，当干燥时稳定剂有助于维持蛋白质的适当折叠，使得蛋白质的功能在储存期间不被破坏。在某些实施方案中，稳定剂延长试剂例如，但不限于蛋白质的使用寿命。在某些实施方案中，稳定剂可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，稳定剂在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，稳定剂被涂覆在第一板的内表面上，而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，该稳定剂被涂覆在该第二板的内表面上，而不是该第一板上；在一些实施方案中，稳定剂涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，稳定剂是糖，比如但不限于蔗糖和葡萄糖。在一些实施方案中，稳定剂是聚合物。在某些实施方案中，稳定剂是甘油。
[0078] 如图11所示，在一些实施方案中，第二板包括涂覆在第二板的内表面上的检测探针。在一些实施方案中，检测探针可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，检测探针在第二板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，检测抗体包被在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，检测抗体包被在第一板的内表面上，而不是包被在第二板的内表面上；在一些实施方案中，检测探针涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，包被的检测探针的浓度为1fM-1mm。
[0079] 在一些实施方案中，检测探针被构造成在与核酸靶结合后产生可检测信号。例如，在一些实施方案中，信号可以是比色信号、发光信号或荧光信号。在一些实施方案中，例如，检测探针被荧光标记物标记，其在检测探针与核酸靶或捕获探针-靶复合物结合后产生信号。在一些实施方案中，荧光标记直接标记检测探针。在一些实施方案中，荧光标记物标记可结合检测探针或检测探针-靶复合物的试剂。在一些实施方案中，该检测探针被构造成一种化学物质，该化学物质可以扩增信号或可以扩增来自该化学物质的信号；其中该扩增步骤中的扩增方法包括但不限于：
[0081] 基于荧光的酶促反应，通过与检测剂连接的酶扩增底物产生的荧光信号；其中酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶；其中底物包括但不限于Amplex Red；
[0082] 基于化学发光的酶促反应，底物产生的化学发光信号经连接到检测剂的酶扩增；其中酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶；其中底物包括但不限于鲁米诺和异鲁米诺；
[0083] 在一些实施方案中，常用的标记酶和显色或荧光或化学发光底物的实施例总结于表1中。
[0084] 表1.标记酶和底物的实施例
[0085]
[0086]
[0087] 催化扩增。分析物激活催化剂，然后产生报道分子的多个拷贝。
[0088] 催化自扩增。分析物激活催化剂，这导致报道分子的产生。这些不仅产生信号，而且能够活化催化剂。
[0089] 分析物诱导的集体性质的修饰。单个分析物分子与受体的结合通过信号转导影响相邻单元的性质。
[0090] 用于结合多种分析物分子的多价表面。使用多价支架如聚合物、树枝状聚合物或纳米颗粒募集多个报道分子扩增了信号。
[0091] 其中上述催化剂包括Pd(0)-催化剂、三磷酸腺苷双磷酸酶、高锰酸钾、铂等。
[0092] 图12示出了用于捕获过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。在该方法中，
[0093] 1)将含有1aM至1mm浓度的核酸靶的1μL样本滴在第一板上
[0094] 2)用手将第二板按压在液体的顶部。
[0095] 3)拍摄第一张板上的孔的照片。通过计数加样的孔计算总样本的体积。
[0096] 4)孵育1分钟。
[0097] 5)剥离第二板/用5XSSC洗涤第一板3次。
[0098] 如本文所用，“样本”可以是含有或不含有样本的任何核酸，包括但不限于人体液，比如全血、血浆、血清、尿、唾液和汗液，以及细胞孵育物(哺乳动物、植物、细菌、真菌)。可以新鲜获得或以任何所需的或方便的方式(例如，通过稀释或加入缓冲液，或其他溶液或溶剂)储存或处理样本。样本中可以存在细胞结构，例如，人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞和病毒颗粒。
[0099] 本文所用的术语“核酸”是指任何DNA或RNA分子，或DNA/RNA杂合体，或DNA和/或RNA的混合物。因此，术语“核酸”包括但不限于基因组或染色体DNA、质粒DNA、扩增的DNA、cDNA、总RNA、mRNA和小RNA。术语“核酸”旨在包括天然DNA和/或RNA分子，或合成的DNA和/或RNA分子。在一些实施方案中，样本中存在无细胞核酸，如本文所用，“无细胞”表示核酸不包含在任何细胞结构中。在一些其他实施方案中，核酸包含在细胞结构中，其包括但不限于人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞和/或病毒颗粒。样本中可以存在无细胞核酸形式或细胞结构内或其组合形式的核酸。在一些进一步的实施方案中，核酸在导入第一板的内表面之前被纯化。在另外的实施方案中，核酸可以在与其他分子(比如蛋白质和脂质)结合的复合物内。
[0100] 本发明的方法适用于一定体积范围的样本。可以将具有不同体积的样本引入到具有不同尺寸的板上。
[0101] 如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸”旨在与它们在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的物种或其功能类似物。特别有用的核酸功能性类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作特定核苷酸序列复制的模板。天然存在的核酸通常具有含磷酸二酯键的主链。类似物结构可具有替代的主链连接，包含本领域已知的任何种类的主链连接。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，在脱氧核糖核酸(DNA)中发现的)或核糖(例如，在核糖核酸(RNA)中发现的)。核酸可以含有具有本领域已知的这些糖部分的任何类似物的核苷酸。核酸可包括天然或非天然核苷酸。在这点上，天然脱氧核糖核酸可以具有一个或多个选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基，核糖核酸可以具有一个或多个选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基。可包括在核酸或核苷酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。当术语“探针”或“靶”用于指核酸时，在本文的方法或组合物的上下文中用作核酸的语义标识符，并且不一定限制核酸的结构或功能超出另外明确指明的范围。术语“探针”和“靶”可类似地应用于其他分析物，比如蛋白质、小分子、细胞等。
[0102] 如本文所用，术语“捕获探针”是指与具有互补序列的核酸杂交的核酸。
[0103] 本文所用的术语“互补的”是指通过氢键与目的靶核酸碱基配对的核苷酸序列。在典型的Watson-Crick碱基配对中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，DNA中鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)取代。因此，A与T互补、G与C互补。通常，“互补的”是指与感兴趣的靶完全互补的核苷酸序列，使得序列中的每个核苷酸与靶核酸中相应位置的每个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不完全互补(100％互补)但由于核苷酸序列的某些片段与非靶序列的互补性仍可能与非靶序列碱基配对时，可以计算互补百分比以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。通常，50％或更少的互补不会导致非特异性结合。此外，70％或更少的互补序列在严格杂交条件下不会导致非特异性结合。
[0105] 在某些实施方案中，预定的时间段等于或长于靶核酸穿过均匀厚度层扩散到样本中所需的时间。
[0106] 在某些实施方案中，预定的时间段等于或长于靶核酸所需的时间。
[0107] 图13示出了用于扩增过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。在该方法中，
[0108] 1)在第一板上滴加3μL(过量)TMB扩增底物；
[0109] 2)用手将扩增第二板按压在液体的顶部；
[0110] 3)孵育1分钟。在该过程中，只有良好捕获的靶被扩增并显示信号(颜色或荧光)；
[0111] 4)拍摄第一板上的孔的照片，并用信号计数孔的数目
[0112] 图14示出了用于数字核酸扩增测定的开放构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0113] 在一些实施方案中，干燥的试剂包括细胞溶解试剂，其包括但不限于盐、去污剂、酶和其他添加剂。本文中的术语“盐”包括但不限于锂盐(例如，氯化锂)、钠盐(例如，氯化钠)、钾(例如，氯化钾)。本文中的术语“洗涤剂”可以是离子的，包括阴离子的和阳离子的、非离子的或两性离子的。本文所用的术语“离子洗涤剂”包括当溶于水时部分或全部为离子形式的任何洗涤剂。合适的阴离子去污剂包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)或其他碱金属烷基硫酸盐或类似去污剂、肌氨酰或其组合。本文中的术语“酶”包括但不限于溶菌酶、纤维素酶和蛋白酶。此外，螯合剂(包括但不限于EDTA、EGTA和其他聚氨基羧酸)和一些还原剂(例如，二硫苏糖醇(dTT))也可包括在细胞裂解试剂中。本文必需试剂的组成根据不同扩增反应的合理设计而变化。
[0114] 在一些实施方案中，“干燥试剂”包括PCR试剂，其包括但不限于引物、脱氧核苷酸(dNTPs)、二价阳离子(例如，Mg2+)、单价阳离子(例如，K+)、缓冲液、酶和报道分子。如本文所用，在一些实施方案中，“引物”可以指一对正向和反向引物。在一些实施方案中，引物可以指多个引物或引物组。如本文所用，适用于核酸扩增的酶包括但不限于DNA依赖性聚合酶，或RNA依赖性DNA聚合酶，或DNA依赖性RNA聚合酶。
[0115] 如本文所用，术语“报道分子”是指可结合或嵌入核酸分子或由扩增过程的副产物活化以使核酸分子或扩增过程可视化的任何标记、标签或染料。合适的报道分子包括但不限于荧光标记或标签或染料、嵌入剂、分子信标标记，或生物发光分子，或其组合。
[0116] 在一些实施方案中，“干燥试剂”包括稳定剂，其包括但不限于蛋白质稳定剂，实施例包括但不限于多元醇、糖、氨基酸、胺和盐析盐；聚合物和蛋白质，实施例包括但不限于PEG、多糖、葡聚糖、羟乙基淀粉(HETA)、PEG-4000和明胶；表面活性剂的实施例包括但不限于吐温20、吐温80、Triton X-100、Brij 35、Pluronic F127和SDS；氨基酸的实施例包括但不限于组氨酸、精氨酸和甘氨酸；防腐剂的实施例包括但不限于苯甲醇、间甲酚和苯酚。
[0117] 图15示出了在用于数字核酸扩增测定的样本引入之后处于闭合构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。在该方法中，
[0118] 1)在第一板上滴下含有核酸靶标的样本
[0119] 2)用手将第二板按压在液体的顶部。
[0120] 3)拍摄第一张板上的孔的照片。通过计数加样的孔计算总样本的体积。
[0121] 在一些实施方案中，“样本”可以是含有或不含有样本的任何核酸，包括但不限于人体液，比如，全血、血浆、血清、尿、唾液和汗液，以及细胞培养物(哺乳动物、植物、细菌、真菌)。可以新鲜获得或以任何所需的或方便的方式(例如，通过稀释或加入缓冲液，或其他溶液或溶剂)储存或处理样本。样本中可以存在细胞结构，比如，人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞和病毒颗粒。
[0122] 本文所用的术语“核酸”是指任何DNA或RNA分子，或DNA/RNA杂合体，或DNA和/或RNA的混合物。因此，术语“核酸”旨在包括但不限于基因组或染色体DNA、质粒DNA、扩增的DNA、cDNA、总RNA、mRNA、miRNA和小RNA。术语“核酸”还包含天然DNA和/或RNA分子，或合成的DNA和/或RNA分子。在一些实施方案中，样本中存在无细胞核酸，如本文所用，“无细胞”表示核酸不包含在任何细胞结构中。在一些其他实施方案中，核酸包含在细胞结构中，其包括但不限于人体细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞和/或病毒颗粒。样本中可以存在无细胞核酸形式或细胞结构内或其组合形式的核酸。在一些进一步的实施方案中，核酸在导入第一板的内表面之前被纯化。在另外的实施方案中，核酸可以在与其他分子如蛋白质和脂质结合的复合物内。
[0123] 本发明的方法适用于一定体积范围的样本。可以将具有不同体积的样本引入到具有不同尺寸的板上。
[0124] 在一些实施方案中，在样本引入之后，将图14中的干燥试剂溶解在所述样本中。
[0125] 图16示出了在数字核酸扩增过程中处于闭合构造的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。
[0126] 如本文所用，“扩增子”是指通过核酸扩增技术产生的各种核酸。本文中核酸扩增产物的类型包括但不限于单链DNA、单链RNA、双链DNA、线性DNA或环状DNA等。在一些实施方案中，核酸扩增产物可以是具有相同长度和构造的相同核酸。在一些其他实施方案中，核酸扩增产物可以是具有不同长度和构造的多种核酸。
[0127] 如本文所用，“核酸扩增”包括用于通过扩增(产生…的大量拷贝)样本中的靶分子来检测核酸的任何技术，本文中“靶”是指目的核酸的序列或部分序列。合适的核酸扩增技术包括但不限于不同的聚合酶链式反应(PCR)方法，比如，热启动PCR、嵌套PCR、降落PCR、逆转录PCR、RACEPCR、数字PCR等，和等温扩增方法，比如，环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切刻酶扩增、滚环扩增。重组酶聚合酶扩增等。
[0128] 如本文所用，术语“报道分子”是指可结合或嵌入核酸分子或由扩增过程的副产物活化以使核酸分子或扩增过程可视化的任何标记、标签或染料。合适的报道分子包括但不限于荧光标记或标签或染料、嵌入剂、分子信标标记，或生物发光分子，或其组合。
[0129] 在一些实施方案中，使用报道分子定量核酸扩增后积累的核酸。如上所定义和使用的，报道分子具有可定量的特征，其与在闭合室中积累的核酸扩增子的存在或不存在或数量相关。
[0130] C.用于杂交测定的核酸捕获的QMAX装置的另一个实施例
[0131] 图4是QMAX(Q：量化)的示例性实施方案的示意图；M：扩增；A：加入试剂；X：加速；也称为压缩调节开放流(CROF)装置，其可用于例如，捕获用于杂交测定的核酸。在图4中，QMAX装置是开放构造。
[0132] DD1.一种用于像素化测定流体样本的装置，包含：
[0133] 第一板、第二板和微孔，其中
[0134] (a)第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含目标分析物的流体样本的样本接触区域；
[0135] (b)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)200μm或更小的孔深度，(ii)体积显著小于样本体积的孔，和(iii)包含固定在位点的捕获剂的结合位点，以及捕获剂被构造成捕获目标分析物；
[0136] 其中构造之一是开放构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距为至少250μm，并且样本沉积在一个或两个板上；
[0137] 其中构造中的另一个是闭合构造，闭合构造是在样本以开放构造沉积之后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0138] 图4(b)示出了第二板上微孔的顶视图，第二板具有(i)正方形点阵的圆形，(ii)正方形点阵的矩形，(iii)六边形点阵的三角形，(iv)非间隔的圆形。
[0139] 图6示出了在0.25mm厚的丙烯酸基板上制造的QMAX第一板上的隔离孔阵列的显微镜实施例，具有(a)20μm×20μm的正方形孔，100μm的间隔，30μm的深度；(b)20μm×20μm的正方形孔，200μm的间隔，30μm的深度；(c)10μm的圆孔直径，200μm的间隔，20μm的深度。
[0140] DD2一种用于像素化测定的试剂盒，包含：
[0141] 实施例DD1中的设备，以及
[0142] 用于对样本接触区域成像的成像器。
[0143] DD3一种用于像素化测定的试剂盒，包含：
[0144] 实施方案DD1中的设备，
[0145] 待添加到具有微孔的QMX卡上的试剂，以及
[0146] 用于对样本接触区域成像的成像器。
[0147] 如前述任一实施方案所述的试剂盒，其中试剂是洗液。
[0148] 如前述任一实施方案所述的试剂盒，其中试剂是检测剂。
[0149] 如前述任一实施方案所述的试剂盒，其中试剂是能够在底物中产生光的酶溶液。
[0150] M1.一种用于像素化测定流体样本的方法，包含：
[0151] iii.获得第一板，
[0152] iv.获得第二板，
[0153] 其中
[0154] (a)第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含目标分析物的流体样本的样本接触区域；
[0155] (b)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)200μm或更小的孔深度，(ii)体积显著小于样本体积的孔，和(iii)包含固定在位点的捕获剂的结合位点，以及捕获剂被构造成捕获目标分析物；
[0156] iii.将样本沉积在一个或两个板上；以及
[0157] v.将板制成闭合构造；
[0158] 其中构造之一是开放构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距为至少250μm，并且样本沉积在一个或两个板上；
[0159] 其中构造中的另一个是闭合构造，闭合构造是在样本以开放构造沉积之后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0160] 在实施方案M1的方法中，其中方法进一步包含，在步骤(iv)之后，部分或全部分离两个板的步骤、洗涤原始样本或添加另一种试剂的方式，和然后使板进入闭合构造的步骤。
[0161] 在任何前述实施方案的方法中，其中方法还包含使样本接触区域成像的步骤。
[0162] 在任何前述段落(也称为“段落”)的装置或方法中，其中成像样本接触区域测量与来自样本接触区域的分析物相关的一次总和信号。
[0163] 在任何前述段落(也称为“段落”)的装置或方法中，其中使样本接触区域成像测量由捕获剂和捕获的靶分析物之间的个体结合事件引起的个体信号。
[0164] 在任何前述段落(也称为“段落”)的装置或方法中，其中使样本接触区域成像测量(a)与来自样本接触区域的分析物相关的一次总和信号和(b)由捕获剂和捕获的目标分析物之间的个体结合事件引起的个体信号。
[0165] 在任何前述段落(也称为“段落”)的装置或方法中，其中样本中靶分析物的存在或浓度通过检测由捕获剂和捕获的靶分析物之间的个体结合事件引起的个体信号来确定。
[0166] 在任何前述段落的装置或方法中，其中对于预期的目标分析物浓度，构造每个孔的体积，使得每个孔中(加样)的目标分析物的分布遵循泊松分布。
[0167] 在任何前述段落的装置或方法中，其中对于预期的靶分析物浓度，构造每个孔的体积，使得靶分析物在每个孔(加样孔)中的分布平均为一个靶分析物每2个孔、3个孔、5个孔、10个孔、20个孔、0个孔、50个孔、75个孔、100个孔、150个孔、200个孔、300个孔、500个孔、1000个孔、2000个孔、10000个孔、100,000个孔，或在任何两个值的范围内。
[0168] 在任何前述段落的装置或方法中，其中在闭合构造中，第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/11(十一分之一)、1/20、1/30、1/40、1/50、1/100、1/300、1/500，或在任何两个值的范围内。
[0169] 在任何前述段落的装置或方法中，其中在闭合构造中，第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距显著接触。
[0170] 在任何前述段落的器件或方法中，其中在闭合构造中，两个相邻孔之间的平均间距小于5nm、10nm、30nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm，或在任何两个值的范围内。
[0171] 如前述段落的装置，其中该第一板具有形状为球形、矩形、六边形和/或任何其他多面体的孔阵列，具有正方形、六边形和/或任何其他网格的网格。
[0173] 在一些实施方案中，第一板上的孔具有1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或任何两个值之间的范围的间隔(平均孔到孔中心距离)；以及10nm至100nm、
100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围(间隔)。
100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围(间隔)。
[0174] 在一些实施方案中，第一板上的孔具有1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm的孔尺寸(平均长度或直径)，或任何两个值之间的范围；和10nm-100nm、100nm-
500nm、500nm-1μm、1μm-10μm或10μm-50μm(尺寸)的优选范围。
500nm、500nm-1μm、1μm-10μm或10μm-50μm(尺寸)的优选范围。
[0175] 在一些实施方案中，第一板上的孔的深度为1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm，或任何两个值之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm(深度)的优选范围。
[0176] 在一些实施方案中，孔具有(i)无金属涂层(ii)孔底部(柱顶部)上的金属涂层(iii)孔侧壁(柱侧面)上的金属涂层(iv)孔底部和侧壁上的金属涂层。
[0178] 在一些实施方案中，孔面积比率(孔面积与表面的总面积的比率)为40％到50％、50％到60％、60％到70％、70％到80％、80％到90％、90％到99％。
[0179] 在一些实施方案中，孔边缘到孔边缘的距离大于孔深度，这确保孔边缘到孔边缘的扩散时间长于孔边缘到孔底部的扩散时间。
[0180] 在一些实施方案中，设计孔的尺寸以确保在测定过程中不发生交叉反应。
[0181] 在一些实施方案中，第一板上的孔数远大于样本中的分子数。
[0182] 例如，第一板上的总孔数为600的1-2倍、2-5倍、5-10倍、10-100倍、100-1000倍、1000-10000倍，如果分子浓度为1fM，则体积为1μL；
[0183] 例如，第一板上的总孔数为600,000的1-2倍、2-5倍、5-10倍、10-100倍、100-1000倍、1000-10000倍，如果分子浓度为1μL体积1pM；
[0184] 例如，第一板上的总孔数为600,000,000的1-2倍、2-5倍、5-10倍、10-100倍、100-1000倍、1000-10000倍，如果分子浓度为为1μL体积1nM；
[0185] 在一些实施方案中，在核酸捕获步骤之后，孔数以这样的方式实现，即大多数孔捕获不超过一个靶分子。
[0186] 例如，对于100μm的孔口，4cm2大小的第一板上的总孔数为40000。如果使用这种孔板测量1μL样本中的1fM分子样本，其具有600个靶分子，则统计上每个孔将具有不超过一个分子。
[0187] 在一些实施方案中，第二板是X板。
[0188] 在一些实施方案中，第一板可以是具有平坦或工程固体表面的任何材料。第一板的实施例包括但不限于：塑料、硅、PMMA、金和玻璃。在一些实施方案中，第二板可以是具有平坦或工程固体表面的任何材料。第一板的实施例包括但不限于：塑料、硅、PMMA、金和玻璃。
[0189] 在一些实施方案中，第一板由包括碳、锗、硒、硅、砷化镓(GaAs)、氮化镓(GaN)、磷化铟(InP)、硒化锌(ZnSe)和碳化硅(SiC)的半导体制成；金属包括金、铝、银、铜、锡和/或它们的组合。
[0190] 如图4所示，在一些实施方案中，第一板的面向第二板的表面被限定为第一板的内表面；第二板的面对第一板的表面也被限定为第二板的内表面。在一些实施方案中，各个板的内表面包含用于接触包含核酸的样本的样本接触区域。样本接触区域可占据相应内表面的部分或全部。如图4所示，第二板可包含固定在第二板的内表面上的间隔件。然而，应当注意，在一些实施方案中，间隔件固定在第一板的内表面上，而在其他实施例中，间隔件固定在第二板和第一板的内表面上。
[0191] 样本可以是任何需要测试的液体。在一些实施方案中，样本是有或没有处理或稀释的体液。例如，体液可以是全血、血浆、血清、尿液、唾液、汗液或呼吸冷凝物。在一些实施方案中，样本是血液。在某些实施方案中，样本包含血浆。在某些实施方案中，样本包含全血。在某些实施方案中，样本是已经用缓冲液稀释0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、5,000、10,000、50,000、
100,000、500,000或1,000,000次或在这两个值中的任一个之间的范围内的血液或血浆。在一些实施方案中，样本包含分析物，其可以是可检测和定量的任何细胞或分子。
100,000、500,000或1,000,000次或在这两个值中的任一个之间的范围内的血液或血浆。在一些实施方案中，样本包含分析物，其可以是可检测和定量的任何细胞或分子。
[0192] 本文所用的术语“样本”涉及含有一种或多种感兴趣分析物的材料或材料混合物。在特定的实施方案中，样本可以从生物样本如细胞、组织、体液和粪便中获得。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆、血清等)、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物、尿液和呼出的冷凝物。在特定实施例中，样本可从受试者(例如，人)获得，且其可在用于受试者分析之前处理。例如，在分析之前，蛋白质/核酸可以在使用之前从组织样本中提取，其方法是已知的。在特定实施方案中，样本可以是临床样本，例如，从患者收集的样本。
[0193] 标记是发光标记或光学可检测标记，直接或间接地，在其与捕获剂结合之前或之后。该标记是具有拉曼散射、色度、发光、荧光、电致发光、化学发光和/或电化学发光信号的标记。如本文所用，术语“发光标记”是指在外部激发下可发光的标记。这可以是发光。荧光标记(包括染料分子或量子点)和发光标记(例如，电致发光或化学发光标记)是发光标记的类型。外部激发是用于荧光的光(光子)，用于电致发光的电流和用于化学发光的化学反应。外部激励可以是上述的组合。短语“标记的分析物”是指用发光标记可检测地标记的分析物，使得可以通过评估标记的存在来检测分析物。标记的分析物可以直接打标记(即，分析物本身可以直接缀合到标记，例如，经由强键，例如，共价键或非共价键)，或者标记的分析物可以间接打标记(即，分析物通过直接标记的第二捕获剂结合)。
[0194] 在一些实施方案中，在孔的底部或侧壁或两者上完全或部分地存在信号扩增层。当来自扩增层的目标分析物或标记为1nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、
90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm或任意两个值之间的范围；以及0nm至50nm、50nm至100nm、100nm至200nm、200nm至500nm的优选范围时，扩增层扩增来自目标分析物或目标分析物的标记的信号。
90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm或任意两个值之间的范围；以及0nm至50nm、50nm至100nm、100nm至200nm、200nm至500nm的优选范围时，扩增层扩增来自目标分析物或目标分析物的标记的信号。
[0195] 术语“扩增”是指信号幅度的增加，例如，信号增加至少10倍、增加至少100倍、增加至少1,000倍、增加至少10,000倍，或增加至少100,000倍。
[0196] 在一些实施方案中，感应扩增层包括但不限于于2010年5月21日提交的美国临时专利申请号61/347178、于2012年4月10日提交的美国临时专利申请号61/622,226、于2012年10月1日提交的美国临时专利申请号61/708,314、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/800,915、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/801,933、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/801,096、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/801,424、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/794,317、于2014年12月
10日提交的美国临时专利申请号62/090,299、于2014年10月21日提交的美国临时专利申请号62/066,777、于2015年9月29日提交的美国临时专利申请号62/234,538、于2015年6月13日提交的美国实用新型专利申请13/699,270、于2013年3月15日提交的美国实用新型专利申请号13/838,600、于2014年8月13日提交的美国实用新型专利申请号14/459,239、于2014年8月13日提交的美国实用新型专利申请号14/459,251、于2014年3月16日提交的美国实用新型专利申请号14/852,412、于2015年9月30日提交的美国实用新型专利申请号14/871,
678、于2015年10月5日提交的美国实用新型专利申请号14/431,266、于2015年3月25日提交的美国实用新型专利申请号14/668,750、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/775,634、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/775,638、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/852,417、于2015年12月9日提交的美国实用新型专利申请号14/964,394、于2011年5月20日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2011/
037455、于2013年3月15日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2013/032347、于2013年10月
1日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2013/062923、于2014年3月16日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/030108、于2014年3月14日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/
US2014/029675、于2014年3月14日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/028417、于
2014年3月15日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/029979、于2015年10月20日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2015/056518、于2016年9月27日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2016/054025中所描述的感应扩增层，其全部公开内容出于所有目的通过引用并入本文。
10日提交的美国临时专利申请号62/090,299、于2014年10月21日提交的美国临时专利申请号62/066,777、于2015年9月29日提交的美国临时专利申请号62/234,538、于2015年6月13日提交的美国实用新型专利申请13/699,270、于2013年3月15日提交的美国实用新型专利申请号13/838,600、于2014年8月13日提交的美国实用新型专利申请号14/459,239、于2014年8月13日提交的美国实用新型专利申请号14/459,251、于2014年3月16日提交的美国实用新型专利申请号14/852,412、于2015年9月30日提交的美国实用新型专利申请号14/871,
678、于2015年10月5日提交的美国实用新型专利申请号14/431,266、于2015年3月25日提交的美国实用新型专利申请号14/668,750、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/775,634、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/775,638、于2015年9月11日提交的美国实用新型专利申请号14/852,417、于2015年12月9日提交的美国实用新型专利申请号14/964,394、于2011年5月20日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2011/
037455、于2013年3月15日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2013/032347、于2013年10月
1日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2013/062923、于2014年3月16日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/030108、于2014年3月14日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/
US2014/029675、于2014年3月14日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/028417、于
2014年3月15日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2014/029979、于2015年10月20日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2015/056518、于2016年9月27日提交的PCT申请号(指定美国)PCT/US2016/054025中所描述的感应扩增层，其全部公开内容出于所有目的通过引用并入本文。
[0197] 第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造。其中一种构造是开放构造，其中两个板部分或完全分开，并且板之间的间隔不受间隔件的限制。图4示出了开放构造的板，其中可以将样本添加到第一板、第二板或这两个板上。在一些实施方案中，相应板的内表面包括样本接触区域，其占据整个内表面的一部分。在某些实施方案中，间隔件定位在样本接触区域内。在一些实施方案中，间隔件不固定到任何一个板上，而是在样本中混合。
[0198] 使用QMAX装置进行像素化测定的另一示例方法
[0199] 图5是示出使用QMAX装置进行像素化测定的示例性过程中的基本步骤的示例性流程图。
[0200] 图5提供了“测定”部分中的过程的示例性流程图。然而，应注意，本发明的装置可用于各种测定，包含但不限于测量本文的免疫测定。例如，虽然图2示出了使用抗体检测分析物的过程，但是可以使用包括抗原的过程和装置来检测和/或定量抗体或抗体表达细胞。
[0201] 如图5所示，在一些实施方案中，像素化测定过程包括：(1)将样本沉积在微孔板(图4所示的第一板)的中心；(2)用X-板(图1所示的第二板)覆盖并将两个板压在一起；(3)统计加样的孔数；(4)用孔数和孔容相乘计算样本体积；(5)在分离的孔中孵育和捕获分析物；(6)在隔离孔中扩增信号；(7)用信号计数孔；(8)计算样本中分析物的浓度。
[0202] 在一些实施方案中，本发明的方法在步骤(5)之前和步骤(4)之后还包含将均匀厚度的层孵育预定时间段。在某些实施方案中，所述预定时间段等于或长于靶分子穿过均匀厚度层扩散到样本中所需的时间。
[0203] 在某些实施方案中，所述预定时间段等于或长于靶分子穿过均匀厚度层扩散到样本中并被捕获探针捕获所需的时间。
[0204] 在某些实施方案中，预定时间段小于10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、1.5分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或60分钟。或者在两个值中的任何一个之间的范围内。
[0205] 在一些实施方案中，对于本发明的方法，将样本沉积在第一板上。在某些实施方案中，在步骤(4)之后的步骤(5)之前，在步骤(5)之后的步骤(6)之前，将样本在第一板上孵育预定的时间段。在某些实施方案中，预定时间段等于或长于捕获抗体和分析物之间结合达到平衡所需的时间。在某些实施方案中，预定时间段小于10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、1.5分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或60分钟。或者在两个值中的任何一个之间的范围内。
[0206] 在一些实施方案中，对于本发明的方法，在步骤(5)之后和在步骤(6)之后，可以洗涤第一板的内表面以除去未结合的分子。对于该方法，在将板切换到闭合构造之前进行洗涤。在一些实施方案中，对于本发明的方法，在步骤(6)之前和步骤(5)之后，在步骤(7)之前和步骤(6)之后，可以将板切换到开放构造(例如，通过移除第二板)并且可以洗涤第一板的内表面。对于该方法，在将板切换到闭合构造之前进行洗涤。在某些实施方案中，这样的步骤降低了非特异性结合并降低了信号噪声。在某些实施方案中，每个洗涤步骤仅包括一次或多次洗涤。在一些实施方案中，进行两个洗涤步骤。在一些实施方案中，仅进行一个洗涤步骤。
[0207] 在一些实施方案中，内表面可以用吸收在海绵中的洗涤溶液洗涤。在一些实施方案中，通过挤压海绵以将洗涤液释放到第一板的内表面上并释放海绵以再吸收洗涤液来进行洗涤。在一些实施方案中，洗涤改善了可检测信号的检测极限(LOD)。
[0208] 在(6)扩增步骤中的扩增方法包括但不限于：
[0209] 显色酶促反应，底物产生的吸收信号经连接到检测剂的酶扩增；其中酶包括辣根过氧化物酶；其中底物包括ABTS或TMB；
[0210] 基于荧光的酶促反应，通过与检测剂连接的酶扩增底物产生的荧光信号；其中酶包括辣根过氧化物酶；其中底物包括Amplex red；
[0211] 催化扩增。分析物激活催化剂，然后产生报道分子的多个拷贝。
[0212] 催化自扩增。分析物激活催化剂，这导致报道分子的产生。这些不仅产生信号，而且能够活化催化剂。
[0213] 分析物诱导的集体性质的修饰。单个分析物分子与受体的结合通过信号转导影响相邻单元的性质。
[0214] 用于结合多种分析物分子的多价表面。使用多价支架比如聚合物、树枝状聚合物或纳米颗粒募集多个报道分子扩增了信号。
[0215] 其中上述催化剂包括Pd(0)-催化剂、三磷酸腺苷双磷酸酶、高锰酸钾、铂等。
[0216] 在某些实施方案中，扩增底物在步骤(6)之前加入，扩增底物包括但不限于ABTS和TMB。
[0217] 在某些实施方案中，在步骤(6)之后的步骤(7)之前，将样本在第一板上孵育预定的时间段。在某些实施方案中，预定时间段等于或长于扩增过程所需的时间。在某些实施方案中，预定时间段等于或长于孔具有可读信号所需的时间。在某些实施方案中，预定时间段小于10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、1.5分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或60分钟，或者在两个值中的任何一个之间的范围内。
[0218] 步骤(3)统计加样的孔数；和(7)用信号对孔进行计数，各种类型的“检测方法”包括但不限于使用荧光显微镜、DSLR(数字单镜头反射式照相机)和智能电话。
[0219] 在步骤(4)中，计算样本的体积、观察并计数所有孔，或者观察并计数部分孔。从计数数目和孔体积的乘积估计QMAX中样本的总体积。
[0220] 由于孔数目比样本中的总分子数目大得多，因此统计上每个孔具有不超过一个分子。通过在扩增步骤之后用信号对孔数目进行计数来估计样本中的总分子数目。通过将分子数除以样本体积来计算样本中分析物的最终浓度。
[0221] 本发明的其他实施例
[0222] 图4示出了用于像素化测定QMAX的示例性实施方案的结合位点板(第一板)和储存板(第二板)的制备示意图。实验过程遵循图5的流程图。
[0223] 具体地，本实施例中的第一板是在0.25mm厚的丙烯酸基板上制造的尺寸为20μm×20μm，间隔为100μm，深度为30μm的正方形孔阵列。PBS中的10μg/mL蛋白-A包被第一板2小时，然后用PBST洗涤三次。然后用溶于PBS的10μg/mL抗人IgG捕获抗体(山羊抗人IgG)包被第一板2小时，然后用溶于PBS的4％BSA闭合2小时。然后将第一板与100μL蛋白稳定剂一起孵育2小时。除去过量的液体并将板在室温下干燥。
[0224] 该实施例中的第二板是0.175mm厚的平坦丙烯酸膜。将检测Ab(小鼠抗人IgG)缀合的HRP 10μg/mL 200μL均匀印刷并在37℃下在其上干燥2小时。
[0225] 如图7所示，在一些实施方案中，第一板包含完全或部分包被在第一板的内表面上的捕获抗体。在一些实施方案中，捕获抗体完全或部分位于第一板上的孔的底部或侧壁或两者上。
[0226] 在一些实施方案中，捕获抗体可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀或部分试剂层的方法涂覆到表面。在某些实施方案中，捕获抗体在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，捕获抗体包被在第一板的内表面上，而不是包被在第二板的内表面上；在一些实施方案中，捕获抗体包被在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，捕获抗体包被在两个板的内表面上。在一些实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、工程化抗体(例如，单链可变片段(scFv))或其片段。在一些实施方案中，包被的捕获抗体的浓度为1fg/mL-1g/mL。
[0227] 在一些实施方案中，捕获抗体经构造以结合分析物。例如，当分析物包含抗原表位时，在某些实施方案中，捕获抗体被构造成特异性结合抗原表位。在一些实施方案中，捕获抗体(a)共价结合到表面，或(b)通过经由固体表面和蛋白质上的非极性残基之间的疏水相互作用的被动吸收附着到表面。例如，在图4所示的一些实施方案中，捕获抗体通过蛋白A附着于第一板10。在某些实施方案中，捕获抗体可以将分析物95固定到第一板的内表面上。
[0228] 尽管抗体可用于检测抗原，抗原也可用于检测抗体。例如，在本发明的一些实施方案中，代替捕获抗体的捕获抗原(或表位)可以包被在各自板(例如，第一板)的内表面上。捕获抗原可以附着在内表面上并用于将分析物(例如，抗体或抗体表达细胞)固定在内表面上。
[0229] 如图7所示，在一些实施方案中，第一板包括涂覆在第一板的内表面上的阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂阻断可在测定中引起不需要的非特异性结合的固体表面上的任何未占据位点。在某些实施方案中，阻断剂减少非特异性结合。在某些实施方案中，阻断剂可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，阻断剂在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，阻断剂涂覆在第一板的内表面上，而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，阻断剂涂覆在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，阻断剂涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，阻断剂是牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或来自全脂乳的总蛋白等。
[0230] 如图7所示，在一些实施方案中，第一板包括涂覆在第一板的内表面上的稳定剂。在一些实施方案中，当干燥时稳定剂有助于维持蛋白质的适当折叠，使得蛋白质的功能在储存期间不被破坏。在某些实施方案中，稳定剂延长试剂比如，但不限于蛋白质的使用寿命。在某些实施方案中，稳定剂可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，稳定剂在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，稳定剂被涂覆在第一板的内表面上，而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，该稳定剂被涂覆在该第二板的内表面上，而不是该第一板上；在一些实施方案中，稳定剂涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，稳定剂是糖，比如，但不限于蔗糖和葡萄糖。在一些实施方案中，稳定剂是聚合物。在某些实施方案中，稳定剂是甘油。
[0231] 如图7所示，在一些实施方案中，第二板包含包被在第二板的内表面上的检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面。在某些实施方案中，检测抗体在第二板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，检测抗体包被在第二板而不是第一板的内表面上；在一些实施方案中，检测抗体包被在第一板的内表面上，而不是包被在第二板的内表面上；在一些实施方案中，检测抗体包被在两个板的内表面上。在一些实施方案中，检测抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、工程化抗体(例如，单链可变片段(scFv))或其片段。在一些实施方案中，包被的检测抗体的浓度为
1fg/mL-1g/mL。
1fg/mL-1g/mL。
[0232] 在一些实施方案中，检测抗体经构造以结合分析物。例如，当分析物包含抗原表位时，在某些实施方案中，检测抗体被构造成特异性结合抗原表位。在某些实施方案中，捕获抗体和检测抗体结合分析物的不同位点(例如，表位)。在某些实施方案中，检测抗体经构造以特异性结合捕获抗体-分析物复合物。在某些实施方案中，检测抗体不与内表面共价结合。在某些实施方案中，检测抗体不通过经由固体表面和蛋白质上的非极性残基之间的疏水相互作用的被动吸收附着于表面。在某些实施方案中，检测抗体160可以在样本沉积并且检测抗体与样本液体接触之后扩散到样本中。
[0233] 在一些实施方案中，检测抗体经构造以在结合到分析物后产生可检测信号。例如，在一些实施方案中，信号可以是比色信号、发光信号或荧光信号。例如，在一些实施方案中，检测抗体由荧光标记165标记，其在检测抗体1与分析物或捕获抗体-分析物复合物结合后产生信号。在一些实施方案中，荧光标记直接标记检测抗体。在一些实施方案中，荧光标记165标记可结合检测抗体160或检测抗体-分析物复合物的试剂。在一些实施方案中，第二抗体可以与光学可检测标记缀合，例如，荧光团，比如，但不限于cy5、IR800、SAPE
IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800。在一些实施方案中，捕获抗体或检测抗体或分析物上的标记物是核酸。通过实时PCR扩增定量核酸的存在和浓度。
IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800。在一些实施方案中，捕获抗体或检测抗体或分析物上的标记物是核酸。通过实时PCR扩增定量核酸的存在和浓度。
[0234] 在一些实施方案中，检测抗体被构造成能够扩增信号的化学物质或来自该化学物质的信号能够被扩增；其中该扩增步骤中的扩增方法包括但不限于：
[0235] 显色酶促反应，底物产生的吸收信号经连接到检测剂的酶扩增；其中酶包括辣根过氧化物酶；其中底物包括ABTS或TMB；
[0236] 基于荧光的酶促反应，通过与检测剂连接的酶扩增底物产生的荧光信号；其中酶包括辣根过氧化物酶；其中底物包括Amplex red；
[0237] 催化扩增：分析物激活催化剂，然后产生报道分子的多个拷贝。
[0238] 催化自扩增：分析物激活催化剂，这导致报道分子的产生。这些不仅产生信号，而且能够活化催化剂。
[0239] 分析物诱导的集体性质的修饰。单个分析物分子与受体的结合通过信号转导影响相邻单元的性质。
[0240] 用于结合多种分析物分子的多价表面。使用多价支架比如聚合物、树枝状聚合物或纳米颗粒募集多个报道分子扩增了信号。
[0241] 其中上述催化剂包括Pd(0)-催化剂、三磷酸腺苷双磷酸酶、高锰酸钾、铂等。
[0242] 尽管抗体可用于检测抗原，抗原也可用于检测抗体。例如，在本发明的一些实施方案中，代替检测抗体的检测抗原(或表位)可以包被在各自板(例如，第二板)的内表面上。捕获抗原可附着于内表面并用于检测内表面上的分析物(例如，抗体或抗体表达细胞)。
[0243] 如图7所示，在一些实施方案中，第二板包含稳定剂，其稳定蛋白质(例如，检测抗体)并延长装置的保存期限。在一些实施方案中，当干燥时稳定剂有助于维持蛋白质的适当折叠，使得蛋白质的功能在储存期间不被破坏。在某些实施方案中，稳定剂延长试剂，比如，但不限于蛋白质的使用寿命。在某些实施方案中，稳定剂可以通过印刷、喷雾、浸泡或任何其他涂覆均匀试剂层的方法涂覆到表面上。在某些实施方案中，稳定剂在第一板上干燥。还应当注意，在一些实施方案中，稳定剂155涂覆在第一板而不是第二板的内表面上；在一些实施方案中，该稳定剂被涂覆在该第二板的内表面上，而不是该第一板上；在一些实施方案中，稳定剂涂覆在两个板的内表面上。在一些实施方案中，稳定剂是糖，比如，但不限于蔗糖和葡萄糖。在一些实施方案中，稳定剂是聚合物。在某些实施方案中，稳定剂是甘油。在一些实施方案中，涂覆在第一板上的稳定剂和涂覆在第二板上的稳定剂是相同的。在一些实施方案中，涂覆在第一板上的稳定剂和涂覆在第二板上的稳定剂是不同的。
[0244] 图8示出了用于捕获过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。在该方法中，
[0245] 1)将浓度为1ng/mL至1fg/mL的1μL抗原(人IgG的PBS溶液)滴在第一板上。
[0246] 2)用手将第二板按压在液体的顶部。
[0247] 3)拍摄第一张板上的孔的照片。通过计数加样的孔计算总样本的体积。
[0248] 4)孵育1分钟。
[0249] 5)剥离第二板/在PBST内洗涤第一板1分钟，然后用水洗涤1分钟。
[0250] 图9示出了用于扩增过程的闭合构造中的像素化测定QMAX装置的示例性实施方案的示意图。在该方法中，
[0251] 5)在第一板上滴加3μL(过量)TMB扩增底物；
[0252] 6)用手将扩增第二板按压在液体的顶部；
[0253] 7)孵育1分钟。在该过程中，只有良好捕获的抗原被扩增并显示信号(颜色或荧光)；
[0254] 8)剥离所述扩增第二板/在PBST内洗涤第一板1分钟，然后用水洗涤1分钟。
[0255] QMAX像素化测定结果的其他实施例
[0256] 图10是具有分离孔的像素化测定的代表性测量图。(a)通过在捕获步骤中计数加样的孔来估计样本体积。(b)通过用扩增步骤中的信号计数孔数目来估计样本中的分子数目。样本中分析物的最终浓度是样本体积上的分子数。
[0257] 考虑到统计上每个孔具有不超过一个分子，通过用扩增的信号计数孔数目，QMAX像素化测定具有分子水平敏感性。
[0258] 如这些示例所展示的，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于测定的平台，该平台是快速的、简单的、便携式的并且仅需要少至1μL或更少的样本，具有对分子水平浓度的敏感性。利用本发明，可以在具有指定参数的浅闭合空间中进行测定，从而可以精确地控制样本体积和捕获时间。在一些实施方案中，分子的布朗运动被限制在浅空间中，使得可以更快地达到分子结合的平衡。该平台可适用于在传统微量滴定板中进行的任何测定，因此具有广泛的应用。
[0259] 同质分析物的像素化检测实施例
[0260] 在任何前述实施方案的装置或方法中，当样本中的分析物接触并与储存在孔中的化学品和试剂反应时，孔产生信号。在该方法中不进行任何洗涤步骤。
[0261] 在一些实施方案中，所述信号可以是比色信号、发光信号、荧光信号、吸收率信号或微/纳米图案变化。
[0262] 在一些实施方案中，所述信号是用一种化学反应产生的。例如，辣根过氧化物酶直接与3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(TMB)反应。
[0263] 在一些实施方案中，所述信号通过链化学反应产生。例如，醇与醇氧化酶反应产生过氧化氢，然后过氧化氢与辣根过氧化物酶和Amplex Red反应。
[0264] 在一些实施方案中，在产生所述信号之后，所述信号被进一步均匀地扩增。例如，初始信号由核酸产生。进行随后的聚合酶链式反应(PCR)以在每个孔中产生和扩增信号。
[0265] 在一些实施方案中，均匀像素化测定过程包括：(1)将样本沉积在微孔板(图4所示的第一板)的中心；(2)用X-板(图1所示的第二板)覆盖并将两个板压在一起；(3)统计加样的孔数；(4)用孔数和孔容乘积计算样本体积；(5)在分离的孔中孵育分析物，并在分离的孔中产生信号；(7)信号计数孔；(8)反算样本中分析物的浓度。
[0266] 在一些实施方案中，将试剂干燥并均匀涂布在微孔底部。
[0267] 在一些实施方案中，试剂是液体形式并且用微孔底部上的薄膜密封。
[0268] 在一些实施方案中，将试剂干燥并均匀涂布在微孔的侧壁上。
[0269] 在一些实施方案中，将试剂干燥并均匀涂布在没有微孔的其他板上。
[0270] 系统中使用的一些比色测定实施例给出如下：
[0271] 1.用葡萄糖氧化酶100单位/ml、辣根过氧化物酶100单位/ml、4-氨基安替比林20mm和TOOS20 mm进行葡萄糖比色(荧光)测定，
[0272] 3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(TMB)20mm、Amplex Red 20mm、Hexokinase 1单位/ml，ATP220 g/ml、NAD400 g/ml。
[0273] 2.偶氮胂Ⅲ17μg/ml钙比色法。
[0274] 3.Bromcresol紫22μg/ml白蛋白比色测定。
[0275] 4.用1.34mg/ml硫酸铜、3.43mg/ml酒石酸钠钾、0.28mg/ml碘化钾进行总蛋白比色测定。
[0276] 5.用ONPG220μg/ml、β-半乳糖苷酶0.05单位/ml进行钠比色测定。
[0277] 6.用ADP220μg/ml、磷酸烯醇丙酮酸盐0.05单位/ml，丙酮酸激酶0.1单位/ml、NADH480μg/ml、磷酸钾13.6mg/ml、硫酸镁95μg/ml、FAD7.85μg/ml、4-氨基安替比林130μg/ml、辣根过氧化物酶10单位/ml和TBHBA1.88 mg/ml进行钾比色测定。
[0278] 7.用CNPG3530μg/ml、淀粉酶0.36单位/ml、乙酸钙250μg/ml进行氯化物比色测定。
[0279] 8.用尿素酰胺裂解酶、PEP、ATP、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、磷酸钾、MgCl2、FAD、TBHBA、4-AAP、过氧化物酶进行血液尿素氮比色测定。
[0281] 10.对硝基苯磷酸酯、硫酸锌、硫酸镁碱性磷酸酶比色法。
[0282] 11.用L-丙氨酸、α-酮戊二酸、丙酮酸氧化酶、磷酸钾、MgCl2、FAD、TBHBA、4-AAP、过氧化物酶进行丙氨酸氨基转移酶比色测定。
[0283] 12.用辣根过氧化物酶、4-氨基安替比林、TOOS，3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(TMB)、Amplex Red进行过氧化氢(荧光)测定。
[0284] 13.用淀粉、氯化钠、氢氧化钠、酒石酸钠钾，3,5-DNS(二硝基水杨酸)进行淀粉酶(比色法)测定。
[0286] 15.用L-乳酸钠、NAD+、黄递酶、INT(碘硝基四唑)测定乳酸脱氢酶(比色法)。
[0287] 16.谷氨酰胺(比色法)测定用谷氨酰胺脱氢酶、NAD+、磷酸化酶、INT(碘硝基四唑)。
[0288] 其他实施例
[0289] 1.一种用于分析流体样本的装置，包含：
[0290] 第一板、第二板和微孔，其中
[0291] (a)第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含目标分析物的流体样本的样本接触区域；
[0292] (b)第二板在样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)200μm或更小的孔深度，(ii)基本上小于样本的孔体积，和(iii)具有固定在位点的捕获剂的结合位点，并且捕获剂被构造成捕获目标分析物；
[0293] 其中构造之一是开放构造，其中：第一板的内表面与第二板中的微孔的边缘之间的平均间距为至少250μm，并且样本沉积在一个或两个板上；
[0294] 其中构造中的另一种是闭合构造，闭合构造是在样本以开放构造沉积之后的构造；在闭合构造中，样本的至少一部分在微孔内，并且第一板的内表面和第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/10(十分之一)。
[0295] 2.一种用于分析样本的试剂盒，包含：
[0296] (a)实施例1的装置；
[0297] (b)海绵，其被构造成将储存在海绵中的溶液释放到外部并且将海绵外部的溶液吸收到海绵内部。
[0298] 3.一种用于分析样本的系统，包含：
[0299] (a)权利要求1所述的装置；
[0300] (b)读取装置，用于产生从第二板的结合位点发出的信号的图像；
[0301] (c)装置组件，将读取装置可操作地连接至第一板和第二板的闭合构造上；
[0302] (d)用于存储图像的存储器；以及
[0303] (e)用于识别和计数图像区域中的各个绑定事件的程序。
[0304] 4.一种测定流体样本的方法，包含：
[0305] (a)获得包含目标分析物的样本；
[0306] (b)获得实施例1的装置；
[0307] (c)当板被构造成开放构造时，将样本沉积在一个或两个板上；
[0308] (d)在(c)之后，将实施例1的装置的两个板移动成闭合构造；以及
[0309] (e)用读取装置读取第二板的样本接触区域以产生信号图像。
[0310] 2-1.如实施方案2所述的试剂盒，其中试剂盒还包含检测剂。
[0311] 2-2.如实施方案2所述的试剂盒，其中试剂盒进一步包含检测剂和底物，且检测剂和底物经构造以一起产生发光或产生颜色的产物。
[0312] 2-2.1.如实施方案2-2所述的试剂盒，其中检测剂为与检测剂如辣根过氧化物酶连接的酶，底物为基于颜色的ABTS或TMB；
[0313] 2-2.2.如实施方案2-2所述的试剂盒，其中其中检测剂是与检测剂作为辣根过氧化物酶连接的酶，底物是基于荧光的Amplex Red；
[0315] 2-4.如实施方案2所述的试剂盒，其中试剂盒还包含一种或多种催化剂，并且催化剂包括Pd(0)-催化剂、三磷酸腺苷双磷酸酶、高锰酸钾或铂等。
[0316] 3-1.如实施方案3所述的系统，其中设备组件是连接到手持移动通信设备的相机的适于器。
[0317] 3-2.如实施方案3所述的系统，其中信号代表单个靶-分析物结合事件。
[0318] 3-3.如实施方案3所述的系统，其中装置组件在三个(x、y、z)正交方向中的至少一个方向上控制或改变板与读取装置之间的相对位置，以读取信号。
[0319] 3-4.如实施方案3所述的系统，其中读取装置是CCD相机。
[0320] 3-5.如实施方案3所述的系统，其中读取装置是光电检测器，光电检测器包括从滤光器、分光计、透镜、孔径、分束器、反射镜、偏振器、波片和快门中选择的一个或多个其他光学装置。
[0321] 3-6.如实施方案3所述的系统，其中读取设备收集所述信号的位置、局部强度、局部光谱和局部拉曼特征。
[0322] 3-7.如实施方案3所述的系统，其中编程包括编程用于：(1)确定背景信号的局部强度或光谱或拉曼特征，(2)确定一个标记、两个标记、三个标记和四个或更多个标记的局部信号强度或光谱或拉曼特征；(3)确定成像区域内标记总数。
[0323] 3-8.如实施方案3所述的系统，其中识别和计数包括确定局部强度、光谱和拉曼特征中的任一个、一些或全部。
[0325] 3-10.如实施方案3所述的系统，其中所述系统包含用于在电极与感测扩增层之间涂覆电压以产生电场和/或电场梯度的电极、电场和/或电场梯度(a)将已置于板表面上的溶液中的分析物移动到感测扩增层上的捕获剂。
[0326] 3-11.如实施方案3所述的系统，其中所述系统包含用于在所述信号扩增层与另一电极之间涂覆偏压以进一步改进灵敏度的电极。
[0327] 3-12.如实施方案3所述的系统，其中读取装置是电或机械或生物探针，其收集板与读取装置之间的位置、局部电、局部机械、局部生物和局部光学相互作用。
[0328] 3-13.根据实施例13所述的系统，其中读取装置是手持式移动通信装置的相机。
[0329] 4-1.如实施方案4所述的方法，其中方法进一步包含洗涤以移除未结合到捕获剂的任何生物材料的步骤。
[0330] 4-1.如实施方案4所述的方法，其中方法不包含洗涤以移除未结合到捕获剂的任何生物材料的任何步骤。
[0331] 4-2.如实施方案4所述的方法，其中方法还包含添加检测剂的步骤。
[0332] 4-3.如实施方案4所述的方法，其中方法还包含以下步骤：(i)加入检测剂，(ii)洗涤以除去任何未结合的检测剂，和(iii)加入底物以产生颜色。
[0333] 4-4.如实施方案4所述的方法，其中步骤(e)中的读数是在板处于闭合构造并且微孔具有底物的情况下进行的。
[0334] 4-5.如实施方案5的方法，其中方法是均相分析，均相分析读取信号而不使用洗涤步骤来移除未在结合位点处结合到捕获剂的任何生物材料或标记。
[0335] 5.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中结合区域具有信号扩增层，且捕获剂固定在信号扩增层上。
[0336] 6.如前述实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔间隔为1nm至10nm、10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至5μm、5μm至50μm、50μm至500μm、500μm至1mm或1mm至5mm；优选范围为1μm-10μm、10μm-50μm，或50μm-500μm。
[0337] 7.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔尺寸(长度或直径)为1nm至10nm、10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至5μm、5μm至50μm、50μm至500μm、500μm至1mm或1mm至5mm；优选范围为0.5μm-5μm、5μm-25μm或25μm-300μm。
[0338] 8.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔深度为1nm至10nm、10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至5μm、5μm至50μm、50μm至500μm、500μm至1mm或1mm至5mm；优选0.5μm-5μm、5μm-25μm或25μm-300μm；
[0339] 9.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔具有球形，矩形，六边形和/或任何其他多面体的形状。
[0340] 10.如前述实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔具有正方形、六边形和/或任何其他晶格的晶格。
[0341] 11.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔是非间隔性的，在以上实施例6中具有平均间隔。
[0342] 12.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔面积比(微孔面积与表面的总面积的比率)为至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在两个值中的任一者之间的范围内。
[0343] 13.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中板的材料是聚苯乙烯、PMMA、PC、COC、COP或另一塑料。
[0344] 14.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中微孔距离(间隔减去尺寸)大于微孔深度；被构造成确保分析物从一个微孔到另一个微孔的扩散时间长于孵育时间(微孔深度的扩散时间)。
[0345] 15.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中一个或两个板包含永久固定在相应板的内表面上的间隔件。
[0346] 15-1.如实施方案15所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中间隔件具有等于或小于200微米的预定大致均匀高度和预定间隔件间距；
[0347] 16.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中在闭合构造中板之间的平均间隔为100μm或更小。
[0348] 17.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中在闭合构造中板之间的平均间隔为50μm或更小。
[0349] 15.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中装置进一步包含铰链，该铰链连接第一板和第二板，且经构造以允许板围绕铰链旋转成不同构造。
[0350] 19.如前述任一实施方案所述的装置、试剂盒、系统或方法，其中板中的至少一者是柔性的。
[0351] 20.一种测定流体样本的方法，包含：
[0352] (a)获得包含目标分析物的样本；
[0353] (b)获得实施例1的装置；
[0354] (c)当板被构造成开放构造时，将样本沉积在一个或两个板上；
[0355] (d)在(c)之后，将实施例1的装置的两个板移动到闭合构造中；以及
[0356] (e)用读取装置读取第二板的样本接触区域以产生信号图像。
[0357] 20-1.如实施方案20所述的方法，还包含：(f)量化图像区域中的信号以提供对样本中一种或多种分析物的量的估计。
[0358] 20-2.如实施方案20-1所述的方法，其中步骤(f)包括识别和计数图像区域中分析物与捕获剂之间的个体结合事件，从而提供样本中一种或多种分析物的量的估计。
[0359] 20-3.如实施方案20-1所述的方法，其中步骤(f)包括定量图像区域中的一次总和信号，从而提供样本中一种或多种分析物的量的估计。
[0360] 20-4.如实施方案20所述的方法，其中第二板的样本接触区域具有试剂储存位点。
[0361] 20-5.如实施方案20所述的方法，其中第二板的样本接触区域具有试剂储存位点，并且储存位点在闭合构造中大约在第一板上的结合位点上方。
[0362] 20-6.如实施方案20所述的方法，其中第一板中的样本接触区域进一步包含试剂存储位点。
[0363] 20-7.如实施方案20所述的方法，其中第一板中的样本接触区域还包含试剂储存位点，其中试剂储存位点与结合位点不在样本接触区域的相同位置处。
[0364] 20-8.如实施方案20-7所述的方法，其中试剂储存位点中的试剂是结合靶分析物的检测剂。
[0365] 20-9.如实施方案20所述的方法，其中方法还包含用检测剂标记靶分析物的步骤。
[0366] 20-10.如实施方案20-9所述的方法，其中检测剂包含标记。
[0367] 20-11.如实施方案20-9所述的方法，其中捕获剂和检测剂两者结合到目标分析物以形成夹层。
[0368] 20-12.如实施方案20所述的方法，其中方法进一步包含测量由读取装置成像的区域中的样本的体积。
[0369] 20-13.如实施方案20所述的方法，其中第一板包含多个结合位点，每个结合位点包含：
[0370] (i)邻近相关信号扩增层，以及
[0371] (ii)附着于邻近依赖性信号扩增层的捕获剂。
[0372] 20-14.如实施方案20所述的方法，其中靶分析物是蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞或纳米颗粒。
[0373] 20-15.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中捕获剂特异性结合靶分析物。
[0374] 20-16.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中图像显示信号的位置、局部强度和局部光谱。
[0375] 20-17.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号是选自荧光、电致发光、化学发光和电化学发光信号的发光信号。
[0376] 20-18.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号是拉曼散射信号。
[0377] 20-20.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号是由于板与读取装置之间的局部电、局部机械、局部生物或局部光学相互作用而产生的力。
[0378] 20-21.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中在步骤(b)之前，还包含在靶分析物与捕获剂结合之前或之后，用标记物标记靶分析物的步骤。
[0379] 20-22.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中通过在信号扩增层与另一电极之间涂覆偏压来执行读取步骤(b)，从而提供更大的灵敏度。
[0380] 20-23.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中识别和计数步骤(c)包含：(1)确定背景信号的局部强度，(2)确定一个标记、两个标记、三个标记和四个或更多个标记的局部信号强度；和(3)确定成像区域内标记总数。
[0381] 20-24.如前述方法实施方案中任一项所述的方法，其中识别和计数步骤(c)包含：(1)确定背景信号的局部光谱，(2)确定一个标记、两个标记、三个标记和四个或更多个标记的局部信号光谱；(3)确定成像区域内标记总数。
[0382] 20-25.如前述方法实施方案中任一项所述的方法，其中识别和计数步骤(c)包含：(1)确定背景信号的局部拉曼特征，(2)确定一个标记、两个标记、三个标记和四个或更多个标记的局部信号拉曼特征；(3)确定成像区域内标记总数。
[0383] 20-26.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中识别和计数步骤包含确定局部强度、光谱和拉曼签名中的一者或一者以上。
[0384] 20-27.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中结合步骤(a)通过向平板涂覆电场而加速，从而将分析物移动到传感扩增层。
[0385] 20-28.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中邻近相关信号扩增层包含D2PA。
[0386] 20-29.如前述任一实施方案所述的方法，其中邻近相关信号扩增层包含一个或多个金属盘和显著平坦的金属膜，其中金属盘的大部分具有与金属膜的间距，并且盘的间距和尺寸小于用于感测的光的波长。
[0387] 20-30.如实施方案20-29所述的方法，其中金属盘具有选自由圆形、多边形、棱锥形、椭圆形、细长条形或其任何组合组成的群组的形状。
[0388] 20-31.如实施方案20-29所述的方法，其中间距为0.5至30nm，并且其中盘具有在20nm至250nm范围内的平均横向尺寸。
[0389] 20-32.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中捕获剂通过将所述捕获剂与所述感测扩增层连接的分子连接层而附接到感测扩增层。
[0390] 20-33.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号是光信号。
[0391] 20-34.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号由荧光标记产生，该荧光标记在分析物与捕获剂结合之前或之后与结合的分析物结合。
[0392] 20-35.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中在读取步骤(c)中被读取以形成信号图像的两个相邻信号之间的平均距离大于10nm。
[0393] 20-36.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中信号是通过拉曼散射产生的信号。
[0394] 20-37.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中捕获剂是抗体。
[0395] 20-38.如前述任一方法实施方案所述的方法，其中捕获剂是多核苷酸。
[0396] 另外的附加实施方案
[0397] 如本文所用，“捕获组分”是设置在固体载体上的任何分子、其他化学/生物学实体或固体载体修饰，其可用于特异性附着、结合或以其他方式捕获靶分子或颗粒(例如，分析物分子或离解的物种)，使得靶分子/颗粒相对于捕获组分和固体底物变得固定。如本文所用，“固定化”是指被捕获、附着、结合或附着以防止靶分子/颗粒的离解或损失，但不需要相对于捕获组分或固体底物的绝对固定性。下面更详细地讨论对实施本发明的某些方面和实施方案有用或可能有用的捕获组分。至少一些分析物分子在暴露于包含多种捕获组分的底物时可以相对于捕获组分变得固定，从而形成多种固定的复合物。例如，在某些实施方案中，基本上所有的多种分析物分子可以相对于捕获组分变得固定，使得基本上每种固定的复合物包含捕获组分和分析物分子。
[0398] 如本文所用，“结合配体”是特异性结合或另外特异性结合分析物分子、固定化复合物和/或离解物质或结合或另外结合分析物分子、固定化复合物和/或离解物质的另一分子或颗粒(例如，另一结合配体)的任何分子、颗粒等。在某些实施方案中，结合配体可以将前体标记物分子转化为标记物，如下面更详细讨论的。在任何给定的测定方法中可以使用多于一种类型的结合配体，例如，第一种类型的结合配体和第二种类型的结合配体。在一个实施例中，第一结合配体能够与分析物分子结合，第二结合配体能够与第一结合配体结合。当底物暴露于多种类型的结合配体时，在一些情况下，多种固定化复合物中的至少一些可另外包含每种类型的结合配体中的至少一种。在某些实施方案中，结合配体可在捕获分析物分子后暴露于底物，使得结合配体结合于固定化复合物。在其他实施方案中，结合配体可以与分析物分子结合以形成复合物，随后通过底物捕获复合物以形成固定化复合物。在其他实施方案中，结合配体可以结合在固定化复合物或其部分从底物释放时形成的离解物
质。
质。
[0399] 在一些实施方案中，固定的复合物包含可裂解键。本文所用的“可裂解键基”是能够容易地(即：在对固定复合物的其他部分的完整性无害的条件下，并在暴露于离解剂时选择性裂解。通过暴露于离解剂而裂解时的可裂解键形成离解物质。可使用β-巯基乙醇裂解的可裂解键的一个具体实施例是二硫键。下面更详细地讨论可断裂键和可引起可断裂键断裂的相应离解剂。
[0400] 在一些实施方案中，多个分子可以通过暴露于离解剂而从第一底物释放。例如，可将包含多种捕获组分的底物暴露于包含多种分析物分子或颗粒的样本，使得分析物分子或颗粒与捕获组分结合以形成多种复合物，复合物相对于底物固定。每个固定化复合物可包含至少一种捕获组分和至少一种分析物分子或颗粒。将多种固定化复合物暴露于还原剂(例如，β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦等)导致多种固定化复合物中的至少一些的至少一部分从底物离解以形成多种离解物质。可以检测至少一些离解物质以确定流体样本中分析物分子或颗粒的存在和/或测量流体样本中分析物分子或颗粒的量或浓度，如本文更详细讨论的。还原剂可以或可以不在检测离解物质之前从包含离解物质的溶液中除
去，如本文更详细讨论的。在一些实施方案中，离解剂是还原剂(例如，β-巯基乙醇)。在一些实施方案中，离解剂对捕获组分基本上没有特异性亲和力。也就是说，离解剂不会通过与捕获组分相互作用并利用竞争性结合释放与捕获组分缔合的分析物分子而引起离解物质的
释放。
去，如本文更详细讨论的。在一些实施方案中，离解剂是还原剂(例如，β-巯基乙醇)。在一些实施方案中，离解剂对捕获组分基本上没有特异性亲和力。也就是说，离解剂不会通过与捕获组分相互作用并利用竞争性结合释放与捕获组分缔合的分析物分子而引起离解物质的
释放。
[0401] 在一些实施方案中，多种离解物质可以通过裂解可裂解键形成。例如，每个固定化复合物可以包含至少一个可裂解键(例如，二硫键)。可裂解键可以位于捕获组分、分析物分子或结合配体中，并且可以被裂解以形成多个离解物质。在一个实施方案中，可裂解键是二硫键，其在一些情况下可以通过将固定的复合物暴露于还原剂而裂解。
[0402] 在一些实施方案中，固定化复合物的至少一部分包含酶组分。即，捕获组分、分析物分子或固定化复合物的任何其他组分(例如，结合配体)中的至少一种包含酶组分。在一些情况下，酶组分可以在固定复合物的从第一底物离解形成离解物质的部分中。例如，图9说明了测定的示例性实施方案，其中结合配体包含如本文更详细讨论的部分(例如，酶组分)。
[0403] 在某些实施方案中，方案可以包括使用至少一种结合配体，其至少一部分包含从第一底物转移到第二底物的离解物质的至少一部分(例如，结合配体可以在分子或颗粒从第一底物释放之前或之后固定)。在一些实施方案中，结合配体包含可裂解键(例如，二硫键)和/或通过暴露于还原剂而从第一底物离解。在一些实施方案中，至少一种结合配体包含酶组分。例如，结合配体或其至少一部分形成从第一底物转移到第二底物的离解物质的至少一部分，还可以包含能够将前体标记剂分子(例如，酶底物)转化为标记剂(例如，可检测产物)的部分(例如，酶组分或酶底物)。在将离解物质转移到第二底物上或第二底物内并任选地捕获离解物质后，可将第二底物暴露于多种前体标记剂分子，其中多种前体标记剂分子在暴露于结合配体时转化为多种标记剂分子。然后可以基于第二底物上或第二底物内的标记剂分子的测量来确定流体样本中的分析物分子或颗粒的浓度的测量。
[0404] 一种检测QMAX装置中的分析物分子或颗粒的方法，包含：
[0405] (a)获得包含多个分析物分子或颗粒的样本；
[0406] (b)获得QMAX装置，该QMAX装置包含：
[0407] 第一板、第二板和间隔件，其中：
[0408] i.所述板可相对于彼此移动成不同的构造；
[0409] ii.一个或两个板是柔性的；
[0410] iii.一个或两个板具有多个反应容器；
[0411] iv.每个板包含具有用于接触血液样本的样本接触区域的内表面；
[0412] v.一个或两个板包含多个捕获组分；
[0413] vi.一个或两个板包含永久固定在相应板的样本接触区域上的间隔件；
[0414] vii.间隔件具有：
[0415] (1)预定的基本上均匀的高度，该高度具有在1μm至80μm的范围内选择的值，
[0416] (2)具有基本上均匀的截面和平坦的顶表面的柱的形状；
[0417] (3)宽度与高度之比等于或大于1；
[0418] (4)在10μm至200μm(微米)范围内的预定固定的、非随机的间隔件间距；以及
[0419] (c)将样本沉积在一个或两个板上，将包含多个捕获组分的板暴露于包含多个分析物分子或颗粒的样本，使得分析物分子或颗粒与捕获组分缔合以形成多个复合物，每个复合物相对于板固定并且包含至少一个捕获组分和至少一个分析物分子或颗粒；
[0420] (d)离解每个复合物的至少一部分以形成相对于板不固定的多个离解的物种；
[0421] (e)将多个离解的物质分隔穿过多个反应容器；
[0422] (f)确定至少一个反应容器中离解物质的存在或不存在；
[0423] (g)确定多个反应容器的数目和/或多个反应容器中含有或不含有离解物质的部分，其中多个离解物质被分隔，使得反应容器的统计学显著部分不含有离解物质，并且反应容器的统计学显著部分含有至少一种离解物质。
[0424] 一种用于确定流体样本中的分析物分子或颗粒的浓度的测量值的方法，包含：
[0425] 在第一板上捕获多个分析物分子或颗粒；
[0426] 从第一板释放多个分子或颗粒；
[0427] 检测在包括多个反应容器的第二板上或第二板内从第一板释放的分子或颗粒；
[0428] 以及基于对在第二板上或第二板内从第一板释放的分子或颗粒的检测，确定流体样本中的分析物分子或颗粒的浓度的测量值，其中通过确定包含或不包含从第一板释放的分子或颗粒的多个反应容器的数量或数量来确定流体样本中分析物分子或颗粒的浓度。
[0429] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中含有离解物质的多个反应容器的数目或数量与所述样本中的分析物分子或颗粒的浓度相关。
[0430] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，进一步包含确定流体样本中分析物分子或颗粒的浓度的动作。
[0431] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中板包含多个珠子。
[0432] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中珠子是磁性的。
[0433] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中板包括微量滴定板。
[0434] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个反应容器在密封组件的至少一部分与第二板的至少一部分配合时形成。
[0435] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个反应容器限定在平面第二板上。
[0436] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个反应容器中的每一个的体积为约10-100皮升。
[0437] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个反应容器中的每一者包含至少一个离解物质捕获组件。
[0438] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其进一步包含相对于所述至少一个离解的物种捕获组件固定所述多个离解的物种中的至少一者。
[0439] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个反应容器中的每一者暴露于至少一个前体标记剂分子。
[0440] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中当包含在包含离解物质的反应容器中时，至少一种前体标记剂分子转化成标记剂分子。
[0441] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中通过确定所述反应容器中存在或不存在标记剂分子来确定反应容器中存在或不存在离解物质。
[0442] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中板暴露于多个第一结合配体。
[0443] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中第一结合配体在所述暴露中与所述多个分析物分子或颗粒中的每一者缔合以形成所述多个复合物的至少一部分。
[0444] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中每个第一结合配体包含酶组分。
[0445] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中第一结合配体包含可裂解键。
[0446] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个离解物种是通过裂解所述可裂解键物中的至少一些形成的。
[0447] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个离解物种中的至少一者包含第一结合配体的至少一部分。
[0449] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中通过将板暴露于离解剂来形成多个离解物质。
[0450] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中离解剂包括pH剂、盐剂、变性剂、还原剂、化学试剂或酶中的至少一种。
[0451] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中分析物分子或颗粒是蛋白质。
[0452] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中捕获组分是抗体。
[0453] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，进一步包含密封多个反应容器。
[0454] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中第一板包含多个第一捕获组件。
[0455] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个分析物分子或颗粒中的至少一者通过相对于所述多个第一捕获组件中的至少一者特定地固定而被捕获。
[0456] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其进一步包含将捕获在所述第一板上的所述多个分析物分子或颗粒暴露于多个第一结合配体的动作。
[0457] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中多个第一结合配体中的至少一者相对于捕获在所述第一板上的所述多个分析物分子或颗粒的至少一部分中的每一者变得固定。
[0458] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中释放动作包含将板暴露于电磁辐射。
[0459] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中释放动作包括将板暴露于离解剂。
[0460] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中第二板包含多个第二捕获组件。
[0461] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中从所述第一板释放的所述多个分子或颗粒的至少一部分中的每一者相对于所述第二板上的至少一个第二捕获组件变得固定。
[0462] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，进一步包含密封所述多个反应容器的至少一部分的动作。
[0464] 如前述任一实施方案的方法或装置，其中多个反应容器的总数的少于约80％含有从板释放的至少一个分析物分子或颗粒。
[0465] 如前述任一实施方案的方法或装置，其中第二板包含平坦表面和包含多个微孔的密封组件，且多个反应容器在平坦板的至少一部分与密封组件的至少一部分配合时形成。
[0466] 用于多路复用的具有不同色码的珠子：
[0468] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中具有一种颜色条形码的珠子含有对一种分析物具有亲和力的试剂。
[0469] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中捕获特定种类的分析物的每一种类的条形码的珠子的数目是统计上显著的。
[0470] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中标记是具有不同几何尺寸的珠子，其中尺寸包括但不限于球体、立方体、长方体、四面体。
[0471] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中微孔具有不同的几何形状，其中每一种形状的微孔只能容纳一种几何尺寸的珠子。
[0472] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中具有不同几何尺寸的珠子含有用于不同分析物的捕获剂。
[0473] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中捕获特定分析物的每个单独几何尺寸的珠子的数目是统计上显著的。
[0474] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中可使用标记的数目与间隔件/柱的数目的比率来进行量化。
[0475] 一种用于确定QMAX卡上的流体样本中的分析物分子或颗粒的浓度的度量的方法，包含：
[0476] 以珠为标记对QMAX卡进行测定；
[0477] 基于确定与分析物分子结合的珠子的数目与间隔件(柱)的数目的比率来确定样本中分析物浓度的量度。
[0478] 本发明的其他实施方案和相关公开
[0479] 本发明包括只要各种组分彼此不矛盾就可以以多种方式组合的各种实施方案。实施方案应当被认为是单个发明文件：每个申请将其他申请作为参考，并且也出于所有目的而整体地而不是作为离散的独立文件被引用。这些实施方案不仅包括当前文件中的公开内容，而且还包括在此引用、并入或要求优先权的文件。
[0480] (1)定义
[0481] 在本申请中或在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号
62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中定义了用于描述本文公开的装置、系统和方法的术语，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中定义了用于描述本文公开的装置、系统和方法的术语，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0482] 术语“CROF卡(或卡)”、“COF卡”、“QMAX卡”、Q卡”、“CROF装置”、“COF装置”、“QMAX装置”、“CROF板”、“COF板”以及“QMAX板”是可互换的，除了在一些实施方案中，COF卡不包括垫片；并且这些术语是指一种装置，该装置包括第一板和第二板，第一板和第二板可相对于彼此移动成不同构造(包括打开构造和闭合构造)，并且该装置包括调节板之间的间距的垫片(COF的一些实施方案除外)。术语“X板”是指CROF卡中的两个板之一，其中垫片固定到该板。COF卡、CROF卡和X板的更多描述在于2017年2月7日提交的临时申请序列号62/456065中进行描述，其全部内容出于所有目的并入本文。
[0483] (2)Q卡、垫片和均匀样品厚度
[0484] 本文公开的装置、系统和方法可以包括或使用用于样品检测、分析和定量的Q卡、垫片和均匀样品厚度实施方案。在一些实施方案中，Q卡包括垫片，其有助于使样品的至少一部分成为高度均匀层。垫片的结构、材料、功能、变化和尺寸以及垫片和样品层的均匀性在本文中公开，或在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0485] (3)铰链、开口槽、凹边和滑动件
[0486] 本文公开的装置、系统和方法可以包括或使用用于样品检测、分析和定量的Q卡。在一些实施方案中，Q卡包括铰链、槽口、凹槽和滑动件，其有助于促进Q卡的操作和样品的测量。铰链、槽口、凹槽和滑动件的结构、材料、功能、变化和尺寸在本文中公开，或在分别于
2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/
US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文
2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/
US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文
[0487] (4)Q卡、滑动件和手机检测系统
[0488] 本文公开的装置、系统和方法可以包括或使用用于样品检测、分析和定量的Q卡。在一些实施方案中，Q卡与使卡能够被手机检测系统读取的滑动件一起使用。Q卡、滑动件和手机检测系统的结构、材料、功能、变化、尺寸和连接在本文中公开，或在分别于2016年8月
10日和于2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/
051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287和于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
10日和于2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/
051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287和于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0489] (5)检测方法
[0490] 本文公开的装置、系统和方法可以包括或用于各种类型的检测方法。检测方法在本文中公开，或在分别于2016年8月10日和于2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0491] (6)标签
[0492] 本文公开的装置、系统和方法可以采用用于分析物检测的各种类型的标签。标签在本文中公开，或在分别于2016年8月10日和于2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0493] (7)分析物
[0494] 本文公开的装置、系统和方法可以应用于操作和检测各种类型的分析物(包括生物标记物)。分析物在本文中公开，或在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0495] (8)应用(领域和样品)
[0496] 本文公开的装置、系统和方法可以用于各种应用(领域和样品)。在本文中公开该应用，或在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、
2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号
62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号
62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0497] (10)云
[0498] 这里公开的装置、系统和方法可以采用云技术进行数据传输、存储和/或分析。相关的云技术在本文中公开，或在分别于2016年8月10日和2016年9月14日提交的PCT申请(指定美国)号PCT/US2016/045437和PCT/US0216/051775、于2017年2月7日提交的美国临时申请号62/456065、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456287、于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456504中列出、描述和总结，所有这些申请的全部内容出于所有目的并入本文。
[0499] 间隔件填充因子
[0500] 术语“间隔件填充因子”或“填充因子”是指间隔件接触面积与总板面积的比率，其中间隔件接触面积在闭合构造下是指间隔件的顶表面接触到板的内表面的接触面积，总板面积是指垫片平顶接触的板内表面的总面积。由于存在两个板并且每个间隔件具有两个接触表面，每个接触表面接触一个板，所以填充事实是最小的填充因子。
[0501] 例如，如果间隔件是具有正方形(10μm×10μm)的平顶、几乎均匀的横截面和2μm高的柱，并且间隔件是间隔为100μm的间隔，则间隔件的填充因子是1％。如果在上述示例中，柱间隔件的底部是15μm×15μm的正方形形状，则填充因子仍是定义的1％。
[0502] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件具有柱状形状和几乎均匀的横截面。
[0503] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件间距(SD)等于或小于约120μm(微米)。
[0504] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件间距(SD)等于或小于约100μm(微米)。
[0505] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件间距(ISD)的四次方除以所述柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×106μm3/GPa或更小。
[0506] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件间距(ISD)的四次方除4 5 3
以所述柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD/(hE))为5×10μm/GPa或更小。
以所述柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD/(hE))为5×10μm/GPa或更小。
[0507] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件具有柱状形状、大致平坦的顶表面、预定的大致均匀的高度和预定的恒定间隔件间距离，间隔件间距离比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2MPa，其中填充因子是间隔件接触面积与总板面积的比率，且其中对于每一间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1(一)。
[0508] 如前述任一实施方案的方法或装置，其中间隔件具有柱状形状、大致平坦的顶表面、预定的大致均匀的高度和预定的恒定间隔件间距离，该间隔件间距离比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2MPa，其中该填充因子是该间隔件接触面积与该总板面积的比率，并且其中，对于每个间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1(一)，其中间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×106μm3/GPa或更小。
[0509] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中所述间隔件的间隔间距离与间隔件的平均宽度的比率为2或更大，且间隔件的填充因子乘以间隔件的杨氏模量为2MPa或更大。
[0510] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中分析物是蛋白质、肽、核酸、合成化合物或无机化合物。
[0511] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述样本是生物样本，所述生物样本选自羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆或血清)、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、呼吸、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿、唾液、呼出的冷凝物、皮脂、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物和尿液。
[0512] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中所述间隔件呈柱状且柱的宽度与高度的比率等于或大于1。
[0513] 如前述任一实施方案所述的方法，其中沉积在一个或两个板上的样本具有未知体积。
[0514] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中间隔件呈柱状，且柱具有大体上均匀的横截面。
[0515] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本用于检测、纯化和定量与某些疾病的阶段相关的化合物或生物分子。
[0517] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本涉及微生物的检测、纯化和定量。
[0518] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本涉及来自环境(例如，水、土壤或生物样本)的病毒、真菌和细菌。
[0519] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本涉及对食品安全或国家安全造成危害的化合物或生物样本(例如，有毒废物、炭疽)的检测、定量。
[0520] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本与医学或生理监视器中的生命参数的量化相关。
[0521] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本与葡萄糖、血液、氧水平、总血细胞计数相关。
[0522] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本与来自生物样本的特异性DNA或RNA的检测和定量相关。
[0523] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本与用于基因组分析的染色体和线粒体中DNA的遗传序列的测序和比较相关。
[0524] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本涉及例如在药物合成或纯化期间检测反应产物。
[0525] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本是细胞、组织、体液和粪便。
[0526] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本是人、兽医、农业、食品、环境和药物测试领域中的样本。
[0527] 如前述任一实施方案所述的方法或装置，其中样本是选自毛发、指甲、耳蜡、呼吸、结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织、软骨、癌样本或骨的生物样本。
[0528] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中间隔件间距在5m到120m的范围内。
[0529] 如前述任一实施方案所述的装置或方法，其中间隔件间距在120m到200m的范围内。
[0530] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中柔性板具有在20μm到250μm范围内的厚度和在0.1到5GPa范围内的杨氏模量。
[0531] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中对于柔性板，柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在60到750GPa-μm的范围内。
[0532] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在至少1mm2的横向区域上是均匀的。
[0533] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在至少3mm2的横向区域上是均匀的。
[0534] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在至少5mm2的横向区域上是均匀的。
[0535] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在至少10mm2的横向区域上是均匀的。
[0536] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在至少20mm2的横向区域上是均匀的。
[0537] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层在20mm2到100mm2范围内的横向区域上是均匀的。
[0538] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层具有高达+/-5％或更好的厚度均匀性。
[0539] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层具有高达+/-10％或更好的厚度均匀性。
[0540] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层具有高达+/-20％或更好的厚度均匀性。
[0541] 如前述任一装置实施方案所述的装置，其中均匀厚度样本层具有高达+/-30％或更好的厚度均匀性。
[0542] 本发明可用于需要测定样本中一种或多种分析物的存在与否和/或定量的各种领域中的各种不同应用。例如，本发明可用于检测原子、分子、蛋白质、肽、核酸、合成化合物、无机化合物、有机化合物、细菌、病毒、细胞、组织、纳米颗粒等。样本可以是各种领域的样本，包括但不限于人、兽医、农业、食品、环境、健康、保健、美丽等领域。
[0543] 本发明实施例
[0544] 一种用于执行数字测定的装置，包含：
[0545] 第一板、第二板和微孔，其中：
[0546] (e)所述第一板和所述第二板可相对于彼此移动成不同的构造，并且在其各自的表面上具有用于接触包含分析物的流体样本的样本接触区域；
[0547] (f)所述第二板在所述样本接触区域中具有多个微孔，其中每个微孔具有(i)预定和已知的几何形状，(ii)200μm或更小的孔深度，和(iii)具有基本上小于所述流体样本的体积，
[0548] 其中所述构造之一是开放构造，其中：所述第一板的内表面与所述第二板中的所述微孔的边缘之间的平均间距大于所述孔的深度，并且所述样本沉积在所述一个或两个板上；以及
[0549] 其中所述构造中的另一个是闭合构造，所述闭合构造是在所述样本沉积在所述开放构造之后的构造；在所述闭合构造中，所述样本的至少一部分在所述微孔内，并且所述第一板的内表面和所述第二板中微孔的边缘之间的平均间距小于1μm或小于所述微孔深度的1/10(十分之一)。
[0550] 一种设备，包含热循环仪和如实施方案1所述的装置。
[0551] 一种设备，包含热循环仪、如实施方案1所述的装置和用于实时PCR的读取器。
[0552] 一种用于分隔流体样本的方法，包含：
[0553] 获得如前述任一实施方案所述的装置或设备，
[0554] 当所述板是开放构造时，将所述样本沉积在所述一个或两个板上，其中所述沉积是所述样本的单个或多个液滴的形式，其中所述液滴中的至少一个具有占据两个以上微孔的体积；且关闭所述板至所述闭合构造以将所述样本分隔在所述微孔中。
[0555] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述分析物是蛋白质、肽、核酸、病毒、细菌、细胞、纳米颗粒、分子、合成化合物或无机化合物。
[0556] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含间隔件，所述间隔件经构造以调节所述第一板和所述第二板之间的间隔。
[0557] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含位于所述一个或两个板的内表面上的结合位点，其中所述结合位点包含固定在所述位点处的捕获剂，且所述捕获剂经构造以特异性捕获所述样本中的分析物。
[0558] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含表面扩增层，所述表面扩增层位于所述一个或两个板的所述内表面上，其中所述表面扩增层包含固定在所述位点处的捕获剂，且所述捕获剂被构造成特异性地捕获所述样本中的分析物，其中所述表面扩增层扩增来自所述分析物或附着于所述分析物的标记的光信号，当它们在所述表面扩增层附近时比在微米或更远外时扩增得更强。
[0559] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使得来自直接或间接结合到所述捕获剂的单个标记的所述光学信号可见。
[0560] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使得来自直接或间接结合到所述捕获剂的单个标记的所述光学信号可见。
[0561] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含处于所述板的紧密构造中的所述微孔中的试剂，其中当所述分析物与检测剂之间存在结合时，所述试剂将在所述孔中产生多个发光组分，而所述检测剂特异性地结合到所述分析物。
[0562] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中所述第一板与所述第二板之间的所述间隔经构造以使得所述目标分析物与所述捕获剂的饱和结合时间为300秒或更短。
[0563] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中所述第一板与所述第二板之间的所述间隔经构造以使得所述目标分析物与所述捕获剂的饱和结合时间为60秒或更短。
[0564] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中调整所述表面扩增层的所述扩增因子以使来自单个标记的所述光信号可见。
[0565] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是核酸。
[0566] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是蛋白质。
[0567] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是抗体。
[0568] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是适体。
[0569] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述捕获剂是适体。
[0570] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含存储位置，所述存储位置位于所述一个或两个板的所述内表面上，其中所述存储位置包含可溶于液体中的试剂。
[0571] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述试剂用于扩增所述样本中的分析物。
[0572] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述试剂通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述分析物。
[0573] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述试剂是检测剂。
[0574] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中针对预期目标分析物浓度构造每一孔的体积，使得加样的每一孔中的目标分析物的分布遵循泊松分布。
[0575] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中针对预期目标分析物浓度构造每一孔的体积，使得加样的每一孔中的目标分析物的分布平均为每2个孔、3个孔、5个孔、10个孔、20个孔、0个孔、50个孔、75个孔、100个孔、150个孔、200个孔、300个孔、500个孔、
1000个孔、2000个孔、10000个孔、100,000个孔，或在任何两个值的范围内一个目标分析物。
1000个孔、2000个孔、10000个孔、100,000个孔，或在任何两个值的范围内一个目标分析物。
[0576] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中优选针对预期目标分析物浓度来构造每一孔的体积，使得加样的每一孔中的目标分析物的分布平均为每10个孔、20个孔、0个孔、50个孔、75个孔、100个孔，或在任何两个值的范围内一个目标分析物。
[0577] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，所述第一板的内表面与所述第二板中的微孔的边缘之间的平均间距小于微孔深度的1/11(十一分之一)、1/20、1/30、1/40、1/50、1/100、1/300、1/500，或在任何两个值的范围内。
[0578] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，所述第一板的内表面与所述第二板中的微孔的边缘显著接触。
[0579] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中在所述闭合构造中，两个相邻孔之间的平均间隔小于5nm、10nm、30nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm，或在任何两个值的范围内。
[0580] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述微孔具有选自圆形、矩形、六边形和/或具有正方形、六边形和/或任何其他网格的任何其他多面体的形状。
[0581] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的所述孔具有至少1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或所述值中的任一者之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的间隔(平均孔到孔中心距离)。
[0582] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的孔具有1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm，或介于所述值中的任一者之间的范围；以及
10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的孔尺寸(平均长度或直径)。
10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的孔尺寸(平均长度或直径)。
[0583] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的所述孔具有至少1nm、10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或所述值中的任一者之间的范围；以及10nm至100nm、100nm至500nm、500nm至1μm、1μm至10μm或10μm至50μm的优选范围的深度。如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述孔具有(i)无金属涂层，(ii)在所述孔的底部(所述柱的顶部)上的金属涂层，(iii)在所述孔的侧壁(所述柱的侧部)上的金属涂层和/或(iv)在所述孔的底部和侧壁两者上的金属涂层。
[0584] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述金属是金、铝、银、铜、锡和/或其任何组合。
[0585] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，孔面积比(孔面积与表面的总面积的比)为40％到50％、50％到60％、60％到70％、70％到80％、80％到90％、90％到99％。
[0586] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中孔边缘到孔边缘的距离大于孔深度，这确保孔边缘到孔边缘的扩散时间长于孔边缘到孔底部的扩散时间。
[0587] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述孔的尺寸经设计以确保在所述分析过程期间不发生交叉反应。
[0588] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述第一板上的孔的数目远大于所述样本中的分子数目。
[0589] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1fM/μL，那么所述第一板上的总孔数为600的1到2倍、2到5倍、5到10倍、10到100倍、100到1000倍、1000到10000倍。
[0590] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1pM/μL，则所述第一板上的总孔数为600,000的1至2倍、2至5倍、5至10倍、10至100倍、100至1000倍、1000至10000倍。
[0591] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中如果所述分子浓度为约1nM/μL，那么所述第一板上的总孔数为600,000,000的1到2倍、2到5倍、5到10倍、10到100倍、100到1000倍、1000到10000倍。
[0592] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述孔的数目允许在闭合所述装置之后将不多于一个目标分子放置在孔中。
[0593] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述板中的至少一者包含扩增表面。
[0594] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含位于所述第一板与所述第二板之间的薄密封层，其中在闭合构造中，所述密封层经构造以防止一个微孔中的样本或分析物移动到其他微孔。
[0595] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述装置进一步包含夹具，其中在闭合构造中，所述实施方案经构造以防止一个微孔中的样本或分析物移动到其他微孔。
[0596] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述信号扩增层包括金属材料层。
[0597] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述信号扩增层包括金属材料层和位于所述金属材料层顶部的介电材料层，其中所述捕获剂位于所述介电材料上。
[0598] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述金属材料层是均匀金属层、纳米结构化金属层或组合。
[0599] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述扩增层包括金属材料层和在所述金属材料层顶部上的介电材料层，其中所述捕获剂在所述介电材料上，且所述介电材料层具有厚度为0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm、00nm、200nm、500nm、1000nm、2μm、3μm、5μm、10μm、20μm、30μm、50μm、100μm、200μm、500μm或在任何两个值的范围内。
[0600] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述样本整体沉积在所述一个或两个板上，且所述闭合步骤将所述样本扩散到所述微孔中的至少一些微孔上并扩散到所述微孔中的至少一些微孔中。
[0601] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含将所述样本一同沉积在板上、按压所述第二板并将所述样本分离到孔中、对加样的所述孔进行计数、计算所述样本的体积、用信号对所述孔进行计数，以及计算所述样本中所述分析物的浓度。
[0602] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含识别哪些孔未加样。
[0603] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含在所述板处于闭合构造时测量与所述微孔中的每一者中的目标分析物相关的信号的步骤。
[0604] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法包含扩增，其中所述扩增使所述分析物比未经所述扩增的分析物更可观察到，且其中所述扩增包含化学发光、发光、核酸扩增、ELISA(酶联免疫吸附测定)、使用等离子体结构的光增强或化学反应。
[0605] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含对包含所述目标分析物的孔的数目进行计数。
[0606] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中统计上每个孔将具有不多于一个目标分析物分子。
[0607] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中加样的每一孔中的目标分析物的分布遵循泊松分布。
[0608] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含确定所述样本中的所述目标分析物的浓度。
[0609] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述目标分析物是蛋白质、核酸、小分子、细胞或颗粒。
[0610] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述目标分析物是核酸，且所述方法包含扩增所述核酸。
[0611] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
[0612] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中使用结合分析来分析所述目标分析物。
[0613] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，进一步包含从所述装置洗涤未结合的目标分析物。
[0614] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法进一步包含：在所述两个板已闭合之后部分或完全分离所述两个板；冲洗所述原始样本或添加另一试剂；以及接着使所述板进入闭合构造的步骤。
[0615] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中使用海绵进行所述洗涤。
[0616] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法进一步包含对所述样本接触区域进行成像。
[0617] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像测量与来自所述样本接触区域的所述分析物相关的所述一次总和信号。
[0618] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像测量由捕获剂与捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的个别信号。
[0619] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述样本接触区域的所述成像测量(a)来自所述样本接触区域的与所述分析物相关的所述集总信号和(b)由捕获剂与捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的个别信号两者。
[0620] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中通过检测由捕获剂与所述捕获的目标分析物之间的所述个别结合事件引起的所述个别信号来确定所述样本中目标分析物的存在或浓度。
[0621] 如前述任一实施方案所述的装置、设备或方法，其中所述方法包括由(i)通过在明场图像中成像孔和/或通过在所述扩增步骤之前成像来识别所述空孔，以及(ii)通过在体积计算中减去所述空孔来量化所述分析物浓度，从而在确定所述实际样本体积时减去空孔。
[0622] 用途
[0623] 其中，本方法可用于检测和/或测量与疾病如癌症、感染或炎性疾病(参见，例如，WO2017058827的表1-3)、自身抗体表位(参见WO2017058827的表4)、变应原表位(参见WO2017058827的表5)、感染剂(参见，例如，WO2017058827的表6)、miRNA(参见，例如，WO2017058827的表7)、环境标记物(参见，例如，WO2017058827的表8)、食品标记物(参见，例如，WO2017058827的表9)、小分子，比如代谢物或药物(例如，THC-COOH(11-去甲-9-羧基-THC))、无细胞DNA(cfDNA)中的一种或多种分子，包括循环肿瘤DNA(ctDNA)、无RNA(cfRNA)细胞中的一种或多种分子，和细胞，例如，循环肿瘤细胞、病毒或细菌等。
[0624] 在一些实施方案中，样本是体液或其加工形式。尽管在本方法中可以使用几种其他体液，感兴趣的体液包括血浆、唾液和尿。体液包括但不限于羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆、血清等)、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物和尿液。在一些实施方案中，样本可以从受试者(例如，人)获得，并且可以在用于受试者测定之前进行处理。例如，在分析之前，可以在开始本方法之前从组织样本中提取蛋白质。在特定实施方案中，样本可以是临床样本，例如，从患者收集的样本。
[0625] 根据目标分析物，本发明方法可具有至少5fM、10fM、50fM、100fM、0.5pM、1pM、5pM、10pM、50pM、100pM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM或100nM的灵敏度。
[0626] 不希望束缚于任何特定用途，本方法在分析血浆中具有特定用途。血浆可以非侵入性获得，并且其含有诊断、预后或治疗性的多种不同的低丰度蛋白质(通常参见Anderson等人,Molecular&Cellular Proteomics 2002 1:845–867and Anderson et al.,Clinical Chemistry 2010 56:177–185)。因此，在一些实施方案中，本发明方法可用于定量血浆中下列蛋白中的任何一种或组合(例如，2、3、4、5或更多种)：酸性磷酸酶、IgG、丙氨酸转氨酶(ALT或SGPT)、IgM、白蛋白、抑制素-A、醛缩酶、胰岛素。碱性磷酸酶(ALP)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、α-1-酸性糖蛋白(血清类粘蛋白)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、α-1-抗胰蛋白酶、IGFBP-1、α-2-抗纤维蛋白溶酶、IGFBP-3、α-2-HS-糖蛋白、白介素-2受体(IL-2R)、α-2-巨球蛋白、异柠檬酸脱氢酶、α-甲胎蛋白(肿瘤标记物)、K轻链、淀粉酶、乳酸脱氢酶心脏部分(LDH-1)、淀粉酶、乳酸脱氢酶肝脏部分(LLDH)、ACE、乳铁蛋白、抗凝血酶III(ATIII)、A轻链、载脂蛋白A1、脂肪酶、载脂蛋白B、Lp(a)、天冬氨酸转氨酶(AST或SGOT)、脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)、3-2微球蛋白、LH、3-血栓球蛋白、溶菌酶、生物素酶、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、髓过氧化物酶(MPO)、癌抗原125(CA125)、肌红蛋白、癌抗原15-3(CA15-3)、骨钙蛋白、癌抗原、人附睾蛋白(HE4)、甲状旁腺激素、癌胚抗原(CEA)、磷酸己糖异构酶、血浆铜蓝蛋白、纤溶酶原、胆碱酯酶、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)、补体C1、前白蛋白、补体C1抑制剂、NTproBNP、补体C1Q、降钙素原(PCT)、补体C3、催乳素、补体C4、血清灭菌蛋白因子B、补体C5、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CRP、前列腺特异性抗原(PSA)、肌酸激酶-BB(CKBB)、蛋白C、肌酸激酶-MM(CKMM)、蛋白S、胱抑素C、假胆碱酯酶、红细胞生成素、丙酮酸激酶、因子IX抗原、肾素、因子X、视黄醇结合蛋白(RBP)、因子XIII、性激素结合球蛋白、铁蛋白、可溶性间皮素相关肽、纤维蛋白原、山梨糖醇脱氢酶(SDH)、纤连蛋白、甲状腺球蛋白、FSH、TSH、GGT、甲状腺素结合球蛋白(TBG)、触珠蛋白、组织纤溶酶原激活物(T-PA)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、转铁蛋白、血红素结合蛋白、转铁蛋白受体(TFR)、her-2/neu蛋白、肌钙蛋白T(TnT)；人生长激素(HGH)、TnI(心脏)、人胎盘催乳素(HPL)、胰蛋白酶、IgA、尿激酶、IgD、冯维勒布兰德因子、IgE、核苷酸酶、IgG亚类4、ADAMTS13活性和抑制剂、抑制素B(不育)、腺苷脱氨酶、IGFBP-2、脂联素、细胞间粘附分子1、垂体糖蛋白激素亚基、干扰素-βα-半乳糖苷酶、干扰素-α、EIA、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、白介素-1受体拮抗剂、淀粉样蛋白13-蛋白、白介素-1可溶性受体II型、血管紧张素原、白介素-1α、抗米勒激素(AMH)、白介素-
113、3-葡糖醛酸糖苷酶、白介素-2、3-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、白介素-3、钙卫蛋白、白介素-4、癌抗原72-4、白介素-5缩胆囊素、白介素-6、补体C2、白介素-7、补体C4结合蛋白、白介素-8、补体C6、白介素-9、补体C7水平、白介素-10、补体C8水平、白介素-11、补体C9水平、白介素-12、皮质类固醇结合球蛋白(皮质素传递蛋白)、白介素-13、CYFRA21-1(可溶性细胞角蛋白片段)、白介素-14、多巴脱羧酶、白介素-15、弹性蛋白酶、白介素-16、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、白介素-17、表皮生长因子、白介素-18、表皮生长因子受体(EGFR)、激肽释放酶、因子II、瘦素、因子V、亮氨酸氨肽酶、因子VII、甘露糖结合凝集素、因子VIII、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、因子XI、神经生理素、因子XII、胰抑制素、成纤维细胞生长因子(FGF2)、胃蛋白酶原I、胃抑制多肽(GIP)、胃蛋白酶原II、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、谷胱甘肽过氧化物酶、蛋白酶体活性、基于血浆的Leumeta、粒细胞集落刺激因子、S-100B蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、可溶性CD30、生长激素结合蛋白；鳞状细胞癌抗原、血红蛋白、促甲状腺素释放激素(TRH)、肝素辅因子II、转化生长因子-131、氨基己糖苷酶A和总氨基己糖苷酶、肿瘤坏死因子受体1、高分子量激肽原、肿瘤坏死因子受体2、人生长激素释放激素(HGH-RH)、肿瘤坏死因子-α、IgG亚类1、肿瘤坏死因子-13、IgG亚类2、血管内皮生长因子(VEGF)、IgG亚类3和维生素D结合蛋白。
113、3-葡糖醛酸糖苷酶、白介素-2、3-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、白介素-3、钙卫蛋白、白介素-4、癌抗原72-4、白介素-5缩胆囊素、白介素-6、补体C2、白介素-7、补体C4结合蛋白、白介素-8、补体C6、白介素-9、补体C7水平、白介素-10、补体C8水平、白介素-11、补体C9水平、白介素-12、皮质类固醇结合球蛋白(皮质素传递蛋白)、白介素-13、CYFRA21-1(可溶性细胞角蛋白片段)、白介素-14、多巴脱羧酶、白介素-15、弹性蛋白酶、白介素-16、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、白介素-17、表皮生长因子、白介素-18、表皮生长因子受体(EGFR)、激肽释放酶、因子II、瘦素、因子V、亮氨酸氨肽酶、因子VII、甘露糖结合凝集素、因子VIII、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、因子XI、神经生理素、因子XII、胰抑制素、成纤维细胞生长因子(FGF2)、胃蛋白酶原I、胃抑制多肽(GIP)、胃蛋白酶原II、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、谷胱甘肽过氧化物酶、蛋白酶体活性、基于血浆的Leumeta、粒细胞集落刺激因子、S-100B蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、可溶性CD30、生长激素结合蛋白；鳞状细胞癌抗原、血红蛋白、促甲状腺素释放激素(TRH)、肝素辅因子II、转化生长因子-131、氨基己糖苷酶A和总氨基己糖苷酶、肿瘤坏死因子受体1、高分子量激肽原、肿瘤坏死因子受体2、人生长激素释放激素(HGH-RH)、肿瘤坏死因子-α、IgG亚类1、肿瘤坏死因子-13、IgG亚类2、血管内皮生长因子(VEGF)、IgG亚类3和维生素D结合蛋白。
[0627] 显然，该方法也可用于识别临床样本中的微生物(例如，细菌或病毒)病原体，例如，细胞表面蛋白或分泌蛋白。在这些实施方案中，捕获剂可以靶向来自病原体的蛋白质或其他部分。如果检测到圆圈，则可以将受试者诊断为被该病原体感染。可以使用本方法，组合物和试剂盒识别的微生物包括但不限于：病毒、酵母、革兰氏(+)细菌、革兰氏(-)细菌、肠杆菌科细菌、肠球菌属细菌、葡萄球菌属细菌和弯曲杆菌属细菌、大肠杆菌(E.coli)、各种菌株的大肠杆菌(E.coli)，比如，K12-MG1655、CFT073,O157：H7ED1933,O157：H7VT2-Sakai等，肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、多种念珠菌属物种包括白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、维斯假丝酵母、近平滑念珠菌、肺炎克雷伯氏菌，多种分枝杆菌属比如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡介菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、龟分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、分枝杆菌噬菌体、猿分支杆菌、偶发分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、肠炎分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、非洲分枝杆菌、李斯特氏菌属物种、衣原体属物种、支原体属物种、沙门氏菌属物种、布鲁氏菌属物种、耶尔森氏菌属物种等。因此、本方法能够将微生物识别到微生物的属、种、亚种、菌株或变体的水平。
[0628] 在一些实施方案中，该方法的结果可以是诊断性的(例如，可以提供疾病或病症或疾病或病症的类型或阶段等的诊断)、预后性的(例如，指示临床结果，例如，在时间范围内存活或死亡)或治疗性的(例如，指示哪种治疗将是最有效的)。在一些实施方案中，该方法可用于分析一组1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种分析物，该分析物相对于对照(例如，内部对照)独立地以较高浓度或较低浓度存在，其中该分析物的身份和它们的丰度共同与表型相关。
[0629] 该方法可用于分析患者样本。在该实施例中，该方法可以包括：(a)使用上述方法定量样本中的一种或多种分析物，和(b)提供指示与表型相关的报告。该实施例可以进一步包含基于该报告做出诊断、预后或治疗。该报告可指示分析物的正常范围。
[0630] 在一些实施方案中，该方法可以包括创建如上所述的报告(其电子形式可以从远程位置转发)并且将该报告转发到医生或其他医学专业人员以确定患者是否具有表型(例
如，癌症等)或者识别用于患者的合适疗法。该报告可用作诊断以确定受试者是否患有疾病或病症，例如，癌症。在某些实施方案中，该方法可用于确定癌症的阶段或类型、识别转移的细胞，或监测患者对治疗的反应。
如，癌症等)或者识别用于患者的合适疗法。该报告可用作诊断以确定受试者是否患有疾病或病症，例如，癌症。在某些实施方案中，该方法可用于确定癌症的阶段或类型、识别转移的细胞，或监测患者对治疗的反应。
[0631] 在任何实施例中，可将报告转发到“远程位置”，其中“远程位置”意指不同于检查图像的位置的位置。例如，远程位置可以是同一城市中的另一位置(例如，办公室、实验室等)，不同城市中的另一位置、不同州中的另一位置、不同国家中的另一位置等。这样，当一个项目被指示为“远离”另一个项目时，意味着两个项目可以在相同的房间中但是分开，或者至少在不同的房间或不同的建筑物中，并且可以相隔至少一英里，十英里或至少一百英里。“通信”信息是指通过适当的通信信道(例如，专用或公共网络)将表示该信息的数据作为电信号发送。“转发”物品是指将该物品从一个位置带到下一个位置的任何方式，无论是通过物理地传送该物品还是以其他方式(在可能的情况下)，并且至少在数据的情况下包括物理地传送携带数据的介质或传送数据。通信介质的示例包括无线电或红外传输信道以及到另一计算机或联网设备的网络连接，以及因特网或电子邮件传输和记录在网站等上的信息。在某些实施方案中，可以由MD或其他有资格的医学专业人员分析报告，并且可以将基于图像分析结果的报告转发给从中获得样本的患者。
[0632] 附注：
[0633] 在以下列举的段落中描述了根据本公开的发明主题的其他实施例。
[0634] 必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示对象，除非上下文另外明确指出，例如当使用词语“单个”时。例如，提及“分析物”包括单个分析物和多个分析物，提及“捕获剂”包括单个捕获剂和多个捕获剂，提及“检测剂”包括单个检测剂和多个检测剂，提及“试剂”包括单个试剂和多个试剂。
[0635] 如本文所用，术语“适于”和“构造”意味着元件、部件或其他主题被设计和/或旨在执行给定功能。因此，术语“适于”和“构造”的使用不应被解释为意味着给定的元件、组件或其他主题简单地“能够”执行给定的功能。类似地，被陈述为构造为执行特定功能的主题可以附加地或可选地描述为可操作以执行该功能。
[0636] 如本文所用，当在提及根据本公开的一个或多个部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法时，使用短语“例如”、短语“作为示例”和/或简称为术语“示例”和“示例性”旨在传达所描述的部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法是根据本公开的部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法的说明性的非排他示例。因此，所描述的部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法不旨在是限制性的、必需的或排他性的/穷尽的；并且其他部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法，包括结构上和/或功能上类似和/或等效的部件、特征、细节、结构、实施方案和/或方法，也在本公开的范围内。
[0637] 如本文所用，关于多于一个实体的列表的短语“至少一个”和“一个或多个”是指实体列表中的任何一个或多个实体，并且不限于实体列表中具体列出的每个(each)和每个(every)实体中的至少一个。例如，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地，“A和/或B中的至少一个”)可指单独的A、单独的B，或A和B的组合。
[0638] 如本文所用，置于第一实体和第二实体之间的术语“和/或”是指(1)第一实体，(2)第二实体，以及(3)第一实体和第二实体中的一个。使用“和/或”列出的多个实体应当以相同的方式来解释，即如此结合的实体的“一个或多个”。除了由“和/或”子句具体标识的实体之外，可以任选地存在其他实体，无论其与具体标识的那些实体相关还是无关。
[0639] 当本文提及数值范围时，本发明包括其中包括端点的实施方案、其中排除两个端点的实施方案、以及其中包括一个端点而排除另一个端点的实施方案。应当假定包括两个端点，除非另有说明。此外，除非另有说明或本领域普通技术人员从上下文和理解中明显看出。
[0640] 在任何专利、专利申请或其他参考文献通过引用并入本文并且(1)定义术语的方式与本公开的未并入部分或其他并入的参考文献不一致和/或(2)以其他方式与本公开的
未并入部分或其他并入的参考文献不一致的情况下，应当以本公开的未并入部分为准，并且术语或其中并入的公开应当仅对于其中术语被定义和/或并入的公开最初存在的参考文献为准。
未并入部分或其他并入的参考文献不一致的情况下，应当以本公开的未并入部分为准，并且术语或其中并入的公开应当仅对于其中术语被定义和/或并入的公开最初存在的参考文献为准。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种酶联免疫吸附试验装置 | 2020-05-12 | 822 |
| DNA免疫吸附剂及其制备方法 | 2020-05-12 | 470 |
| 蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺 | 2020-05-13 | 691 |
| 血液内病毒免疫吸附清除系统 | 2020-05-13 | 193 |
| 犬粪抗原检测酶联免疫吸附试剂盒 | 2020-05-13 | 878 |
| 一种改良蛋白A免疫吸附柱 | 2020-05-14 | 196 |
| 蛋白A免疫吸附材料及其制备方法 | 2020-05-14 | 658 |
| 一种高灵敏度酶联免疫吸附分析方法 | 2020-05-14 | 940 |
| 球形纤维素DNA免疫吸附剂 | 2020-05-15 | 607 |
| 酶联免疫吸附测定溶液系统 | 2020-05-15 | 701 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈