人参果胶在抗抑郁样行为中的应用
阅读：263发布：2020-05-18
专利汇可以提供人参果胶在抗抑郁样行为中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人参果胶在抗抑郁样行为中的应用，属于中药应用领域。本发明通过人参果胶强饲给予小鼠12天，通过开场自主活动实验， 高架十字迷宫 实验，社会干扰实验及强迫游泳实验评价其抗抑郁样行为的活性，结果表明人参果胶显著增加了小鼠社会干扰实验中的干扰时间、次数，降低了小鼠入侵时间、次数；增加了小鼠进入高架十字迷宫中敞开臂的时间率和次数率；降低了小鼠强迫游泳实验的固定不动时间，上述行为学的改变伴随着小鼠海 马 脑区β-链蛋白Beta-catenin及脑源性神经营养因子BDNF的蛋白表达增加；即人参果胶通过诱导小鼠海马Beta-catenin及BDNF的蛋白表达，增强突触间递质的释放及突触间联系进而影响神经元的可塑性和促进神经元的发育，发挥抗抑郁样行为的活性。，下面是人参果胶在抗抑郁样行为中的应用专利的具体信息内容。
1.人参果胶在制备抗抑郁样行为药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的人参果胶在制备抗抑郁样行为药物中的应用，其特征在于，所述人参果胶活性组分为人参果胶酸性组分WGPA-A。
3.根据权利要求2所述的人参果胶在制备抗抑郁样行为药物中的应用，其特征在于，所述人参果胶酸性组分WGPA-A能诱导小鼠海马Beta-catenin及BDNF的蛋白表达上调，增强突触间递质的释放，影响神经元的可塑性和促进神经元的发育。
4.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的人参果胶在制备抗抑郁样行为药物中的应用，其特征在于，所述抗抑郁样行为为双向情感性精神障碍、社会攻击行为或焦虑等。
5.一种抗抑郁样行为的药物，其特征在于，所述药物包含人参果胶酸性组分WGPA-A。
6.根据权利要求5所述的一种抗抑郁样行为的药物，其特征在于，所述药物为以人参果胶酸性组分WGPA-A单一成分为有效药物成分。
7.根据权利要求6所述的一种抗抑郁样行为的药物，其特征在于，所述药物为人参果胶酸性组分WGPA-A和其他具有同类功效的药物成分组成的复方形式。
人参果胶在抗抑郁样行为中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种人参果胶在抗抑郁样行为中的应用，属于中药应用领域。
背景技术
[0002] 人参自古以来就以强身健体、延年益寿而著称，它具有抗疲劳、抗氧化、调节物质代谢、调节中枢神经系统等功效。人参及其提取物的神经保护作用已被广泛证实，如人参通过神经保护机制拮抗帕金森症(Van Kampen, J. M., Baranowski, D. B., Shaw, C. A., & Kay, D.G. (2014). Panax ginseng is neuroprotective in a novel progressive model of Parkinson's disease. Experimental Gerontology, 50, 95-105.)，此外，其提取物如人参皂甙Rg3也已经被证明能够拮抗24-羟-胆固醇诱导的细胞毒作用，保护皮质神经元(Roh, Y. S., Kim, H. B., Kang, C. W., Kim, B. S, Nah, S. Y, & Kim, J. H. (2010). Neuroprotective effects of ginsenoside Rg3 against 24-OH-cholesterol-induced cytotoxicity in cortical neurons. Journal of Ginseng Research, 34, 246-253.)。人参果胶作为人参的活性组分，具有抗肿瘤(Shin, H. J., Kim, Y. S., Kwak, Y. S., Song, Y. B., Kim, Y. S., & Park, J. D. (2004). Enhancement of antitumor effects of paclitaxel (taxol) in combination with red ginseng acidic polysaccharide (RGAP). Planta Medica, 24, 1033-1038.)，抗氧化应激(Luo, D. H., & Fang, B. S. (2008). Structural identification of ginseng polysaccharides and testing of their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers, 72, 376-381.)及抑制糖尿病(Konno, C., Murakami, M., Oshima, Y., & Hikino, H. (1985). Isolation and hypoglycemic activity of panaxans Q, R, S, T and U, glycans of Panax ginseng roots. Journal of Ethnopharmacology 14：69-74.)等生物学功能。
[0003] 发明人前期的实验结果已经证明人参果胶WGPA能够明显逆转小鼠强迫游泳实验的固定时间，具有抗抑郁的活性(Wang, J, Flaisher-Grinberg, S., Li, S. S., Liu, H. B., Sun, L., Zhou, Y. F., et al. (2010). Antidepressant-like effects of the active acidic polysaccharide portion of ginseng in mice. Journal of Ethnopharmacology, 132, 65-69.)，然而其抗抑郁的活性组分及分子机制尚未验证。本发明研究了人参果胶抗抑郁的活性及其分子生物学机制。
发明内容
[0005] 本发明提供一种人参果胶WGPA-A在抗抑郁样行为中的应用。
[0006] 本发明还提供一种人参果胶在制备抗抑郁样行为药物中的应用，所述抗抑郁样行为药物为以人参果胶酸性组分WGPA-A为有效药物成分或人参果胶酸性组分WGPA-A和其他具有同类功效的药物成分组成的复方形式。
[0008] 本发明还提供一种抗抑郁样行为的药物，所述的药物包含人参果胶酸性组分WGPA-A。
[0009] 本发明首先制备人参果胶WGPA，然后分离得到人参果胶的中性组分WGPA-N 和酸性组分WGPA-A。
[0010] 本发明预先给予BS小鼠不同剂量人参果胶WGPA-A，通过自主活动实验，高架十字迷宫、社会干扰实验及强迫游泳实验评价人参果胶抗抑郁的活性，通过Western Blotting 检测Wnt信号通路中的关键调节因子β-链蛋白（Beta-catenin）及脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白表达，以探讨其作用机制。
[0011] 结果显示人参果胶显著增加了小鼠社会干扰实验中的干扰时间、次数，降低了小鼠入侵时间、次数；增加了小鼠进入高架十字迷宫中敞开臂的时间率和次数率；降低了小鼠强迫游泳实验的固定不动时间，该行为学结果表明人参果胶WGPA-A具有抗抑郁活性。同时，上述行为学的改变伴随着小鼠海马组织Beta-catenin及BDNF的蛋白表达增加，其机制可能是通过诱导小鼠海马Beta-catenin及BDNF的蛋白表达上调，增强突触间递质的释放，影响神经元的可塑性和促进神经元的发育，从而发挥其抗抑郁的活性。
[0012] 本发明通过一系列实验证明了人参果胶酸性组分具有抗双向情感性精神障碍的活性。其生物学活性主要通过上调BDNF的蛋白表达，活化Wnt/β-catenin信号通路，促进β-catenin合成增加，进而促进神经元的存活，形态发生，突触的功能及增加神经元的可塑性，发挥抗双向情感性精神障碍的作用。
[0013] 啮齿动物的双向情感性精神障碍的行为学表象虽然很难评价，但通过行为学实验以及社会互动实验去验证小鼠对新奇环境的探索行为已经被证明是一种评价双向情感性精神障碍的有效方式，人参果胶酸性组分WGPA-A能够明显降低小鼠社会互动实验的入侵时间率、入侵次数率，显著增加小鼠社会互动实验的时间及次数，即人参果胶酸性组分显著增加了社会互动能力，同时减少了社会攻击行为。
[0014] 高架十字迷宫实验小鼠进入敞开臂的时间和次数可以用来评价小鼠的焦虑样行为及药物抗焦虑的药理学活性，人参果胶酸性组分WGPA-A能够显著增加小鼠高架十字迷宫实验中（敞开臂/敞开臂+密闭臂）时间率及次数率。小鼠进入敞开臂的时间和次数比进入密闭臂的时间和次数显著增加意味着药物逆转了小鼠焦虑样症状。
[0015] 此外，人参果胶酸性组分WGPA-A能够降低小鼠强迫游泳的固定时间，增加其游泳时间，提示人参果胶的酸性组分能够明显逆转双向情感性精神障碍的抑郁症状。且上述的行为学表现并未伴随小鼠开场行为的自主活动（无论是10min的测试还是60min的测试）改变，说明WGPA-A对上述行为学实验结果的影响并不是因为总体上改变了小鼠行为学基线，引起小鼠躁狂或是抑郁。
[0016] 本发明的有益效果：目前，抗抑郁症的药物绝大多数都是通过化学合成，长期应用，给机体带来许多毒副作用，因此，迫切要求找到具有抗抑郁功能且无毒副作用的天然产物，人参已经被证明能够调节下丘脑-垂体-肾上腺轴及单胺能系统而拮抗认知和焦虑功能障碍，因此，以天然产物-人参提取物拮抗抑郁症将具有广阔的应用前景。人参果胶WGPA包含两种组分，之前的研究已经证明WGPA具有抗抑郁活性，而未知具体是哪一种活性组分起作用，本发明确认人参果胶具体活性组分为人参果胶酸性组分WGPA-A。
[0017] 传统认为，人参对中枢神经系统的调节作用的活性成分是人参皂甙，因此，人参提取过程中，人参多糖往往作为残渣被大量丢弃，造成了很大的浪费，本发明通过系列实验证明了人参果胶酸性组分WGPA-A具有抗抑郁的活性。其生物学活性主要通过上调BDNF的蛋白表达，活化Wnt/Beta-catenin信号通路，促进β-链蛋白合成增加，增加神经元的可塑性，发挥抗抑郁的作用。这将为人参组分的充分利用，人参最大程度的开发提供重要的工作基础。附图说明
[0018] 图1：人参果胶酸性组分WGPA-A对小鼠在高架十字迷宫的测试结果；图A为小鼠高架十字迷宫实验中[敞开臂/ (敞开臂+密闭臂)] 时间率结果；图B为次数率结果，Post-hoc LSD test: *表示与生理盐水对照组相比具有显著性差异 (p<0.0001)。
[0019] 图2：人参果胶酸性组分WGPA-A对小鼠社会互动干扰时间（A）和干扰次数（B）的影响；*表示与生理盐水对照组相比有显著性差异（p<0.05）。
[0020] 图3：人参果胶酸性组分WGPA-A对小鼠社会互动实验（10分钟）内的入侵时间率及入侵次数率的影响；*表示与生理盐水对照组相比有显著性差异(p < 0.05)。
[0021] 图4：人参果胶酸性组分WGPA-A对小鼠强迫游泳实验的固定时间的影响；*表示与生理盐水对照组相比有显著性差异（p<0.002）。
[0022] 图5：给药后小鼠的BDNF及Beta-catenin的Western Blotting 蛋白印记结果，A为BDNF的印记结果，B为Beta-catenin的蛋白印记结果。
[0023] 图6：给药后小鼠的BDNF及Beta-catenin的蛋白表达百分比结果，A为BDNF的蛋白表达百分比结果，B为Beta-catenin的蛋白表达百分比结果；*表示与生理盐水对照组相比差别有显著性意义（p<0.05）。
具体实施方式
[0024] 实施例1：人参果胶的制备制备人参果胶WGPA：
提取分离过程如下：人参根（市售）经热水煮提，大孔树脂分出人参皂甙，剩余物醇沉得到粗多糖。粗多糖经过Sevag法脱蛋白和醇沉精制得到总多糖WGP（Water soluble ginseng polysaccharides）。WGP通过DEAE-Cellulose离子交换柱被分成淀粉样多糖WGPN（Starch-like glucans）和人参果胶WGPA（Ginseng pectin）。WGPA重新溶解在水中，采用DEAE-Cellulose离子交换柱进行分离，用NaCl水溶液（0 M、0.5 M）进行梯度洗脱，从而得到人参果胶的中性组分WGPA-N 和酸性组分WGPA-A。
提取分离过程如下：人参根（市售）经热水煮提，大孔树脂分出人参皂甙，剩余物醇沉得到粗多糖。粗多糖经过Sevag法脱蛋白和醇沉精制得到总多糖WGP（Water soluble ginseng polysaccharides）。WGP通过DEAE-Cellulose离子交换柱被分成淀粉样多糖WGPN（Starch-like glucans）和人参果胶WGPA（Ginseng pectin）。WGPA重新溶解在水中，采用DEAE-Cellulose离子交换柱进行分离，用NaCl水溶液（0 M、0.5 M）进行梯度洗脱，从而得到人参果胶的中性组分WGPA-N 和酸性组分WGPA-A。
[0025] 实施例2：行为学实验Black Swiss小鼠购自江苏大学，10-12周龄，分为三组，每组10只，对照组为生理盐水组，给药容积10 mL/kg；实验组为2组，人参果胶WGPA-A 100 mg/kg组和200 mg/kg组。
[0026] （1）开场自主活动实验给药后第8天，小鼠被放置于一个50 cm×25 cm×20 cm的透明自动活动监视器中（OptoM3, Columbus Instruments, Columbus, OH）。红外线监测每10 min记录1次，连续记录小鼠自主活动6次，共60 min，实验完成后，小鼠被送返饲养笼中，并用10%的酒精擦净监视器。
[0027] 开场自主活动实验结果见表1，无论在前10 min内还是在60 min内，WGPA-A并未影响小鼠的自主活动时间，即人参果胶并未影响小鼠行为学基线的改变。
[0028] 表1 WGPA对小鼠自主活动结果的影响结果用 表示N.S = No significance，没有显著性差异
（2）高架十字迷宫测试（EPM）
高架十字迷宫是木制的，高于地面60 cm的十字形状的迷宫，由四条臂组成，其中包含两条密闭的臂（24 cm）和两条敞开的臂（1 cm）。每条臂都是由30 cm×5 cm的区域及5 cm×5 cm的中心区共同组成。给药后第9天，小鼠首先被放置于迷宫的中心区，由迷宫上方的摄像机记录其行为活动5 min，然后根据摄像记录手动计数小鼠在敞开臂及密闭臂的时间及次数，只有当小鼠四肢全部进入臂中才被记录。进入臂中的时间及次数将用于统计学分析敞开臂时间/（敞开臂时间+密闭臂时间）；敞开臂次数/（敞开臂次数+密闭臂次数）。每只小鼠实验结束后都被送返其饲养笼，并用10%酒精擦净迷宫装置。与生理盐水组相比，WGPA-A 100 mg/kg 及WGPA –A 200 mg/kg显著增加了小鼠的进入敞开臂的时间率［F(2, 27) = 30.2, p < 0.0001］（见图1A）和次数率［F(2, 27) = 53.1, p < 0.0001］（见图1B）。
（2）高架十字迷宫测试（EPM）
高架十字迷宫是木制的，高于地面60 cm的十字形状的迷宫，由四条臂组成，其中包含两条密闭的臂（24 cm）和两条敞开的臂（1 cm）。每条臂都是由30 cm×5 cm的区域及5 cm×5 cm的中心区共同组成。给药后第9天，小鼠首先被放置于迷宫的中心区，由迷宫上方的摄像机记录其行为活动5 min，然后根据摄像记录手动计数小鼠在敞开臂及密闭臂的时间及次数，只有当小鼠四肢全部进入臂中才被记录。进入臂中的时间及次数将用于统计学分析敞开臂时间/（敞开臂时间+密闭臂时间）；敞开臂次数/（敞开臂次数+密闭臂次数）。每只小鼠实验结束后都被送返其饲养笼，并用10%酒精擦净迷宫装置。与生理盐水组相比，WGPA-A 100 mg/kg 及WGPA –A 200 mg/kg显著增加了小鼠的进入敞开臂的时间率［F(2, 27) = 30.2, p < 0.0001］（见图1A）和次数率［F(2, 27) = 53.1, p < 0.0001］（见图1B）。
[0029] 高架十字迷宫实验小鼠进入敞开臂的时间和次数可以用来评价小鼠的焦虑样行为及药物抗焦虑的药理学活性，人参果胶酸性组分WGPA-A能够显著增加小鼠高架十字迷宫实验中（敞开臂/敞开臂+密闭臂）时间率及次数率。小鼠进入敞开臂的时间和次数比进入密闭臂的时间和次数显著增加意味着药物逆转了小鼠焦虑样症状。
[0030] （3）社会干扰实验给药后第10天，小鼠从其饲养笼中，被配对转移进入一空的、不熟悉的测试笼中10 min，配对的小鼠应当为同一治疗组或生理盐水组，通过其上方的摄像机连续记录配对小鼠的行为活动10 min，然后根据摄像记录手动计数每只小鼠的攻击时间及社会干扰时间。攻击时间被定义为试图咬、实际咬、拳击、踢等行为。社会干扰时间被定义为另一种形式的身体接触，包括嗅、舔或身体的接触。小鼠之间没有进行相互接触将不被记录。入侵比率被定义为入侵时间/（入侵时间+社会干扰时间）。实验结束后，小鼠被送返回饲养笼中。
[0031] 结果WGPA-A 100 mg/kg 及WGPA-A 200 mg/kg均显著影响了社会干扰实验的结果。与生理盐水组相比，WGPA-A显著增加了小鼠的社会干扰时间［见图2A, F（2, 27）=13.4, p < 0.0001］和社会干扰次数［见图2B, F（2, 27）= 6.91, p = 0.004］。同时，WGPA-A显著降低了小鼠的入侵时间率和入侵次数率［见图3, 时间率: F（2, 27）=3.65, p=0.04; 次数率 F（2,27）=9.8, p < 0.001]。
[0032] 证明了人参果胶酸性组分WGPA-A能够明显降低小鼠社会互动实验的入侵时间率、入侵次数率（入侵行为/非入侵行为），显著增加小鼠社会互动实验的时间及次数，即人参果胶酸性组分显著增加了社会互动能力，同时减少了社会攻击行为。
[0033] （4）强迫游泳实验强迫游泳实验的实验过程按（Porsolt R.D., Bertin A., Jalfre M., et al (1978). "Behavioural despair" in rats and mice: strain differences and the effects of imipramine. Eur J Pharmacol 51(3): 291-294.）进行。BS小鼠于给药后第11天，被分别放入盛有水的塑料圆柱体25 cm（高）×10 cm（直径）中，圆柱体盛有23～25℃，10 cm高的水，小鼠被迫在塑料圆柱体中6 min，当小鼠在塑料圆柱体中停止挣扎，保持漂浮的状态（仅有微小的动作以保持头部露出水面）被认为是固定不动。总测试时间持续6 min，前2 min作为适应期，后4 min通过Enthovision 8.5自动分析软件记录下其游泳时间及固定不动时间。每只小鼠游泳完，都需要更换圆柱体中的水。结果WGPA-A 100 mg/kg和200 mg/kg均显著减少了强迫游泳实验的固定时间[F2, 27=8.64, p<0.002]（见图4）。
[0034] 试验证明，人参果胶酸性组分WGPA-A能够降低小鼠强迫游泳的固定时间，增加其游泳时间，提示人参果胶的酸性组分能够明显逆转双向情感性精神障碍的抑郁症状。
[0035] 实施例3：机制研究脑组织的准备: 给药第12天，小鼠于给药后1 h通过CO2麻醉过量处死，取其海马置于液氮中，转移至-80℃冰箱中。匀浆：脑组织样本加入9×体积 的50 mM KPO4缓冲液，
0.5% pH7.2的Triton-X-100和1×不含EDTA的蛋白酶抑制剂中，使用Barnant匀浆器匀浆，脑匀浆物于4℃，13,000 g 离心15 min，取上清储存在-80℃冰箱中，其蛋白浓度使用BCA蛋白分析试剂盒检测。
0.5% pH7.2的Triton-X-100和1×不含EDTA的蛋白酶抑制剂中，使用Barnant匀浆器匀浆，脑匀浆物于4℃，13,000 g 离心15 min，取上清储存在-80℃冰箱中，其蛋白浓度使用BCA蛋白分析试剂盒检测。
[0036] β-链蛋白 Western Blotting 分析：Beta-catenin上样量为1 μg /孔，上样至8%凝胶中，SDS-PAGE电泳（100 V，1 h），分离出的蛋白转移到PVDF膜中，5% 脱脂奶粉封闭1h，兔源Anti-beta catenin多克隆一抗孵育（1:5000, Abcam, Inc, Cambridge, ab32572）2h，Anti-rabbit IgG二抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, A0208）孵育1h，凝胶成像分析系统检测。鼠源Beta-tubulin一抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, AT819）孵育1 h，Anti-mouse IgG二抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, A0216）孵育1 h，凝胶成像分析系统进行检测。蛋白表达量使用Bio-Rad Quality One 分析软件进行统计。样本检测结果通过对照样本纠正（每个胶中都跑了同一对照样本），最后通过Beta-tubulin纠正，保证上样量的一致。
[0037] 脑源性神经营养因子Western Blotting 分析: BDNF上样量为5 μg /孔，上样至10%凝胶中，SDS-PAGE电泳（100 V，1 h），分离出的蛋白转移到PVDF膜中，5% 脱脂奶粉封闭1h，兔源Anti-BDNF多克隆一抗孵育（1:1000, Abcam, Inc, Cambridge, ab6201）2h，Anti-rabbit IgG二抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, A0208）孵育1h，凝胶成像分析系统检测。鼠源Beta-tubulin一抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, AT819）孵育1 h，Anti-mouse IgG二抗（1: 1000, Beyotime Biotechnology, A0216）孵育1 h，凝胶成像分析系统进行检测。蛋白表达量使用Bio-Rad Quality One 分析软件进行统计。样本检测结果通过对照样本纠正（每个胶中都跑了同一对照样本），最后通过Beta-tubulin纠正，保证上样量的一致。
[0038] 图5为给药后小鼠的BDNF及Beta-catenin的Western Blotting 印记结果，A为BDNF的印记结果，B为Beta-catenin的蛋白印记结果；图6为给药后小鼠的BDNF及Beta-catenin的蛋白表达百分比结果，A为BDNF的蛋白表达百分比结果，B为Beta-catenin的蛋白表达百分比结果；*表示与生理盐水对照组相比差别有显著性意义（p<0.05）。结果显示，WGPA-A显著增加了小鼠海马区的BDNF及Beta-catenin的蛋白表达百分比。
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