用于特异性靶向全血中的人CD14+单核细胞的阳离子脂质体递药系统
阅读：686发布：2021-10-11
专利汇可以提供用于特异性靶向全血中的人CD14+单核细胞的阳离子脂质体递药系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含脂质和至少一种活性成分的脂质体，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜 抽取 的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞；本发明还涉及基于脂质的包含所述脂质体的药物组合物及其在与单核细胞相关的 预防 、 治疗 或改善病症例如癌症、感染性 疾病 、炎性疾病、自身免疫疾病或过敏症中的应用。，下面是用于特异性靶向全血中的人CD14+单核细胞的阳离子脂质体递药系统专利的具体信息内容。
1.脂质体，包含脂质和至少一种活性成分，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞。
2.权利要求1的脂质体，所述脂质体具有15-85％的相对ζ电位。
3.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述脂质体适合于静脉内施用。
4.上述权利要求任一项的脂质体，具有20-80％的相对ζ电位。
5.上述权利要求任一项的脂质体，具有25-75％的相对ζ电位。
6.上述权利要求任一项的脂质体，其中该脂质体包含低于20％、例如低于10％、优选低于5％、更优选低于2％的胆固醇，最优选基本上不含胆固醇。
7.上述权利要求任一项的脂质体，其中至少部分脂质选自磷脂类、甾醇类和甾醇衍生物。
8.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述脂质包含或构成选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、DPG(双磷脂酰甘油)、PEOH(磷脂酰醇)、胆固醇、麦角固醇和羊毛甾醇的成员。
9.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱。
10.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱，优选1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱。
11.权利要求1-8任一项的脂质体，其中所述磷脂酰乙醇胺类选自1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-二油酰基-磷脂酰乙醇胺；所述磷脂酰丝氨酸类选自1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸、
1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；所述磷脂酰甘油类选自1,2-二油酰基-磷脂酰甘油、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；且所述磷脂酸类选自二-棕榈酰基-甘油磷脂酸、二-硬脂酰基-甘油磷脂酸、二-肉豆蔻酰基-甘油磷脂酸、二-油酰基-甘油磷脂酸、棕榈酰基-油酰基-甘油磷脂酸。
12.上述权利要求任一项的脂质体，其中至少部分脂质是阳离子脂质。
13.权利要求12的脂质体，其中所述阳离子脂质选自十八酰胺(SA)、溴化月桂基三甲基铵；溴化十六烷基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、溴化二甲基二-十八铵(DDAB)、
3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、1,2-二-十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和DOTAP衍生物例如1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)和DODAP衍生物例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和
1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、
1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、SAINT-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)和GL67TM。
14.权利要求13的脂质体，其中所述阳离子脂质选自十八酰胺(SA)、1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、优选1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。
15.上述权利要求任一项的脂质体，其中至少部分脂质是阳离子脂肽，其选自脂质聚精氨酸缀合物、脂质TAT缀合物、脂质聚赖氨酸缀合物或阳离子脂多糖或脂多糖例如脂质脱乙酰壳多糖缀合物。
16.上述权利要求任一项的脂质体，其中该脂质体包含0.5-50％、优选1-20％、例如
3-15、例如7.5-12.5％(mol/mol)的阳离子脂质。
17.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述脂质的烷基链是C8–C24、优选C10–C22、更优选C12–C20、优选C14–C18、最优选C16–C18饱和链或不饱和链，优选饱和链。
18.上述权利要求任一项的脂质体，其中至少一种脂质体是大单层脂质体(LUV)。
19.上述权利要求任一项的脂质体，其中该脂质体具有以下直径：40-2000nm，优选
80-1000nm，更优选100-500nm，优选50-200nm，更优选100-150nm，优选100-400nm。
20.上述权利要求任一项的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，其为胞内蛋白和/或受体的配体。
21.权利要求20的脂质体，其中所述胞内蛋白和/或受体选自TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、NOD5、NALP1、NALP2、NALP3、NALP12、NALP14、IPAF、NAIP、CIITA、RIG-I、MDA5和LGP2，优选选自TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和NOD2，更优选TLR7。
22.权利要求21的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，选自聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、聚腺尿苷酸(聚A:U)、聚I:C-聚-L-赖氨酸(聚-ICLC)、聚-ICR、CL264、N-棕榈酰基-S-[2,3-双(棕榈酰基氧基)-(2R,S)-丙基]-(R)-半胱氨酸-(S)丝氨酸-(S)赖氨酸4(Pam3Cys)、单磷酰脂质A(MPLA)和其他脂多糖类、α-半乳糖基神经酰胺(αGC)、Propirimine、咪喹莫德(R837)、瑞喹莫德(R848)、Gardiquimod、R850(3M Pharma)、R851(3M Pharma)、852A(3M Pharma)、S-27610、3M-002(CL075)、3M-003、
3M-005、3M-006、3M-007、3M-012、3M-13、3M-031、3M-854(3M Pharma)、CL097、CL264、IC-31、洛索立宾和其他咪唑并喹啉类、ssPolyU、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、ANA975(Anadys/Novartis)、SM360320(Sumitomo)、R1354(Coley Pharmaceuticals)单链或双链RNA、ORN02(5’-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3’)、ORN 065’-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3’、CpG-ODN DSLIM(Mologen)、AVE 0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG B寡脱氧核苷酸(ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN1982、CpG B ODN 2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO 2125(Idera Pharma)、CpG A ODN 2216、CpG A ODN 2336、CpG
2395、CpG ODN7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚 草 过 敏 原 )(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、
10181SS(Dynavax Technologies)、IM02055(Idera Pharmaceuticals)、IRS954(Dynavax Technologies)、(鞭毛蛋白、胞壁酰二肽、皂苷类例如QS21、利什曼原虫属延伸因子、SB-AS4、苏氨酰-胞壁酰二肽、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。
23.权利要求22的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，选自单磷酰脂质A(MPLA)、咪喹莫德(R837)、瑞喹莫德(R848)、Gardiquimod、洛索立宾、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、SM360320(Sumitomo)、CpG B寡脱氧核苷酸 (ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN 1982、CpG B ODN
2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO 2125(Idera Pharma)、CpG A ODN 2216、CpG A ODN 2336、CpG 2395、CpG ODN 7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚草 过敏 原)(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、QS21、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。
24.权利要求23的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，选自米伐木肽(2-[(N-{(2R)-[(2-乙酰氨基-2,3-双脱氧-D-吡喃葡萄糖-3-基)氧基]-丙酰基}-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酰基)氨基]乙基(2R)-2,3-双(十六酰氧基)丙基磷酸氢酯)、L18MDP(6-O-硬脂酰基-N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺)以及上述举出的免疫刺激性化合物的酰化或C12-20饱和或不饱和酯或醚结合的衍生物。
25.权利要求1-19任一项的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫抑制化合物，包含类固醇，所述类固醇选自21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松、阿尔孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松半琥珀酸酯、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、Blovetasone、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、氟氢可的松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼龙、丙酮缩氟氢羟龙、福莫可他、氯氟舒松、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、利美达松、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、甲泼尼龙半琥珀酸酯、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、强的松龙棕榈酸酯、磷酸泼尼松龙、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、替可的松和曲安西龙。
26.权利要求25的脂质体，其中所述至少一种活性成分是是免疫抑制化合物，包含类固醇，所述类固醇选自倍他米松半琥珀酸酯、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、利美达松、甲泼尼龙半琥珀酸酯、强的松龙棕榈酸酯和磷酸泼尼松龙。
27.权利要求1-19任一项的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫抑制化合物，包含对胞内靶标起作用的小分子抑制剂，其选自c-Fms、PDGFRα、Abl、PDGFRβ、NFκΒ、IκΒ、JAK1、JAK2、JAK3、GSK3、p38MAPK、JNK、KIT、EGFR、ERBB2、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FLT3、PKCβ、RAF1、CDK1、CDK2、CDK4、NLRP3、IRF3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、Hsp90、Hsp70、PI3K、mTOR、AKT、DNA-PK、ATM、AMPK、PDK-1、S6激酶、RIP2、TRIF、MYD88、TAK1。
28.权利要求27的脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫抑制化合物，包
含对胞内靶标起作用的小分子抑制剂，其选自吲哚美辛、CLI-095(C15H17ClFNO4S,CAS#243984-11-4)、Bay11-7082(C10H9NO2S,CAS#19542-67-7)、雷 公 藤 内 酯 (PG 490)、CGP53716、SU9518、PD166326、南蛇藤醇、雷公藤红素(Tripterin)、BIRB-796(度马莫德)、SB 203580、SB202190、VX-702、NVP-BEZ235、GDC-0980(RG7422)、地 磷 莫 司( 地磷莫司,AP23573)、尼洛替尼(Tasigna,AMN107)、甲苯磺酸索拉非尼(多吉美)、达沙 替 尼(Sprycel,BMS-354825)、MLN518(CT53518)、伐 他 拉 尼 (PTK787/ZK222584)、OSI-930、AZD2171、帕唑帕尼(Votrient)、IPI-504(瑞螺旋霉素)、地磷莫司(地磷莫 司 )、GDC-0980(RG7422、C23H30N8O3S,CAS#1032754-93-0)、Palomid 529(C24H22O6CAS#914913-88-5)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec/Glivec)、依维莫司(Afinitor,RAD001)、西罗莫司(雷帕鸣,雷帕霉素)、坦西莫司(Torisel,CCI-779)、硼替佐米(Velcade)、吉非替尼(Iressa)、卡纽替尼(CI-1033、CAS#267243-28-7,C24H25ClFN5O3)、盐酸厄洛替尼(特罗凯)、培利替尼(EKB-569)(C24H23ClFN5O2,CAS#257933-82-7)、凡德他尼(Zactima,ZD6474,C22H24BrFN4O2,CAS No.:443913-73-3)、舒尼替尼(Sutent,SU-11248,C22H27FN4O2.C4H6O5、CAS No.:341031-54-7)、坦度替尼(MLN518)、C31H42N6O4,CAS No.:387867-13-2、细胞周期蛋白依赖激酶(塞利西利)、C19H26N6O,CAS No.:186692-46-6。
29.权利要求1-19任一项的脂质体，其中所述至少一种活性成分是诱导免疫耐受性的化合物，其选自维生素D3(1,25-二羟基维生素D3)和视黄酸(全反式和9-顺式视黄酸)及其相关合成或天然类似物和倍他米松半琥珀酸酯、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、利美达松、甲泼尼龙半琥珀酸酯、强的松龙棕榈酸酯和磷酸泼尼松龙。
30.权利要求1-19任一项的脂质体，其中所述至少一种活性成分是抗感染化合物，其选自利福平、双脱氧胞苷-5′-三磷酸、克拉霉素、阿昔洛韦、环丙沙星、夫西地酸钠、庆大霉素、氯霉素、左氧氟沙星、土霉素、妥布霉素、natriumcromoglicat、阿莫西林、氨苄西林、匹氨西林、厄他培南、美罗培南、多立培南、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、伐昔洛韦、依非韦伦、恩曲他滨、替诺福韦二吡呋酯、利匹韦林、青霉素、甲氧苄啶磺胺甲异噁唑合剂、利福平、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、伏立康唑、两性霉素B、卡泊芬净、氟胞嘧啶、伊曲康唑、脱氧土霉素、磺胺类和磺胺甲噁唑。
31.上述权利要求任一项的脂质体，还包含至少一种抗原作为活性成分。
32.权利要求31的脂质体，其中所述至少一种抗原选自癌抗原、自体抗原或自身免疫抗原、微生物抗原、过敏原或环境抗原。
33.基于脂质的用于靶向新鲜血液中的单核细胞的递送系统，该系统将至少一种活性成分递送至靶向的单核细胞并且至所述单核细胞处释放，所述系统包含：
(I)包含至少一种阳离子脂质的脂质；和
(II)至少一种活性成分；
所述脂质能够形成脂质体，所述脂质体包含至少部分所述至少一种活性成分；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞。
34.适合于静脉内施用至少一种活性成分的药物制剂，所述药物制剂包含脂质体，所述脂质体包含至少部分所述至少一种活性成分且至少部分所述脂质体是权利要求1-32任一项的脂质体。
35.权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物，用作药物。
36.权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物，用于与单核细胞相关的预防、治疗或改善。
37.权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物，用于预防、治疗或改善癌症、感染性疾病、炎性病症或疾病、自身免疫疾病或过敏症。
38.权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物在用于与单核细胞相关的预防、治疗或改善中的应用。
39.权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物在用于预防、治疗或改善癌症、感染性疾病、炎性病症或疾病、自身免疫疾病或过敏症中的应用。
40.用于体外活化/抑制单核细胞的方法，包括下列步骤：
i)提供新鲜血液；
ii)给所述新鲜血液施用权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物；
iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物反应。
41.体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括下列步骤：给所述哺乳动物施用足以活化/抑制所述单核细胞的用量的权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物。
42.体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括下列步骤：
i)提供来自有此需要的哺乳动物的新鲜血液；
ii)给所述新鲜血液施用权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物；
iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物与所述新鲜血液反应；
iv)再将所述血液导入所述哺乳动物的循环。
43.预防或治疗或改善癌症、感染性疾病、炎性病症或疾病、自身免疫疾病或过敏症的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-32任一项的脂质体、权利要求33的脂质递送系统或权利要求34的药物组合物。
权利要求43的方法，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、伯基特(非何杰金)淋巴瘤、神经胶质瘤、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、绒毛膜癌、上皮细胞癌、肾癌、何杰金淋巴瘤、胃癌、肝细胞癌、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、非小细胞性肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、口咽癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、宫颈和食道鳞状细胞癌、睾丸癌、T细胞白血病和阴道癌症。
44.权利要求43的方法，其中所述感染性疾病由感染导致，所述感染选自大肠杆菌、葡萄球菌属、衣原体属、链球菌、假单胞菌属、难辨梭菌、军团病杆菌属、Pnetanococcus、嗜血菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、奈瑟球菌属、脑膜炎球菌B、志贺菌属、沙门菌属、利斯特菌属、巴斯德菌属、链杆菌属、螺旋菌属、密螺旋体属、放线菌属、疏螺旋体属、棒杆菌属、肺结核、诺卡氏菌属、加德那菌属、弯曲杆菌属、螺旋体属、变形杆菌属、类杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、幽门螺杆菌、炭疽、HIV、冠状病毒属、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人偏肺病毒、EB病毒、轮状病毒属、腺病毒、流感病毒(普通、H1N1v、H7N1、H9N2)、肺炎球菌、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、水痘带状疱疹病毒、天花、猴痘、西尼罗病毒、SARS、念珠菌病、钱癣、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病、隐球菌病、曲霉菌病、产色霉菌病、足分支菌病感染、假性阿利什利菌病、花斑癣、阿米巴病、热带南美洲锥虫、片形吸虫病、利什曼病、疟原虫属、盘尾丝虫病、并殖吸虫病、锥虫、肺囊虫、阴道毛滴虫、绦虫属、膜壳绦虫、棘球属、血吸虫病、神经囊尾蚴病、美洲板口线虫和鞭虫。
45.权利要求43的方法，其中所述炎性病症或疾病选自创伤、烧伤、手术、冠状动脉病、冠状动脉动脉粥样硬化、动脉粥样硬化、心肌梗死后梗死炎症和修复、心脏缺血-再灌注损伤、心肌炎症、心肌缺血、心血管疾病、脑梗死、出血性休克、再灌注损害、透析、休克和/或细菌或病毒感染、体外膜式氧合(ECMO)、休克、系统性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、多器官衰竭、移植物例如器官和/或假体排斥、心肺搭桥手术、慢性炎症、哮喘和/或肺中的应激相关疾病、细菌感染、坏疽、软组织感染和伤口感染。
46.权利要求43的方法，其中所述自身免疫疾病选自糖尿病、糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦综合征包括斯耶格伦综合征继发性干燥性角结膜炎、斑秃、因节肢动物叮咬反应导致的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感音神经性听觉丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿、慢性活动性肝炎、斯-约二氏综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔癣、克罗恩病、格雷夫斯眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。
47.权利要求43的方法，其中所述过敏症选自哮喘、过敏性咳嗽、过敏性鼻炎和结膜炎、特应性湿疹、皮炎、药物过敏、风疹、荨麻疹、昆虫咬伤过敏症、食物过敏，例如鱼、牛奶、小麦、花生、苹果、坚果过敏。
用于特异性靶向全血中的人CD14+单核细胞的阳离子脂质
体递药系统
发明领域
[0001] 本发明涉及使用阳离子脂质体的特异性递送。更具体地，本发明涉及包含脂质和至少一种活性成分的脂质体，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞；本发明还涉及基于脂质的包含所述脂质体的药物组合物及其在与单核细胞相关的预防、治疗或改善病症中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 脂质体是由包封水性芯的脂双层组成的脂质囊泡。这些囊泡因几个原因而被视为具有作为递药系统的巨大潜能：i)可以递送不同类型的药物；可以将亲水性药物载入水性隔室或可以使疏水性药物锚着在膜内；ii)治疗效能通过靶向特定组织而得到增强，导致所递送药物的生物利用度提高；和iii)副作用显著减少，因为仅患病组织暴露于施用的药物。作为结果，在过去几十年已经广泛地研究了脂质体，以尝试研发新制剂用于治疗例如癌症(1,2,3)和炎症(4,5)，而且靶向特定组织，例如脑、线粒体、眼表面和真皮。
[0004] 脂质体在减少达到靶部位的药量施用后被单核巨噬细胞系统(MPS)的摄取被视为早期脂质体递药系统的主要缺陷之一。MPS由血液中的单核细胞、骨髓中的其前体细胞和组织巨噬细胞组成。单核细胞不同于骨髓中的造血干细胞，从其中它们释放入血液中。它们可以循环几天，此后它们作为促炎、代谢或免疫刺激物的产物离开脉管系统，迁移入组织并分化成巨噬细胞或树突细胞。尤其是在肝、脾和淋巴系统中发现的组织巨噬细胞具有高度吞噬细胞活性并且促成凋亡细胞以及施用的脂质体清除。血液中的单核细胞还在通过吞噬作用消除病原体和凋亡宿主细胞方面起重要作用。
[0005] MPS的细胞的吞噬细胞的能力可以通过靶向血液中的细胞而被转化成优势，所述血液中的细胞通常不需要地摄取施用的脂质体制剂，即单核细胞。单核细胞是第一种补充至炎症或感染部位的细胞，使得单核细胞成为第一线防御并且调节疾病的重要成分。单核细胞、巨噬细胞和树突细胞在免疫细胞中具有3种主要的功能；吞噬作用、抗原呈递和细胞因子产生。它们在急性和慢性炎症中起关键作用，因为它们通过分泌促炎细胞因子例如TNF-α、IL-1β和IL-6维持炎症条件。全身给予的抗炎药存在不良副作用+定位于健康组织或快速地被排泄，这是可以通过使用特定递药系统防止发生的一个问题。因此，靶向递送至单核细胞具有巨大重要性。
[0006] Karathanasis等人(6)已经研究了包含特定带正电荷肽称作GGP的脂质体制剂的摄取。他们发现，这些脂质体制剂可以选择性地靶向中性白细胞和单核细胞，而且依赖于肽的序列，而不依赖于正电荷，因为不靶向具有相同正电荷的对照肽没有增强脂质体摄取。然而，据报道脂质体的电荷对脂质体的细胞摄取具有显著影响。Lee等人(7)研究了中性与带负电荷的脂质体在作为混悬液的胎牛血清的存在下对培养基中培养的人单核细胞细胞系或体外粘着细胞的相互作用关系。他们发现，带负电荷的脂质体的摄取依赖于单核细胞的成熟状态。当细胞分化成巨噬细胞时，带负电荷的脂质体的摄取增加了5-倍，而中性脂质体的摄取仍然保持不变。相同的结果还发生在制剂在混悬液形式的单核细胞培养物中的摄取的情况中。以前还报道了带负电荷的脂质体被人巨噬细胞细胞系J774的摄取(8,9)。
[0007] 已经在非病毒转染的系统中研究了阳离子脂质体，这归因于其浓缩RNA/DNA的能力和一般地被许多细胞类型非选择性地吸收内在化而得到的脂复合物的高正电荷(1,2,3,10,11,12)。已经报道阳离子肽类对细胞具有毒性，但这种作用可以通过在脂质体制剂中添加共-脂质或共聚物而防治发生()。
[0008] US 6,120,799公开了选择性地被脂质/DNA复合物或阳离子脂质体靶向的血管生成内皮细胞。
[0009] US2010/0068212A1涉及用于靶向致病性单核细胞的方法。
[0010] US2002/0155609A1公开了单核细胞特异性颗粒递送载体。
[0011] US2007/0292494A1公开了碳水化合物-衍生的脂质体，其用于靶向CTL/CTLD外源凝集素的细胞碳水化合物识别结构域，以便将活性剂在胞内递送至储库细胞，其感染或易感传染原，例如HIV。
[0012] US 2005/0142114A1涉及用于将药物递送至骨髓和淋巴样免疫细胞的靶向脂质-药物制剂。
[0014] WO 2007/134819A1公开了阳离子脂质体制剂在治疗或诊断类风湿性关节炎或相关疾病中的应用。
[0015] WO 2011/098578A2公开了用于眼内施用的脂质体，从而能够使得活性药物成分缓释或延迟释放。
[0016] Zhou D.等人在“The role of surface charge in monocyte activation and cell viability induced by cationic liposome”,ACTA BIOPHYSICA SINICA,第26卷，第8期，2010年9月20日，第726-734页，XP002692700，USSB:1000-6737中公开了带有不同表面电荷的阳离子脂质体对单核细胞活化和活力的作用。
[0017] 带正电荷的脂质体可以展示出细胞毒性活性(Lv J Control Release.2006年8月10日；114(1):100-9和C.Kelly等人J Drug Deliv.2011:article ID 727241)。
[0018] 阳离子脂质体用于例如在基因递送技术或基于寡核苷酸的敲除技术中递送核酸(14)。
[0019] 如果脂质体递药系统用于免疫调节，则该制剂必须被单核细胞摄取，而不被血液中的其他细胞群摄取。本发明提供了选择性地被新鲜全血中的单核细胞摄取的脂质体制剂。为了达到这一目的，研究了不同脂质体制剂与血液中的特异性细胞群之间的相互作用。
[0020] 发明概述
[0021] 已经令人意外地发现，在生理条件下带有净正电荷的脂质体能够在新鲜全血中温育时选择性地靶向单核细胞。
[0022] 根据第一个方面，本发明涉及用于靶向单核细胞的脂质体，其包含脂质和至少一种活性成分，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞，由此能够选择性地靶向存在于血液或组织中的单核细胞并且与之结合。
[0023] 带正电荷的脂质体通过细胞膜结合、吞噬作用或胞吞作用显示优先结合单核细胞并且保留在那里。这些机制可以由补体系统诱导，所述补体系统在新鲜人体血液中具有活性，而在血液、血浆和血清的贮存或冷冻过程中失活。几种补体因子显示分钟范围内的生物半衰期。
[0024] 根据第二个方面，本发明涉及基于脂质的用于靶向新鲜血液中的单核细胞的递送系统，该系统提供将至少一种活性成分递送至靶向的单核细胞并且在那里释放，所述系统包含：
[0025] (I)脂质，其包含：
[0026] 至少一种阳离子脂质；和
[0027] (II)至少一种活性成分；
[0028] 所述脂质能够形成脂质体，所述脂质体包含至少部分所述至少一种活性成分；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞。
[0029] 根据第三个方面，本发明涉及包含本发明第一个方面的脂质体的药物制剂。
[0030] 本领域技术人员认为适合的赋形剂包括在这种药物制剂中。然而，参照下文的详细公开内容。
[0031] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物，它们用作药物。
[0032] 本发明的脂质体、脂质递送系统或药物组合物可以用作用于预防、治疗或改善许多如下文更详细公开的病症的药物。
[0033] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物，它们用于与单核细胞相关的预防、治疗或改善。
[0034] 因此，通过靶向在免疫系统中起关键作用的单核细胞，能够定制递送至期望的作用部位的药物。
[0035] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物在制备用于与单核细胞相关的预防、治疗或改善的药物中的应用。
[0036] 根据另一个方面，本发明涉及体外活化/抑制单核细胞的方法，包括下列步骤：
[0037] i)提供新鲜血液；
[0039] iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物反应。
[0040] 因此，能够分析单核细胞级分的单核细胞功能的免疫刺激或免疫抑制。
[0041] 根据另一个方面，本发明涉及体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括下列步骤：将本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物以足以活化/抑制所述单核细胞的用量施用于所述哺乳动物。
[0042] 根据另一个方面，本发明涉及体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括下列步骤：
[0043] i)提供来自有此需要的哺乳动物的新鲜血液；
[0044] ii)将本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物施用于所述新鲜血液；
[0045] iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物与所述新鲜血液反应；
[0046] iv)将所述血液再导入所述哺乳动物循环。
[0047] 因此，诱导或抑制免疫功能通过所述哺乳动物中的单核细胞起作用，而不是直接将所述脂质递送系统或药物施用于该哺乳动物。
[0048] 根据另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗或改善癌症、感染性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病或过敏症的方法，包括对有此需要的受试者施用有效量的本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物。附图说明
[0049] 图1:脂质体、脂质体大小和表面电荷的概述。(A)由1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]
(DOPE-PEG2000)组成的脂质体列表。显示了脂质体中每种成分的比例。(B)以mV表示的脂质体表面电荷。(C)以纳米(nm)测量的脂质体大小。B和C的脂质体组合物是指来自图
1A的编号。
(DOPE-PEG2000)组成的脂质体列表。显示了脂质体中每种成分的比例。(B)以mV表示的脂质体表面电荷。(C)以纳米(nm)测量的脂质体大小。B和C的脂质体组合物是指来自图
1A的编号。
[0050] 图2:包含POPC(制剂3和4)的添加或不添加负电荷(POPG,制剂1和2)或正电荷(DOTAP,制剂5和8)脂质的脂质体制剂的摄取。(A)用作全血样品中5种不同细胞群的标记的抗体；CD14(单核细胞标记)、CD15(粒细胞标记)、CD3(T-淋巴细胞标记)、CD19(B-淋巴细胞标记)和CD56(NK细胞标记)。(B)包含RhB的6种不同脂质
体制剂的摄取的FACS分析(分别为图1A中的组合物1-4、8和5)(POPC:POPG 90:10、POPC:POPG:DOPE-PEG200090:5:5、POPC、POPC:DOTAP:DOPE-PEG200090:5:5、POPC:DOTAP
90:10、POPC:DOTAP:DOPE-PEG200080:15:5)。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(***P<0.001，****P<0.0001)。(C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
体制剂的摄取的FACS分析(分别为图1A中的组合物1-4、8和5)(POPC:POPG 90:10、POPC:POPG:DOPE-PEG200090:5:5、POPC、POPC:DOTAP:DOPE-PEG200090:5:5、POPC:DOTAP
90:10、POPC:DOTAP:DOPE-PEG200080:15:5)。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(***P<0.001，****P<0.0001)。(C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0051] 图3:显示0、5、15和60min温育后脂质体制剂3(A)和8(B)的摄取。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组(****P<0.0001)。(C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0052] 图4:包含RhB(图1A)的浓度为0、50、250和500mM的脂质体制剂3(A)和8(B)的摄取。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组(****P<0.0001)。(B)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0053] 图5:分析正电荷对不同细胞群中摄取的作用。(A)包含0-50mol％DOTAP的脂质体制剂的摄取(图1A中的组合物3和6-12)。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(***P<0.001，****P<0.0001，ns＝无显著性)。(C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0054] 图6:显示在37C旋转下血液温育0、2h和4h后包含RhB(图1A)的脂质体制剂3(A)和8(B)的摄取。将数据表示为对显示为平均值±SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)。(C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0055] 图7:使用包含0-50％DOTAP的脂质体(图1A中的组合物3和6-12)对人单核细胞细胞系THP-1测定脂质体的细胞毒性。使用4种不同浓度的脂质体：5、50、250和500μM。(A)60min温育后THP-1细胞中的脂质体摄取的FACS分析。(B)使用细胞培养基洗涤前将脂质体与细胞一起温育60min。24h后，通过FACS测定与细胞结合的膜联蛋白V。将星状孢子素用作细胞凋亡的阳性对照。(C)显示膜联蛋白V阳性细胞门控的有代表性的示意图。
(D)使用细胞培养基洗涤前将脂质体与细胞一起温育60min。24h后，通过与XTT一起温育
4小时测定脂质体诱导的细胞毒性。(E)XTT温育后显示细胞的相差显微镜检查照片。将数据表示为脂质体摄取的MFI(A)、膜联蛋白V阳性的细胞百分比(B)或显示为平均值±SD的吸光度(D)。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(***P<0.001，****P<0.0001，ns＝无显著性)。
(D)使用细胞培养基洗涤前将脂质体与细胞一起温育60min。24h后，通过与XTT一起温育
4小时测定脂质体诱导的细胞毒性。(E)XTT温育后显示细胞的相差显微镜检查照片。将数据表示为脂质体摄取的MFI(A)、膜联蛋白V阳性的细胞百分比(B)或显示为平均值±SD的吸光度(D)。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验(***P<0.001，****P<0.0001，ns＝无显著性)。
[0056] 本发明的详细公开内容
[0057] 定义
[0058] 本申请和权利要求中的"脂质体"表示由至少一种脂双层构成的人工制备的囊泡。
[0059] 作为本文上下文中使用的术语“优先粘附”是指本发明的脂质体粘附新鲜抽取的血液中的单核细胞的程度是粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少3倍，更优选至少4倍，例如是粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞的至少5倍。
[0060] 本文上下文中的术语“新鲜抽取的血液”是指在从哺乳动物中抽取的不超过60分钟、例如不超过30分钟、优选不超过15分钟、不超过10分钟、例如不超过5分钟的所述血液。
[0061] 本文上下文中的术语“ζ电位”描述相对于离开界面的大量流体中的点的溶液中胶粒滑面位置上的电位。将本文上下文中用于脂质体X的术语“相对ζ电位”定义为(X的ζ电位减去图1的脂质体6的ζ电位(5％DOTAP))除以(图1的脂质体11的ζ电位(20％DOTAP)减去图1的脂质体6的ζ电位(5％DOTAP)之差)x 100；在与实施例2中详细公开的相同的条件下在10％蔗糖缓冲液中测定。
[0062] 术语“免疫原性”是指能够诱导免疫应答。
[0063] 作为本文上下文中使用的术语“致耐受性”是指能够减量调节免疫应答。
[0064] 当本文使用术语"基本的"/"基本上的"或"主要的"/"主要地"时，它预以表示的是通过这些术语描述的特征以一定量存在或具有一种影响，所述量或影响提供与请求保护的本发明实施相关的技术效果。例如，组合物中物质的"基本的量"是提供该物质所显示的技术效果的量，其程度为提供本发明方面的技术效果。同样，如果组合物显示为包含"基本上不含"颗粒物质，则这是允许该组合物包括不显著量的物质，条件是这些量对组合物中的其他成分不具有任何技术影响且在其自身方面不能"存在差异"–或换句话说，"基本上不含"和"主要地不含"是指例如可能存在痕量或微小的效果，条件是它们不具有总体技术影响。
[0065] 本发明的具体实施方案
[0066] 本发明另外的实施方案如下所述。本领域技术人员显而易见，可以合并本发明的方面和/或实施方案。
[0067] 本发明的一个实施方案是具有15-85％的ζ电位的脂质体。
[0068] 正如从本文报道的结果中显而易见的，本发明的脂质体以15-85％的相对ζ电位选择性地粘附单核细胞。
[0069] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体适合于静脉内施用。
[0070] 本发明的一个实施方案是具有20-80％的相对ζ电位的脂质体。
[0071] 本发明的一个实施方案是具有25-75％的相对ζ电位的脂质体。
[0072] 更具体地，相对ζ电位在20-80％的范围，甚至更具体地在25-75％的范围。在这些范围内，对于单核细胞的选择性与其他血液成分例如粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞相比甚至更显著。
[0073] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体包含低于20％、例如低于10％、优选低于5％、更优选低于2％的胆固醇，最优选基本上不含胆固醇。
[0074] 脂质体结构和特征
[0075] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中至少部分脂质选自磷脂类、甾醇类和甾醇衍生物。
[0076] 本发明的一个具体的实施方案是脂质体，其中所述脂质包含或构成选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、DPG(双磷脂酰甘油)、PEOH(磷脂酰醇)、胆固醇、麦角固醇和羊毛甾醇的成员。
[0077] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱。
[0078] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱。
[0079] 本发明的一个具体的实施方案是脂质体，其中所述脂质包含1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱。
[0080] 本发明的另一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰乙醇胺类选自1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-二油酰基-磷脂酰乙醇胺；所述磷脂酰丝氨酸类选自
1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、
1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；所述磷脂酰甘油类选自1,2-二油酰基-磷脂酰甘油、
1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；所述磷脂酸类选自二-棕榈酰基-甘油磷脂酸、二-硬脂酰基-甘油磷脂酸、二-肉豆蔻酰基-甘油磷脂酸、二-油酰基-甘油磷脂酸、棕榈酰基-油酰基-甘油磷脂酸。
1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、
1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；所述磷脂酰甘油类选自1,2-二油酰基-磷脂酰甘油、
1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；所述磷脂酸类选自二-棕榈酰基-甘油磷脂酸、二-硬脂酰基-甘油磷脂酸、二-肉豆蔻酰基-甘油磷脂酸、二-油酰基-甘油磷脂酸、棕榈酰基-油酰基-甘油磷脂酸。
[0081] 本发明的另一个实施方案是脂质体，其中所述脂质包含或构成：磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、DPG(双磷脂酰甘油)、PEOH(磷脂酰醇)、胆固醇、磷脂酰胆碱类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱；磷脂酰乙醇胺类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、
1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-二油酰基-磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰甘油、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；1,2-二-十八酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(Ethyl PC)；聚乙二醇化脂质；聚乙二醇化磷脂，例如磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]；聚乙二醇化神经酰胺类，例如N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)1000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)3000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)5000]}；溶血-磷脂酰胆碱类、溶血-磷脂酰乙醇胺类、溶血-磷脂酰甘油类、溶血-磷脂酰丝氨酸类、神经酰胺类；鞘脂；糖脂，例如神经节苷脂GMI；糖脂类；硫苷脂类；磷脂酸，例如二-棕榈酰基-甘油磷脂酸；棕榈酸脂肪酸；硬脂酸脂肪酸；花生四烯酸脂肪酸；月桂酸脂肪酸；肉豆蔻酸脂肪酸；月桂烯酸脂肪酸；抹香鲸酸脂肪酸；豆蔻脑酸脂肪酸；棕榈油酸脂肪酸；岩芹酸脂肪酸；油酸脂肪酸；
异月桂酸脂肪酸；异肉豆蔻酸脂肪酸；异硬脂酸脂肪酸；甾醇和甾醇衍生物，例如胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇硫酸酯和胆固醇基-(4-三甲基铵基)-丁酸酯、麦角固醇、羊毛甾醇；聚氧乙烯脂肪酸酯类和聚氧乙烯脂肪酸醇类；聚氧乙烯脂肪酸醇醚类；聚氧乙基化脱水山梨糖醇醇脂肪酸酯类、甘油聚乙二醇氧基-硬脂酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯；乙氧基化大豆甾醇类；乙氧基化蓖麻油；聚氧乙烯聚氧丙烯脂肪酸聚合物；聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯类；二-油酰基-sn-甘油；二棕榈酰基-琥珀酰基甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油；1-烷基-2-酰基-磷脂酰胆碱类，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-酰基-磷脂酰乙醇胺类，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺；
1-烷基-2-酰基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-酰基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油；1-烷基-2-烷基-磷脂酰胆碱类，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-烷基-磷脂酰乙醇胺类，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰乙醇胺；1-烷基-2-烷基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-烷基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰甘油；和N-琥珀酰基-二-十八胺；棕榈酰基高半胱氨酸。
1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-二油酰基-磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油类，例如1,2-二油酰基-磷脂酰甘油、1,2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；1,2-二-十八酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(Ethyl PC)；聚乙二醇化脂质；聚乙二醇化磷脂，例如磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]、磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]；聚乙二醇化神经酰胺类，例如N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)1000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)3000]}、N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)5000]}；溶血-磷脂酰胆碱类、溶血-磷脂酰乙醇胺类、溶血-磷脂酰甘油类、溶血-磷脂酰丝氨酸类、神经酰胺类；鞘脂；糖脂，例如神经节苷脂GMI；糖脂类；硫苷脂类；磷脂酸，例如二-棕榈酰基-甘油磷脂酸；棕榈酸脂肪酸；硬脂酸脂肪酸；花生四烯酸脂肪酸；月桂酸脂肪酸；肉豆蔻酸脂肪酸；月桂烯酸脂肪酸；抹香鲸酸脂肪酸；豆蔻脑酸脂肪酸；棕榈油酸脂肪酸；岩芹酸脂肪酸；油酸脂肪酸；
异月桂酸脂肪酸；异肉豆蔻酸脂肪酸；异硬脂酸脂肪酸；甾醇和甾醇衍生物，例如胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇硫酸酯和胆固醇基-(4-三甲基铵基)-丁酸酯、麦角固醇、羊毛甾醇；聚氧乙烯脂肪酸酯类和聚氧乙烯脂肪酸醇类；聚氧乙烯脂肪酸醇醚类；聚氧乙基化脱水山梨糖醇醇脂肪酸酯类、甘油聚乙二醇氧基-硬脂酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯；乙氧基化大豆甾醇类；乙氧基化蓖麻油；聚氧乙烯聚氧丙烯脂肪酸聚合物；聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯类；二-油酰基-sn-甘油；二棕榈酰基-琥珀酰基甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油；1-烷基-2-酰基-磷脂酰胆碱类，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-酰基-磷脂酰乙醇胺类，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺；
1-烷基-2-酰基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-酰基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油；1-烷基-2-烷基-磷脂酰胆碱类，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰胆碱；1-烷基-2-烷基-磷脂酰乙醇胺类，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰乙醇胺；1-烷基-2-烷基-磷脂酰丝氨酸，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰丝氨酸；1-烷基-2-烷基-磷脂酰甘油，例如1-十六烷基-2-十六烷基-磷脂酰甘油；和N-琥珀酰基-二-十八胺；棕榈酰基高半胱氨酸。
[0082] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中至少部分脂质是阳离子脂质。
[0083] 因此，发现与粘附粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时，具有净正电荷的脂质体优先粘附单核细胞。
[0084] 在本发明的一个实施方案中，关注与粘附内皮细胞比较时，具有净正电荷的脂质体优先粘附全血中的单核细胞。
[0085] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述阳离子脂质选自十八酰胺(SA)、溴化月桂基三甲基铵；溴化十六烷基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、溴化二甲基二-十八铵(DDAB)、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)、1,2-二-十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和DOTAP衍生物例如1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和
1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)和DODAP衍生物例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-O-十八
烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、SAINT-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)和GL67TM。
1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)和DODAP衍生物例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-O-十八
烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、SAINT-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)和GL67TM。
[0086] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述阳离子脂质选自十八酰胺(SA)、1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，优选1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。
[0087] 优选的阳离子脂质是DOTAP和DOTAP衍生物。阳离子脂质和脂质成分的另外的实例可以在US 4,804,539中找到或根据该文献制备。
[0088] 本发明的一个特别的实施方案是脂质体，其中至少部分脂质是阳离子脂肽，其选自脂质聚精氨酸缀合物、脂质TAT缀合物、脂质聚赖氨酸缀合物或阳离子脂多糖或脂多糖例如脂质脱乙酰壳多糖缀合物。
[0089] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体包含0.5-50％、优选1-20％、例如3-15、例如7.5-12.5％(mol/mol)的阳离子脂质。
[0090] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体包含0.5-50％,优选1-20％、例如3-15、例如7.5-12.5％(mol/mol)的阳离子脂质，且其中与粘附内皮细胞比较时，具有净正电荷的所述脂质体优先粘附全血中的单核细胞。
[0091] 正如从本文报道的结果中显而易见的，得到在上述范围内的阳离子脂质范围对于单核细胞的选择性。
[0092] 本发明的一个实施方案是脂质体，如果相关，则其包含脂质的烷基链，其为C8–C24、优选C10–C22、更优选C12–C20、优选C14–C18、最优选C16–C18饱和链或不饱和链，优选饱和链。
[0093] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中至少一种脂质体是大单层脂质体(Large Unilamellar Vesicle)(LUV)。
[0094] 本发明优选的脂质体是大单层脂质体(LUV)形式，即LUVs是包含本发明脂质体的药物组合物的优选成分。
[0095] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体具有以下的直径：40-2000nm，优选80-1000nm，更优选100-500nm，优选50-200nm，更优选100-150nm，优选100-400nm。
[0096] 本发明的脂质体包含活性成分，典型地为药物物质或组合物。典型地，该脂质体包含基本上所有的所述至少一种活性成分。通常，选自内部水性隔室的隔室、疏水性双层和脂质体内层和外层的极性内相之一携带所述至少一种活性成分。
[0097] 本领域技术人员一般了解活性成分及其正确剂量的选择。
[0098] 在优选的实施方案中，所述活性成分是免疫刺激化合物形式，优选具有刺激先天性免疫系统的能力。
[0099] 本发明的一个实施方案由此是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，其为胞内蛋白和/或受体的配体。
[0100] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述胞内蛋白和/或受体选自TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、NOD5、NALP1、NALP2、NALP3、NALP12、NALP14、IPAF、NAIP、CIITA、RIG-I、MDA5和LGP2，优选选自TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和NOD2，更优选TLR7。
[0101] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，选自聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、聚腺尿苷酸(聚A:U)、聚I:C-聚-L-赖氨酸(聚-ICLC)、聚-ICR、CL264、N-棕榈酰基-S-[2,3-双(棕榈酰基氧基)-(2R,S)-丙基]-(R)-半胱氨酸-(S)丝氨酸-(S)赖氨酸4(Pam3Cys)、单磷酰脂质A(MPLA)和其他脂多糖类、α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosyl ceremaide)(αGC)、Propirimine、咪喹莫德(R837)、瑞喹莫德(R848)、Gardiquimod、R850(3M Pharma)、R851(3M Pharma)、852A(3M Pharma)、S-27610、3M-002(CL075)、3M-003、3M-005、3M-006、3M-007、3M-012、
3M-13、3M-031、3M-854(3M Pharma)、CL097、CL264、IC-31、洛 索 立 宾 和 其 他 咪 唑并喹啉类、ssPolyU、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、ANA975(Anadys/Novartis)、SM360320(Sumitomo)、R1354(Coley Pharmaceuticals)单 链 或 双 链 RNA、ORN 02(5’-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3’)、ORN 065’-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3’、CpG-ODN DSLIM(Mologen)、AVE 0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG B寡脱氧核苷酸(ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN1982、CpG B ODN 2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO 2125(Idera Pharma)、CpG A ODN 2216、CpG A ODN 2336、CpG
2395、CpG ODN7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚 草 过 敏 原 )(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、
10181SS(Dynavax Technologies)、IM02055(Idera Pharmaceuticals)、IRS954(Dynavax Technologies)、(鞭毛蛋白、胞壁酰二肽、皂苷类例如QS21、利什曼原虫属延伸因子、SB-AS4、苏氨酰-胞壁酰二肽、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，其选自单磷酰脂质A(MPLA)、咪喹莫德(R837)、瑞喹莫德(R848)、Gardiquimod、洛索立宾、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、SM360320(Sumitomo)、CpG B寡脱氧核苷酸(ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN 1982、CpG B ODN 2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO
2125(Idera Pharma)、CpG A ODN2216、CpG A ODN 2336、CpG 2395、CpG ODN 7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚草过敏原)(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、QS21、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。
3M-13、3M-031、3M-854(3M Pharma)、CL097、CL264、IC-31、洛 索 立 宾 和 其 他 咪 唑并喹啉类、ssPolyU、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、ANA975(Anadys/Novartis)、SM360320(Sumitomo)、R1354(Coley Pharmaceuticals)单 链 或 双 链 RNA、ORN 02(5’-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3’)、ORN 065’-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3’、CpG-ODN DSLIM(Mologen)、AVE 0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG B寡脱氧核苷酸(ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN1982、CpG B ODN 2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO 2125(Idera Pharma)、CpG A ODN 2216、CpG A ODN 2336、CpG
2395、CpG ODN7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚 草 过 敏 原 )(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、
10181SS(Dynavax Technologies)、IM02055(Idera Pharmaceuticals)、IRS954(Dynavax Technologies)、(鞭毛蛋白、胞壁酰二肽、皂苷类例如QS21、利什曼原虫属延伸因子、SB-AS4、苏氨酰-胞壁酰二肽、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，其选自单磷酰脂质A(MPLA)、咪喹莫德(R837)、瑞喹莫德(R848)、Gardiquimod、洛索立宾、索替莫德(3M Pharma)、艾托立宾(Anadys)、SM360320(Sumitomo)、CpG B寡脱氧核苷酸(ODN)1018(Dynavax Technologies)、AZD 1419(Dynavax)、ODN 1982、CpG B ODN 2006(Coley Pharmaceuticals)、IMO
2125(Idera Pharma)、CpG A ODN2216、CpG A ODN 2336、CpG 2395、CpG ODN 7909(Coley Pharmaceuticals)、CpG 10101(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN AVE0675(Coley Pharmaceuticals)、CpG ODN HYB2093(Idera Pharmaceuticals/Novartis)、CpG ODN HYB2055(Idera Pharmaceuticals)、CpG-ODN IMO-2125(Idera Pharmaceuticals)、CpG C ODN M362、Tolamba(具有共价连接的CpG B类ODN 1018的Amb a1豚草过敏原)(Dynavax Technologies)、Heplisav(Dynavax Technologies)、QS21、L18-MDP、米伐木肽和OM-174。
[0102] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫刺激化合物，其选自米伐木肽(2-[(N-{(2R)-[(2-乙酰氨基-2,3-双脱氧-D-吡喃葡萄糖-3-基)氧基]-丙酰基}-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酰基)氨基]乙基(2R)-2,3-双(十六酰氧基)丙基磷酸氢酯)、L18MDP(6-O-硬脂酰基-N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺)以及上述举出的免疫刺激性化合物的酰化或C12-20饱和或不饱和酯或醚结合的衍生物。
[0103] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是包含类固醇的免疫抑制化合物，其选自21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松(Aalclometasone)、阿尔孕酮、安西奈德(Amicinonide)、倍氯米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松半琥珀酸酯、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、Blovetasone、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、氟氢可的松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼龙、丙酮缩氟氢羟龙、福莫可他、氯氟舒松、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、利美达松、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、甲泼尼龙半琥珀酸酯、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、强的松龙棕榈酸酯、磷酸泼尼松龙、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、替可的松和曲安西龙。
[0104] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是包含类固醇的免疫抑制化合物，其选自倍他米松半琥珀酸酯、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、利美达松、甲泼尼龙半琥珀酸酯、强的松龙棕榈酸酯和磷酸泼尼松龙。
[0105] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是免疫抑制化合物，其包含对胞内靶标起作用的小分子抑制剂，所述靶标选自c-Fms、PDGFRα、Abl、PDGFRβ、NFκΒ、IκΒ、JAK1、JAK2、JAK3、GSK3、p38MAPK、JNK、KIT、EGFR、ERBB2、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FLT3、PKCβ、RAF1、CDK1、CDK2、CDK4、NLRP3、IRF3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、Hsp90、Hsp70、PI3K、mTOR、AKT、DNA-PK、ATM、AMPK、PDK-1、S6激酶、RIP2、TRIF、MYD88、TAK1。
[0106] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是是免疫抑制化合物，其包含对胞内靶标起作用的小分子抑制剂，其选自吲哚美辛、CLI-095(C15H17ClFNO4S,CAS#243984-11-4)、Bay11-7082(C10H9NO2S,CAS#19542-67-7)、雷公藤内酯(PG490)、CGP53716、SU9518、PD166326、南蛇藤醇、雷公藤红素(Tripterin)、BIRB-796(度马莫德)、SB 203580、SB202190、VX-702、NVP-BEZ235、GDC-0980(RG7422)、地磷莫司(地磷莫司,AP23573)、尼洛替尼(Tasigna,AMN107)、甲苯磺酸索拉非尼(多吉美)、达沙替尼(Sprycel,BMS-354825)、MLN518(CT53518)、伐他拉尼(PTK787/ZK222584)、OSI-930、AZD2171、帕唑帕尼(Votrient)、IPI-504(瑞螺旋霉素)、地磷莫司(地磷莫司)、GDC-0
980(RG7422,C23H30N8O3S,CAS#1032754-93-0)、Palomid 529(C24H22O6CAS#914913-88-5)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec/Glivec)、依维莫司(Afinitor,RAD001)、西罗莫司(雷帕鸣,雷帕霉素)、坦西莫司(Torisel,CCI-779)、硼替佐米(Velcade)、吉非替尼(Iressa)、卡纽替尼(CI-1033,CAS#267243-28-7,C24H25ClFN5O3)、盐酸厄洛替尼(特罗凯)、培利替 尼(EKB-569)(C24H23ClFN5O2,CAS#257933-82-7)、凡 德 他 尼 (Zactima,ZD6474,C22H24BrFN4O2,CAS No.:443913-73-3)、舒 尼 替 尼 (Sutent,SU-11248,C22H27FN4O2.C4H6O5,CAS No.:341031-54-7)、坦度替尼(MLN518)、C31H42N6O4,CAS No.:387867-13-2、细胞周期蛋白依赖激酶(塞利西利)、C19H26N6O,CAS No.:186692-46-6。
980(RG7422,C23H30N8O3S,CAS#1032754-93-0)、Palomid 529(C24H22O6CAS#914913-88-5)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec/Glivec)、依维莫司(Afinitor,RAD001)、西罗莫司(雷帕鸣,雷帕霉素)、坦西莫司(Torisel,CCI-779)、硼替佐米(Velcade)、吉非替尼(Iressa)、卡纽替尼(CI-1033,CAS#267243-28-7,C24H25ClFN5O3)、盐酸厄洛替尼(特罗凯)、培利替 尼(EKB-569)(C24H23ClFN5O2,CAS#257933-82-7)、凡 德 他 尼 (Zactima,ZD6474,C22H24BrFN4O2,CAS No.:443913-73-3)、舒 尼 替 尼 (Sutent,SU-11248,C22H27FN4O2.C4H6O5,CAS No.:341031-54-7)、坦度替尼(MLN518)、C31H42N6O4,CAS No.:387867-13-2、细胞周期蛋白依赖激酶(塞利西利)、C19H26N6O,CAS No.:186692-46-6。
[0107] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种活性成分是抗感染化合物，其选自利福平、双脱氧胞苷-5′-三磷酸、克拉霉素、阿昔洛韦、环丙沙星、夫西地酸钠、庆大霉素、氯霉素、左氧氟沙星、土霉素、妥布霉素、natriumcromoglicat、阿莫西林、氨苄西林、匹氨西林、厄他培南、美罗培南、多立培南、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、伐昔洛韦、依非韦伦、恩曲他滨、替诺福韦二吡呋酯(tenofovirdisoproxil)、利匹韦林、青霉素、甲氧苄啶磺胺甲异噁唑合剂、利福平、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、伏立康唑、两性霉素B、卡泊芬净、氟胞嘧啶、伊曲康唑、脱氧土霉素、磺胺类和磺胺甲噁唑。
[0108] 本发明的一个实施方案是脂质体，还包含至少一种抗原作为活性成分。
[0109] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述至少一种抗原选自癌抗原、自体抗原或自身免疫抗原、微生物抗原、过敏原或环境抗原。
[0110] 对于药物的单核细胞特异性靶向，带正电荷的脂质体能够被单核细胞吞噬，且俘获在脂质体内部的药物在单核细胞内释放，使得药物发挥其胞内功能。对于免疫刺激化合物，如针对胞内受体如模式识别受体(PRRs)的激动剂，这些分子在细胞内释放一次并且活化相关受体，这可以产生免疫刺激性单核细胞。
[0111] 用于单核细胞靶向的脂质体的试验：
[0112] 在 使 用 ζ 电 位 分 析 仪 (Brookhaven InstrumentsCoorporation,Holtsville,NY)、在由在MilliQ水中的300mM葡萄糖、10mM HEPES、1mM CaCl2(pH 7.4)组成的缓冲液中测定时，用于特异性单核细胞靶向的优选的脂质体显示
0-60mV、20-50mV、23-45mV、31-41mV、32-38mV的ζ电位。此外，使用下列测试系统测试用于特异性单核细胞靶向的优选的脂质体：
0-60mV、20-50mV、23-45mV、31-41mV、32-38mV的ζ电位。此外，使用下列测试系统测试用于特异性单核细胞靶向的优选的脂质体：
[0113] 使用BD真空采血管(Cat#366450)与EDTA作为抗凝剂从健康供体中抽取新鲜人体全血。将10μL体积的脂质体(5mM)加入到在1.5mL埃彭道夫管中的190μL体积(最终250μM)的新鲜血液中并且在37C与适度旋转下温育60分钟。将红细胞在室温在黑暗处在BD血清真空采血管(Cat#367614)中在4mL BD Pharm裂解缓冲液中裂解15分钟，以200g离心5min，重新混悬于1mL Pharm裂解缓冲液。在RT在黑暗中5min温育后，将样品以
200g离心5min，重新混悬于1mL FACS缓冲液(补充了1％BSA的PBS)，即刻以200g离心
5min，重新混悬于400μL FACS缓冲液，转入具有圆底的96孔培养板(Nunc,Roskilde,DK)。
在冰上用人IgG阻断非特异性结合10min，然后将细胞在冰上在具有初级预缀合抗体或同工型对照的100μL中温育60分钟，在4℃以500g离心5min，用200μL FACS缓冲液洗涤
2次。将细胞重新混悬于150μL FACS缓冲液，然后进行流式细胞检测分析，其可以使用BD FACSArray生物分析仪进行。基于掺入脂质体膜的DOPE-罗丹明B(RhB)的荧光测定脂质体的细胞摄取量。使用在532nm处的激发和在564-606nm处的发射评估与细胞结合的脂质体的总量(表示为‘摄取量’且包括细胞膜结合的脂质体和已经摄入的脂质体)。基于下列标记分析不同细胞群中的脂质体摄取量：CD14(单核细胞标记)、CD15(粒细胞标记)、CD3(T-淋巴细胞标记)、CD19(B-淋巴细胞标记)和CD56(天然杀伤细胞标记)。可以用BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析每一实验中的所有细胞群。
200g离心5min，重新混悬于1mL FACS缓冲液(补充了1％BSA的PBS)，即刻以200g离心
5min，重新混悬于400μL FACS缓冲液，转入具有圆底的96孔培养板(Nunc,Roskilde,DK)。
在冰上用人IgG阻断非特异性结合10min，然后将细胞在冰上在具有初级预缀合抗体或同工型对照的100μL中温育60分钟，在4℃以500g离心5min，用200μL FACS缓冲液洗涤
2次。将细胞重新混悬于150μL FACS缓冲液，然后进行流式细胞检测分析，其可以使用BD FACSArray生物分析仪进行。基于掺入脂质体膜的DOPE-罗丹明B(RhB)的荧光测定脂质体的细胞摄取量。使用在532nm处的激发和在564-606nm处的发射评估与细胞结合的脂质体的总量(表示为‘摄取量’且包括细胞膜结合的脂质体和已经摄入的脂质体)。基于下列标记分析不同细胞群中的脂质体摄取量：CD14(单核细胞标记)、CD15(粒细胞标记)、CD3(T-淋巴细胞标记)、CD19(B-淋巴细胞标记)和CD56(天然杀伤细胞标记)。可以用BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析每一实验中的所有细胞群。
[0114] 抗原
[0115] 抗原可以为、但不限于癌抗原、自体抗原或自身免疫抗原、微生物抗原、过敏原或环境抗原。抗原实际上可以是肽、脂质或碳水化合物，但不限于此。
[0116] 癌抗原：癌抗原是优先由癌细胞表达的抗原(即它以高于在非癌细胞中的水平在癌细胞中表达)，在一些情况中，它仅由癌细胞表达。癌抗原可以在癌细胞中或在癌细胞表面上表达。癌抗原可以是MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脱氨酶-结合蛋白(ADAbp)、FAP、亲环蛋白b、结肠直肠关联蛋白(CRC)0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML 1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrange antigen)(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链和MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7,MAGE-A8、MAGE-A9,MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2、(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3,GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9.BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、a-甲胎蛋白、E-钙黏着糖蛋白、a-连环蛋白、β-连环蛋白、y-连环蛋白、pl120ctn、gp100、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤状结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2神经节苷脂、GD2神经节苷脂、人乳头瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV-编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶(brain glycogen phosphorylase)、SSX-1、SSA-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、CD20和c-erbB-2.(Amll:亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)；伯基特(非何杰金)淋巴瘤(CD20):神经胶质瘤(E-钙黏着糖蛋白类:α-连环蛋白、β-连环蛋白、-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆道癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族；HER2/neu；e-erbB2)、宫颈癌(p53；p21ras)、结肠癌(p21ras；HER2/neu；c-erbB-2；MUC家族)、胃癌(HER2/neu；c-erbB-2；ga733糖蛋白)、肝细胞癌、黑素瘤(p15蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂类)、骨髓瘤(MUC家族,p21ras)、非小细胞性肺癌(HER2/neu；c-erbB-2)、鼻咽癌(lmp-1；EBNA-1)、卵巢癌(MUS家族；Her2/neu；c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物，例如人乳头瘤病毒蛋白和非感染性颗粒)、睾丸癌(NY-ESO-1)、T细胞白血病(HTLV-1表位)。
[0117] 微生物抗原：微生物抗原是来源于微生物种类的抗原，例如、但不限于细菌、病毒、真菌、寄生虫和分支杆菌种类。照此，微生物抗原包括细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和分支杆菌抗原。细菌、病毒、真菌、寄生虫和分支杆菌种类的实例如本文所提供。微生物抗原可以是微生物种类的组成部分或可以是整个微生物。在一个实施方案中，细菌可以来源于细菌种类，其选自大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌属(Staphylococcal)、衣原体属(Chlamydia)、链球菌(Streptococcal)、假单胞菌属(Pseudomonas)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、军团病杆菌属(Legionella)、Pnetanococcus、嗜血菌属(Haemophilus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、奈瑟球菌属(Neisseria)、脑膜炎球菌B(Meningococcus B)、志贺菌属(Shigella)、沙门菌属(Salmonella)、利斯特菌属(Listeria)、巴斯德菌属(Pasteurella)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、密 螺旋体属(Treponema)、放线菌属(Actinomyces)、疏螺旋体属(Borrelia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肺结核(Tuberculosis)、诺卡氏菌属(Norcardia)、加德那菌属(Gardnerella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺旋体属(Spirochaeta)、变形杆菌属(Proteus)、类杆菌(Bacteriodes)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersenia pestis)、幽门螺杆菌(H.pylori)和炭疽。
[0118] 在另一个实施方案中，病毒抗原来源于病毒种类，其选自HIV、冠状病毒属(Coronavirus)、单纯疱疹病毒1型(Herpes simples virus 1)、单纯疱疹病毒2型(Herpes simplex virus 2)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、登革热病毒(Dengue virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型肝炎病毒(hepatits A virus)、乙型肝炎病毒(hepatits B virus)、丙型肝炎病毒(hepatits C virus)、戊型肝炎病毒(hepatits E virus)、人乳头瘤病毒(human papilloma virus)、人偏肺病毒(human Metapneumoniavirus)、EB病毒(Epstein Barr virus)、轮状病毒属(rotavirus)、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)(普通、H1N1v、H7N1、H9N2)、肺炎球菌(Pneumococcus)、副流感病毒(Para influenza virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)(RSV)、水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus)、天花(small pox)、猴痘(monkey pox)、西尼罗病毒(West Nile virus)、SARS。
[0119] 在另一个实施方案中，真菌抗原来源于导致感染的真菌种类，其选自念珠菌病(candidiasis)、钱癣(ringworm)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、芽生菌病(blastomycosis)、副球孢子菌病(paracoccidioidomycosis)、隐球菌病(crytococcosis)、曲霉菌病(aspergillosis)、产色霉菌病(chromomycosis)、足分支菌病感染(mycetoma infections)、假性阿利什利菌病(pseudallescheriasis)、花斑癣(tinea versicolor)感染。
[0120] 在另一个实施方案中，寄生虫抗原来源于寄生虫种类，其选自阿米巴病(amebiasis)、热带南美洲锥虫(trypanosome cruzi)、片形属(Fasciolia)、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Plasmodium)、盘尾丝虫属(Onchocercia)、并殖属(Paragonimia)、锥虫(Trypanosoma brucei)、肺囊虫(Pneumocystis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、绦虫属(Taenia)、膜壳绦虫(Hymenolepsis)、棘球属(Echinococcus)、血吸虫属(Schistosoma)、神经囊尾蚴病(neurocysticercosis)、美洲板口线虫(Necator americanus)和鞭虫(Trichuris trichuria)。
[0121] 分支杆菌抗原可以来源于分支杆菌的种类，例如结核分支杆菌(M.tuberculosis)和麻风分枝杆菌(M.leprae)，但不限于此。
[0122] 过敏原：过敏原是可以诱导受试者中的过敏性或哮喘性应答的抗原。过敏原包括、但不限于花粉、昆虫毒液、动物毛皮垢屑粉尘、真菌孢子和药物(例如青霉素)。天然、动物和植物过敏原的实例包括、但不限于对下列属具有特异性的蛋白质：犬(家犬(Canis familiaris))；表皮螨属(Dermatophagoides)(例如，粉尘螨(Dermatophagoides farinae))；猫属(Felis)(猫(Felis domesticus))；豕草属(Ambrosia)(Ambrosia artemi isfolia；黑麦草属(Lolium)(例如黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum))；柳杉属(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica)):链格孢属(Alternaria)(链格孢菌(Alternaria alternate))；赤杨；桤木属(Alnus)(欧洲桤木(Alnus gultinoasa))；桦木属(Betula)(Betula verrucosa)；栎树属(Quercus)(白栎(Quercus alba))；木犀榄属(Olea)(油橄榄(Olea Europa))；蒿属(Artemisia)(艾蒿(Artemisia vulgaris)):车前属(Plantago)(例如长叶车前(Plantago lanceolata))；墙草属(Parietaria)(例 如Parietaria officinalis of Parietaria judaica)；蜚蠊(Blattella)(例如德国小蠊(Blattella germanica))；蜜蜂属(Apis)(例如Apis multiflorum)；柏属(Cupressus)(例如地中海柏木(Cupressus sempervires)，绿干柏(Cupressus arizonica)和大果柏木(Cupressus macrocarpa))；刺柏属(Juniperus)(例如Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、欧洲刺柏(Juniperus communis)和阿希刺柏(Juniperus ashei))；金钟柏(Thuya)(例如Thuya orientalis)；红桧(Chamaecyparis)(例如Chamaecyparis obtuse)；大蠊属(Periplaneta)(例如美洲大蠊(Periplaneta Americana))；冰草属(Agropyron)(例如偃麦草(Agropyron repens))；黑麦属(Secale)(例如黑麦(Secale cereal))；小麦属(Triticum)(例如小麦(Triticum aestivum))；鸭茅属(Dactylis)(例如鸭茅(Dactylis glomerata))；羊茅属(Festuca)(例如牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾属(Poa)(例如草地早熟禾或加拿大早熟禾(Poa pratensis of Poa compressa))；燕麦属(Avena)(例如燕麦(Avena sativa))；绒毛草属(Holcus)(例如Holcus lanatus)；黄花茅属(Anthoxanthum)(例如燕麦(Avena sativa))；
绒毛草属(Holcus)(例如绒毛草(Holcus lanatus))；黄花茅属(Anthoxanthum)(例如黄花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麦草属(Arrhenatherum)(例如燕麦草(Arrhenatherum elatius))；剪股颖属(Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草属(Phleum)(例如梯牧草(Phleum pretense))；草芦属(Phalaris)(例如草芦(Phalaris arundinacea))；
雀稗属(Paspalum)(例如百喜草(Paspalum notatum))；高梁属(Sorghum)(例如石茅高粱(Sorghum halepensis))；和柏木(Bomus)(例如无芒雀麦(Bromus inermis))。
绒毛草属(Holcus)(例如绒毛草(Holcus lanatus))；黄花茅属(Anthoxanthum)(例如黄花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麦草属(Arrhenatherum)(例如燕麦草(Arrhenatherum elatius))；剪股颖属(Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草属(Phleum)(例如梯牧草(Phleum pretense))；草芦属(Phalaris)(例如草芦(Phalaris arundinacea))；
雀稗属(Paspalum)(例如百喜草(Paspalum notatum))；高梁属(Sorghum)(例如石茅高粱(Sorghum halepensis))；和柏木(Bomus)(例如无芒雀麦(Bromus inermis))。
[0123] 例如，在如下任意一种或多种的自身免疫疾病或障碍中涉及的抗原可以用于本发明；糖尿病、糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦综合征包括斯耶格伦综合征继发性干燥性角结膜炎、斑秃、因节肢动物叮咬反应导致的过敏反应、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、过敏性鼻炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感音神经性听觉丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血(pure red cellanemia)、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿、慢性活动性肝炎(chronic active pepatitis)、斯-约二氏综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔癣、克罗恩病、格雷夫斯眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。自身免疫疾病中涉及的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白质、乙酰胆碱受体成分、甲状腺球蛋白和促甲状腺激素(TSH)受体。
[0124] 本发明同样关注的其他病症的特征为全身炎症和/或感染且可能与如下疾病相关：创伤、烧伤、手术、冠状动脉病、冠状动脉动脉粥样硬化、动脉粥样硬化、心肌梗死后梗死炎症和修复、心脏缺血-再灌注损伤、心肌炎症、心肌缺血、心血管疾病、脑梗死、出血性休克、再灌注损害、透析、休克和/或细菌或病毒感染、体外膜式氧合(ECMO)、休克、系统性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、多器官衰竭、移植物例如器官和/或假体排斥、心肺搭桥手术、慢性炎症、哮喘和/或肺中的应激相关疾病、细菌感染、坏疽、软组织感染和伤口感染。
[0125] 本发明的药物组合物
[0126] 如上所述，本发明的脂质体用作本发明药物制剂的成分。关注适合于静脉内施用于哺乳动物的任意这种制剂形式。
[0127] 本发明的药物制剂优选是溶液、分散液、混悬液、冻干物形式或冷冻形式。
[0128] 治疗用途或方法
[0129] 本发明的另一个部分是用作药物的本发明的脂质体或基于脂质的递药系统或药物组合物。特别地，本发明的这些方面可以用于预防或治疗或改善单核细胞相关疾病，例如：
[0130] 脓毒症：
[0131] 脓毒性休克是重症监护病房中最常见的死亡原因且死亡率为25-50％(Kumar,V,等人(2007).Robbins Basic Pathology(第8版).Saunders Elsevier.第102-103页)。活化单核细胞在患者存活方面起重要作用，其中单核细胞是对于疾病发展而言关键的分泌的细胞因子的主要来源，主要涉及IL1β、IL-6和TNFa。存活或脓毒症患者与来自脓毒症发作后前48h的这些患者的血清中观察到的IL-6水平相关。对于具有在诊断后前48h内测定的高IL-6的患者(>1000pg/mL)，死亡率为50％，而低IL-6(<1000pg/mL)与良好的存活率相关(在第28天时存活率为100％)(Spittler A.等人Clinical Infections Diseases,2000、31；1338-42)。施用低剂量的糖皮质激素降低了患有脓毒症的患者中的死亡率(Djillali A.,等人JAMA 2002,288、no7,862-872)，表明糖皮质激素治疗且特别是如本申请中所公开的靶向的脂质体糖皮质激素治疗靶向脓毒症中的住院效应细胞之一；单核细胞可以是富有希望的治疗机会，特别是在诊断和/或发作后前48h施用于具有高IL-6水平(>1000pg/mL)的患者时。
[0132] 川崎病：
[0133] 川崎病(KD)是中等大小动脉的自身免疫炎症。它影响许多器官系统，主要是包括血管、皮肤、粘膜和淋巴结的那些；最严重的作用是针对心脏，其中它可以导致未治疗的儿童中发生致命性冠状动脉瘤。KD主要是儿科疾病，其可能由早期感染诱发。炎症完全弥漫在动脉周围；作为结果，动脉的结构成分发生强烈损伤；动脉随后开始膨胀。炎症细胞浸润持续直至大约该病的第25天，此后炎症细胞数量逐步减少。KD动脉炎的特征在于由单核细胞/巨噬细胞严重蓄积组成的肉芽肿性炎症(Matsubara T.等人Clin Exp Immunol,141:381-387)。认为单核细胞/巨噬细胞异常活化牵连形成血管损害。KD进行至多3-4周且涉及具有诱导的TNFa、IL-2R、IL-1、IL-6和NO-合酶增加的单核细胞/巨噬细胞活化(Furukawa S等人Nihon Rinsho.2008Feb；66(2):258-64)。
[0134] 冠状动脉炎
[0135] 冠状动脉炎在KD发作后6-8天开始(Takahashi K,Clin Exp Immunol.2011年5月；164增刊1:20-2)。静脉内免疫球蛋白(IVIG)是川崎病的标准疗法，通常补充使用施用阿司匹林至多2个月。使用皮质类固醇也取得了成功且与IVIG在降低细胞因子水平方面相差无几或略高于它，尤其是在其他治疗无效或症状复发时，但是可能产生另外的副作用(Miura M等人Eur J Pediatr.2008Oct；167(10):1119-23)。因此，使用免疫抑制脂质体的脂质体靶向KD中的单核细胞可以改善免疫抑制作用和疾病进展，同时减少因施用游离皮质类固醇观察到的全身副作用。
[0136] 结节病
[0137] 结节病是未知原因的疾病，其中慢性炎症细胞的异常集合(肉芽肿)在多个器官]中作为结节形成。30-70％的患者无需治疗。皮质类固醇、最常见的是泼尼松龙成为治疗标准已经许多年了。在一些患者中，这种治疗可以减缓或逆转疾病过程，而另外的患者对类固醇疗法无应答。大约10％发生严重的残疾。肺瘢痕形成或感染可以导致呼吸衰竭和死亡(Chen ES.等人，Nat Rev Rheumatol.2011年7月12日；7(8):457-67)。来自合并TLR2和NOD2刺激后的结节病患者的血单核细胞中的促炎细胞因子的TLR表达增加和分泌增强可能与结节病的病原体相关。因此，与靶向结节病患者中的单核细胞的免疫抑制性化合物如皮质类固醇一起配制的阳离子脂质体可以改善许多结节病的严重性病例中的疾病发展(Wikén M.等人.J Clin Immunol.2009年1月；29(1):78-89)。
[0138] 本发明同样关注的其他疾病的特征为全身炎症和/或感染，且可能与创伤、烧伤、手术、透析、休克和/或细菌或病毒感染相关。在本发明的一个优选的实施方案中，全身性疾病与选自如下疾病的相关：体外膜式氧合(ECMO)、休克、冠状动脉病、冠状动脉动脉粥样硬化、动脉粥样硬化、心肌梗死后梗死炎症和修复、心脏缺血-再灌注损伤、心肌炎症、心肌缺血、心血管疾病、脑梗死、出血性休克、再灌注损害、全身性炎性反应综合征(systemic inflammatiory response syndrome)(SIRS)、脓毒症、多器官衰竭、移植物例如器官和/或假体排斥、心肺搭桥手术、慢性炎症、哮喘和/或肺中与应激相关的疾病、细菌感染、坏疽、软组织感染和伤口感染、全身性炎性反应综合征、SLE、溶血性尿毒症综合征、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症、肺泡蛋白沉积症、系统性硬化病、骨髓炎、器官移植排斥(GVHD)、红斑狼疮、斯耶格伦综合征、肾小球肾炎、溶血性尿毒症综合征、丹毒、嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症。
[0139] 此外，本发明的方面可以用于预防或治疗或改善局部和/或慢性炎症，例如如下的炎症：
[0140] 与缺血性再灌注损伤相关的心肌梗死：
[0141] 心肌梗死(MI)可以引起短暂性局部缺血，其导致心脏组织中的坏死。坏死组织必须在NK细胞、巨噬细胞和单核细胞迁移入组织并且产生蛋白水解酶和炎症细胞因子和趋化因子包括IL-8、MCP-1和CCL5和活性氧(ROS)时出现的MI后的第一天内被除去。在MI后的第一天，受损的组织受到坏死组织吞噬作用所需的炎性单核细胞浸润，触发血管发生并且启动胶原蛋白合成，其为对于梗死区域的后期组织愈合重要的因子。然而，如果炎性单核细胞持续在愈合组织中，则修补的单核细胞不能侵入组织并且使其恢复。因此，炎性单核细胞与修补单核细胞之间的平衡对于MI后的成功愈合过程是重要的(Nahrendorf M等人Circulation,2010、121:2437-2445)。因此，患有具有MI后第一阶段中高水平炎性单核细胞的患者可以得益于使用具有免疫抑制性化合物如糖皮质激素的单核细胞靶向脂质体的治疗，它们可以抑制促炎细胞因子、趋化因子和活性氧在损伤部位产生，由此减轻因炎性单核细胞导致的心肌炎症和损伤效应。
[0142] 动脉粥样硬化：
[0143] 动脉粥样硬化是涉及动脉壁炎症和胆固醇、脂质和炎性巨噬细胞沉积而形成斑块的动脉疾病。所述斑块可以破裂，从而导致血栓形成、心肌梗死和中风。单核细胞蓄积在炎症部位，且据报道进入动脉硬化斑块，在那里它们可能分化成细胞和巨噬细胞(Wollard KJ,.Geissmann F.,Nar Rev Cardiol.,2010；7(2):77)。此外，单核细胞衍生的细胞因子IL-6和TNFα在动脉硬化患者中升高(Correa CR.,等人Journal of inflammation,2011,8:23)，且抑制单核细胞补充至斑块的疗法表明为减少斑块形成的有活力的策略(Potteaux S.等人Journal of clinical investigation,2011；5；121、2025-2036)。使用糖皮质激素处理单核细胞显示迁移减少且粘附发炎的内皮细胞，表明与糖皮质激素共同配制的单核细胞靶向脂质体可以是减少动脉硬化斑块乃至使其消退的良好策略。
[0144] 类风湿性关节炎
[0145] 类风湿性关节炎(RA)是具有炎症和变形关节的自身免疫疾病、单核细胞、巨噬细胞、T和B-细胞蓄积在滑膜中，在那里它们对于关节破坏起重要作用。炎性单核细胞牵连RA发生基于如下事实：单核细胞分泌大量TNFα且阻断这种细胞因子是RA最有效的治疗之一；第二，单核细胞耗尽已经显示对于RA患者的有益效果(Sanmarti R.等人,Rheumatology.2005Sep；44(9):1140-4)；第三，通过中和迁移标记CCR1、2、3、5和9阻断单核细胞迁移已表明了用于缓RA解症状的富有希望的策略(Schmutz C.等人Arthritis Research&Therapy,2010、12:R161)。因此，能够递送免疫抑制性化合物如糖皮质激素的脂质体可以是富有希望的策略，以便1)通过减量调节迁移受体减少单核细胞迁移至发炎关节；2)减少炎症细胞因子例如TNFα产生。
[0146] 骨关节炎
[0147] 骨关节炎(OA)是全世界最常见的关节疾病且具有巨大的社会和经济影响。尽管骨关节炎(OA)牵连关节发炎，但是OA中的炎症的严重程度低于RA。然而，来自OA关节的单核细胞产生炎性细胞因子如IL-1和TNFα，它们在OA进展中起主要作用(Femandes J.C.等人Biorheology.2002；39(1-2):237-46)。中和IL-1和/或TNFα似乎可以减轻疾病症状，至少是在实验性动物模型中(Calich AL,Clin Rheumatol.2010年5月；29(5):451-5)。因此，能够递送免疫抑制性化合物如糖皮质激素的脂质体可以是富有希望的策略，以便1)通过减量调节迁移受体减少单核细胞迁移至发炎OA关节；2)减少炎症细胞因子如IL-1和TNFα产生。
[0148] 此外，本发明的方面可以用于预防或治疗或改善如下病症或疾病：克罗恩病、特应性湿疹、肺纤维化、皮肤炎症、肺泡蛋白沉积症、COPD、糖尿病、糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦综合征包括斯耶格伦综合征继发性干燥性角结膜炎、斑秃、因节肢动物叮咬反应导致的过敏反应、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感音神经性听觉丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿、慢性活动性肝炎、斯-约二氏综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔癣、格雷夫斯眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化。
[0149] 此外，本发明的方面可以用于预防或治疗或改善其中优选免疫刺激的病症，例如癌症、感染的病症或需要施用疫苗或免疫刺激的疾病，例如(癌症实体瘤、针对癌症和感染性疾病的疫苗)。
[0150] 致耐受性疫苗
[0151] 此外，本发明的方面可以用于致耐受性疫苗，其中通过被动或主动加载或通过锚着在脂质体膜中包封抗原或使所述抗原结合单核细胞靶向脂质体。此外，致耐受性脂质体可以包括一种或多种诱导耐受性的化合物，其选自维生素D3(1,25-二羟基维生素D3)和视黄酸(全反式和9-顺式视黄酸)、倍他米松半琥珀酸酯、地塞米松棕榈酸酯、磷酸地塞米松、利美达松、甲泼尼龙半琥珀酸酯、强的松龙棕榈酸酯和磷酸泼尼松龙及其相关合成或天然类似物。这种静脉内施用的制剂可以诱导诱导抗原特异性耐受性的单核细胞，其可以分化成诱导耐受性的巨噬细胞或树突细胞。诱导耐受性的单核细胞靶向脂质体可以用于治疗或缓解涉及自身抗原(自身免疫疾病)或外部抗原(过敏症)的免疫性疾病或超敏反应。这种疾病的实例包括自身免疫疾病，例如克罗恩病、特应性湿疹、糖尿病、关节炎、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、银屑病。用于治疗过敏症的致耐受性疫苗可以包括哮喘、过敏性咳嗽、过敏性鼻炎和结膜炎、特应性湿疹、皮炎、药物过敏、风疹、荨麻疹、昆虫咬伤过敏症、食物过敏例如鱼、牛奶、小麦、花生、苹果、坚果过敏症。
[0152] 将全部引述的参考文献完整地引入本文。
[0153] 实施例1
[0154] 脂质体制备
[0155] 单层完全水化的脂质体由1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DOPE-PEG2000)的混合物构成。作为测定生物系统中脂质体存在的荧光标记，将0.5％
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-罗丹明(DOPE-RhB)与作为示踪物的脂质混合。
将脂质体中每种脂质的摩尔比概括在图1A中。全部脂质均得自Avanti Polar lipids。简言之，将称重的适量POPC、POPG、DOTAP和DOPE-PEG2000溶于氯仿。通过适度N2气流除去溶剂，使脂质膜在低压下干燥过夜，以除去痕量的溶剂。通过将干燥的脂质分散于包含如下成分的缓冲溶液制备多层脂质体：150mM KCL、10mM HEPES(pH＝7.5)、1mM NaN3、30μM CaCl2和10μM EDTA。通过如Mayer等人Biochim.Biophys.Acta,858、161-168所述的2层叠加的100nm孔径的聚碳酸酯滤膜将多层脂质体挤出10次。
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-罗丹明(DOPE-RhB)与作为示踪物的脂质混合。
将脂质体中每种脂质的摩尔比概括在图1A中。全部脂质均得自Avanti Polar lipids。简言之，将称重的适量POPC、POPG、DOTAP和DOPE-PEG2000溶于氯仿。通过适度N2气流除去溶剂，使脂质膜在低压下干燥过夜，以除去痕量的溶剂。通过将干燥的脂质分散于包含如下成分的缓冲溶液制备多层脂质体：150mM KCL、10mM HEPES(pH＝7.5)、1mM NaN3、30μM CaCl2和10μM EDTA。通过如Mayer等人Biochim.Biophys.Acta,858、161-168所述的2层叠加的100nm孔径的聚碳酸酯滤膜将多层脂质体挤出10次。
[0156] 实施例2
[0157] 依赖于组成的脂质体大小和表面电荷的表征
[0158] 通过设计具有被单核细胞、但不能被血液中的其他细胞识别和摄取的能力的脂质体的尝试制备如图1A中概括制备的脂质体。我们设计了带有0-50％净正电荷的脂质体(图1A中的制剂6-12)与带有负电荷或近中性电荷的对照脂质体(图1A中的制剂1-5)。如实施例1中所述制备脂质体并且通过动态光散射、使用来自Brookhaven Instruments的ZetaPALSζ电位分析仪在由在MilliQ水中的300mM葡萄糖、10mM HEPES、1mM CaCl2组成的pH 7.4的缓冲液中测定以纳米(nm)计的它们的大小。脂质体显示直径大小为
110±20nm(图1B)。以mV测定该脂质体的表面电荷(ζ电位)，且其显示表面电荷依赖于脂质组成(图1C)。在脂质体中添加带负电荷的POPG(10摩尔％)显示表面负电荷为-13mV(图
1C，组合物1)。脂质体中高含量的中性脂质POPC(100摩尔％)显示中性电荷(图1C，组合物3)。DOTAP的量增加至10％(摩尔百分比90:10)显示净正电荷接近38mV(图1B，组合物8)，而在50mol％(摩尔百分比50:50)下的最高量DOTAP显示净正电荷为52mV(图1C，组合物12)。
110±20nm(图1B)。以mV测定该脂质体的表面电荷(ζ电位)，且其显示表面电荷依赖于脂质组成(图1C)。在脂质体中添加带负电荷的POPG(10摩尔％)显示表面负电荷为-13mV(图
1C，组合物1)。脂质体中高含量的中性脂质POPC(100摩尔％)显示中性电荷(图1C，组合物3)。DOTAP的量增加至10％(摩尔百分比90:10)显示净正电荷接近38mV(图1B，组合物8)，而在50mol％(摩尔百分比50:50)下的最高量DOTAP显示净正电荷为52mV(图1C，组合物12)。
[0159] 实施例3
[0160] 依赖于脂质体组成的靶向至单核细胞的脂质体
[0161] 基于掺入脂质体膜的RhB的荧光测定改进的POPC脂质体制剂的细胞摄取量。使用在532nm处的激发和在564-606nm处的发射评估与细胞结合的脂质体的总量(表示为‘摄取量’且包括细胞膜结合的脂质体和已经吸收内在化的脂质体)。分析全血中5种不同细胞群中的脂质体摄取量。下列标记用于区分不同的群体：CD14(单核细胞标记)、CD15(粒细胞标记)、CD3(T-淋巴细胞标记)、CD19(B-淋巴细胞标记)和CD56(天然杀伤细胞标记)。全血通过使用包含乙二胺四乙酸(EDTA,366450)的BD真空采血管的标准方法得自健康志愿者。简言之，将10μl脂质体制剂(图1A中的制剂1-5和8)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl新鲜全血中。将样品在37℃与旋转下温育1h。将红细胞(RBC)在室温(RT)在黑暗处在BD血清真空采血管(367614)中在4mL BD Pharm裂解缓冲液中裂解15min，以
200g离心5min，重新混悬于1mL Pharm裂解缓冲液中。在RT在黑暗中5min温育后，将样品以200g离心5min，重新混悬于1mL FACS缓冲液(补充有1％BSA的PBS)，即刻以200g离心5min，重新混悬于400μL FACS缓冲液，转入具有圆底的96孔培养板(Nunc)。在冰上用人IgG阻断非特异性结合10min，然后将细胞在冰上在具有初级预缀合抗体或同工型对照(表1)的100μL中温育60分钟，在4℃以600g离心5min，用200μLFACS缓冲液洗涤
2次。将细胞重新混悬于150μL FACS缓冲液，然后进行流式细胞检测分析，其可以使用BD FACSArray生物分析仪进行。用BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析所有细胞群。带负电荷的和中性的脂质体未被细胞摄取(图2)。阴离子的和中性的脂质体未被任何细胞群摄取。包含DOTAP的阳离子制剂被大于其他细胞群的量的CD14阳性单核细胞摄取(p<0.0001)。添加10mol％PEG抑制了阳离子脂质体在CD14阳性单核细胞中的一些摄取。基于这些结果，仅两种类型的制剂(POPC和POPC:DOTAP)用于将来的实验中。
200g离心5min，重新混悬于1mL Pharm裂解缓冲液中。在RT在黑暗中5min温育后，将样品以200g离心5min，重新混悬于1mL FACS缓冲液(补充有1％BSA的PBS)，即刻以200g离心5min，重新混悬于400μL FACS缓冲液，转入具有圆底的96孔培养板(Nunc)。在冰上用人IgG阻断非特异性结合10min，然后将细胞在冰上在具有初级预缀合抗体或同工型对照(表1)的100μL中温育60分钟，在4℃以600g离心5min，用200μLFACS缓冲液洗涤
2次。将细胞重新混悬于150μL FACS缓冲液，然后进行流式细胞检测分析，其可以使用BD FACSArray生物分析仪进行。用BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析所有细胞群。带负电荷的和中性的脂质体未被细胞摄取(图2)。阴离子的和中性的脂质体未被任何细胞群摄取。包含DOTAP的阳离子制剂被大于其他细胞群的量的CD14阳性单核细胞摄取(p<0.0001)。添加10mol％PEG抑制了阳离子脂质体在CD14阳性单核细胞中的一些摄取。基于这些结果，仅两种类型的制剂(POPC和POPC:DOTAP)用于将来的实验中。
[0162] 实施例4
[0163] 依赖于脂质体温育时间的靶向至单核细胞的脂质体
[0164] 全血如实施例3中所述得自健康志愿者。简言之，将10μl脂质体制剂(图1A中的制剂3和8)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl新鲜全血中。将样品在37℃与旋转下温育5min、15min和1h。如实施例3中所述将红细胞(RBC)裂解，并且准备细胞用于FACS分析。通过BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析所有细胞群(图3)。当脂质体包含10％DOTAP时，在单核细胞中观察到细胞摄取量的时间依赖性增加(图3B)。在所有3个时间点处，单核细胞中的摄取量都显著高于其他4种细胞群中的摄取量(p<0.0001)。
[0165] 实施例5
[0166] 依赖于脂质体电荷特性的靶向至单核细胞的脂质体
[0167] 使用包含0-50mol％DOTAP的脂质体制剂测试正电荷对细胞摄取量的作用(图5A)。全血如实施例3中所述得自健康志愿者。简言之，将10μl脂质体制剂(图1A中的制剂3和6-12)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl新鲜全血中。将样品在37℃与旋转下温育1h。如实施例3中所述将红细胞(RBC)裂解，并且准备细胞用于FACS分析。通过BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析所有细胞群(图5)。由POPC组成的脂质体和包含5mol％DOTAP的那些脂质体几乎未被细胞摄取(RhB阳性的细胞<5％)。包含7.5-12.5mol％DOTAP的脂质体在CD14阳性单核细胞中的摄取程度高于在其他细胞群中的摄取程度(p<0.0001)。当将15mol％DOTAP掺入膜时，更多的CD19阳性B-淋巴细胞开始摄取所述制剂。CD14细胞对RhB的阳性率明显高于CD19细胞(p<0.001)和其他3种细胞群(p<0.0001)。在20mol％DOTAP下，CD19细胞对RhB呈阳性的量与CD14细胞相同，而CD3、CD15和CD56对RhB呈阳性的细胞明显较少。在50mol％DOTAP下，85-100％的所有细胞群都已摄取脂质体。这表明竞争以特异性靶向血液中的CD14阳性单核细胞的最佳的DOTAP为7.5-12.5mol％DOTAP。
[0168] 实施例6
[0169] 依赖于血液新鲜度的靶向至单核细胞的脂质体
[0170] 为了能够研究脂质体在人血细胞中的摄取量，必需使用体外模型。全部实验均在从供体中抽取血液后即刻得到的全血中(10分钟内)进行，因为新鲜血液可能最接近地模拟体内条件。为了研究这种体外条件方面的重要性，将血液在37℃与旋转下保持2h和4h，然后进行脂质体摄取研究(图6)。全血如实施例3中所述得自健康志愿者。简言之，将血液在37℃与旋转下温育0h、2h和4h后，将10μl脂质体制剂(图1A中的制剂3和8)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl新鲜全血中。将样品在37℃与旋转下温育1h。如实施例3中所述将红细胞(RBC)裂解，并且准备细胞用于FACS分析。通过BD FACSDiva软件v5.0.2分析数据。将未染色的细胞用作阴性对照，并且将具有高于对照组细胞的荧光的细胞视为阳性。相同的门控用于分析所有细胞群。在t＝0h时，摄取量如上所述(实施例3，制剂3和8)，其中在CD14阳性细胞中的摄取量明显高于4种另外的群体。2h后，摄取达
10％DOTAP的CD14阳性单核细胞百分比明显地比在t＝0h时的CD14阳性细胞下降，同时，CD19阳性B-淋巴细胞摄取的脂质体模型多于在t＝0的CD19细胞。在t＝2h和t＝4h时，在CD14与CD19阳性细胞之间的摄取量无显著性差异。在CD14单核细胞中的摄取量在t＝4h时进一步减少。这些结果一起显示血液的新鲜度对于体外条件模拟体内条件的重要性。
10％DOTAP的CD14阳性单核细胞百分比明显地比在t＝0h时的CD14阳性细胞下降，同时，CD19阳性B-淋巴细胞摄取的脂质体模型多于在t＝0的CD19细胞。在t＝2h和t＝4h时，在CD14与CD19阳性细胞之间的摄取量无显著性差异。在CD14单核细胞中的摄取量在t＝4h时进一步减少。这些结果一起显示血液的新鲜度对于体外条件模拟体内条件的重要性。
[0171] 实施例7
[0172] 阳离子脂质体对单核细胞细胞系THP1的细胞毒活性
[0173] 进行毒性试验以检验阳离子脂质体的潜在细胞毒性效应(图7)。使用来自图5A的制剂(图1A中的组合物3+6、8、10、11、12)测定脂质体对人单核细胞细胞系的细胞毒性。6
将脂质体制剂(10μl)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl细胞混悬液(10细胞/ml)中。将细胞与不同浓度(0、5、50、250和500μM)的脂质体一起在37℃与旋转下温育1h，然后用新鲜培养基洗涤2次。即刻通过FACS分析THP-1细胞的摄取量(图7A)。在新鲜培养基中24h温育后，通过分析结合细胞的膜联蛋白V测定诱导的细胞凋亡。膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸具有特异性亲和力，其在诱导细胞凋亡后迅速地从质膜内层易位至细胞表面(G.Koopman等人,Blood,84(5):1415–1420，1994年9月)。将细胞在37℃在加湿空气气-6
氛中在5％CO2的存在下在96孔培养板中温育24h。将10 M(0.26g/μl)星状孢子素加入到1个含有细胞的孔中并且用作细胞凋亡的阳性对照。收集细胞并且用冰冷的PBS洗
6
涤2次，以10细胞/ml的浓度重新混悬于结合缓冲液。将总计100μl的细胞混悬液加入到1μl膜联蛋白V中，适度混合，在RT在黑暗中温育15min，即刻通过FACS分析。包含至多20mol％DOTAP的阳离子脂质体与未处理细胞相比无显著性细胞毒性(图7B和7C)。在
50mol％DOTAP下，脂质体对细胞具有毒性，此时它们以高浓度存在(250和500μM)，所述浓度由结合的膜联蛋白V的量检测到，其明显高于对照组和其他制剂(P<0.001)。在24h温育后还在细胞上进行增殖试验以分析脂质体处理的细胞的活率。基于细胞将四唑鎓试剂(氢氧化2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓(XTT))转化成水溶性甲 产物的能力评价脂质体诱导的细胞毒性。将脂质体制剂(10μl)加入
6
到1.5ml埃彭道夫管中的200μl细胞混悬液(10细胞/ml)中。将样品在37℃与旋转下温育1h。在96-孔微量滴定板上的100μl培养基中接种105细胞/孔，在37℃温育24h。
加入XTT标记混合物(20μl)，将细胞再温育4h。使用Infinite 200微量培养板读出器(Tecan, Switzerland)如制造商推荐的在450nm扣除在690nm处的吸光度
测定样品的吸光度。与膜联蛋白V结合一样，包含50mol％DOTAP的脂质体在高浓度(250和500μM)下对细胞具有根据减少的量的转化的XTT检测的毒性。
将脂质体制剂(10μl)加入到1.5ml埃彭道夫管中的200μl细胞混悬液(10细胞/ml)中。将细胞与不同浓度(0、5、50、250和500μM)的脂质体一起在37℃与旋转下温育1h，然后用新鲜培养基洗涤2次。即刻通过FACS分析THP-1细胞的摄取量(图7A)。在新鲜培养基中24h温育后，通过分析结合细胞的膜联蛋白V测定诱导的细胞凋亡。膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸具有特异性亲和力，其在诱导细胞凋亡后迅速地从质膜内层易位至细胞表面(G.Koopman等人,Blood,84(5):1415–1420，1994年9月)。将细胞在37℃在加湿空气气-6
氛中在5％CO2的存在下在96孔培养板中温育24h。将10 M(0.26g/μl)星状孢子素加入到1个含有细胞的孔中并且用作细胞凋亡的阳性对照。收集细胞并且用冰冷的PBS洗
6
涤2次，以10细胞/ml的浓度重新混悬于结合缓冲液。将总计100μl的细胞混悬液加入到1μl膜联蛋白V中，适度混合，在RT在黑暗中温育15min，即刻通过FACS分析。包含至多20mol％DOTAP的阳离子脂质体与未处理细胞相比无显著性细胞毒性(图7B和7C)。在
50mol％DOTAP下，脂质体对细胞具有毒性，此时它们以高浓度存在(250和500μM)，所述浓度由结合的膜联蛋白V的量检测到，其明显高于对照组和其他制剂(P<0.001)。在24h温育后还在细胞上进行增殖试验以分析脂质体处理的细胞的活率。基于细胞将四唑鎓试剂(氢氧化2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓(XTT))转化成水溶性甲 产物的能力评价脂质体诱导的细胞毒性。将脂质体制剂(10μl)加入
6
到1.5ml埃彭道夫管中的200μl细胞混悬液(10细胞/ml)中。将样品在37℃与旋转下温育1h。在96-孔微量滴定板上的100μl培养基中接种105细胞/孔，在37℃温育24h。
加入XTT标记混合物(20μl)，将细胞再温育4h。使用Infinite 200微量培养板读出器(Tecan, Switzerland)如制造商推荐的在450nm扣除在690nm处的吸光度
测定样品的吸光度。与膜联蛋白V结合一样，包含50mol％DOTAP的脂质体在高浓度(250和500μM)下对细胞具有根据减少的量的转化的XTT检测的毒性。
[0174] 实施例8
[0175] 动物模型中单核细胞的特异性脂质体摄取的测试
[0176] 将由POPC(100)(阴性对照)和包含0,2-0,5mol％DOPE-罗丹明B和/或氚标记的POPC(1-2mol％)的POPC:DOTAP(90:10)组成的RhB标记的脂质体注入啮齿动物(例如大鼠或家兔)尾静脉。5min、15min和1h后，抽取血样，裂解RBCs，通过FACS、经检测罗丹明B分析不同细胞群中的脂质体摄取量，如实施例3中所述。通过处死动物分析器官如肝、脾、心脏和肺中蓄积的脂质体的总量，抽取大量血样，取出器官，匀化组织，检测这些器官中氚的量。预计富含免疫细胞的器官如血液、肝和脾显示与例如心脏相比相对高的氚水平。
[0177] 实施例9
[0178] 治疗脓毒症的单核细胞靶向的治疗效果分析
[0179] 脓毒症是潜在威胁生命的病症，其中细菌或其毒性产物被血液扩散。免疫系统可以损伤远离起始感染的器官。RhB标记的脂质体由糖皮质激素例如磷酸地塞米松或甲泼尼龙琥珀酸酯组成，其可以主动地载入(Avnir等人PLoS ONE,2011年10月，第6卷，第10期,25721)由POPC:DOTAP(90:10)组成的脂质体，将所述的RhB标记的脂质体注入急性炎症的大鼠模型的尾静脉。实验性脓毒症的相关模型可以包括盲肠结扎与穿刺模型(CLP)或LPS诱导的实验模型。优选地，在模型启动的当天注射糖皮质激素脂质体或在随后的数天注射1次或每日静脉内注射。在确定的间隔，测定血液中的炎症标记，典型地，监测血液中的细胞因子如TNF-α、IL-6以确定单核细胞抑制的效应。
[0180] 实施例10
[0181] 用于治疗单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)感染的单核细胞靶向的治疗效果分析
[0182] 利斯特菌病是因细菌单核细胞增生利斯特菌导致的严重感染。该细菌在血液细胞中生长并且在胞内分裂(Stavru F.等人Immunol Rev,240(1):160–184,2011年5月)。单核细胞增生利斯特菌在所有血液细胞类型中发现，因为它们使用InlA和IlnB进入非吞噬细胞类型。氨苄西林被包封在RhB标记的由POPC:DOTAP(90:10)组成的脂质体内并且被注入单核细胞增生利斯特菌的大鼠模型的尾静脉。将从肝、脾和血液中回收的单核细胞增生利斯特菌细胞的数量用作治疗单核细胞增生利斯特菌感染的治疗效能的参数。
[0183] 实施例11
[0184] 用于治疗动脉粥样硬化的单核细胞靶向的治疗效果分析
[0185] 动脉粥样硬化是这样一种疾病，其中作为内皮功能障碍的结果动脉壁增厚，导致脂蛋白在内皮下蓄积并且粘附白细胞，例如单核细胞和T-淋巴细胞。该病发生中的关键步骤是单核细胞在受损的内皮中分化成巨噬细胞且随后脂质的摄入将它们转化成泡沫细胞。通过Yamaguchi等人(1993)的方法制备正常和致动脉粥样化的小鼠。将RhB标记的由例如掺入POPC:DOTAP(90:10)的磷酸地塞米松或甲泼尼龙琥珀酸酯组成的脂质体注入尾静脉。
通过监测主动脉胆固醇酯(CE)水平检查致动脉粥样化的小鼠中粥样硬化病变的形成。
通过监测主动脉胆固醇酯(CE)水平检查致动脉粥样化的小鼠中粥样硬化病变的形成。
[0186] 实施例12
[0187] 使用免疫抑制性脂质体(非-抗原特异性)治疗患有关节炎的哺乳动物
[0188] 关节炎是涉及炎症与产生促炎细胞因子如TNFα和IL-6、存在炎性细胞且其迁移入关节并且存在与自身抗原反应的自身抗原抗体的关节自身免疫疾病。涉及关节炎发生的主要细胞类型是巨噬细胞和树突细胞，它们不同于从周围迁移入发炎关节的单核细胞，在那里它们进一步促进炎症病症。因此，通过使用定向于单核细胞的免疫抑制性脂质体抑制周围的单核细胞，迁移的单核细胞可以产生不会主动促进炎性病症的巨噬细胞和树突细胞。为了治疗或减轻关节炎症，如实施例1中所述使用POPC:DOTAP(90:10)制备脂质体，其中远距离地加载例如甲泼尼龙半琥珀酸酯(MPS)，其为两亲的弱酸性前药，使用如Avnir等人Arthritis&Rheumatism,第58卷,第1期,2008,pp119-129中的方法中所述的乙酸Ca梯度将MPS主动地载入脂质体。简言之，[乙酸 Ca]脂质体-[乙酸 Ca]介质跨膜梯度用2-
作远距离地加载两亲弱酸性GC前药的驱动力。这种梯度的特征在于不可透过膜的Ca 离子超过了可透过膜的乙酸。在这种脂质体中，MPS以其质子化(不带电荷)形式通过经脂双层扩散被“泵”入微碱性的脂质体内部的水相。在那里它失去其质子，变成带负电荷的并且形成难溶性MPS–钙盐，其在脂质体内部的水相中沉淀。将该脂质体以在等渗缓冲液例如盐水和/或含有蔗糖的形式施用于患有类风湿性关节炎的患者。优选将MPS-脂质体缓慢地静脉内施用于较大静脉之一，以减少粘附并且被内皮细胞摄取。MPS-脂质体由此粘附并且结合周围单核细胞，其吞噬MPS-脂质体。在此过程中，MPS从脂质体中释放并且在一定程度上活化核糖皮质激素受体，一旦单核细胞接近炎性关节炎环境，其抑制随后的单核细胞活化。因此，单核细胞分化成巨噬细胞和树突细胞受到抑制或倾向于致耐受性表型，且单核细胞迁移入发炎关节的可能性减少。
作远距离地加载两亲弱酸性GC前药的驱动力。这种梯度的特征在于不可透过膜的Ca 离子超过了可透过膜的乙酸。在这种脂质体中，MPS以其质子化(不带电荷)形式通过经脂双层扩散被“泵”入微碱性的脂质体内部的水相。在那里它失去其质子，变成带负电荷的并且形成难溶性MPS–钙盐，其在脂质体内部的水相中沉淀。将该脂质体以在等渗缓冲液例如盐水和/或含有蔗糖的形式施用于患有类风湿性关节炎的患者。优选将MPS-脂质体缓慢地静脉内施用于较大静脉之一，以减少粘附并且被内皮细胞摄取。MPS-脂质体由此粘附并且结合周围单核细胞，其吞噬MPS-脂质体。在此过程中，MPS从脂质体中释放并且在一定程度上活化核糖皮质激素受体，一旦单核细胞接近炎性关节炎环境，其抑制随后的单核细胞活化。因此，单核细胞分化成巨噬细胞和树突细胞受到抑制或倾向于致耐受性表型，且单核细胞迁移入发炎关节的可能性减少。
[0189] 实施例13
[0190] 使用免疫抑制性脂质体(抗原特异性)作为致耐受性疫苗的实例治疗患有关节炎的乳动物
[0191] 为了在自身免疫疾病如类风湿性关节炎中得到抗原特异性致耐受性应答，主要如实施例12所述制备脂质体。然而，可以给该脂质体加载MPS或其他诱导耐受性的化合物，如维生素D3或维A酸或一些其有效的类似物，已知它们诱导免疫耐受性。在加载免疫抑制性化合物前，根据实施例1制备脂质体并且根据抗原特性通过主动或被动加载将与类风湿性关节炎相关的抗原载入脂质体。相关抗原可以包括胶原蛋白II型、人软骨细胞糖蛋白39、聚集蛋白聚糖(衍生自蛋白聚糖)、热休克蛋白、瓜氨酸化角质纤丝聚集蛋白或其他相关抗原。主要根据Copland等人Vaccine 21,2003,pp 883-890的方法加载脂质体。简言之，在有机溶剂中混合POPC和DOTAP(90:10)，真空干燥，生成薄脂质膜。加入一定体积的典型地为2ml的包含可溶性抗原的pH 7.4的HEPES缓冲液，通过振摇制备多层脂质体。通过如实施例1中概括的挤出匀化该脂质体。将该脂质体通过静脉内施用于患有类风湿性关节炎的患者，目的在于生成可分化成树突细胞的单核细胞，其以抗原特异性特异性地显示针对包封的抗原的致耐受性活性。为了使靶向的单核细胞分化成致耐受性的抗原特异性树突细胞，有利的是包括少量免疫刺激性化合物，例如L18-MDP或TLR3、TLR7、TLR8或TLR9激动剂。
[0192] 实施例14
[0193] 使用免疫刺激性脂质体(非-抗原特异性)治疗患有癌症的哺乳动物
[0194] 为了得到适合于癌症治疗的免疫刺激性脂质体，使用例如POPC和DOTAP(90:10)制备靶向单核细胞的脂质体，其中添加了适合的免疫刺激性化合物，其通过可以为TLR3、7、8、9或NOD2的胞内受体起作用。在本实施例中，将免疫刺激性化合物米伐木肽(2-[(N-{(2R)-[(2-乙酰氨基-2,3-双脱氧-D-吡喃葡萄糖-3-基)氧基]-丙酰基}-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酰基)氨基]乙基(2R)-2,3-双(十六酰氧基)丙基磷酸氢酯)与POPC和DOTAP一起配制，并且干燥至得到脂质膜。该膜在适合于静脉内施用的缓冲液例如盐水和葡萄糖中水化。将米伐木肽-脂质体通过静脉内施用于患有例如骨肉瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤的癌症患者，间隔1-2周。已知单核细胞主要迁移至肿瘤环境且由此适合于在正确条件下增强抗肿瘤免疫应答。然而，已知的肿瘤发育现象是产生免疫抑制物质，如细胞因子和调节性T-细胞，它们对于完整免疫系统而言可能是难以克服的。因此，吞噬米伐木肽-脂质体的周围单核细胞被刺激以加强免疫应答，且可以显示更好的抗受性，并且克服了与癌症和肿瘤区域相关的诱导免疫耐受性的环境，由此使得米伐木肽-脂质体靶向的单核细胞刺激抗癌免疫应答。
[0195] 实施例15
[0196] 使用免疫刺激性脂质体(抗原特异性)治疗患有癌症的哺乳动物
[0197] 为了得到抗原特异性免疫应答，如实施例14中所述制备脂质体，然而用于水化脂质体的缓冲液包含所关注的癌症相关抗原(被动加载)。该抗原还可以使用适合于它的方法主动加载。该抗原可以是，例如用于治疗黑素瘤的MAGE抗原、用于治疗前列腺癌的PSA或第三种抗原。将所述抗原与可以为米伐木肽或TLR3、-7、-8和-9激动剂的免疫刺激性化合物一起，单独或以组合方式通过静脉内施用于相当于加载抗原的癌症患者。将该脂质体施用于同一患者多次，以加强抗原特异性应答，优选间隔1-2周。
[0198] 实施例16
[0199] 使用免疫刺激性脂质体(非-抗原特异性)治疗患有感染性疾病(例如单核细胞增生利斯特菌)的哺乳动物
[0200] 具有革兰氏阳性菌单核细胞增生利斯特菌的感染是最具有毒力的食物传播的病原体之一，其中20-30％的临床感染导致死亡，超过了沙门菌属和肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的致死率。为了得到适合于治疗感染性疾病如具有单核细胞增生利斯特菌(其为侵害单核细胞和巨噬细胞的胞内病原体)的人体感染的脂质体，使用例如POPC和DOTAP(90:10)制备脂质体。对于利斯特菌病的治疗，使用3种抗生素之一，包括青霉素、氨苄西林或甲氧苄啶磺胺甲异噁唑合剂。通过如实施例13中举出的被动加载或通过与实施例12中MPS加载类似的主动加载配制这些抗生素。用等渗缓冲液制备抗生素加载的脂质体，并且在较长时间期限内通过静脉内施用于患有利斯特菌病的患者。抗生素加载的阳离子脂质体会粘附单核细胞、被吞噬并且在胞内间隙释放抗生素，其中细菌是活的和正在分裂的。因此，抗生素可以杀死胞内细菌，阻断细菌在单核细胞和巨噬细胞内的进一步分裂且由此防止了感染向患者的进一步扩散。
[0201] 实施例17
[0202] 使用抗原特异性免疫刺激性脂质体预防感染性疾病(例如流感病毒)的疫苗[0203] 为了得到适合于治疗感染性疾病例如流感感染的抗原特异性免疫应答，使用例如POPC和DOTAP(90:10)制备脂质体。如实施例13中所述制备脂质体，然而用于水化脂质体的缓冲液包含流感病毒抗原(被动加载)或使用适合的梯度主动加载的流感病毒抗原。将所述抗原与可以为米伐木肽或TLR3、-7、-8和-9激动剂的免疫刺激性化合物一起，单独或以组合方式通过静脉内施用于期望降低未来流感感染风险的人。将该脂质体施用于同一患者多次，以加强抗原特异性应答，优选间隔2-3周。该疫苗还可以用于皮下或肌内施用。
[0204] 实施例18
[0205] 使用免疫抑制性脂质体治疗患有脓毒症的哺乳动物
[0206] 脓毒症是威胁生命的全身炎症，其牵连早期产生促炎细胞因子，特别是TNFα、IL-1β和IL-6。这些细胞因子由不同细胞类型且特别是由单核细胞产生。抑制这些促炎细胞因子在脓毒症早期阶段和诊断时的单核细胞产生可以减少促炎细胞因子且特别是IL-6产生，其为患者后期死亡的强烈预测物。靶向单核细胞的免疫抑制性脂质体由此可以通过靶向单核细胞并且减量调节其免疫活化而对患有脓毒症的患者具有强烈影响。
[0207] 为了治疗或减少单核细胞活化和全身炎症，如实施例1中所述使用POPC:DOTAP(90:10)制备脂质体，其中如实施例12中所概括的远距离加载例如甲泼尼龙半琥珀酸酯。
[0208] 将该脂质体在诊断的早期阶段施用于患有脓毒症的患者(典型地在住院期间或随后不久)。通过静脉内缓慢地施用MPS-脂质体，优选施用于较大静脉之一，以减少粘附并且被内皮细胞摄取。MPS-脂质体由此粘附并且结合周围单核细胞，其吞噬MPS-脂质体。在此过程中，MPS从脂质体中释放并且进一步抑制单核细胞活化。可以监测患者的全身IL-6水平，且如果IL-6水平超过500-1000pg/ml，则进一步用MPS-脂质体治疗。
[0209] 参考文献
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