人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18及其应用
阅读：38发布：2023-03-02
专利汇可以提供人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种人源化修饰型抗CD147 嵌合 抗体 HcHAb18及其应用。具体而言是在获得抗人CD147单克隆抗体的杂交瘤细胞及其抗体HAb18基因的 基础 上，制备了抗CD147人鼠嵌合抗体，它的轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的 氨 基酸序列，它的重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在特定宿主细胞中岩藻糖不结合于抗体Fc段糖链还原端中的N‐乙酰氨基 葡萄糖 ，糖型为甘露糖型(MAN5)，该抗体具有抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(ADCC)。本发明还包括所述的抗CD147嵌合抗体的表达载体、工程细胞株及其作为 癌症 治疗 药物的应用。，下面是人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18及其应用专利的具体信息内容。
1.一种人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18，该抗体特异性结合人肿瘤相关抗原CD147分子，它包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，恒定区为人抗体恒定区。
2.如权利要求1所述的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18，其特征在于，该抗体是IgG1人同种型。
3.如权利要求1所述的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18，其特征在于，该抗体包含具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖或木糖不结合于所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖。
4.如权利要求1所述的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18，其特征在于，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，重链氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
5.一种核苷酸分子，其编码权利要求1所述的抗CD147嵌合抗体HcHAb18，其特征在于，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.如权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，编码轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码重链核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
7.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求5或6所述的核苷酸分子，该表达载体为pQD-Hyg-GSeu-cHAb18。
8.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞被权利要求7的表达载体转化。
9.权利要求8所述的宿主细胞，为CHO-K1细胞。
10.权利要求1所述的抗体HcHAb18在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症是选自肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、血液病或胃癌。
人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的人源化修饰型抗CD147单克隆嵌合抗体，该抗体能够抑制肿瘤生长和转移，并且还涉及氨基酸序列和编码抗体的核苷酸序列。本发明还包括该抗体作为用于癌症治疗的药物的用途。
[0002] 发明背景
[0003] CD147分子是一种广泛表达的细胞跨膜糖蛋白，在人类中，CD147共有269个氨基酸组成，可分为胞外区、跨膜区及胞内区。N端起始翻译后前21个残基为信号肽，22～205构成胞外区，206～229为跨膜区，具有典型的亮氨酸拉链结构，C端230～269为胞内区。
[0004] CD147属免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IgSF)成员，胞外4个半胱氨酸形成2个二硫键，构成两个Ig样结构域。X射线晶体衍射分析表明，该分子胞外区晶体结构由两个Ig样结构域，其中N末端的结构域为IgC2‐set，而靠近胞膜的C端结构域属于IgI‐set。
[0005] CD147也是一种糖蛋白，在Asp44、Asp152、Asp1863个位点能发生N-糖基化修饰，使其分子量由去糖基化状态下的30kDa上升至35～60kDa。
[0006] CD147的糖基化对其功能成熟十分重要，与肿瘤的进展、侵袭、转移有关。
[0008] 申请人研发的“CD147检测试剂盒(免疫组化法)”(专利号：ZL200910022400.1)在3045例临床组织标本中的免疫组化染色结果显示CD147分子在肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中显著高表达(总阳性率85.30％，1694/1986)，而在正常组织及良性病变组织中低表达(总阳性率7.27％，77/1059)，尤其在肺癌中显示较高的灵敏度(95.36％)与特异度(97.96％)。
[0009] 既往研究表明，CD147分子是肿瘤发展过程重要的功能性膜蛋白，参与多种与癌症有关的现象，如：
[0010] ①CD147介导肿瘤细胞的粘附和运动：肿瘤细胞表面表达的CD147与vinclin相互作用，促进肿瘤细胞伪足形成，铺展及粘附；与膜联蛋白annxin II相互作用，促进肿瘤细胞MMP-2分泌，增强肿瘤细胞运动能力和侵袭潜能；通过刺激肿瘤细胞自身及其周围的成纤维细胞，分泌多种基质金属蛋白酶(extracellular matrix metalloproteinase，MMP)，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-11以及MT1-MMP和MT2-MMP等，从而加快肿瘤周围基质的降解，促进了肿瘤的转移。在肿瘤的异源移植小鼠模型中，抑制肿瘤细胞CD147的表达或功能，在显著下调瘤组织中MMPs表达的同时，还可以抑制肿瘤细胞在小鼠体内的转移。CD147促进MMPs分泌的机制，可能是通过活化胞内信号蛋白ERK1/2、MAPK和FAK，以及促进胞内Ca2+内流实现的。
[0011] ②CD147参与肿瘤细胞的无氧代谢：CD147是单羧酸转运体(monocarboxylate transporter)MCT-1和MCT-4的重要分子伴侣。CD147可以与MCT-1和MCT-4相互结合，辅助它们在细胞膜上正确定位，并继续调节它们对乳酸代谢产物的转运功能。由于肿瘤细胞主要依靠无氧代谢产生能量，因此CD147可间接通过影响MCT的表达和功能调节肿瘤细胞的能量代谢。
[0012] ③CD147促进肿瘤细胞耐药：耐药是恶性肿瘤临床治疗失败的重要原因。多药耐药(multi-drug resistance，MDR)的肿瘤细胞通过过度表达P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-g)将进入肿瘤细胞的化疗药物泵出细胞以逃避化疗药的杀伤。CD147分子在促进MMPs分泌时，通过共表达调节机制影响MDR基因的转录，促进P-g的表达，从而可诱导肿瘤的多药耐药。Kanekura等证实CD147通过P-g导致MDR，所以下调CD147的表达可能是一个有效抵制MDR的靶点。Wang等在体外实验研究中发现，沉默胃癌SGC7901细胞系CD147的表达，可使其对顺铂的化疗敏感性增加。Zou等在人卵巢癌HO-8910细胞系中证实，通过抑制CD147的表达可增加对紫杉醇的敏感性。Kuang在人口腔上皮鳞癌中同样发现CD147在耐药过程中起着重要的作用。Tang证明CD147促进p-TFII-I细胞核内定位，上调未折叠蛋白反应(UPR)的关键因子Bip表达，引起肿瘤细胞内质网应激和UPR，从而抑制凋亡及对药物的不敏感性，抑制CD147分子可促进肝癌细胞凋亡，并可增强肿瘤细胞对现有抗肿瘤药物的敏感性。
[0013] ④CD147上调VEGF表达促进肿瘤新生血管形成：VEGF是影响肿瘤形成、生长和转移的关键因子。CD147可以上调VEGF的表达促进肿瘤血管的生长；抑制CD147的表达，能够显著抑制VEGF的分泌和肿瘤血管的生成。
[0014] ⑤CD147结合多种分子参与相互作用：CD147蛋白的跨膜段存在一个在进化上高度保守的负电荷谷氨酸，是其可以与多种细胞膜蛋白发生相互作用的结构基础，同时也提示CD147可以通过与多种蛋白的相互作用，影响细胞的多种生理活动。CD147可以通过与CD98、Integrin、caveolin-1、cyclophilins(CyP)等多种蛋白相互作用，从能量代谢、细胞-基质相互作用、信号传导等多个方面影响肿瘤细胞的生长和转移过程。
[0016] 因此，CD147分子已成为肿瘤治疗的新靶点，其中抗体药物“利卡汀”的研制成功，证明了该靶点成药的安全性和有效性。
[0017] 利卡汀(碘[131I]美妥昔单抗注射液(Iodine[131I]Metuximab Injection))，是以CD147分子为靶点的首个用于原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体免疫靶向药物。该药物通过美妥昔单抗特异性结合肝癌细胞膜上的高表达的CD147抗原，将单抗荷载的放射性碘131
[ I]输送到肿瘤部位，通过高能β离子的“交叉火力”作用，发挥局部肿瘤杀伤作用。
[ I]输送到肿瘤部位，通过高能β离子的“交叉火力”作用，发挥局部肿瘤杀伤作用。
[0018] 多中心临床试验结果表明：利卡汀对肝癌移植术后复发降低了21％；对肝癌射频消融术后复发降低了34％。治疗原发性肝癌临床控制率86.30％，临床有效率27.40％，中位生存时间20个月，显示了较好的安全性和有效性。但利卡汀由于荷载有放射性同位素碘131
[ I]，因此在临床应用、医护人员防护、废弃物处理等环节存在一定局限。
[ I]，因此在临床应用、医护人员防护、废弃物处理等环节存在一定局限。
[0019] 单克隆抗体(McAb)以其高特异性、高亲和力、毒副作用小、免疫原性低、体内作用时间长、可利用体内自身免疫系统发挥疗效等优点，在许多疾病的诊疗中得到广泛应用，成为新型药物研制的一条有效途径。
[0020] 然而，众多的研究表明，鼠源性单克隆抗体具有相对较短的半衰期，并且用于人类时，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如补体依赖R细胞毒作用(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity，ADCC)。
[0021] 另外，鼠源McAb重复注入人体内会引起患者诱发人抗鼠抗体(human anti mouse antibody，HAMA)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥。
[0022] 因此，为了降低鼠源McAb在人体内的免疫原性，尽可能地避免患者出现HAMA反应，从而可以给患者重复应用McAb实施治疗，同时提高抗体的效应功能，加强对肿瘤靶细胞的杀伤作用，成为目前抗体生物药物研发的热点。
[0023] 通过将鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转入工程细胞，获得的嵌合抗体，因其减少了鼠源基因成分，从而可心降低鼠源性抗体引起的不良反应，另一方面，保留鼠源性抗体上的抗原抗体互补决定簇，维持人源化改造抗体识别抗原的特异性；第三，人源化抗体的效应区能够更好地与人免疫系统的其它部分相互作用，通过ADCC或CDC作用更加有效的杀伤靶细胞。
[0024] 尽管在人体中免疫球蛋白有多种类型及其亚类，当前单抗药物主要是IgG1，因为它们在血清中有更长的半衰期以及更强的效应功能。
[0025] 肿瘤治疗性抗体在体内发挥作用的主要途径包括：ADCC、CDC、抗体直接诱导细胞凋亡以及维持抗体浓度的补救途径等。ADCC效应是抗体杀伤肿瘤的最主要途径。
[0026] ADCC是抗体识别靶细胞表面抗原后，抗体Fc结合NK细胞表面激活型FcγRs(FcγRI、FcγRⅡa和FcγRⅢa)受体，其中FcγRⅢa是主要受体，这种结合触发了细胞内部信号传导，并致使NK细胞释放穿孔素/颗粒酶复合物裂解靶细胞。一个IgG分子在其Fc段有两个N‐连接的寡聚糖位点，是在重链的297位天冬酰胺(Asn297)上。该糖基化位点的结构异质性与抗体的效应功能相关。既往研究表明去除岩藻糖后可增强抗体Fc对FcγRIIIa的结合能力，从而提高抗体的ADCC作用。
发明内容
[0028] 为此，本发明提供的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18特异性结合人CD147分子，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：轻链可变区具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0029] 本发明提供的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18特征还在于重链及轻链恒定区序列对应于人同种型IgG1。
[0030] 本发明提供的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18特征还在于其包括含有SEQ ID NO:3的轻链氨基酸序列，和包括含有SEQ ID NO:4的重链氨基酸序列。
[0031] 本发明提供的人源化修饰型抗CD147嵌合抗体HcHAb18特征还在于抗体具有N-糖苷-连接的复合糖链的Fc区，其中岩藻糖或木糖不与所述糖链还原端中的N-乙酰氨基葡萄糖结合。
[0032] 本发明另一目的是提供了编码上述抗体的DNA分子。该DNA分子含有SEQ ID NO:5所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:6所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。SEQ ID NO:7所示的编码轻链核苷酸序列，SEQ ID NO:8所示的编码重链核苷酸序列。
[0033] 本发明的目的之三是提供了一种表达载体。该表达载体为pQD-Hyg-GSeu-cHAb18，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
[0034] 本发明的目的之四是提供一种宿主细胞。该宿主细胞被上述表达载体转化，优选的，该宿主细胞来源于CHO-K1细胞。
[0035] 本发明的目的之五是提供上述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症是选自肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、血液病或胃癌。
[0036] 为克服鼠源性抗体HAb18(专利号：ZL02114471.0)在临床应用中的局限性，本发明通过RT-PCR的方法从杂交瘤细胞中克隆其轻、重链可变区基因，分别与人的恒定区基因相连，构建了抗CD147的嵌合抗体基因，并构建了相应的表达载体，通过转染化学诱导的岩藻糖缺陷型CHO-K1细胞(MAGE1.5)(Eureka Therapeutics)，获得了ADCC效应增强型的抗CD147嵌合抗体—HcHAb18，该抗体在特定宿主细胞中岩藻糖不结合于抗体Fc段糖链还原端中的N‐乙酰氨基葡萄糖末端，抗体Fc段糖型为甘露糖型(MAN5)。体外实验表明，此嵌合抗体保留了与鼠源性亲本抗体相似的亲和力和特异性，并能诱发ADCC效应，同时具有抑制肿瘤细胞侵袭迁移的能力；体内实验表明，该嵌合抗体具有抑制肿瘤的生长能力。附图说明
[0037] 图1为质类pQD-Hyg-GSeu-cHAb18载体示意图；
[0038] 图2为HcHAb18抗体糖谱分析
[0039] 图3为HcHAb18抗体与靶抗原CD147分子亲和力测定，图中A图为HcHAb18测定结果；B图为鼠源性亲本抗体HAb18测定结果；
[0040] 图4为HcHAb18单抗在组织中的免疫组化染色结果；
[0041] 图5为HcHAb18对肺癌细胞系ADCC体外杀伤试验；
[0042] 图6为HcHAb18对肺癌细胞运动能力的影响；
[0043] 图7为HcHAb18抑制肺癌细胞侵袭能力；
[0044] 图8为HcHAb18抑制NCI-H520荷瘤小鼠体内肿瘤生长。
具体实施方式
[0045] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步说明，而不是用来限制本发明。
[0046] 实施例1：鼠源抗CD147单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和测序[0047] 按Trizol Reagent试剂盒(Invitrogen公司)说明书提取2×106分泌抗人CD147单克隆抗体HAb18的杂交瘤细胞(专利号：02114471.0)的总RNA。经1％琼脂糖电泳鉴定TM总RNA质量后，用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)反转录试剂盒进行反转录，获得总RNA的cDNA。根据专利“抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用”(专利号：02114471.0)所公布的HAb18单抗轻、重链可变区基因序列信息，设计合成相应引物扩增HAb18单抗轻、重链可变区基因。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：
[0048] VL-5’：5’-GGGGATATCCACCATGAACTTCGGGCTGAGCTGG-3’；VL-3’：5’-GGATACAGTTGGTGGTGCAGTCGACTTACGTTT(GT)GTTTCA(AG)CTT-3’；VH-5’：5’-GGGGATATCCACCATGGACTCACATACTCAGGTC-3‘；VH-3’：5’-GAC(ACT)CATGGGG(CG)TGT(TC)GTGCTAGCTG(AD)(AG)GAGAC(AGT)GTGA-3’。
[0049] 反应条件：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；40个循环，最后72℃延伸，10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并连入pMD18-T载体(TaKaRa)，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与专利(专利号：02114471.0)所公布序列一致。将测序正确的结果分别命名为pMD18T-VL或pMD18T-VH。
[0050] 实施例2：VL和VH基因的优化和嵌合抗体构建
[0051] 在获得VL和VH测序结果后。首先，采用仓鼠的密码子偏性对轻、重链基因进行改造，以解决在翻译过程中因CHO细胞中稀有密码子产生的蛋白质表达量较低，其原理是基于解决氨基酸合成过程中转运氨基酸的tRNA偏性，即采用所对应tRNA含量较多的密码子，加快蛋白质的合成。根据仓鼠的密码子利用度表，对实施例一中获得的VL和VH核苷酸序列中的密码子偏性进行优化，获得如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示的单克隆抗体的轻、重链可变区氨基酸序列及其核苷酸编码序列。
[0052] 其次，人工合成抗体轻、重链基因的寡核苷酸片段，并在重链基因的两端分别合成NheI和BamH1酶切位点，在轻链基因的两端分别合成HindIII和XbaI酶切位点。用NheI和BamH1、HindIII和XbaI分别对人工合成的抗体重链和轻链可变区DNA序列进行酶切，经1％琼脂糖电泳分离后，用Gel Extraction Kit(Omega bio-tek)纯化酶切片段。
[0053] 然后，将纯化获得的酶切片段与同酶切的质粒pcDNA3.1(Invitrogen)用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，构建成含抗体重链和轻链全长基因的真核表达载体pQD-Hyg-GSeu-cHAb18，如图1所示。
[0054] 实施例3：CHO细胞的转染与重组克隆的筛选
[0055] 用上述构建的含有人源化抗体基因的表达载体pQD-Hyg-GSeu-cHAb18转化大肠杆菌DH-5α菌株，接种于100ml LB培养基上进行扩增。
[0056] 用超纯质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen)，按试剂盒说明书要求提取表达载体pQD-Hyg-GSeu-cHAb18质粒DNA。
[0057] 采用电穿孔法将pQD-Hyg-GSeu-cHAb18质粒DNA转染到岩藻糖转移酶缺陷的CHO细胞(MAGE1.5细胞)(专利：200980145664.9)中。
[0058] 采用终浓度为500ug/ml潮霉素B(Invitrogen，简称HyB)对转染的MAGE1.5细胞进行压力筛选，后采用终浓度为25uM的L-甲硫氨酸亚矾胺(L-Methionine Sulfoximine，MSX)(Sigma)继续进行细胞筛选培养；并采用ClonePix FL(Genentix，Inc)，对MSX压力筛选后仍存活的细胞进行多次克隆化筛选。通过上述操作获得了人源化抗体细胞株HcH18-M。
[0059] 在CD OptiCHO(Invitrogen)培养基上培养筛选出的单克隆细胞株HcH18-M，用Protein A亲和层析从培养上清中分离纯化抗体HcHAb18(即人源化修饰型抗CD147嵌合抗体)。
[0060] 实施例4：HcHAb18抗体的N-连接寡糖谱分析
[0061] 取2mg纯化的嵌合抗体HcHAb18经脱盐处理后，放入薄壁长试管中，经真空干燥仪45℃干燥，加入经2M三氟乙酸(TFA)4mL，100℃条件下水解2h，再次干燥后重悬于Milli-Q级水中。样品经再次脱盐处理后，加入PNGase F，37℃反应过夜，切下连接在抗体上的N-连接型糖链，滤膜过滤，获得供试品N-连接寡糖进行分析。
[0062] N-连接寡糖通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)方法进行分析。色谱条件如下：色谱柱Shimpack CLC-ODS column(60×150mm；Japan)，色谱柱经淋洗液A(10mM磷酸钠溶液(pH3.8))平衡，流速1.0ml/min，55℃；加入N-连接寡糖样品25μl后，用淋洗液B(10mM磷酸钠溶液(pH3.8)含0.5％正丁醇)和淋洗液A进行梯度洗脱，淋洗液B和淋洗液A的比率在80min内线性增加至60:40。用荧光(激发光波长320nm，发射光波长400nm)检测流出液。检测得到的寡糖峰通过PA标记的寡糖标准品(TaKaRa)进行比对分析。
[0063] 结果如图2所示，与表达于野生型CHO细胞的对照样品cHAb18相比，表达于MAGE1.5细胞的HcHAb18只有单一寡糖峰，进一步进行单糖分析表明，HcHAb18抗体的糖型为高甘露糖(Man5)，未检测到岩藻糖或木糖。
[0064] 实施例5：重组人源化修饰型嵌合抗体的生物学功能
[0065] (1)抗体亲和力测定
[0066] 经ProteOn XPR36蛋白质相互作用系统测定HcHAb18抗体与靶抗原CD147分子的亲和力，利用朗缪尔动力学(Kinetic‐Langmuir)模型分析数据。实验结果表明：HcHAb18抗‐10体与抗原CD147的亲和力KD＝3.62*10 M。与鼠源性抗体HAb18相比，经改造后的HcHAb18抗体与靶抗原的亲和力无显著差异。结果如图3所示。
[0067] (2)抗体特异性测定
[0068] 用免疫组织化学方法，检测HcHAb18单抗与肿瘤组织的特异性结合能力，考察该抗体的免疫组织交叉反应。具体操作如下：常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、水化组织芯片；3％H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶；正常羊血清工作液封闭；以HcHAb18抗体为一抗，生物素标记的兔抗人Fc抗体为二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液为三抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明后封片、镜检。结果如图4和表1所示，HcHAb18单抗在肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌和胃癌等多种恶性肿瘤组织中可见特异性着色(总阳性率84.66％)着色程度均为“++”或“+++”，其着色部位为癌细胞胞膜；而与正常组织极少结合(总阳性率13.70％，22/159)，在肺癌中显示较高的灵敏度88.24％)与特异度(91.67％)。
[0069] 表1HcHAb18单抗与肿瘤组织免疫交叉研究
[0070]
[0071]
[0072] (3)ADCC效应试验
[0073] 以分离人脾细胞作为效应细胞，比较不同剂量HcHAb18单抗在效应细胞参与下对肺癌细胞的体外杀伤作用，效靶细胞比为50：1。MTS法检测人脾细胞与HcHAb18包被的肿瘤细胞共孵育后，HcHAb18所介导的肿瘤杀伤作用。结果显示，HcHAb18单抗所诱导产生的ADCC效应显著高于对照单抗(cHAb18)。HcHAb18单抗体外对肺鳞癌细胞NCI‐H520、肺腺癌细胞A549和肺小细胞癌NCI‐H446的EC50分别为0.04μg/ml、0.06μg/ml和0.11μg/ml。结果如图5所示。(4)体外细胞划痕实验
[0074] 经0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml HcHAb18处理后，NCI‐H520细胞迁移速率由18.8μm/hr(培养基对照)，分别减小为15.0μm/hr、12.4μm/hr、10.5μm/hr，迁移速率与培养基对照相比，分别减小了20.2％、34.0％和44.1％(图7)，单因素方差分析(one‐way ANOVA)结果显示结果具有统计学意义(P<0.01，P<0.001，P<0.001)；A549细胞迁移速率由20.1μm/hr(培养基对照)，分别减小为15.2μm/hr、12.4μm/hr和10.1μm/hr，迁移速率与培养基对照相比，分别减小了24.4％、38.3％和50.0％(图6)，单因素方差分析(one‐way ANOVA)表明结果具有统计学意义(P<0.05，P<0.001，P<0.001)。
[0075] (5)细胞侵袭试验
[0076] 经0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml HcHAb18处理后，与空白对照相比，NCI‐H520细胞穿膜细胞数分别显著减少了30.0％(P<0.01)、48.0％(P<0.001)、66.2％(P<0.001)(图6)；同样地，侵袭穿膜的A549细胞分别减少了53.5％(P<0.01)、61.5％(P<0.001)、74.6％(P<0.001)，结果如图7所示。
[0077] (6)荷瘤小鼠体内抑制肿瘤生长分析
[0078] 取经体外细胞培养已在裸鼠体内皮下传代生长良好的人可移植性人肺癌细胞6
NCI‐H520肿瘤结节，无菌操作制成瘤细胞悬液，接种于裸鼠腋窝皮下，细胞密度为8×10/
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鼠，待肿瘤生长至大于100mm 后，随机分为6组：对照组(无菌0.9％氯化钠注射液10mL/kg)、HcHAb18低剂量组(2mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、高剂量组(30mg/kg)、化疗药物组(顺铂2mg/kg+健泽100mg/kg)和联合给药组(HcHAb1810mg/kg+顺铂2mg/kg+健择100mg/kg)每组10只。给药期间观察动物一般临床症状，用游标卡尺测量并计录肿瘤长径和短径，
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根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(V)＝(长径×短径 )/2。给药后第28天脱颈处死小鼠，并剥离肿瘤，称重。
NCI‐H520肿瘤结节，无菌操作制成瘤细胞悬液，接种于裸鼠腋窝皮下，细胞密度为8×10/
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鼠，待肿瘤生长至大于100mm 后，随机分为6组：对照组(无菌0.9％氯化钠注射液10mL/kg)、HcHAb18低剂量组(2mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、高剂量组(30mg/kg)、化疗药物组(顺铂2mg/kg+健泽100mg/kg)和联合给药组(HcHAb1810mg/kg+顺铂2mg/kg+健择100mg/kg)每组10只。给药期间观察动物一般临床症状，用游标卡尺测量并计录肿瘤长径和短径，
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根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(V)＝(长径×短径 )/2。给药后第28天脱颈处死小鼠，并剥离肿瘤，称重。
[0079] 结果如图8所示：
[0080] (1)瘤体积抑制率
[0081] 与对照组相比，HcHAb18单抗三个剂量组肿瘤体积均显著小于对照组，低剂量组瘤体积抑制率分别为47.31％(P<0.01)；中剂量组瘤体积抑制率分别为49.97％(P<0.01)；高剂量组瘤体积抑制率分别为55.21％(P<0.01)；
[0082] 与化疗组(47.31％)相比，HcHAb18各剂量组和联合组统计学均无显著性差异，但高剂量组和联合组的抑瘤率均高于化疗组，联合组抑瘤效果最为明显，抑瘤率分别为61.05％。
[0083] (2)瘤重抑制率
[0084] 与对照组相比，HcHAb18单抗三个剂量组肿瘤重量均显著小于对照组，低剂量组瘤重抑制率分别为47.12％(P<0.01)；中剂量组瘤重抑制率分别为48.73％(P<0.01)；高剂量组瘤重抑制率分别为53.28％(P<0.01)；
[0085] 与化疗组(44.58％)相比，HcHAb18各剂量组和联合组统计学均无显著性差异，但高剂量组和联合组的瘤重抑瘤率均高于化疗组，联合组抑瘤效果最为明显，抑瘤率分别为61.06％。
[0086] 以上结果表明：HcHAb18单抗能显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长；高剂量组的抑瘤效果优于临床常规用量化疗效果；与化疗药物联用，可显著提高肺癌生长的抑制效果。
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