技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物医学技术领域，具体涉及一种筛选防治帕金森病药物的方法。
背景技术
[0002] 帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见的神经系统变性
疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少最终导致疾病发生。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、
氧化应激等均可能诱导PD多巴胺能神经元的变性死亡。
[0003] 随着帕金森病发病率的增加，防治帕金森病的药物研究成为现代医学的研究热点，但是相关的药物筛选模型或是药效评价方法还很缺乏，现有的帕金森疾病模型常用的一种是应用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注入黑质纹状体系统来损毁大鼠黑质-纹状体系统多巴胺(DA)能神经元所制成的模型，此模型应用较为广泛，但是后续评价流程还很缺乏，评价方法通常为肉眼观察实验动物的行为表现，相关生物学方面的检测缺乏。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种筛选防治帕金森病药物的方法，本发明的筛选方法包括帕金森动物模型的构建和实验检测相关因子变化量，所选用的PD相关评价因子包括Nurr1、DAT、Pitx3、TH、Iba1，通过Westernblot、PCR和免疫
荧光法检测上述相关因子的含量，从而评价药物作用效果。
[0005] 为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0006] 一种筛选防治帕金森病药物的方法，包括以下步骤：
[0007] ①应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型；
[0008] ②Westernblot和RT-PCR检测纹状体内多巴胺相关因子表达量的变化；
[0009] ③免疫荧光检测纹状体内TH和Iba1的变化。
[0010] 进一步，上述的应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型的步骤如下：
[0011] 通过黑质-纹状体通路
定位注射6-OHDA建立大鼠PD模型，6-OHDA的注射量为每点4μl。术后
腹腔注射青霉素抗感染，连续一周。术后2周后，腹腔注射APO诱发旋转行为。注射10min后，手动计数SD大鼠旋转圈数，共记录30min。平均转速≥7r/min者定义为PD阳性，连续3周阳性的则认为造模成功。
[0012] 进一步，上述的多巴胺相关因子包括Nurr1、DAT、Pitx3、TH。
[0013] 进一步，上述步骤②RT-PCR检测纹状体内多巴胺相关因子所用引物序列如下：
[0014] Nurr1基因的引物序列：
[0015] F：5′-AAGCCACCTTGCTTGTACCAAA-3′，
[0016] R：5′-CTTGTAGTAAACCGACCCGCTG-3′；
[0017] TH基因的引物序列：
[0018] F：5′-CAGGGCTGCTGTCTTCCTAC-3′，
[0019] R：5′-GGGCTGTCCAGTACGTCAAT-3′；
[0020] DAT基因的引物序列：
[0021] F：5′-TTGCAGCTGGCACATCTATC-3′，
[0022] R：5′-ATGCTGACCACGACCACATA-3′；
[0023] Pitx3基因的引物序列：
[0024] F：5′-CTTAGTCCCTGCCAGTACGC-3′，
[0025] R：5′-GTGAGCCAAGGGTGAATTG-3′。
[0026] 进一步，上述的筛选防治帕金森病药物的方法，大鼠
给药发生在步骤①应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型前或后。
[0027] 有益效果：
[0028] (1)本发明提供的筛选防治帕金森病药物的方法在进行动物模型实验的同时也建立了分子生物学
基础检测相关蛋白的研究方案，补充现有研究手段的不足；
[0029] (2)本筛选防治帕金森病药物的方法中检测动物模型后的相关蛋白包括Nurr1，TH，Pitx3，DAT，Iba1，上述蛋白在现有研究中都被发现与帕金森病的发生和发展有关，对它们表达量的检测用于评价药物效果更具有说服
力；
[0030] (3)本发明利用了Westernblot、RT-PCR和免疫荧光技术根据需要对Nurr1，TH，Pitx3，DAT和Iba1的表达变化量进行检测，通过与对照组的比较，判断待测药物或待测手术方法的作用，多方法检测使本方法的结果判断更为准确；
[0031] (4)本筛选防治帕金森病药物的方法可用于评价口服药、注射药或
治疗手术的治疗效果，使用范围广泛。
具体实施方式
[0032] 为使本发明
实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例中所用蛋白：
[0034] Nurr1：核受体相关蛋白1，是细胞内转录因子核受体家族的成员，在维持大脑多巴胺能系统中起着关键作用。该基因的突变与多巴胺能功能障碍相关的疾病有关，包括帕金森病，
精神分裂症和躁狂
抑郁症。该
蛋白质被认为对中脑中多巴胺表型的发育至关重要。
[0035] DAT：dopaminetransport，多巴胺转运体，位于突触前体，重新摄取神经递质多巴胺，维持突触多巴胺有效性和多巴胺能神经元的协调性。
[0036] Pitx3：
炎症因子3，在中脑黑质多巴胺(DA)能神经元终末分化和生存维持中起关键作用，诸多研究表明，Pitx3单核苷酸多样性(SNP)与帕金森病(PD)有关。
[0037] TH：Tyrosinehydroxylase，酪
氨酸羟化酶，是多巴胺生物合成途径的关键酶，PD是由于黑质纹状体多巴胺严重不足导致的一种神经变性疾病，TH的表达调节在PD的发展和治疗中有重要的作用。
[0038] Iba1：在巨噬细胞/小胶质细胞中特异性表达，是M-CSF诱导的膜起皱所必需的巨噬细胞/小胶质细胞特异性肌动蛋白交联蛋白。
[0039] 实施例一：一种筛选防治帕金森病药物的方法
[0040] 1.PD大鼠模型的建立
[0041] 选用雄性SD大鼠进行模型的建立，参照Paxinos教授主编的《大鼠脑
立体定向图谱》确定注射
位置：第一点注射位置：前囟前0.7mm，中线右3.0mm，硬膜下4.5mm；第二点注射位置：前囟后0.2mm，中线右2.6mm，硬膜下6.0mm。调整针尖位置，利用牙科钻进行颅骨钻孔，用10μl
微量注射器向右侧脑内两个预定靶点分别注入6-OHDA，每点4μl。术后腹腔注射青霉素抗感染，连续一周。术后2周后，腹腔注射APO(阿扑吗啡)诱发旋转行为。注射5-10min后，手动计数SD大鼠旋转圈数，共记录30min。平均转速≥7转/min者定义为PD阳性，选用PD阳性大鼠继续进行药物给药或手术治疗。每组6只，随机选取6只仅注射生理盐
水作为阴性对照。
[0042] 2待测药物给药或进行治疗手术
[0043] 待测药物根据其性质给药，治疗性药物在造模成功后给药治疗，
预防性药物在造模前给药治疗。治疗手术如细胞移植等在造模成功后即可进行。
[0044] 3治疗后的观察
[0045] 分别于移植后3w，6w，9w及12w用APO腹腔注射造模后的大鼠诱导旋转，记录旋转次数。
[0046] 4检测纹状体内DA相关因子的变化
[0047] 根据需要结束实验后，分别用Westernblot及RT-PCR检测各组间Nurr1、DAT、Pitx3及TH表达的变化，上述因子表达上调则表明待测药物有缓解PD的作用。
[0048] 使用TRIzol通用
试剂(TiangenBiotech，中国北京)从组织中提取总RNA(每组n＝4)，并合成互补DNA(cDNA)。Nurr1，TH，Pitx3，DAT使用以下引物扩增cDNA
片段：
[0049] Nurr1基因的引物序列：
[0050] F：5′-AAGCCACCTTGCTTGTACCAAA-3′，
[0051] R：5′-CTTGTAGTAAACCGACCCGCTG-3′；
[0052] TH基因的引物序列：
[0053] F：5′-CAGGGCTGCTGTCTTCCTAC-3′，
[0054] R：5′-GGGCTGTCCAGTACGTCAAT-3′；
[0055] DAT基因的引物序列：
[0056] F：5′-TTGCAGCTGGCACATCTATC-3′，
[0057] R：5′-ATGCTGACCACGACCACATA-3′；
[0058] Pitx3基因的引物序列：
[0059] F：5′-CTTAGTCCCTGCCAGTACGC-3′，
[0060] R：5′-GTGAGCCAAGGGTGAATTG-3′。
[0061] RT-PCR反应条件为：94℃，3分钟，35个循环；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分钟；最后延伸72℃，10分钟。反应结束后，取PCR产物经1％琼脂糖凝胶
电泳分析。对目的基因与内参基因GAPDH的mRNA进行实时PCR分析。
[0062] 用RIPA裂解缓冲液提取治疗组及对照组大鼠的纹状体组织的总蛋白，Westernblot法检测Nurr1，TH，Pitx3，DAT的蛋白变化量，以β-actin为内参对
照蛋白，对蛋白检测结果进行分析。
[0063] 5免疫荧光检测纹状体TH和Iba1的变化
[0064] 根据需要结束实验后，10％水合氯
醛腹腔注射麻醉SD大鼠，经生理盐水及4％多聚甲醛灌注后取脑，
蔗糖梯度脱水后进行
冰冻切片。制作好的脑切片经过固定、透膜、封闭过程，加入兔抗TH(1:200，Abcam)以及鼠抗Iba1(1:200，Abcam)4℃过夜孵育。次日分别吸去上述一抗，经PBS洗片3次后，加入对应荧光二抗孵育2h，结束后使用PBS洗片3次，滴加含DAPI的封片剂后盖上盖玻片封片，在正置荧光
显微镜下观察并拍照。
[0065] 6结果分析
[0066] 将上述实验结果进行统计分析，分别比较治疗组和对照组大鼠的APO腹腔注射造模后的大鼠后的旋转次数、Westernblot及RT-PCR检测的Nurr1、DAT、Pitx3及TH表达的变化、以及免疫荧光检测纹状体TH和Iba1的变化，治疗后大鼠出现旋转次数减少、Nurr1、DAT、Pitx3及TH表达量增加以及TH阳性细胞明显增多，而Iba1阳性细胞减少等现象，则表明该待测药物或治疗手段是有效的，可进一步开发成治疗PD的药物。
