一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法
专利汇可以提供一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种能够去 除热原 及病毒的尿激酶的制备方法。本发明的技术方法是将尿激酶粗品经DEAE- 纤维 素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品。该技术的优点在于在生产过程中采用60℃ 水 浴灭菌处理使病毒失活以及用 磷酸 三钠和 醋酸 钙 吸附 去除产品中的热原，保证产品的 质量 。该方法得到的尿激酶无病毒无热原，且精品的比活能够达到13万单位/mg以上。，下面是一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法，其特征在于：将尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品。
2.根据权利要求1所述的提取尿激酶精品的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）粗品提取：取尿激酶粗品溶解于磷酸缓冲液中，搅拌，过滤，调节pH；
（2）超滤：将粗提液超滤；加水，超滤；加PBS平衡液，超滤；
（3）DEAE-纤维素层析：用PBS平衡液平衡DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加入PBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；
（4）CMC层析：调节滤液pH和电导率，再将滤液上CMC柱，用氨水溶液洗脱，得洗脱液，灭菌；
（5）亲和层析：将树脂装柱，用含NaCl 的PBS平衡液洗涤平衡，将已灭菌的洗脱液上柱，洗涤；用PBS洗脱液洗脱，收集流出液；
（6）沉淀、干燥：调节流出液pH，加入乙醇沉淀，离心，沉淀物用乙醇洗涤，干燥，得干燥品；
（7）去热原
Ⅰ：将干燥品用水溶解，依次加入乙醇、醋酸铵、磷酸钠溶液、醋酸钙溶液，搅拌，调节pH，搅拌，离心，取上清液；
Ⅱ：调节上清液pH，搅拌，加入乙醇进行沉淀，离心，并用乙醇洗涤沉淀，干燥，得去除热原及病毒的尿激酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将尿激酶粗品用磷酸缓冲液溶解；尿激酶粗品与磷酸缓冲液的比例为：1g:10~14ml； 调节pH至7.0~8.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，再超滤至原体积的1/5至1/15；加0.025 mol∕L PBS平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的1/2至1/5。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，DEAE-纤维素用0.025 mol∕L PBS平衡液平衡。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，调节滤液pH至3.0~5.0，调整电导率至15~20μS/cm；CMC柱用0.05~0.2 mol∕L醋酸缓冲液平衡；氨水溶液体积浓度为0.05％~0.2％；将洗脱液在60℃水浴灭菌10小时。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，树脂柱用含1mol∕L NaCl 的0.01mol∕L PBS平衡液平衡；将洗脱液上柱，上柱结束后，先用含1mol /L NaCl 的
0.01mol∕LPBS平衡液洗涤柱子，再用含0.5mol/L NaCl 的0.01mol/LPBS平衡液洗涤；最后用0.01mol/LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，调节pH至6.0~7.0，加入乙醇的体积是洗脱液体积的3~8倍。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（7）的Ⅰ中，用水量与干燥品的比例为: 60~70ml:1g；乙醇的温度：-20~0℃；醋酸铵的用量与溶液总体积的比例为：5~10g:
1ml；磷酸钠溶液的浓度：0.1~0.3 mol /L，磷酸钠溶液的用量与干燥品的比例为10~14ml:
1g；醋酸钙溶液的浓度：0.1~0.5 mol /L，醋酸钙溶液的用量与干燥品的比例为:10~14ml:
1 g；调节pH为8.5。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（7）的Ⅱ中，上清液调pH至
6.0~7.0。
一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法
技术领域
发明内容
（2）超滤：将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15；加0.025mol∕L PBS平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的1/2至1/5；
（3）DEAE-纤维素层析：取经0.025mol/L PBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加入上一次量1/2的0.025 mol/L PBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；合并二次滤液；
（4）CMC层析：调节滤液pH至3.0~5.0，调整电导率至15~20μS/cm。CMC柱先用
0.05~0.2 mol/L醋酸缓冲液平衡，再将滤液上CMC柱，用0.05％~0.2％氨水溶液洗脱，得洗脱液。将洗脱液在60℃水浴灭菌10小时；
（5）亲和层析：将Trypsin-inhibitor-Sepharose装柱，用含1mol/L NaCl 的0.01mol/L PBS平衡液洗涤平衡；将已灭菌的洗脱液进行上柱；用含1mol /L NaCl 的0.01mol/LPBS平衡液洗涤1~3个床体积，再用含0.5mol/L NaCl 的0.01mol/LPBS平衡液洗涤0.1~1个床体积；最后用0.01mol /LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液。
具体实施方式
1.1粗品提取：
取粗品420g，溶解于12倍量1mol/L磷酸缓冲液中，搅拌提取2小时后，过滤得滤液。
滤饼再次溶解于4倍量1mol/L磷酸缓冲液中，搅拌，过滤得滤液。合并二次滤液，用5mol/LHCl调pH至7.5。
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