一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法
阅读：971发布：2023-01-23
专利汇可以提供一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种测定环境 生物 中多 农药 残留的前处理方法，包括以下步骤：将环境生物蚯蚓与 水 混合，得到蚯蚓水 混合液 ；将蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，将匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液；将乙腈提取液与Fe3O4‑SiO2磁微粒、ZrO2、PSA 吸附 剂和吸水剂混合，得到混合料液；将混合料液震荡，磁分离，过滤，收集清液。本发明针对蚯蚓基质高脂高蛋白等特点，选用ZrO2、PSA吸附剂 净化 材料，并基于 磁性 纳米材料 Fe3O4‑SiO2的超 顺磁性 优势及其选择性，建立了快速测定环境生物多农药残留的前处理方法，实现环境生物中的多农药残留快速准确测定。，下面是一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法专利的具体信息内容。
1.一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法，包括以下步骤：
1)将环境生物蚯蚓与水混合，得到蚯蚓水混合液；
2)将所述步骤1)中的蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，将得到的匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液；
3)将所述步骤2)中的乙腈提取液与Fe3O4-SiO2磁微粒、ZrO2、PSA吸附剂和吸水剂混合，得到混合料液；所述乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL：(10～40)mg：(10～40)mg：(20～40)mg：(120～150)mg；
4)将所述步骤3)得到的混合料液震荡后，磁分离，将得到的净化液经滤膜过滤，收集清液。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤1)中蚯蚓的质量和水的体积比为1g:(1～3)mL。
3.根据权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中蚯蚓水混合液与乙腈的体积比为1:2～4。
4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中超声的功率为90～
120W；所述超声的时间为10～20min。
5.根据权利要求1或4所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中所述匀浆的时间为90～150s。
6.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中匀浆料液的体积和无机盐质量比为(9～12)mL：(4.2～5.2)g。
7.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤3)中乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL：(20～
30)mg：(20～30)mg：(25～35)mg：(130～140)mg。
8.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤4)中磁分离的方法为将混合液放置于磁力环境中分离2～3s。
9.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述多农药的种类为啶虫脒、嘧菌酯、甲萘威、多菌灵、克百威、乐果、烯酰吗啉、吡虫啉、马拉硫磷、伏杀硫磷、咪鲜胺、嘧霉胺、
3-羟基克百威、灭幼脲、除虫脲、三唑酮、甲拌磷、水胺硫磷、苯醚甲环唑、多效唑、氯吡脲、戊唑醇、抗蚜威、异丙威、喹硫磷、倍硫磷、腈菌唑、氟硅唑、烯唑醇、莠去津、丙环唑、戊菌唑、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、三唑醇、种菌唑、乙环唑、硅氟唑、氧环唑、粉唑醇、糠菌唑、联苯三唑醇、环丙唑醇、氟醚唑、丁草胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟甲腈和氟虫腈砜中的一种或多种。
一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境生物有机污染物分析前处理方法技术领域。
背景技术
[0002] 随着农业经济的不断增长，为提高农作物产量和质量，农药被大量使用，但仅有1％发挥实际作用，约60％逸散于土壤，残留在土壤中的农药将严重影响环境生物安全。因此，建立快速测定环境中多农药残留的分析方法具有重要意义。在土壤生态系统中，蚯蚓是数量最大的一类陆生动物，是控制土壤生态系统和能量流动的重要组成部分。蚯蚓处于食物链底端，其所受污染将会影响到食物链中更高级生物的安全。故常被视为土壤动物区系的代表类群用于指示、监测土壤污染。
[0003] 目前环境生物中农药残留分析常用样品前处理技术为索氏提取法，该方法提取彻底，不存在溶质饱和问题，在环境生物样品的农药残留检测中得到广泛应用。但该方法需时较长，对样品通量低，不适于对热不稳定的农药。因此，该方法不适作为多种农药检测标准方法。
[0004] 2013年，美国农业部提出了一种快速、简单、高效的适于多农药残留分析的样品前处理技术——QuEChERS，已广泛应用于蔬果中多农药残留的监测。QuEChERS方法由萃取和净化两部分组成，具有分析时间短、价格低廉、操作简便等特点，在多农药残留分析中展现较好的应用前景。经过多次改进优化，开发出了针对水产品，农作物以及土壤、中药材等特殊基质的QuEChERS改进方法。但相关研究多基于QuEChERS方法中提取液、净化粉和萃取剂的改进，未减少多步离心和涡旋等操作过程，限制了多农药残留检测批处理速度，因此QuEChERS方法仍存在很大的局限性。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于基于磁纳米材料提供一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法，使所述方法具有快速、准确和回收率高的特点。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法，包括以下步骤：
[0008] 1)将环境生物蚯蚓与水混合，得到蚯蚓水混合液；
[0009] 2)将所述步骤1)中的蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，将得到的匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液；
[0010] 3)将所述步骤2)中的乙腈提取液与Fe3O4-SiO2磁微粒、ZrO2、PSA吸附剂和吸水剂混合，得到混合料液；所述乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL∶(10～40)mg∶(10～40)mg∶(20～40)mg∶(120～150)mg；
[0011] 4)将所述步骤3)得到的混合料液震荡后，磁分离，得到的净化液经过滤，收集清液。
[0012] 优选的，所述步骤1)中蚯蚓的质量和水的体积比为1g∶(1～3)mL。
[0013] 优选的，所述步骤2)中蚯蚓水混合液与乙腈的体积比为1∶2～4。
[0014] 优选的，所述步骤2)中超声的功率为90～120W；所述超声的时间为10～20min。
[0015] 优选的，所述步骤2)中所述匀浆的时间为90～150s。
[0016] 优选的，所述步骤2)中匀浆料液的体积和无机盐质量比为(9～12)mL∶(4.2～5.2)g。
[0017] 优选的，所述步骤3)中乙腈提取液的体积与所述步骤3)中Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL∶(20～30)mg∶(20～30)mg∶(25～35)mg∶(130～140)mg。
[0018] 优选的，所述步骤4)中磁分离的方法为将混合液放置在磁力环境中分离2～3s。
[0019] 优选的，所述多农药的种类为啶虫脒、嘧菌酯、甲萘威、多菌灵、克百威、乐果、烯酰吗啉、吡虫啉、马拉硫磷、伏杀硫磷、咪鲜胺、嘧霉胺、3-羟基克百威、灭幼脲、除虫脲、三唑酮、甲拌磷、水胺硫磷、苯醚甲环唑、多效唑、氯吡脲、戊唑醇、抗蚜威、异丙威、喹硫磷、倍硫磷、腈菌唑、氟硅唑、烯唑醇、莠去津、丙环唑、戊菌唑、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、三唑醇、种菌唑、乙环唑、硅氟唑、氧环唑、粉唑醇、糠菌唑、联苯三唑醇、环丙唑醇、氟醚唑、丁草胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟甲腈和氟虫腈砜中的一种或多种。
[0020] 本发明提供了一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法，包括以下步骤：1)将环境生物蚯蚓与水混合，得到蚯蚓水混合液；2)将所述蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，将得到的匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液；3)将所述乙腈提取液与Fe3O4-SiO2磁微粒、ZrO2、PSA吸附剂和吸水剂混合，得到混合料液；所述乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL∶(10～40)mg∶(10～40)mg∶(20～40)mg∶(120～150)mg；4)将所述混合料液震荡后，固液分离，将得到的净化液经过滤，收集清液。本发明针对蚯蚓基质高脂高蛋白等特点，基于磁性纳米材料Fe3O4-SiO2的超顺磁性优势及其选择性，配合ZrO2、PSA吸附剂净化材料吸附蛋白质、脂肪类等杂质，来减少多次离心和涡旋的实验步骤实现对QuEChERS方法的优化，从而建立快速测定环境生物多农药残留的前处理方法，实现环境生物中的多农药残留快速准确测定。
具体实施方式
[0021] 本发明提供了一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法，包括以下步骤：
[0022] 1)将环境生物蚯蚓与水混合，得到蚯蚓水混合液；
[0023] 2)将所述步骤1)中的蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，将得到的匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液；
[0024] 3)将所述步骤2)中的乙腈提取液与Fe3O4-SiO2磁微粒、ZrO2、PSA吸附剂和吸水剂混合，得到混合料液；所述乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL∶(10～40)mg∶(10～40)mg∶(20～40)mg∶(120～150)mg；
[0025] 4)将所述步骤3)得到的混合料液震荡后，固液分离，得到的净化液经过滤，收集清液。
[0026] 本发明将环境生物蚯蚓与水混合，得到蚯蚓水混合液。
[0027] 本发明中，所述蚯蚓的质量和水的体积比优选为1g∶(1～3)mL，更优选为1g∶2mL。在本发明中，水能够稀释环境生物蚯蚓的粘液，利于后续农药萃取。在本发明的实施例中，所述水优选为超纯水。
[0028] 本发明中，所述蚯蚓的来源从农田环境中采集。本发明实施例中，蚯蚓试验选用由浙江大学动物科学学院蚯蚓养殖场提供的赤子爱胜蚯蚓(Eisenia foetida)。所述蚯蚓按照常规方法先预养一段时间，然后挑选2月龄以上，体重为400～500mg，环带明显且大小一致的健康成蚯进行试验。蚯蚓通过多农药处理来模拟环境中农药富集的蚯蚓。
[0029] 得到蚯蚓水混合液，本发明将所述蚯蚓水混合液与乙腈超声混合后匀浆，得到匀浆料液。在本发明中，所述超声使乙腈分散到蚯蚓水混合液中。
[0030] 本发明中，所述蚯蚓水混合液与乙腈的体积比优选为1∶2～4，更优选为1∶3。
[0031] 本发明中，所述超声的功率优选为90～120W，更优选为100W。所述超声的时间优选为10～20min，更优选为15min。
[0032] 本发明中，所述匀浆的时间优选为90～150s，更优选为120s；所述匀浆无需介质。本发明所述均浆的方法优选采用匀浆仪进行。本发明实施例中，所述匀浆仪为德国IKA T18。
[0033] 本发明所述匀浆的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的匀浆的方法即可。所述匀浆有利于使蚯蚓破碎，使蚯蚓体内的农药释放出来，被乙腈萃取。
[0034] 得到匀浆料液后，本发明将所述匀浆料液与无机盐混合，震荡，固液分离，得到乙腈提取液。
[0035] 本发明中，所述步骤2)中匀浆料液的体积和无机盐质量比为(9～12)mL∶(4.2～5.2)g。
[0036] 本发明中，所述无机盐优选包括MgSO4和NaCl。所述MgSO4与NaCl的质量比为(3.4～4.0)g∶(0.8～1.2)g，更优选为3.6g∶0.9g。本发明中，所述无机盐增加了匀浆料液的盐度，促进匀浆料液中的靶标化合物发生盐析，并促进乙腈-水分层，确保靶标化合物进入乙腈层。
[0037] 本发明中，所述震荡的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的震荡方法即可。本发明实施例中，所述震荡具体采用涡旋的方法进行。
[0038] 本发明中，所述固液分离的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的固液分离的方法即可。本发明实施例中固液分离具体采用离心的方法进行。所述离心的时间为3～7min，更优选为5min。所述离心的转速优选为2500～3500rpm，更优选为3000rpm。
[0039] 得到乙腈提取液后，本发明将所述乙腈提取液与Fe3O4-SiO2磁微粒、ZrO2、PSA吸附剂和吸水剂混合，得到混合料液。
[0040] 本发明中，所述乙腈提取液的体积与Fe3O4-SiO2磁微粒的质量、ZrO2的质量、PSA吸附剂的质量和吸水剂的质量比为1mL∶(10～40)mg∶(10～40)mg∶(20～40)mg∶(120～150)mg，优选为1mL∶(20～30)mg∶(20～30)mg∶(25～35)mg∶(130～140)mg，更优选为1mL∶25mg∶25mg∶30mg∶135mg。
[0041] 本发明中，所述Fe3O4-SiO2磁微粒的粒径优选为400～600nm，更优选为500nm。所述Fe3O4-SiO2磁微粒包括四氧化三铁载体和负载在所述载体上的二氧化硅。所述Fe3O4-SiO2磁微粒作为磁性材料，吸附细胞碎片等杂质。
[0042] 所述Fe3O4-SiO2磁微粒的来源没有特殊限制，商品购买或自己制备均可。所述Fe3O4-SiO2磁微粒制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
[0043] 本发明中，所述Fe3O4-SiO2磁微粒的制备优选包括以下步骤：
[0044] 将十六烷基溴化铵溶于水中，得到十六烷基溴化铵溶液；
[0045] 将所述十六烷基溴化铵溶液与Fe3O4和水超声混合，得到混合分散液；
[0048] 本发明中，所述ZrO2作为净化材料，利用静电吸附作用及表面键合功能基团实现对蛋白质和脂肪的吸附分离，以除去乙腈提取液中残余的蛋白质和脂肪。所述ZrO2的来源购于Supelco公司。
[0049] 本发明中，PSA吸附剂为N，N-甲基乙基氨修饰在硅胶材料表面，所述PSA吸附剂作为净化材料，具有弱阴离子交换功能，与基质中有机酸、糖类等分子中的羟基形成非共价键而去除这类杂质。所述PSA吸附剂的来源购于Agela Technologies公司。
[0051] 得到混合料液后，本发明将所述混合料液震荡后，磁分离分离，将得到的净化液经滤膜过滤，收集清液。
[0052] 本发明中，所述震荡的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的震荡方案即可。
[0053] 本发明中，所述磁分离的方法优选为将混合液放置在磁力环境中分离2～3s。所述磁力环境为磁力架或磁铁。磁珠分离就依靠磁性相吸，在净化材料ZrO2和PSA吸附剂中含有磁性材料，净化过程结束，含磁材料在内的吸附剂和乙腈提取液是一体的，这时，如给予外磁场的作用力(即放置磁铁)，即可使磁材料包裹着所有的净化吸附剂被磁铁吸附在一侧或底部，实现固液相的分离。
[0054] 本发明中，所述多农药的种类优选为啶虫脒、嘧菌酯、甲萘威、多菌灵、克百威、乐果、烯酰吗啉、吡虫啉、马拉硫磷、伏杀硫磷、咪鲜胺、嘧霉胺、3-羟基克百威、灭幼脲、除虫脲、三唑酮、甲拌磷、水胺硫磷、苯醚甲环唑、多效唑、氯吡脲、戊唑醇、抗蚜威、异丙威、喹硫磷、倍硫磷、腈菌唑、氟硅唑、烯唑醇、莠去津、丙环唑、戊菌唑、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、三唑醇、种菌唑、乙环唑、硅氟唑、氧环唑、粉唑醇、糠菌唑、联苯三唑醇、环丙唑醇、氟醚唑、丁草胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫腈、氟虫腈亚砜、氟甲腈和氟虫腈砜中的一种或多种。
[0055] 本发明中，所述磁分离后对得到的液相组分进行滤膜过滤，得到清液。在本发明中，所述滤膜的孔径优选为0.22μm。
[0056] 下面结合实施例对本发明提供的一种测定环境生物中多农药残留的前处理方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0057] 实施例1
[0058] 所述Fe3O4-SiO2磁微粒的制备包括以下步骤：
[0059] 向1000ml三口瓶中加入2g十六烷基溴化铵和200ml水的混合液，搅拌至溶解；向烧杯中投入1000mg Fe3O4和100ml水；超声10分钟(滴管搅拌)，加入到1000ml三口瓶中；.补加200ml水，机械搅拌；加入50mg(约60ul)浓氨水，机械搅拌；在氮气保护下加热至60℃，并滴加1.4ml乙醇和2.5ml正硅酸四乙酯的混合液，滴加完毕，继续保持60℃反应12小时。
[0060] 反应结束后，用磁铁将产品与母液分离；将产品移进100ml离心管中，如下操作重复6次：加入25ml丙酮，超声10-15分钟；最后，采用磁铁吸附，将产品与丙酮分离。所得产品用乙醇反复洗涤，至液相澄清，存放在无水乙醇中，待用。
[0061] 实施例2
[0062] 以蚯蚓样品中混配农药标准溶液添加浓度为0.3mg/L。
[0063] 称取2.0g蚯蚓试样(精确至±0.01g)于50ml聚丙烯具塞离心管中，加入3ml水，涡旋1min，使样品完全分散。加入6ml乙腈，涡旋1min，超声15min后用高速匀浆机匀浆1min，加入3.6g MgSO4和0.9g NaCl，剧烈震荡，采用3500r/min离心3min，取乙腈提取液待净化。
[0064] 准确移取1.0ml乙腈提取液加入到含有30mg实施例1制备的Fe3O4-SiO2、20mg ZrO2、30mg PSA吸附剂和150mg MgSO4的2ml离心管中，震荡1min后，置于磁力架上3秒即可完全分离，移取0.5ml上清液至装有0.5ml水的2ml离心管中，混匀，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液待UPLC-MS/MS分析。
[0065] 实施例3
[0066] 称取实施例2中所述蚯蚓试样2.0g(精确至±0.01g)于50ml聚丙烯具塞离心管中，加入4ml水，涡旋1min，使样品完全分散。加入8ml乙腈，涡旋1min，超声15min后用高速匀浆机匀浆1min，加入3.6g MgSO4和0.9g NaCl，剧烈震荡，采用3000r/min离心5min，取乙腈提取液待净化。
[0067] 准确移取1.0ml乙腈提取液加入到含有30mg实施例1制备的Fe3O4-SiO2、40mg ZrO2、30mg PSA吸附剂和150mg MgSO4的2ml离心管中，震荡1min后，置于磁力架上2秒即可完全分离，移取0.5ml上清液至装有0.5ml水的2ml离心管中，混匀，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液待UPLC-MS/MS分析。
[0068] 实施例4
[0069] 称取实施例2中所述蚯蚓试样2.0g(精确至±0.01g)于50ml聚丙烯具塞离心管中，加入2ml水，涡旋1min，使样品完全分散。加入10ml乙腈，涡旋1min，超声15min后用高速匀浆机匀浆1min，加入4.0g MgSO4和1.2g NaCl，剧烈震荡，采用3000r/min离心5min，取乙腈提取液待净化。
[0070] 准确移取1.0ml乙腈提取液加入到含有40mg实施例1制备的Fe3O4-SiO2、30mg ZrO2、30mg PSA吸附剂和150mg MgSO4的2ml离心管中，震荡1min后，置于磁力架上3秒即可完全分离，移取0.5ml上清液至装有0.5ml水的2ml离心管中，混匀，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液待UPLC-MS/MS分析。
[0071] 实施例5
[0072] 称取实施例2中所述蚯蚓试样2.0g(精确至±0.01g)于50ml聚丙烯具塞离心管中，加入3ml水，涡旋1min，使样品完全分散。加入6ml乙腈，涡旋1min，超声15min后用高速匀浆机匀浆1min，加入3.2g MgSO4和0.8g NaCl，剧烈震荡，采用3000r/min离心5min，取乙腈提取液待净化。
[0073] 准确移取1.0ml乙腈提取液加入到含有20mg实施例1制备的Fe3O4-SiO2、30mg ZrO2、20mg PSA吸附剂和150mg MgSO4的2ml离心管中，震荡1min后，置于磁力架上2秒即可完全分离，移取0.5ml上清液至装有0.5ml水的2ml离心管中，混匀，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液待UPLC-MS/MS分析。
[0074] 实施例6
[0075] 称取实施例2中所述蚯蚓试样2.0g(精确至±0.01g)于50ml聚丙烯具塞离心管中，加入3ml水，涡旋1min，使样品完全分散。加入6ml乙腈，涡旋1min，超声15min后用高速匀浆机匀浆1min，加入3.6g MgSO4和1.0g NaCl，剧烈震荡，采用3000r/min离心5min，取乙腈提取液待净化。
[0076] 准确移取1.0ml乙腈提取液加入到含有30mg实施例1制备的Fe3O4-SiO2、20mg ZrO2、40mg PSA吸附剂和150mg MgSO4的2ml离心管中，震荡1min后，置于磁力架上2秒即可完全分离，移取0.5ml上清液至装有0.5ml水的2ml离心管中，混匀，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液待UPLC-MS/MS分析。
[0077] 实施例7
[0078] 将实施例2～6制备得到的上清液进行LC-MS/MS检测，计算待测样品中农药的回收率。检测的具体方法是采用色谱柱Waters BEH C18(100×2.1mm，1.7μm)进行样品分离，流动相为水和甲醇(1∶9，v/v)，其中水相和有机相中均加入5mmol/L甲酸铵。流速为0.25mL/min，柱温15℃，进样量5μL。质谱条件：采用电喷雾离子源，正负离子源切换模式，其中正源喷雾电压为5500V，负源为4500V，多重反应监测模式(MRM)，加热温度450℃。
[0079] 啶虫脒、嘧菌酯和甲萘威等50种农药作为检测对象，以回收率(回收率＝(实测浓度/添加浓度)*100％)作为主要评价指标，实施例2～6的技术方案的回收率见表1。
[0080] 表1实施例2～6的技术方案对靶标化合物回收率的影响
[0081]
[0082]
[0083]
[0084] 由表1可知，实施例2～6的回收率根据农药种类的不同而变化较明显，另外不同净化材料的含量差异会引起回收率产生差异。
[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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