千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用
阅读：401发布：2023-03-05
专利汇可以提供千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，涉及千金子素1(EuphoriafactorL1,EFL1)作为 肿瘤 多药耐药逆转剂的应用，特别是与抗肿瘤药物合用 治疗 多药耐药肿瘤，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，本发明还涉及千金子素1逆转肿瘤多药耐药性的机制，即通过增强肿瘤细胞内ABCB1的ATP酶活性、抑制ABCB1的外排功能，逆转由ABCB1所介导肿瘤细胞的MDR；不降低MDR细胞中mRNA或 蛋白质 水 平上的ABCB1表达。，下面是千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用专利的具体信息内容。
1.千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，所述的肿瘤多药耐药逆转为ABCB1所介导的。
2.千金子素1在制备抑制肿瘤细胞ABCB1外排抗肿瘤药物的制剂方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的抗肿瘤药物为长春碱类、蒽环类、表鬼臼毒素、紫杉醇中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞人口底癌耐药细胞、乳腺癌耐药细胞或慢性粒细胞白血病耐药细胞。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为KBv200、MCF-7/adr、K562/ADR、或K562/A02。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为人口底癌细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为人口底癌KBv200细胞。
8.千金子素1在制备ABCB1特异性抑制剂方面的应用。
9.千金子素1在制备肿瘤细胞ATP 酶活性增强剂方面的应用。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为KBv200、MCF-7/adr、K562/ADR、或K562/A02中的一种或多种。
千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域,涉及千金子素1(Euphoria factor L1, EFL1)在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，特别是与抗肿瘤药物合用治疗多药耐药肿瘤，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，本发明还涉及千金子素1逆转肿瘤多药耐药性的机制。
背景技术
[0002] 肿瘤细胞对一种抗癌药物出现耐药的同时，对其他结构不同、作用机制不同的抗癌药物也产生耐药的现象称为多药耐药性（multidrug resistance, MDR）。MDR 是肿瘤化疗失败的主要原因，也是化疗领域亟需解决的难题。MDR 通常是由 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白过度表达介导产生的，ABC 转运蛋白可水解 ATP 并借由水解产生的能量将抗癌药物外排出肿瘤细胞。人类基因组中已经发现有48种不同的膜转运蛋白，并根据序列相似性分为7个亚家族(A-G)。其中，介导产生 MDR 的 ABC 转运蛋白超家族主要成员包括 ABC 转运蛋白 B 亚家族成员1 (ABCB1；P-糖蛋白)、ABC 转运蛋白 C 亚家族成员 (ABCCs，MDR 相关蛋白) 以及 ABC 亚家族 G 成员2 (ABCG2，乳腺癌耐药蛋白，米托蒽醌耐药蛋白，胎盘特定 ABC 转运蛋白)。这些转运蛋白高度差异，但均能识别和泵出大量结构不同的药物，而这些药物主要为疏水化合物。一般来说，除了某些转运蛋白的底物特异性重复外，每种转运蛋白均特定转运其对应的药物。经 ABCB1 转运的药物包括不带电或稍带电的疏水化合物，这其中包括大多数的化疗药物如长春碱类、蒽环类、表鬼臼毒素、紫杉醇。ABCB1 (P-gp) 高表达而导致的 MDR 被称为典型 MDR，也是临床上最重要、最常见的导致肿瘤化疗失败的原因。
[0003] 为了克服 MDR，研究人员致力于寻找 MDR 逆转剂，以提高或恢复耐药肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，这是可行的逆转 MDR 策略。已有 MDR 逆转剂进入了临床试验，若研发成功并用于临床，将有望改善化疗面临的耐药困境。
[0004] 传统中药千金子是大戟科植物续随子 Euphorbia lathyris L. 的干燥种子，具有逐水消肿、破癥杀虫的功效，有小毒。研究发现，千金子中的二萜类成分具有一定的抗肿瘤、逆转 ABCB1 介导的 MDR 活性。千金子中的二萜类成分复杂，已有文献报道的有12种化合物，结构类型各异，如千金子二萜醇、环氧千金子二萜醇以及它们的生源重排产物，各种化合物含量高低不同，化学性质与生理活性也不相同。除此，还存在多种尚未被纯化和鉴定出来的化合物。由于尚不明确千金子中逆转 ABCB1介导的肿瘤多药耐药的主要成分，并且对其机制缺乏研究，目前，利用目前中药千金子来制备肿瘤耐药逆转剂的效率不高。并且，由于千金子的不同有效部位可能具有一定的毒性作用，在逆转效率不高的情况下，很难在低浓度用药的情况下，来获得逆转抗癌药物外排的效果。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种有效的肿瘤多药耐药逆转剂。
[0006] 发明提供了千金子素1在制备肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用，所述的肿瘤多药耐药逆转为ABCB1所介导的。
[0007] 千金子素1 (Euphoria factor L1 , EFL1)结构式如式1所示。
[0008] 式1发明公开并保护了千金子素1在制备抑制肿瘤细胞ABCB1外排抗肿瘤药物的制剂方面的应用。
[0009] 优选地，所述的抗肿瘤药物为长春碱类、蒽环类、表鬼臼毒素、紫杉醇中的一种或多种。
[0010] 所述的肿瘤细胞为高表达ABCB1的耐药肿瘤细胞，包括人口底癌耐药细胞、乳腺癌耐药细胞、慢性粒细胞白血病耐药细胞等。作为其中的一些实施方案，所适用的肿瘤细胞包括例如人口底癌耐药细胞KBv200、乳腺癌耐药细胞MCF-7/adr、慢性粒细胞白血病耐药细胞K562/ADR、K562/A02等。
[0011] 作为更优选的方案，所述的肿瘤细胞为人口底癌细胞。发明人发现，作用于人口底癌耐药细胞KBv200是，本发明的逆转效果最为明显。
[0012] 发明发现，在某些细胞中，千金子素1对ABCB1的外排作用的抑制非常明显，这可能是因为不同细胞中的ABCB1表达量及外排活性的差异，从而导致千金子素1产生或强或弱的抑制效果。
[0013] 除此，发明发现，抗癌药物作为ABCB1识别的底物，结构不同导致被识别转运的程度不同。而对ABCB1外排不同的抗癌药物，抗癌药物本身的结构差异，也会影响千金子素1影响ABCB1所能发挥出来的逆转作用的程度。其中，逆转效果最佳的是长春新碱，当千金子素1以10.0 μM的浓度存在时，其逆转长春新碱外排的倍数可达到25；而逆转经阿霉素外排的倍数也可达到10倍。而对于有些药物，如秋水仙碱、伊马替尼，尽管他们也是ABCB1识别的底物，但是，千金子素1对他们的逆转外排倍数并不高。
[0014] 发明人进一步发现，千金子素1是通过增强肿瘤细胞中ABCB1的ATP酶活性、抑制ABCB1的外排作用来逆转肿瘤多药耐药，而不下调ABCB1在mRNA和蛋白质水平的表达。千金子素1与传统抗癌药物合用可恢复多药耐药肿瘤细胞对传统抗癌药物的敏感性。
[0015] 千金子素1用作肿瘤多药耐药逆转剂，通过增强肿瘤细胞中ATP酶的活性、抑制 ABCB1 的外排功能，逆转由 ABCB1所介导肿瘤细胞的MDR，恢复MDR肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，应用于临床化疗耐药的病人联合化疗或预防肿瘤细胞耐药性产生。
[0016] 本发明以多药耐药细胞株及其相应的敏感株，包括KB细胞、以长春新碱(VCR)诱导的ABCB1过度表达的KBv200细胞、乳腺癌MCF-7细胞、经阿霉素(DOX)诱导的ABCB1过度表达的MCF-7/adr细胞为模型，研究千金子素1逆转MDR的作用及机制。结果表明千金子素1具有逆转KBv200和MCF-7/adr细胞中由ABCB1介导的MDR的活性，却不改变KB和MCF-7细胞对化疗药物的敏感性。千金子素1可显著增加阿霉素和罗丹明123在KBv200和MCF-7/adr细胞的积累，而对KB和MCF-7细胞的积累没有明显影响。千金子素1还可以增强由维拉帕米激活的ABCB1的ATP水解活性，可抑制KBv200和MCF-7/adr细胞ABCB1的外排功能，与此同时却不降低KBv200和MCF-7/adr细胞中mRNA或蛋白质水平的ABCB1表达。抑制ABCB1的外排功能而不抑制其表达，这在治疗中有起效快的优势。
[0017] 发明同时发现，千金子素1可应用于制备肿瘤细胞的ABCB1的特异性抑制剂。
[0018] 千金子素1可应用于制备肿瘤细胞ATP 酶活性增强剂。所述的肿瘤细胞为高表达ABCB1的耐药肿瘤细胞，例如KBv200、MCF-7/adr、K562/ADR、或K562/A02等。
[0019] 千金子二萜类成分千金子素1 (Euphoria factor L1 , EFL1)可有效逆转 ABCB1 介导的 MDR ，恢复 ABCB1 介导的 MDR 细胞对传统抗癌药物的敏感性，其作用机制是增强肿瘤细胞中 ATP 酶的活性、抑制 ABCB1 的外排作用，而不下调 ABCB1 在 mRNA 和蛋白质水平的表达。由此，千金子素1可能具有作为临床肿瘤多药耐药逆转剂的应用前景。
[0021] 图1. 千金子素1对KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/adr细胞的IC50值曲线；图2.千金子素1对KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/adr细胞内阿霉素(DOX)蓄积的影响(*P<0.05;**P<0.01)；
图3.千金子素1对KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/adr细胞内罗丹明123(Rh123)蓄积的影响(*P<0.05;**P<0.01)；
图4.千金子素1对KBv200、MCF-7/adr细胞内mRNA和蛋白质水平的ABCB1表达没有影响；
图5.千金子素1对ABCB1的ATP酶活性的影响；
图6.千金子素1抑制KBv200、MCF-7/adr细胞内ABCB1的外排功能，对KB、MCF-7细胞的ABCB1外排功能没有影响。
图3.千金子素1对KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/adr细胞内罗丹明123(Rh123)蓄积的影响(*P<0.05;**P<0.01)；
图4.千金子素1对KBv200、MCF-7/adr细胞内mRNA和蛋白质水平的ABCB1表达没有影响；
图5.千金子素1对ABCB1的ATP酶活性的影响；
图6.千金子素1抑制KBv200、MCF-7/adr细胞内ABCB1的外排功能，对KB、MCF-7细胞的ABCB1外排功能没有影响。
具体实施方式
[0022] 以下结合实施例对本发明技术方案作进一步的阐释。
[0023] 实施例1 千金子素1逆转体外ABCB1介导的MDRo
取对数生长期的细胞接种到96 孔板，培养24 h后加入不同浓度逆转剂在37 C培养
1 h，再加入不同浓度的抗癌药物。耐药倍数=耐药细胞对抗癌药物的IC50 值/敏感细胞对抗癌药物的IC50 值；逆转倍数=无逆转剂时细胞对抗癌药物的IC50 值/在逆转剂存在时细胞对抗癌药物的IC50 值。结果如表1、图1所示。
取对数生长期的细胞接种到96 孔板，培养24 h后加入不同浓度逆转剂在37 C培养
1 h，再加入不同浓度的抗癌药物。耐药倍数=耐药细胞对抗癌药物的IC50 值/敏感细胞对抗癌药物的IC50 值；逆转倍数=无逆转剂时细胞对抗癌药物的IC50 值/在逆转剂存在时细胞对抗癌药物的IC50 值。结果如表1、图1所示。
[0024] 表1 千金子素1 逆转肿瘤细胞由 ABCB1介导的MDR 的作用以上结果表示千金子素1具有强的逆转肿瘤细胞MDR作用，与传统的抗癌药物合用，可恢复抗癌药物的敏感性。因此，临床上，可作为MDR逆转剂，增加化疗的敏感性，提高化疗疗效。
[0025] 实施例2 千金子素1增加MDR细胞内抗癌药物的积累o
取对数生长期的细胞接种到6 孔板，培养24 h 后加入不同浓度逆转剂在37 C培养
3 h，然后加入终浓度为10 μM 的阿霉素(DOX) 继续培养3 h，或加入终浓度为5 μM 的罗丹明123 (Rh123) 继续培养30 min，收集细胞，冰冷PBS 洗2 次，制成单细胞悬液进行流式细胞仪检测分析。结果如图2、3所示，千金子素1能剂量依赖性增加抗癌药物DOX 和Rh123 在KBv200及MCF-7/adr 细胞中的积累，而对相应的敏感细胞KB及MCF-7 的DOX 和Rh123 积累均无影响。
取对数生长期的细胞接种到6 孔板，培养24 h 后加入不同浓度逆转剂在37 C培养
3 h，然后加入终浓度为10 μM 的阿霉素(DOX) 继续培养3 h，或加入终浓度为5 μM 的罗丹明123 (Rh123) 继续培养30 min，收集细胞，冰冷PBS 洗2 次，制成单细胞悬液进行流式细胞仪检测分析。结果如图2、3所示，千金子素1能剂量依赖性增加抗癌药物DOX 和Rh123 在KBv200及MCF-7/adr 细胞中的积累，而对相应的敏感细胞KB及MCF-7 的DOX 和Rh123 积累均无影响。
[0026] 实施例3 千金子素1对ABCB1在mRNA和蛋白质水平上的表达没有影响Western blot检测蛋白表达水平；提取mRNA、RT-PCR 并电泳检测以分析ABCB1 的mRNA 表达水平。结果如图4所示，千金子素1不影响mRNA和蛋白质水平上ABCB1的表达，这表明千金子素1逆转ABCB1介导的MDR的机制不是降低ABCB1的表达。
[0027] 实施例4 千金子素1增强ABCB1的ATP酶活性TM
购买Promega 的Pgp-Glo 检测试剂盒，按说明书进行，检测千金子素1调控ABCB1中ATP酶的活性。结果如图5所示，千金子素1剂量依赖性地增强ATP酶活性。
购买Promega 的Pgp-Glo 检测试剂盒，按说明书进行，检测千金子素1调控ABCB1中ATP酶的活性。结果如图5所示，千金子素1剂量依赖性地增强ATP酶活性。
[0028] 实施例5 千金子素1抑制MDR细胞内抗癌药物的外排取对数生长期的细胞接种到6 孔板，培养24 h 后加入终浓度为5 μM的Rh123 培养o
2 h，以冰冷PBS 洗2 次，再以不含Rh123 的培养液继续在37 C孵育（含或不含逆转剂），在不同的时间点以流式细胞仪检测细胞内Rh123 水平。结果如图6所示，千金子素1可有效地抑制ABCB1的外排功能。
2 h，以冰冷PBS 洗2 次，再以不含Rh123 的培养液继续在37 C孵育（含或不含逆转剂），在不同的时间点以流式细胞仪检测细胞内Rh123 水平。结果如图6所示，千金子素1可有效地抑制ABCB1的外排功能。
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