降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用
阅读：565发布：2023-03-05
专利汇可以提供降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且降低 农药 霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用，涉及一种降低农药残留的基因及其应用。降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本 发明 可用于降低农药霜霉威残留的转基因 植物 品系的构建。，下面是降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用专利的具体信息内容。
降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种降低农药残留的基因及其应用。
背景技术
[0002] 黄瓜是中国的大宗蔬菜之一，在全国各地均有栽培，且以设施栽培为主。由于设施环境的特殊小气候及周年生产、连作等原因导致黄瓜生产中极易发生霜霉病。黄瓜霜霉病从幼苗到成株过程中均可发生，严重时可造成20％～40％产量损失。农药霜霉威是一种可有效防治黄瓜霜霉病的低毒杀菌剂，因此，目前大量使用霜霉威进行防治。但由于霜霉威存在一定的挥发性和内吸性，使用过程中会污染环境且极易在黄瓜果实内积蓄形成农药残留。农药残存在黄瓜中可视为一种神经性毒物，严重危害人体健康。已有动物实验证实了该农药确实具有致癌作用。
发明内容
[0003] 本发明为了进一步降低残留农药霜霉威对人体的伤害，而提供了一种降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用。
[0004] 本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005] 本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG在构建低农药残留品系转基因植物中的应用；所述的降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007] 本发明基因CsMAPEG组成性表达，且具有品种差异性和组织差异性，能积极响应霜霉威胁迫，可能对霜霉威胁迫具有一定的耐受性，并参与降低植株体内的霜霉威残留量。本发明可用于降低农药霜霉威残留的转基因植物品系的构建。附图说明
[0010] 图3是基因CsMAPEG编码的蛋白质跨膜区域预测图；
[0011] 图4是基因CsMAPEG编码的蛋白质二级结构预测图；
[0012] 图5是基因CsMAPEG编码的蛋白质三级结构预测图；
[0013] 图6是基因CsMAPEG编码的蛋白质构建的系统进化树；
[0014] 图7是基因CsMAPEG亚细胞定位图；
[0015] 图8是具体实施方式二中转基因T0代黄瓜与野生型黄瓜果实中霜霉威残留量检测图；
[0016] 图9是具体实施方式二中转基因T1代黄瓜与野生型黄瓜果实中霜霉威残留量检测图。
具体实施方式
[0017] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0018] 具体实施方式一：本实施方式降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0019] 黄瓜低农药残留品种D0351果实的cDNA为模板进行PCR扩增，上游引物CsMAPEG-F:ATGGCCGCAATCCAGCTTCTC，下游引物CsMAPEG-R:TTAATGACGAAGAAGCTTAACACCGAAC。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增出的条带测序，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，被命名为CsMAPEG，全长为438bp，起始密码子为ATG、终止密码子为TGA的完整开放阅读框，共编码145个氨基酸。CsMAPEG编码的蛋白预测理论分子量为16.486KDa，理论等电点为9.66，原子组成为C775H1193N189O186S11，原子总数2354，脂肪系数为104.83。基因CsMAPEG编码的氨基酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的比对结果显示该蛋白带有MAPEG结构域，属于MAPEG superfamily家族蛋白，被命名为CsMAPEG蛋白。
[0020] 对基因CsMAPEG编码的蛋白进行亲疏水性预测结果如图1所示，第16个氨基酸位置有最高疏水值2.944，第67个氨基酸位置有最大亲水值-2.122，平均亲水系数为-0.538，为亲水蛋白。
[0021] 利用SignalP程序分析基因CsMAPEG编码的蛋白质(如图2所示)，结果发现检测不到明显的信号肽切割位点，说明该蛋白质可能是细胞质基质或细胞器基质中的蛋白质，不属于膜蛋白或分泌蛋白。使用在线生物软件TMHMM对基因CsMAPEG编码的蛋白质进行跨膜区域预测，结果显示有3个明显的跨膜区域(如图3所示)。采用SOPMA软件分析了基因CsMAPEG编码的蛋白质的二级结构(如图4所示)，结构表明有83个α螺旋，占整个多肽链的57.24％；20个延伸主链，占整个多肽链的13.79％；36个无规卷曲，占整个多肽链的24.83。将基因CsMAPEG编码的蛋白全序列提交到蛋白同源建模Phyre，预测蛋白质三级结构(如图5所示)。
[0022] CsMAPEG蛋白输入MEGA软件Neighbor-joining法构建系统进化树(如图6所示)，表明CsMAPEG蛋白与甜瓜Cucumis melo L.(XM 008462283.2)同源性最高。
[0023] 构建CsMAPEG与GFP融合表达载体：设计带有XmaⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物扩增基因CsMAPEG，获得去掉终止密码子的CsMAPEG开放读码框，其中引物序列为CsMAPEG-LF:CGGGATCCATGGCCGCAATCCAGCTTCTC和CsMAPEG-LR:CCCCCCGGGTAATGACGAAGAAGCTTAACACCGAAC。用去掉终止密码子的CsMAPEG开放读码框构建pEASY-T3-CsMAPEG载体，转化至Trans1-T1大肠杆菌中并鉴定测序，将pEASY-T3-CsMAPEG瞬时表达载体质粒和pGII-eGFP载体质粒用快速内切酶XmaⅠ和BamHⅠ双酶切，胶回收得纯化产物，将目的基因片段与载体片段用T4连接酶连接，获得融合表达载体CsMAPEG-pGII-EGFP，转化至Trans1-T1大肠杆菌中并鉴定。在转入空载体的整个细胞中可见明亮的绿色荧光，而在转入CsMAPEG-pGII-EGFP融合表达载体绿色荧光只富集在细胞质中，由此可见CsMAPEG蛋白主要存在于细胞质上(如图7所示)。
[0024] 具体实施方式二：本实施方式降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG在构建低农药残留品系转基因植物中的应用；所述的降低农药霜霉威残留基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0025] 用基因CsMAPEG和PCXSN-1250载体(XcmⅠ单酶切)构建载体PCXSN-CsMAPEG再转化大肠杆菌，通过菌液PCR及测序鉴定构建PCXSN-CsMAPEG正义表达载体，之后采用冻融法将构建的表达载体转入根癌农杆菌LBA4404中，侵染黄瓜子叶节。然后采用“Farkas M H,Berry J O.Chlortetracycline detoxification in maize via induction of Glutathione S-transferases after antibiotic exposure[J].Environ Sci Technol.2007,1450-1456.”中遗传转化技术，用含1.0mg/L草甘膦的MS培养基筛选，获得T0代转基因黄瓜；T0代植株自交授粉获得转基因T1代转基因黄瓜种子，并以非转基因黄瓜高农药残留品种D9320植株作为对照，分别在幼苗长到“三叶一心”时使用喷雾法接种多主棒孢霉菌于黄瓜叶片，接种浓度为1×105个分生孢子/mL。于第10节位商品瓜成熟时对植株喷施400倍稀释的霜霉威盐酸盐溶液，对照组喷施相同的霜霉威盐酸盐溶液，均以喷施到叶片叶缘滴液为度。喷施处理后1h、6h、12h、24h、48h、72h取样，进行霜霉威残留量检测分析。
[0026] 称取待检测样品12.5g(用剪刀剪碎，然后准确称取样品，可以置于-20℃保存)，然后向待检测样品中加入25ml的乙腈，匀质2min，静置0.5h；之后将其中的乙腈提取到含有3g NaCl的离心管涡旋1min，直接离心；再取上清5ml，于60℃水浴，将乙腈蒸干，蒸干后用2.5ml丙酮溶解，过有机相滤膜(0.22，2个套用)后装小瓶(500～1000ul)备用。将上述小瓶盛装的溶液均稀释50倍后再装一批小瓶，用气质联用仪进行检测。其中，过完滤膜的溶液要澄清，无颗粒，可将过完滤膜的溶液静止数分钟后观察是否浑浊，若有颗粒需要再次过膜，直到澄清。
[0027] 测定果实中霜霉威残留量：
[0028] 结果表明在转基因(T0和T1代转基因黄瓜)和野生型(对照组黄瓜)果实中霜霉威残留量变化模式相同，残留量随时间变化先增加再减少。霜霉威胁迫最初12小时中转基因T0代植株中霜霉威残留量逐渐增加，12小时处达到最大值，之后降低，且各时间点残留量明显低于野生型。霜霉威残留量在T1代植株中的变化趋势与T0代一致，其中，转基因后12小时残留量与野生型基本一致，12小时处达到最大值，之后呈明显降低趋势，且残留量显著低于野生型，72小时处残留量仅为最大值的0.43倍。
[0029] 喷施霜霉威后针对不同黄瓜不同组织部位样品中CsMAPEG蛋白的表达量为果实>叶片>茎>根，CsMAPEG蛋白在果实中表达量最高。
[0030] 植株三叶一心幼苗期激素JA、SA和ABA诱导，转基因组CsMAPEG蛋白表达模式上调明显，表达量分别为对照组的4.00、8.76、6.06倍。
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