背景技术

本发明总体而言涉及分子生物学、神经生物学和药理学领域以及帕金 森病(Parkinson’s Disease，PD)的诊断、预后或预防性/治疗性治疗。

帕金森病是一种进行性的神经退行性疾病，其特征为黑质中多巴胺神 经元缺失和存活神经元中存在细胞质内含物(路易体，Lewy bodies)。帕 金森病的经典临床特征包括进行性震颤、强直和运动迟缓。然而，在其早 期阶段，由于缺乏临床症状和可信的生物标志物使得PD很难被诊断。另 外，PD可能被误诊为其它一些疾病，包括，但不仅限于，例如：特发性 震颤和多系统萎缩等，这进一步干扰了任何潜在诊断。PD诊断可以基于 神经表现，这些只在大脑脆弱区域内实体细胞损失之后才显现出来。

发明概要

本发明总体而言涉及样品的分析测试以及用于PD诊断、预后或者预 防性/治疗性治疗的生物标志物说明的各个方面。其中一个方面，本文提供 了一种诊断或监测帕金森病的方法，其包括：(a)确定在一个或多个时间 点取自受试者的样品中Bmal1或Per1的表达水平，和(b)将样品中Bmal1 或Per1的表达水平和参考水平相比较，其中样品中Bmal1或Per1表达水 平和参考水平的差异指示出受试者患有帕金森病或其分级。

在一个实施方案中，所述参考水平是指未患帕金森病的受试者对照群 体中Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施方案中，所述参考水平是指 未患帕金森病的个体中Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施方案中， 所述参考水平是指受试者之前的Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施 方案中，所述参考水平是指受试者在接受治疗方案之前Bmal1或Per1的 表达水平。

在一个实施方案中，所述样品为血液样品。在一个说明性实施方案中， 所述样品包含外周白细胞。

在一个实施方案中，测量表达水平的步骤是通过定量PCR实施。在一 个实施方案中，测量表达水平的步骤是通过northern印迹或点印迹实施。

在一个实施方案中，测定表达水平的步骤包括将Bmal1或Per1的 mRNA的量相对于管家基因mRNA的量进行归一化。在一个实施方案中， 所述管家基因选自：hCDK4、β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和18S rRNA。

在一个实施方案中，所述一个或多个时间点包括至少一个处于昼夜循 环中夜间部分的时间点。在一个实施方案中，所述一个或多个时间点包括 选自约23:00至约9:00之间的至少一个时间点。在一个实施方案中，所述 一个或多个时间点来自选自下列的时间段：20:00到22:00，23:00到1:00， 5:00到7:00，以及8:00到10:00。在一个举例性实施方案中，所述一个或 多个时间点选自：约21:00、约00:00、约06:00和约09:00。   在一个实施方案中，比较Bmal1或Per1表达水平与参考水平的步骤 是通过Mann-Whitney U检验来实施的。在一个实施方案中，受试者Bmal1 或Per1表达水平与参考水平的差异与受试者帕金森病分级正相关。在一个 实施方案中，帕金森病分级是通过Hoehn & Yahr分级系统测定的。在一 个实施方案中，确定受试者是否患有帕金森病或其分级的步骤是对Hoehn & Yahr分级系统所确定的分级和受试者Bmal1或Per1表达水平与参考水 平的差异之间进行Pearson相关性分析。在一个实施方案中，帕金森病的 分级通过UPDRS量表进行评价。

在一个实施方案中，相比于参考水平，受试者Bmal1表达水平在选自 约21:00、约00:00和约06:00的一个或多个时间点处降低指示出受试者患 有帕金森病或其分级。在一个实施方案中，相比于参考水平，受试者Per1 表达水平在约00:00、约06:00或同时在约00:00和约06:00时升高指示出 受试者患有帕金森病或其分级。在一个实施方案中，相比于参考水平，受 试者Per1表达水平在21:00时降低指示出受试者患有帕金森病或其分级。

在一些示例性实施方案中，所述方法另外包括通过测量来源于受试者 取自至少两个时间点之间的样品中Per1和/或Bmal1的表达水平以及比较 至少两个时间点之间Per1和/或Bmal1的表达水平来确定受试者中Per1和 /或Bmal1表达模式的步骤。在一个实施方案中，受试者Per1在约21:00 和约00:00时表达水平比约06:00和09:00时低的表达模式指示出受试者患 有帕金森病。

在一些示例性实施方案中，本方法还包括根据受试者所患帕金森病以 及其分级选择治疗方案的步骤。在一些示例性实施方案中，本方法还包括 在治疗方案施用给受试者之后测量Bmal1或Per1表达水平的步骤。

在本发明的一个方面，本文提供了一种筛选可用于治疗帕金森病的化 合物的方法，其包括：(a)对施用了测试化合物的受试者的样品中Bmal1 或Per1的表达水平进行测量；(b)将Bmal1或Per1的表达水平和参考水 平相比较；和(c)确定所述测试化合物的效力，其中Bmal1或Per1的表 达水平相比于参考水平的差异指示出所述测试化合物可用于治疗受试者 的帕金森病。在一个实施方案中，所述参考水平是接受所述测试化合物之 前受试者的Bmal1或Per1表达水平。

在本发明的一个方面，本文提供了一种诊断或监测受试者帕金森病的 试剂盒，它包含：(a)一种或多种用于测量受试者样品中Bmal1或Per1 表达水平的检测试剂；(b)至少一例来自未患帕金森病的受试者对照群体 的对照样品；和(c)一种或多种检测试剂的使用说明。在一个实施方案 中，所述一种或多种检测试剂包括用于Bmal1 mRNA的RT-PCR的引物。 在一个实施方案中，所述一种或多种检测试剂包括用于Per1 mRNA的 RT-PCR的引物。

在本发明的一个方面，本文提供了一种或多种测量受试者样品中 Bmal1或Per1表达水平的检测试剂用于制备诊断或监测帕金森病的药 剂中的用途。

在一个实施方案中，本文提供了一种或多种测量受试者样品中 Bmal1或Per1表达水平的检测试剂用于制备诊断或监测帕金森病的药 剂中的用途，其中：(a)所述一种或多种测量受试者样品中Bmal1或 Per1表达水平的检测试剂确定在一个或多个时间点取自受试者的样品 中Bmal1或Per1的表达水平；和(b)将所述样品中Bmal1或Per1表 达水平和Bmal1或Per1表达的参考水平进行比较；其中所述样品中 Bmal1或Per1表达水平和参考水平的差异指示出受试者患有帕金森病 或其分级。

在一个实施方案中，所述参考水平是指未患帕金森病的受试者对照群 体中Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施方案中，所述参考水平是指 未患帕金森病的个体中Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施方案中， 所述参考水平是指受试者之前的Bmal1或Per1的表达水平。在一个实施 方案中，所述参考水平是指受试者在接受治疗方案之前Bmal1或Per1的 表达水平。

在一个实施方案中，所述样品为血液样品。在一个说明性实施方案中， 所述样品包含外周白细胞。

在一个实施方案中，使用定量PCR确定所述表达水平。在另一个实 施方案中，使用northern印迹或点印迹确定所述表达水平。

在一个实施方案中，所述表达水平的确定包括将Bmal1或Per1的 mRNA的量相对于管家基因mRNA的量进行归一化。在一个实施方案 中，所述管家基因选自：hCDK4、β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和 18S rRNA。

在一个实施方案中，所述一个或多个时间点包括至少一个处于昼夜 循环中夜间部分的时间点。在一个实施方案中，所述一个或多个时间点 包括至少一个处于约23:00至约9:00的时间点。在一个实施方案中，所 述一个或多个时间点来自选自下列的时间段：20:00到22:00，23:00到 1:00，5:00到7:00，以及8:00到10:00。在一个实施方案中，所述一个 或多个时间点选自：约21:00、约00:00、约06:00和约09:00。

在一个实施方案中，采用Mann-Whitney U检验比较Bmal1或Per1 表达水平和参考水平。在一个实施方案中，受试者Bmal1或Per1的表 达水平和参考水平之间的差异与受试者帕金森病的分级正相关。在一个 实施方案中，帕金森病分级是通过Hoehn & Yahr分级系统测定的。在 一个实施方案中，确定受试者是否患有帕金森病或其分级的步骤是对 Hoehn & Yahr分级系统所确定的分级和受试者Bmal1或Per1表达水平 与参考水平的差异之间进行Pearson相关性分析。在一个实施方案中， 帕金森病的分级通过UPDRS量表进行评价。

在一个实施方案中，与参考水平相比受试者Bmal1表达水平在一个 或多个时间点处降低指示出受试者患有帕金森病或其分级，所述时间点 选自：约21:00、约00:00、约06:00。在一个实施方案中，与参考水平 相比受试者Per1表达水平在约00:00、约06:00或者约00:00和约06:00 同时升高指示出受试者患有帕金森病或其分级。在一个实施方案中，与 参考水平相比受试者Per1的表达水平在21:00下降指示出受试者患有 帕金森病或其分级。

在一个实施方案中，其中一种或多种测量受试者样品中Bmal1或 Per1表达水平的检测试剂还可用于确定受试者中Per1或Bmal1的表达 模式，所述确定是通过测量来源于受试者取自至少两个时间点的样品中 Per1或Bmal1的表达水平以及比较所述至少两个时间点之间的Per1或 Bmal1表达水平来进行的。在一个实施方案中，受试者中在约21:00和 约00:00时的表达水平比约06:00和约09:00时低的Per1表达模式指示 出受试者患有帕金森病。

在一个实施方案中，其中还根据受试者患有帕金森病或其分级选择 治疗方案。在一个实施方案中，其中另外在受试者接受治疗方案之后测 量Bmal1或Per1表达水平。

上述概要仅为说明性而并不意为任何形式的限制。除上述的示例性方 面、实施方案以及特征之外，另外的示例性方面、实施方案以及特征通过 参考附图以及以下发明详述进行说明。

发明详述

在下面的详细说明中，参考作为说明书一部分的附图。在附图中，除 非文中另外指出，相似的符号通常表示相似的成员。在详细说明、附图以 及权利要求中描述的示例性实施方案不意味着限制。在不脱离本文主题的 精神和范围的前提下，也可使用其它一些实施例以及做出一些其它的改 变。

本文中提及时间时采用24小时制。24小时制是惯用的计时方式，其 中一天从午夜开始至午夜结束，其被划分为24个小时，以数字0到23表 示。

I定义

单位、前缀以及符号都以其公认的SI制表示。除非另外说明，核酸从 左至右以5′端至3′端的方向书写；氨基酸序列从左至右以从氨基端至羧基 端的方向书写。本文中用通常所知的三字母代码或者采用IUPAC-IUBMB 命名委员会推荐的单字母代码表示氨基酸。类似的，核苷酸可以用普遍接 受的单字母编码表示。

在随后的说明中，频繁使用很多术语。通过参考说明书整体更完整地 定义下列术语。

除非有明确相反的说明，单词“包含”及其变化形式如“有”和/或“包括” 将被理解为例如包含权利要求中所述的信息，但并不排除未明确说明的信 息。

除非明确说明是单数，本文提及的名词均表示“一个(种)或多个(种)”。

如本文中所使用的，当提到数值时，除非另外说明，术语“约”表示 所举数值的正负10％。

如本文中所使用的，对受试者或患者“施用”试剂或药物包括将化合物 通过任意途径引入或送入受试者体内以实施其预期功能。可以通过任何合 适途径进行施用，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹腔内或皮 下)、直肠或局部。施用包括自我施用和他人施用。另外还要认识到，各 种所提到的治疗或预防医学状况的模式都意味着“基本上”，其包含全部 但也包含少于全部的治疗或预防，其中得到一些生物或者药物相关的结 果，包括生活质量的改善。

术语“评估”和“评价”可互换地用于指代任何形式的测量，包括确 定特性、特点或特征是否存在。术语“确定”，“测量”，“评估”和“测定” 可互换地使用，其包括定量和定性的确定。评估可以是相对的或绝对的。 “评价其存在”包括确定存在事物的量，也包括确定事物是否存在。

如本文中所使用的，本发明背景中术语“生物标志物”指信使RNA， 与取自对照受试者或对照受试者群体的相当样品相比，该信使RNA差异 存在于取自帕金森病患者的样品中。

如本文中所使用的，术语“对照群体”是指阴性诊断或未检测到帕金 森病的个体，例如，正常或健康的受试者。

如本文中所使用的，短语“水平差异”是指取自帕金森病患者身上的 样品中存在的生物标志物与对照相比在数量上的差异。在一个实施方案 中，生物标志物可以是信使RNA，与参考水平相比，它以升高的或降低的 量存在于帕金森病患者的样品中。在一个实施方案中，“水平差异”可以 是统计学上的显著性差异。例如，如果生物标志物的测量水平落在任何对 照或参考群组平均值约1.0标准偏差、约1.5标准偏差、约2.0标准偏差或 约2.5标准偏差之外，其差异可以是统计学上显著的。

如本文中所使用的，“昼夜循环”是指一天24小时的循环，其被划分 为夜间和白天两段。

如本文中所使用的，术语测试化合物的“有效量”是指足以达到所需 治疗和/或预防效果的量，例如，达到预防或减轻与所治疗疾病(即帕金森 病)相关症状的剂量。施用给受试者的化合物量取决于疾病的类型和严重 程度以及个体特性，如，基本健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性。 它还取决于疾病的程度、严重性和分级。本领域技术人员可以根据这些或 其他因素决定合适的剂量。

如本文中所使用的，术语“群体”可以是任何至少两个个体的组。群 体可以包括，但不仅限于，对照群体、患者群体、参考群体、群体组、家 族群体、临床群体和同性别群体等。

如本文中所使用的，术语“参考水平”是指用于比较的目的生物标志 物的量或浓度。在一个实施方案中，所述参考水平可以是至少一种生物标 志物的表达水平，其表现为取自健康受试者对照群体的样品中至少一种生 物标志物的平均水平。在另一个实施方案中，所述参考水平可以是相同受 试者之前的(即在当前测定之前)至少一种生物标志物表达水平。在另外 一个实施方案中，所述参考水平可以是受试者在接受治疗方案之前至少一 种生物标志物的水平。

如本文中所使用的，术语“样品”可以包括，但不仅限于，身体组织 或体液，如血液(或血液的一部分如血浆或血清)、淋巴液、粘液、眼泪、 唾液、胆囊液、尿液、精液、粪便、脊髓液(CSF)、腹水或全血，以及包 括来自身体组织的活检样品。样品可以来自任何受试者，如具有或怀疑有 患帕金森病潜在风险的受试者/患者。

如本文中所使用的，术语“筛选”意味着确定测试化合物是否具有预 防或减缓(减轻)本文所述的目标病理状况(即帕金森病)的能力和特性。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，如人类，但也可 以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等) 或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。术语“患者”是指 那些患有或怀疑患有帕金森病的“受试者”。

如本文中所使用的，术语“治疗”或“疗法”是指治疗性处理和预防 性或防治性措施，其目的是为预防、减缓或减轻目标病理状况或疾病。如 果，在接受治疗量的根据本发明方法的测试化合物后，受试者表现出一种 或几种PD迹象或症状可观察的和/或可测量的减少或消失或者在Hoehn& Yahr和/或UPDRS分级类别上有所改善，那么患者的帕金森病特征的疾 病就被成功“治疗”。

II发明概述

本文公开了检测受试者是否患有帕金森病(PD)的方法，其(至少部 分地)基于本发明对样品的测试方法的结果。本文还公开了监测被诊断为 帕金森病的受试者发展状况的方法，其至少部分基于对样品的测试结果。 本文公开的测试样品以下列物质为代表，但不仅限于此，例如：血液(或 血液的一部分如血浆或血清)、淋巴液、粘液、眼泪、唾液、胆囊液、尿 液、精液、粪便、脊髓液(CSF)、腹水或全血，以及身体组织的活检样本。 本公开涉及诊断、监测和治疗PD的方法，等等。

本发明一般性提供了对测试样品中Per1和Bmal1基因表达的检测、 测量和比较。因此，涉及测试样品中信使RNA的收集、制备、分离、鉴 定、定性和丰度比较的各个方面。本发明还涉及包含Per1和Bmal1信使 RNA的样品的检测和/或监测，所述信使RNA可单独或组合用于确定是否 患有帕金森病或其发展状态。

另一方面包括根据受试者是否患有帕金森病及其程度来选择治疗方 案。因此，本发明还涉及选择和检测药剂(如药物、化合物)对Per1和/ 或Bmal1基因表达影响，其在下文有详细描述。本发明的另一方面涉及用 于检测和监测帕金森病的诊断试剂盒，其在下文有详细描述。

本发明的实施过程中，用到了许多分子生物学、蛋白生物化学、细胞 生物学、免疫学以及微生物学中的常规技术。这些公知技术分别在下列文 献中有解释：例如：Current Protocols in Molecular Biology，Vols.I-III， Ausubel，Ed.(1997)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；DNA Cloning：A Practical Approach，Vols.I and II， Glover，Ed.(1985)；Oligonuchotide Synthesis，Gait，Ed.(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames & Higgins，Eds.(1985)；Transcription and Translation，Hames & Higgins，Eds.(1984)；Animal Cell Culture，Freshney， Ed.(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Meth.Enzymol.， (Academic Press，Inc.，1984)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells， Miller & Calos，Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1987)；和Meth. Enzymol.，Vols.154 and 155，Wu & Grossman，and Wu，Eds.。检测和测量 信使RNA基因表达产物水平(即基因转录水平)的方法是本领域公知的， 其包括mRNA的检测方法，如RT-PCR和印迹技术。

III诊断和监测PD的方法

一方面，本文提供了诊断、监测PD和筛选治疗PD的化合物的方法。 在一些实施方案中，该方法包括测量受试者血液样品中分子时钟基因表 达。在白天或夜间特定时间时钟基因的表达水平提供了有关受试者是否患 有帕金森病或其分级的信息。在一些实施方案中，时钟基因在特定时间点 的表达可用于确定受试者是否患有帕金森病或其分级，在其它一些实施方 案中，在几个时间点的表达模式可用于确定受试者是否患有帕金森病或其 分级。

A.PD昼夜节律的分子特征

帕金森病患者经常会经受各种各样受昼夜节律控制的生理性改变。 Bruguerolle et al.，Clin Neuropharmacol 25：194-201(2002)。例如，帕金森 病患者的血压缺少了其正常的昼夜节律从而导致了一天内血压的显著变 化。另外，他们的交感神经早间峰值和心率昼夜调节丧失。最后，帕金森 病患者具有更高的皮质醇合成速率，伴随着变得平缓的每日皮质醇分泌曲 线。大多数帕金森病患者还患有睡眠紊乱、体温显著降低、次级异常症状 波动(second abnormal motor fluctuation)和时间依赖的多巴胺刺激反应。 Camara et al.，Chronobiol Intl 22(5)：917-924(2005)；Monge et al.，Clin Neuropharmacol 27：116-118(2004)。

Per1和Bmal1基因的表达遵循身体的昼夜节律。Per1、Bmal1和其它 基因(如Clock、Cry基因、其它Per基因、Dec基因和Rev-erbα)构成包 括身体分子时钟的自调节网络。Rutter et al.，Annu Rev Biochem 71： 307-331(2002)；Honma et al.，Nature 419：841-844(2002)；Lowrey et al.， Annu Rev Genet 34：533-563(2000)。时钟基因的转录和翻译的正负调节构 成了一个互联的反馈回路，该回路驱动细胞内生物钟的自维持振荡。具体 的，CLOCK和BMAL1蛋白形成了诱导Period基因Per1、Per2和Per3 以及隐花色素基因Cry1和Cry2的表达的二聚体。由PER和CRY蛋白形 成的二聚体接着以负调节方式作用，其通过转位回细胞核和抑制 CLOCK/BMAL1二聚体的活性来完成反馈回路。其他次级调节过程对核 心时钟机制的精细调节也有贡献。Liu et al.，Chronobiol Intl 24(5)：793-820 (2007)。所得的分子时钟具有全身性，并被广泛研究，例如，在下丘脑腹 侧的视交叉上核(suprachiasmic nucleus)以及外周组织中。Reppert & Weaver，Annu Rev Physiol 63：647-676(2001)；Fukuhara & Tosini，Front Biosci 8：642-651(2003)。时钟系统因此包括一个复杂的分级结构，其中视 交叉上核的时钟基因振荡传遍整个大脑并通过神经及体液系统到达外周 组织。Albrecht & Eichele，Curr Opin Genet Dev 13：271-277(2003)。

在分子时钟基因中，Per1表现出强有力的振荡，而Bmal1是时钟的中 心调控子。Ko & Takahashi，Hum Mol Genet 15：R271-277(2006)； Dardente & Cermakian，Chronobiol Int 24：195-213(2007)。Per1和Bmal1 的表达在健康受试者的全血细胞中振荡，从而建立了Per1和Bmal1表达 的参考水平。Boivin et al.，Blood 102：4143-4145(2003)；Takimoto et al.， Amer J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289(5)：R1273-1279(2005)； Fukuya et al.，Biochem Biophys Res Commun 354(4)：924-8(2007)；James et al.，Chronobiol Int 24(6)：1009-34(2007)。在年轻人的外周血单个核细胞以 及多形核细胞中Per1表达表现出相似的24小时模式，表明在不同血细胞 类型中存在相似的时钟基因活性。Kusanagi et al.，Neurosci Lett 365(2)： 124-7(2004)。特别地，Per1在血液、口腔粘膜、皮肤和骨髓CD34+祖细 胞中的表达通常在早间达到峰值，而在白细胞中Bmal1表达的峰值则在一 天的晚些时候或夜间出现，在口腔粘膜细胞和皮肤细胞中在傍晚稍晚些时 候或夜间出现。

B.Per1和Bmal表达的测量

Per1或Bmal1的表达可以在下列样品中测量，其包括但不仅限于，例 如，全血、部分血液成分或其它身体组织。因此，在本方法的一个实施方 案中，Bmal1或Per1的表达水平在血液样品中测定，在另一个实施方案中， Bmal1或Per1的表达水平在外周白细胞中测定。

可以通过确定样品中存在的Per1或Bmal1的信使RNA(mRNA)转 录物的量来测量Per1和Bmal1的表达水平。大多数基因，包括Per1和 Bmal1，携带有细胞合成特定蛋白质分子的信息。基因表达是指基因信息 转化成细胞结构、功能和行为的多步过程。该过程包括转录和翻译，借助 转录基因信息被拷贝到mRNA分子中，借助翻译mRNA分子编码的信息 被用来合成蛋白质分子。mRNA和蛋白质在细胞内都可具有多种作用。因 此，转录自一个特定基因的mRNA分子数与基因表达相关。

mRNA的分子数可以通过几种本领域技术人员已知的成熟方法进行定 量。第一步可以包括用公知的常规方法，如苯酚/氯仿提取后2-丙醇沉淀法， 制备样品的总RNA。另外，许多采用固相离心柱的商品试剂盒的方法也是 可用的。在一些实验方案中，在样品中加入一些特殊的酶来除去基因组 DNA污染。

RNA分离完成之后，有几种技术可以用来测定制备的总RNA中的特 定目标mRNA的量。例如，印迹和扩增方法都适用于通过mRNA的定量 来测量基因的表达水平。总的来说，这些技术测定了与转录自特定基因的 mRNA分子数成比例的信号。使用寡核苷酸探针的印迹以及使用寡核苷酸 引物的PCR是两种mRNA定量的方法。其它一些可以被采用的高通量测 定方法有基因表达系列分析(serail analysis of gene expression，SAGE)、 微阵列法以及表达序列标签(expressed sequence tag，EST)分析。

在所公开方法的一个实施方案中，Per1和Bmal1的表达水平通过印迹 方法，如northern印迹测定。如本文中所用的，“northern印迹”意为包 含所有基本的RNA检测方法(包括点印迹和狭缝印迹)在内的各种变化。 在典型的印迹方法中，总RNA被分离并通常是根据尺寸不同采用电泳法 分离。电泳包括将分离后的样品置于凝胶的孔中，其中凝胶可以是变性的 或非变性的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。对凝胶加以直流或脉冲电流，样品 中的各组分根据分子大小、构象、电荷和/或物理性质的组合进行分离。

随后，凝胶上的RNA被转移到膜上。转移方法是本领域公知的，其 包括但不仅限于，通过毛细管作用、吸取和通过加载电场进行转移。在转 移和固定在滤纸或膜上之后，采用标记的序列特异的探针通过序列特异杂 交对特定基因的mRNA进行定量。该探针将与固定在膜上的RNA结合， 并通过各种显影方法(如放射性标记、荧光、化学发光、比色)以确定特 定RNA的量。样品中存在的mRNA分子数以结合在目标mRNA上标记 过的探针量所产生的信号强度来表示。

在另外一个实施方案中，通过定量PCR测量Per1和/或Bmal1的表达 水平。定量PCR方法由标准PCR变化而来，其是分子生物学中广泛应用 的通过体外酶复制扩增一段DNA或RNA的技术。PCR需要热稳定的聚 合酶(如Taq聚合酶)，特异性针对目标DNA或RNA序列扩增的被称作 寡核苷酸引物的短DNA分子，四种单独的DNA核苷酸单体以及合适的缓 冲液。这些组分均有市售的。在将这些反应组分与样品混合后，反应采用 常规实验室仪器进行热循环，使得目标DNA或RNA序列进行指数式链式 反应和扩增。通过标准PCR，有可能将一个或几个拷贝的DNA片段进行 几个数量级的扩增，产生百万计或更多拷贝的DNA片段。然而，可以对 PCR进行大量修改以进行一系列的基因操作或提供定量特定种类RNA的 方法。在定量PCR中，反应所得产物的量与样品中特定RNA的量成正比。

为了对特定的信使RNA分子进行定量，使用逆转录酶合成样品中 mRNA的互补DNA(cDNA)拷贝。随后，使用PCR扩增cDNA拷贝以 确定样品中最初的mRNA分子数。可以使用多种信号进行定量，其包括但 不仅限于：荧光、溴化乙锭染色和化学发光法。在一些定量PCR方法中， 使用另外的荧光标记探针进行mRNA的定量。可以用来定量Per1的引物 实例有：正向引物SEQ ID NO：1和反向引物SEQ ID NO：2，Boivin et.al， Blood 102：4143-4145(2003)；可以用来定量Bmal1的引物实例有：正向引 物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ ID NO：4，Chen at al.，Pediatr Res 58： 1180-1184(2005)。

采用合适的方法，探针SEQ ID NO：5可以用来检测Per1而SEQ ID NO：6可以用来检测Bmal1。Boivin et al.，Blood 102：4143-4145(2003)； Chen at al.，Pediatr Res 58：1180-1184(2005)。这些探针通常在其一端具有 荧光标签而另一端具有淬灭剂染料。例如，这些探针可以在5′端具有荧光 标签例如6-羧基荧光素(缩写为FAM)，而在3′端具有淬灭剂染料如四甲 基罗丹明(缩写为TANMRA)。采用这类引物的一种方法被称作“Taqman” 法。Heid et al.，Genome Res 6：986-994(1996)。其它适当的Per1和Bmal1 基因特异性的引物和探针也可以在其它一些检测方法中使用。

一方面，测量Per1或Bmal1表达水平包括将Per1或Bmal1的量相对 于“管家”基因mRNA的量进行归一化。细胞或样品中mRNA的总量变 化会影响到该样品中具体的目标mRNA的量。例如，样品中总RNA的分 离和回收效率的变化以及样品中总RNA非特异性降解会影响到特定目标 mRNA的定量。为了解决此问题，采用表达水平相对恒定的特定基因作为 内参对不同样品和制备物中目标mRNA定量进行归一化。涉及总体的和/ 或重要的细胞维持活动的管家基因被用作此目的。这些活动的例子有胞内 运输、总体代谢和蛋白质合成。一些涉及这些过程的并被本领域技术人员 普遍用于归一化的管家基因包括但不仅限于：编码hCDK4、β-肌动蛋白、 3-磷酸甘油醛脱氢酶和18S核糖体RNA的基因。使用上述方法对这些管 家基因进行定量。在一个实施方案中，可通过定量PCR测定18S核糖体 RNA基因表达，其使用正向引物SEQ ID NO：7和反向引物SEQ ID NO： 8，以及探针SEQ ID NO：9。

在一个实施方案中，可以通过确定样品中生物标志物多肽的量来测量 一种或多种生物标志物的表达水平。可通过抗体检测多肽，所述抗体是具 有可检测标记的，或可以随后被标记的。可以采用多种形式来确定样品是 否包含与给定抗体结合的目标蛋白。可用于检测生物标志物的免疫检测方 法包括但不仅限于：例如点印迹、western印迹、蛋白芯片、免疫沉淀(IP)、 竞争性和非竞争性蛋白结合测定、酶联免疫测定(ELISA)和其他一些常 规使用并在科技文献和专利文献中广泛描述的方法以及许多商业应用的 方法。本领域技术人员可以轻易调整已知的蛋白/抗体检测方法以用于确定 样品中是否包含生物标志物和样品中该特定多肽表达产物的相对浓度或 变体形式。可以采用本领域技术人员熟知的技术分离来自受试者的蛋白。 所采用的蛋白分离方法包括但不仅限于，如Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)中所述。

抗体可以用于下列方法以检测表达的生物标志物，所述方法包括但不 仅限于：如，western印迹或ELISA。在这些应用中，可以将抗体或蛋白 固定在固体支持物上。支持物或载体包括任何能与抗原或抗体结合的支持 物。公知的支持物或载体包括但不仅限于：例如，玻璃、聚苯乙烯、聚丙 烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的或修饰的纤维素、聚丙烯酰 胺、辉长岩和磁石。

在一个实施方案中，western印迹可用于检测生物标志物。如本文所使 用的，“western印迹”旨在包括基本蛋白检测方法的所有变化。本领域中 western印迹技术已非常成熟，其通常包括在变性或非变性条件下通过 PAGE基于质量进行蛋白分离，及随后的检测步骤。免疫荧光和酶免疫检 测(EIA)技术都已非常成熟。但是，也可使用其它的一些报告分子，其 包括但不仅限于：例如，放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对于 本领域技术人员，如何改变所述过程使之适合所需的要求是显而易见的。

在另外一个实施方案中，IP测定可以用于生物标志物检测。如本文所 使用的，“免疫沉淀”或“IP”旨在包括基本蛋白检测方法的所有变化。免 疫沉淀技术已非常成熟，其通常包括采用特异或非特异的抗体使样品中蛋 白沉淀。随后可以通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白，接着是检测步骤。但 是，也可使用其它的报告分子，其包括但不仅限于：例如，放射性同位素， 化学发光和生物发光分子。对于本领域技术人员来说，如何改变所述过程 使之适合所需应用是显而易见的。

在另一个实施方案中，存在很多变化的ELISA法和/或夹心ELISA法 可用于本发明的方法和测定。如本文所使用的，“ELISA”旨在包括基本免 疫吸附测定的所有变化。如本文所使用的，“夹心测定”旨在包括基本的 双位点免疫吸附结合技术的所有变化。在本领域中免疫荧光和EIA技术都 已非常成熟。然而，也可使用其它的报告分子，其包括但不仅限于：例如， 放射性同位素、化学发光和生物发光分子。对于本领域技术人员来说，如 何改变所述过程使之适合所需应用是显而易见的。

B.Per1和Bmal1表达水平和参考水平的比较

在另外一方面，本文提供了受试者样品中Per1和/或Bmal1表达水平 与参考水平的比较。这些基因即为生物标志物，也就是，与受试者相关的 生物化学特征与方面，其可用来测量疾病发展或衰退和/或治疗效果。当与 参考水平相比较时，本文所述的生物标志物的表达水平可以与受试者发病 状态相关联。因此，生物标志物可以作为受试者患病或健康状态的指示。 帕金森病患者的Per1和/或Bmal1表达特征谱为确定患者中PD状态提供 了诊断工具。因此，在一个实施方案中，受试者样品中Per1和/或Bmal1 与参考水平相近的表达指示出受试者未患帕金森病。在另一实施方案中， 受试者的样品中Per1和/或Bmal1的表达与参考水平的差异指示出受试者 患有帕金森病或其严重程度。而在另一个实施方案中，可以通过不同时间 的Per1和/或Bmal1的表达与参考水平的比较来监测帕金森病的发展或衰 退。

可以采用统计方法来设置阈值以确定何时可认为受试者表达水平与参 考水平有差异或相似。另外，统计方法可以用于确定患者所观察到的基因 表达水平和参考水平的差异或相似的有效性。有用的统计分析方法在L.D. Fisher & G.vanBelle，Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences (Wiley-Interscience，NY，1993)中有描述。例如，置信度(“p”)可以通过未 成对双侧t检验进行计算，如果p值小于或等于0.05，则认为组间具有显 著性差异。在一个实施方案中，受试者Per1或Bmal1表达水平与参考水 平的比较是通过被称作Man-Whitney U检验的统计学方法实施的。

II.治疗方案和有效化合物筛选方法的选择

本文所述的方法可以用于帕金森病的预后、诊断、分级、治疗以及选 择和/或筛选测试化合物。在一些实施方案中，这些方法可以用于监测帕金 森病的进展，选择有效的特定治疗，和/或筛选对帕金森病的治疗和/或预 防可能有治疗或预防效果的化合物。因此，本文所描述的方法可以用于确 定在采用特定治疗方案和/或化合物后帕金森病是否存在。所述方法还可通 过检测生物标志物监测帕金森病治疗或提前确定多种治疗和/或化合物是 否有效。由此，一些实施方案提供了用于确定受试者是否有帕金森病发病 风险、选择临床实验的受试者、检测临床效果和划分受试者的预后或预测 测定。

在一个实施方案中，测定可以以预后或预测为目的用于确定受试者是 否具有发生帕金森病的风险，以及随后任选地在受试者发病之前对其实施 预防性治疗。此外，本文所述的预后测定可以用于确定受试者是否可作为 临床试验的可能候选，其中可以确定所施用的帕金森病治疗是否有效。例 如，这些方法可用于确定受试者是否可以用影响时钟基因(例如但不仅限 于Per1和Bmal1)昼夜节律表达的化合物来有效治疗帕金森病。因此，本 发明提供了用于确定受试者是否可以用针对PD的化合物有效治疗的方 法，其中获得测试样品并将本文所述的生物标志物与参考水平相比较(例 如，其中受试者Per1或Bmal1表达水平的升高或降低是施用所述化合物 预防和/或治疗帕金森病的诊断依据)。因此，可以在临床试验前根据本文 所述的诊断测定结果对受试者进行分类。对此，本发明的一个实施方案提 供的化合物可用于筛选其中有效治疗帕金森病的，其中受试者分类可以在 得到治疗/临床试验结果后重新评估。

帕金森病患者通常经受着多种睡眠紊乱，导致了夜间睡眠异常。因此， 一方面，本方法包括测量在一个或多个时间点处Per1和/或Bmal1的表达 水平，所述时间点包括至少一个处于昼夜循环中夜间部分的时间点。如上 所讨论的，帕金森病患者昼夜节律发生改变，可以通过监测Per1和/或 Bmal1表达检测这些改变。实施例1报道了帕金森病患者和健康对照中这 两个基因的夜间表达水平。在帕金森病患者和健康对照中，Per1的表达从 21:00到06:00整个夜间一直增加。但是，尽管帕金森病患者的Per1表达 水平在09:00继续增加，而健康对照的表达水平在此时间点时下降。因此， 在一个实施方案中，Per1的表达模式可以作为受试者患有帕金森病或其分 级的指示，相比健康对照在所述表达模式中Per1的表达在09:00时增加。

在一个实施方案中，一个或多个样品取自约23:00到约09:00。在另一 个实施方案中，一个或多个时间点选自：20:00到22:00、23:00到01:00、 05:00到07:00和08:00到10:00。在另外一些实施方案中，一个或多个时 间点选自：约21:00、约00:00、约06:00以及约09:00。

各个时间点处的Per1或Bmal1表达可用于确定受试者是否患有帕金 森病或其分级。观察到特定时间点的Per1和Bmal1表达在健康受试者和 帕金森病患者之间是不同的。因此，在一个实施方案中，在以下至少一个 时间受试者Bmal1的表达水平相对于参考水平下降可以指示出受试者患有 帕金森病或其分级，所述时间为：约21:00、约00:00或约06:00。

另外，可以通过在两个或更多时间点测量Per1或Bmal1的表达水平 以及比较测量结果来确定Per1或Bmal1的表达模式。已在帕金森病患者 中观察到这些时钟基因表达模式相对于健康对照受试者的差异。在一个实 施方案中，在约21:00和约00:00时比约06:00和约09:00时要低的Per1 表达模式指示出受试者患有帕金森病。在所述方法的另一个实施方案中， 在约21:00和约09:00时比约00:00和约06:00时要高的Per1表达模式指 示出受试者未患帕金森病。

为了推导对治疗的临床响应与特定生物标志物水平之间的相关性，需 要获取接受治疗的受试者群体(即临床群体)的临床响应数据。可以通过 对临床试验结果的回顾性分析得到这些临床数据。在一个实施方案中，可 以通过设计并实施一个或多个新的临床试验得到所述临床数据。临床群体 数据分析可用于定义标准参考群体，接着可用于以参与临床试验和选择治 疗方案为目的将受试者分类。在一个实施方案中，对临床群体中的受试者 针对帕金森病的存在进行分级。对潜在受试者的分级包括但不仅限于：例 如Hoehn & Yahr分级法或UPDRS得分分析并随后确定临床群体中生物 标志物水平相对于对照群体升高或降低。在一个实施方案中，根据受试者 中一个或多个生物标志物(例如，Per1或Bmal1的表达)的测量水平和标 准参考群体中所观察的相同生物标志物水平的相似性，可以将其划分或分 配为特定的组或类。

在另一个实施方案中，将感兴趣的治疗方案施加于实验群体中每个受 试者，通过一个或多个预先确定的标准测量每个受试者对治疗的反应(即 治疗的效力)。在许多情况下，预期试验群体会表现出一系列的响应，研 究人员将选择由多种响应组成的响应者分组的数目(例如高、中、低)。 另外，对生物标志物(如Per1或Bmal1)的表达水平进行定量，这可以在 治疗前和/或后实施。接下来对这些结果进行分析以确定是否组之间观察到 的任何临床响应(即疗效)改变是统计学显著的。可用的统计分析方法在 Fisher & vanBelle，Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences (Wiley-Interscience，NY，1993)中有描述。

本领域技术人员可以建立数学模型以预测作为上述分析中生物标志物 表达水平函数的临床响应或帕金森病分级。临床响应和生物标志物表达水 平之间相关性的鉴定可以作为设计诊断方法的基础，所述诊断方法用以确 定受试者是否对治疗有响应，或者以较低水平响应由此可能需要更多的治 疗(例如更大剂量的化合物、药物或治疗)。所述诊断方法可以采取几种 以下数种形式之一，例如但不仅限于，如印迹方法、定量PCR、微阵列实 验、SAGE分析或EST分析。唯一的要求是诊断测试结果和潜在的帕金森 病之间具有相关性。在一个实施方案中，诊断方法采用Taqman PCR来确 定如上所述的Per1和/或Bmal1的表达水平和表达模式。

在一个实施方案中，一个或多个生物标志物的表达水平相关于帕金森 病分级。可以通过基于Hoehn & Yahr量表对患者进行分类实施帕金森病 的进行性监测，所述量表将其分为五个不同的分级。每个分级描述了与帕 金森病相关的症状和临床表现。所述分级由以下组成：(1)只有身体一侧 有症状；(2)身体两侧都有症状但平衡能力没有被破坏；(3)轻度至中度 的平衡能力破坏但患者身体独立；(4)患者严重残疾，但患者仍可以在无 帮助情况下行走或站立；(5)患者在无帮助情况下只能坐在轮椅上或卧床。 参见Hoehn & Yahr，Neurology.17：427-442(1967)。

在另一个实施方案中，帕金森病综合评分量表(UPDRS)可以根据临 床表现将患者划分为四个不同分级，以用于监测帕金森病的发展。每个分 级用5分制评分，其对帕金森病的临床表现排序。组成每个分级的症状涉 及：(1)精神状态、行为和情绪方面，其中对智力损伤、思维混乱、动机/ 主动性和抑郁进行评价；(2)日常生活行为方面，其中对语言、流涎、吞 咽、书写、切割食物、穿衣、卫生、在床上翻身、摔倒、静止、行走、震 颤和感觉疾病进行评价；(3)运动检查方面，其中对语言、面部表情、静 止时震颤、行动震颤、强直、手指拍打、手部移动、手部翻转、腿部灵活 性、从椅子中站起、姿势、步态、姿势稳定性和身体运动迟缓进行评价； (4)治疗并发症方面，其中对运动功能障碍持续时间、运动功能障碍程度、 运动功能障碍的疼痛、凌晨肌张力障碍、关-可预测(offs-predictable)、 关-不可预测(offs-unpredictable)、关-突然(offs-sudden)、关-长期 (offs-duration)、厌食、恶心、呕吐、睡眠障碍以及有症状的姿势性低血 压进行评价。参见Rascol et al.，Lancet 359：1589-1598(2002)。

睡眠紊乱在帕金森病患者中有许多报道，Young et al.，Sleep 25：573-577(2002)。因此，在另一个实施方案中，使用匹兹堡睡眠质量指 数(PSQI)对帕金森病患者睡眠质量进行分级。PSQI评价一个月时间间 隔的睡眠质量，它基于十九个单项，得到七个部分的评分：主观睡眠质量、 入睡潜伏期、睡眠时间、习惯睡眠效率、睡眠障碍、睡眠药物的使用以及 日间功能障碍。Buysse et al.，Psychiatry Res 28：193-213(1989)。

因此，所公开生物标志物的表达水平可与Hoehn & Yahr和/或UPDRS 分级相关，或者与PSQI相关，以用于帕金森病的预后、诊断、治疗选择、 监测和/或治疗化合物的筛选。

统计学方法可以用于表征两个变量之间的相关性程度，例如，帕金森 病严重程度或睡眠质量与Per1或Bmal1表达之间。总的来说，相关性是 指两个独立变量之间的偏离，可以计算得到几个衡量相关性程度的系数。 尽管可以在不同的情况下使用许多不同系数，最著名的Pearson积矩相关 系数是通过两个变量的协方差除以它们的标准偏差的乘积得到的。在本方 法的一个实施方案中，确定受试者是否患有帕金森病或其分级的步骤是通 过对Hoehn & Yahr分级系统所确定分级和受试者Per1或Bmal1的表达水 平与参考水平相比的差异之间实施Pearson相关性分析得到的。

在一个实施方案中，以这些测定和指示因素为指导，感兴趣的治疗性 或预防性治疗可以选自：蛋白质、多肽、肽、核酸、病毒、病毒样核酸、 氨基酸类似物、经修饰氨基酸、经修饰氨基酸类似物、类固醇、蛋白多糖、 脂类和碳水化合物，或其组合(例如：包含蛋白质和DNA组分的治疗或 者一对或一组治疗，其中一个或多个成分将其它成分转化为活性形式，例 如通过催化)。

在另一个实施方案中，治疗性或预防性治疗可包括核酸，其包括但不 限于：例如，寡核苷酸或经修饰寡核苷酸、反义寡核苷酸或经修饰反义寡 核苷酸、核酸适体(aptamer)、cDNA、基因组DNA、人工或天然染色体 (例如，酵母人工染色体)或其一部分、RNA(包括siRNA、shRNA、 mRNA、tRNA、ncRNA、rRNA)或核酶；肽核酸(peptide nuleic acid， PNA)或锁核酸(locked nucleic acid，LNA)；病毒或病毒样颗粒；核苷 酸或核糖核苷酸或其合成类似物，它们可以是经修饰的或未经修饰的。所 述治疗还可以是氨基酸或其类似物，其可以是经修饰的或未经修饰的或非 肽类(如胆固醇)激素；蛋白多糖；脂类；或碳水化合物。

在一个实施方案中，还可以使用小分子，其包括无机和有机物质。在 另一个实施方案中，所述小分子是药物活性剂。可用的药物活性剂种类包 括但不仅限于：例如，抗生素、抗炎药物、血管生成或血管活性剂、生长 因子和化疗剂。

在另一个实施方案中，感兴趣的治疗性或预防性治疗可选自包含PD 药物的组，所述PD药物包括但不仅限于：例如，左旋多巴、COMT抑制 剂、恩他卡朋、托卡朋、多巴胺激动剂、溴隐亭、普拉克索、罗匹尼罗、 阿朴吗啡金刚烷胺、抗胆碱、甲磺酸苄托品、丙环啶、比哌立登、和/或司 立吉林。

在另一个实施方案中，感兴趣的治疗性或预防性治疗实际上可以是手 术，其过程可以任选地选自：苍白球切开术、丘脑切开术、丘脑刺激、神 经组织移植和/或深度脑刺激(deep brain stimulation，DBS)。

在一个实施方案中，测定来源于受试者的测试样品中Per1或Bmal1 在第一个时间点处的表达水平，并将其与来源于受试者的测试样品在后一 个时间点处生物标志物的水平相比较。来源于受试者的测试样品在第一个 时间点处生物标志物的表达水平可以与来源于受试者的测试样品在第二 个时间点处的生物标志物的水平相比较，其中生物标志物在第一个时间点 和第二个时间点处表达水平的差异指示出需要帕金森病治疗的受试者。或 者，生物标志物在第一个时间点和第二个时间点处表达水平的差异指示出 对帕金森病治疗有反应的受试者。受试者中生物标志物的水平可以进一步 与Hoehn & Yahr和/或UPDRS分级或与PSQI相关联。可能需要进一步 的测试以做出阳性诊断。

本文还包括监测患者帕金森病进展的方法，其是出于选择治疗方案和/ 或筛选有用化合物的目的，其中测定来源于受试者的测试样品中生物标志 物在第一个时间点的表达水平(例如，Per1或Bmal1表达的升高或降低)， 并将其与来源于受试者的测试样品中生物标志物在后一个时间点处的水 平相比较。来源于受试者的测试样品中生物标志物在第一个时间点处的表 达水平可以与来源于受试者的测试样品中生物标志物在第二个时间点处 的水平相比较，其中生物标志物在第一个时间点和第二个时间点处的表达 水平的改善(即，向与参考水平更相似的水平变化)指示出有效的帕金森 病治疗或化合物。本领域技术人员可以轻易的理解用于选择治疗方案和/ 或筛选有用化合物的方法。有多种方法可被用于上述帕金森病的诊断性或 预后性评价，包括Per1或Bmal1和本文所述的所有生物标志物，以及受 试者是否易患这些疾病的鉴别/治疗。

在一个实施方案中，可通过测量不同对照群组的表达水平确定Per1或 Bmal1表达水平的标准对照。接着将参考水平与本文所述的给定受试者的 生物标志物的测量水平相比较。根据测量水平与给定组对照水平相比的相 似度，可以将受试者划分或分配为特定的组。

本领域技术人员会理解，做出这种测定具有某种程度上的不确定性。 因此，对照组表达水平的标准偏差可以用于做出概率性判定，本文的方法 在宽范围的基于概率的基因型或表型组判定中都适用。因此，例如，但不 仅限于，在一个实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组 平均值的2.5个标准偏差以内，则受试者可以被分配到该组中。在另一个 实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的2.0个 标准偏差以内，则受试者可以被分配到该组中。在另一个实施方案中，如 果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的1.5个标准偏差以内， 则受试者可以被分配到该组中。在另一个实施方案中，如果生物标志物的 测量水平落入任意对照组平均值的1.0个标准偏差以内，则受试者可以被 分配到该组中。因此，该过程允许在多种概率度下做出判定，将特定受试 者分配至应该处于的组内，并且这种分配接着会将风险分类确定至个体应 该处于的位置。

IV.PD诊断试剂盒

在另一方面，本文提供可用于确定受试者中PD预后、诊断或监测受 试者中PD的检测试剂盒。该试剂盒还可用于划分选来进行临床试验的受 试者。具体而言，本发明包括用于测量样品中一个或多个时钟基因表达的 试剂盒。例如，该试剂盒可以包含一个能够检测样品中时钟基因表达的标 记的化合物或试剂。

在一个实施方案中，可通过使用预先包装的包含实施本发明任意方法 所需试剂的诊断试剂盒实施本文所述的方法。例如，这类试剂盒可包含用 于测量样品中Per1和/或Bmal1水平的检测试剂。在这类试剂盒的一个实 施方案中，检测试剂是用于RT-PCR检测Per1或Bmal1的mRNA所需的 PCR引物和荧光标记探针。可以轻易的合成PCR引物并在多种制剂中稳 定保存很长一段时间，特别是以冻干或其他干燥方式下得到的粉末形式。 在这种形式下，本领域技术人员可使其轻易地复原。打算使用该试剂盒的 本领域技术人可以轻易的鉴定和配制其它使用该试剂盒所需的试剂和消 耗品。该试剂盒还可包含本发明方法中有用的酶和缓冲液。该试剂盒可以 包含试剂使用和结果分析的使用说明。

在另一个实施方案中，本发明所提供的试剂盒包含至少一个用作对照 的样品，其包装在一个或多个小瓶中。该试剂盒的每个组分可以装在单独 的容器中，所有的容器可以装在单个包装中，并附以分析试剂盒测定结果 的说明。

实施例

通过下列实施例进一步说明本文，但并不以任何方式构成限制。在下 文描述本节出现的实验的方法。

方法

受试者。在征得同意后，招募了十七位神经学家认为的帕金森病患者。 运动障碍专家确认了对所有患者的初发性帕金森病的临床诊断。病情严重 程度评价采用帕金森病综合评分量表(UPDRS)和Hoehn & Yahr分级系 统。参见Recent Development in Parkinson’s Disease.MacMillan Health Care Information，Florham Park，NJ；1987：153-163；Hoehn & Yahr， Neurology 17：427-442(1967)。睡眠质量通过匹兹堡睡眠质量指数(PSQI) 确定。Buysse，et al.，Psychiatry Res 28：193-213(1989)。

从当地社区招募了十六位性别年龄匹配的健康的非帕金森病对照。 帕金森病患者的平均年龄为62.2±2.8岁，健康对照的为57.8±1.1岁。在 研究期间，所有的受试者一日三餐常规饮食，饮食时间平均分别在07:00 到08:00之间，11:30到12:30之间，和19:00左右进行。被研究的受试者通 常在22:00左右睡觉，约06:30起床。他们在实验前一周以及实验期间不 饮酒或咖啡因。血液样品分别在十二个小时周期内的21:00、00:00、06:00 和09:00时采集。所有受试者继续其日常生活，除了在睡眠障碍实验室过 夜睡眠以进行血液取样。实验室照明在睡眠期间维持在低于10lux的水平， 室温整夜维持在23±1℃。

血液总白细胞的制备。在肘前静脉血管内插入内置导管十二小时， 将血液样品在每个设定时间时收集到PAX基因血液RNA试管中(Qiagen， Alameda，CA)。

RNA制备、逆转录和实时PCR测定。根据PAX基因血液RNA试 剂盒的说明手册分离样品中的总RNA，接着进行RQ1无RNA酶的DNA 酶I(Promega，San Luis Obispo，CA)处理以除去可能的基因组DNA污染。 通过Superscript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。Per1、 Bmal1和18S核糖体RNA基因的表达水平通过TaqMan定量实时逆转录 聚合酶链式反应(RT-PCR)确定。扩增引物和探针从Sangon，Inc. (Shanghai，China)订购。引物和探针对设计如下：对于Per1(正向： 5′-TTCCTGACGGGCCGAAT-3′(SEQ ID NO：1)；反向： 5′-CGCTTGCAACGCAGCA-3′(SEQ ID NO：2)；TaqMan探针： 5′-FAM-TCTACATTTCGGAGCAGGCAGCCG-Tamra-3’(SEQ ID NO： 5))，对于Bmal1，(正向：5′-CTCCAGCCCATTGAACATC-3′(SEQ ID NO： 3)；反向：5′-GCCTCATCATTACTGGGACT-3′(SEQ ID NO：4)； TaqMan探针：5′-FAM-CTCCCCCTGATGCCTCTTCTCC-Tamra-3′ (SEQ ID  NO：6))，以及对于18S基因，(正向： 5′-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3′(SEQ ID NO：7)；反向： 5′-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3′(SEQ ID NO：8)；TaqMan探针： 5′-FAM-CTCTAGCGGCGCAATACGAATGC-Tamra-3′(SEQ ID NO： 9))。

统计分析。Per1和Bmal1表达定义为每个血液样品相应的mRNA 与18S基因mRNA的比值。每个时间点的数据表示为平均值±标准误差 (SEM)。采用独立样品的双侧t检验进行同一时间点处两组中Per1和 Bmal1相对丰度的比较。帕金森病患者和对照受试者中Per1和Bmal1 mRNA的相对丰度也都标准化为个体平均值的百分数并通过组结合。采用 单向ANOVA进行数据标准化以检验12小时采样周期内不同时间点间的 差异，其可指示出时间依赖性。采用双侧Pearson’s相关系数评价Per1和 Bmal1相对表达水平与帕金森病严重程度以及睡眠质量度量的相关性。如 果p≤0.05，任何差异都认为具有统计显著性，或如果0.05＜p≤0.10，则 具有边界显著性。

实施例1

在此实验中研究了十七位帕金森病患者(9男；8女)，以及十六位 年龄匹配的对照(9男；7女)。在十二小时周期内的21:00，00:00，06:00和 09:00时从帕金森病患者和对照身上采集血样。制备总RNA，采用上述的 引物和探针通过TaqMan定量实时RT-PCR对Per1、Bmal1以及18S核 糖体RNA基因定量。数据结果呈现在下面表1中。

将Per1和Bmal1的平均丰度相对于18S核糖体RNA基因表达进 行归一化。p值由未成对双侧t检验计算得到，如果p≤0.05则表示组间差 异显著。

在十二小时时间间隔的研究中，通过ANOVA观察到显著的时间依 赖性。在健康对照和帕金森病患者的Per1中观察到的ANOVA p值小于 0.001，在帕金森病患者Bmal1中观察到的ANOVA p值小于0.001，而对 照的则小于0.017。在帕金森病患者和健康对照中，Per1的表达在夜间从 21:00到06:00一直升高。然而，尽管帕金森病患者的Per1表达水平在09:00 继续升高，而健康对照的则在此时下降。因此，Per1和Bmal1是帕金森病 生物标志物，测量这些生物标志物的表达可用于诊断和监测受试者帕金森 病的方法。

实施例2

通过统计方法分析来自实施例1的数据。帕金森病患者的严重程度 用Hoehn & Yahr分级系统或UPDRS量表表示。平均Hoehn & Yahr分级 为2.0±0.2(范围：1到4)，平均UPDRS得分为28.3±4.5(范围：8到70)。 使用统计分析确定Per1和Bmal的表达(上述)和帕金森病严重程度的相 关性。根据Hoehn & Yahr或UPDRS评分在21:00、00:00和06:00显示 的结果将帕金森病患者进一步分组，无论帕金森病严重程度如何患者的 Bmal1表达都低于对照组。09:00时，UPDRS得分小于20的帕金森病患 者的Bmal1丰度较低，其中在UPDRS表，20是被选为区分严重病例(＞20) 和非严重病例(≤20)的切断值。帕金森病患者的Per1表达水平在00:00， 06:00和总体时间内与UPDRS得分相关，Bmal1表达水平在06:00，09:00 和总体时间内与UPDRS得分相关。Per1基因表达和Hoehn & Yahr量表 的帕金森病严重程度的相关性在00:00时和总体时间内具有显著性，而 Bmal1基因表达与之的相关性在09:00和总体时间内具有显著性。因此， 测量Per1和Bmal1等生物标志物的表达可用于确定受试者帕金森病分级 的方法。

表2.外周白细胞中Bmal1的表达

在上面的表格中，将Bmal1的平均丰度相对于18S核糖体RNA 基因的表达进行归一化。疾病严重程度采用帕金森病综合评分量表 (UPDRS)和Hoehn & Yahr分级系统进行评价。p值通过未成对双侧 t检验计算得到。如果p≤0.05，则组间差异认为具有统计显著性；如果 0.05＜p≤0.10，则具有边界显著性。

实施例3

在睡眠质量和Bmal1表达相关性实验中研究了十七位帕金森病患 者(9男8女)，以及十六位年龄匹配的对照(9男7女)。采用匹兹堡睡眠 质量指数(PSQI)确定睡眠质量，它是用来测量老年人睡眠的质量和模式。 通过对七个方面的测量来区分睡眠的“好”和“坏”：一个月中的主观睡 眠质量、入睡潜伏期、睡眠时间、习惯睡眠效率、睡眠功能障碍、睡眠药 物的使用以及日间功能障碍。帕金森病患者PSQI的平均得分为6.4±1.2 (范围：1到17)，健康对照的平均得分为3.8±0.5(范围：1到10)，从 而导致他们睡眠质量具有边界显著差异(p＝0.069)。帕金森病患者和健康 对照的外周白细胞Bmal1表达的时间点平均值通过睡眠质量进一步分组。

通过匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)测量睡眠质量。通过未成对双侧t 检验计算得到p值。如果p≤0.05，则认为对照组C1或C2间差异具有统 计显著性；如果0.05＜p≤0.10，则具有边界显著性。

在21:00，00:00，和06:00时，与所有对照和正常睡眠对照相比，观 察到正常睡眠(PSQI＜5)和劣质睡眠(PSQI≥5)的帕金森病患者的Bmal1 表达下降。09:00时没有观察到显著性差异。在任何时间点都未发现帕金 森病组内正常和劣质睡眠者的Bmal1水平有统计性差异(数据未显示)。

通过计算Pearson相关系数分析帕金森病严重程度或睡眠质量与时 钟基因(Per1或Bmal1)表达的相关性。帕金森病患者和对照组在单一时 间点处的Per1和Bmal1的表达通过UPDRS，Hoehn & Yahr评分法和PSQI 评分法评价。数据在表4中显示。

将Bmal1和Per1的表达相对于18S核糖体RNA的基因表达进行 归一化。采用帕金森病综合评分量表(UPDRS)或Hoehn & Yahr(HY)分级 系统评价疾病严重程度。睡眠质量通过PSQI进行分类。通过线性回归分 析计算R2和p值，如果p≤0.05则具有组间显著相关性。

两个独立的帕金森病严重程度评价方法(Hoehn & Yahr和 UPDRS)之间有很强的联系，其p＜0.001。特别是，帕金森病患者时钟基 因Per1的表达水平在00:00、06:00和整体时间时与UPDRS得分相关， Bmal1的表达水平在06:00、09:00和整体时间时与UPDRS的得分相关。 Per1时钟基因表达与Hoehn & Yahr分级只在00:00时和整体时间时具有 显著相关性，对于Bmal1在09:00时具有显著相关性。

另外，不论采用哪种帕金森病严重程度的评价方法，睡眠质量随着 帕金森病的发展也会恶化。帕金森病患者中在00:00和06:00时，无论Per1 还是Bmal1的表达都与PSQI得分正相关。在对照受试者中未观察到相关 性。因此，测量Per1和Bmal1等生物标志物的表达可用于确定受试者中 PD状态的方法。

等同方案

本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案。对于本领域技术人 员而言显而易见的是，可以进行许多修改和改变，而不偏离其构思和范围。 结合上文的描述，本发明范围内除本文所列举以外的功能等同的实施方案 对于本领域技术人员而言将是很明显的。这些修改和改变旨在与权利要求 书所述等同方案的完整范围一起落入权利要求书的范围内。应当理解，本 发明不受限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物体系，它们当然是 可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案， 而不旨在限制。

另外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技 术人员会明白，本发明还就该马库什组的任何个体成员或成员亚组而言进 行了描述。

就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别 是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及全部可能的子 界及其子界的组合。任何列出的范围可以很容易地认为是对同一范围分成 相等的至少两部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而进行了描述。 作为非限制性的实例，每个本文讨论过的范围可以容易地分为前三分之 一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语例如 “多至”、“至少”、“多于”、“少于”等包括所提到的数值，并指可以如上 所述分成子界的范围。最后，本领域技术人员会理解，范围包括每个个体 成员。因此，例如，含有1-3个细胞的组是指含有1个、2个或3个细胞 的组。类似的，含有1-5个细胞的组是指含有1个、2个、3个、4个或5 个细胞的组，依此类推。

尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于 本领域技术人员来说也是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案用 于说明目的而非限制，真正的范围和构思由以下的权利要求进行说明。