枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用
阅读：413发布：2020-05-14
专利汇可以提供枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开枸杞多糖在防治慢性应激和 创伤后应激障碍 的药物中的应用，其特征是：将提取的纯度≥50％的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。每粒含枸杞多糖500㎎，或制成片剂，每片含枸杞多糖500㎎。将提取的纯度≥50％的枸杞多糖与玉米 淀粉 混合均以，装入胶囊或制成片剂。每粒胶囊含枸杞多糖500㎎、含玉米淀粉100mg；或者每片含枸杞多糖500㎎、玉米淀粉100mg。本发明的有益效果：药物由枸杞多糖组成的单方制剂，具有抗应激作用，能够于 预防 和 治疗 慢性应激和或创伤后应激障碍，改善认知的功能，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。，下面是枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用专利的具体信息内容。
1.枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是：将提取的纯度> 50%的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是：将提取的枸杞多糖，装入胶囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片剂，每片含枸杞多糖500 mg。
3.枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是：将提取的纯度>50%的枸杞多糖与玉米淀粉混合均勻，装入胶囊或制成片剂。
4.根据权利要求3所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是：每粒胶囊含枸杞多糖500啤、含玉米淀粉IOOmg ；或者每片含枸杞多糖500 mg、玉米淀粉lOOmg。
枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应
用
技术领域
[0001] 本发明涉及枸杞提取物的新用途，具体涉枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用。
背景技术
[0002] 慢性应激障碍是指个体面对长期特殊环境变化而不能调整和稳定内稳态时所经历的持续的情感变化及心理压力。其致病机制在于：应激原刺激机体失稳态应激刺激持续或反复存在，则应激的效应累积形成稳态应变负荷，循环和组织中的应激相关神经内分泌介质和细胞因子持续升高，进而发展为稳态应变超负荷。由于大量神经内分泌介质和细胞因子的长期作用，导致各系统器官、组织和细胞功能异常。其中创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder, PTSD)是指由于生命受到威胁、遭遇悲剧导致的精神、躯体症状持续的临床综合征。1980年美国精神病协会《精神障碍统计诊断手册》 DSM-III(第三版）中确立了 PTSD的诊断标准。1993年PTSD正式纳入《国际疾病分类》 ICD-10(第十版）。随后1994年美国精神障碍诊断统计分类手册-第四版（DSM-IV)将 PTSD归在焦虑障碍中，并将其分为三种类型：急性（症状持续小于3个月）、慢性（症状至少持续3个月）、伴延迟起病（症状在应激后至少6个月才出现）。PTSD症状主要表现为对创伤事件的闯入性记忆为特征的病理性重现、对创伤相关线索的回避、持续性的高唤醒，以及对创伤经历的选择性遗忘和情感麻木，患者因此而感到痛苦不堪。PTSD症状一般在遭受创伤后数日甚至数月后出现，病程可长达数年。
[0003] 不同类型导致的创伤后应激障碍发病率不同，有调查发现在美国经历过创伤事件的普通人群有25%〜30%的人患有PTSD ；—些特殊创伤，如性暴力等，可以导致更高的发病率。在职业卫生领域，因突发事故造成的PTSD，也有较高的发病率。据美国精神病协会统计，美国PTSD的人群总患病率为1 %〜14%，平均为8%，个体终身患病危险性达3%〜5%， 女性约为男性的2倍。德国研究结果显示患病群体为1. 3%，而阿尔及利亚显示高达37. 4%。 而我国伍志刚、张本等分别对洞庭湖严重洪涝灾区成人和唐山大地震所致孤儿PTSD发病率调查情况显示为33. 89%和23%。2008年“5. 12”汶川地震极重灾区幸存者三个月后罹患失眠、梦魇、闪回等PTSD典型症状困扰的人约有18.4 %。PTSD以其发病率高，病程长，疗效差等严重影响创伤救治，是医学研究难点。PTSD的发生一方面给患者本身造成生理残疾， 患精神病或躯体疾病（如：心血管疾病、睡眠障碍、抑郁所致的自杀等）的危险性显著增加， 使患者的生存质量显著下降；另一方面因患者工作功能减退，给社会造成沉重的经济负担。
[0004] 目前关于PTSD的临床药物治疗多次采用苯二氮卓类（benzodiaz印ines，BZ)抗焦虑药、抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs)、单胺氧化酶抑制药、非典型抗精神病药、心境稳定剂和抗惊厥药、交感神经阻滞剂等，但是长期应用抗焦虑药易导致依赖，停药出现戒断反应，还损害认知功能；其它一些药物总是由于药物作用机制不同，不良反应多。中药在创伤后应激障碍治疗中的作用一直为医学工作者所关注。目前国内已经开展的研究包括：逍遥散加减、益智仁等都有不错的疗效。
[0005] 枸杞是中国传统的药食兼用的名贵中药材，其味甘、性平，具有补肝肾、益精血和明目的功能，近年来，一直受到临床和营养研究领域的高度重视。枸杞的药理和保健作用与其中含有的生物活性物质枸杞多糖有很大关系。现代科学研究表明，枸杞多糖具有调节机体免疫、清除氧自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用，具有广阔的开发应用前景。虽然在预防和治疗慢性应激以及创伤后应激障碍有良好的研究效果，但主要还是以复方制剂出现，未见有关药、食兼用的成分单独应用枸杞及其枸杞提取物一枸杞多糖成分预防和治疗应激的报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，该药物具有预防和治疗应激、改善认知的功能。
[0007] 本发明用枸杞的提取物一枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides)为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
[0008] 本发明所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是：将提取的纯度> 50%的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。
[0009] 进一步，将提取的枸杞多糖，装入胶囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片剂，每片含枸杞多糖500 mg。
[0010] 所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是： 将提取的纯度>50%的枸杞多糖与玉米淀粉混合均勻，装入胶囊或制成片剂。
[0011] 进一步，每粒胶囊含枸杞多糖500啤、含玉米淀粉IOOmg;或者每片含枸杞多糖500 mg、玉米淀粉lOOmg。
[0013] 图1是对照、应激、预防性LBP灌胃和治疗性LBP灌胃组大鼠拒俘反应与对照组比较图，（* P < 0. 05，** P < 0. 01 ；与应激组比较：# P < 0. 05，# # P < 0. 01)。
[0014] 图2是对照、应激、预防性LBP灌胃和治疗性LBP灌胃组大鼠应激后lw，2w, 4w僵立反应比较与对照组比较图，（* P < 0.05，* * P < 0.01 ；与应激组比较：# P < 0. 05, # #P < 0. 01)。 [0015] 图 3-1. 是应激后Iw水迷宫空间探索轨迹图。[0016] 图 3-2. 是应激后2w水迷宫空间探索轨迹图。[0017] 图 3-3. 是应激后^水迷宫空间探索轨迹图。[0018] 图 3-4. 是预防性LBP3d灌胃应激后Iw水迷宫空间探索轨迹图。[0019] 图 3-5. 是预防性LBP3d灌胃应激后2w水迷宫空间探索轨迹图。[0020] 图 3-6. 是预防性LBP3d灌胃应激后#水迷宫空间探索轨迹图。[0021] 图 3-7. 是应激后灌胃LBPlw水迷宫空间探索轨迹图。
4[0022] 图3-8.是应激后LBP2w水迷宫空间探索轨迹图。
4[0022] 图3-8.是应激后LBP2w水迷宫空间探索轨迹图。
[0023] 图3-9.是应激后LBP#水迷宫空间探索轨迹图。
[0025] 图4-2.是LBP预防灌胃对幽闭电刺激大鼠海马神经元各区形态学影响图（4w， HE、Nissl 和 Silver 染色)。
[0026] 图4-3. LBP治疗灌胃对幽闭电刺激大鼠海马神经元各区形态学影响图（½，HE、 Nissl 和 Silver 染色)。
[0027] 图4-4.是对照组、应激组、应激前LBP、应激后LBP组大鼠海马CAl的神经元密度图（均数士标准差，神经元/50 mm2)。
[0028] 图4-5.是对照组、应激组、应激前LBP、应激后LBP组大鼠海马CA3的神经元密度图（均数士标准差，神经元/50 mm2)。
[0029] 图4-6.对照组、应激组、应激前LBP，应激后LBP组大鼠海马DG的神经元密度图 (均数士标准差，神经元/50 mm2)。
[0030] 图5-1.是对照、应激、应激前LBP，应激后LBP组大鼠海马DG区BrdU阳性细胞数图（均数士标准差）。
[0031] 图5-2.激光共聚焦显微镜观察3d预防性低剂量灌胃大鼠应激后Iw海马DG区 BrdU阳性表达图（右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。
[0032] 图5-3.是激光共聚焦显微镜观察3d预防性低剂量灌胃大鼠应激后#海马DG区 BrdU阳性表达图（右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。
[0033] 图5-4.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后Iw海马DG区BrdU阳性表达图（右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。
[0034] 图5-5.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后2w海马DG区BrdU阳性表达图（右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)图.5-6.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后#海马DG区BrdU阳性表达图（右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色）。
具体实施方式
[0035] 实施例一：枸杞多糖的制备称取枸杞果肉干粉末100g，石油醚（60 — 90°C)回流脱脂二次，每次1 h。再用80% 乙醇回流提取2次，每次池，以除去单糖和低聚糖。将药渣加500ml水90 °C水浴提取二次，合并二次提取液。旋转薄膜蒸发仪上减压浓缩至150 ml，加少量活性炭脱色，过滤。滤液加5倍量95%乙醇，放置过夜，抽滤后的沉淀以100 ml水溶解重复醇沉一次。沉淀以 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，60 ！：干躁，即得枸杞多糖，纯度彡50%。过筛， 装胶囊，即得枸杞多糖胶囊；每粒胶囊含枸杞多糖500 mg ；或者制成片剂，每片含枸杞多糖 500啤，配加玉米淀粉lOOmg。
[0036] 除了采用上述方法提取外，也可以采用传统水提取法、快速酶提取法、超声波、微波辅助水以及超临界C02萃取等多种提取法，不同方法枸杞提取物均具有预防和治疗慢性应激障碍和或创伤后应激障碍得药效。[0037] 枸杞多糖也可参照CN 101029088A公开的“一种枸杞多糖的制备方法”制备，也可以直接购买市售产品，如：纯度> 50%的枸杞多糖，批号：20100409，陕西瑞康生物工程有限公司提供，临用时加生理盐水制成2 mg/ml,20 mg/ml浓度的药液供药理实验用。
[0038] 以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果。
[0040] 试药试剂：枸杞多糖，纯度> 50%，批号20100409，陕西瑞康生物工程有限公司生产； 氯化钠注射液，批号K090915，四川科伦药业股份有限公司生产； 戊巴比妥钠，丹麦进口分装；
多聚甲醛分析纯，批号20100501，成都市科龙化工试剂厂生产； 无水乙醇，批号20100509，重庆茂业化学试剂有限公司生产； 磷酸二氢钠，批号20091105，重庆川东化工集团有限公司生产； 磷酸氢二钠，批号90519，重庆博弈化学试剂有限公司生产； 蔗糖分析纯，批号20081113，成都市科龙化工试剂厂生产； 二甲苯，批号20090911，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产； 大鼠BrdU单克隆抗体，批号B2531，美国Sigma提供； BrdU，批号 118K4835，美国 Sigma 提供；
羊抗小鼠FITC，批号ZF-0312，进口分装中国中衫金桥公司提供。
多聚甲醛分析纯，批号20100501，成都市科龙化工试剂厂生产； 无水乙醇，批号20100509，重庆茂业化学试剂有限公司生产； 磷酸二氢钠，批号20091105，重庆川东化工集团有限公司生产； 磷酸氢二钠，批号90519，重庆博弈化学试剂有限公司生产； 蔗糖分析纯，批号20081113，成都市科龙化工试剂厂生产； 二甲苯，批号20090911，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产； 大鼠BrdU单克隆抗体，批号B2531，美国Sigma提供； BrdU，批号 118K4835，美国 Sigma 提供；
羊抗小鼠FITC，批号ZF-0312，进口分装中国中衫金桥公司提供。
[0041] 实验仪器：旷场测试系统（美国Smart公司），冰冻切片机（CM1900美国Leica)，激光共聚焦扫描系统（TCSSP2，德国Leica)，蜡块切片机（SM2000R，德国Leica)，台式低温离心机(美国 Sigma2-16k), YLS-17B穿梭箱（山东益研发展有限公司），高架十字迷宫(美国Smart公司）， 幽闭电击箱（自制)，水迷宫系统(中国中国医科院药物研究所）
实验例1 ：枸杞多糖对幽闭电击致PTSD大鼠一般状态、体重和拒付反应观察。
实验例1 ：枸杞多糖对幽闭电击致PTSD大鼠一般状态、体重和拒付反应观察。
[0042] SD大鼠72只，雄性，体重210士^g，实验分组为：对照组，18只；幽闭电击应激组， 18只；LBP低剂量预防组，18只；LBP高剂量治疗组，18只；对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激；
LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 ：00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；
LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg，每组18只，观察时间点为应激后lw，2w，#。
LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 ：00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；
LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg，每组18只，观察时间点为应激后lw，2w，#。
[0043] 拒俘反应：以动物从未接触过的手套抓大鼠，观察其反应。记分标准：0 ：很容易抓取动物；1 ：尖叫或者回避；2 ：尖叫并回避；3 ：逃脱；4 ：逃脱并尖叫；5 ：试图撕咬手套；6 ：主动跃起攻击。总分用于评价动物恐惧与冲突素质特征的改变。分别在应激前、应激后lw， 2w，#秤量大鼠体重，计算体重变化率。体重变化百分率=(应激后lw，2w，#体重一应激前体重）/应激前体重X 100%。进行双因素方差分析。
[0044] 实验结果参见图1 ：一般观察：与对照组大鼠相比，经幽闭+电刺激后大鼠出现行为异常，主要表现为行动迟缓，对外界刺激极少作出反应和易激怒；容易躁狂型（13只）。而预先灌胃低剂量组大鼠和高剂量灌胃组大鼠比较温顺和安静，配合研究人员的任何操作。
[0045] 体重改变：与对照组大鼠相比，幽闭电刺激大鼠的体重明显降低，随着时间降低， 应激后前2w体重降低最显著（P < 0.01)。低、高剂量灌胃组表现为体重持续增加，且高剂量灌胃组的体重增加幅度在应激后4周较低剂量组明显（P < 0. 05)拒俘反应改变：与对照组大鼠相比，幽闭电击组的拒付反应强烈，保持对陌生手套的竭力挣脱（评分为3分）或者为尖叫、逃脱（评分4分），且在应激最初2w时间内拒俘反应保持稳定，第4周，组间评分平均略有下降，仍维持高反应性。预先灌胃组则在应激后4周反应稳定，为1. 5士0. 55，高剂量灌胃组则在应激后Iw反应为尖叫或回避，到^时则为容易抓取或者轻微挣脱反应组间值为0. 33 士0. 52。
[0046] 枸杞多糖能够显著平静应激大鼠情绪，减少创伤后应激障碍/慢性应激的体重减少。
[0047] 实验例2 ：枸杞多糖对创伤后应激障碍闯入性记忆的影响。
[0048] 采用大鼠僵立行为检测。SD大鼠，雄性，体重；实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。
[0049] 对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 ：00灌胃，每次每只10 mg/kg,连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。闯入性记忆主要以僵立行为来体现，僵立行为测定：将经应激大鼠放入反射箱，测3分钟僵立行为。僵立行为的定义，是一种常见于啮齿类动物的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，可以有一定程度的摇摆。观察可见大鼠除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的行为方式。连续检测3min，僵立的时间占总时间的百分比即为僵立时间百分比。进行双因素方差分析。
[0050] 实验结果参见图2 ：在置身于幽闭电击箱时，对照组和PTSD组大鼠在僵立时间表现出明显差异。双因素方差分析表明PTSD组大鼠僵立行为持续的时间百分比最大（P < 0. 01)，预先低剂量灌胃组与PTSD组比较有僵立时间百分比明显下降，应激后Iw僵立时间百分比大于高剂量灌胃组，应激后2w没有差异，应激后#大于高剂量灌胃组。
[0051] 实验例3 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠的自由活动的影响。
[0052] 采用大鼠旷场行为检测。SD大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8:00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2wjw。用一 100 cm XlOO cm X 48 cm木制箱，底板有25个20cm X20 cm的方格，光照度为60 lux，设置屏障，操作室内隔音。观察者在行为实验室内用摄像系统记录动物在旷场木箱内5 min的行为表现，包括水平活动、直立次数、修饰次数、呆滞和排便量。其中水平行走、探究、呆滞和修饰行为通过摄像分析系统获得数据，每只动物的排便量是以旷场试验结束后排便的颗粒数来表示。
[0053] 实验结果：与对照组大鼠相比，幽闭电击大鼠的旷场行为随着时间改变明显，横向穿格、直立次数明显减少（P < 0.01)，修饰次数在应激后lw，2w明显减少，#无差异。与应激组相比，低剂量预防组，应激后lw，横向穿格没有差异，但是直立行为减少，梳洗行为增加(P < 0.05)。应激后2w横向运动和直立行为明显增加（P < 0 .01)，梳洗行为无差异，应激后4周时各项行为皆较应激组增加明显（P < 0.01)，旷场行为随应激时间延长行为表现下降但降低幅度低于应激组。高剂量灌胃组旷场行为增加明显，且在第4周与对照组仍有差异（P < 0.0¾。高剂量组各项行为皆高于低剂量灌胃预防组。枸杞多糖预防性剂量服用可显著减少应激对大鼠旷场行为的影响，治疗性服用效果较预防效果明显。（见表1) 表1.枸杞多糖对PTSD大鼠旷场实验的影响与对照组比较：* P < 0. 05，< 0.01 ；与应激组比较：#P < 0. 05，# # P < 0. 01
实验例4 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠情绪的影响。 [0054] 采用大鼠高架十字迷宫行为检测。SD大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8: 00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。实验室保持安静、光线适当，室温25°C左右，周围布以 2 m高黑色单调背景。测试于每天10: 00〜12: 00进行。在测试开始时，大鼠被放至迷宫的中间平台上，面对迷宫的同一个开放吊臂。试验开始前使动物适应试验环境，试验开始将动物置于迷宫中央头朝向封闭臂区，通过摄像监视器垂直监视记录其活动情况，每只动物测试5 min。中间用酒精湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一轮测试，以减少动物之间的相互干扰。实验指标以进入开放臂的百分数和在开放臂停留时间的百分数为主；开放臂和中央平台区向下探究次数则反映在非保护区内的探索行为，代表动物对陌生环境的好奇探究或因恐惧而寻求逃避，进入开放臂和封闭臂总次数反映动物运动能力。高架迷宫使动物同时产生探究的冲动与恐惧，造成“探究一回避”的冲突行为，能较好地反映动物的焦虑情绪。
实验例4 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠情绪的影响。 [0054] 采用大鼠高架十字迷宫行为检测。SD大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8: 00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。实验室保持安静、光线适当，室温25°C左右，周围布以 2 m高黑色单调背景。测试于每天10: 00〜12: 00进行。在测试开始时，大鼠被放至迷宫的中间平台上，面对迷宫的同一个开放吊臂。试验开始前使动物适应试验环境，试验开始将动物置于迷宫中央头朝向封闭臂区，通过摄像监视器垂直监视记录其活动情况，每只动物测试5 min。中间用酒精湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一轮测试，以减少动物之间的相互干扰。实验指标以进入开放臂的百分数和在开放臂停留时间的百分数为主；开放臂和中央平台区向下探究次数则反映在非保护区内的探索行为，代表动物对陌生环境的好奇探究或因恐惧而寻求逃避，进入开放臂和封闭臂总次数反映动物运动能力。高架迷宫使动物同时产生探究的冲动与恐惧，造成“探究一回避”的冲突行为，能较好地反映动物的焦虑情绪。
[0055] 实验结果：低剂量预防组较对照组大鼠进入开放臂的时间百分比明显减小（P < 0.05)，但与应激组比较进入开臂次数百分比高，（P < 0.01)。高剂量灌胃组大鼠进入开放臂的时间百分比表现为先降低，随后在加，#逐渐增大（P < 0.01)。在进入开放臂的次数百分比方面，高剂量灌胃组进入次数明显高于应激组（P < 0.01)，并且高于对照组（P < 0.05)。但是向下探头的次数明显减少，直立行为较应激组减少（P < 0.0¾ (见表2)。
[0056]表2.枸杞多糖对PTSD大鼠高架迷宫实验的影响
与对照组比较：* P < 0.05，* * P < 0.01;与应激组比较：# P < 0. 05，# # P < 0.01 实验例5 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠认知功能的影响。
与对照组比较：* P < 0.05，* * P < 0.01;与应激组比较：# P < 0. 05，# # P < 0.01 实验例5 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠认知功能的影响。
[0057] 采用大鼠穿梭箱行为检测。SD大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8:00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。穿梭箱底部铺以300 X 300 X 200 mm的不锈钢电栅，箱顶部装有蜂鸣器。训练时，将大鼠放在箱内任一侧，20 s后出现蜂鸣音，持续15 s，蜂鸣5 s 后由底部电栅给予电刺激（电流强度1 mA)，大鼠受到电刺激后逃到另一端，电击蜂鸣自动停止。记录动物在单独蜂鸣期间主动穿越小门逃避的时间和遭受电击的时间以及电击的次数。
[0058] 实验结果：如表3所示，与应激组相比，低剂量灌胃组，从主动回避成绩从应激后 Iw 52. 83%士41. 47%应激后物下降为6. 67% 士 12. 11%，下降幅度低于应激组（P < 0.05)， 但被动回避反应无差别。高剂量灌注组主动记忆成绩下降较应激组慢，在应激后Iw下降成绩低于低剂量组（P < 0.05见表幻。枸杞多糖的预防和治疗剂量可不同程度改善应激对大鼠认知功能的损害。
[0059] 表3.枸杞多糖对PTSD大鼠穿梭箱实验的影响与对照组比较：* P < 0. 05，** P < 0. 01 ；与应激组比较：# P < 0. 05，# # P < 0. 01 实验例6 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠空间记忆能力的影响。
[0060] 采用大鼠Morris水迷宫行为检测。SD大鼠，雄性，体重010士沈），实验分组为： 对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 :00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w, #。
[0061] 应用中国医学科学院药物研究所研制的Morris水迷宫由直径130 cm、高55 cm的铁皮圆形蓄水池及有机玻璃站台构成，水温保持在25°C。水池平均分为4个象限，站台位于某一个象限中央并可任意方向转动。圆池位于光线良好的实验室内，包括相对固定的迷宫外视觉线索。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。
[0062] 定位航行试验（place navigation test)：用于测试大鼠对水迷官学习与记忆的获取能力。在进行水迷宫实验前1 d，每只大鼠在无逃避平台的水迷宫池里自由游泳60 S, 排除有游泳能力缺陷大鼠。实验历时5 d，每天训练4次，每次间隔15 min。训练时实验者随机选择1个象限为入水点将大鼠放入水中，当大鼠爬到隐蔽平台上或到达60 s时即停止实验。大鼠爬上隐蔽平台后让其停留10 s;如果60 s内大鼠没有找到平台，则引导其爬到隐蔽平台上，并让其停留10 S。通过影像跟踪系统记录实验过程中大鼠的寻找平台潜伏其月(Escape latency, EL) EL0
[0063] 空间搜索实验（spatial probe test):用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的保持能力，即在最后1次训练后第2天撤除水下平台，然后任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，测定其120 s内在平台象限的游泳距离占总距离的百分比（Distance Percentage, DP)0
[0064] 实验结果参见图3 — 1至图3 — 9 ：与应激组比较，低剂量关注组大鼠寻找平台潜伏期延长，但短于应激组；高剂量灌注组的潜伏期较应激组明显短（P < 0.01表4)。在应激后1周平台潜伏期长于低剂量组，但在应激后2«，#平台潜伏期都较低剂量组和应激组缩短。枸杞多糖的预防和治疗剂量可不同程度改善应激对大鼠空间记忆和定位能力的损害。
[0065] 表4.枸杞多糖对创伤后应激大鼠水迷宫实验的影响与对照组比较：* P < 0. 05，** P < 0. 01 ；与应激组比较：# P < 0. 05，# # P < 0. 01 实验例7 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠海马病理形态学的影响。 [0066] 采用病理染色：HE，Nissl和Holems银染方法。SD大鼠，雄性，体重（210士26)，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8:00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/ kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。参见图4一1至图4一 6。
[0067] 苏木素-伊红（HE)和尼氏（Nissl)染色：上述各组动物在实验后经1 %戊巴比妥钠GO mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌注0.01 M PBS 200 ml，随后灌注4%多聚甲醛-PB液200ml (0. lmol/L，pH:7. 4)进行内固定，然后取出脑标本，放入4%的多聚甲醛液固定M h，充分水洗后过夜，行脱水、透明、石蜡包埋、冠状切片，每张脑片厚5 um〜10 um，行HE和Nissl染色，透明、封固。镜下观察海马形态学改变。 所有动物均在大致相同的海马结构断面上选取切片，依次每隔15张切片取1张，共5张，采用目镜网格细胞计数法，每张切片均分别于DG、CA3和CAl连续取5个视野，计神经细胞数， 用细胞数/50 mm2表示细胞密度。观察镜下尼氏体的改变情况。Holmes银染：同上区域固定、包埋、切片、烘干、浸银、还原、AgCl调色、定色、脱水、透明等步骤，每张切片厚为10 um。 评估细胞损伤半定量分析，评分标准为：0 ：正常，无损伤；1 ：损伤不可逆且少于10% ；2 ：不可逆损伤在20^-50^^3 ：不可逆损伤大于50%，同时对神经纤维进行定性处理。
[0068] 尼氏体观察：与对照组相比，应激组海马各区细胞排列整齐，胞体呈圆形或菱形，胞体膨胀，胞膜不完整，尼氏体有不同程度的浅染，有少量细胞尼氏体彻底消失。在2w 和#可见明显的尼氏体碎片（见图4-；3)。低剂量灌胃组组尼氏体在#时可见CA3区神经元淡染。但是在高剂量灌胃组见尼氏体改变很少，胞体规则，胞膜完整。
[0069] 银染观察所见：相对于对照组，海马神经元损伤较明显，损伤细胞占总体细胞的 11%，评分为1分，CA3区有神经纤维轴突断裂、变短，排列不整齐现象。低剂量灌胃预防组损伤细胞约在15%，评分为1，高剂量灌胃组损伤细胞约占8%，评分为1，纤维整齐，有轴突延长深入CA3区。
[0070] 实验结果：枸杞多糖的预防和治疗剂量可不同程度改善慢性应激获创伤后应激障碍大鼠的重要核团一海马神经元的病理学改变。
[0071] 实验例8 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠海马齿状回区细胞再生的影响。
[0072] 采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2' _deoxyuridine，BrdU)标记观察海马齿状回区再生细胞检测。SD大鼠，雄性，体重010士沈），实验分组为：对照组、幽闭电击应激、 LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8:00灌胃，每次每只 10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后 lw,2w,4w0
[0073] 幽闭电击结束后，腹腔内注射10 mg/ml BrdU溶液，剂量为100 mg/kg体重，2次/ 天，连续注射3天。最后一次注射BrdUM小时后，将大鼠用戊巴比妥钠（30 mg/kg)麻醉，仰卧位固定，用剪刀剪开腹部皮肤，提起剑突，顺胸骨两侧剪开肋骨并用止血钳钳夹暴露心脏。用眼科剪于心尖处剪开，将灌注管插入左心室直至主动脉，固定，剪开右心耳。通过灌注泵向主动脉内快速注入0. OlM PBS 200 ml〜250 ml，观察到右心耳流出的液体清亮， 改用4%多聚甲醛灌注，持续灌注40 min，观察到大鼠眼睛变白、尾巴变硬、肝脏变白、变硬即可。灌注后将灌注动物置于4度冰箱30 min，取脑并修取海马脑段，4度冰箱置于4%多聚甲醛溶液中固定8小时后，移入20%蔗糖溶液中过夜至脑组织下沉。自前因后后2. 3-5.2mm将包含整个DG在内的海马进行连续冠状冰冻切片，切片厚15 μ m，每6张取一张，每只动物取8〜10张用于BrdU染色。
[0074] BrdU免疫细胞化学染色：1) 冰冻切片，片厚15 μΐΉ，0. OlMPBS漂洗3*5min ；
2) 3%双氧水孵育37度下IOmin, 0. OlMPBS漂洗3*5min ；
3) 2 mol/L HCl 中 37 °C 孵育 0. 5 h ；
4) 0. OlM PBS 彻底漂洗 3*10 min ；
5) 胰蛋白酶消化37 0C 20 min ；
6) 0. OlM PBS 漂洗 3*5 min ；
7) 3 Ml/LTriton X — 100 10 min ；
8)滴加正常山羊血清封闭液37度孵育15 min，甩掉多余液体，不清洗；
9) 滴加BrdU的抗体（1 ：500)中37 °C孵育1 h，然后4 °C冰箱48h ；
10) 0. OlM PBS 漂洗 3X5min ；
11)滴加二抗中衫标记的羊抗小鼠FITCd ：50)避光；
12) 37 °C 孵育 1-2 h ；
13) 0. OlM PBS 漂洗 3X5min ；
14) DAPI核染色（DAPI为4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚）；
15) 0. OlM PBS 漂洗 3 min ；
16) DPX封片，激光共聚焦显微镜下扫描；
17)图像分析：采用Image PLUS软件，先在低倍IOX物镜下聚焦切片，圈出计数范围， 再切换到高倍200下，用软件随机生成的计数框计数BrdU阳性细胞（绿色荧光与DAPI核染重叠），计算整个DG区BrdU阳性细胞总数。另取一套切片按上法做空白对照。
2) 3%双氧水孵育37度下IOmin, 0. OlMPBS漂洗3*5min ；
3) 2 mol/L HCl 中 37 °C 孵育 0. 5 h ；
4) 0. OlM PBS 彻底漂洗 3*10 min ；
5) 胰蛋白酶消化37 0C 20 min ；
6) 0. OlM PBS 漂洗 3*5 min ；
7) 3 Ml/LTriton X — 100 10 min ；
8)滴加正常山羊血清封闭液37度孵育15 min，甩掉多余液体，不清洗；
9) 滴加BrdU的抗体（1 ：500)中37 °C孵育1 h，然后4 °C冰箱48h ；
10) 0. OlM PBS 漂洗 3X5min ；
11)滴加二抗中衫标记的羊抗小鼠FITCd ：50)避光；
12) 37 °C 孵育 1-2 h ；
13) 0. OlM PBS 漂洗 3X5min ；
14) DAPI核染色（DAPI为4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚）；
15) 0. OlM PBS 漂洗 3 min ；
16) DPX封片，激光共聚焦显微镜下扫描；
17)图像分析：采用Image PLUS软件，先在低倍IOX物镜下聚焦切片，圈出计数范围， 再切换到高倍200下，用软件随机生成的计数框计数BrdU阳性细胞（绿色荧光与DAPI核染重叠），计算整个DG区BrdU阳性细胞总数。另取一套切片按上法做空白对照。
[0075] 实验结论参见图5 — 1至图5 — 6 ：低剂量灌胃预防组在应激后lw，2w和4wDG区的BrdU阳性细胞较对照组明显下降，阳性细胞数目差别无统计学含义，表明细胞增殖损伤固定，与时间增长没有改变。高剂量灌胃组在应激后lw，细胞增殖受到抑制，但随着时间延长阳性细胞数目开始递增，（P < 0.05)，表明枸杞多糖可明显改善应激对大鼠海马齿状回区细胞再生减少。
[0076] 实验例9 ：枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠海马体积的影响。
[0077] 应用连续切片计算海马体积的方法。D大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为：对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8: 00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M 只，观察时间点为应激后lw，2w，#。
[0078] 在每组中选3个脑做海马（从前囟后1.40〜6. 70)连续切片尼氏染色，切片厚度为40 ym，根据大鼠脑图谱观察分析海马平面的立体形态。应用SPOT软件，按照 Cavalier' s原理勾画双侧海马轮廓，定标尺2 ‘瞧为309象素，进行统计。每组分析三个脑连续切片标本，每个标本平均分析180张脑片，来获取整个海马体积。
[0079] 实验结果：对应激组相比，低剂量灌胃预防组^后测量海马体积为63. 64士 1. 14 um3，与应激组无明显差异，而高剂量灌胃组则明显大于应激组（P < 0.05)，小于对照组（P16< 0.05)。
[0080] 综上所述：枸杞及其枸杞提取物枸杞多糖对幽闭电击所致创伤后应激障碍大鼠的一般情况、拒付反应、体重改变、旷场自由活动行为、高架十字迷宫的焦虑情绪、穿梭箱实验中的认知功能、水迷宫实验中的空间记忆和定位能力、HE，Nissl和Holmes染色所表现出的脑神经元数目、尼氏体形态以及神经纤维的病理学改变、海马齿状回区细胞再生以及海马体积的改变实验，得出枸杞及其提取物枸杞多糖可用于预防和治疗慢性应激和或创伤后应激障碍的治疗。本发明为传统药、食兼用的药材枸杞的应用提供了新用途，还为预防和治疗应激所致损伤的药品开发提供了新的、广泛的可利用资源。
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