肝素结合肽
阅读：69发布：2020-06-19
专利汇可以提供肝素结合肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新的肽 片段 ，它们能够刺激神经突向外生长、刺激细胞存活、刺激与记忆和学习有关的神经可塑性、和调控细胞运动性。所述肽片段的 生物 学活性与它们结合和活化Trk家族的神经营养蛋白受体的能 力 有关。本发明的肽片段包含结合和活化Trk家族的神经营养蛋白受体所必需的 氨 基酸基序。本发明还涉及包含所述化合物的药用组合物及其用于 预防 和/或 治疗 下述病症和/或 疾病 的应用，其中神经营养蛋白、Tkr受体和/或NCAM起重要作用，并且其中刺激神经突向外生长、细胞存活、与记忆和学习有关的神经可塑性、和/或调控细胞运动性对于治疗是有益的。，下面是肝素结合肽专利的具体信息内容。
1、由6到13个氨基酸残基组成的分离的连续肽序列，所述肽序列含 有氨基酸基序
G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L
其中
xa为任意氨基酸残基，
xb为I，T，M或E。
2、权利要求1的分离的连续肽序列，其中xa为碱性氨基酸残基。
3、权利要求1的分离的连续肽序列，其中xa为L。
4、权利要求1的分离的连续肽序列，其中xa为G。
5、权利要求1至4中任一项的分离的连续肽序列，所述肽序列通过结 构式(I)定义
x0-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x9-x9-x10-x11-X12-X13
其中
x0为K、R、N、A或键
x1为G，
x2为碱性或疏水氨基酸残基，
x3为E或D，
x4为V，
x5为疏水氨基酸残基，
x6为V或L，
x7为任意氨基酸残基，
x8为任意氨基酸残基，
x9为E、D、K或Q，
x10为V或L，
x11为任意氨基酸残基，
x12为疏水氨基酸残基或T，
x13为I、N、S、G、A或键。
6、权利要求5的分离的肽序列，其中x3为Q，N或T。
7、权利要求5的分离的肽序列，其中x5为T或E
8、权利要求5的分离的肽序列，其中x7和x8独立地选自K，R，N，I，L，G， E或A。
9、权利要求6、7或8的分离的肽序列，其中x7为L。
10、权利要求5、7和9的分离的肽序列，其中x8为G。
11、权利要求5、7和9的分离的肽序列，其中x8为E。
12、权利要求5的分离的肽序列，其中x11为R，K，L，N或P。
13、权利要求5的分离的肽序列，其中x12为疏水氨基酸残基且选自F， V，I，T或A
14、权利要求1或5的分离的连续肽序列，其中所述肽序列通过结构 式(II)定义
x0-G-x2-D/E-V-I-L-x7-x8-x9-V-x11-x12-x13
其中
x0为选自K、R、A或N的氨基酸残基，
x2为选自R或L的氨基酸残基，
x7为选自K、A、N或L的氨基酸残基，
x8为选自K、N或L的氨基酸残基，
x9为选自D或Q的氨基酸残基，
x11为选自R或L的氨基酸残基，
x12为选自V或F的氨基酸残基，
x13为选自I、L或V的氨基酸残基。
15、权利要求1或5的分离的连续肽序列，所述肽序列通过结构(III) 定义
x0-G-x2-x3-V-x5-V-L-G/E-x9-V/L-x10-x11-x12-x13
其中
x0，x2，x3，x5，x9，x10如权利要求5中所定义，
x11为N、K或P，
x12为I、T、A或V，和
x13为S、A、N或G。
16、权利要求15的分离的肽序列，其中x3为Q。
17、权利要求5或15的分离的肽序列，其中x11为R，N，P或L。
18、权利要求5或15的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列含有权利 要求1所定义的氨基酸序列基序。
19、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 KGRDVILKKDVRFI(SEQ ID NO：1)
20、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列化合物，其中所述氨基酸序 列为KGRDVILAKDVRVI(SEQ ID NO：2)。
21、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 KGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：3)。
22、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 KGRDVILNNQVRFI(SEQ ID NO：4)。
23、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 AGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：5)。
24、权利要求1，2，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 NGRDVILKKDVLFI(SEQ ID NO：6)。
25、权利要求1，3，5或14的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列为 NGLDVILIIDVRFI(SEQ ID NO：7)。
26、权利要求1，2，5，9，10或15的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列 为KGKEVMVLGEVNIN(SEQ ID NO：8)。
27、权利要求1，2，5，6，7，9，10或15的分离的肽序列，其中所述氨基酸序 列为RGHQVTVLGEIKTG(SEQ ID NO：9)。
28、前述权利要求1，2，5，7，9，10或15的肽，其中所述氨基酸序列为 RGREVEVLGEVPAA(SEQ ID NO：10)。
29、前述权利要求1，4，5，6，7，9，11或15的肽，其中所述氨基酸序列为 SGGTVTVLEKVPVS(SEQ ID NO：11)。
30、权利要求1的分离的肽序列，其中所述肽序列为选自SEQ ID NOS： 1-10的任一项序列的片段、变体或同源物，所述片段、变体或同源物含有 权利要求1所定义的基序。
31、前述权利要求1-30中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能 够结合Trk家族受体的神经营养蛋白受体，其包含Trk A、Trk B和Trk C。
32、权利要求31的分离的肽序列，其中所述受体为Trk A或Trk B。
33、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够刺激神经元细胞分化。
34、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够刺激神经突向外生长。
35、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够刺激神经元细胞存活。
36、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够调控细胞运动性。
37、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够抑制细胞运动性。
38、前述权利要求1至31中任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列 能够刺激与学习和/或记忆有关的神经可塑性。
39、权利要求19的分离的肽序列，其中所述肽序列为神经细胞粘附分 子(NCAM)的肽片段。
40、权利要求26的分离的肽序列，其中所述肽序列为神经生长因子 (NGF)的肽片段。
41、权利要求27的分离的肽序列，其中所述肽序列为神经营养蛋白-3 (NT-3)的肽片段。
42、权利要求28的分离的肽序列，其中所述肽为神经营养蛋白-4/5 (NT-4/5)的肽片段。
43、权利要求29的分离的肽序列，其中所述肽为脑衍生的神经营养因 子(BDNF)的肽片段。
44、化合物，其含有权利要求1-43中任一项的分离的肽序列。
45、权利要求44的化合物，其中所述肽序列被制成由单拷贝的单独肽 序列组成的单体。
46、权利要求44的化合物，其中所述肽序列被制成由两个或更多拷贝 的单独肽序列组成的多聚体，例如单独肽序列的二聚体或四聚体。
47、权利要求46的化合物，其中所述多聚体为两个或更多单独肽序列 的树状体。
48、权利要求46的化合物，其中所述多聚体为含有两个相同肽序列的 二聚体。
49、权利要求46的化合物，其中所述多聚体为含有两个不同肽序列的 二聚体。
50、权利要求1-43中任一项的单独肽序列或权利要求44-49中任一项 的化合物在生产药物中的应用。
51、权利要求50的应用，其中所述药物是用于治疗病症或疾病，其中 刺激神经细胞分化，神经细胞存活，神经细胞可塑性，刺激学习和/或记忆， 调控细胞运动性或调控Trk家族受体的神经营养蛋白受体的活性是所述治 疗的一部分。
52、权利要求51的应用，其中所述病症或疾病是中枢和外周神经系统 的病症或疾病。
53、权利要求50的应用，其中所述病症或疾病选自手术后的神经损伤、 创伤性神经损伤、神经纤维的髓鞘形成受损、缺血后损伤，例如中风后的、 与糖尿病有关的神经退化、影响生物钟或神经肌肉传导的病症。
54、权利要求50的应用，其中所述药物是用于治疗选自如下病症或疾 病的药物：肌肉病症或疾病，包括神经肌肉连接功能受损的病症，例如器 官移植后的、或例如遗传性或创伤性肌肉萎缩疾病。
55、权利要求50的应用，其中所述药物是用于治疗与新血管发生、组 织重新塑造和/或细胞运动性增加有关的病症的药物。
56、权利要求55的应用，其中所述疾病为癌症。
57、权利要求56的应用，其中所述癌症为涉及新血管发生的任意癌症。
58、权利要求56的应用，其中所述癌症为神经系统的癌症。
59、权利要求51的应用，其中所述病症或疾病为学习能力的减弱和/ 或记忆的减退。
60、权利要求51或59的应用，其中所述病症或疾病为帕金森氏病、 阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病或痴呆，例如多梗塞性痴呆。
61、权利要求51的应用，其中所述病症或疾病为精神疾病，例如思想 和/或情绪障碍、神经精神障碍包括双极神经精神障碍(BPD)、遗传相关单 极情感障碍、妄想性障碍、妄想痴呆、偏执型精神病、精神分裂症、分裂 型障碍、情感分裂性精神障碍、情感分裂性两极和遗传相关单极情感障碍、 精神性精神病、紧张症、周期性两极和遗传相关单极情感障碍、循环性精 神病、分裂样人格障碍、偏执型人格障碍、两极和遗传相关单极情感障碍 相关的情感障碍以及单极情感障碍的各个亚型。
62、权利要求50的应用，其中所述药物是用于与由于酒精消耗引起的 身体损伤有关的病症或疾病的治疗。
63、权利要求50的应用，其中所述药物是用于朊病毒疾病的治疗。
64、含有按照权利要求1-43任一项的单独的肽序列或按照权利要求 44-49任一项的化合物的药物。
65、含有有效量的权利要求64的药物的药用组合物。
66、治疗的方法，其包括给药至有此需要个体有效量的权利要求1-43 的任一项的肽序列、权利要求44-49的任一项的化合物、权利要求64的药 物和/或权利要求65的药用组合物。
67、刺激神经细胞分化、神经细胞存活、神经细胞可塑性和/或调节细 胞运动性的方法，所述方法包括使用权利要求1-43的任一项的单独的肽序 列、权利要求44-49的任一项的化合物、权利要求64的药物或权利要求65 的药用组合物。
68、权利要求1至33的任一项的肽序列在抗体的制备中的应用。
69、能够识别和结合至含有权利要求1所述基序的抗原决定簇的抗体。
70、含有权利要求69的抗体的药用组合物。
发明领域
本发明涉及新的肽化合物，它们能够刺激神经突向外生长、细胞存活、 与记忆和学习有关的神经可塑性、和调控细胞运动性。本发明的化合物能 够结合和活化Trk家族的神经营养蛋白受体。本发明还涉及包含所述化合物 的药用组合物及其用于治疗下述病症的应用，其中刺激神经突向外生长、 神经元细胞存活、与记忆和学习有关的神经可塑性、和/或调控细胞运动性 是有益的。
发明背景
免疫球蛋白超家族的细胞粘着分子(CAM)在早期发育期间和在成体 中在关键位点使成群细胞成核(nucleate)和保持。除了它们的粘着特性， CAM同嗜性和异嗜性相互作用能影响胞内信号。因此它们影响发育事件， 包括细胞迁移、增殖和分化的能力可能由它们的粘着特性及它们的信号特 性两者产生。然而，聚积事件也表明细胞最好还是分开的，相互独立的使 用与不同生理活动有关的CAM的粘着和信号特性。
神经细胞粘着分子NCAM是首个被发现的神经CAM。自发现以来， NCAM已经被透彻的研究并且现在已经被很好的表征(Ronn等人(2000)Int J Dev Neurosci 18：193-9)。NCAM属于免疫球蛋白(Ig)超家族。其胞外部 分由五个Ig样和两个纤连蛋白III型(F3)组件组成。NCAM帮助细胞-细 胞和细胞-基质两种相互作用。NCAM结合各种胞外基质组分，诸如肝素/ 硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、硫酸软骨素蛋白聚糖和不同类型的胶原。 细胞-细胞相互作用通常由NCAM同嗜性相互作用辅助。据显示NCAM的 不同组件行使不同的功能。因此，NCAM同嗜性结合现在被认为依赖于前 三个Ig组件。肝素结合序列位于Ig2组件。NCAM也结合神经细胞粘着分 子L1。此相互作用被认为发生在NCAM的第四个Ig组件和L1上所表达的 低聚甘露糖苷部分之间。据显示NCAM的两个近膜F3组件涉及成纤维细 胞生长因子受体(FGFR)结合。
已经鉴定了NCAM上涉及不同蛋白质相互作用的许多结合位点，并且 包含不同结合位点序列的许多NCAM序列短片段被提议作为生物学活性化 合物用于治疗性应用(Berezin v.，Bock E.(2004)J Mol Neurosci.22(1-2)： 33-39)。许多这些NCAM肽片段源自同嗜性NCAM结合位点，并因此能用 于刺激表达NCAM的细胞。
FGFR是已经详细描述的NCAM的异嗜性结合伴侣之一。因此，NCAM 被认为是FGFR的一类新的假定可选配体的成员，而且最近获得了NCAM 和受体之间直接相互作用的证据(Kiselyov等人(2003)Structure(Camb)11： 691-701)。具有涉及NCAM和FGFR之间直接相互作用的序列 EVYVVAENQQGKSKA(FGL肽)的已鉴定NCAM片段最近被提议作为治 疗下述多种病理紊乱的新候选化合物，其中刺激FGFR活性可能起关键作 用(WO03/016351)。有趣的是，据显示导致刺激神经突向外生长的同嗜性 NCAM相互作用也部分涉及FGFR的刺激(Soroka等人(2002)J Biol Chem. 277(27)：24676-83)。
另一类被描述为NCAM配体/受体的分子是硫酸乙酰肝素和硫酸软骨 素蛋白聚糖(分别为HSPG和CSPG)(Cole等人(1985)J Cell Biol.100(4)： 1192-9；Cole等人(1986)Nature 320：445-7；Cole，G.J.，Akeson，R.(1989) Neuron2(2)：1157-65)。多种HSPG和CSPG能与脑中影响细胞粘着的NCAM 相互作用。因此，在细胞表面上表达的NCAM具有结合HSPG聚集蛋白从 而介导细胞粘着的能力(Storms等人(1996)Cell Adhes Commun.3(6)： 497-509)，并且据显示脑特异性CSPG神经聚糖与NCAM结合从而抑制其 同嗜性相互作用及后续神经元粘着(Retzler等人(1996)J Biol Chem. 271(44)：27304-10)。在用作细胞生长基质时，据显示包含源自NCAM，在 Ig2 NCAM组件中鉴定的推定肝素结合域(HBD)之氨基酸序列的不同合成 肽促进NCAM表达细胞的粘着，并且能够调节神经突向外生长的刺激(Cole， G.J.，Akeson，R.(1989)Neuron 2(2)：1157-65；Kallapur S.G.，Akeson R.J. (1992)J Neurosci Res.33(4)：538-48)。最近，源自NCAM HBD域，涵盖 NCAM的氨基酸残基152-165的14个氨基酸的序列(SwissProt P13596)被 提议作为纤维蛋白3D基质凝胶的融合组分以增强掺入该凝胶的神经元的 神经突向外生长(US2003/0119186)。包含残基149-166的另一种NCAM HBD片段被提议作为NCAM介导的粘着的抑制剂(US6,333,307)，然而后 一种片段的生物学活性并没有被证明。
包含序列IWKHKGRDVILKKDVRFI的NCAM的HBD含有两组碱性 氨基酸，其被证明对于NCAM结合肝素的能力以及对于NCAM同嗜性粘着 是至关重要的。已显示这些碱性氨基酸残基的突变影响该结构域的生物学 活性(Kallapur S.G.，Akeson R.J.(1992)J Neurosci Res.33(4)：538-48；Cole，G. J.，Akeson，R.(1989)Neuron 2(2)：1157-65)。
发明概述
根据本发明：
1)NCAM肝素结合域(HBD)的肽片段，其对应于包含NCAM的氨 基酸残基154-167的序列(SwissProt P13596)，在本文中称为肝素结合肽 (HBP)，具有很高的神经突发生活性(neuritogenic activity)；
2)HBP突变体，其中已知对于肽的生物学活性重要的碱性氨基酸残基 被其它氨基酸残基替代，也能够与HBP的未突变序列同样程度的刺激神经 突向外生长；
3)HBP和HBP突变体的神经突发生活性不依赖于i)NCAM-NCAM 结合，ii)FGFR-NCAM结合，和iii)HSPG-或GSPG-NCAM结合；
4)本发明的肽片段能够调控细胞运动性；
5)本发明的肽片段是既作为细胞生长基质的固定组分又作为细胞生长 培养基的可溶组分的活性化合物；
6)本发明的肽片段包含在神经营养蛋白中发现的氨基酸基序；
7)本发明的肽片段能够结合Trk家族的神经营养蛋白受体。
因此，本发明的一个方面涉及肽，其为6到13个氨基酸残基的分离连 续序列，所述序列包含氨基酸基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L
其中
xa为任意氨基酸残基，
xb为I、T、M或E。
包含依照本发明上述基序的分离的肽序列能够i)结合Trk家族受体的 神经营养蛋白受体；ii)刺激神经突向外生长；iii)调控细胞运动性；iv) 刺激神经细胞存活；v)刺激神经细胞分化；和/或vi)刺激与学习和记忆有 关的神经可塑性。
因此，本发明的另一方面涉及使用本发明的肽序列和/或包含所述序列 的化合物来制备用于治疗下述病症或疾病的药物，其中i)刺激神经突向外 生长；ii)调控细胞运动性；iii)刺激神经细胞存活；iv)刺激神经细胞分 化；v)刺激神经可塑性；vi)调控Trk家族的神经营养蛋白受体的活性是 所述治疗的一部分。
还有，在另一方面，本发明的肽序列或包含所述序列的化合物可用于 生产抗体。
本发明还涉及包含本发明的肽序列的化合物以及包含所述肽序列和/或 所述化合物的药用组合物。包含能够识别包含本发明基序的表位的抗体的 药用组合物也在本发明范围内。
本发明还涉及治疗下述病症的方法，其中刺激神经突向外生长、调控 细胞运动性、刺激神经细胞存活、刺激神经细胞分化、刺激神经可塑性、 和/或调控Trk家族受体的神经营养蛋白受体的活性是有益的，所述方法包 括对有所需要的个体施用本发明的肽序列、本发明的化合物、本发明的抗 体或包含所述肽序列、所述化合物或所述抗体的药用组合物的步骤。
附图说明
图1显示了表达NCAM的成纤维细胞与不表达NCAM的对照成纤维细 胞相比明显促进大鼠小脑粒状神经元(cerebella granular neuron)(CGN)的神 经突向外生长，而且HBP(SEQ ID NO：1)以剂量依赖性方式增加在表达 NCAM的成纤维细胞上以及在不表达NCAM的成纤维细胞上生长的CGN 的神经突向外生长。相反，肽M不影响在表达NCAM的成纤维细胞上生长 的CGN的神经突向外生长应答，但它仍然刺激在不表达NCAM的成纤维 细胞上生长的CGN的神经突向外生长。
图2表明了用SU5402，一种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的抑 制剂，进行处理没有阻断HBP(SEQ ID NO：1)对在不表达NCAM的单层 成纤维细胞上生长的CGN的神经突发生效果，而且仅仅部分抑制在表达 NCAM的成纤维细胞单层上生长的CGN的NCAM介导神经突向外生长， 但是在不存在HBP的情况下SU5402阻断NCAM介导的神经突向外生长。
图3表明了在存在或不存在肝素酶III的情况下，HBP(SEQ ID NO：1) 和M肽(SEQ ID NO：2)对单个CGN的影响，已知该酶主要将硫酸乙酰肝 素特异性裂解为二糖。
图4表明了在存在和不存在肝素酶III的情况下，肽HBP(SEQ ID NO： 1)、M(SEQ ID NO：2)、Mln(SEQ ID NO：3)和M3n(SEQ ID NO：4)的 神经突发生效果。
图5表明了用HBP(SEQ ID NO：1)和M肽(SEQ ID NO：2)处理表 达NCAM的成纤维细胞和不表达NCAM的对照成纤维细胞都导致对细胞 运动性的明显抑制，其反映为细胞的扩散速率(R)、平均细胞速度(Sτ) 和运动指数(LI)的显著降低。
图6显示了NCAM HBD的不同肽片段的分析结果。
图7表明了HBP(SEQ ID NO：1)(A)和NCAM的重组Ig2组件(B) 与重组的Trk B受体的结合。
发明详述
1、肽序列
本发明的第一个方面涉及由6到13个氨基酸残基组成的分离的连续肽 序列，其含有氨基酸基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L
其中
xa为任意氨基酸残基，
xb为I、T、M或E。
在一个实施方案中，xa可以为碱性氨基酸残基。一些优选的实施方案涉 及xa为K，其它优选的实施方案涉及xa为R，并且还有其它优选的实施方 案涉及xa为H。
在另一个实施方案中xa可以为L，并且还有另一个实施方案中xa可以 为G。
因此，本发明涉及至少6个氨基酸的肽序列，其互相连续(contiguous) 并且含有上述基序，所述肽序列为分离的肽序列。这表明本发明涉及作为 单独的化学个体存在并且作为单独的化学个体用于本发明的目的的肽序 列。本发明不涉及下列含有本发明基序的肽序列，该肽序列1)为14个或 更多氨基酸残基的分离的肽序列，例如US2003/0119186的双结构域肽 (bi-domain peptides)，如含有共同融合在序列 LNEQVSPKHKGRDVILKKDVR中的抗凝血酶III的肽片段和NCAM HBD 片段的双结构域肽；2)为天然或重组多肽的完整序列，例如如神经细胞 粘附分子(NCAM)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营 养蛋白-4/5(NT-4/5)或脑衍生的神经营养因子(BDNF)的超过14个氨基酸长 的多肽或片段，3)为任何类型3D结构的完整部分，例如纤维蛋白或胶原 蛋白凝胶。
更具体地，本发明涉及可以通过结构式(I)定义的分离的连续肽序列
x0-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x9-x9-x10-x11-x12-x13
其中
x0为K、R、N、A或键
x1为G，
x2为碱性或疏水氨基酸残基，
x3为E或D，
x4为V，
x5为疏水氨基酸残基，
x6为V或L，
x7为任意氨基酸残基，
x8为任意氨基酸残基，
x9为E、D、K或Q，
x10为V或L，
x11为任意氨基酸残基，
x12为疏水氨基酸残基或T，
x13为I、N、S、G、A或键。
在一些实施方案中残基x0可以为选自K、R、N、A的氨基酸残基。在 其它实施方案中符合该结构式的分离的肽序列可以不具有残基x0。在这种 情况下序列的第一个残基为x1。当所述序列为下述化合物的一部分时，x0 可以为键。
根据一个优选的实施方案，x3可以选自Q、N或T。根据另一个优选的 实施方案，x5可以选自T或E。其它优选的实施方案涉及其中x7和x8独立 地选自K、R、N、I、L、G、E或A的肽序列。在一些优选的实施方案中 x7为L，在其它优选的实施方案中x8可以为G或E。不同的优选实施方案 可以涉及其中x11选自R、K、L、N或P并且x12为选自F、V、I、T或A 的疏水氨基酸残基的序列。x13可以选自氨基酸残基I、N、S、G或A，或 者当所述序列为下述化合物的一部分时可以为键。当x0和/或x13为键时也 存在一些优选的实施方案。
此外，一些本发明的优选实施方案涉及可以通过结构式(II)定义的序 列
x0-G-x2-D/E-V-I-L-x7-x8-x9-V-x11-x12-x13
其中
x0为选自K、R、A或N的氨基酸残基，
x2为选自R或L的氨基酸残基，
x7为选自K、A、N或L的氨基酸残基，
x8为选自K、N或L的氨基酸残基，
x9为选自D或Q的氨基酸残基，
x11为选自R或L的氨基酸残基，
x12为选自V或F的氨基酸残基，
x13为选自I、L或V的氨基酸残基。
本发明其它的优选实施方案可以涉及可以通过结构式(III)定义的序 列
x0-G-x2-x3-V-x5-V-L-G/E-x9-V/L-x10-x11-x12-x13
其中
x0，x2，x3，x5，x9，x10如上述结构式(I)所定义
x11为N、K或P，
x12为I、T、A或V，和
x13为S、A、N或G。
不同的优选实施方案可以包含其中x3为Q并且x11选自R、N、P或L 的序列。
独立于上述不同的实施方案，符合结构式I、II和III的肽序列都含有 本发明的基序。在肽序列中存在确定的结构，例如特定的氨基酸基序，经 常是一组不同肽序列的共同的生物学活性的必要条件。根据本发明，上述 基序是本发明序列的生物学活性所必需的。
本发明在此确定了一组含有上述基序的肽序列，其相应于结构式I、II 或III，并且在此证明了这些序列的共同的生物学活性，其与序列的所述共 有的结构特征(基序)有关。该组由下列序列组成：
KGRDVILKKDVRFI(SEQ ID NO：1)，
KGRDVILAKDVRVI(SEQ ID NO：2)，
KGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：3)，
KGRDVILNNQVRFI(SEQ ID NO：4)，
AGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：5)，
NGRDVILKKDVLFI(SEQ ID NO：6)，
NGLDVILIIDVRFI(SEQ ID NO：7)，
KGKEVMVLGEVNIN(SEQ ID NO：8)，
RGHQVTVLGEIKTG(SEQ ID NO：9)，
RGREVEVLGEVPAA(SEQ ID NO：10)和
SGGTVTVLEKVPVS(SEQ ID NO：11)。
可以理解上面所列的序列表示所述序列的非限制性实例，其含有本发 明的基序和/或结构式II或结构式III的基序并具有至少一个与所述肽序列 的结构中存在的基序有关的共同生物学活性。与上述结构特征有关的生物 学活性可以选自但不限于刺激细胞分化、记忆和学习、神经细胞存活、活 化神经营养蛋白受体或调控细胞运动性的能力。
含有基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L，其中xa为任意氨基酸残基，xb为I、 T、M或E的本发明的分离的肽序列含有6到13个氨基酸残基。然而，如 果所述序列符合上述结构式I、II或III，它可以为14个氨基酸残基的序列， 例如如序列SEQ ID NOs.1-11。本发明还包括符合结构式I-III的序列的片 段，特别是SEQ ID NOs：1-11的序列的片段，和含有所述片段的6-13个氨 基酸残基长的任意肽序列。因此，本发明的片段可以为12、11、10、9、8、 7或6个氨基酸残基长。含有上述定义的任意结构式基序的片段是本发明的 优选片段。但是，一些实施方案可以更优选的涉及含有结构式II基序 G-x2-D/E-V-I-L的片段，其中x2为R或L，然而其它实施方案可以更优选的 涉及含有结构式III基序V-L-G/E-x9-V/L的片段，其中x9为E、D、K或Q。
本发明还涉及上述序列的变体和同源物(homologue)，其具有所述序列 的至少某些生物学活性。优选地，该变体和同源物含有上述氨基酸基序， 即
i)本发明的基序：G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L，其中xa为任意氨基酸残基， 且xb为I、T、M或E，
ii)结构式II的基序：G-x2-D/E-V-I-L，其中x2为R或L，或者
iii)结构式III的基序：V-L-G/E-x9-V/L，其中X9为E、D、K或Q。
在本申请中，应用氨基酸残基的标准单字母代码和标准三字母代码。 氨基酸的缩写与Biochemical Nomenclature Eur.J.Biochem，1984，vol.184，pp 9-37上IUPAC-IUB Joint Commission中的建议一致。在说明书和权利要求书 中，使用三字母代码或单字母代码。当没有特别说明L或D形式时，应理 解所指的氨基酸具有天然的L形式，cf.Pure&Appl.Chem.Vol.(56(5)pp 595-624(1984)或D形式，因此形成的肽可以由L形、D形的氨基酸或混合 L形和D形的序列构成。
当没有特别说明时，应当理解本发明的肽的C端氨基酸是作为游离的 羧酸存在，这也可以表示为“-OH”。然而，本发明化合物的C端氨基酸可以 为酰胺化衍生物，其表示为“-NH2”。当没有其它规定时，多肽的N端氨基 酸含有游离的氨基，这也可以表示为“H-”。
当没有其它特别说明时，氨基酸可以选自任意氨基酸，无论是否为天 然的，例如α氨基酸、β氨基酸和/或γ氨基酸。因此，该组包括但不限于： Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu， Lys，Arg，His Aib，Nal，Sar，Orn，赖氨酸类似物，DAP，DAPA和4Hyp。
同样，根据本发明可以进行化合物/肽的修饰，例如氨基酸的糖基化和/ 或乙酰化。
根据本发明的碱性氨基酸残基意指氨基酸Arg、Lys和His的残基，酸 性氨基酸残基-氨基酸Glu和Asp的残基，疏水氨基酸残基-氨基酸Leu、Ile、 Val、Phe、Trp、Tyr和Ala的残基，带电的氨基酸残基-氨基酸Arg、Lys、 Glu和Asp的残基。
如上所示，本发明涉及上述肽序列的片段、变体和同源物。在本文的 上下文中
i)片段为具有符合结构式I、II或III定义序列的序列或选自序列SEQ ID NOs：1-11的序列的至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优 选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％长度的 序列；
ii)变体为与结构式I、II或III定义的序列或选自序列SEQ ID NOs： 1-11的序列具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至 少90％，更优选95％同一性的氨基酸序列，或者为与结构式I、II或III定 义的序列或选自SEQ ID NOs：1-11的序列相比具有至少60％，更优选至少 70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选95％正氨基酸匹配(positive amino acid matehes)的氨基酸序列。本文中定义正氨基酸匹配为通过在两个 进行比较的序列中相同位置的氨基酸的物理和/或化学性质定义的同一性或 相似性。本发明优选的正氨基酸匹配为K对R，E对D，L对M，Q对E， I对V，I对L，A对S，Y对W，K对Q，S对T，N对S和Q对R。定义 一个氨基酸序列与另一个氨基酸的同源性为两个进行比较的序列中相同的 氨基酸的百分比。可以使用公知的算法，例如BLOSUM30，BLOSUM40， BLOSUM45，BLOSUM50，BLOSUM55，BLOSUM60，BLOSUM62， BLOSUM65，BLOSUM70，BLOSUM75，BLOSUM80，BLOSUM85或 BLOSUM90计算序列的同源性；
iii)同源物为与结构式I、II或II定义的序列或选自SEQ ID NOs：1-11 的序列具有低于60％但高于30％，如50-59％，例如55％，如40-49％，例 如45％，如30-39％，例如35％同源性的氨基酸序列。
推测上述片段、变体或同源物保留了原始序列的至少某些生物学活性， 如刺激神经可塑性的能力，例如与神经细胞分化有关和/或与记忆和学习有 关的神经可塑性的能力、刺激细胞存活的能力，例如抑制凋亡的能力、活 化神经营养蛋白受体的能力，例如活化Trk受体的能力、调控细胞运动性的 能力，例如抑制细胞运动性的能力。
根据本发明，上述含有本发明基序和/或结构式II或结构式III基序的序 列源自SwissProt Acc.No：P13596的神经细胞粘附分子(NCAM)的序列， 例如来自NCAM的Ig2组件的序列。该序列的一个例子可以为序列 KGRDVILKKDVRFI，其在本文中被定义为SEQ ID N0：1。该序列为NCAM 的Ig组件的肝素结合区域的一部分。在另一个实施方案中，序列可以源自 神经营养蛋白，如神经生长因子(NGF)，例如来自SwissProt Acc.No： NP_02497所示的NGF多肽的序列、神经蛋白-3(NT-3)，例如来自SwissProt Acc.No：NP_002518所示的NT-3多肽的序列、神经蛋白-4/5(NT-4/5)，例 如来自SwissProt Acc.No：AAAV38176所示的NT-4/5多肽的序列、或脑衍 生的神经营养因子(BDNF)，例如来自SwissProt Acc.No：NP_733928所示 的BDNF多肽的序列。根据本发明，序列KGKEVMVLGEVNIN(SEQ ID NO： 8)源自上述NGF多肽，序列RGHQVTVLGEIKTG(SEQ ID NO：9)源自上述 NT-3多肽，序列RGREVEVLGEVPAA(SEQ ID NO：10)源自上述NT-4/5多 肽，序列SGGTVTVLEKVPVS(SEQ ID NO：11)源自上述BDNF多肽。
根据本发明，上述分离的肽序列可以被制成化合物，
化合物可以含有单拷贝的选自上述任一的单独的氨基酸序列，或者它 可以含有两个或更多拷贝的该氨基酸序列。这表明本发明的化合物可以被 制成肽序列的单体，例如含有单个单独的肽序列，或者它可以被制成肽序 列的多聚体，即含有两个或更多单独的肽序列，其中所述单独的肽序列表 市两个或更多拷贝的相同序列或两个或更多不同的单独肽序列。多聚体也 可以含有全长序列和一个或多个其片段的组合。在一个实施方案中，化合 物可以含有两个氨基酸序列，本文中定义该化合物为二聚体，在另一个实 施方案中，化合物可以含有超过两个氨基酸序列，例如三个、四个或更多 序列。本发明优选涉及含有两个或四个本发明肽序列的化合物。但是，含 有3、5、6、7、8或更多序列的化合物也在本发明的范围内。
制成二聚体或多聚体的肽片段可以具有相同的氨基酸序列，或者它们 具有不同的氨基酸序列。一个该化合物的实例可以为含有SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2的化合物。另一个实例可以为含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的化合物。依据本发明的不同实施方案可以制备本发明序列的任意其 它组合。所述序列可以通过肽键相互连接；或者通过连接分子或基团 (grouping)相互连接。在另一个实施例中，化合物可以含有序列的两个或 更多相同的拷贝，例如选自SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10和11的序列 的两个拷贝，其中所述两个序列可以通过连接分子或基团相互连接。优选 所述序列通过连接基团连接的化合物。该连接基团的一个实例可以为非手 性二、三或四羧酸。本发明的说明书中进一步详细讨论了合适的非手性二、 三或四羧酸和生产该化合物的方法(配体呈递组装方法(LPA))。可能的连 接体的另一个实例可以为氨基酸赖氨酸。单独的肽序列可以被连接到核心 分子如赖氨酸从而形成单独的肽序列的树状多聚体(树状体(dendrimer))。 树状体的制备是本领域公知的(PCT/US90/02039，Lu等人，(1991)Mol Immunol.28：623-630；Defoort等人，(1992)Int J Pept Prot Res.40：214-221； Drijfhout等人(1991)Int J Pept Prot Res.37：27-32)，并且现在树状体被广泛 的应用于研究和医疗应用中。本发明优选的实施方案为提供含有连接到赖 氨酸核心分子的四个单独氨基酸序列的树状化合物。还优选四个单独氨基 酸序列的至少一个含有上面定义的结构式的氨基酸序列。甚至更优选树状 化合物的全部四个单独氨基酸序列独立地含有上面定义的结构式的氨基酸 序列。
本发明的多聚体化合物，例如LPA二聚体或赖氨酸树状体是本发明的 优选化合物。但是，依据实施方案可以优选其它类型的含有两个或更多本 发明单独序列的多聚体化合物。
含有一个或更多拷贝的本发明的单独序列或其片段、变体或同源物， 以及另一生物学活性化合物，例如另一肽序列的多聚体化合物也在本发明 的范围内。在这些化合物中，最优选的那些含有至少一个本发明的肽序列， 并且进一步含有其它任意具有刺激Trk家族的神经营养蛋白受体能力的化 学个体，例如所述化学个体可以为源自Trk受体配体或Trk受体活化蛋白的 肽序列，其中该序列不同于本发明的序列。
2、生物学活性
本发明的肽序列和包含本发明序列的化合物具有生物学活性。本发明 优选涉及选自下组的生物学活性：刺激与神经细胞分化有关的神经可塑性， 诸如例如刺激神经突向外生长，和/或与记忆和学习有关的神经可塑性，诸 如例如刺激突触效力的能力，刺激细胞存活，诸如例如抑制凋亡的能力， 活化神经营养蛋白受体，诸如例如活化Trk受体的能力，和调控细胞运动性， 诸如例如抑制细胞运动性的能力。
因而，在一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合选自TrkA、Trk B和Trk C的神经营养蛋白受体。在一个优选的实施方案中，受体可以为 Trk A；在另一个优选的实施方案中，受体可以为Trk B；在又一个优选的实 施方案中，受体可以为Trk C。
本发明的作者鉴定了既存在于神经营养蛋白(NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF)中又存在于NCAM中的氨基酸基序，并且将该基序的存在与本发 明肽片段的生物学活性联系起来。依照本发明的基序是本发明的肽序列与 Trk受体，特别是与Trk B的结合所必需的。Trk受体是神经系统中驱动神 经细胞分化的主要受体。Trk受体对于促进神经元存活也是重要的，并且涉 及与学习和记忆有关的神经可塑性，特别是Trk B受体。本发明肽序列结合 和活化受体的能力适于调控依赖于受体活性的生物学应答。因此，本发明 提供了调控Trk家族的神经营养蛋白受体的活性的方法，其包括使用本发明 的分离的肽序列或包含所述序列的化合物。在优选的实施方案中，本发明 涉及活化Trk家族的神经营养蛋白受体的方法。
本发明的分离的肽序列能够刺激神经元细胞分化。术语“神经元分化” 应理解为既为神经前体细胞或神经干细胞的分化，又为神经元的分化，诸 如已分化神经元的成熟。该分化的实例可以是从未成熟神经元的神经突向 外生长、神经突的分枝、神经元再生。在一个优选的实施方案中，本发明 可涉及刺激神经前体/干细胞或未成熟神经元的分化；在另一个优选的实施 方案中，本发明可涉及刺激从成熟神经元，例如受损但存活的神经元的神 经突向外生长。因而，本发明还提供了刺激神经元细胞分化的方法，其包 括使用本发明的肽序列或包含所述序列的化合物。
本发明的一个最优选实施方案涉及与学习和记忆有关的肽序列的活 性。具体而言，在本发明的一个实施方案中，肽序列可刺激棘(突)形成(spine formation)；在另一个实施方案中，序列可促进突触效力。因而，本发明还 提供了刺激记忆和/或学习的方法，其包括使用本发明的肽序列和/或包含所 述序列的化合物。本发明既涉及短期记忆又涉及长期记忆。
本发明的肽序列还可刺激神经元细胞存活。本发明涉及刺激具有损伤 和变性疾病的神经元细胞存活的能力。因此，本发明提供了通过使用本发 明的肽序列和/或包含所述序列的化合物来刺激细胞存活，优选神经元细胞 存活的方法。
在又一个实施方案中，本发明的肽序列可调控细胞运动性。术语“调控 细胞运动性”既包括刺激又包括抑制细胞运动性。优选导致抑制细胞运动性 的肽序列的活性。因而，通过使用本发明的肽序列或包含所述序列的化合 物来调控细胞运动性，特别是抑制细胞运动性的方法也在本发明提供的调 控细胞和生理活动的方法之中。
本发明的肽序列和包含它们的化合物有作为细胞生长培养基的可溶/流 动物质和作为细胞生长培养基的固定物质的生物学活性。在一些实施方案 中，可优选使用肽物质或包含它们的化合物作为细胞基质。但是，最优选 可溶性肽序列或包含它们的化合物。
本申请中描述了本发明的肽序列和包含它们的化合物的生物学活性的 非限制性实例(见下述及实施例2、3和5)。
刺激神经突向外生长
具有潜力促进神经突向外生长和刺激神经元细胞再生和/或分化的物 质，诸如某些内源营养因子，是搜寻促进例如神经元再生和其它形式神经 元可塑性的化合物中的首要目标。为了评估现有化合物的潜力，可以调查 刺激神经突向外生长相关信号、干扰细胞粘着、刺激神经突向外生长、神 经再生的能力。据显示本发明的化合物促进神经突向外生长，并因此被认 为是神经元连接再生及由此损伤后功能修复的优良促进物，以及需要该效 果的其它病症中神经元功能的促进物。
在本文中，“分化”涉及神经元成熟和神经突延伸的过程，其发生在所述 神经元最后的细胞分裂之后。本发明的化合物可能能够终止神经细胞分裂 和开始所述细胞的成熟，诸如开始神经突的延伸。另外，“分化”涉及神经元 前体细胞、未成熟神经细胞或胚胎干细胞中导致具有正常神经元细胞功能 特征的细胞形成的遗传学、生物化学、形态学和生理学转化过程的开始， 所述特征如本领域所定义的。本发明将“未成熟神经细胞”定义为具有至少一 项本领域中接受作为神经细胞典型特征的特征的细胞。
依照本发明，包含至少一种上述肽序列的化合物能够刺激神经突向外 生长。本发明涉及神经突向外生长的改善/刺激，诸如在对照/未刺激细胞的 神经突向外生长值上约75％的改善/刺激，例如50％，诸如约150％，例如 100％，诸如约250％，例如200％，诸如约350％，例如300％，诸如约450％， 例如400％，诸如约500％。
候选化合物刺激神经突向外生长的能力的评估可以通过使用任何已知 的用于评估神经突向外生长的方法或测定法来进行，诸如例如本申请实施 例2中所描述的。
依照本发明，化合物在作为细胞生长基质的不溶性固定组分和作为细 胞生长培养基的可溶性组分时都具有神经突发生活性。在本文中，“固定的” 表示化合物结合/粘附于在水或水溶液中不可溶的物质上，从而它在该溶液 中也成为不可溶的。对于药物应用，不可溶和可溶的化合物都可以在应用 中被考虑，然而可溶性化合物是优选的。“可溶性化合物”理解为在水或水溶 液中可溶的化合物。
细胞运动性的抑制
细胞迁移是神经系统的发育、创伤愈合和肿瘤侵袭期间所必需的。神 经系统的正确形成和正常功能都需要多数神经元贯穿发育中的神经系统从 它们的原始位点迁移至它们的最终位置。
一些类型的细胞在成熟生物体中也保持了移动的能力，但是其它的类 型失去了它。在一些极端的情况中，诸如在疾病或损伤中，细胞移动的能 力可规定疾病的救助或死亡的开始，例如伤口愈合或癌细胞侵袭和转移。 因此，具有潜力调控细胞运动性的物质，诸如某些内源营养因子是搜寻例 如促进损伤恢复、防止癌细胞散播或抑制炎症扩散的化合物中的首要目标。 为了评估现有化合物的潜力，可以调查调控涉及细胞运动性的信号、干扰 细胞粘着、刺激或抑制细胞运动性的能力。本发明的化合物能够抑制细胞 运动性，因此被认为是抑制例如癌细胞侵袭和散播以及在需要该抑制的病 症中抑制任何类型的细胞侵袭的优良候选化合物。
依照本发明，包含至少一种上述序列的化合物能够抑制细胞运动性。 本发明涉及细胞运动性的抑制，在与对照细胞运动性相比时估计其为约 75％，例如约50％，诸如150％，例如约100％，诸如约250％，例如约200％， 诸如约350％，例如约300％，诸如约450％，例如约400％，诸如例如约500％。 术语“运动性”在本文中定义为在一定时间段中细胞从其所在的地方向另一 个地方的转移，而且在本申请中将细胞运动性估算为对应于细胞起始和最 终位置的两点之间的欧几里德距离。在考虑细胞运动性和化合物抑制潜力 的量化时，诸如上文提及的抑制或运动的“值”，本发明涉及定义为诸如细胞 的扩散速率(R)、平均细胞速度(Sτ)和运动指数(LI)等参数的“值”。在 后的参数在本领域中常用于量化细胞运动性，由例如Walmod等人(2001) Methods Mol Biol.161：59-83记载，并在下面详细描述。
细胞运动性的分析可通过使用本领域为该目的开发的任何可用的方法 和测定法来进行。例如可以如本申请实施例3中所述进行。
3、肽序列的制备
优选合成制备本发明的化合物。但是也设想了重组制备该化合物。
重组制备
因此，在一个实施方案中，本发明的肽序列可以通过使用重组DNA技 术进行制备。
编码肽或肽所来源的相应全长蛋白质的DNA序列可以通过已经建立的 标准方法，以合成方式制备，例如Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1869描述的磷脒(phosphoamidine)法或Matthes等，1984， EMBO J 3：801-805描述的方法。依照磷脒法，在例如自动DNA合成仪中 合成寡核苷酸，并将其纯化、退火、连接并克隆至合适的载体中。
编码肽的DNA序列也可以通过使用DNA酶I依照标准方案(Sambrook 等人，Molecular cloning：A Laboratory manual，2rd ed.，CSHL Press，Cold Sprin Harbor，NY，1989)对编码肽所来源的相应全长蛋白质的DNA序列进行片段 化来制备。本发明涉及选自上文鉴定的蛋白质的全长蛋白质。或者，编码 本发明全长蛋白质的DNA可以使用特异的限制性内切酶进行片段化。使用 Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory manual，2rd ed，CSHL Press， Cold Spring Harbor，NY，1989描述的标准方案，进一步纯化DNA片段。
编码全长蛋白质的DNA序列也可以是基因组或cDNA来源的，例如通 过制备基因组或cDNA文库并通过使用合成寡核苷酸探针依据标准技术(参 见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2rd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)进行杂交以筛选编码全长蛋白质的全部或部分DNA序 列而获得。也可以使用特异引物通过聚合酶链式反应来制备DNA序列，例 如US4,683,202或Saiki等人，1988，Science 239：487-491中所述。
然后将DNA序列插入重组表达载体，它可以是可以方便的进行重组 DNA流程的任何载体。载体的选择常常取决于其将要引入的宿主细胞。因 此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在且其复制独立 于染色体复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是在引入宿主细胞后整 合到宿主细胞基因组中并与其所整入的染色体一起复制的载体。
在载体中，编码肽或全长蛋白质的DNA序列应可操作连接合适的启动 子序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 其可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码 DNA序列在哺乳动物细胞中转录的合适启动子的实例是SV40启动子 (Subramani等人，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因) 启动子(Palmiter等人，1983，Science 222：809-814)或2型腺病毒主要晚期 启动子。适于在昆虫细胞中使用的启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan 等人，1992，FEBS Lett.311：7-11)。适于在酵母宿主细胞中使用的启动子包 括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，1980，J Biol.Chem.255： 12073-12080；Alber and Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1：419-434)或醇脱 氢酶基因(Young等人，1982，在《Genetic Engineering of Microorganism for Chemicals》中，Hollaender等人编，Plenum Press，纽约)的启动子，或者TPI1 (US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等人，1983，Nature 304：652-654)启 动子。适于在丝状真菌宿主细胞中使用的启动子是例如ADH3启动子 (McKnight等人，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
编码DNA序列也可以可操作连接合适的终止子，诸如人生长激素终止 子(Palmiter等人，前述引文)或者(对于真菌宿主)TPI1(Alber and Kawasaki， 前述引文)或ADH3(McKnight等人，前述引文)终止子。载体还可以包 含诸如多聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或5型腺病毒Elb区)、转录增 强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA 的翻译增强子序列)等元件。
重组表达载体还可以包含使载体能够在所考虑的宿主细胞中复制的 DNA序列。该序列的例子(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复 制起点。载体还可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因， 诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或者赋予药物例如新霉素、潮 霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
用于将编码肽或全长蛋白质的DNA序列与启动子和终止子分别连接起 来的方法，以及用于将它们插入含有复制所需信息的合适载体中的方法是 本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等人，前述引文)。
为了获得本发明的重组肽，有用的是，可以将编码DNA序列与编码第 二种肽的序列和编码蛋白酶切割位点的序列融合，产生编码融合蛋白的 DNA构建物，其中编码蛋白酶切割位点的序列位于HBP片段和编码第二种 肽的DNA之间，并插入重组表达载体中，在重组宿主细胞中表达。在一个 实施方案中，所述第二种肽选自但不限于谷胱苷肽-S-还原酶、小牛胸腺素、 细菌硫氧还蛋白或人泛素的天然或合成变体、或者其肽。在另一个实施方 案中，包含蛋白酶切割位点的肽序列可以是具有氨基酸序列IEGR的因子 Xa的切割位点、具有氨基酸序列DDDDK的肠激酶的切割位点、具有氨基 酸序列LVPR/GS的凝血酶的切割位点、或具有氨基酸序列XKX的水解无色 杆菌(Achromobacter lyticus)的切割位点。
表达载体所引入的宿主细胞可以是能够表达肽或全长蛋白质的任何细 胞，并且优选真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞， 例如光滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和 哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系的例子是HEK293(ATCC CRL-1573)、COS(ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632，ATCC CCL-10) 或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞和表达引入这些细胞 的DNA序列的方法描述于例如Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159，1982， pp.601-621；Southern and Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter 等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等人，1978，Cell 14： 725；Corsaro and Pearson，1981，在《Somatic Cell Genetics 7》中，p.603； Graham and van der Eb，1973，Virol.52：456；及Neumann等人，1982， EMBO J.1：841-845。
或者，可以使用真菌细胞(包括酵母细胞)作为宿主细胞。合适的酵 母细胞的例子包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces spp.)物种的细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。其它真菌细胞的例子是丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)或脉孢霉(Neurospora spp.)物种，特别是米曲霉(Aspergillus oryzae) 或黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。曲霉属物种在蛋白质表达中的应用描述 于例如EP238023。
用于培养细胞的培养基可以是适于哺乳动物细胞生长的任何常规培养 基，诸如含有适当补充物的含血清或无血清培养基，或者是适于昆虫、酵 母或真菌细胞生长的培养基。合适的培养基可以从供应商处获得，或者可 以根据已经公布的配方(例如美国典型培养物保藏中心的目录)制备。
通过细胞重组产生的肽或全长蛋白质然后可以从培养基中利用常规流 程回收，包括通过离心或过滤从培养中分离宿主细胞，利用盐例如硫酸铵 沉淀上清液或滤出液中的蛋白质性质成分，通过各种层析流程例如HPLC、 离子交换层析、亲和层析等纯化。
各肽序列的合成制备
肽的合成制备方法是本领域熟知的。关于制备合成肽的详细描述和实 践意见可以参见《Synthetic Peptides：A User’s Guide(Advances in Molecular Biology)》，Grant G.A.编，Oxford University Press，2002，或者在 《Pharmaceutical Formulation：Development of Peptides and Proteins》中， Frokjaer and Hovgaard编，Taylor and Francis，1999。
肽可以例如通过使用Fmoc化学以及Acm保护的半胱氨酸来合成。通 过反相HPLC纯化后，可以进一步加工肽以获得例如环状或C或N端修饰 的异构体。用于环化和末端修饰的方法是本领域熟知的，详细描述在上文 引用的手册中。
在一个优选的实施方案中，本发明的个别肽序列通过合成方式，特别 是通过上述手册中描述的序列辅助的肽合成(SAPS)方法来制备。
另外，本发明个别肽序列的合成可以从制造商，诸如例如Sigma-Genosys (USA)处定购和购买。
各肽序列多聚体的LPA法制备
LPA方法公开于WO00/18791。该方法基本上包括下列步骤：
(a)通过固相合成或片段偶联提供包含预期序列的肽片段，该肽片段附着 于固相上；
(b)如必要的话，将任何N端氨基去保护，整个肽片段仍然附着在固相上；
(c)使具有去保护N端基团的肽片段与非手性二、三或四羧酸反应，以提 供具有环结构的构建物，并
(d)从固相上切下构建物，以提供包含具有游离C端基团的肽片段的LPA。
在上述方法中，在步骤(d)前可以进行下列步骤：
(c1)如果存在，将源自步骤(c)中所使用的羧酸的任何N-受保护基团去保护，
(c2)继续固相合成或片段偶联，以提供包含预期序列的肽片段，其具有至 少一个N-受保护N端氨基酸基团和/或附着化学部分，和
(c3)如果存在，将任何N端氨基去保护(在步骤(d)之前或之后)。
该方法还提供了以N到C取向呈现本发明预期序列的LPA(步骤(c))。 同时还有C到N取向的序列(步骤(c2))
因此，为了获得本发明的化合物，将依靠非手性二、三或四羧酸装配 附着到固相上的两种肽链。适合在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立的为1到20的整数，X为HN，A和B独立的为取代或未 取代的C1-10烷基、取代或未取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取 代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构 成取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳 香族部分。
在另一个实施方案中，适合在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为H2N(CR2)pCR或RHN(CR2)pCR， 其中p为0或1到20的整数，其中每个R为H、取代或未取代的C1-10烷基、 取代或未取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环 部分、取代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的 环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
在又一个实施方案中，适于在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素 -(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、 RCO(CR2)pCR，或[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，其中p为0或1 到20的整数，每个R独立的为H或取代或未取代的C1-10烷基、取代或未 取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取 代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的环部分、 取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
在又一个实施方案中，适于在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、 HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、 RCO(CR2)p，或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p，其中p为0或1到20的 整数，每个R独立的为H或取代或未取代的C1-10烷基、取代或未取代的 C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未 取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的环部分、取代或 未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
术语C1-10烷基表示具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙 基、异丙基、丁基和叔丁基。
术语C2-10烯基表示具有2-10个碳原子的直链或支链烯基，如乙炔基 (ethynyl)、丙烯基、异丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
术语环部分表示有环己烷和环戊烷。
术语芳香族部分表示有苯基。
措词“A和B构成环、杂环或芳香族部分”表示有环己烷、哌啶、苯和 吡啶。
通过与羧酸反应，获得X(CO-序列)2-固相类型的构建物，其中X如上 定义。
术语“序列”在当前内容中表示包含天然存在的和/或非天然存在的氨基 酸、PNA序列或肽模拟物(peptidomimetic)的肽。“天然存在的氨基酸”表 示在自然界中发现的20种L-和D-型氨基酸。非天然存在的氨基酸为例如 经过修饰的天然存在氨基酸。术语序列还意图包括一种或多种这样的序列。 合适的肽模拟物的实例记载于Marshall G.R.，(1993)Tetrahedron 49： 3547-3558。术语“化学部分”表示增强LPA的溶解性或生物学活性的实体， 和指导LPA至其靶的实体或标记物。序列的优选实施方案如上所述。
基团X直接或间接的允许同一序列、或者一种或多种不同序列和/或部 分的继续逐步合成或片段偶联。LPA中肽片段的取向(N到C或C到N) 根据需要定义。在一个实施方案中，本发明以N到C的取向作为LPA的特 征；在另一个实施方案中，它涉及序列同时存在N到C和C到N表现的化 合物；在又一实施方案中，序列具有C到N的取向。
在X包含暂时受保护氨基功能的情况下，可以在保护后直接进行合成 或偶联。使用半当量羧酸能确保提供环系统有效形成(步骤(c)中，参见上 述)的所有含羧基基团的适当活化。在三或四羧酸的情况下，活化的羧基 可以进一步用二胺诸如乙二胺或适当功能化的胺衍生化，以与诸如巯基、 氢氧基、氧(oxo)或羧基基团进一步反应。在二胺的情况下，肽合成或片段 偶联可以直接根据所需序列或化学部分继续。在一个优选的实施方案中， 使用Fmoc保护策略，但是根据合成或偶联策略可以使用任何氨基保护基 团。例子有Boc保护基团策略。
由于连续逐步合成或片段偶联是用一个或在双功能化学部分诸如赖氨 酸的情况下用两个氨基酸基团进行的，惊奇的发现与通过MAP合成获得的 常规四聚赖氨酸树状体(dendimer)相比能获得更好的结果。此外，最佳肽 合成流程或偶联流程可用于附着于固相的单链，并且在形成LPA前可验证 它们的同质性。从固相上切下和同时的侧链去保护可以通过标准肽合成流 程(上述)进行。从而可获得最终产物，其具有最佳和良好定义的组成。 如果期望或有需要，可以容易的通过标准层析方法诸如HPLC或凝胶过滤 进行纯化。
有利于提供环结构的二、三和四羧酸可以选自亚氨二乙酸、2-氨基丙二 酸、3-氨基戊二酸、3-甲氨基戊二酸、3-氯谷氨酸、3-甲氧基-羰基戊二酸、 3-乙酰基戊二酸、戊二酸、丙三羧酸、3，4-二羧甲基己二酸、4-(2-羧乙基)- 庚二酸、(3，5-二羧甲基-苯基)-乙酸、3，4-二羧甲基-己二酸、苯-1，2，4，5-四羧 酸、4-(3-羧基-丙烯氨基)-丁-2-烯酸、4，4-亚氨基-二苯甲酸、1，4-二氢吡啶-3，5- 二羧酸、5-氨基异酞酸、2-氯丙二酸、3-羟基戊二酸和苯-1，3，5-三羧酸。
片段偶联(片段偶联或片段缩合)可以依照标准流程进行，例如如 Peptide Synthesis protocols，Methods in Molecular Biology Vol.35，Chapter15， 303-316，Nyfeler R，Pennington MW and Dunne BM Eds.，Humana Press，1994 中所述。因此，片段可以如上所述在固相上合成，以完全保留保护基团的 方式从固相上切下，纯化并鉴定。也可以通过上述其它技术获得合适的片 段。
使用上述LPA方法来制备本发明的化合物是本发明的优选实施方案。
4、抗体
本发明的一个目的是提供能够识别和选择性结合包含对应于本发明通 式I之序列或所述序列之片段、变体或同源物或由其包含的表位的抗体、其 抗原结合片段或重组蛋白，在一个优选的实施方案中，所述表位为包含本 发明基序的表位。在一个优选的实施方案中，抗体为识别和结合包含基序 G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L的表位的抗体，其中xa为任意氨基酸残基，xb为I、 T、M或E。在另一个优选的实施方案中，抗体为识别和结合包含基序 G-x2-D/E-V-I-L的表位的抗体，其中x2为R或L。在又一个优选的实施方案 中，抗体为识别和结合包含基序V-L-G/E-x9-V/L的表位的抗体，其中X9为 E、D、K或Q。在其它优选的实施方案中，抗体可以选自识别和结合包含 或被包含于选自SEQ ID NO：1-11中任意序列或所述序列之片段、变体或同 源物的序列或由其包含的表位的抗体。
优选的是，表位位于NCAM、NGF、NT-3或NT-4/5多肽上。
术语“表位”表示(抗原分子上)受到(该抗原的)抗体识别(从而引起 免疫应答)的一组特定的原子。术语“表位”等同于术语“抗原决定簇”。表位 可包含3个或更多氨基酸残基，诸如例如4个、5个、6个、7个、8个氨 基酸残基，其位置紧密接近，诸如在连续的氨基酸序列中，或者位于抗原 氨基酸序列的远隔部分，但是由于蛋白质折叠而互相接近。
抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族，其基本构件(basic building block)，免疫球蛋白折叠或结构域，以各种形式用于免疫系统和其 它生物学识别系统的许多分子中。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，含 有称为可变区的抗原结合区和称为恒定区的不变区域。
天然抗体和免疫球蛋白通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链 (H)构成的约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价 二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有 所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端 具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区 (VL)，而另一端是一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在 一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残 基在轻链和重链可变区之间形成界面(Novotny J.&Haber E.Proc Natl Acad Sci U S A.82(14)：4592-6，1985)。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白归入不同的类别。 免疫球蛋白有至少五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有 些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。 将与不同免疫球蛋白类别对应的重链恒定区分别称作阿尔法(α)、德尔塔 delta(δ)、厄普西隆(ε)、伽马gamma(γ)和谬mu(μ)。根据其恒定区的氨基酸 序列，抗体的轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(к)和拉姆 达(λ)。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
术语“可变的”在抗体可变区的语境中指可变区中的某些部分在抗体序 列中差异广泛的实情。可变区用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和决 定特异性。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻 链和重链可变区中称作互补决定区(CDR)，也称作高变区的三个区段。
可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变 区各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在 某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通 过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗 原结合位点的形成。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种 效应物功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
因此设想在本发明中使用的抗体可以为多种形式，包括完整的免疫球 蛋白，抗体片段诸如Fv、Fab和类似片段，包含可变区互补决定区(CDR) 的单链抗体等形式，它们都归入本文中所使用的广义术语“抗体”。本发明设 想了任意特异性的抗体的应用，多克隆的或单克隆的，并且不限于识别特 定抗原并与其发生免疫反应的抗体。在优选的实施方案中，在下述治疗和 筛选方法的情况中，使用对本发明的抗原或表位具有免疫特异性的抗体或 其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产 生两个相同的抗原结合片段，称作Fab片段，各自具有一个抗原结合位点， 和一个残余“Fc”片段，这样叫是因为它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生 一个F(ab′)2片段，它具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，和一个残余 的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括双抗体、线性抗体、单链抗体分 子、及由抗体片段形成的多特异性抗体。在用于本文时，关于抗体的“功能 性片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
术语“抗体片段”在用于本文时可与术语“抗原结合片段”互换。
抗体片段可以小至约4个氨基酸，5个氨基酸，6个氨基酸，7个氨基 酸，9个氨基酸，约12个氨基酸，约15个氨基酸，约17个氨基酸，约18 个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸或更多。一般 而言，本发明的抗体片段可以具有任意大小上限，只要它相对于特异性结 合包含选自本文中标示为SEQ ID NO：1-11的任意序列或所述序列之片段的 肽序列的表位的抗体具有类似的免疫学特性。因此，在本发明的上下文中 术语“抗体片段”与术语“抗原结合片段”等同。
抗体片段保留了选择性结合其抗原或受体的一些能力。抗体片段的一 些类型定义如下：
(1)Fab为包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。为了制备Fab 片段，可用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部 分。
(2)Fab′为抗体分子的片段，它可以如下获得，用胃蛋白酶处理完整 抗体，然后还原以产生完整的轻链和重链的一部分。每个抗体分子可获得 两个Fab′片段。
Fab′片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基末端增加了 少数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
(3)(Fab′)2为抗体的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，但 不进行后续还原来获得。
F(ab′)2为通过两个二硫键结合在一起的两个Fab′片段的二聚体。
(4)Fv为包含包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域 由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体(VH-VL 二聚体)组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个CDR相互作用而在 VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以 抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个 CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合 位点。
(5)单链抗体(“SCA”)定义为包含轻链可变区和重链可变区的基因 工程分子，两个可变区通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。 该单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽还在VH和 VL结构域之间包含多肽接头，其能够使sFv形成抗原结合所需的结构。sFv 的综述可见Pluckthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中， 113：269-315，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，NY，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一 条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过 使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域 与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整 的描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
本发明设想了能够结合依照本发明的表位的多克隆和单克隆抗体，其 抗原结合片段和重组蛋白。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员所公知的。参见例如Green等人 1992.Production of Polyclonal Antisera，in：Immunochemical Protocols (Manson ed.)，pages 1-5(Humana Press)；Coligan等人，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，in：Current Protocols in Immunology，section 2.4.1，收入本文作为参考
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler&Milstein，Nature， 256：495-7(1975)；Coligan等人，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等人，in： Antibodies：A Laboratory Manual，page 726，Cold Spring Harbor Pub.(1988)。单 克隆抗体可以通过多种已经建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。该 分离技术包括使用蛋白A-Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换 层析。参见例如Coligan等人，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3； Barnes等人，Purification of Immunoglobulin G(IgG).In：Methods in Molecular Biology，1992，10：79-104，Humana Press，NY。
体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员所公知的。例如， 将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler and Milstein，1975， Nature 256：495-7描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组方法来制备， 例如如US4,816,567中所述。将用于本发明的单克隆抗体还可以使用 Clackson等人，1991，Nature 352：624-628，中和Marks等人，1991，J Mol Biol 222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。另一种法牵涉通过重组 方法将单克隆抗体人源化以产生包含人特异性和可识别序列的抗体。综述 综述参见Holmes等人，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等人，1998， Annals Allergy，Asthma&Immunol 81：105-115。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以极少量存在的可能天然存 在的突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。此外，与 典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品不 同，每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性，单克 隆抗体的优越性体现在它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球 蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特 征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/ 或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的 相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体 类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要 它们显示出所需的生物学活性(US4,816,567；Morrison等人，1984，Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855)。
制备抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如Harlow and Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988，收 入本文作为参考)。可通过蛋白水解抗体或者通过在大肠杆菌中表达编码片 段的DNA来制备本发明的抗体片段。可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完 整抗体的常规方法来获得抗体片段。例如，为了制备抗体片段，可以用胃 蛋白酶酶促切割抗体以提供称为F(ab′)2的5S片段。可以用硫醇还原剂进一 步切割该片段，和任选的针对切割二硫键产生的巯基的封闭基团，以产生 3.5S Fab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab′ 片段和一个Fc片段。这些方法记载于例如US4,036,945和US4,331,647及 其所含参考文献。将这些专利完整收入本文作为参考。
也可以使用切割抗体，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一 步切割片段，或者其它酶促的、化学的或基因的技术的其它方法，只要片 段与完整抗体所识别的抗原结合。例如，Fv片段包含VH和VL链的联合体。 该联合可以是非共价的，或者可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化 学试剂诸如戊二醛交联。优选的是，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和 VL链。通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列 的结构基因，制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载 体，随后导入宿主细胞诸如大肠杆菌。重组宿主细胞合成以接头肽跨接两 个V结构域的单一多肽链。制备sFv的方法记载于例如Whitlow等人，1991， In：Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：97；Bird等人，1988， Science 242：423-426；US4,946,778；和Pack等人，1993，BioTechnology 11： 1271-77。
抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽 (“ 最小识别单位”)经常涉及抗原识别和结合。可以通过克隆或构建编码目 的抗体的CDR的基因来获得CDR肽。为了制备所述基因，例如使用聚合 酶链式反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区。参见例如Larrick等人， Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 106(1991)。
本发明设想了人源和人源化形式的非人(例如鼠源)抗体。所述人源 化抗体为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、 F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最 小序列，诸如表位识别序列。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白 (受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有所需特异性、亲和力和 能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫 球蛋白。包含本发明抗体的最小序列，诸如识别本文所述表位的序列的人 源化抗体为本发明的优选实施方案之一。
在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替代。 此外，人源化抗体可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中都没有发现 的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体的性能。一般而言， 人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所 有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基 本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。任选的是，人源化抗 体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒 定区。更多细节参见：Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等 人，1988，Nature 332：323-329；Presta，1992，Curr Op Struct Biol 2：593-596； Holmes等人，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等人，1998，Annals Allergy，Asthma&Immunol 81：105-115。
可以使用包含本发明基序，诸如例如标示为SEQ ID NO：1-11之序列的 NCAM、NGF、NT3或NT4/5的天然或重组片段作为抗原，通过本领域用 于制备多克隆和单克隆抗体的任何标准方法来产生抗体。为了产生所述抗 体，还可以使用SEQ ID NO：1-11的肽序列的变体、同源物或片段，或者任 何其它免疫原性肽序列或其免疫原性片段，其符合以下条件：
(i)为至少6个氨基酸的连续氨基酸序列，和
(ii)包含至少一个上述氨基酸基序。
还可以由待治疗个体在体内产生抗体，例如通过对所述个体施用本发 明的免疫原性片段。因此，本发明还涉及包含上述免疫原性片段的疫苗。
本申请还涉及制备本发明抗体的方法，所述方法包括提供上述免疫原 性片段的步骤。
本发明涉及1)抗体，其能够调控，诸如增强或削弱人NCAM和/或神 经营养蛋白和/或Trk受体的生物学功能，特别是涉及细胞生长、分化和存 活、与学习或记忆有关的神经可塑性、和/或细胞运动性的功能，2)抗体， 其能识别和特异性结合NCAM和/或Trk受体配体，诸如NGF、NT-3或 NT-4/5，且调控NCAM和/或Trk受体配体的功能；和3)抗体，其能识别 和特异性结合NCAM和/或Trk受体配体，诸如NGF、NT-3或NT-4/5，但 不调控其生物学活性。优选通过使用上述免疫原性肽序列来制备所述抗体。
本发明涉及上述抗体用于1)涉及调控神经营养蛋白、NCAM和/或Trk 受体活性的治疗性应用；2)调控细胞和生理活动，包括细胞分化、存活和 运动性、以及与学习和记忆有关的神经可塑性，3)为诊断目的，4)研究 目的在体外和/或体内检测和/或监测神经营养蛋白、NCAM和/或Trk受体 的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及包含上述抗体的药用组合物。
5、药物
本发明提供了肽序列和化合物，其能够i)刺激神经突向外生长；ii) 调节细胞运动性性；iii)刺激神经细胞存活；iv)刺激神经细胞分化；v) 刺激与记忆和学习有关的神经可塑性；vi)调节Trk家族受体的神经营养蛋 白受体的活性。因此，所述化合物可以用于刺激神经突向外生长、刺激神 经细胞存活、刺激神经可塑性、刺激神经细胞分化、调节Trk家族受体的神 经营养蛋白受体的活性、和调节细胞运动性，以及用于制造治疗下述疾病 和/或病征的药物，其中需要所述刺激或所述调节。在优选实施方案中，本 发明的肽序列和化合物包括神经营养蛋白的分离的肽片段，诸如NGF、NT-3 和NT-4/5和/或NCAM。
神经生长因子(NGF)刺激胆碱能功能，在损伤、淀粉状蛋白过表达 和衰老的动物模型中改善记忆和防止胆碱能变性，刺激神经突向外生长和 神经元存活(Tuszynski MH等人Nat Med.2005 Jun；11(6)：551-5； Jakubowska-Dogru E，Gumusbas U，Neurosci Lett.2005 Jul 1；382(1-2)：45-50； Walz R等人Neurochem Res.2005 Feb；30(2)：185-90；Hu Z等人Neurobiol Dis.2005 Feb；18(1)：184-92)。此外，已经将不同Trk受体的表达和活性水 平与癌症患者的存活联系起来(Schramm A等人Cancer Lett.2005 May 24， PubMed Epub ahead of print)，而且癌细胞的入侵行为依赖于NCAM、Trk 受体和NGF的表达和活性(Chen-Tsai CP等人Dermatol Surg.2004 Jul；30(7)： 1009-16)。
NCAM功能已经显示出对不同身体系统和器官，特别是神经系统的很 多种正常的和病态的状况是重要的(Sandi C.Nat Rev Neurosci.2004 Dec； 5(12)：917-30；Kiryushko D等人Ann N Y Acad Sci.2004 Apr；1014：140-54； Gniadecki R等人Arch Dermatol.2004 Apr；140(4)：427-36；Berezin V，Bock E. J Mol Neurosci.2004；22(1-2)：33-39)。
因此，本发明的肽序列和/或化合物可用于预防和/或治疗下述病症或疾 病，其中神经营养蛋白或神经营养蛋白受体的功能、或NCAM的功能起重 要作用。
因此，可以预期使用本发明的肽序列和/或化合物可能在治疗或预防下 述病症和疾病的非限制性实施例中具有有益效果：
1)中枢和周围神经系统的疾病和病症，诸如手术后神经损伤、创伤性 神经损伤、神经纤维的髓鞘形成受损、缺血后损伤例如由中风引起的、帕 金森氏(Parkinson)病、阿尔茨海默氏(Alzheimer)病、亨廷顿氏(Huntington) 病、痴呆诸如多梗塞性痴呆(multiinfarct dementia)、硬化、与糖尿病有关 的神经变性、影响生物钟或神经-肌肉传导的紊乱或与之有关的，和/或
2)精神疾病和病症，诸如思想和/或情绪障碍、神经精神障碍 (neuropsychiatric disorders)包括两极(bipolar)(BPD)、遗传相关单极情 感障碍(genetically related unipolar affective disorders)、妄想性障碍 (delusional disorders)、妄想痴呆(paraphrenia)、偏执型精神病(paranoid psychosis)、精神分裂症(schizophrenia)、分裂型障碍(schizotypal disorder)、 情感分裂性精神障碍(schizoaffective disorder)、情感分裂性两极和遗传相 关单极情感障碍(schizoaffective bipolar and genetically related unipolar affective disorders)、精神性精神病(psychogenic psychosis)、紧张症 (catatonia)、周期性两极和遗传相关单极情感障碍(periodic bipolar and genetically related unipolar affective disorders)、循环性精神病(cycloid psychosis)、分裂样人格障碍(schizoid personality disorder)、偏执型人格障 碍(paranoid personality disorder)、两极和遗传相关单极情感障碍相关的情 感障碍(bipolar and genetically related unipolar affective disorders related affective disorders)以及单极情感障碍的亚型，和/或
3)肌肉疾病或病症，包括神经-肌肉连接功能受损的病症，诸如器官移 植后的，或诸如遗传性或创伤性萎缩性肌障碍；和/或
4)各种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺诸如I型和II型糖尿病、 肾诸如肾病、以及心、肝和肠的变性病症，和/或
5)学习能力的削弱和/或短期和/或长期记忆的削弱。
具体而言，本发明涉及正常的、变性的或损伤的NCAM、Trk受体和/ 或神经营养蛋白呈递细胞的治疗。
本发明的化合物还能够调节细胞运动性，即抑制细胞运动性。因此， 本发明也考虑将所述化合物用于调节细胞运动性，优选用于抑制细胞运动 性。
因此，根据这种考虑，本发明的化合物和药物可用于预防和/或治疗：
1)癌症，
2)炎性疾病，
3)变应性病症，和/或
4)新血管发生(neoangeogenesis)。
本发明涉及癌症，为要求新血管发生的任意类型的固体瘤以及任意恶 性癌症。具体而言，本发明涉及神经系统的癌症。
本发明的肽序列和/或化合物还可用于治疗由于饮酒而具有身体损伤的 个体及治疗患有朊病毒疾病的个体。
因此，一个目的是将肽序列、化合物和/或抗体用于制造药物。本发明 的药物可用于治疗其中刺激神经突向外生长、刺激神经细胞存活、刺激神 经可塑性、刺激神经细胞分化、调节Trk家族受体的神经营养蛋白受体的活 性、及调节细胞运动性有益于治疗的任何病症或疾病。所述病症和疾病的 非限制性实例如上所述。
本发明的药物可含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、化合物 或抗体，或者其可以配制成含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、 化合物或抗体以及药学可接受添加剂的药用组合物。在有些实施方案中， 药物或药用组合物可以含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、化合 物和/或抗体的联合。
因此，本发明在另一方面还涉及含有至少一种本发明的分离的肽序列、 化合物和/或抗体的药用组合物。
本发明的又一方面为制备药用组合物的方法，包括将有效量的一种或 多种本发明的分离的肽序列、化合物或抗体，或者按照本发明的药用组合 物与一种或多种药学可接受添加剂或载体混合。
在上述方法的一个实施方案中，将化合物用于与假体装置(prosthetic device)联合，其中所述装置为假体神经导杆(prosthetic nerve guide)。因 此，在另一方面，本发明涉及假体神经导杆，特征在于其包含一种或多种 上述化合物或药用组合物。神经导杆为本领域已知的。
本发明还涉及含有本发明化合物的药用组合物用于治疗或预防本申请 所提到的任何疾病或病症的用途。
在有些实施方案中，本发明涉及含有能够识别包含本发明氨基酸基序 的表位的抗体的药用组合物。所述药用组合物还可用于治疗本文所述的病 症和疾病。
本发明的药物和/或药用组合物可以合适的配制用于口服、经皮、肌肉 内、静脉内、颅内、鞘内、脑室内、鼻内或肺部施用。
基于本发明化合物的药物和组合物的剂型开发策略通常与基于蛋白质 的任何其它药物产品的配制策略相同。潜在的问题以及克服这些问题所需 要的指导涉及一些教科书，例如《Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems》，Ed.A.K.Banga，Technomic Publishing AG， Basel，1995。
注射剂通常制备成液体溶液或悬浮液、在注射前适于溶解或悬浮于液 体的固体形式。制剂也可以乳化。常常将活性成分与药学可接受的且与活 性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、 乙醇等，及其组合。此外，如果需要的话，制剂可以含有极少量的辅助物 质，诸如湿润或乳化剂、pH缓冲剂或可增强制剂效力或输送的物质。
本发明化合物的配制剂可以通过本领域技术人员已知的技术来制备。 配制剂可以含有药学可接受的载体和赋形剂，包括微球、脂质体、微囊、 纳米粒等。
制剂可以合适的通过注射来施用，任选在要活性成分发挥其作用的部 位。适于其它施用模式的其它剂型包括栓剂、鼻内、肺部以及在一些情况 中，口服剂型。对栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚(亚烷基)二醇或甘 油三酯。所述栓剂可以由含有从0.5％至10％，优选1-2％范围的活性成分的 混合物制成。口服剂型包括常用赋形剂，诸如例如药用级的甘露醇、乳糖、 淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬 浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放剂型或粉剂的形式，且通常含有10-95％ 的活性成分，优选25-70％。
其它剂型为那些适于鼻腔和肺部施用的剂型，例如吸入器和气雾剂。
活性化合物可以配制成中性或盐形式。药学可接受的盐包括与无机酸， 诸如例如盐酸或磷酸、或者与有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等 形成的酸加成盐(与肽化合物的游离氨基形成的)。由游离羧基形成的盐 也可以衍生自无机碱，诸如例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及有机碱 诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
制剂以与剂量配制剂相容的形式，且以治疗有效量施用。将施用的量 取决于待治疗的受试者，包括例如受试者的体重和年龄、所治疗的疾病和 疾病的阶段。合适的剂量范围达到每次施药每千克体重几百微克活性成分， 优选的范围为每千克体重约0.1微克至5000微克。在使用化合物的单体形式 时，合适的剂量通常在每千克体重0.1微克至5000微克的范围内，诸如在每 千克体重约0.1微克至3000微克的范围内，尤其是在每千克体重约0.1微克至 1000微克的范围内。在使用化合物的多聚体形式时，合适的剂量通常在每 千克体重约0.1微克至1000微克的范围内，诸如在每千克体重约0.1微克至 750微克的范围内，尤其是每千克体重约0.1微克至500微克的范围内，诸如 在每千克体重约0.1微克至250微克的范围内。具体而言，在鼻腔施药时，使 用比通过其它途径施药时较小的剂量。施药可以执行一次，或者可以随后 进行后续施药。剂量也将取决于施药途径，并且将随着待治疗受试者的年 龄和体重而变化。多聚体形式的优选剂量将在每70千克体重1mg至70mg之 间。
对有些适应症，优选局部的或本质上局部的应用。
对其它应用，优选鼻内应用。
本发明的有些化合物具有足够的活性，但是对于其它一些，如果制剂 还包含药学可接受的添加剂和/或载体，效果将增强。所述添加剂和载体将 是本领域已知的。在有些情况中，含有促进活性物质投递至其靶的化合物 将是有益的。
在许多情况中，多次施用配制剂将是必要的。施药可以是持续输注， 诸如心室内输注或多剂施用，诸如一天多次、每天一次、一周多次、每周 一次等。优选在个体受到可能导致细胞死亡的因素之前或短暂之后开始施 用药物。优选的是，在所述因素开始作用8小时内，诸如在所述因素开始作 用5小时内施用药物。许多化合物显示长期作用，由此可以间隔较长时间施 用所述化合物，诸如1周或2周。
在与神经导杆的联合中，施药可以是持续的或者基于活性化合物的受 控释放的小部分。此外，可以使用前体来控制释放速率和/或释放部位。其 它种类的植入以及口服施用可以相似地以受控释放和/或使用前体为基础。
6.治疗
通过使用依照本发明的肽序列、包含它们的化合物、抗体、包含它们 的药物、和/或包含它们的药用组合物的治疗在一个实施方案中对于诱导分 化、调节细胞增殖和运动性、刺激再生、存活和神经元可塑性是有用的。
因此，治疗包括中枢和周围神经系统的疾病或病征的治疗和/或预防， 诸如手术后神经损伤、创伤性神经损伤例如由脊髓损伤产生的、神经纤维 的髓鞘形成受损、缺血后损伤例如由中风(stroke)产生的、多梗塞性痴呆 (multiinfarct dementia)、多发性硬化、与糖尿病有关的神经变性(nerve degeneration)、神经-肌肉变性、精神分裂症、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(parkinson’s disease)或亨廷顿氏病(huntington’s disease)。
此外，关于肌肉的疾病或病症，包括神经-肌肉连接功能受损的病症， 诸如遗传性或创伤性萎缩性肌障碍(atrophic muscle disorder)；或者用于治疗 各种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺诸如I型和II型糖尿病、肾诸如 肾病的变性病。依照本发明的化合物可以用于诱导分化、调节增殖、刺激 再生、神经元可塑性。
本发明还涉及所述化合物和/或药用组合物在治疗癌症中的应用。调节 癌细胞运动性对于含癌细胞肿瘤的生长、侵入、血管发生及其传播是重要 的。因此，所述化合物可作为抑制后续过程的药物有利的用于癌症的预防 和治疗。
在还有一个实施例中，本发明涉及所述化合物以及包含其的药物和/或 包含其的药用组合物用于刺激短期和/或长期记忆和/或学习能力的应用。增 强的神经突向外生长和新神经元连接的建立是记忆巩固机制的一部分。所 述肽序列及包含它们的化合物对于长期记忆和短期记忆的刺激可能都是有 用的。
本发明的化合物、药物和/或药用组合物可用于例如治疗临床病症，诸 如瘤，诸如恶性瘤、良性瘤、原位癌和具有不定表现的瘤，内分泌腺疾病， 诸如糖尿病，精神病，诸如老年性和早老性器质性精神病病症、酒精中毒 性精神病、药物性精神病、暂时性器质性精神病病症、阿尔茨海默氏病、 脑脂沉积、癫痫、全身轻瘫[梅毒]、肝豆状核变性、亨廷顿氏舞蹈病、雅- 克二氏(Jakob-Creutzfeldt)病、多发性硬化、皮克氏(Pick)脑病、梅毒、 精神分裂症、情感性精神病、神经症性障碍(neurotic disorder)、人格障碍， 包括性格神经症、与器质性脑综合征有关的非精神病性人格障碍、偏执型 人格障碍、狂信型人格、偏执型人格(障碍)、偏执特质、性偏离和性功 能障碍、智力迟钝、神经系统和感觉器官的疾病、认知异常、中枢神经系 统的炎性疾病，诸如脑膜炎、脑炎、大脑变性，诸如阿尔茨海默氏病、皮 克氏病、脑的老年性变性、交通性脑积水、梗阻性脑积水、帕金森氏病包 括其它椎体外疾病和异常运动障碍、脊髓-小脑疾病、小脑共济失调、马里 氏(Marie)、Sanger-Brown、肌阵挛性小脑共济失调、原发性小脑变性诸 如脊髓性肌萎缩、家族性、青少年性、成年性脊髓性肌萎缩、运动神经元 疾病、肌萎缩性侧索硬化、运动神经元疾病、进行性延髓麻痹、假延髓麻 痹、原发性侧索硬化、其它前角细胞疾病、前角细胞疾病、未分类的、其 它脊髓疾病、脊髓空洞症和延髓空洞症、血管性脊髓病、脊髓的急性梗死 (栓塞性的)(非栓塞性的)、脊髓的动脉血栓症、脊髓的水肿、亚急性 坏死性脊髓病、脊髓的亚急性联合变性(分类在其它疾病中)、脊髓病、 药物诱导的、辐射诱导的脊髓炎、自主神经系统紊乱、周围自主、交感、 副交感或植物系统紊乱、家族性自主神经异常[里-戴二氏(Riley-Day)综合 征]、特发性周围自主神经病、颈动脉窦晕厥或综合征、颈交感神经营养不 良或麻痹、周围自主神经病(分类在其它病症中)、淀粉样变性、周围神 经系统的疾病、臂神经丛损伤、颈肋综合征、肋锁综合征、前斜角肌综合 征(scalenus anterior syndrome)、胸腔出口综合征、臂丛神经炎或脊神经根 炎，包括新生儿中的；炎性和毒性神经病，包括急性传染性多神经炎、格- 巴二氏(Guillain-Barre)综合征、感染后多神经炎、胶原血管病中的多神经 病、影响眼睛多个结构的疾病、化脓性眼内炎、耳和乳突的疾病、慢性风 湿性心脏病、缺血性心脏病、心律失常、肺系统的疾病、新生儿的器官和 软组织异常，包括神经系统中的，阵痛和分娩中施用麻醉剂或其它镇静剂 的并发症、皮肤疾病，包括感染、不充分的血液循环问题、损伤，包括手 术后的、压伤、烧伤；神经和脊髓的损伤，包括神经切断、连贯性的损害 (有或无开放伤口)、创伤性神经瘤(有或无开放伤口)、创伤性暂时性 麻痹(有或无开放伤口)、在医学操作中的意外刺伤或撕裂、视神经和视 路的损伤、视神经损伤、第二颅神经、视交叉损伤、视路损伤、视皮层损 伤、未分类的失明、其它颅神经损伤、其它和未分类的神经的损伤；药物、 医学和生物学物质中毒、遗传性或创伤性萎缩性肌障碍；或者用于治疗各 种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺(诸如I和II型糖尿病)、肾(诸 如肾病)的变性病。瘙痒病、克-雅二氏(Creutzfeldt-Jakob)病、GSS三氏 (Gerstmann-Straussler-Sheinker)病。
依照本发明，治疗和/或预防上述病征和症状的方法包括对有所需要的 个体施用有效量的本发明的肽序列和/或化合物、和/或抗体和/或药物、和/ 或药用组合物的步骤。
7、实施例
实施例1肽序列的合成
使用Fmoc保护的氨基酸(3eq)在采用Rink酰胺连接体(p-(R，S)-α- (1-(9H-芴-9-基)-甲氧基氨基甲酰)-2，4-二甲氧基苯甲基)-苯氧基乙酸 (Novabiochem))的TentaGel树脂上合成肽。在手动多层析装置中用TBTU(3 eq)，HOBt(3eq)和DIEA(4.5eq)进行＞60分钟的连接。用DMF中20％的哌 啶去保护Fmoc 10分钟。通过连接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Novabiochem) 到连接体树脂，然后Fmoc基团的Fmoc去保护，进一步进行Fmoc-Lys(Fmoc) -OH的连接以完成肽树状体(dendrimer)的合成。Fmoc去保护后，进行上述 肽的合成以得到单体肽。用90％TFA，5％H2O，3％EDT，2％苯硫基甲烷去保 护肽基树脂，在二乙基醚(diethyl ether)中沉淀，在二乙基醚中洗三次， 溶解于5％AcOH中，冻干。使用连接到WISP 712的Waters picotag和Waters 501 pump进行氨基酸分析。装备有Waters 996光电二极管阵列探测器的 Waters 600E被用于C18柱上的分析和制备HPLC(Delta-Pak 100 15um， Millipore)。可以在VG TOF Spec E，Fisions Instrument上进行Maldi-MS。通 过HPLC估计肽至少为95％纯。
实施例2通过NCAM HBP刺激神经突向外生长
表达或不表达NCAM的成纤维细胞与原代CGNs的共培养
表达或不表达NCAM的基因修饰的成纤维细胞(小鼠成纤维细胞样L 细胞)被以7×104细胞/孔的密度接种到八孔LabTek组织培养室载片(Nunc， Roskilde，Denmark)上，在37℃和5％CO2保存在含有10％HS，100U/ml 青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM中。平板接种24h后，移除培养基， 在含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的 Neurobasal-A培养基中接种CGNs(104细胞/孔)到表达或不表达NCAM的 成纤维细胞单层上，在共培养物中培育24小时，然后测定神经突的向外生 长。根据Rnn，L.C.，Doherty，P.，Holm，A.，Berezin，V.，Bock，E.(2000).J Neurochem 75(2)：665-71从出生后3-4天的大鼠幼崽制备CGNs。
为评估NCAM的肝素结合肽(HBP)(KGRDVILKKDVRFI)(SEQ ID NO： 1)(IgII NCAM的氨基酸154-167(SwissProt P13596)的效果。在存在不同浓 度的HBP或其中Lys-161和Phe-166(对应于HBP序列的残基)分别被替 换为Ala和Val的肽M(KGRDVILAKDVRVI)(SEQ ID NO：2)的情况下将 CGNs接种到表达或不表达NCAM的成纤维细胞上。从图1中显示表达 NCAM的成纤维细胞与不表达NCAM的对照成纤维细胞相比明显促进 CGNs的神经突向外生长，并且HBP剂量依赖性的增加生长在表达NCAM 的成纤维细胞上和不表达NCAM的成纤维细胞上的CGNs的神经突向外生 长。相反，肽M不影响来自生长在表达NCAM的成纤维细胞上的CGNs 的神经突向外生长反应，但是它仍然刺激生长在不表达NCAM的成纤维细 胞上的CGNs的神经突向外生长。
从图2中显示用SU5402，一种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的 抑制剂，进行处理不会阻断HBP对生长在对照成纤维细胞上的CGNs的促 神经突生长效果，并且仅仅部分抑制CGNs和表达NCAM的成纤维细胞的 共培养物中NCAM介导的神经突向外生长，但是在不存在HBP的情况下 SU5402阻断NCAM介导的神经突向外生长。这表明HBP诱导的神经突向 外生长取决于至少两个机制：1.当涉及转NCAM同嗜性相互作用(trans NCAM homophilic interaction)时，依赖于NCAM-FGFR信号的活化，和2.当 不存在转NCAM同嗜性相互作用时，不依赖于FGFR信号。
单CGNs神经元的原代培养
根据Rnn，L.C.，Doherty，P.，Holm，A.，Berezin，V.，Bock，E.(2000).J Neurochem.75(2)：665-71从出生后3-4天的大鼠幼崽制备原代小脑颗粒神经 元。在37℃和5％CO2条件下在含有20mM Hepes，100U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的Neurobasal-A培养基(全部来自 Gibco BRL)中培养分离的小脑细胞。为检测肽的效果，在含有100U/ml青 霉素，100μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的Neurobasal-A培养基中 以104细胞/孔的密度将CGNs接种到带有Permanox塑料生长表面的八孔 LabTech组织培养室载片(Nunc)上。当用肝素酶III(1U/ml)处理时，平 板接种后立刻加入该酶到培养基中。在加入不同浓度(1μg/ml，5μg/ml和 20μg/ml)的肽之前用该酶处理CGNs 1小时。培养24小时后，细胞用多聚 甲醛固定，用针对CD90(Thy-1)(1∶200)(Caltag Laboratories，USA)(PC12-E2 细胞)或GAP-43(1∶1000)(Chemicon，USA)(CGNs)的第一(primary)小鼠抗体 和针对小鼠IgG的第二AlexaFluor488山羊抗体(1∶1000)(Molecular Probes， Netherlands)免疫染色，神经突的长度通过先前已有记载的立体测量学方法 (Ronn，L.C.，Ralets，I.，Hartz，B.P.，Bech，M.，Berezin，A.，Berezin，V.，Moller， A.，Bock，E(2000).J Neurosci Methods.100(1-2)，25-32)进行测量。
图3表明NCAM HBP(SEQ ID NO：1)对生长在存在或不存在肝素酶III 的培养物中的单一原代CGNs的影响，已知该酶特异性裂解硫酸乙酰肝素 为二糖。固定在组织培养塑料上的HBP能够以剂量依赖性方式诱导CGNs 中的神经突向外生长，其在5μg/ml的包被浓度具有680％的最大效果。肽 M在5μg/ml的包被浓度具有400％的最高效果。用肝素酶III进行处理降 低了HBP的效果，但是不降低M肽的效果。这些结果表明NCAM HBP的 刺激神经突向外生长的活性取决于共同作用的两个目标(target)，硫酸乙酰 肝素敏感的和硫酸乙酰肝素不敏感的目标。
图4表明在存在和不存在肝素酶III的情况下，肽：HBP (KGRDVILKKDVRFI)(SEQ ID NO：1)，肽M(KGRDVILAKDVRVI)(SEQ ID NO：2)，肽M1n(KGRDVILNNDVRFI)(SEQ ID NO：3)和肽M3n (KGRDVILNNQVRFI)(SEQ ID NO：4)的神经突发生效果。所有的肽都具有 非常强的促神经突生长活性，其反映为被处理的神经元的神经突长度增加 4-7倍。NCAM HBP(SEQ ID NO：1)的肝素结合活性不是通过肽刺激神经突 向外生长的先决条件，但是在存在硫酸乙酰肝素的情况下所述序列的神经 突发生潜力更强。
实施例3通过NCAM HBP调控成纤维细胞的运动性
为评估所述肽对细胞运动性的影响，用改造后的Puck′s盐水(Gibco BRL) 中0.5mg/ml的胰蛋白酶和0.75mM EDTA移出表达或不表达NCAM的成纤 维细胞的铺满培养物，以4×103细胞/cm2的密度接种到六孔组织培养皿 (Nunc)中，在37℃和5％CO2培养24h。
如先前已记载的通过使用定时录影和图像分析评估任意细胞运动性( Walmod等人，(1998).Cell Motil Cytoskeleton.40(3)，220-37)。简要的，将用 胶带紧密密封的组织培养皿置于安放在Nikon Diaphot 300倒置显微镜 (Nikon，Denmark)上的恒温控制的镜台(Lincam Scientific Instruments Ltd.， UK)上。使用恒温控制的加热风扇(DFA，Denmark)将安放在显微镜镜台周 围的树脂玻璃培养器中的温度保持在37℃。安放在显微镜上的机动镜台使 得能够同时记录许多(50-100个)不同的视野。用连在显微镜上的黑白CCD 摄影机(Burle，Lancaster，PA)进行活细胞的录影。使用软件PRIMA(Protein Laboratory，Copenhagen，Denmark)在4小时中每间隔15分钟用使用10×物镜 的相位对比度光学装置(phase contrast optics)进行768×576象素图片的自动 获得和存储。
使用图像处理软件PRIMA进行细胞运动性和形态学的评估。通过手动 标记细胞核的中心确定细胞个体的位置。定义单个细胞的轨迹为在不同时 间点细胞核中心的座标的顺序。如下所述根据Walmod等人，(2000)(Methods Mol.Biology.161，59-83)测定均方细胞速度(mean squared cell speed)(Sτ)， 扩散率(rate of diffusion)(R)和运动指数(locomotive index)(LI)的参数。
细胞运动性的分析
细胞的移动是相应于细胞原始和最终位置的两点之间的欧几里得距离 (Euclidean distance)。在连续观察之间恒定的时间段进行细胞位置的测定。 给定观察的时间(ti)后细胞群的均方细胞位移(mean squared cell displacement)被计算为
其中i为观察编号(i＝0，1，2，...k)，k为观察的总数减一，ti为最初的观 察(t0)和观察编号i之间的时间间隔(ti＝i×τ)，xm(ti)和ym(ti)为细胞编号m 在时间点ti的座标，N为细胞的总数。通过测绘相对于时间的均方位移 估测扩散率R，随后其曲线拟合为方程式：
＝R(τ-P(1-e-τ/P))
其中P为定向持续时间(23)。平均细胞细胞速度Sτ被计算为细胞的平 均位移()对时间间隔τ的比值。这根据如下方程式进行：
对于在给定的观察时间细胞群样品，平均细胞轨迹长度(mean cell-path-length)被计算为：
运动指数LI被计算为平均细胞位移()和平均细胞轨迹长度的比 值：
LI被用作细胞定向持续(directional persistence)的量度。具有完全直线运 动的细胞LI将为1，反之较低的定向持续将导致较低的LI值。对于随机移 动的细胞，证明LI显示与定向的持续时间(persistence time of direction)(P)， 一个反映单个细胞的定向移动中的明显变化之间的平均时间的参数，有统 计学意义的相关性。
图5显示表达NCAM的成纤维细胞与对照成纤维细胞相比移动的更快 (275％)，其反映为NCAM阳性成纤维细胞与不表达NCAM的成纤维细胞 相比具有更高的扩散比率(R)。
用HBP处理表达NCAM的成纤维细胞和对照成纤维细胞都导致细胞运 动性的明显抑制，其反映为R，Sτ和LI的显著降低。肽M(SEQ ID NO：2) 对成纤维细胞的运动行为具有抑制效果，其类似于HBP的效果。这些结果 表明HBP抑制成纤维细胞的运动不依赖于NCAM表达，并且可能不依赖于 肝素结合。后者支持NCAM HBP的神经突向外生长刺激活性含有硫酸乙酰 肝素不敏感成分的推测。
实施例4本发明肽序列的分析
图6显示本发明肽序列(SEQ ID NO：1-7中所示)和本领域中已有记载 的NCAM HBD片段的比较分析结果。从图中显示1)本发明的肽片段，即 HBP，M，M1n，M3n，M4，M5和M6，是神经突向外生长的非常有效的刺激物 (与对照(未处理)神经元相比，在体外用本发明肽处理神经元导致对神 经突向外生长超过400％的刺激作用)，但是本领域已知的NCAM HBD片段 的刺激作用效力比本发明肽差很多(已报道的刺激作用效力低于50％)。有 趣的是，据报道对于NCAM HBP的生物学活性很重要的氨基酸残基的突变 不会影响突变肽的活性，因此表明所述肽序列中存在负责它们的生物学活 性，如刺激神经突向外生长和细胞运动性的另一结构。比较本发明NCAM HBD的14个氨基酸的多个肽片段和US2003/0119186的14个氨基酸长的 肽的氨基酸序列显示了本发明所述片段的序列和US2003/0119186肽的序 列之间的本质差别。US2003/0119186中的肽在N端具有两个附加的带负电 荷氨基酸残基，在C端缺少两个疏水残基。另一个被报道对神经突向外生 长具有刺激效果的序列(Kallapur等人，1992)(见图6)为18个氨基酸长，并 且既含有C端疏水残基又含有附加的碱性残基。该序列与本申请的序列相 比刺激效力低得多。
考虑了上述分析和所述肽序列对神经突向外生长的刺激效果的阈值， 其比得上公知为神经细胞分化和神经突向外生长的主要刺激物的神经营养 蛋白的效果，本发明的作者比较了本发明肽序列和神经营养蛋白，特别是 NGF，NT-3，NT-4/5和BDNF的序列，从而鉴定出了新的神经营养蛋白受体 Trk结合基序。
神经营养蛋白结合和活化两种类型的受体：p75NTR受体(其激活与诱导 神经元的细胞凋亡有关)以及Trk家族的受体(其活化与促进神经突向外生 长有关)。令人惊奇的是，本发明的肽序列显示与位于所述蛋白的β-发夹环 1中的NGF序列片段具有非常高的同源性，所述蛋白含有氨基酸基序 TDIKGKE，据报道其对于NGF与受体p75NTR的结合是至关重要的(Williams 等人，J Biol Chem 280：5862-69，2005；Ibanez et al.，Cell 69：329-341，1992；He and Garcia，Science 304：870-875，2004)，但是本发明的肽序列不包含氨基酸 基序RGE，据报道该基序对于Trk受体的结合和活化是很重要的(Williams 等人，J Biol Chem 280：5862-69，2005；W02005025514)。
然而，本发明的作者在本文中显示HBP肽与TrkB受体直接结合，并 要求保护上面详细描述的新的Trk受体结合氨基酸基序。本申请公开的氨基 酸基序指向本发明的肽序列的氨基酸残基，其对于它们的神经突发生活性 是至关重要的。因此，缺乏重要的C端疏水残基的US2003/0119186的 NCAM HBD肽的序列不能刺激神经突向外生长至与本发明的肽序列相同的 程度。从另一方面，N端的负电荷残基似乎不是与Trk受体的结合所必需的， 如同相应的序列形式BDNF(本申请的SEQ ID NO：11)，其是Trk B受体的天 然配体，即不具有这些残基。后者可以解释含有这些残基的NCAM HBP的 序列(Kallapur等人，1992)对神经突向外生长的降低的效果。
因此，本发明的作者在本文中鉴定和要求保护肽序列的结构式，其对 于结合Trk受体导致受体活化是最有效的。
实施例5 NCAM HBP与Trk B受体的结合
如先前已记载的(Kiselyov等人，Biol.Chem.272，10125-10134，1997)在酵 母P.pastoris表达系统(Invitrogen，USA)中制备重组的NCAM的Ig2组件 (module)。重组的Trk B受体从RDsystems(USA)购得。
使用BlAcoreX仪器(Biosensor AB)在25℃用10mM磷酸钠pH7.4，150 mM NaCl作为电泳缓冲液进行结合分析。流速为5μl/min。使用制造商提供 的软件通过非线性曲线拟合分析数据。如下使用胺连接试剂盒(Biosensor AB) 在传感芯片CM5上固定HBP或NCAM的重组Ig2组件：1)通过20μl活 化溶液激活传感片的两部分(表示为Fc1和Fc2)；2)将所述蛋白固定在 Fc1上，其使用12μl的10mM磷酸钠缓冲液pH6.0中的20μg/ml蛋白；3) 通过35μl的阻断溶液阻断Fc1和Fc2。Trk B和固定的HBP或NCAM的Ig 组件II的结合如下进行研究：Trk B被同时注入Fc1(具有固定的HBP或 NCAM的Ig组件II)和Fc2(不具有任何固定物)。
从显示Trk B与固定的蛋白(HBP或NCAM的Ig2组件)和Fc1表面 结合的曲线中减去显示化合物与Fc2表面的非特异性结合的曲线。在图7 中显示获得的表明所记录的结合的曲线。HBP NCAM作为分离的肽序列和 NCAM的Ig2组件的完整序列，分别以KD～10-8-10-7M和KD～10-9-10-8M与 Trk B受体结合。
序列表
<110>恩卡姆医药公司(ENKAM Pharmaceuticals A/S)
<120>肝素结合肽
<130>P947PC00
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP NCAM
<400>1
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Lys Lys Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M)
<400>2
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Ala Lys Asp Val Arg Val Ile
1 5 10
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M1n)
<400>3
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M3n)
<400>4
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Gln Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M4)
<400>5
Ala Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M5)
<400>6
Asn Gly Arg Asp Val Ile Leu Lys Lys Asp Val Leu Phe Ile
1 5 10
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M6)
<400>7
Asn Gly Leu Asp Val Ile Leu Ile Ile Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NGF片段
<400>8
Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn
1 5 10
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NT-3片段
<400>9
Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly
1 5 10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NT-4/5片段
<400>10
Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala
1 5 10
<210>11
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BDNF片段
<400>11
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser
1 5 10
神经细胞粘着分子NCAM是首个被发现的神经CAM。自发现以来， NCAM已经被透彻的研究并且现在已经被很好的表征(Ronn等人(2000)Int J Dev Neurosci 18：193-9)。NCAM属于免疫球蛋白(Ig)超家族。其胞外部 分由五个Ig样和两个纤连蛋白III型(F3)组件组成。NCAM帮助细胞-细 胞和细胞-基质两种相互作用。NCAM结合各种胞外基质组分，诸如肝素/ 硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、硫酸软骨素蛋白聚糖和不同类型的胶原。 细胞-细胞相互作用通常由NCAM同嗜性相互作用辅助。据显示NCAM的 不同组件行使不同的功能。因此，NCAM同嗜性结合现在被认为依赖于前 三个Ig组件。肝素结合序列位于Ig2组件。NCAM也结合神经细胞粘着分 子L1。此相互作用被认为发生在NCAM的第四个Ig组件和L1上所表达的 低聚甘露糖苷部分之间。据显示NCAM的两个近膜F3组件涉及成纤维细 胞生长因子受体(FGFR)结合。
已经鉴定了NCAM上涉及不同蛋白质相互作用的许多结合位点，并且 包含不同结合位点序列的许多NCAM序列短片段被提议作为生物学活性化 合物用于治疗性应用(Berezin v.，Bock E.(2004)J Mol Neurosci.22(1-2)： 33-39)。许多这些NCAM肽片段源自同嗜性NCAM结合位点，并因此能用 于刺激表达NCAM的细胞。
FGFR是已经详细描述的NCAM的异嗜性结合伴侣之一。因此，NCAM 被认为是FGFR的一类新的假定可选配体的成员，而且最近获得了NCAM 和受体之间直接相互作用的证据(Kiselyov等人(2003)Structure(Camb)11： 691-701)。具有涉及NCAM和FGFR之间直接相互作用的序列 EVYVVAENQQGKSKA(FGL肽)的已鉴定NCAM片段最近被提议作为治 疗下述多种病理紊乱的新候选化合物，其中刺激FGFR活性可能起关键作 用(WO03/016351)。有趣的是，据显示导致刺激神经突向外生长的同嗜性 NCAM相互作用也部分涉及FGFR的刺激(Soroka等人(2002)J Biol Chem. 277(27)：24676-83)。
另一类被描述为NCAM配体/受体的分子是硫酸乙酰肝素和硫酸软骨 素蛋白聚糖(分别为HSPG和CSPG)(Cole等人(1985)J Cell Biol.100(4)： 1192-9；Cole等人(1986)Nature 320：445-7；Cole，G.J.，Akeson，R.(1989) Neuron2(2)：1157-65)。多种HSPG和CSPG能与脑中影响细胞粘着的NCAM 相互作用。因此，在细胞表面上表达的NCAM具有结合HSPG聚集蛋白从 而介导细胞粘着的能力(Storms等人(1996)Cell Adhes Commun.3(6)： 497-509)，并且据显示脑特异性CSPG神经聚糖与NCAM结合从而抑制其 同嗜性相互作用及后续神经元粘着(Retzler等人(1996)J Biol Chem. 271(44)：27304-10)。在用作细胞生长基质时，据显示包含源自NCAM，在 Ig2 NCAM组件中鉴定的推定肝素结合域(HBD)之氨基酸序列的不同合成 肽促进NCAM表达细胞的粘着，并且能够调节神经突向外生长的刺激(Cole， G.J.，Akeson，R.(1989)Neuron 2(2)：1157-65；Kallapur S.G.，Akeson R.J. (1992)J Neurosci Res.33(4)：538-48)。最近，源自NCAM HBD域，涵盖 NCAM的氨基酸残基152-165的14个氨基酸的序列(SwissProt P13596)被 提议作为纤维蛋白3D基质凝胶的融合组分以增强掺入该凝胶的神经元的 神经突向外生长(US2003/0119186)。包含残基149-166的另一种NCAM HBD片段被提议作为NCAM介导的粘着的抑制剂(US6,333,307)，然而后 一种片段的生物学活性并没有被证明。
包含序列IWKHKGRDVILKKDVRFI的NCAM的HBD含有两组碱性 氨基酸，其被证明对于NCAM结合肝素的能力以及对于NCAM同嗜性粘着 是至关重要的。已显示这些碱性氨基酸残基的突变影响该结构域的生物学 活性(Kallapur S.G.，Akeson R.J.(1992)J Neurosci Res.33(4)：538-48；Cole，G. J.，Akeson，R.(1989)Neuron 2(2)：1157-65)。
发明概述
根据本发明：
1)NCAM肝素结合域(HBD)的肽片段，其对应于包含NCAM的氨 基酸残基154-167的序列(SwissProt P13596)，在本文中称为肝素结合肽 (HBP)，具有很高的神经突发生活性(neuritogenic activity)；
2)HBP突变体，其中已知对于肽的生物学活性重要的碱性氨基酸残基 被其它氨基酸残基替代，也能够与HBP的未突变序列同样程度的刺激神经 突向外生长；
3)HBP和HBP突变体的神经突发生活性不依赖于i)NCAM-NCAM 结合，ii)FGFR-NCAM结合，和iii)HSPG-或GSPG-NCAM结合；
4)本发明的肽片段能够调控细胞运动性；
5)本发明的肽片段是既作为细胞生长基质的固定组分又作为细胞生长 培养基的可溶组分的活性化合物；
6)本发明的肽片段包含在神经营养蛋白中发现的氨基酸基序；
7)本发明的肽片段能够结合Trk家族的神经营养蛋白受体。
因此，本发明的一个方面涉及肽，其为6到13个氨基酸残基的分离连 续序列，所述序列包含氨基酸基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L
其中
xa为任意氨基酸残基，
xb为I、T、M或E。
包含依照本发明上述基序的分离的肽序列能够i)结合Trk家族受体的 神经营养蛋白受体；ii)刺激神经突向外生长；iii)调控细胞运动性；iv) 刺激神经细胞存活；v)刺激神经细胞分化；和/或vi)刺激与学习和记忆有 关的神经可塑性。
因此，本发明的另一方面涉及使用本发明的肽序列和/或包含所述序列 的化合物来制备用于治疗下述病症或疾病的药物，其中i)刺激神经突向外 生长；ii)调控细胞运动性；iii)刺激神经细胞存活；iv)刺激神经细胞分 化；v)刺激神经可塑性；vi)调控Trk家族的神经营养蛋白受体的活性是 所述治疗的一部分。
还有，在另一方面，本发明的肽序列或包含所述序列的化合物可用于 生产抗体。
本发明还涉及包含本发明的肽序列的化合物以及包含所述肽序列和/或 所述化合物的药用组合物。包含能够识别包含本发明基序的表位的抗体的 药用组合物也在本发明范围内。
本发明还涉及治疗下述病症的方法，其中刺激神经突向外生长、调控 细胞运动性、刺激神经细胞存活、刺激神经细胞分化、刺激神经可塑性、 和/或调控Trk家族受体的神经营养蛋白受体的活性是有益的，所述方法包 括对有所需要的个体施用本发明的肽序列、本发明的化合物、本发明的抗 体或包含所述肽序列、所述化合物或所述抗体的药用组合物的步骤。
附图说明
图1显示了表达NCAM的成纤维细胞与不表达NCAM的对照成纤维细 胞相比明显促进大鼠小脑粒状神经元(cerebella granular neuron)(CGN)的神 经突向外生长，而且HBP(SEQ ID NO：1)以剂量依赖性方式增加在表达 NCAM的成纤维细胞上以及在不表达NCAM的成纤维细胞上生长的CGN 的神经突向外生长。相反，肽M不影响在表达NCAM的成纤维细胞上生长 的CGN的神经突向外生长应答，但它仍然刺激在不表达NCAM的成纤维 细胞上生长的CGN的神经突向外生长。
图2表明了用SU5402，一种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的抑 制剂，进行处理没有阻断HBP(SEQ ID NO：1)对在不表达NCAM的单层 成纤维细胞上生长的CGN的神经突发生效果，而且仅仅部分抑制在表达 NCAM的成纤维细胞单层上生长的CGN的NCAM介导神经突向外生长， 但是在不存在HBP的情况下SU5402阻断NCAM介导的神经突向外生长。
图3表明了在存在或不存在肝素酶III的情况下，HBP(SEQ ID NO：1) 和M肽(SEQ ID NO：2)对单个CGN的影响，已知该酶主要将硫酸乙酰肝 素特异性裂解为二糖。
图4表明了在存在和不存在肝素酶III的情况下，肽HBP(SEQ ID NO： 1)、M(SEQ ID NO：2)、Mln(SEQ ID NO：3)和M3n(SEQ ID NO：4)的 神经突发生效果。
图5表明了用HBP(SEQ ID NO：1)和M肽(SEQ ID NO：2)处理表 达NCAM的成纤维细胞和不表达NCAM的对照成纤维细胞都导致对细胞 运动性的明显抑制，其反映为细胞的扩散速率(R)、平均细胞速度(Sτ) 和运动指数(LI)的显著降低。
图6显示了NCAM HBD的不同肽片段的分析结果。
图7表明了HBP(SEQ ID NO：1)(A)和NCAM的重组Ig2组件(B) 与重组的Trk B受体的结合。
发明详述
1、肽序列
本发明的第一个方面涉及由6到13个氨基酸残基组成的分离的连续肽 序列，其含有氨基酸基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L
其中
xa为任意氨基酸残基，
xb为I、T、M或E。
在一个实施方案中，xa可以为碱性氨基酸残基。一些优选的实施方案涉 及xa为K，其它优选的实施方案涉及xa为R，并且还有其它优选的实施方 案涉及xa为H。
在另一个实施方案中xa可以为L，并且还有另一个实施方案中xa可以 为G。
因此，本发明涉及至少6个氨基酸的肽序列，其互相连续(contiguous) 并且含有上述基序，所述肽序列为分离的肽序列。这表明本发明涉及作为 单独的化学个体存在并且作为单独的化学个体用于本发明的目的的肽序 列。本发明不涉及下列含有本发明基序的肽序列，该肽序列1)为14个或 更多氨基酸残基的分离的肽序列，例如US2003/0119186的双结构域肽 (bi-domain peptides)，如含有共同融合在序列 LNEQVSPKHKGRDVILKKDVR中的抗凝血酶III的肽片段和NCAM HBD 片段的双结构域肽；2)为天然或重组多肽的完整序列，例如如神经细胞 粘附分子(NCAM)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营 养蛋白-4/5(NT-4/5)或脑衍生的神经营养因子(BDNF)的超过14个氨基酸长 的多肽或片段，3)为任何类型3D结构的完整部分，例如纤维蛋白或胶原 蛋白凝胶。
更具体地，本发明涉及可以通过结构式(I)定义的分离的连续肽序列
x0-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x9-x9-x10-x11-x12-x13
其中
x0为K、R、N、A或键
x1为G，
x2为碱性或疏水氨基酸残基，
x3为E或D，
x4为V，
x5为疏水氨基酸残基，
x6为V或L，
x7为任意氨基酸残基，
x8为任意氨基酸残基，
x9为E、D、K或Q，
x10为V或L，
x11为任意氨基酸残基，
x12为疏水氨基酸残基或T，
x13为I、N、S、G、A或键。
在一些实施方案中残基x0可以为选自K、R、N、A的氨基酸残基。在 其它实施方案中符合该结构式的分离的肽序列可以不具有残基x0。在这种 情况下序列的第一个残基为x1。当所述序列为下述化合物的一部分时，x0 可以为键。
根据一个优选的实施方案，x3可以选自Q、N或T。根据另一个优选的 实施方案，x5可以选自T或E。其它优选的实施方案涉及其中x7和x8独立 地选自K、R、N、I、L、G、E或A的肽序列。在一些优选的实施方案中 x7为L，在其它优选的实施方案中x8可以为G或E。不同的优选实施方案 可以涉及其中x11选自R、K、L、N或P并且x12为选自F、V、I、T或A 的疏水氨基酸残基的序列。x13可以选自氨基酸残基I、N、S、G或A，或 者当所述序列为下述化合物的一部分时可以为键。当x0和/或x13为键时也 存在一些优选的实施方案。
此外，一些本发明的优选实施方案涉及可以通过结构式(II)定义的序 列
x0-G-x2-D/E-V-I-L-x7-x8-x9-V-x11-x12-x13
其中
x0为选自K、R、A或N的氨基酸残基，
x2为选自R或L的氨基酸残基，
x7为选自K、A、N或L的氨基酸残基，
x8为选自K、N或L的氨基酸残基，
x9为选自D或Q的氨基酸残基，
x11为选自R或L的氨基酸残基，
x12为选自V或F的氨基酸残基，
x13为选自I、L或V的氨基酸残基。
本发明其它的优选实施方案可以涉及可以通过结构式(III)定义的序 列
x0-G-x2-x3-V-x5-V-L-G/E-x9-V/L-x10-x11-x12-x13
其中
x0，x2，x3，x5，x9，x10如上述结构式(I)所定义
x11为N、K或P，
x12为I、T、A或V，和
x13为S、A、N或G。
不同的优选实施方案可以包含其中x3为Q并且x11选自R、N、P或L 的序列。
独立于上述不同的实施方案，符合结构式I、II和III的肽序列都含有 本发明的基序。在肽序列中存在确定的结构，例如特定的氨基酸基序，经 常是一组不同肽序列的共同的生物学活性的必要条件。根据本发明，上述 基序是本发明序列的生物学活性所必需的。
本发明在此确定了一组含有上述基序的肽序列，其相应于结构式I、II 或III，并且在此证明了这些序列的共同的生物学活性，其与序列的所述共 有的结构特征(基序)有关。该组由下列序列组成：
KGRDVILKKDVRFI(SEQ ID NO：1)，
KGRDVILAKDVRVI(SEQ ID NO：2)，
KGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：3)，
KGRDVILNNQVRFI(SEQ ID NO：4)，
AGRDVILNNDVRFI(SEQ ID NO：5)，
NGRDVILKKDVLFI(SEQ ID NO：6)，
NGLDVILIIDVRFI(SEQ ID NO：7)，
KGKEVMVLGEVNIN(SEQ ID NO：8)，
RGHQVTVLGEIKTG(SEQ ID NO：9)，
RGREVEVLGEVPAA(SEQ ID NO：10)和
SGGTVTVLEKVPVS(SEQ ID NO：11)。
可以理解上面所列的序列表示所述序列的非限制性实例，其含有本发 明的基序和/或结构式II或结构式III的基序并具有至少一个与所述肽序列 的结构中存在的基序有关的共同生物学活性。与上述结构特征有关的生物 学活性可以选自但不限于刺激细胞分化、记忆和学习、神经细胞存活、活 化神经营养蛋白受体或调控细胞运动性的能力。
含有基序G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L，其中xa为任意氨基酸残基，xb为I、 T、M或E的本发明的分离的肽序列含有6到13个氨基酸残基。然而，如 果所述序列符合上述结构式I、II或III，它可以为14个氨基酸残基的序列， 例如如序列SEQ ID NOs.1-11。本发明还包括符合结构式I-III的序列的片 段，特别是SEQ ID NOs：1-11的序列的片段，和含有所述片段的6-13个氨 基酸残基长的任意肽序列。因此，本发明的片段可以为12、11、10、9、8、 7或6个氨基酸残基长。含有上述定义的任意结构式基序的片段是本发明的 优选片段。但是，一些实施方案可以更优选的涉及含有结构式II基序 G-x2-D/E-V-I-L的片段，其中x2为R或L，然而其它实施方案可以更优选的 涉及含有结构式III基序V-L-G/E-x9-V/L的片段，其中x9为E、D、K或Q。
本发明还涉及上述序列的变体和同源物(homologue)，其具有所述序列 的至少某些生物学活性。优选地，该变体和同源物含有上述氨基酸基序， 即
i)本发明的基序：G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L，其中xa为任意氨基酸残基， 且xb为I、T、M或E，
ii)结构式II的基序：G-x2-D/E-V-I-L，其中x2为R或L，或者
iii)结构式III的基序：V-L-G/E-x9-V/L，其中X9为E、D、K或Q。
在本申请中，应用氨基酸残基的标准单字母代码和标准三字母代码。 氨基酸的缩写与Biochemical Nomenclature Eur.J.Biochem，1984，vol.184，pp 9-37上IUPAC-IUB Joint Commission中的建议一致。在说明书和权利要求书 中，使用三字母代码或单字母代码。当没有特别说明L或D形式时，应理 解所指的氨基酸具有天然的L形式，cf.Pure&Appl.Chem.Vol.(56(5)pp 595-624(1984)或D形式，因此形成的肽可以由L形、D形的氨基酸或混合 L形和D形的序列构成。
当没有特别说明时，应当理解本发明的肽的C端氨基酸是作为游离的 羧酸存在，这也可以表示为“-OH”。然而，本发明化合物的C端氨基酸可以 为酰胺化衍生物，其表示为“-NH2”。当没有其它规定时，多肽的N端氨基 酸含有游离的氨基，这也可以表示为“H-”。
当没有其它特别说明时，氨基酸可以选自任意氨基酸，无论是否为天 然的，例如α氨基酸、β氨基酸和/或γ氨基酸。因此，该组包括但不限于： Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu， Lys，Arg，His Aib，Nal，Sar，Orn，赖氨酸类似物，DAP，DAPA和4Hyp。
同样，根据本发明可以进行化合物/肽的修饰，例如氨基酸的糖基化和/ 或乙酰化。
根据本发明的碱性氨基酸残基意指氨基酸Arg、Lys和His的残基，酸 性氨基酸残基-氨基酸Glu和Asp的残基，疏水氨基酸残基-氨基酸Leu、Ile、 Val、Phe、Trp、Tyr和Ala的残基，带电的氨基酸残基-氨基酸Arg、Lys、 Glu和Asp的残基。
如上所示，本发明涉及上述肽序列的片段、变体和同源物。在本文的 上下文中
i)片段为具有符合结构式I、II或III定义序列的序列或选自序列SEQ ID NOs：1-11的序列的至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优 选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％长度的 序列；
ii)变体为与结构式I、II或III定义的序列或选自序列SEQ ID NOs： 1-11的序列具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至 少90％，更优选95％同一性的氨基酸序列，或者为与结构式I、II或III定 义的序列或选自SEQ ID NOs：1-11的序列相比具有至少60％，更优选至少 70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选95％正氨基酸匹配(positive amino acid matehes)的氨基酸序列。本文中定义正氨基酸匹配为通过在两个 进行比较的序列中相同位置的氨基酸的物理和/或化学性质定义的同一性或 相似性。本发明优选的正氨基酸匹配为K对R，E对D，L对M，Q对E， I对V，I对L，A对S，Y对W，K对Q，S对T，N对S和Q对R。定义 一个氨基酸序列与另一个氨基酸的同源性为两个进行比较的序列中相同的 氨基酸的百分比。可以使用公知的算法，例如BLOSUM30，BLOSUM40， BLOSUM45，BLOSUM50，BLOSUM55，BLOSUM60，BLOSUM62， BLOSUM65，BLOSUM70，BLOSUM75，BLOSUM80，BLOSUM85或 BLOSUM90计算序列的同源性；
iii)同源物为与结构式I、II或II定义的序列或选自SEQ ID NOs：1-11 的序列具有低于60％但高于30％，如50-59％，例如55％，如40-49％，例 如45％，如30-39％，例如35％同源性的氨基酸序列。
推测上述片段、变体或同源物保留了原始序列的至少某些生物学活性， 如刺激神经可塑性的能力，例如与神经细胞分化有关和/或与记忆和学习有 关的神经可塑性的能力、刺激细胞存活的能力，例如抑制凋亡的能力、活 化神经营养蛋白受体的能力，例如活化Trk受体的能力、调控细胞运动性的 能力，例如抑制细胞运动性的能力。
根据本发明，上述含有本发明基序和/或结构式II或结构式III基序的序 列源自SwissProt Acc.No：P13596的神经细胞粘附分子(NCAM)的序列， 例如来自NCAM的Ig2组件的序列。该序列的一个例子可以为序列 KGRDVILKKDVRFI，其在本文中被定义为SEQ ID N0：1。该序列为NCAM 的Ig组件的肝素结合区域的一部分。在另一个实施方案中，序列可以源自 神经营养蛋白，如神经生长因子(NGF)，例如来自SwissProt Acc.No： NP_02497所示的NGF多肽的序列、神经蛋白-3(NT-3)，例如来自SwissProt Acc.No：NP_002518所示的NT-3多肽的序列、神经蛋白-4/5(NT-4/5)，例 如来自SwissProt Acc.No：AAAV38176所示的NT-4/5多肽的序列、或脑衍 生的神经营养因子(BDNF)，例如来自SwissProt Acc.No：NP_733928所示 的BDNF多肽的序列。根据本发明，序列KGKEVMVLGEVNIN(SEQ ID NO： 8)源自上述NGF多肽，序列RGHQVTVLGEIKTG(SEQ ID NO：9)源自上述 NT-3多肽，序列RGREVEVLGEVPAA(SEQ ID NO：10)源自上述NT-4/5多 肽，序列SGGTVTVLEKVPVS(SEQ ID NO：11)源自上述BDNF多肽。
根据本发明，上述分离的肽序列可以被制成化合物，
化合物可以含有单拷贝的选自上述任一的单独的氨基酸序列，或者它 可以含有两个或更多拷贝的该氨基酸序列。这表明本发明的化合物可以被 制成肽序列的单体，例如含有单个单独的肽序列，或者它可以被制成肽序 列的多聚体，即含有两个或更多单独的肽序列，其中所述单独的肽序列表 市两个或更多拷贝的相同序列或两个或更多不同的单独肽序列。多聚体也 可以含有全长序列和一个或多个其片段的组合。在一个实施方案中，化合 物可以含有两个氨基酸序列，本文中定义该化合物为二聚体，在另一个实 施方案中，化合物可以含有超过两个氨基酸序列，例如三个、四个或更多 序列。本发明优选涉及含有两个或四个本发明肽序列的化合物。但是，含 有3、5、6、7、8或更多序列的化合物也在本发明的范围内。
制成二聚体或多聚体的肽片段可以具有相同的氨基酸序列，或者它们 具有不同的氨基酸序列。一个该化合物的实例可以为含有SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2的化合物。另一个实例可以为含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8的化合物。依据本发明的不同实施方案可以制备本发明序列的任意其 它组合。所述序列可以通过肽键相互连接；或者通过连接分子或基团 (grouping)相互连接。在另一个实施例中，化合物可以含有序列的两个或 更多相同的拷贝，例如选自SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10和11的序列 的两个拷贝，其中所述两个序列可以通过连接分子或基团相互连接。优选 所述序列通过连接基团连接的化合物。该连接基团的一个实例可以为非手 性二、三或四羧酸。本发明的说明书中进一步详细讨论了合适的非手性二、 三或四羧酸和生产该化合物的方法(配体呈递组装方法(LPA))。可能的连 接体的另一个实例可以为氨基酸赖氨酸。单独的肽序列可以被连接到核心 分子如赖氨酸从而形成单独的肽序列的树状多聚体(树状体(dendrimer))。 树状体的制备是本领域公知的(PCT/US90/02039，Lu等人，(1991)Mol Immunol.28：623-630；Defoort等人，(1992)Int J Pept Prot Res.40：214-221； Drijfhout等人(1991)Int J Pept Prot Res.37：27-32)，并且现在树状体被广泛 的应用于研究和医疗应用中。本发明优选的实施方案为提供含有连接到赖 氨酸核心分子的四个单独氨基酸序列的树状化合物。还优选四个单独氨基 酸序列的至少一个含有上面定义的结构式的氨基酸序列。甚至更优选树状 化合物的全部四个单独氨基酸序列独立地含有上面定义的结构式的氨基酸 序列。
本发明的多聚体化合物，例如LPA二聚体或赖氨酸树状体是本发明的 优选化合物。但是，依据实施方案可以优选其它类型的含有两个或更多本 发明单独序列的多聚体化合物。
含有一个或更多拷贝的本发明的单独序列或其片段、变体或同源物， 以及另一生物学活性化合物，例如另一肽序列的多聚体化合物也在本发明 的范围内。在这些化合物中，最优选的那些含有至少一个本发明的肽序列， 并且进一步含有其它任意具有刺激Trk家族的神经营养蛋白受体能力的化 学个体，例如所述化学个体可以为源自Trk受体配体或Trk受体活化蛋白的 肽序列，其中该序列不同于本发明的序列。
2、生物学活性
本发明的肽序列和包含本发明序列的化合物具有生物学活性。本发明 优选涉及选自下组的生物学活性：刺激与神经细胞分化有关的神经可塑性， 诸如例如刺激神经突向外生长，和/或与记忆和学习有关的神经可塑性，诸 如例如刺激突触效力的能力，刺激细胞存活，诸如例如抑制凋亡的能力， 活化神经营养蛋白受体，诸如例如活化Trk受体的能力，和调控细胞运动性， 诸如例如抑制细胞运动性的能力。
因而，在一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合选自TrkA、Trk B和Trk C的神经营养蛋白受体。在一个优选的实施方案中，受体可以为 Trk A；在另一个优选的实施方案中，受体可以为Trk B；在又一个优选的实 施方案中，受体可以为Trk C。
本发明的作者鉴定了既存在于神经营养蛋白(NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF)中又存在于NCAM中的氨基酸基序，并且将该基序的存在与本发 明肽片段的生物学活性联系起来。依照本发明的基序是本发明的肽序列与 Trk受体，特别是与Trk B的结合所必需的。Trk受体是神经系统中驱动神 经细胞分化的主要受体。Trk受体对于促进神经元存活也是重要的，并且涉 及与学习和记忆有关的神经可塑性，特别是Trk B受体。本发明肽序列结合 和活化受体的能力适于调控依赖于受体活性的生物学应答。因此，本发明 提供了调控Trk家族的神经营养蛋白受体的活性的方法，其包括使用本发明 的分离的肽序列或包含所述序列的化合物。在优选的实施方案中，本发明 涉及活化Trk家族的神经营养蛋白受体的方法。
本发明的分离的肽序列能够刺激神经元细胞分化。术语“神经元分化” 应理解为既为神经前体细胞或神经干细胞的分化，又为神经元的分化，诸 如已分化神经元的成熟。该分化的实例可以是从未成熟神经元的神经突向 外生长、神经突的分枝、神经元再生。在一个优选的实施方案中，本发明 可涉及刺激神经前体/干细胞或未成熟神经元的分化；在另一个优选的实施 方案中，本发明可涉及刺激从成熟神经元，例如受损但存活的神经元的神 经突向外生长。因而，本发明还提供了刺激神经元细胞分化的方法，其包 括使用本发明的肽序列或包含所述序列的化合物。
本发明的一个最优选实施方案涉及与学习和记忆有关的肽序列的活 性。具体而言，在本发明的一个实施方案中，肽序列可刺激棘(突)形成(spine formation)；在另一个实施方案中，序列可促进突触效力。因而，本发明还 提供了刺激记忆和/或学习的方法，其包括使用本发明的肽序列和/或包含所 述序列的化合物。本发明既涉及短期记忆又涉及长期记忆。
本发明的肽序列还可刺激神经元细胞存活。本发明涉及刺激具有损伤 和变性疾病的神经元细胞存活的能力。因此，本发明提供了通过使用本发 明的肽序列和/或包含所述序列的化合物来刺激细胞存活，优选神经元细胞 存活的方法。
在又一个实施方案中，本发明的肽序列可调控细胞运动性。术语“调控 细胞运动性”既包括刺激又包括抑制细胞运动性。优选导致抑制细胞运动性 的肽序列的活性。因而，通过使用本发明的肽序列或包含所述序列的化合 物来调控细胞运动性，特别是抑制细胞运动性的方法也在本发明提供的调 控细胞和生理活动的方法之中。
本发明的肽序列和包含它们的化合物有作为细胞生长培养基的可溶/流 动物质和作为细胞生长培养基的固定物质的生物学活性。在一些实施方案 中，可优选使用肽物质或包含它们的化合物作为细胞基质。但是，最优选 可溶性肽序列或包含它们的化合物。
本申请中描述了本发明的肽序列和包含它们的化合物的生物学活性的 非限制性实例(见下述及实施例2、3和5)。
刺激神经突向外生长
具有潜力促进神经突向外生长和刺激神经元细胞再生和/或分化的物 质，诸如某些内源营养因子，是搜寻促进例如神经元再生和其它形式神经 元可塑性的化合物中的首要目标。为了评估现有化合物的潜力，可以调查 刺激神经突向外生长相关信号、干扰细胞粘着、刺激神经突向外生长、神 经再生的能力。据显示本发明的化合物促进神经突向外生长，并因此被认 为是神经元连接再生及由此损伤后功能修复的优良促进物，以及需要该效 果的其它病症中神经元功能的促进物。
在本文中，“分化”涉及神经元成熟和神经突延伸的过程，其发生在所述 神经元最后的细胞分裂之后。本发明的化合物可能能够终止神经细胞分裂 和开始所述细胞的成熟，诸如开始神经突的延伸。另外，“分化”涉及神经元 前体细胞、未成熟神经细胞或胚胎干细胞中导致具有正常神经元细胞功能 特征的细胞形成的遗传学、生物化学、形态学和生理学转化过程的开始， 所述特征如本领域所定义的。本发明将“未成熟神经细胞”定义为具有至少一 项本领域中接受作为神经细胞典型特征的特征的细胞。
依照本发明，包含至少一种上述肽序列的化合物能够刺激神经突向外 生长。本发明涉及神经突向外生长的改善/刺激，诸如在对照/未刺激细胞的 神经突向外生长值上约75％的改善/刺激，例如50％，诸如约150％，例如 100％，诸如约250％，例如200％，诸如约350％，例如300％，诸如约450％， 例如400％，诸如约500％。
候选化合物刺激神经突向外生长的能力的评估可以通过使用任何已知 的用于评估神经突向外生长的方法或测定法来进行，诸如例如本申请实施 例2中所描述的。
依照本发明，化合物在作为细胞生长基质的不溶性固定组分和作为细 胞生长培养基的可溶性组分时都具有神经突发生活性。在本文中，“固定的” 表示化合物结合/粘附于在水或水溶液中不可溶的物质上，从而它在该溶液 中也成为不可溶的。对于药物应用，不可溶和可溶的化合物都可以在应用 中被考虑，然而可溶性化合物是优选的。“可溶性化合物”理解为在水或水溶 液中可溶的化合物。
细胞运动性的抑制
细胞迁移是神经系统的发育、创伤愈合和肿瘤侵袭期间所必需的。神 经系统的正确形成和正常功能都需要多数神经元贯穿发育中的神经系统从 它们的原始位点迁移至它们的最终位置。
一些类型的细胞在成熟生物体中也保持了移动的能力，但是其它的类 型失去了它。在一些极端的情况中，诸如在疾病或损伤中，细胞移动的能 力可规定疾病的救助或死亡的开始，例如伤口愈合或癌细胞侵袭和转移。 因此，具有潜力调控细胞运动性的物质，诸如某些内源营养因子是搜寻例 如促进损伤恢复、防止癌细胞散播或抑制炎症扩散的化合物中的首要目标。 为了评估现有化合物的潜力，可以调查调控涉及细胞运动性的信号、干扰 细胞粘着、刺激或抑制细胞运动性的能力。本发明的化合物能够抑制细胞 运动性，因此被认为是抑制例如癌细胞侵袭和散播以及在需要该抑制的病 症中抑制任何类型的细胞侵袭的优良候选化合物。
依照本发明，包含至少一种上述序列的化合物能够抑制细胞运动性。 本发明涉及细胞运动性的抑制，在与对照细胞运动性相比时估计其为约 75％，例如约50％，诸如150％，例如约100％，诸如约250％，例如约200％， 诸如约350％，例如约300％，诸如约450％，例如约400％，诸如例如约500％。 术语“运动性”在本文中定义为在一定时间段中细胞从其所在的地方向另一 个地方的转移，而且在本申请中将细胞运动性估算为对应于细胞起始和最 终位置的两点之间的欧几里德距离。在考虑细胞运动性和化合物抑制潜力 的量化时，诸如上文提及的抑制或运动的“值”，本发明涉及定义为诸如细胞 的扩散速率(R)、平均细胞速度(Sτ)和运动指数(LI)等参数的“值”。在 后的参数在本领域中常用于量化细胞运动性，由例如Walmod等人(2001) Methods Mol Biol.161：59-83记载，并在下面详细描述。
细胞运动性的分析可通过使用本领域为该目的开发的任何可用的方法 和测定法来进行。例如可以如本申请实施例3中所述进行。
3、肽序列的制备
优选合成制备本发明的化合物。但是也设想了重组制备该化合物。
重组制备
因此，在一个实施方案中，本发明的肽序列可以通过使用重组DNA技 术进行制备。
编码肽或肽所来源的相应全长蛋白质的DNA序列可以通过已经建立的 标准方法，以合成方式制备，例如Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1869描述的磷脒(phosphoamidine)法或Matthes等，1984， EMBO J 3：801-805描述的方法。依照磷脒法，在例如自动DNA合成仪中 合成寡核苷酸，并将其纯化、退火、连接并克隆至合适的载体中。
编码肽的DNA序列也可以通过使用DNA酶I依照标准方案(Sambrook 等人，Molecular cloning：A Laboratory manual，2rd ed.，CSHL Press，Cold Sprin Harbor，NY，1989)对编码肽所来源的相应全长蛋白质的DNA序列进行片段 化来制备。本发明涉及选自上文鉴定的蛋白质的全长蛋白质。或者，编码 本发明全长蛋白质的DNA可以使用特异的限制性内切酶进行片段化。使用 Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory manual，2rd ed，CSHL Press， Cold Spring Harbor，NY，1989描述的标准方案，进一步纯化DNA片段。
编码全长蛋白质的DNA序列也可以是基因组或cDNA来源的，例如通 过制备基因组或cDNA文库并通过使用合成寡核苷酸探针依据标准技术(参 见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2rd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)进行杂交以筛选编码全长蛋白质的全部或部分DNA序 列而获得。也可以使用特异引物通过聚合酶链式反应来制备DNA序列，例 如US4,683,202或Saiki等人，1988，Science 239：487-491中所述。
然后将DNA序列插入重组表达载体，它可以是可以方便的进行重组 DNA流程的任何载体。载体的选择常常取决于其将要引入的宿主细胞。因 此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在且其复制独立 于染色体复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是在引入宿主细胞后整 合到宿主细胞基因组中并与其所整入的染色体一起复制的载体。
在载体中，编码肽或全长蛋白质的DNA序列应可操作连接合适的启动 子序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 其可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码 DNA序列在哺乳动物细胞中转录的合适启动子的实例是SV40启动子 (Subramani等人，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因) 启动子(Palmiter等人，1983，Science 222：809-814)或2型腺病毒主要晚期 启动子。适于在昆虫细胞中使用的启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan 等人，1992，FEBS Lett.311：7-11)。适于在酵母宿主细胞中使用的启动子包 括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，1980，J Biol.Chem.255： 12073-12080；Alber and Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1：419-434)或醇脱 氢酶基因(Young等人，1982，在《Genetic Engineering of Microorganism for Chemicals》中，Hollaender等人编，Plenum Press，纽约)的启动子，或者TPI1 (US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等人，1983，Nature 304：652-654)启 动子。适于在丝状真菌宿主细胞中使用的启动子是例如ADH3启动子 (McKnight等人，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
编码DNA序列也可以可操作连接合适的终止子，诸如人生长激素终止 子(Palmiter等人，前述引文)或者(对于真菌宿主)TPI1(Alber and Kawasaki， 前述引文)或ADH3(McKnight等人，前述引文)终止子。载体还可以包 含诸如多聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或5型腺病毒Elb区)、转录增 强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA 的翻译增强子序列)等元件。
重组表达载体还可以包含使载体能够在所考虑的宿主细胞中复制的 DNA序列。该序列的例子(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复 制起点。载体还可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因， 诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或者赋予药物例如新霉素、潮 霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
用于将编码肽或全长蛋白质的DNA序列与启动子和终止子分别连接起 来的方法，以及用于将它们插入含有复制所需信息的合适载体中的方法是 本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等人，前述引文)。
为了获得本发明的重组肽，有用的是，可以将编码DNA序列与编码第 二种肽的序列和编码蛋白酶切割位点的序列融合，产生编码融合蛋白的 DNA构建物，其中编码蛋白酶切割位点的序列位于HBP片段和编码第二种 肽的DNA之间，并插入重组表达载体中，在重组宿主细胞中表达。在一个 实施方案中，所述第二种肽选自但不限于谷胱苷肽-S-还原酶、小牛胸腺素、 细菌硫氧还蛋白或人泛素的天然或合成变体、或者其肽。在另一个实施方 案中，包含蛋白酶切割位点的肽序列可以是具有氨基酸序列IEGR的因子 Xa的切割位点、具有氨基酸序列DDDDK的肠激酶的切割位点、具有氨基 酸序列LVPR/GS的凝血酶的切割位点、或具有氨基酸序列XKX的水解无色 杆菌(Achromobacter lyticus)的切割位点。
表达载体所引入的宿主细胞可以是能够表达肽或全长蛋白质的任何细 胞，并且优选真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞， 例如光滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和 哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系的例子是HEK293(ATCC CRL-1573)、COS(ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632，ATCC CCL-10) 或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞和表达引入这些细胞 的DNA序列的方法描述于例如Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159，1982， pp.601-621；Southern and Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter 等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等人，1978，Cell 14： 725；Corsaro and Pearson，1981，在《Somatic Cell Genetics 7》中，p.603； Graham and van der Eb，1973，Virol.52：456；及Neumann等人，1982， EMBO J.1：841-845。
或者，可以使用真菌细胞(包括酵母细胞)作为宿主细胞。合适的酵 母细胞的例子包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces spp.)物种的细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。其它真菌细胞的例子是丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)或脉孢霉(Neurospora spp.)物种，特别是米曲霉(Aspergillus oryzae) 或黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。曲霉属物种在蛋白质表达中的应用描述 于例如EP238023。
用于培养细胞的培养基可以是适于哺乳动物细胞生长的任何常规培养 基，诸如含有适当补充物的含血清或无血清培养基，或者是适于昆虫、酵 母或真菌细胞生长的培养基。合适的培养基可以从供应商处获得，或者可 以根据已经公布的配方(例如美国典型培养物保藏中心的目录)制备。
通过细胞重组产生的肽或全长蛋白质然后可以从培养基中利用常规流 程回收，包括通过离心或过滤从培养中分离宿主细胞，利用盐例如硫酸铵 沉淀上清液或滤出液中的蛋白质性质成分，通过各种层析流程例如HPLC、 离子交换层析、亲和层析等纯化。
各肽序列的合成制备
肽的合成制备方法是本领域熟知的。关于制备合成肽的详细描述和实 践意见可以参见《Synthetic Peptides：A User’s Guide(Advances in Molecular Biology)》，Grant G.A.编，Oxford University Press，2002，或者在 《Pharmaceutical Formulation：Development of Peptides and Proteins》中， Frokjaer and Hovgaard编，Taylor and Francis，1999。
肽可以例如通过使用Fmoc化学以及Acm保护的半胱氨酸来合成。通 过反相HPLC纯化后，可以进一步加工肽以获得例如环状或C或N端修饰 的异构体。用于环化和末端修饰的方法是本领域熟知的，详细描述在上文 引用的手册中。
在一个优选的实施方案中，本发明的个别肽序列通过合成方式，特别 是通过上述手册中描述的序列辅助的肽合成(SAPS)方法来制备。
另外，本发明个别肽序列的合成可以从制造商，诸如例如Sigma-Genosys (USA)处定购和购买。
各肽序列多聚体的LPA法制备
LPA方法公开于WO00/18791。该方法基本上包括下列步骤：
(a)通过固相合成或片段偶联提供包含预期序列的肽片段，该肽片段附着 于固相上；
(b)如必要的话，将任何N端氨基去保护，整个肽片段仍然附着在固相上；
(c)使具有去保护N端基团的肽片段与非手性二、三或四羧酸反应，以提 供具有环结构的构建物，并
(d)从固相上切下构建物，以提供包含具有游离C端基团的肽片段的LPA。
在上述方法中，在步骤(d)前可以进行下列步骤：
(c1)如果存在，将源自步骤(c)中所使用的羧酸的任何N-受保护基团去保护，
(c2)继续固相合成或片段偶联，以提供包含预期序列的肽片段，其具有至 少一个N-受保护N端氨基酸基团和/或附着化学部分，和
(c3)如果存在，将任何N端氨基去保护(在步骤(d)之前或之后)。
该方法还提供了以N到C取向呈现本发明预期序列的LPA(步骤(c))。 同时还有C到N取向的序列(步骤(c2))
因此，为了获得本发明的化合物，将依靠非手性二、三或四羧酸装配 附着到固相上的两种肽链。适合在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m独立的为1到20的整数，X为HN，A和B独立的为取代或未 取代的C1-10烷基、取代或未取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取 代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构 成取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳 香族部分。
在另一个实施方案中，适合在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为H2N(CR2)pCR或RHN(CR2)pCR， 其中p为0或1到20的整数，其中每个R为H、取代或未取代的C1-10烷基、 取代或未取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环 部分、取代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的 环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
在又一个实施方案中，适于在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为HO(CR2)pCR、HS(CR2)pCR、卤素 -(CR2)pCR、HOOC(CR2)pCR、ROOC(CR2)pCR、HCO(CR2)pCR、 RCO(CR2)pCR，或[HOOC(A)n][HOOC(B)m]CR(CR2)pCR，其中p为0或1 到20的整数，每个R独立的为H或取代或未取代的C1-10烷基、取代或未 取代的C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取 代或未取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的环部分、 取代或未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
在又一个实施方案中，适于在本发明中使用的非手性二、三或四羧酸 具有通式
X[(A)nCOOH][(B)mCOOH]
其中n和m为0或1到20的整数，X为H2N(CR2)p、RHN(CR2)p、HO(CR2)p、 HS(CR2)p、卤素-(CR2)p、HOOC(CR2)p、ROOC(CR2)p、HCO(CR2)p、 RCO(CR2)p，或[HOOC(A)n][HOOC(B)m](CR2)p，其中p为0或1到20的 整数，每个R独立的为H或取代或未取代的C1-10烷基、取代或未取代的 C2-10烯基、取代或未取代的环部分、取代或未取代的杂环部分、取代或未 取代的芳香族部分，或者A和B一起构成取代或未取代的环部分、取代或 未取代的杂环部分、取代或未取代的芳香族部分。
术语C1-10烷基表示具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙 基、异丙基、丁基和叔丁基。
术语C2-10烯基表示具有2-10个碳原子的直链或支链烯基，如乙炔基 (ethynyl)、丙烯基、异丙烯基、丁烯基和叔丁烯基。
术语环部分表示有环己烷和环戊烷。
术语芳香族部分表示有苯基。
措词“A和B构成环、杂环或芳香族部分”表示有环己烷、哌啶、苯和 吡啶。
通过与羧酸反应，获得X(CO-序列)2-固相类型的构建物，其中X如上 定义。
术语“序列”在当前内容中表示包含天然存在的和/或非天然存在的氨基 酸、PNA序列或肽模拟物(peptidomimetic)的肽。“天然存在的氨基酸”表 示在自然界中发现的20种L-和D-型氨基酸。非天然存在的氨基酸为例如 经过修饰的天然存在氨基酸。术语序列还意图包括一种或多种这样的序列。 合适的肽模拟物的实例记载于Marshall G.R.，(1993)Tetrahedron 49： 3547-3558。术语“化学部分”表示增强LPA的溶解性或生物学活性的实体， 和指导LPA至其靶的实体或标记物。序列的优选实施方案如上所述。
基团X直接或间接的允许同一序列、或者一种或多种不同序列和/或部 分的继续逐步合成或片段偶联。LPA中肽片段的取向(N到C或C到N) 根据需要定义。在一个实施方案中，本发明以N到C的取向作为LPA的特 征；在另一个实施方案中，它涉及序列同时存在N到C和C到N表现的化 合物；在又一实施方案中，序列具有C到N的取向。
在X包含暂时受保护氨基功能的情况下，可以在保护后直接进行合成 或偶联。使用半当量羧酸能确保提供环系统有效形成(步骤(c)中，参见上 述)的所有含羧基基团的适当活化。在三或四羧酸的情况下，活化的羧基 可以进一步用二胺诸如乙二胺或适当功能化的胺衍生化，以与诸如巯基、 氢氧基、氧(oxo)或羧基基团进一步反应。在二胺的情况下，肽合成或片段 偶联可以直接根据所需序列或化学部分继续。在一个优选的实施方案中， 使用Fmoc保护策略，但是根据合成或偶联策略可以使用任何氨基保护基 团。例子有Boc保护基团策略。
由于连续逐步合成或片段偶联是用一个或在双功能化学部分诸如赖氨 酸的情况下用两个氨基酸基团进行的，惊奇的发现与通过MAP合成获得的 常规四聚赖氨酸树状体(dendimer)相比能获得更好的结果。此外，最佳肽 合成流程或偶联流程可用于附着于固相的单链，并且在形成LPA前可验证 它们的同质性。从固相上切下和同时的侧链去保护可以通过标准肽合成流 程(上述)进行。从而可获得最终产物，其具有最佳和良好定义的组成。 如果期望或有需要，可以容易的通过标准层析方法诸如HPLC或凝胶过滤 进行纯化。
有利于提供环结构的二、三和四羧酸可以选自亚氨二乙酸、2-氨基丙二 酸、3-氨基戊二酸、3-甲氨基戊二酸、3-氯谷氨酸、3-甲氧基-羰基戊二酸、 3-乙酰基戊二酸、戊二酸、丙三羧酸、3，4-二羧甲基己二酸、4-(2-羧乙基)- 庚二酸、(3，5-二羧甲基-苯基)-乙酸、3，4-二羧甲基-己二酸、苯-1，2，4，5-四羧 酸、4-(3-羧基-丙烯氨基)-丁-2-烯酸、4，4-亚氨基-二苯甲酸、1，4-二氢吡啶-3，5- 二羧酸、5-氨基异酞酸、2-氯丙二酸、3-羟基戊二酸和苯-1，3，5-三羧酸。
片段偶联(片段偶联或片段缩合)可以依照标准流程进行，例如如 Peptide Synthesis protocols，Methods in Molecular Biology Vol.35，Chapter15， 303-316，Nyfeler R，Pennington MW and Dunne BM Eds.，Humana Press，1994 中所述。因此，片段可以如上所述在固相上合成，以完全保留保护基团的 方式从固相上切下，纯化并鉴定。也可以通过上述其它技术获得合适的片 段。
使用上述LPA方法来制备本发明的化合物是本发明的优选实施方案。
4、抗体
本发明的一个目的是提供能够识别和选择性结合包含对应于本发明通 式I之序列或所述序列之片段、变体或同源物或由其包含的表位的抗体、其 抗原结合片段或重组蛋白，在一个优选的实施方案中，所述表位为包含本 发明基序的表位。在一个优选的实施方案中，抗体为识别和结合包含基序 G-xa-D/E/Q/T-V-xb-V/L的表位的抗体，其中xa为任意氨基酸残基，xb为I、 T、M或E。在另一个优选的实施方案中，抗体为识别和结合包含基序 G-x2-D/E-V-I-L的表位的抗体，其中x2为R或L。在又一个优选的实施方案 中，抗体为识别和结合包含基序V-L-G/E-x9-V/L的表位的抗体，其中X9为 E、D、K或Q。在其它优选的实施方案中，抗体可以选自识别和结合包含 或被包含于选自SEQ ID NO：1-11中任意序列或所述序列之片段、变体或同 源物的序列或由其包含的表位的抗体。
优选的是，表位位于NCAM、NGF、NT-3或NT-4/5多肽上。
术语“表位”表示(抗原分子上)受到(该抗原的)抗体识别(从而引起 免疫应答)的一组特定的原子。术语“表位”等同于术语“抗原决定簇”。表位 可包含3个或更多氨基酸残基，诸如例如4个、5个、6个、7个、8个氨 基酸残基，其位置紧密接近，诸如在连续的氨基酸序列中，或者位于抗原 氨基酸序列的远隔部分，但是由于蛋白质折叠而互相接近。
抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族，其基本构件(basic building block)，免疫球蛋白折叠或结构域，以各种形式用于免疫系统和其 它生物学识别系统的许多分子中。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，含 有称为可变区的抗原结合区和称为恒定区的不变区域。
天然抗体和免疫球蛋白通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链 (H)构成的约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价 二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有 所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端 具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区 (VL)，而另一端是一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在 一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残 基在轻链和重链可变区之间形成界面(Novotny J.&Haber E.Proc Natl Acad Sci U S A.82(14)：4592-6，1985)。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白归入不同的类别。 免疫球蛋白有至少五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有 些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。 将与不同免疫球蛋白类别对应的重链恒定区分别称作阿尔法(α)、德尔塔 delta(δ)、厄普西隆(ε)、伽马gamma(γ)和谬mu(μ)。根据其恒定区的氨基酸 序列，抗体的轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(к)和拉姆 达(λ)。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
术语“可变的”在抗体可变区的语境中指可变区中的某些部分在抗体序 列中差异广泛的实情。可变区用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和决 定特异性。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻 链和重链可变区中称作互补决定区(CDR)，也称作高变区的三个区段。
可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变 区各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在 某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通 过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗 原结合位点的形成。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种 效应物功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
因此设想在本发明中使用的抗体可以为多种形式，包括完整的免疫球 蛋白，抗体片段诸如Fv、Fab和类似片段，包含可变区互补决定区(CDR) 的单链抗体等形式，它们都归入本文中所使用的广义术语“抗体”。本发明设 想了任意特异性的抗体的应用，多克隆的或单克隆的，并且不限于识别特 定抗原并与其发生免疫反应的抗体。在优选的实施方案中，在下述治疗和 筛选方法的情况中，使用对本发明的抗原或表位具有免疫特异性的抗体或 其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产 生两个相同的抗原结合片段，称作Fab片段，各自具有一个抗原结合位点， 和一个残余“Fc”片段，这样叫是因为它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生 一个F(ab′)2片段，它具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，和一个残余 的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括双抗体、线性抗体、单链抗体分 子、及由抗体片段形成的多特异性抗体。在用于本文时，关于抗体的“功能 性片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
术语“抗体片段”在用于本文时可与术语“抗原结合片段”互换。
抗体片段可以小至约4个氨基酸，5个氨基酸，6个氨基酸，7个氨基 酸，9个氨基酸，约12个氨基酸，约15个氨基酸，约17个氨基酸，约18 个氨基酸，约20个氨基酸，约25个氨基酸，约30个氨基酸或更多。一般 而言，本发明的抗体片段可以具有任意大小上限，只要它相对于特异性结 合包含选自本文中标示为SEQ ID NO：1-11的任意序列或所述序列之片段的 肽序列的表位的抗体具有类似的免疫学特性。因此，在本发明的上下文中 术语“抗体片段”与术语“抗原结合片段”等同。
抗体片段保留了选择性结合其抗原或受体的一些能力。抗体片段的一 些类型定义如下：
(1)Fab为包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。为了制备Fab 片段，可用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部 分。
(2)Fab′为抗体分子的片段，它可以如下获得，用胃蛋白酶处理完整 抗体，然后还原以产生完整的轻链和重链的一部分。每个抗体分子可获得 两个Fab′片段。
Fab′片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基末端增加了 少数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
(3)(Fab′)2为抗体的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，但 不进行后续还原来获得。
F(ab′)2为通过两个二硫键结合在一起的两个Fab′片段的二聚体。
(4)Fv为包含包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域 由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体(VH-VL 二聚体)组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个CDR相互作用而在 VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以 抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个 CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合 位点。
(5)单链抗体(“SCA”)定义为包含轻链可变区和重链可变区的基因 工程分子，两个可变区通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。 该单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽还在VH和 VL结构域之间包含多肽接头，其能够使sFv形成抗原结合所需的结构。sFv 的综述可见Pluckthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中， 113：269-315，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，NY，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一 条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过 使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域 与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整 的描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
本发明设想了能够结合依照本发明的表位的多克隆和单克隆抗体，其 抗原结合片段和重组蛋白。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员所公知的。参见例如Green等人 1992.Production of Polyclonal Antisera，in：Immunochemical Protocols (Manson ed.)，pages 1-5(Humana Press)；Coligan等人，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，in：Current Protocols in Immunology，section 2.4.1，收入本文作为参考
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler&Milstein，Nature， 256：495-7(1975)；Coligan等人，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等人，in： Antibodies：A Laboratory Manual，page 726，Cold Spring Harbor Pub.(1988)。单 克隆抗体可以通过多种已经建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。该 分离技术包括使用蛋白A-Sepharose的亲和层析、大小排阻层析和离子交换 层析。参见例如Coligan等人，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3； Barnes等人，Purification of Immunoglobulin G(IgG).In：Methods in Molecular Biology，1992，10：79-104，Humana Press，NY。
体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员所公知的。例如， 将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler and Milstein，1975， Nature 256：495-7描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组方法来制备， 例如如US4,816,567中所述。将用于本发明的单克隆抗体还可以使用 Clackson等人，1991，Nature 352：624-628，中和Marks等人，1991，J Mol Biol 222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。另一种法牵涉通过重组 方法将单克隆抗体人源化以产生包含人特异性和可识别序列的抗体。综述 综述参见Holmes等人，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等人，1998， Annals Allergy，Asthma&Immunol 81：105-115。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以极少量存在的可能天然存 在的突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。此外，与 典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品不 同，每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性，单克 隆抗体的优越性体现在它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球 蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特 征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/ 或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的 相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体 类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要 它们显示出所需的生物学活性(US4,816,567；Morrison等人，1984，Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855)。
制备抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如Harlow and Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988，收 入本文作为参考)。可通过蛋白水解抗体或者通过在大肠杆菌中表达编码片 段的DNA来制备本发明的抗体片段。可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完 整抗体的常规方法来获得抗体片段。例如，为了制备抗体片段，可以用胃 蛋白酶酶促切割抗体以提供称为F(ab′)2的5S片段。可以用硫醇还原剂进一 步切割该片段，和任选的针对切割二硫键产生的巯基的封闭基团，以产生 3.5S Fab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab′ 片段和一个Fc片段。这些方法记载于例如US4,036,945和US4,331,647及 其所含参考文献。将这些专利完整收入本文作为参考。
也可以使用切割抗体，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一 步切割片段，或者其它酶促的、化学的或基因的技术的其它方法，只要片 段与完整抗体所识别的抗原结合。例如，Fv片段包含VH和VL链的联合体。 该联合可以是非共价的，或者可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化 学试剂诸如戊二醛交联。优选的是，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和 VL链。通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列 的结构基因，制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载 体，随后导入宿主细胞诸如大肠杆菌。重组宿主细胞合成以接头肽跨接两 个V结构域的单一多肽链。制备sFv的方法记载于例如Whitlow等人，1991， In：Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：97；Bird等人，1988， Science 242：423-426；US4,946,778；和Pack等人，1993，BioTechnology 11： 1271-77。
抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽 (“ 最小识别单位”)经常涉及抗原识别和结合。可以通过克隆或构建编码目 的抗体的CDR的基因来获得CDR肽。为了制备所述基因，例如使用聚合 酶链式反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区。参见例如Larrick等人， Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 106(1991)。
本发明设想了人源和人源化形式的非人(例如鼠源)抗体。所述人源 化抗体为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、 F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最 小序列，诸如表位识别序列。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白 (受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有所需特异性、亲和力和 能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫 球蛋白。包含本发明抗体的最小序列，诸如识别本文所述表位的序列的人 源化抗体为本发明的优选实施方案之一。
在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替代。 此外，人源化抗体可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中都没有发现 的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体的性能。一般而言， 人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所 有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基 本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。任选的是，人源化抗 体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒 定区。更多细节参见：Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等 人，1988，Nature 332：323-329；Presta，1992，Curr Op Struct Biol 2：593-596； Holmes等人，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等人，1998，Annals Allergy，Asthma&Immunol 81：105-115。
可以使用包含本发明基序，诸如例如标示为SEQ ID NO：1-11之序列的 NCAM、NGF、NT3或NT4/5的天然或重组片段作为抗原，通过本领域用 于制备多克隆和单克隆抗体的任何标准方法来产生抗体。为了产生所述抗 体，还可以使用SEQ ID NO：1-11的肽序列的变体、同源物或片段，或者任 何其它免疫原性肽序列或其免疫原性片段，其符合以下条件：
(i)为至少6个氨基酸的连续氨基酸序列，和
(ii)包含至少一个上述氨基酸基序。
还可以由待治疗个体在体内产生抗体，例如通过对所述个体施用本发 明的免疫原性片段。因此，本发明还涉及包含上述免疫原性片段的疫苗。
本申请还涉及制备本发明抗体的方法，所述方法包括提供上述免疫原 性片段的步骤。
本发明涉及1)抗体，其能够调控，诸如增强或削弱人NCAM和/或神 经营养蛋白和/或Trk受体的生物学功能，特别是涉及细胞生长、分化和存 活、与学习或记忆有关的神经可塑性、和/或细胞运动性的功能，2)抗体， 其能识别和特异性结合NCAM和/或Trk受体配体，诸如NGF、NT-3或 NT-4/5，且调控NCAM和/或Trk受体配体的功能；和3)抗体，其能识别 和特异性结合NCAM和/或Trk受体配体，诸如NGF、NT-3或NT-4/5，但 不调控其生物学活性。优选通过使用上述免疫原性肽序列来制备所述抗体。
本发明涉及上述抗体用于1)涉及调控神经营养蛋白、NCAM和/或Trk 受体活性的治疗性应用；2)调控细胞和生理活动，包括细胞分化、存活和 运动性、以及与学习和记忆有关的神经可塑性，3)为诊断目的，4)研究 目的在体外和/或体内检测和/或监测神经营养蛋白、NCAM和/或Trk受体 的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及包含上述抗体的药用组合物。
5、药物
本发明提供了肽序列和化合物，其能够i)刺激神经突向外生长；ii) 调节细胞运动性性；iii)刺激神经细胞存活；iv)刺激神经细胞分化；v) 刺激与记忆和学习有关的神经可塑性；vi)调节Trk家族受体的神经营养蛋 白受体的活性。因此，所述化合物可以用于刺激神经突向外生长、刺激神 经细胞存活、刺激神经可塑性、刺激神经细胞分化、调节Trk家族受体的神 经营养蛋白受体的活性、和调节细胞运动性，以及用于制造治疗下述疾病 和/或病征的药物，其中需要所述刺激或所述调节。在优选实施方案中，本 发明的肽序列和化合物包括神经营养蛋白的分离的肽片段，诸如NGF、NT-3 和NT-4/5和/或NCAM。
神经生长因子(NGF)刺激胆碱能功能，在损伤、淀粉状蛋白过表达 和衰老的动物模型中改善记忆和防止胆碱能变性，刺激神经突向外生长和 神经元存活(Tuszynski MH等人Nat Med.2005 Jun；11(6)：551-5； Jakubowska-Dogru E，Gumusbas U，Neurosci Lett.2005 Jul 1；382(1-2)：45-50； Walz R等人Neurochem Res.2005 Feb；30(2)：185-90；Hu Z等人Neurobiol Dis.2005 Feb；18(1)：184-92)。此外，已经将不同Trk受体的表达和活性水 平与癌症患者的存活联系起来(Schramm A等人Cancer Lett.2005 May 24， PubMed Epub ahead of print)，而且癌细胞的入侵行为依赖于NCAM、Trk 受体和NGF的表达和活性(Chen-Tsai CP等人Dermatol Surg.2004 Jul；30(7)： 1009-16)。
NCAM功能已经显示出对不同身体系统和器官，特别是神经系统的很 多种正常的和病态的状况是重要的(Sandi C.Nat Rev Neurosci.2004 Dec； 5(12)：917-30；Kiryushko D等人Ann N Y Acad Sci.2004 Apr；1014：140-54； Gniadecki R等人Arch Dermatol.2004 Apr；140(4)：427-36；Berezin V，Bock E. J Mol Neurosci.2004；22(1-2)：33-39)。
因此，本发明的肽序列和/或化合物可用于预防和/或治疗下述病症或疾 病，其中神经营养蛋白或神经营养蛋白受体的功能、或NCAM的功能起重 要作用。
因此，可以预期使用本发明的肽序列和/或化合物可能在治疗或预防下 述病症和疾病的非限制性实施例中具有有益效果：
1)中枢和周围神经系统的疾病和病症，诸如手术后神经损伤、创伤性 神经损伤、神经纤维的髓鞘形成受损、缺血后损伤例如由中风引起的、帕 金森氏(Parkinson)病、阿尔茨海默氏(Alzheimer)病、亨廷顿氏(Huntington) 病、痴呆诸如多梗塞性痴呆(multiinfarct dementia)、硬化、与糖尿病有关 的神经变性、影响生物钟或神经-肌肉传导的紊乱或与之有关的，和/或
2)精神疾病和病症，诸如思想和/或情绪障碍、神经精神障碍 (neuropsychiatric disorders)包括两极(bipolar)(BPD)、遗传相关单极情 感障碍(genetically related unipolar affective disorders)、妄想性障碍 (delusional disorders)、妄想痴呆(paraphrenia)、偏执型精神病(paranoid psychosis)、精神分裂症(schizophrenia)、分裂型障碍(schizotypal disorder)、 情感分裂性精神障碍(schizoaffective disorder)、情感分裂性两极和遗传相 关单极情感障碍(schizoaffective bipolar and genetically related unipolar affective disorders)、精神性精神病(psychogenic psychosis)、紧张症 (catatonia)、周期性两极和遗传相关单极情感障碍(periodic bipolar and genetically related unipolar affective disorders)、循环性精神病(cycloid psychosis)、分裂样人格障碍(schizoid personality disorder)、偏执型人格障 碍(paranoid personality disorder)、两极和遗传相关单极情感障碍相关的情 感障碍(bipolar and genetically related unipolar affective disorders related affective disorders)以及单极情感障碍的亚型，和/或
3)肌肉疾病或病症，包括神经-肌肉连接功能受损的病症，诸如器官移 植后的，或诸如遗传性或创伤性萎缩性肌障碍；和/或
4)各种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺诸如I型和II型糖尿病、 肾诸如肾病、以及心、肝和肠的变性病症，和/或
5)学习能力的削弱和/或短期和/或长期记忆的削弱。
具体而言，本发明涉及正常的、变性的或损伤的NCAM、Trk受体和/ 或神经营养蛋白呈递细胞的治疗。
本发明的化合物还能够调节细胞运动性，即抑制细胞运动性。因此， 本发明也考虑将所述化合物用于调节细胞运动性，优选用于抑制细胞运动 性。
因此，根据这种考虑，本发明的化合物和药物可用于预防和/或治疗：
1)癌症，
2)炎性疾病，
3)变应性病症，和/或
4)新血管发生(neoangeogenesis)。
本发明涉及癌症，为要求新血管发生的任意类型的固体瘤以及任意恶 性癌症。具体而言，本发明涉及神经系统的癌症。
本发明的肽序列和/或化合物还可用于治疗由于饮酒而具有身体损伤的 个体及治疗患有朊病毒疾病的个体。
因此，一个目的是将肽序列、化合物和/或抗体用于制造药物。本发明 的药物可用于治疗其中刺激神经突向外生长、刺激神经细胞存活、刺激神 经可塑性、刺激神经细胞分化、调节Trk家族受体的神经营养蛋白受体的活 性、及调节细胞运动性有益于治疗的任何病症或疾病。所述病症和疾病的 非限制性实例如上所述。
本发明的药物可含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、化合物 或抗体，或者其可以配制成含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、 化合物或抗体以及药学可接受添加剂的药用组合物。在有些实施方案中， 药物或药用组合物可以含有有效量的一种或多种上述分离的肽序列、化合 物和/或抗体的联合。
因此，本发明在另一方面还涉及含有至少一种本发明的分离的肽序列、 化合物和/或抗体的药用组合物。
本发明的又一方面为制备药用组合物的方法，包括将有效量的一种或 多种本发明的分离的肽序列、化合物或抗体，或者按照本发明的药用组合 物与一种或多种药学可接受添加剂或载体混合。
在上述方法的一个实施方案中，将化合物用于与假体装置(prosthetic device)联合，其中所述装置为假体神经导杆(prosthetic nerve guide)。因 此，在另一方面，本发明涉及假体神经导杆，特征在于其包含一种或多种 上述化合物或药用组合物。神经导杆为本领域已知的。
本发明还涉及含有本发明化合物的药用组合物用于治疗或预防本申请 所提到的任何疾病或病症的用途。
在有些实施方案中，本发明涉及含有能够识别包含本发明氨基酸基序 的表位的抗体的药用组合物。所述药用组合物还可用于治疗本文所述的病 症和疾病。
本发明的药物和/或药用组合物可以合适的配制用于口服、经皮、肌肉 内、静脉内、颅内、鞘内、脑室内、鼻内或肺部施用。
基于本发明化合物的药物和组合物的剂型开发策略通常与基于蛋白质 的任何其它药物产品的配制策略相同。潜在的问题以及克服这些问题所需 要的指导涉及一些教科书，例如《Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems》，Ed.A.K.Banga，Technomic Publishing AG， Basel，1995。
注射剂通常制备成液体溶液或悬浮液、在注射前适于溶解或悬浮于液 体的固体形式。制剂也可以乳化。常常将活性成分与药学可接受的且与活 性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、 乙醇等，及其组合。此外，如果需要的话，制剂可以含有极少量的辅助物 质，诸如湿润或乳化剂、pH缓冲剂或可增强制剂效力或输送的物质。
本发明化合物的配制剂可以通过本领域技术人员已知的技术来制备。 配制剂可以含有药学可接受的载体和赋形剂，包括微球、脂质体、微囊、 纳米粒等。
制剂可以合适的通过注射来施用，任选在要活性成分发挥其作用的部 位。适于其它施用模式的其它剂型包括栓剂、鼻内、肺部以及在一些情况 中，口服剂型。对栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚(亚烷基)二醇或甘 油三酯。所述栓剂可以由含有从0.5％至10％，优选1-2％范围的活性成分的 混合物制成。口服剂型包括常用赋形剂，诸如例如药用级的甘露醇、乳糖、 淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬 浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放剂型或粉剂的形式，且通常含有10-95％ 的活性成分，优选25-70％。
其它剂型为那些适于鼻腔和肺部施用的剂型，例如吸入器和气雾剂。
活性化合物可以配制成中性或盐形式。药学可接受的盐包括与无机酸， 诸如例如盐酸或磷酸、或者与有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等 形成的酸加成盐(与肽化合物的游离氨基形成的)。由游离羧基形成的盐 也可以衍生自无机碱，诸如例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及有机碱 诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
制剂以与剂量配制剂相容的形式，且以治疗有效量施用。将施用的量 取决于待治疗的受试者，包括例如受试者的体重和年龄、所治疗的疾病和 疾病的阶段。合适的剂量范围达到每次施药每千克体重几百微克活性成分， 优选的范围为每千克体重约0.1微克至5000微克。在使用化合物的单体形式 时，合适的剂量通常在每千克体重0.1微克至5000微克的范围内，诸如在每 千克体重约0.1微克至3000微克的范围内，尤其是在每千克体重约0.1微克至 1000微克的范围内。在使用化合物的多聚体形式时，合适的剂量通常在每 千克体重约0.1微克至1000微克的范围内，诸如在每千克体重约0.1微克至 750微克的范围内，尤其是每千克体重约0.1微克至500微克的范围内，诸如 在每千克体重约0.1微克至250微克的范围内。具体而言，在鼻腔施药时，使 用比通过其它途径施药时较小的剂量。施药可以执行一次，或者可以随后 进行后续施药。剂量也将取决于施药途径，并且将随着待治疗受试者的年 龄和体重而变化。多聚体形式的优选剂量将在每70千克体重1mg至70mg之 间。
对有些适应症，优选局部的或本质上局部的应用。
对其它应用，优选鼻内应用。
本发明的有些化合物具有足够的活性，但是对于其它一些，如果制剂 还包含药学可接受的添加剂和/或载体，效果将增强。所述添加剂和载体将 是本领域已知的。在有些情况中，含有促进活性物质投递至其靶的化合物 将是有益的。
在许多情况中，多次施用配制剂将是必要的。施药可以是持续输注， 诸如心室内输注或多剂施用，诸如一天多次、每天一次、一周多次、每周 一次等。优选在个体受到可能导致细胞死亡的因素之前或短暂之后开始施 用药物。优选的是，在所述因素开始作用8小时内，诸如在所述因素开始作 用5小时内施用药物。许多化合物显示长期作用，由此可以间隔较长时间施 用所述化合物，诸如1周或2周。
在与神经导杆的联合中，施药可以是持续的或者基于活性化合物的受 控释放的小部分。此外，可以使用前体来控制释放速率和/或释放部位。其 它种类的植入以及口服施用可以相似地以受控释放和/或使用前体为基础。
6.治疗
通过使用依照本发明的肽序列、包含它们的化合物、抗体、包含它们 的药物、和/或包含它们的药用组合物的治疗在一个实施方案中对于诱导分 化、调节细胞增殖和运动性、刺激再生、存活和神经元可塑性是有用的。
因此，治疗包括中枢和周围神经系统的疾病或病征的治疗和/或预防， 诸如手术后神经损伤、创伤性神经损伤例如由脊髓损伤产生的、神经纤维 的髓鞘形成受损、缺血后损伤例如由中风(stroke)产生的、多梗塞性痴呆 (multiinfarct dementia)、多发性硬化、与糖尿病有关的神经变性(nerve degeneration)、神经-肌肉变性、精神分裂症、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(parkinson’s disease)或亨廷顿氏病(huntington’s disease)。
此外，关于肌肉的疾病或病症，包括神经-肌肉连接功能受损的病症， 诸如遗传性或创伤性萎缩性肌障碍(atrophic muscle disorder)；或者用于治疗 各种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺诸如I型和II型糖尿病、肾诸如 肾病的变性病。依照本发明的化合物可以用于诱导分化、调节增殖、刺激 再生、神经元可塑性。
本发明还涉及所述化合物和/或药用组合物在治疗癌症中的应用。调节 癌细胞运动性对于含癌细胞肿瘤的生长、侵入、血管发生及其传播是重要 的。因此，所述化合物可作为抑制后续过程的药物有利的用于癌症的预防 和治疗。
在还有一个实施例中，本发明涉及所述化合物以及包含其的药物和/或 包含其的药用组合物用于刺激短期和/或长期记忆和/或学习能力的应用。增 强的神经突向外生长和新神经元连接的建立是记忆巩固机制的一部分。所 述肽序列及包含它们的化合物对于长期记忆和短期记忆的刺激可能都是有 用的。
本发明的化合物、药物和/或药用组合物可用于例如治疗临床病症，诸 如瘤，诸如恶性瘤、良性瘤、原位癌和具有不定表现的瘤，内分泌腺疾病， 诸如糖尿病，精神病，诸如老年性和早老性器质性精神病病症、酒精中毒 性精神病、药物性精神病、暂时性器质性精神病病症、阿尔茨海默氏病、 脑脂沉积、癫痫、全身轻瘫[梅毒]、肝豆状核变性、亨廷顿氏舞蹈病、雅- 克二氏(Jakob-Creutzfeldt)病、多发性硬化、皮克氏(Pick)脑病、梅毒、 精神分裂症、情感性精神病、神经症性障碍(neurotic disorder)、人格障碍， 包括性格神经症、与器质性脑综合征有关的非精神病性人格障碍、偏执型 人格障碍、狂信型人格、偏执型人格(障碍)、偏执特质、性偏离和性功 能障碍、智力迟钝、神经系统和感觉器官的疾病、认知异常、中枢神经系 统的炎性疾病，诸如脑膜炎、脑炎、大脑变性，诸如阿尔茨海默氏病、皮 克氏病、脑的老年性变性、交通性脑积水、梗阻性脑积水、帕金森氏病包 括其它椎体外疾病和异常运动障碍、脊髓-小脑疾病、小脑共济失调、马里 氏(Marie)、Sanger-Brown、肌阵挛性小脑共济失调、原发性小脑变性诸 如脊髓性肌萎缩、家族性、青少年性、成年性脊髓性肌萎缩、运动神经元 疾病、肌萎缩性侧索硬化、运动神经元疾病、进行性延髓麻痹、假延髓麻 痹、原发性侧索硬化、其它前角细胞疾病、前角细胞疾病、未分类的、其 它脊髓疾病、脊髓空洞症和延髓空洞症、血管性脊髓病、脊髓的急性梗死 (栓塞性的)(非栓塞性的)、脊髓的动脉血栓症、脊髓的水肿、亚急性 坏死性脊髓病、脊髓的亚急性联合变性(分类在其它疾病中)、脊髓病、 药物诱导的、辐射诱导的脊髓炎、自主神经系统紊乱、周围自主、交感、 副交感或植物系统紊乱、家族性自主神经异常[里-戴二氏(Riley-Day)综合 征]、特发性周围自主神经病、颈动脉窦晕厥或综合征、颈交感神经营养不 良或麻痹、周围自主神经病(分类在其它病症中)、淀粉样变性、周围神 经系统的疾病、臂神经丛损伤、颈肋综合征、肋锁综合征、前斜角肌综合 征(scalenus anterior syndrome)、胸腔出口综合征、臂丛神经炎或脊神经根 炎，包括新生儿中的；炎性和毒性神经病，包括急性传染性多神经炎、格- 巴二氏(Guillain-Barre)综合征、感染后多神经炎、胶原血管病中的多神经 病、影响眼睛多个结构的疾病、化脓性眼内炎、耳和乳突的疾病、慢性风 湿性心脏病、缺血性心脏病、心律失常、肺系统的疾病、新生儿的器官和 软组织异常，包括神经系统中的，阵痛和分娩中施用麻醉剂或其它镇静剂 的并发症、皮肤疾病，包括感染、不充分的血液循环问题、损伤，包括手 术后的、压伤、烧伤；神经和脊髓的损伤，包括神经切断、连贯性的损害 (有或无开放伤口)、创伤性神经瘤(有或无开放伤口)、创伤性暂时性 麻痹(有或无开放伤口)、在医学操作中的意外刺伤或撕裂、视神经和视 路的损伤、视神经损伤、第二颅神经、视交叉损伤、视路损伤、视皮层损 伤、未分类的失明、其它颅神经损伤、其它和未分类的神经的损伤；药物、 医学和生物学物质中毒、遗传性或创伤性萎缩性肌障碍；或者用于治疗各 种器官的疾病或病症，诸如生殖腺、胰腺(诸如I和II型糖尿病)、肾(诸 如肾病)的变性病。瘙痒病、克-雅二氏(Creutzfeldt-Jakob)病、GSS三氏 (Gerstmann-Straussler-Sheinker)病。
依照本发明，治疗和/或预防上述病征和症状的方法包括对有所需要的 个体施用有效量的本发明的肽序列和/或化合物、和/或抗体和/或药物、和/ 或药用组合物的步骤。
7、实施例
实施例1肽序列的合成
使用Fmoc保护的氨基酸(3eq)在采用Rink酰胺连接体(p-(R，S)-α- (1-(9H-芴-9-基)-甲氧基氨基甲酰)-2，4-二甲氧基苯甲基)-苯氧基乙酸 (Novabiochem))的TentaGel树脂上合成肽。在手动多层析装置中用TBTU(3 eq)，HOBt(3eq)和DIEA(4.5eq)进行＞60分钟的连接。用DMF中20％的哌 啶去保护Fmoc 10分钟。通过连接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Novabiochem) 到连接体树脂，然后Fmoc基团的Fmoc去保护，进一步进行Fmoc-Lys(Fmoc) -OH的连接以完成肽树状体(dendrimer)的合成。Fmoc去保护后，进行上述 肽的合成以得到单体肽。用90％TFA，5％H2O，3％EDT，2％苯硫基甲烷去保 护肽基树脂，在二乙基醚(diethyl ether)中沉淀，在二乙基醚中洗三次， 溶解于5％AcOH中，冻干。使用连接到WISP 712的Waters picotag和Waters 501 pump进行氨基酸分析。装备有Waters 996光电二极管阵列探测器的 Waters 600E被用于C18柱上的分析和制备HPLC(Delta-Pak 100 15um， Millipore)。可以在VG TOF Spec E，Fisions Instrument上进行Maldi-MS。通 过HPLC估计肽至少为95％纯。
实施例2通过NCAM HBP刺激神经突向外生长
表达或不表达NCAM的成纤维细胞与原代CGNs的共培养
表达或不表达NCAM的基因修饰的成纤维细胞(小鼠成纤维细胞样L 细胞)被以7×104细胞/孔的密度接种到八孔LabTek组织培养室载片(Nunc， Roskilde，Denmark)上，在37℃和5％CO2保存在含有10％HS，100U/ml 青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM中。平板接种24h后，移除培养基， 在含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的 Neurobasal-A培养基中接种CGNs(104细胞/孔)到表达或不表达NCAM的 成纤维细胞单层上，在共培养物中培育24小时，然后测定神经突的向外生 长。根据Rnn，L.C.，Doherty，P.，Holm，A.，Berezin，V.，Bock，E.(2000).J Neurochem 75(2)：665-71从出生后3-4天的大鼠幼崽制备CGNs。
为评估NCAM的肝素结合肽(HBP)(KGRDVILKKDVRFI)(SEQ ID NO： 1)(IgII NCAM的氨基酸154-167(SwissProt P13596)的效果。在存在不同浓 度的HBP或其中Lys-161和Phe-166(对应于HBP序列的残基)分别被替 换为Ala和Val的肽M(KGRDVILAKDVRVI)(SEQ ID NO：2)的情况下将 CGNs接种到表达或不表达NCAM的成纤维细胞上。从图1中显示表达 NCAM的成纤维细胞与不表达NCAM的对照成纤维细胞相比明显促进 CGNs的神经突向外生长，并且HBP剂量依赖性的增加生长在表达NCAM 的成纤维细胞上和不表达NCAM的成纤维细胞上的CGNs的神经突向外生 长。相反，肽M不影响来自生长在表达NCAM的成纤维细胞上的CGNs 的神经突向外生长反应，但是它仍然刺激生长在不表达NCAM的成纤维细 胞上的CGNs的神经突向外生长。
从图2中显示用SU5402，一种成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的 抑制剂，进行处理不会阻断HBP对生长在对照成纤维细胞上的CGNs的促 神经突生长效果，并且仅仅部分抑制CGNs和表达NCAM的成纤维细胞的 共培养物中NCAM介导的神经突向外生长，但是在不存在HBP的情况下 SU5402阻断NCAM介导的神经突向外生长。这表明HBP诱导的神经突向 外生长取决于至少两个机制：1.当涉及转NCAM同嗜性相互作用(trans NCAM homophilic interaction)时，依赖于NCAM-FGFR信号的活化，和2.当 不存在转NCAM同嗜性相互作用时，不依赖于FGFR信号。
单CGNs神经元的原代培养
根据Rnn，L.C.，Doherty，P.，Holm，A.，Berezin，V.，Bock，E.(2000).J Neurochem.75(2)：665-71从出生后3-4天的大鼠幼崽制备原代小脑颗粒神经 元。在37℃和5％CO2条件下在含有20mM Hepes，100U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的Neurobasal-A培养基(全部来自 Gibco BRL)中培养分离的小脑细胞。为检测肽的效果，在含有100U/ml青 霉素，100μg/ml链霉素，1％ glutamax并补充B27的Neurobasal-A培养基中 以104细胞/孔的密度将CGNs接种到带有Permanox塑料生长表面的八孔 LabTech组织培养室载片(Nunc)上。当用肝素酶III(1U/ml)处理时，平 板接种后立刻加入该酶到培养基中。在加入不同浓度(1μg/ml，5μg/ml和 20μg/ml)的肽之前用该酶处理CGNs 1小时。培养24小时后，细胞用多聚 甲醛固定，用针对CD90(Thy-1)(1∶200)(Caltag Laboratories，USA)(PC12-E2 细胞)或GAP-43(1∶1000)(Chemicon，USA)(CGNs)的第一(primary)小鼠抗体 和针对小鼠IgG的第二AlexaFluor488山羊抗体(1∶1000)(Molecular Probes， Netherlands)免疫染色，神经突的长度通过先前已有记载的立体测量学方法 (Ronn，L.C.，Ralets，I.，Hartz，B.P.，Bech，M.，Berezin，A.，Berezin，V.，Moller， A.，Bock，E(2000).J Neurosci Methods.100(1-2)，25-32)进行测量。
图3表明NCAM HBP(SEQ ID NO：1)对生长在存在或不存在肝素酶III 的培养物中的单一原代CGNs的影响，已知该酶特异性裂解硫酸乙酰肝素 为二糖。固定在组织培养塑料上的HBP能够以剂量依赖性方式诱导CGNs 中的神经突向外生长，其在5μg/ml的包被浓度具有680％的最大效果。肽 M在5μg/ml的包被浓度具有400％的最高效果。用肝素酶III进行处理降 低了HBP的效果，但是不降低M肽的效果。这些结果表明NCAM HBP的 刺激神经突向外生长的活性取决于共同作用的两个目标(target)，硫酸乙酰 肝素敏感的和硫酸乙酰肝素不敏感的目标。
图4表明在存在和不存在肝素酶III的情况下，肽：HBP (KGRDVILKKDVRFI)(SEQ ID NO：1)，肽M(KGRDVILAKDVRVI)(SEQ ID NO：2)，肽M1n(KGRDVILNNDVRFI)(SEQ ID NO：3)和肽M3n (KGRDVILNNQVRFI)(SEQ ID NO：4)的神经突发生效果。所有的肽都具有 非常强的促神经突生长活性，其反映为被处理的神经元的神经突长度增加 4-7倍。NCAM HBP(SEQ ID NO：1)的肝素结合活性不是通过肽刺激神经突 向外生长的先决条件，但是在存在硫酸乙酰肝素的情况下所述序列的神经 突发生潜力更强。
实施例3通过NCAM HBP调控成纤维细胞的运动性
为评估所述肽对细胞运动性的影响，用改造后的Puck′s盐水(Gibco BRL) 中0.5mg/ml的胰蛋白酶和0.75mM EDTA移出表达或不表达NCAM的成纤 维细胞的铺满培养物，以4×103细胞/cm2的密度接种到六孔组织培养皿 (Nunc)中，在37℃和5％CO2培养24h。
如先前已记载的通过使用定时录影和图像分析评估任意细胞运动性( Walmod等人，(1998).Cell Motil Cytoskeleton.40(3)，220-37)。简要的，将用 胶带紧密密封的组织培养皿置于安放在Nikon Diaphot 300倒置显微镜 (Nikon，Denmark)上的恒温控制的镜台(Lincam Scientific Instruments Ltd.， UK)上。使用恒温控制的加热风扇(DFA，Denmark)将安放在显微镜镜台周 围的树脂玻璃培养器中的温度保持在37℃。安放在显微镜上的机动镜台使 得能够同时记录许多(50-100个)不同的视野。用连在显微镜上的黑白CCD 摄影机(Burle，Lancaster，PA)进行活细胞的录影。使用软件PRIMA(Protein Laboratory，Copenhagen，Denmark)在4小时中每间隔15分钟用使用10×物镜 的相位对比度光学装置(phase contrast optics)进行768×576象素图片的自动 获得和存储。
使用图像处理软件PRIMA进行细胞运动性和形态学的评估。通过手动 标记细胞核的中心确定细胞个体的位置。定义单个细胞的轨迹为在不同时 间点细胞核中心的座标的顺序。如下所述根据Walmod等人，(2000)(Methods Mol.Biology.161，59-83)测定均方细胞速度(mean squared cell speed)(Sτ)， 扩散率(rate of diffusion)(R)和运动指数(locomotive index)(LI)的参数。
细胞运动性的分析
细胞的移动是相应于细胞原始和最终位置的两点之间的欧几里得距离 (Euclidean distance)。在连续观察之间恒定的时间段进行细胞位置的测定。 给定观察的时间(ti)后细胞群的均方细胞位移(mean squared cell displacement)被计算为
其中i为观察编号(i＝0，1，2，...k)，k为观察的总数减一，ti为最初的观 察(t0)和观察编号i之间的时间间隔(ti＝i×τ)，xm(ti)和ym(ti)为细胞编号m 在时间点ti的座标，N为细胞的总数。通过测绘相对于时间的均方位移
其中P为定向持续时间(23)。平均细胞细胞速度Sτ被计算为细胞的平 均位移(
对于在给定的观察时间细胞群样品，平均细胞轨迹长度(mean cell-path-length)
运动指数LI被计算为平均细胞位移(
LI被用作细胞定向持续(directional persistence)的量度。具有完全直线运 动的细胞LI将为1，反之较低的定向持续将导致较低的LI值。对于随机移 动的细胞，证明LI显示与定向的持续时间(persistence time of direction)(P)， 一个反映单个细胞的定向移动中的明显变化之间的平均时间的参数，有统 计学意义的相关性。
图5显示表达NCAM的成纤维细胞与对照成纤维细胞相比移动的更快 (275％)，其反映为NCAM阳性成纤维细胞与不表达NCAM的成纤维细胞 相比具有更高的扩散比率(R)。
用HBP处理表达NCAM的成纤维细胞和对照成纤维细胞都导致细胞运 动性的明显抑制，其反映为R，Sτ和LI的显著降低。肽M(SEQ ID NO：2) 对成纤维细胞的运动行为具有抑制效果，其类似于HBP的效果。这些结果 表明HBP抑制成纤维细胞的运动不依赖于NCAM表达，并且可能不依赖于 肝素结合。后者支持NCAM HBP的神经突向外生长刺激活性含有硫酸乙酰 肝素不敏感成分的推测。
实施例4本发明肽序列的分析
图6显示本发明肽序列(SEQ ID NO：1-7中所示)和本领域中已有记载 的NCAM HBD片段的比较分析结果。从图中显示1)本发明的肽片段，即 HBP，M，M1n，M3n，M4，M5和M6，是神经突向外生长的非常有效的刺激物 (与对照(未处理)神经元相比，在体外用本发明肽处理神经元导致对神 经突向外生长超过400％的刺激作用)，但是本领域已知的NCAM HBD片段 的刺激作用效力比本发明肽差很多(已报道的刺激作用效力低于50％)。有 趣的是，据报道对于NCAM HBP的生物学活性很重要的氨基酸残基的突变 不会影响突变肽的活性，因此表明所述肽序列中存在负责它们的生物学活 性，如刺激神经突向外生长和细胞运动性的另一结构。比较本发明NCAM HBD的14个氨基酸的多个肽片段和US2003/0119186的14个氨基酸长的 肽的氨基酸序列显示了本发明所述片段的序列和US2003/0119186肽的序 列之间的本质差别。US2003/0119186中的肽在N端具有两个附加的带负电 荷氨基酸残基，在C端缺少两个疏水残基。另一个被报道对神经突向外生 长具有刺激效果的序列(Kallapur等人，1992)(见图6)为18个氨基酸长，并 且既含有C端疏水残基又含有附加的碱性残基。该序列与本申请的序列相 比刺激效力低得多。
考虑了上述分析和所述肽序列对神经突向外生长的刺激效果的阈值， 其比得上公知为神经细胞分化和神经突向外生长的主要刺激物的神经营养 蛋白的效果，本发明的作者比较了本发明肽序列和神经营养蛋白，特别是 NGF，NT-3，NT-4/5和BDNF的序列，从而鉴定出了新的神经营养蛋白受体 Trk结合基序。
神经营养蛋白结合和活化两种类型的受体：p75NTR受体(其激活与诱导 神经元的细胞凋亡有关)以及Trk家族的受体(其活化与促进神经突向外生 长有关)。令人惊奇的是，本发明的肽序列显示与位于所述蛋白的β-发夹环 1中的NGF序列片段具有非常高的同源性，所述蛋白含有氨基酸基序 TDIKGKE，据报道其对于NGF与受体p75NTR的结合是至关重要的(Williams 等人，J Biol Chem 280：5862-69，2005；Ibanez et al.，Cell 69：329-341，1992；He and Garcia，Science 304：870-875，2004)，但是本发明的肽序列不包含氨基酸 基序RGE，据报道该基序对于Trk受体的结合和活化是很重要的(Williams 等人，J Biol Chem 280：5862-69，2005；W02005025514)。
然而，本发明的作者在本文中显示HBP肽与TrkB受体直接结合，并 要求保护上面详细描述的新的Trk受体结合氨基酸基序。本申请公开的氨基 酸基序指向本发明的肽序列的氨基酸残基，其对于它们的神经突发生活性 是至关重要的。因此，缺乏重要的C端疏水残基的US2003/0119186的 NCAM HBD肽的序列不能刺激神经突向外生长至与本发明的肽序列相同的 程度。从另一方面，N端的负电荷残基似乎不是与Trk受体的结合所必需的， 如同相应的序列形式BDNF(本申请的SEQ ID NO：11)，其是Trk B受体的天 然配体，即不具有这些残基。后者可以解释含有这些残基的NCAM HBP的 序列(Kallapur等人，1992)对神经突向外生长的降低的效果。
因此，本发明的作者在本文中鉴定和要求保护肽序列的结构式，其对 于结合Trk受体导致受体活化是最有效的。
实施例5 NCAM HBP与Trk B受体的结合
如先前已记载的(Kiselyov等人，Biol.Chem.272，10125-10134，1997)在酵 母P.pastoris表达系统(Invitrogen，USA)中制备重组的NCAM的Ig2组件 (module)。重组的Trk B受体从RDsystems(USA)购得。
使用BlAcoreX仪器(Biosensor AB)在25℃用10mM磷酸钠pH7.4，150 mM NaCl作为电泳缓冲液进行结合分析。流速为5μl/min。使用制造商提供 的软件通过非线性曲线拟合分析数据。如下使用胺连接试剂盒(Biosensor AB) 在传感芯片CM5上固定HBP或NCAM的重组Ig2组件：1)通过20μl活 化溶液激活传感片的两部分(表示为Fc1和Fc2)；2)将所述蛋白固定在 Fc1上，其使用12μl的10mM磷酸钠缓冲液pH6.0中的20μg/ml蛋白；3) 通过35μl的阻断溶液阻断Fc1和Fc2。Trk B和固定的HBP或NCAM的Ig 组件II的结合如下进行研究：Trk B被同时注入Fc1(具有固定的HBP或 NCAM的Ig组件II)和Fc2(不具有任何固定物)。
从显示Trk B与固定的蛋白(HBP或NCAM的Ig2组件)和Fc1表面 结合的曲线中减去显示化合物与Fc2表面的非特异性结合的曲线。在图7 中显示获得的表明所记录的结合的曲线。HBP NCAM作为分离的肽序列和 NCAM的Ig2组件的完整序列，分别以KD～10-8-10-7M和KD～10-9-10-8M与 Trk B受体结合。
序列表
<110>恩卡姆医药公司(ENKAM Pharmaceuticals A/S)
<120>肝素结合肽
<130>P947PC00
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP NCAM
<400>1
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Lys Lys Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M)
<400>2
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Ala Lys Asp Val Arg Val Ile
1 5 10
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M1n)
<400>3
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M3n)
<400>4
Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Gln Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M4)
<400>5
Ala Gly Arg Asp Val Ile Leu Asn Asn Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
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<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M5)
<400>6
Asn Gly Arg Asp Val Ile Leu Lys Lys Asp Val Leu Phe Ile
1 5 10
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBP突变体(肽M6)
<400>7
Asn Gly Leu Asp Val Ile Leu Ile Ile Asp Val Arg Phe Ile
1 5 10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NGF片段
<400>8
Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn
1 5 10
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NT-3片段
<400>9
Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly
1 5 10
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NT-4/5片段
<400>10
Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala
1 5 10
<210>11
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BDNF片段
<400>11
Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser
1 5 10
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