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治疗线粒体障碍的方法

阅读：928发布：2020-05-21

专利汇可以提供治疗线粒体障碍的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了通过将核酸分子离体导入造血干细胞和祖细胞(HSPC)，然后将HSPC移植入需要治疗的受试者中来治疗与线粒体功能紊乱相关的疾病或障碍的方法。所述核酸分子可以包括功能性人共济蛋白(hFXN)或者可以包括在转染到细胞中时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变的基因编辑系统。，下面是治疗线粒体障碍的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法，包括：
将功能性人共济蛋白(hFXN)导入所述受试者的造血干细胞和祖细胞(HSPC)；和将HSPC移植到所述受试者，从而治疗所述线粒体疾病或障碍。
2.根据权利要求1所述的方法，其中导入步骤包括使包含编码人共济蛋白(hFXN)的多核苷酸和FXN启动子的载体与HSPC接触并使hFXN表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体疾病或障碍选自由以下项组成的组：弗里德赖希氏共济失调(FRDA)、糖尿病、Leigh综合征、Leber遗传性视神经病变、肌神经性胃肠性脑病和癌症。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受试者是人。
6.根据权利要求1所述的方法，其中载体是选自由慢病毒、腺病毒和AAV载体组成的组的病毒载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中载体是pCCL-FRDAp-FXN或pCCL-EFS-FXN。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在移植后约6至12个月内，所述移植修正神经、心脏和肌肉并发症。
9.根据权利要求1所述的方法，其中导入步骤是离体进行的。
10.载体，所述载体包含与编码hFXN的多核苷酸功能性连接的启动子。
11.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是选自由慢病毒、腺病毒和AAV载体组成的组的病毒载体。
12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体是pCCL-FRDAp-FXN或pCCL-EFS-FXN。
13.一种分离的哺乳动物宿主细胞，其含有权利要求10所述的表达载体。
14.根据权利要求13所述的哺乳动物宿主细胞，其中所述细胞是HSPC。
15.一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法，包括使来自受试者的表达hFXN的细胞与编码基因编辑系统的载体接触，所述基因编辑系统在转染入所述细胞中时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变，从而治疗所述线粒体疾病或障碍。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述基因编辑系统选自由CRISPR/Cas、锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶组成的组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中接触步骤包括向所述受试者施用有效量的载体。
18.根据权利要求15所述的方法，其中接触步骤包括从所述受试者获得细胞样品，将所述基因编辑系统转染到所述细胞样品中，然后将经转染的细胞移植到所述受试者。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞样品选自由血细胞和HSPC组成的组。

说明书全文

治疗线粒体障碍的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 依照35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2016年3月23日提交的序号为62/312,105的美国专利申请的优先权权益，该美国专利申请的全部内容通过引用并入本文。

[0003] 资助信息

[0004] 本发明是在国立卫生研究院授予的批准号为R21NS090066的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。

[0005] 序列表

[0006] 本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。于2017年3月13日创建的所述ASCII拷贝被命名为20378-201301_SL.txt，大小为23,442字节。

技术领域

[0007] 本发明大体上涉及线粒体疾病，更具体地涉及采用造血干细胞和祖细胞(HSPC)基因疗法治疗线粒体疾病的方法。

背景技术

[0008] 线粒体疾病是由功能紊乱的线粒体引起的一组障碍，线粒体是作为细胞的能量库的细胞器。线粒体见于人体内除红细胞之外的每个细胞中，并且将食物分子的能量转化成为大多数细胞功能供能的ATP。线粒体疾病有时是由影响线粒体功能的线粒体DNA突变引起的。线粒体疾病的其他病因是其基因产物被导入线粒体(线粒体蛋白)的核DNA的基因突变以及获得性线粒体病症。线粒体疾病呈现出独特的特征，原因在于所述疾病通常是遗传性的，还在于线粒体对细胞功能而言至关重要。这些疾病的具有肌神经疾病症状的亚类通常被称为线粒体肌病。与线粒体疾病相关的症状通常包括生长不良、肌协调性丧失、肌无力、视觉问题、听力问题、学习障碍、心脏病、肝病、肾病、胃肠障碍、呼吸障碍、神经问题、自主神经功能紊乱以及痴呆。

[0009] 线粒体疾病/障碍可以由线粒体DNA(mtDNA)或编码线粒体组分的核基因的获得性或遗传性突变导致。它们也可能是因药物、感染或其他环境原因的不利影响而获得的线粒体功能紊乱的结果。

[0010] 与核编码的线粒体蛋白共济蛋白(frataxin)的表达降低相关的最常见常染色体隐性遗传病之一是弗里德赖希氏共济失调(Friedreich’s ataxia,FRDA)，其在早期影响人。点突变导致截短的或功能紊乱的共济蛋白也已有描述。FRDA的特征在于共济失调、无反射、感觉丧失、肌无力和心肌病。症状通常始于5至15岁之间，患者将在发病后10至15年内坐上轮椅。

[0011] 在所有病例的98％中，FRDA是由导致共济蛋白基因(FXN)的第一个内含子中的GAA重复序列扩展(expansion)的基因突变引起的。在健康个体中，等位基因可含有多达约40个GAA重复序列，而FRDA患者中的扩展的等位基因可由90至1700个重复序列组成(SEQ ID NO：12)(参见图1B)。GAA重复序列扩展导致共济蛋白的表达降低，共济蛋白是一种高度保守的线粒体蛋白，主要在富含线粒体的组织(包括神经系统、肌肉和心脏)中表达。此外，与正常表达相比，载体(扩展的等位基因的杂合子)示出共济蛋白mRNA和蛋白质水平降低约50％，但它们未示出任何症状。虽然共济蛋白的功能尚未完全阐明，但它是参与Fe-S簇装配的铁结合蛋白，而且，在不存在共济蛋白时，铁在线粒体内积累，导致有缺陷的铁介导的生物合成过程和增加的氧化应激。

[0012] 在从大肠杆菌分离的超螺旋质粒中，扩展的GAA重复序列形成分子内三股螺旋体(三链体)，即所谓的H-DNA。提出了示出在扩展的GAA重复序列处形成的三链体结构的几种模型，并且最近提供了在体外病理性GAA扩展序列中嘧啶基序H-DNA结构的直接证据。此外，利用凝胶电泳和原子力显微镜在含有共济蛋白GAA重复序列的质粒中观察到形成称为“粘性DNA(sticky DNA)”的更高级结构。尚未解析出粘性DNA的分子结构；然而，目前的证据表明粘性DNA形成为一个长的分子内三链体结构或者由两个三链体缔合而成。

[0013] 所观察到的对DNA复制和转录的影响取决于质粒中GAA重复序列的长度和取向，这与特定DNA结构(H-DNA)的形成有关。最后，GAA重复序列与相邻区域中的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式以及沉默染色质的形成有关。认为GAA重复序列中H-DNA及更高级结构的存在招募染色质重构蛋白复合物，使得保持紧密的染色质结构，导致共济蛋白基因转录下调。

[0014] 大量数据已经证明，对GAA重复序列的分析构成了FRDA诊断以及临床诊断的重要部分。还进行了分子遗传测试以鉴定载体和产前测试。目前的FA诊断方法涉及聚合酶链式反应(PCR)分析和Southern印迹技术。通过扩增共济蛋白基因中含有GAA重复序列的DNA区域进行PCR测试。用于对GAA重复扩展序列作图的不同PCR反应是经典PCR、长程PCR或三重引物PCR(TP-PCR)。在所有情况下，采用琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析PCR片段的大小。在大多数情况下，将PCR和Southern印迹两者组合以补充结果。在利用PCR扩增中等尺寸和长尺寸GAA重复序列(即，重复序列数目>200)期间遇到的问题已有报道。扩展序列的重复性质及其采用H-DNA和更高级DNA结构的能力是导致聚合酶停止从而导致错误结果的两个主要因素。

[0015] 迄今为止，针对这样的线粒体疾病尚没有已知的治疗方法或预防措施，目前的疗法涉及治疗相关症状。因此，本领域需要用于治疗线粒体疾病/障碍的替代或改进方法。

发明内容

[0016] 因此，在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法。该方法包括将功能性人共济蛋白(hFXN)离体导入受试者的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并将HSPC移植入受试者，从而治疗线粒体疾病或障碍。导入步骤可包括使包含编码hFXN的多核苷酸和FXN启动子(或可与多核苷酸一起操作并且在细胞中的其他调节序列)的载体与HSPC接触并使得hFXN表达。在各种实施方案中，线粒体疾病或障碍选自以下项组成的组：弗里德赖希氏共济失调(FRDA)、糖尿病、Leigh综合征、Leber遗传性视神经病变、肌神经性胃肠性脑病和癌症。受试者可以是哺乳动物，例如人。在各种实施方案中，载体是自失活(SIN)-慢病毒载体，例如pCCL-FRDAp-FXN。在各种实施方案中，hFXN的表达在移植后约6至12个月内修正神经、心脏和肌肉并发症。在另一个方面，将hFXN多核苷酸在体内导入受试者的HSPC中。

[0017] 另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法，该方法包括使来自受试者的表达hFXN的细胞与编码基因编辑系统的载体接触，所述基因编辑系统在转染入细胞时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变，从而治疗线粒体疾病或障碍。在各种实施方案中，基因编辑系统选自由CRISPR/Cas、锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶组成的组。接触步骤可包括从受试者获得细胞样品，将基因编辑系统转染或转导到细胞样品中以产生基因经修正的细胞，然后将基因经修正的细胞移植到受试者体内。细胞样品可以是表达hFXN的任何细胞，例如来自受试者的血细胞和HSPC。

[0018] 另一方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包含与编码hFXN的多核苷酸功能性连接的启动子或调节序列。还提供了载体，例如自失活(SIN)-慢病毒载体，该载体包括调节序列(例如与编码hFXN的多核苷酸功能性连接的启动子)。附图说明

[0019] 图1A-1D是示出WT HSPC的全身移植防止YG8R小鼠中的感觉神经元变性和神经行为缺陷的图解和图示。图1A示出5月龄和9月龄的WT(n＝16)、YG8R对照(n＝4)、YG8R/YG8R HSPC(n＝5)和YG8R/WT HSPC(n＝13)小鼠的结果。采用开场测试自主活动，采用旋转杆测试协调性，采用自动步态分析系统测试步态并采用前肢握力测试肌肉力量。数据表示为平均值±sem；*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005；NS统计学上无显著性。对于三个实验组的统计学比较，使用方差(ANOVA)与作为受试者内变量测试的年龄的混合分析，然后进行独立样本t检验。图1B是示出未受影响的(上图)共济蛋白基因(FXN)的内含子1和FRDA(下图)FXN的内含子1的示图，并且按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO：15-16。图1C示出来自代表性的9月龄WT(n＝15)、YG8R对照(n＝4)、YG8R/YG8R HSPC(n＝4)和YG8R/WT HSPC(n＝11)小鼠的腰椎DRG(L5)的Nissl染色切片。YG8R对照的DRG显示出大的空泡(箭头)。比例尺：100μm。右图描绘了每个DRG区的总空泡面积；数据表示为平均值±sem；**P<0.005；***P<0.0005。NS，统计学上无显著性。图1D示出来自移植有WT GFP+HSPC的YG8R小鼠的移植后7个月用抗GFP和抗NeuN染色的代表性共聚焦图像。左图：腰椎(L5)DRG的图像显示出源自GFP+HSPC的细胞的植入遍及DRG。比例尺：100μm。放大图像(下图)显示出源自HSPC的细胞与DRG神经元的频繁紧密关联。比例尺：20μm。右图：颈椎、胸椎和腰椎脊髓图像示出在各级脊髓灰质和白质中均有丰富的HSPC植入。比例尺：250μm。图1E示出经GFP+HSPC处理的YG8R小鼠的DRG和脊髓切片的共聚焦图像。移植细胞(GFP)与神经元(NeuN)密切相关，并且用Iba1标志物共定位；比例尺：30μm。

[0020] 图2A-2E是示出移植的HSPC植入遍及脑部并防止共济蛋白缺陷毒性的图解和图示。图2A示出移植有WT GFP+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗GFP和抗NeuN标记的的脑+的代表性横剖切片。比例尺：1mm。脑部的放大图#1示出在脑室周围区域中观察到源自GFPHSPC的细胞，所述脑室周围区域包括胼胝体(cc)、侧隔核(LS)、尾状壳核(CP)、前扣带区(ACA)和体感皮质(M1，S2)。VL，侧脑室。比例尺：150μm。脑部的腹侧纹状体的放大图#2示出植入的GFP+HSPC存在于腹侧纹状体的区域中，包括前连合(aco)、伏隔核(ACB)和侧隔核(LS)。CP，尾状壳核。比例尺：150μm。放大图#3示出在腹侧苍白球(PAL)和腹侧纹状体(包括卡耶哈氏(Calleja)岛(isl)和嗅结节(OT))中观察到源自GFP+HSPC的细胞。比例尺：150μm。
还通过脑干和小脑的灰质和白质检测到GFP+HSPC。比例尺：500μm。插图描绘了小脑的齿状核(DN)和脑干的脊髓三叉神经核(Sp)内的植入。比例尺：50μm。图2B示出用抗GFP、抗Iba1和抗NeuN标记的脑部的共聚焦图像。用小胶质细胞标志物Iba1对大多数骨髓来源的GFP+细胞共定位。比例尺：30μm。图2C示出对来自WT(n＝14)、YG8R(n＝8)和YG8R/HSPC(n＝13)小鼠的小脑中的鼠共济蛋白mRNA表达的定量。数据表示为相对于以GAPDH归一化的WT的倍数变化。
数据表示为平均值±sem；**P<0.005，***P<0.0005。图2D示出代表性Western印迹的结果，其示出一只WT、一只YG8R、一只YG8R/YG8R HSPC和一只YG8R/WT HSPC小鼠(使用(+)或不使用(-)衍生化试剂)的大脑中的氧化水平。与WT(n＝6)和YG8R/HSPC(n＝6)小鼠相比，Oxyblot分析检测到9月龄YG8R(n＝4)和YG8R/YG8R HSPC(n＝4)的大脑中氧化蛋白水平显著升高。数据表示为平均值±sem；*P<0.05，NS统计学上无显著性。图2E示出与YG8R(n＝3)(左侧散点图)或YG8R/WT HSPC小鼠(n＝3)(右侧散点图)相比，来自WT动物(n＝3)的大脑中线粒体基因变化的散点图。中心线代表零(cipher)，上调和下调的基因分别用点表示。组之间显著不同的mRNA变化在单独的条形图上表示。数据表示为平均值±sem；与WT相比，*P<
0.05，**P<0.005，***P<0.0005，NS在统计学上无显著性。

[0021] 图3A-3H是示出移植的HSPC在心脏和肌肉中大量植入的图示和图解。图3A示出代表性Western印迹的结果，其使用(+)或不使用(-)衍生化试剂示出一只WT、一只YG8R和一只YG8R/HSPC小鼠的骨骼肌中的氧化水平。与WT(n＝16)和YG8R/HSPC(n＝13)小鼠相比，Oxyblot分析仅在9月龄YG8R对照(YG8R，n＝4和YG8R/YG8R HSPC，n＝5)的骨骼肌中检测到高水平的蛋白质氧化。误差条表示SEM。*p<0.05，NS统计学上无显著性。图3B示出通过质谱法对来自WT(n＝6)、YG8R(n＝3)和YG8R/WT HSPC(n＝5)小鼠的肌肉组织中的乳酸和丙酮酸的定量。与WT相比，YG8R小鼠中乳酸/丙酮酸比率显著增加，而YG8R/WT HSPC动物与WT中的乳酸/丙酮酸比率相当。误差条表示sem；*P<0.05，***P<0.0005，NS统计学上无显著性。图3C示出来自18月龄WT、YG8R对照和YG8R/WT HSPC的心脏切片的代表性Perl染色。特征性染色表明铁沉积。比例尺：50μm和15μm(变焦)。相关条形图示出来自WT(n＝4)、YG8R对照(YG8R(n＝2)、YG8R/YG8R HSPC(n＝2))和YG8R/WT HSPC(n＝3)的心脏切片中的铁定量。误差条表示sem；*P<0.05，NS统计学上无显著性。图3D-3E示出对来自WT(n＝12)、YG8R(n＝7)和YG8R/HSPC(n＝11)小鼠的心脏(图3D)和骨骼肌(图3E)中的鼠共济蛋白mRNA表达的定量。数据表示为相对于以GAPDH归一化的WT的倍数变化，误差条表示sem；*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，NS在统计学上无显著性。图3F示出来自移植有WT HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗GFP、心肌细胞标志物抗α-辅肌动蛋白和DAPI染色的心脏切片的图像。在所有心脏组织中都发现了GFP+细胞，在瓣膜中的表达最高，这表明源自HSPC的细胞通过血流进入心脏。比例尺：150μm。心脏的放大图示出在左心室(下图)和主动脉底部(上图)的高水平植入。比例尺：50μm。图3G示出来自移植有WT HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗GFP、丝状肌动蛋白+
染料鬼笔环肽和DAPI染色的骨骼肌切片。GFP细胞被均匀地植入组织中。比例尺：150μm。骨骼肌的放大图(左侧)示出GFP+细胞在肌纤维之间间隙地定位。比例尺：50μm。图3H示出来自WT(n＝5)、YG8R(n＝5)和YG8R/HSPC(n＝5)小鼠的骨骼肌中鼠MuRF-1、Atrogin-1和肌生成抑制素mRNA表达的定量。数据表示为相对于以GAPDH归一化的WT的倍数变化，误差条表示sem；*P<0.05，NS统计学上无显著性。

[0022] 图4A-4F是示出源自HSPC的细胞在体外和体内向病变细胞递送含有共济蛋白的线粒体的图示和图解。图4A和图4B示出与从DsRed Cox8-GFP转基因小鼠分离的原代巨噬细胞(M)(图4A)或与用LV-hFXN-GFP转导并用红色MitoTracker染色的IC21巨噬细胞(图4B)共培养的来自源自YG8R的成纤维细胞(F)的共聚焦成像影片的代表性画面。比例尺：10μm。图4C示出来自移植有DsRed+HSPC(对照)的YG8R小鼠的脑切片和移植有DsRed+/Cox8-GFP+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用-NeuN抗体标记的脑和脊髓切片的代表性共聚焦图像。除了源自DsRed的骨髓细胞外，在脑和脊髓中的宿主神经元中也观察到了cox8-GFP(箭头)。对于DRG、心脏和肌肉，请参见图7A和图7B。比例尺：10μm。图4D示出移植有DsRed+/Cox8-GFP+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗NeuN抗体标记的脊髓切片的代表性共聚焦图像，其示出在+DsRed小胶质细胞的分支延伸内的cox8-GFP(箭头)。比例尺：5μm。图4E示出对移植有DsRed+/Cox8-GFP+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月的颈椎脊髓灰质中含有cox8-GFP的神经元的定量(关于自动无偏差定量方法的描述请参见图8)。图4F示出来自移植有用LV-hFXN-GFP转导的DsRed+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗mcherry和抗NeuN抗体染色的脑和脊髓切片的代表性共聚焦图像。除了源自DsRed的骨髓细胞外，在宿主神经元中观察到共济蛋白-GFP。比例尺：10μm。

[0023] 图5是示出HSPC在YG8R小鼠的外周神经中的植入的图示。来自WT GFP+HSPC-移植的YG8R小鼠的坐骨神经的共聚焦图像，所述小鼠用抗GFP和神经丝标志物抗NF200和髓磷脂碱性蛋白标志物抗MBP标记。比例尺：100μm(左)，10μm(插图)。

[0024] 图6A-6F是示出HSPC在DRG及脊髓和脑中的小胶质细胞中分化成巨噬细胞的图示。图6A和6B示出用抗GFP、抗CD68(图6A)、抗MHCII(图6B)、和DAPI标记的来自移植有WT GFP+HSPC的YG8R小鼠的DRG、脊髓和脑的切片的共聚焦图像。比例尺，30μm。图6C和6D示出用抗MHCII标记的来自WT GFP+HSPC-移植的YG8R小鼠的横向脊髓(图6C)和脑(图6D)切片。比例尺，100μm(图6C)和300μm(图6D)。图6E示出用抗vwf标记的来自移植有WT GFP+HSPC的YG8R小鼠的脑切片的共聚焦图像。比例尺，50μm。图6F示出用抗RFP和抗Iba1标记的来自移植有WT DsRed+HSPC的YG8R小鼠的脉络丛的共聚焦图像。比例尺，100μm。

[0025] 图7A和图7B是示出HSPC在心脏和肌肉中分化成巨噬细胞的图示。在用抗GFP、抗CD68(图7A)、抗MHCII(图7B)、鬼笔环肽和DAPI标记后，来自移植有WT GFP+HSPC的YG8R的心脏和骨骼肌切片的共聚焦图像。比例尺，30μm。

[0026] 图8是示出源自HSPC的巨噬细胞将线粒体递送至DRG中的神经元及心脏和骨骼肌中的肌细胞的图示。来自移植有DsRed+/Cox8-GFP+HSPC的YG8R小鼠在移植后7个月用抗NeuN(DRG)、抗α-肌动蛋白(心脏)或Palloidin(肌肉)染色和DAPI(心脏和肌肉)染色的DRG、心脏和骨骼肌的代表性共聚焦图像。比例尺，10μm。

[0027] 图9A-9D是示出对从源自HSPC的小胶质细胞转移至神经元的Cox8-GFP的定量的图示和图解。图9A示出用抗NeuN染色的来自移植Cox8-GFP DsRed HSPC 7个月的YG8R小鼠的颈脊髓灰质的代表性横剖图像。比例尺，500μm。图9B示出ImagePro 软件对神经元的自动轮廓和定量。图9C示出GFP 信号仅在描绘的神经元(箭头)之内而不在之外(星形)计数。图9D示出对于三个不同动物(移植的)和一种对照，含有GFP的脊髓灰质内神经元的百分比。对来自三只实验动物和一只对照(每只动物三个切片)的整个灰质进行定量。

具体实施方式

[0028] 本发明基于以下发现：在单次移植野生型造血干细胞和祖细胞后发生线粒体障碍的完全表型修正(complete phenotypic correction)，所述野生型造血干细胞和祖细胞分化成神经系统、肌肉和心脏中的吞噬细胞，引起神经元和肌细胞交叉修正。迫切需要确定用于线粒体障碍(诸如仍没有疗法的FRDA)的有效疗法。迄今为止，采用干细胞或基因疗法的临床前研究取得了有限的成功，或是仅限于评估特定组织。

[0029] 本发明证实，含有人共济蛋白(hFXN)cDNA以及优化启动子的自失活(SIN)-慢病毒载体可用于离体经基因修正的患者的自体造血干细胞和祖细胞(HSPC)，然后可以在患者中重新移植这些自体造血干细胞和HSPC以重新填充患者的骨髓，这些骨髓将成为患者余生的“健康”细胞库。这些细胞动员并整合到病变组织(脑、肌肉、心脏)中，并引发对病变组织的拯救。尽管自体HSPC用于本文的说明性实施例中，但本领域技术人员应当认识到其他HSPC(例如，同种异体HSPC)也是有用的。

[0030] 在对本发明的组合物和方法进行描述之前，应当理解，本发明不限于所述特定组合物、方法和实验条件，原因在于这样的组合物、方法和条件可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意于限制，因为本发明的范围只由所附权利要求限定。

[0031] 如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“an”，以及“the”包括复数指代，。因此，例如，提及“该方法/所述方法”时包括在阅读本公开等后对于本领域技术人员而言变得显而易见的一种或更多种方法，和/或本文所述类型的步骤。

[0032] 与“包含”、“含有”或“特征在于”可互换使用的术语“包括”是包括性语言或开放式语言，并且不排除其它未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些。本发明涵盖对应于这些短语中的每一个的范围的本发明组合物和方法的实施方案。因此，包括所记载的要素或步骤的组合物或方法涵盖其中所述组合物或方法基本上由这些要素或步骤组成或者由这些要素或步骤组成的特定实施方案。

[0033] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但现在对优选的方法和材料进行描述。

[0034] 如本文所用，术语“受试者”或“宿主生物”是指对其实施本发明方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但是如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此受试者的定义还包括其他动物，包括哺乳动物，例如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子；农场动物，包括牛、马、山羊、绵羊、猪等，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)等。

[0035] 术语“治疗有效量”或“有效量”是指将化合物或药物组合物的引起研究人员、兽医、医生或其他临床人员所寻求的组织、系统、动物或人的生物响应或医学响应的量。因此，术语“治疗有效量”在本文中用于表示制剂的当在一段时间内重复施用于受影响区域时引起疾病状况显著改善的任何量。该量将随所治疗的病症、病症的发展阶段以及所用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定的实例中，适当的量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者能够通过常规实验确定。

[0036] 如本文所用，“治疗效果”包括如本文所述的治疗益处和/或预防益处。

[0037] 术语“施用(administration)”或“施用(administering)”定义为包括向需要治疗的受试者提供本发明的化合物或药物组合物的行为。本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”是指除经肠施用和局部施用以外的施用方式，通常是经口或通过注射，包括但不限于通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、动脉内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨下注射和输注。本文所用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指将化合物、药物或其他物质直接施用于中枢神经系统，使其进入受试者的系统，并且因而进行新陈代谢及其他类似过程，例如皮下施用。

[0038] 如果不能获得对细胞类型具有特异性的病毒载体，则可以将载体修饰为表达对在靶细胞上表达的配体(或受体)具有特异性的受体(或配体)，或者可以将载体包封在脂质体内，也可以将载体修饰为包括这样的配体(或受体)。可以通过各种方法将肽试剂引入细胞中，包括例如通过改造肽以包含蛋白质转导结构域，例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导结构域，其可以促进肽向细胞中易位。此外，还有各种基于生物材料的技术，例如也可以对其进行修饰以适应该技术的纳米笼和药物递送晶片(例如用于脑癌化学治疗剂)。

[0039] 最常评估用于基因转移的病毒载体基于DNA基腺病毒(Ads)和腺相关病毒(AAV)以及RNA基逆转录病毒和慢病毒。慢病毒载体最常用于实现染色体整合。

[0040] 如本文所用，术语“降低”和“抑制”一起使用，因为认识到在一些情况下，减少可以降低至低于特定测定的检测水平。因此，可能并不总是清楚表达水平或活性是“降低”低于测定的检测水平，还是被完全“抑制”。然而，在根据本发明方法进行治疗后，这将是可以清楚地确定的。

[0041] 如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指将组合物施用于患有非期望病症的受试者或系统。该病症可包括疾病或障碍。“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指将组合物施用于有患病风险的受试者或系统。该病症可包括对疾病或障碍的易感性。将组合物施用于受试者(治疗和/或预防)的效果可以是，但不限于，停止病症的一种或更多种症状、减少或预防病症的一种或更多种症状、降低病症的严重程度、完全消除病症、特定事件或特征的发展或进展的稳定化或延迟，或者特定事件或特征发生的机会最小化。

[0042] 如本文所用，术语“遗传修饰”用于指以非自然条件下发生的方式对生物体遗传物质进行的任何操作。进行这样的操作的方法是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于利用载体以用目的核酸序列转化细胞的技术。定义中包括各种形式的基因编辑，在所述基因编辑中，使用工程化核酸酶或“分子剪刀”在生物体的基因组中插入、缺失或替换DNA。这些核酸酶在基因组中的期望位置处产生位点特异性双链断裂(DSB)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复，导致靶向突变(即，编辑)。

[0043] 几个工程化核酸酶家族用于基因编辑中，例如但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应因子的核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas系统。

[0044] CRISPR(成簇的、规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是包含多个、短的、直接重复的碱基序列的DNA基因座的首字母缩写。已经使得原核生物CRISPR/Cas系统适合用作在真核生物中使用的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)(参见，例如，Cong，Science，15:339(6121):819-823(2013)和Jinek等，Science，337(6096)：816-21(2012))。通过用包含Cas基因和特别设计的CRISPR的元件转染细胞，可以在任何期望的位置切割和修饰核酸序列。使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法详细描述于美国公开No.2016/0340661、美国公开No.20160340662、美国公开No.2016/0354487、美国公开No.2016/0355796、美国公开US No.20160355797和WO2014/018423中，其全部内容通过引用明确并入本文。

[0045] 因此，如本文所用，“CRISPR系统”统称为参与表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的转录物及其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(包括“直接重复序列”和在内源CRISPR系统的背景下的tracrRNA处理的部分直接重复序列)、引导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔序列”、“引导RNA”或“gRNA”)，或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。与引导序列可操作地连接的一个或更多个tracr配对序列(例如，直接重复序列-间隔序列-直接重复序列)在通过核酸酶加工之前也可以称为“crRNA前体”(CRISPR RNA前体)或在通过核酸酶加工之后称为crRNA。

[0046] 在一些实施方案中，tracrRNA和crRNA连接并形成嵌合的crRNA-tracrRNA杂合体，其中成熟的crRNA通过合成茎环与部分tracrRNA融合以模拟天然crRNA：tracrRNA双链体，如Cong，Science 15：339(6121)：819-823(2013)和Jinek等，Science，337(6096)：816-21(2012)中所述。单个融合的crRNA-tracrRNA构建体也可称为引导RNA或gRNA(或单引导RNA(sgRNA))。在sgRNA内，crRNA部分可以被鉴定为“靶序列”，并且tracrRNA通常被称为“支架”。

[0047] 一旦鉴定出期望的DNA靶序列，即有许多资源可用于帮助实施者确定合适的靶位点。例如，许多公共资源，包括通过生物信息学生成的靶向超过40％的人外显子的约190,000个潜在sgRNA的列表，可用于辅助实施者选择靶位点和设计相关sgRNA以影响位点处的切口或双链断裂。另请参阅crispr.u-psud.fr，这是一种旨在帮助科学家在广泛物种中找到CRISPR靶向位点并生成合适的crRNA序列的工具。

[0048] 在一些实施方案中，将驱动CRISPR系统的一种或更多种元件的表达的一种或更多种载体引入靶细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或更多个靶位点处形成CRISPR复合物。虽然在不同的工程化CRISPR系统中细节可以变化，但总体方法是相似的。对使用CRISPR技术来靶向DNA序列感兴趣的实施者可以将含有靶序列的短DNA片段插入引导RNA表达质粒中。sgRNA表达质粒含有靶序列(约20个核苷酸)以及合适的启动子和在真核细胞中适当加工的必需元件，所述靶序列是一种形式的tracrRNA序列(支架)。这样的载体可商购获得(参见，例如，Addgene)。许多系统依赖于常规的互补寡核苷酸，所述互补寡核酸被退火以形成双链DNA，然后克隆到sgRNA表达质粒中。来自相同或不同质粒的sgRNA和合适的Cas酶在转染细胞中的共表达导致单链或双链在期望的靶位点处断裂(取决于Cas酶的活性)。

[0049] 锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制酶。可以改造锌指结构域以靶向特定的期望DNA序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的特殊序列。通过利用内源DNA修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物的基因组。最常见的切割结构域是IIS型酶Fok1。Fok1催化DNA的双链切割，在一条链上的识别位点为9个核苷酸，另一条链上的识别位点为13个核苷酸。请参见，例如，美国专利No.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等，Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 89(1992):4275-
4279；Li等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2764-2768(1993)；Kim等
.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:883-887(1994a)；Kim等.J.Biol.Chem.269:31,978-31,982(1994b)，所有这些文献都通过引用并入本文。这些酶中的一种或更多种(或其酶促功能片段)可用作切割结构域的来源。

[0050] 转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)具有与ZFN类似的整体结构，主要区别在于DNA结合结构域来自TAL效应因子蛋白，该TAL效应因子蛋白是来自植物病原细菌的转录因子。TALEN的DNA结合结构域是氨基酸重复序列的串联阵列，长度分别为约34个残基。重复序列彼此非常相似；通常它们主要在两个位置(氨基酸12和13，称为重复可变双残基或RVD)不同。每个RVD指定优先结合四种可能的核苷酸之一，这意味着每个TALEN重复结合单个碱基对，但是已知NN RVD除鸟嘌呤外还结合腺嘌呤。TAL效应因子DNA结合在机制上了解得不如锌指蛋白质那么好，但它们看似更简单的编码可证明对工程化核酸酶设计非常有益。TALEN还作为二聚体切割，具有较长的靶序列(迄今为止报道的最短的每个单体结合13个核苷酸)并且对于结合位点之间的间隔区长度的要求似乎不如ZFN严格。单体TALEN和二聚体TALEN可包括超过10个、超过14个、超过20个或超过24个重复序列。改造TAL以结合特定核酸的方法描述于：Cermak等，Nucl.Acids Res.1-11(2011)；美国公开申请No.2011/0145940，其公开了TAL效应因子和使用所述TAL效应因子修饰DNA的方法；Miller等，Nature Biotechnol 29：143(2011)，其报道了通过将TAL截短变体与Fok1核酸酶的催化结构域相连来制备用于位点特异性核酸酶结构的TALEN。已示出，所得TALEN在永生化人细胞中诱导基因修饰。TALE结合结构域的一般设计原理可见于例如WO2011/072246。上述每篇参考文献都通过引用整体并入本文。

[0051] 本文所述的基因组编辑系统的核酸酶活性切割靶DNA以在靶DNA中产生单链或双链断裂。双链断裂可由细胞以两种方式之一修复：非同源末端连接和同源介导的修复。在非同源末端连接(NHEJ)中，通过断裂末端彼此直接连接来修复双链断裂。因此，没有新的核酸物质插入该位点，但是一些核酸物质可能丧失，从而导致缺失。在同源介导的修复中，将与切割的靶DNA序列具有同源性的供体多核苷酸用作修复切割的靶DNA序列的模板，使得遗传信息从供体多核苷酸转移至靶DNA。由此，可以将新的核酸物质插入/复制到该位点。因此，在一些实施方案中，基因组编辑载体或组合物任选地包括供体多核苷酸。由NHEJ和/或同源介导的修复引起的靶DNA修饰可用于诱导基因修正、基因替换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变等。

[0052] 因此，基因组编辑载体或组合物对DNA的切割可用于通过切割靶DNA序列并使得细胞在不存在外源地提供的供体多核苷酸的情况下修复序列来从靶DNA序列中缺失核酸物质。或者，如果基因组编辑组合物包含供体多核苷酸序列，所述供体多核苷酸序列至少含有与靶DNA序列具有同源性的区段，则该方法可用于将核酸物质添加(即，插入或替换)至靶DNA序列(例如，“敲入”编码蛋白质、siRNA、miRNA等的核酸)、用于添加标签(例如，6xHis(SEQ ID NO：13)、荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质；黄色荧光蛋白等)、血凝素(HA)、FLAG等)、用于向基因中加入调节序列(例如，启动子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入序列(IRES)、2A肽、启动密码子、终止密码子、剪接信号、定位信号等)，以修饰核酸序列(例如，引入突变)等。因此，该组合物可用于以位点特异性方式修饰DNA，所述位点特异性方式即如在例如基因疗法中是使用的“靶向”方式，例如基因敲除、基因敲入、基因编辑、基因标记等。

[0053] 在本文中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于如下所述氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。

[0054] 术语“氨基酸”是指天然氨基酸和合成氨基酸，以及以与天然氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α 碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以与天然氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。

[0055] 氨基酸在本文中可以由它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以由它们的通常被接受的单字母代码来指代。

[0056] 如本文所用，“调节基因”或“调节序列”是编码产物(例如，转录因子)的核酸序列，其控制其他基因的表达。

[0057] 如本文所用，“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是在受适当的调节序列控制时在体外或体内转录成mRNA(在DNA的情况下)和被翻译成多肽(在mRNA的情况下)的核酸序列。编码序列的边界通过5'末端(N末端)的起始密码子和3'末端(C末端)的翻译终止无义密码子确定。编码序列可包括但不限于来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列和合成的核酸。转录终止序列通常位于编码序列的3'。

[0058] 如本文所用，“启动子”定义为通常位于基因上游的调节DNA序列，其通过指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成来介导转录起始。启动子可以是组成型活性启动子(即，持续地处于活性/“ON”状态的启动子)；它可以是诱导型启动子(即，其状态，活性/“ON”或失活/“OFF”受外部刺激控制的启动子，所述外部刺激例如为特定化合物或蛋白质的存在)；它可以是空间限制性启动子(即，转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)；它可以是时间限制性启动子(即，在胚胎发育的特定阶段或在生物过程的特定阶段期间，启动子处于“ON”状态或“OFF”状态)。

[0059] 如本文所用，术语“基因”是指包含结构基因的编码区的脱氧核糖核苷酸序列。“基因”还可以包括位于5'末端和3'末端两者的编码区附近的非翻译序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'并且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA形成和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”的以非编码序列中断的编码区。内含子是转录成异源核RNA(hnRNA)的基因区段。内含子可能含有调节元件，例如增强子。内含子被从核或初级转录物中移除或“剪接”出来；因此，在信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译过程中起作用以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。

[0060] 如本文所用，术语“功能性连接”和“可操作地连接”可互换使用，并且指两个或更多个DNA区段之间的功能关系，特别是待表达的基因序列和控制其表达的那些序列之间的功能关系。例如，如果启动子/增强子序列(包括顺式作用转录控制元件的任何组合)在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。与转录的基因序列可操作地连接的启动子调节序列在物理上与转录序列邻接。

[0061] “保守地修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守地修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子均可被改变为任意所述相应密码子而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守地修饰的变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(AUG和TGG除外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。

[0062] 关于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个改变、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸)是“保守地修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸替换氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守替换表在本领域中是公知的。这样的保守地修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源序列和等位基因的补充，并且不排除本发明的多态变体、种间同源序列和等位基因。

[0063] 如本文所用的，术语“抗体”是指多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，及其免疫结合等同物。术语“抗体”是指均相分子实体或混合物，例如由多种不同分子实体构成的多克隆血清产品，并且广泛地包括天然形式的抗体(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体，例如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体和多特异性抗体。术语“抗体”还指所有前述的片段和衍生物，并且可以进一步包含保留特异性结合表位的能力的任何经修饰变体或衍生的变体。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。单克隆抗体能够选择性结合靶抗原或表位。抗体可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化抗体或嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段，例如，由Fab表达文库、抗独特型(抗Id)抗体、胞内抗体、纳米抗体、合成抗体和任意上述的表位结合片段所产生的。

[0064] 如本文所用，术语“人源化小鼠”(Hu-小鼠)是开发用于携带功能性人基因、细胞、组织和/或器官的小鼠。人源化小鼠通常在用于人类治疗的生物学和医学研究中用作小动物模型。免疫缺陷型小鼠通常用作人细胞或组织的接受者，原因是它们由于缺乏宿主免疫力而可以相对容易地接受异源细胞。

[0065] HSC具有多能性的能力(即，一种HSC可以分化成全部功能性血细胞)和自我更新能力(即，HSC可以分裂并产生相同的子细胞，而没有分化)。通过一系列谱系定型步骤，HSC产生逐渐丧失自我更新能力的后代，并逐渐变得越来越受限于其分化能力，产生多潜能和谱系定型的祖细胞，以及最终成熟的功能性循环血细胞。

[0066] 造血干细胞和祖细胞(HSPC)自我更新和分化的能力是终生造血的形成和维持的基础，并且这些过程的失调可能导致严重的临床后果。HSPC对于它们在移植时重建造血系统的能力也非常有价值，这使得它们能够在临床中用于治疗多种障碍，包括骨髓衰竭、骨髓增生性障碍以及其他影响血细胞的获得性或遗传性障碍。

[0067] 如本文所用，“多能细胞”是指源自如下所述胚细胞的细胞，所述胚细胞通过激活含有所有雌性或雄性来源的DNA的细胞产生，所述多能细胞可以以未分化状态在体外维持延长的理论上无限期的时间，可以产生不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层。“胚胎干细胞”(ES细胞)是源自胚泡的内细胞团的多能干细胞，胚泡是早期植入前胚胎。

[0068] 如本文所用，“可药用载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，和各种类型的润湿剂。

[0069] 本工作成果表明，一次性造血干细胞和祖细胞(HSPC)移植具有成为与线粒体功能紊乱相关的疾病或障碍的终生治愈性疗法的潜力。鉴于与同种异体干细胞移植相关的风险，目标是开发出线粒体疾病的自体HSPC基因疗法。

[0070] 如上所述，线粒体疾病/障碍可以由线粒体DNA(mtDNA)或编码线粒体组分的核基因的获得性或遗传性突变导致。它们也可能是由于药物、感染或其他环境原因的不利影响而获得的线粒体功能紊乱的结果。

[0071] 线粒体疾病的实例包括但不限于线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、Leigh综合征、亚急性硬化性脑病、神经病、共济失调、色素性视网膜炎和上睑下垂(NARP)、肌神经性胃肠性(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合征(MERRF)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸性酸中毒、中风样症状(MELAS)、线粒体神经胃肠脑肌病(MNGIE)以及由线粒体复合物缺乏引起的疾病，例如弗里德赖希氏共济失调(FRDA)。

[0072] FRDA是进行性致死的多发全身性疾病。尽管FXN的确切功能仍在争论之中，但预计它将有助于线粒体铁硫簇的生物发生。因此，共济蛋白缺乏导致细胞铁代谢改变、线粒体铁负荷增加、线粒体能量产生和生物发生减少以及氧化应激增加。临床特征包括步态和肢体共济失调、肌无力、构音障碍以及视力和听力异常、糖尿病和心肌病。共济蛋白缺乏特别影响神经元功能，主要影响外周和中枢神经系统(CNS)，导致背根神经节(DRG)的进行性破坏。这种进行性神经变性导致运动技能丧失和进行性肌肉退化，最终无法在发病后10至15年内行走。心脏异常导致60％至80％的受影响个体过早死亡；平均死亡年龄在三十五岁左右。药理化合物对抗氧化应激(idebone和辅酶Q10)或线粒体铁积累(deferipone)的不同临床试验未能证明有效。使用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的表观遗传方法目前正在I期临床试验中进行测试。

[0073] 造血干细胞和祖细胞(HSPC)因其易于分离、自我更新能力和安全性而成为用于再生医学和细胞替代疗法的理想候选者。因此，本发明评估了在FRDA的小鼠模型中造血干细胞和祖细胞(HSPC)移植的影响。使用HSPC来治疗FRDA的理由来自先前针对胱氨酸病(一种多发全身性溶酶体贮积症)的研究。简而言之，使用在强的、遍在的、短的少内含子人延伸因子1α(EFS)启动子的控制下的含有人CTNS cDNA的自失活(SIN)-慢病毒载体在被致命地辐照的Ctns-/-小鼠(胱氨酸病的小鼠模型)中移植HSPC导致源自HSPC的细胞在所有器官中大量移植，这与组织胱氨酸水平的显著降低相关(降低高达94％)。这种治疗还导致肾脏结构和功能的长期保持、拯救眼缺陷和甲状腺功能紊乱。这些数据表明，单次HSPC移植可以在小鼠生命期预防多器官衰竭。然而，这些结果特别出人意料，因为胱氨酸是一种遍在的溶酶体跨膜蛋白。解决了细胞机制，证明了移植的HSPC在分化成巨噬细胞后通过隧道纳米管(TNT)转移带有胱氨酸的溶酶体。在体内，巨噬细胞衍生的管状延伸体穿透致密的管状基底膜并将含有胱氨酸的溶酶体递送到Ctns-/-小鼠的上皮细胞中，从而防止近端小管变性。已经证实，移植有HSPC的Ctns-/-小鼠的眼睛和甲状腺具有相同的机制。

[0074] 然而，相比于CTNS基因，共济蛋白的过表达是有毒的。因此，一种策略是产生新的如下所述慢病毒构建体，其中FXN将在其自身启动子的控制下表达，并在体外和体内测试该策略的功效和安全性。或者，或除此之外，考虑使用基因编辑技术去除三核苷酸延伸突变以修正FRDA HSPC中的缺陷。

[0075] 因此，在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法。该方法包括将功能性人共济蛋白(hFXN)离体导入受试者的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，然后将HSPC移植入受试者中，从而治疗线粒体疾病或障碍。导入步骤可包括使包含编码hFXN的多核苷酸和遍在的或内源的FXN启动子的载体与HSPC接触并使hFXN表达。在各种实施方案中，载体是自失活(SIN)-慢病毒载体，例如pCCL-EFS-FXN或pCCL-FRDAp-FXN。在各种实施方案中，hFXN的表达在移植后约6至12个月内修正神经、心脏和肌肉并发症。

[0076] 人和小鼠共济蛋白(FRDA)的核酸序列在本领域中是已知的。参见，例如，GenBank登录号：U43747.1，人共济蛋白mRNA，完整cds，其提供核酸序列(SEQ ID NO：1)：

[0077] TTTACAGGGCATAACTCATTTTATCCTTACCACAATCCTATGAAGTAGGAACTTTTATAAAACGCATTTTATATNCAAGGGCACAGAGAGGNTAATTAACTTGCCCTCTGGTCACACAGCTAGGAAGTGGGCAGAGTACAGATTTACACTAGGCATCCGTCTCCTGNCCCCACATANCCAGCTGCTGTAAACCCATACCGGCGGCCAAGCAGCCTCAATTTGTGCATGCACCCACTTCCCAGCAAGACAGCAGCTCCCAAGTTCCTCCTGTTTAGAATTTTAGAAGCGGCGGGCCACCAGGCTGCAGTCTCCCTTGGGTCAGGGGTCCTGGTTGCACTCCGTGCTTTGCACAAAGCAGGCTCTCCATTTTTGTTAAATGCACGAATAGTGCTAAGCTGGGAAGTTCTTCCTGAGGTCTAACCTCTAGCTGCTCCCCCACAGAAGAGTGCCTGCGGCCAGTGGCCACCAGGGGTCGCCGCAGCACCCAGCGCTGGAGGGCGGAGCGGGCGGCAGACCCGGAGCAGCATGTGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAACGTGGCCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGATCTAGGAACCTATGTGATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTTCTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTGGTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTGATGCCCAGCCCCGTTTTAAGGACATTAAAAGCTATCAGGCCAAGACCCCAGCTTCATTATGCAGCTGAGGTGTGTTTTTTGTTGTTGTTGTTGTTTATTTTTTTTATTCCTGCTTTTGAGGACACTTGGGCTATGTGTCACAGCTCTGTACAAACAATGTGTTGCCTCCTACCTTGCCCCCAAGTTCTGATTTTTAATTTCTATGGAAGATTTTTTGGATTGTCGGATTTCCTCCCTCACATGATACCCCTTATCTTTTATAATGTCTTATGCCTATACCTGAATATAACAACCTTTAAAAAAGCAAAATAATAAGAAGGAAAAATTCCAGGAGGGAAAAAAAAAAAA；

[0078] GenBank登录号：U43747.1：526-1158，人共济蛋白mRNA，完整cds，其提供核酸序列(SEQ ID NO：2)：

[0079] ATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAACGTGGCCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGATCTAGGAACCTATGTGATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTTCTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTGGTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTGA；

[0080] GenBank登录号：U95736.1，小鼠(Mus musculus)共济蛋白mRNA，完整的cds，其提供核酸序列(SEQ ID NO：3)：

[0081] CGGCCGCGGAGCTGGAGTAGCATGTGGGCGTTCGGAGGTCGCGCAGCCGTGGGCTTGCTGCCCCGGACGGCGTCCCGGGCCTCCGCCTGGGTCGGGAACCCGCGCTGGAGGGAACCGATCGTAACCTGCGGCCGCCGAGGCCTACATGTCACAGTCAACGCCGGCGCCACCCGCCACGCCCATTTGAACCTCCACTACCTCCAGATTCTGAACATCAAAAAGCAGAGCGTCTGCGTGGTGCATTTGAGGAACTTGGGGACATTGGACAACCCAAGCTCTCTAGACGAGACAGCGTATGAAAGACTGGCGGAAGAGACCCTGGACTCCCTGGCCGAGTTCTTTGAAGACCTCGCAGACAAGCCCTATACCCTGGAGGACTACGATGTCTCTTTTGGGGATGGCGTGCTCACCATTAAGCTGGGCGGGGATCTAGGGACCTACGTGATCAACAAGCAGACCCCAAACAAGCAAATCTGGCTGTCTTCTCCTTCCAGCGGCCCCAAGCGCTATGACTGGACCGGGAAGAACTGGGTGTACTCTCATGACGGCGTGTCTCTGCATGAGCTGCTGGCCAGGGAGCTGACTAAAGCTTTAAACACCAAACTGGACTTGTCTTCATTGGCCTATTCTGGAAAAGGCACTTGACTGCCAGCCAGATTCCAAGACATTAAACACTGTCAGGTGAAGACCCCCAGCCTCCTCCTGTAGCTGAATGTCTGCCTTCCCATACCTGCTCCTGAAGATAGTCACACCGTGTGTGACAGCTCTGTGAAAAAAGTGTGTTCCCTCCCACCCTGTCCCCGGACCTGGCTCTTCATTTCTACAGACATTTGTTAGGATTATGTCATTTGCTCCCCAACCTGAGACCTCTGGTCTCTTAGAAAGTCTTATATGCTGGGCAGTGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTCGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTGGAGGCCAGCCTGGTTTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGACTACACAGAGAAACCCTGTGTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAGTCTTACACCACAAGTGTGTCCATGATATAACAGCC；

[0082] 和GenBank登录号：U95736.1：22-645小鼠(Mus musculus)共济蛋白mRNA，完整的cds，其提供核酸序列(SEQ ID NO：4)：

[0083] ATGTGGGCGTTCGGAGGTCGCGCAGCCGTGGGCTTGCTGCCCCGGACGGCGTCCCGGGCCTCCGCCTGGGTCGGGAACCCGCGCTGGAGGGAACCGATCGTAACCTGCGGCCGCCGAGGCCTACATGTCACAGTCAACGCCGGCGCCACCCGCCACGCCCATTTGAACCTCCACTACCTCCAGATTCTGAACATCAAAAAGCAGAGCGTCTGCGTGGTGCATTTGAGGAACTTGGGGACATTGGACAACCCAAGCTCTCTAGACGAGACAGCGTATGAAAGACTGGCGGAAGAGACCCTGGACTCCCTGGCCGAGTTCTTTGAAGACCTCGCAGACAAGCCCTATACCCTGGAGGACTACGATGTCTCTTTTGGGGATGGCGTGCTCACCATTAAGCTGGGCGGGGATCTAGGGACCTACGTGATCAACAAGCAGACCCCAAACAAGCAAATCTGGCTGTCTTCTCCTTCCAGCGGCCCCAAGCGCTATGACTGGACCGGGAAGAACTGGGTGTACTCTCATGACGGCGTGTCTCTGCATGAGCTGCTGGCCAGGGAGCTGACTAAAGCTTTAAACACCAAACTGGACTTGTCTTCATTGGCCTATTCTGGAAAAGGCACTTGA；

[0084] 在另一个方面，治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法包括使来自受试者的表达hFXN的细胞与编码基因编辑系统的载体接触，所述基因编辑系统在转染到细胞中时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变，从而治疗线粒体疾病或障碍。在各种实施方案中，基因编辑系统选自CRISPR/Cas、锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶。接触步骤可以离体进行，首先从受试者获得细胞样品，将基因编辑系统转染到细胞样品中，然后将转染的细胞移植到受试者体内，从而治疗线粒体疾病或障碍。细胞样品可以是表达hFXN的任何细胞，例如受试者的血细胞或HSPC。

[0085] 除溶酶体外，线粒体可通过隧道纳米管(TNT)容易地转移。使用YG8R小鼠模型，因此对HSPC移植是否可以拯救FRDA进行了测试。前提是线粒体交叉修正将通过由源自HSPC的巨噬细胞产生的TNT在所有受损组织中发生。YG8R小鼠目前被认为是FRDA的最佳动物模型，因为它们仅表达含有280个GAA重复序列的人突变的共济蛋白(SEQ ID NO：14)，而没有内源性鼠共济蛋白，fxn-/-FXN+。该小鼠模型表现出共济蛋白表达降低57％，导致包括共济失调的轻度进行性表型，以及与FRDA患者的临床表现类似的协调和运动异常。小鼠示出DRG的大感觉神经元变性，并且脑、心脏和骨骼肌中的乌头酸酶活性降低以及氧化的蛋白质增加。因此，与FRDA的组织特异性条件性FXN敲除模型相比，该小鼠模型的优点是与人类相似的遗传缺陷，并且针对相同动物模型中的CNS、心脏和骨骼肌测试了干细胞疗法的影响。HSPC移植对YG8R小鼠的影响令人印象深刻，因为就经过治疗小鼠而言，完全救治了神经系统并发症和肌无力，其功能、组织学和生物化学特性均与野生型(WT)小鼠相当。

[0086] 本发明还证明了HSPC在脑、脊髓、DRG、肌肉和心脏中分化成吞噬细胞并将共济蛋白转移至相邻的病变细胞。这些数据代表了可通过HSPC移植治疗FRDA的第一个概念证据，以及使得在小鼠模型中生理性拯救与FRDA相关的并发症的第一治疗策略。

[0087] 鉴于与同种异体HSPC移植相关的发病率和死亡率的高风险，在考虑风险/益处比之后，同种异体HSPC移植对于许多疾病仍然是不确定的治疗选择。主要并发症是移植物对抗宿主疾病(GVHD)，在20％至32％的患者中发生II-IV级急性GVHD，在16％至59％的患者中发生慢性GVHD，这两种情况都显著影响接受者的存活率。此外，与骨髓清除方案和免疫抑制药物相关的高感染风险占死亡的16％至19％。由于避免了免疫排斥和GVHD的风险，自体HSPC移植是一种更安全的方法。因此，在胱氨酸病的情况下，开发出了使用含有人CTNS cDNA的自失活(SIN)-慢病毒载体(LV)的自体HSPC移植，并在Ctns-/-小鼠中对该策略进行了测试。因此，示出转导的细胞能够降低所有组织中的胱氨酸含量并使得肾功能改善。使用从健康供体和胱氨酸病患者的外周血中分离的人CD34+HSPC的体外研究现已完成，并且Ctns-/-小鼠中的连续移植已经有了显著进展。

[0088] 因此，本发明提供了一种用于离体基因修饰的HSPC的自体移植以导入功能性共济蛋白的方法。在各种实施方案中，该方法包括使用pCCL SIN-LV载体或基因编辑来去除HSPC中内源性hFXN的三核苷酸延伸突变。如本文所证明的，已经证实，该方法在YG8R小鼠模型中是有效的。这代表了FRDA的独特治疗方法，在完成药理学/毒理学研究后应该进行该疾病的临床试验。已经在体外和体内对FRDA的基因疗法进行了测试，并取得了成功的结果。用含有人FXN(hFXN)cDNA或完整基因组DNA的不同病毒载体、腺相关病毒(AAV)、LV或1型单纯疱疹病毒(HSV-1)来感染源自FRDA患者的人成纤维细胞导致响应于氧化应激，WT细胞表型部分或完全恢复。使用HSV-1载体在条件性神经元fxn敲除小鼠的神经系统中递送人FXN cDNA引起运动协调的完全恢复。在心脏和骨骼肌条件性共济蛋白敲除小鼠模型(MCK小鼠)中腹膜内注射含有hFXN cDNA的AAV-9载体，使小鼠的寿命加倍并改善了其心脏功能。最近报道了通过静脉内注射AAV9-hFXN cDNA实现了MCK小鼠中严重心肌病的完全预防和逆转。

[0089] 相对于迄今为止针对FRDA测试的基因疗法，本发明提供了使用SIN-LV或基因编辑来修正HSPC用于全身性治疗策略。源自慢病毒的载体由于其优异的基因转移效率和更好的生物安全性，已经取代了用于基因疗法的γ-逆转录病毒载体。实际上，迄今为止在临床试验或动物模型中观察到的所有白血病并发症的病例都涉及使用含有强增强子/启动子的LTR的逆转录病毒载体，其可以触发远程增强子活化。相比之下，在其LTR中有缺失的第三代慢病毒载体SIN-LV仅含有一个内部增强子/启动子，这降低了与附近细胞基因相互作用的发生率，从而降低了致癌整合的风险。SIN-LV还被设计用于防止在用生产所必需的三种包装质粒生产病毒上清液期间产生具有复制能力的慢病毒(RCL)的可能性。慢病毒载体有效地转导HSPC并且不改变它们的再增殖特性，这使得这种类型的载体成为干细胞基因治疗的有吸引力的载体。

[0090] 使用SIN-LV来对人HSPC进行基因修正的临床试验正在美国和欧洲针对包括HIV-1、β-地中海贫血、免疫缺陷、代谢疾病和癌症在内的几种病症进行。对于免疫缺陷障碍，目前已有35位患者接受了经SIN-LV修饰的HSPC移植。肾上腺脑白质营养不良(ALD)患者的临床试验已经在2位患者的约20％的造血细胞中实现了稳定的基因修正。在三年的随访期间，脑脱髓鞘被抑制而没有进一步进展，这代表了与同种异体移植后观察到的临床结果相当的临床结果；没有证据表明克隆占优势。最近报道了在移植后32个月的3位患者中Wilskott-Aldrich综合征的临床试验。经基因修饰的HSPC(25-50％)的稳定和长期植入引起血小板计数改善、防止出血和感染，以及湿疹消退。最近报道了针对三名患有异染性脑白质营养不良的症状前患者的另一项临床成功。转导的细胞衍生的血细胞植入达到45％至80％，并且长达24个月后，蛋白质活性在脑脊液中重建至高于正常值，并具有明显的治疗益处。

[0091] 由于弗里德赖希氏共济失调是由共济蛋白蛋白缺乏引起的单基因疾病，因此基因疗法似乎是一种有前景的替代治疗方法。最近在MCK小鼠中使用AAV载体的基因疗法不仅成功地在给予症状前动物时预防了心力衰竭，而且在发病后给予时也逆转了心肌病。虽然令人鼓舞，但这种方法存在潜在的安全性问题和逻辑问题：i)通过直接病毒注射到受影响部位的局部递送在进入诸如心脏和大脑等部位时会带来某些挑战，并且仅引起组织特异性挽救，ii)全身性AAV递送仍然因所必需的高水平载体而难以在人中进行，导致载体合成和安全性问题。相比之下，HSPC基因疗法具有以下关键优势：i)通过单次输注干细胞治疗所有并发症；ii)基因修正将在受控环境中离体发生，使得在移植前进行细胞表征；iii)经基因-修正后的HSPC将在移植后存在于骨髓环境(niche)中，它们将在骨髓环境中自我更新并成为患者生命周期的健康细胞库；iv)与同种异体移植相比，它避免了免疫反应。因此，自体HSPC基因疗法可以治疗目前尚无治疗方法的致死性疾病FRDA。

[0092] 本文提供的另一创新方面是HSPC作为功能性线粒体基因的递送载体的用途。许多疾病例如代谢障碍、癌症、心血管障碍和神经退行性障碍与线粒体功能紊乱有关。遗传性线粒体疾病较常见，每5,000名儿童中就有1名患病，常常导致致命疾病。虽然已经进行了许多尝试以向病变细胞和组织递送健康的线粒体，但是这些方法的功效有限并且通常是短期的。

[0093] 本发明证明，WT HSPC在年轻成年YG8R小鼠中的单次全身移植完全阻止FRDA病理学的发展，所述FRDA病理学包括神经行为缺陷、肌无力和DRG感觉神经元退化。外源性HSPC移植的一个优点是这些细胞能够永久地替换/重新填充骨髓并从其环境迁移以在多个病变组织内分化成吞噬细胞类型。HSPC甚至可以跨越血脑屏障转移并作为分化的小胶质细胞在CNS内移植。与全身辐照相反，这种现象通过组织损伤甚至通过使用白消安介导的骨髓清除而增强，这增强了该工作用于治疗FRDA的临床相关性。相一致地，已经示出移植的HSPC在YG8R小鼠的CNS内分化成小胶质细胞，而且在FRDA病理学并发症的主要部位DRG、外周神经、骨骼肌和心脏中分化成巨噬细胞。

[0094] 与YG8R对照相比，经WT HSPC处理的小鼠中线粒体功能的恢复通过生物化学、分子和组织学研究得到证实。首先，与对照同窝小鼠相比，在经WT HSPC处理的YG8R组织中观察到氧化应激的显著降低。氧化应激是FRDA发病机制中的主要组成，而且可能是神经元保存的原因。最近还示出在缺乏frattxin的小胶质细胞中，氧化应激诱导DNA损伤和多(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)表达的升高，这增加了小胶质细胞激活。因为PARP1活化导致小胶质细胞中炎性细胞因子的表达增加，这些发现表明氧化应激可能在FRDA中诱导神经炎症介导的神经变性。因此，本文在经HSPC处理的YG8R中证明的稳健的神经学表型拯救可能部分是由于野生型小胶质细胞替代了缺乏共济蛋白的小胶质细胞，这是该治疗策略的另一潜在优势。还通过小鼠大脑中的线粒体PCR阵列分析对线粒体功能进行了评估。本文提供的研究结果表明，与WT相比，YG8R小鼠的基因大大上调>2倍(总共84个中有13个基因)，而WT和YG8R/WT HSPC小鼠(4个基因)之间鉴定出的变化很少，差异均无显著性。YG8R与WT中显著上调的基因包括三个溶质线粒体载体家族25基因，Mipep，人类线粒体进口机制的重要组成部分，涉及发育迟缓；和脂肪酸转运蛋白Cpt1b，其在应激和创伤后应激障碍中上调。最后，通过患者心肌细胞中铁沉积物的存在证实了在FRDA中细胞铁代谢失调(Lamarche等.Lemieux,The cardiomyopathy of Friedreich's ataxia morphological observations in 3cases.The Canadian journal of neurological sciences.Le journal canadien des sciences neurologiques 7,389-396(1980))。类似地，本公开证明，在来自YG8R对照的心脏切片中存在丰富的铁沉积，而在WT和YG8R/WT HSPC小鼠中观察到非常少的铁沉积，这表明在经处理的YG8R小鼠中正常的铁代谢。相比之下，使用铁螯合剂的临床前数据和临床数据有时与剂量的函数相反(Pandolfo等,Deferiprone for the treatment of
Friedreich's ataxia.J Neurochem 126Suppl 1,142-146(2013))。这些数据证明在WT HSPC的一次全身性移植后，FRDA、脑、骨骼肌和心脏中不同的受影响组织中线粒体功能的修正。

[0095] 本文提供的数据强有力地表明，共济蛋白交叉修正机制参与WT HSPC移植后的FRDA表型拯救。实际上，证据表明，线粒体共济蛋白从源自HSPC的小胶质细胞/巨噬细胞大量转移到脑、脊髓和DRG中的神经元，以及骨骼肌和心脏中的肌细胞。该数据还证明了非相关线粒体蛋白Cox8的转移，这示出发生了线粒体蛋白的非选择性转移。

[0096] 如上所述，先前已报道，在胱氨酸病小鼠模型的肾脏中植入的源自HSPC的巨噬细胞可通过TNT将含胱氨酸蛋白的溶酶体递送至近端肾小管细胞。在这种情况下，穿过基底膜的TNT是可能穿过连续的、厚的、致密的管状基底膜以进入管状细胞的唯一途径。此前已示出，在体外响应于细胞应激通过TNT转移线粒体，这促使对FRDA中的HSPC移植进行测试。在这里，已经在培养物中示出含有共济蛋白的线粒体可以通过TNT细胞间连接从巨噬细胞转移到缺乏共济蛋白的细胞。在体内，已经观察到线粒体蛋白共济蛋白和Cox8与宿主神经元内的GFP缀合，证明了来自小胶质细胞的神经元交叉修正，这是有效的，因为约50％的神经元在脊髓中含有Cox8-GFP。这种转移必须考虑几种途径：i)遗传物质的囊泡交换，信使RNA表明通过细胞外囊泡/外泌体脱落源自移植物的小胶质细胞转移到神经元；ii)含有线粒体的囊泡的释放，这是此前在急性肺损伤模型中从间充质干细胞到肺泡，或者最近从脑缺血模型中的星形胶质细胞到神经元表明的；iii)通过小胶质细胞分支延伸直接与神经元接触，线粒体的小胶质细胞-神经元转移。虽然尚未考虑此途径，但此处提供的数据表明这是一种可能的转移模式。实际上，已表明，线粒体蛋白Cox8-GFP和FXN-GFP被转移到神经元并且GFP斑点(punctae)也存在于DsRed+小胶质细胞分支延伸内。此外，已经示出大多数含有+ +GFP线粒体的神经元与DsRed小胶质细胞分支延伸接触。小胶质细胞过程是动态的，主动回缩和扩张，并且能够与神经元直接接触，特别是在损伤的情况下，在此期间接触的持续时间延长，支持该假设。

[0097] 因此，该策略使HSPC成为智能且分布广的递送载体，以在它们分化成脑、脊髓、DRG、骨骼肌和心脏中的小胶质细胞/巨噬细胞后获得稳定和持续的交叉修正。这项工作还证明了来自LV-hFXN-GFP转导的HSPC的共济蛋白转移到病变的神经元，并代表了开发诸如FRDA的线粒体障碍的HSPC基因治疗策略的第一个概念证明。

[0098] 以下实施例旨在说明而非限制本发明。

[0099] 实施例1

[0100] 采用HPSC移植治疗FRDA小鼠模型

[0101] 野生型HSPC的全身性移植预防YG8R小鼠的运动缺陷的发作。为了评估HSPC移植对FRDA的影响，使用表达含有280个GAA重复序列(SEQ ID NO：14)且缺乏内源性鼠共济蛋白—mfxn-/-hFXN+的突变型人FXN基因的YG8R小鼠模型。向经致死地辐照的2月龄YG8R小鼠移植通过流式细胞术确定的范围为35％至96％的表达野生型(WT)GFP的HSPC(n＝13)和供体来源的血细胞植入物。在移植后7个月，即9月龄时，处死小鼠用于分析。作为对照，分析WT同窝小鼠(n＝17)、未经处理的YG8R(n＝4)或移植有mfxn-/-hFXN+HSPC的经致死地辐照的YG8R小鼠(n＝5)。在5月龄(移植后3个月)时通过行为测试对所有小鼠进行评估，并在9月龄时对8只WT小鼠、4只YG8R小鼠(3只未经处理的小鼠和1只移植有mfxn-/-hFXN+HSPC小鼠)和3只移植有WT HSPC的YG8R小鼠进行分析。

[0102] FRDA患者中的进行性神经变性导致运动技能的丧失和进行性肌肉退化。YG8R小鼠复制人类FRDA神经症状，例如自三月龄的协调性缺陷，其中运动能力进行性降低。因此，对5月龄和9月龄时HSPC移植对运动和感觉依赖性功能任务的表现以及肌肉力量的影响进行了评定(分别在移植后3个月和7个月)。在任意行为测试的任意时间点均未观察到未经处理的YG8R小鼠和移植有mfxn-/-hFXN+HSPC的那些小鼠之间的表现差异，这表明辐照和用mfxn-/-hFXN+HSPC移植均未改善疾病表型。与WT小鼠相比，YG8R小鼠(对照组)和移植有mfxn-/-hFXN+HSPC的YG8R小鼠示出显著降低的开场运动能力、旋转杆上的协调受损、步态改变以及在两个时间点前肢握力显著降低(图1A)。相比之下，移植有WT HSPC的YG8R小鼠在移植后3个月和7个月都显示出正常的运动能力和肌肉强度(图1A)。有趣的是，相比于先前在胱氨酸病模型中的发现，表现出最低水平的供体来源的血细胞植入的YG8R小鼠仍然表现出对神经行为缺陷的生理学拯救。总之，这些数据表明，2月龄的YG8R小鼠中的HSPC移植完全拯救了该FRDA动物模型特有的进行性神经行为和肌肉缺陷。

[0103] FRDA中的神经变性主要涉及中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的感觉组分，开始于背根神经节(DRG)中大感觉神经元的丧失。在YG8R小鼠中也发生了DRG中感觉神经元的丧失，其特征在于存在大的空泡。在9月龄的对照YG8R小鼠中，检测到L5DRG神经元中的空泡积聚，未经处理的YG8R小鼠和移植有mfxn-/-hFXN+HSPC的YG8R小鼠之间的空泡面积没有显著差异(图1C)。相比之下，经WT HSPC处理的YG8R小鼠显示出与WT小鼠相当的显著减小的空泡面积(图1C)。这些数据表明，HSPC的早期移植防止了YG8R小鼠中DRG的感觉神经细胞体的退化。

[0104] 在植入神经系统后，HSPC分化成吞噬细胞。由于FRDA除了外周感觉神经元之外还影响中枢神经系统(CNS)，因此对神经系统的不同区域中HSPC的植入和分化进行了研究。发现在DRG、脊髓和外周神经内大量植入源自GFP+HSPC的细胞(图1C和图5)。在所有水平的DRG内，发现供体细胞非常接近神经元，并且对巨噬细胞标志物CD68和MHCII以及Iba1具有免疫反应性，将这些细胞表征为DRG驻留巨噬细胞(图1D、图1E、图6A和图6B)。在脊髓中，源自HSPC的细胞在背根和腹根、运动池(motor pools)和背脊髓灰质内的上行感觉轴突束大量存在(图1C和图1D)。这些细胞>99％Iba1+和CD68+，而较少的细胞表达MHCII(～30％；图6A-6C)，这表明它们的小胶质细胞特性。经过组织清除的移植脊髓的3D可视化显示，在血管周围区域附近发现高浓度的移植的源自HSPC的细胞，表明这些细胞通过脉管系统渗入CNS。

[0105] 在经处理的YG8R小鼠的脑、脑干和小脑中的整个灰质和白质中也检测到了移植物来源的细胞(图2A)。脑所有区域中绝大多数(>99％)源自HSPC的细胞显示出小胶质细胞的典型分枝形态并表达CD68和Iba1，但对MHCII没有免疫反应性，证明这些细胞是小胶质细胞(图2B、图6A、图6B和图6D)。在血管附近特别是在高度血管化的脉络丛中存在源自GFP+HSPC的细胞(图6E)进一步证实了脑中的血管周浸润(图6F)。

[0106] WT HSPC移植恢复YG8R小鼠脑中的共济蛋白表达和线粒体功能。脑中的鼠共济蛋白(mFxn)表达分析证实，与YG8R对照相比，源自HSPC的细胞的组织植入与经处理小鼠中mfxn表达的部分恢复相关，尽管未高达WT表达水平；在YG8R小鼠中也检测到残留表达，这可能是由于与人FXN的交叉反应性(图2C)。FRDA中的线粒体功能紊乱与组织内氧化蛋白水平增加有关。与WT对照相比，YG8R小鼠和移植有mfx-/-hFXN+HSPC的YG8R小鼠的大脑中氧化蛋白的水平显著更高(图2D)。WT HSPC移植导致YG8R小鼠中氧化蛋白水平显著衰减至与WT相当的水平，表明经处理小鼠中线粒体功能的恢复(图2D)。

[0107] 另外，使用WT、YG8R和YG8R/WT HSPC的大脑中的线粒体PCR阵列概况评估了线粒体功能。在YG8R动物中，在从凋亡控制到氧化磷酸化的各种过程中起重要作用的多种线粒体基因的表达发生改变。在所测试的89个基因中，15.7％相对于WT增加至少两倍，而经处理的动物中只有4.4％上调(图2E)。在这些基因中，与WT相比，在YG8R小鼠中发现了5个显著上调的基因，包括线粒体膜转运蛋白的SLC家族的几个成员以及参与线粒体脂质代谢的其他蛋白质(图2E)。YG8R/WT HSPC和WT小鼠之间未发现显著差异(图2E)。PCR阵列数据发现反映出在经WT HSPC处理的YG8R小鼠中得以修正的YG8R小鼠中的显著线粒体功能紊乱。

[0108] HSPC在YG8R小鼠的心脏和肌肉中大量植入，恢复线粒体功能并改善骨骼肌萎缩。相对于WT小鼠，YG8R对照(YG8R和YG8R/YG8R HSPC；p＝0.0798)的骨骼肌中也显示出增加的氧化的蛋白质，尽管不显著，并且正常水平见于经处理的YG8R小鼠中(图3A)。此外，通过骨骼肌活组织检查的质谱分析来测量乳酸和丙酮酸水平，这是用于测量氧化代谢损伤的常用测定，其示出在一些线粒体疾病中升高。证实了与WT小鼠相比，YG8R小鼠的骨骼肌中乳酸和乳酸/丙酮酸比率的显著增加，其在移植的移植有WT HSPC的YG8R小鼠中被修正(图3B)。这些数据代表了YG8R小鼠中线粒体功能紊乱的进一步证据，在经治疗小鼠中，这些数据得以正常化。

[0109] 除神经缺陷外，FRDA患者还产生进行性肥厚性心肌病。因此，研究了HSPC移植对YG8R小鼠心脏病理学的潜在影响。然而，由于在该小鼠模型中心肌病非常轻微，因此与9月龄的WT相比，在YG8R小鼠中未发现显著的表型。细胞铁代谢失调的重要指标是存在铁沉积物。在FRDA患者和老龄(14至18月龄)YG22小鼠中观察到心肌细胞中的铁沉积物。如预期的那样，对心脏切片的Perl染色未披露9月龄YG8R小鼠中的任何铁沉积物。因此，对较老龄的小鼠(18月龄)进行测试，并且未经处理的YG8R中或移植有YG8R HSPC的小鼠中存在心肌细胞中的铁沉积，而在YG8R/WT HSPC小鼠中，心肌细胞中的铁沉积显著降低(图3C)。这些数据表明WT HSPC移植在YG8R小鼠中修正线粒体铁代谢的能力。

[0110] 在心脏和骨骼肌组织中，与YG8R对照相比，经WT HSPC处理的小鼠中mFxn表达水平增加(图3D和3E)，并且共聚焦显微镜分析显示出在移植有HSPC的YG8R动物中的这些组织中植入了高水平的GFP+细胞(图3F和3G)。植入的GFP+细胞表达CD68和MHCII(图7A和图7B)，表明这些细胞是巨噬细胞。总之，这些数据表明，源自HSPC细胞整合到心脏和骨骼肌中并在YG8R小鼠中分化成巨噬细胞。

[0111] 还观察到在YG8R小鼠中肌肉强度显著受损并且在移植有WT HSPC的YG8R小鼠中肌肉强度是正常的。为了研究YG8R小鼠中潜在的肌肉萎缩，测量了两种肌肉特异性E3遍在蛋白滞后酶—肌肉环指1(MuRF-1)和F-box(MAFbx)/atrogin-1以及转化生长因子-β超家族的成员—肌肉生长抑制素的表达水平，在每种类型的骨骼肌萎缩中，所述表达水平增加。与WT相比，来自YG8R小鼠的骨骼肌中的MuRF-1、atrogin-1和肌肉生长抑制素表达增加(但对于Atrogin 1而言不显著)，而在经处理的YG8R小鼠中水平是正常的(图3H)，这表明通过HSPC移植拯救了该缺陷。

[0112] 巨噬细胞通过体外隧穿纳米管将带有共济蛋白的线粒体递送至病变细胞。已报道了在溶酶体贮积障碍胱氨酸病的背景下源自HSPC的巨噬细胞经TNT通过溶酶体交叉修正机制促进病变细胞的功能性拯救。因此，研究吞噬细胞是否也通过相似的途径介导携带共济蛋白的线粒体转移到mfxn-/-hFXN+细胞中。将从YG8R新生体皮肤收获的成纤维细胞与从Cox8-GFP DsRed小鼠的骨髓分离的巨噬细胞共培养，所述巨噬细胞遍在地表达与GFP及胞质DsRed报告基因融合的线粒体Cox8蛋白。使用活体成像，观察到GFP+线粒体通过长的管状突起从表达DsRed的巨噬细胞转移至mfxn-/-hFXN+成纤维细胞(图4A)。平行地，使用用含有用GFP标记的人线粒体共济蛋白的慢病毒载体(LV-hFXN-GFP)稳定转导的巨噬细胞。然后在共培养测定中用红色MitoTracker标记线粒体。从巨噬细胞到病变的成纤维细胞观察到携带hFXN-GFP的线粒体通过TNT转移(图4B)。总之，这些结果证明巨噬细胞通过TNT将含有共济蛋白的线粒体转移至FRDA细胞的能力，这表明在YG8R模型中源自HSPC的细胞的潜在拯救机制。

[0113] 源自HSPC的小胶质细胞/巨噬细胞能够在体内进行神经元和肌肉交叉修正。为了评定线粒体蛋白质的转移是否在体内发生，用从DsRed Cox8-GFP小鼠分离的HPSC移植YG8R小鼠。在表达DsRed的小胶质细胞内以及脑、脊髓和DRG中的神经元内检测到Cox8-GFP斑点(图4C和图8)。观察到含有Cox8-GFP的神经元与一个或更多个DsRed+小胶质细胞分支延伸接触(图4C)，并且在这些小胶质细胞突起中也观察到GFP+斑点(图4D)。这些数据表明小胶质细胞膜突起参与Cox8-GFP蛋白源自HSPC的小胶质细胞向宿主神经元转移。脊髓组织中的定量披露约50％的神经元含有Cox8-GFP(图4E和图9A-9D)。通过用从DsRed-转基因小鼠分离的HSPC移植YG8R小鼠并用LV-hFXN-GFP稳定地转导，证明了共济蛋白从小胶质细胞到神经元的交叉修正(图4F)。此外，在心脏和骨骼肌中，转移的证据是明显的，其中在宿主心肌/肌肉肌细胞中检测到Cox8-GFP与源自移植物的巨噬细胞并置(图8)。总之，这些结果代表了线粒体蛋白从小胶质细胞向神经元细胞转移的第一证明，并提供了强有力的指示，即在该动物模型中HSPC介导的FRDA表型拯救涉及交叉修正。

[0114] pCCL-FXN构建体及体外测试。为了开发用于FRDA的HSC基因疗法，使用pCCL-EFS-X-WPRE(pCCL)LV。该载体骨架用于未来的胱氨酸病临床试验。将增加病毒DNA核输入的中央多嘌呤管段(central polypurine tract，cPPT)片段添加到CCL载体骨架中。使用土拨鼠(Woodchuck)肝炎病毒翻译后调节元件(WPRE)来提高滴度和基因表达。然而，其的开放阅读框去掉了，原因是该开放阅读框与土拨鼠肝炎病毒X蛋白重叠，所述土拨鼠肝炎病毒X蛋白是一种参与肝肿瘤发展的转录激活因子。转基因表达由遍在地表达的短的、少内含子的、人延伸因子1α启动子(EFS，242bp)驱动。将对应于见于线粒体中的经典共济蛋白(同种型I，FXN I)的人FXN cDNA(633bp)通过PCR扩增并插入到pCCL中，产生pCCL-EFS-hFXN(图5A)，并且上游eGFP产生pCCL-EFS-hFXNeGFP。另外，产生携带Cas9酶和引导RNA的lentviral构建体以去除共济蛋白基因的第一个内含子中的GAA重复序列的扩增。通过测序和限制酶消化验证构建体的完整性。如前所述产生LV病毒颗粒并进行滴定。

[0115] 用pCCL-EFShFXNeGFP转导YG8R成纤维细胞，产生～100％GFP+细胞，对它们的功能拯救进行测试。据报道，缺乏共济蛋白导致细胞对H2O2毒性的易感性增加。与WT成纤维细胞相比，在YG8R成纤维细胞中观察到暴露于H2O2后细胞存活的显著降低。与YG8R对照相比，在FXN-GFP转导的成纤维细胞中证明存活率提高但未达到WT水平(图5B)。

[0116] 本文提供的数据表明，在2月龄时移植有WT HSPC的YG8R小鼠可以完全预防神经和肌肉病理学。最后，数据表明，这种拯救所涉及的机制是通过TNT将携带共济蛋白的线粒体从源自HSPC的吞噬细胞转移到病变细胞。

[0117] 实施例2

[0118] 材料和方法

[0119] 动物。如此前所述在C57BL/6J背景下产生缺失鼠FXN基因(mFxn)并表达含有190+90个GAA重复扩增的突变型人FXN基因(hFXN)的YG8R小鼠(Al-Mahdawi等,GAA repeat instability in Friedreich ataxia YAC transgenic mice.Genomics 84,301-310(2004)；Al-Mahdawi等,GAA repeat expansion mutation mouse models of Friedreich ataxia exhibit oxidative stress leading to progressive neuronal and cardiac pathology.Genomics 88,580-590(2006),both of which are incorporated herein by reference，这两篇文献都通过引用并入本文)。由Fxn雌性杂合子和Fxn雄性杂合子及FXN半合子组成的繁殖对(B6.Cg-Fxntm1Mkn的Tg(FXN)YG8Pook/J)购自杰克逊实验室(Bar Harbor，ME)。在这些研究中用作对照的YG8R小鼠和野生型(WT)小鼠获自这些繁殖者(breeder)。使用以下引物进行基因分型：

[0120] mfxn-F：5'-CTTCCCTCTACCCTGCCTTC-3'(SEQ ID NO：5)

[0121] mfxn-R：5'-GGAGAACAGTGGACACAGTAACA-3'(SEQ ID NO：6)

[0122] PGK-NEO：5'-CATCGCCTTCTATCGCCTTCT-3'(SEQ ID NO：7)

[0123] FXN-F：5'-GGGCAGATAAAGGAAGGAGATAC-3'(SEQ ID NO：8)

[0124] FXN-R：5'-ACGATAGGGCAACACCAATAA-3'(SEQ ID NO：9)。

[0125] 组成型表达GFP(C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)10Osb/J)或DsRed(B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J)的转基因小鼠也购自杰克逊实验室。表达Cox8-GFP线粒体融合蛋白的mtGFP-Tg转基因小鼠(C57BL/6J-Tg(CAG-Cox8/EGFP)49Rin)通过MEXT的国家生物资源项目购自RIKEN BioResource Center(Wako，Saitama，Japan)。将mtGFP-Tg小鼠与Dsred-Tg小鼠回交以产生DsRed-mtGFP-tg小鼠。如此前所述，通过PCR针对mt-GFP进行基因分型(Shitara等,Non-invasive visualization of sperm mitochondria behavior in transgenic mice with introduced green fluorescent protein(GFP).FEBS Lett 500,7-11(2001))。将小鼠维持在温度和湿度受控的动物设施中，给予12小时的明暗循环并且小鼠可自由获取水和食物。在所有实验中使用雄性小鼠和雌性小鼠两者。

[0126] 共济蛋白-GFP慢病毒构建、产生和滴定(titer)。使用自失活(SIN)-慢病毒载体(LV)pCCL-EFS-X-WPRE-GFP(pCCL-GFP)在HSPC和巨噬细胞中进行稳定基因转移。载体骨架含有少内含子的人延伸因子1a启动子以驱动转基因表达。使用如下引物通过PCR对对应于见于线粒体中的经典共济蛋白(同种型I，FXN I)的人FXN cDNA(克隆ID 5300379，GE Healthcare；633bp)(Perez-Luz等,Delivery of the 135kb human frataxin genomic DNA locus gives rise to different frataxin isoforms.Genomics 106,76-82(2015),该文献通过引用并入本文)进行扩增：F：5'-TTAGGATCCATGTGGACTCTCG-3'(SEQ ID NO：10)和R：5'-AGAGGATCCAGCATCTTTTCCG-3'(SEQ ID NO：11)；并在与GFP cDNA同相的BamH1限制性位点插入pCCL。如此前所述产生LV并进行滴定(Harrison,等,Hematopoietic stem cell gene therapy for the multisystemic lysosomal storage disorder cystinosis.Mol Ther 21,433-444(2013)，该文献通过引用并入本文)。

[0127] 骨髓细胞分离、转导移植和植入确定。从6至8周龄的YG8R小鼠、GFP转基因小鼠、DsRed转基因小鼠或DsRed mt-GFP转基因小鼠的股骨冲洗骨髓细胞。使用与磁珠缀合的抗Sca1抗体(Miltenyl Biotec，Auburn，CA)通过免疫磁性分离来分离造血干细胞和祖细胞(HSPC)。通过尾静脉注射重悬于100μl PBS中的1×106个细胞将Sca1+细胞直接移植入经致死地照射的(7Gy；X-Rad 320，PXi)YG8R小鼠中。在移植之前，首先用LV-hFXN-GFP转导来自DsRed转基因小鼠的Sca1+细胞，以感染复数(MOI)10，在聚凝胺(4mg/mL)的存在下，在涂覆有纤维连接蛋白(20g/mL)24-孔板中以每孔2×106个细胞的密度于补充有SCF、TPO、FLT3配体(各100ng/mL)和IL6(20ng/mL)细胞因子(PeproTech)的StemSpan培养基(StemCell Technologies)中转导16小时。移植后2个月测量外周血中移植的细胞的骨髓细胞植入；用红细胞裂解缓冲液(eBioscience，San Diego，CA)处理从尾部新鲜获取的血液样品，随后通过流式细胞术(BD Accuri C6，BD Biosciences)分析以确定表达GFP或DsRed的细胞的比例。

[0128] 行为测试。对5月龄和9月龄的WT小鼠、YG8R小鼠、移植有mfxn-/-hFXN+HSPC的YG8R小鼠和移植有WT GFP或DsRed/mt-GFP HSPC的YG8R小鼠进行测试，然后处死用于组织分析。使用Roto-rod Series 8装置(Ugo Basille，Comerio，Italy)进行旋转杆分析。该杆是滚花的塑料销子(直径6.0厘米)，设置在30厘米的高度处。在训练期间，将小鼠置于静止的旋转棒上30秒，然后开始试验。然后针对每只小鼠每天进行4次试验，在加速旋转棒上有60秒的试验间间隔(4-40rpm，5分钟)。记录每次试验的跌落等待时间(latency to fall)。使用自动监测系统(Kinder Associates，San Diego，CA)测量运动能力。将含有薄层垫层材料的聚碳酸酯笼(42×22×20cm)放入安装有光电管束的框架(25.5×47cm)中。将每只小鼠置于开场中，并在60秒的测试期间记录所有运动。使用由连接到数字测力计(Ugo Basile，Comerio，Italy)的10cm长T形杆组成的装置测量握力。动物的尾巴被保持住并放置在杆前，允许动物使用它们的前肢抓住杆，然后轻轻向后拉，直到杆被释放。对每只动物进行十次连续测量，并记录平均读数和最大读数两者。使用自动步态分析系统(CatWalk(Noldus Instruments))收集步态测量结果(步长)。将动物放置在通道的一端并使之沿着通道的长度移动，因为两个光源照亮了爪子与玻璃地板的表面接触，所以产生爪印的图像。在运动过程中，由摄像机从玻璃通道下方进行拍摄。使用CatWalk软件程序来分析记录的镜头，定义各个爪印(例如，左前爪、右后爪)，并给出多个步态参数的读数。每天进行测试，连续进行5天。仅在动物沿着通道以恒定速度移动期间不间断发生的运动用于分析。

[0129] 原代成纤维细胞和巨噬细胞分离和转导。从YG8R新生小鼠的皮肤活组织检查产生成纤维细胞。在37℃于5％CO2下，使用补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco，Life Technologies)和1％青霉素/链霉素(PenStrep；Gibco)的高葡萄糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基；Life Technologies，Carlsbad，CA)维持培养物。来自DsRed mt-GFP小鼠的原代巨噬细胞来源于骨髓细胞。从6至8周龄小鼠的股骨冲洗骨髓细胞，并于37℃、5％CO2下保持在含有10％FBS、1％PenStrep和10％L929条件培养基29的RPMI培养基中培养。对于用pCCL-FXN-eGFP转导的巨噬细胞，使用IC-21巨噬细胞系(美国模式培养物保藏中心，American Type Culture Collection，目录号#TIB-186)并在RPMI 1640培养基(Gibco)中培养。按照制造商的说明书，用纤维连接蛋白(20μl/ml；Takara Bio)包被六孔板。将IC-21巨噬细胞以250,000个细胞布板于每孔2ml中，并用pCCLFXN-eGFP以MOI 15转导。转导后24小时更换培养基。

[0130] 实时成像。如此前所述，将YG8R成纤维细胞与用表达hFXN-GFP的慢病毒稳定转导的DsRed Cox8-GFP或巨噬细胞共培养(Naphade等,Brief reports:lysosomal cross-correction by hematopoietic stem cell-derived macrophages via tunneling nanotubes.Stem Cells 33,301-309(2015),该文献通过引用并入本文)。简而言之，在玻璃底培养皿(MatTek Corp，Ashland，MA)中将75,000个成纤维细胞与相同数量的巨噬细胞共培养。在成像之前，将hFXN-GFP共培养物用50nM MitoTracker(Invitrogen)染色45分钟。在37℃，5％CO2下使用具有X40(数值孔径(NA)＝1.30)和X60(NA＝1.42)油物镜的Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal在1天和2天后进行共聚焦实时成像。使用Volocity软件(Perkin Elmer，Waltham，MA)捕获、处理和分析图像。

[0131] 小鼠共济蛋白定量RT-PCR。根据制造商的说明书，使用RNeasy脂质和纤维组织试剂盒(Qiagen)从快速冷冻的骨骼肌、脑和心脏活组织检查制备总RNA。然后使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)制备cDNA。使用对小鼠共济蛋白具有特异性的商业TaqMan探针定量表达(Applied Biosystems)。

[0132] 氧化应激检测。如此前所述，使用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma)制备解剖后直接在液氮中快速冷冻的组织中的蛋白质裂解物(Campuzano等,Frataxin is reduced in Friedreich ataxia patients and is associated with mitochondrial membranes.Human molecular genetics 6,1771-1780(1997),该文献通过引用并入本文)。对于每个测定，在使用BCA测定法测定总蛋白质浓度后使用20μg蛋白质。然后根据制造商的说明，通过加入OxyBlot蛋白氧化检测试剂盒(Chemicon International)中含有的1X 2,4-二硝基苯肼(DNPH)溶液衍生蛋白质。将样品应用于电泳并转移至PVDF膜。用1％BSA/PBS-T封闭后，用兔抗二硝基苯(DNP)抗体然后用山羊抗兔HRP缀合物孵育膜，并使用ECL试剂盒(Pierce)显现。使用抗微管蛋白(ab6161，Abcam)抗体归一化蛋白质水平，并使用ImagePro软件(Media Cybernetics)对条带强度进行定量。

[0133] 小鼠线粒体RT2Profiler PCR阵列。使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒(Qiagen)从大脑中分离RNA，然后用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-rad)逆转录0.5μg。将样品与SYBR green混合并均等地加载到小鼠线粒体RT2Profiler PCR阵列(Qiagen，目录号PAMM-087Z)的所有孔中，并根据制造商的推荐在CFX96热循环仪(Bio-rad)上进行扩增。导出Ct数据并使用样品基因和一组管家对照之间的ΔCt方法计算倍数变化。

[0134] 乳酸/丙酮酸分析。使用组织研磨机(dounce)将肌肉活组织检查样品(10mg)在冰中于1ml冰冷的40％乙腈(含有0.1％甲酸)/40％甲醇/20％H2O)中匀浆化，然后以13,000×g离心10分钟。提取溶液含有稳定的乳酸同位素(13C3乳酸钠，Cambridge Isotope Laboratories，Inc。)。除去上清液，在速度真空/冷冻干燥器系统中干燥，并重悬于150μl 0.1％甲酸中。在0.1N NAOH中重新溶解沉淀物，并使用二辛可宁酸(BCA测定)测量蛋白质含量。如此前所述，将5μl每种重悬的上清液注射到C18-pfp HPLC柱(Mac-Mode Analytical，Chadds Ford，PA)上(Gertsman等,Validation of a dual LC-HRMS platform for clinical metabolic diagnosis in serum,bridging quantitative analysis and untargeted metabolomics.Metabolomics 10,312-323(2014),该文献通过引用并入本文)，并与API-4000三重四极质谱仪(AB Sciex)相联。在采集过程中使用乳酸(89>43)、13C3-乳酸(92>45)和丙酮酸(87>43和87>87)的MRM(分子反应监测)。乳酸和丙酮酸峰均归一化为13C3乳酸。在计算图3B中使用的最终乳酸/丙酮酸(L/P)峰面积比之前，将乳酸和丙酮酸两者进一步归一化为蛋白质含量(mg)。由于该比率以归一化峰面积表示，因此不应将比值与在此前测量L/P的研究中进行的绝对浓度测量所确定的值相混淆，但该比值仍然有效用于检查群组之间的相对差异。

[0135] 空泡成像和定量。收集来自腰椎第5节(L5)的背根神经节(DRG)，使用低温恒温器以30μm间隔切片，并安装在涂覆有凝胶的载玻片上。用硫堇对DRG切片染色(Nissl染色)以观察神经元细胞体。使用BZ-X700荧光显微镜(Keyence)以60×放大倍数获取每位受试者的三个DRG。使用ImageJ，通过盲法实验者一式两份地追踪和测量每个DRG中空泡的存在；空泡定义为DRG神经元内具有光滑边缘的极圆形白色(Nissl阴性)区域。在各基因型之间比较相对于每个DRG切片的整个区域的空泡数和空泡空间面积。

[0136] 心脏组织学和铁定量。对于组织学制备，通过用10％福尔马林进行心内灌注来固定最终麻醉的小鼠。解剖固定的组织，包埋在石蜡中，并通过标准方法切片。如此前所述，使用Perl技术对切片进行脱蜡和染色以检测三价铁(Al-Mahdawi等,GAA repeat expansion mutation mouse models of Friedreich ataxia exhibit oxidative stress leading to progressive neuronal and cardiac pathology.Genomics 88,580-590(2006))。在Keyence荧光显微镜上对整个心脏切片进行成像，并将单个宽视野图像合在一起。使用ImagePro Preimier软件(MediaCybernetics)，通过分离蓝色通道，测量信号的面积然后除以该切片的总面积来测定铁染色水平。报告的值归一化为野生型水平。

[0137] 免疫荧光和图像采集。在5％多聚甲醛中固定心脏和肌肉组织，在20％蔗糖中平衡过夜，并在-80℃下在组织-Tek最优切割温度(OCT)培养基中冷冻(Sakura Finetek U.S.A，Torrance，CA)；切割10μm的切片。将DRG、脑和脊髓组织固定在多聚甲醛中，在30％蔗糖中冷冻保存，并在OCT培养基中冷冻。对于DRG，将组织切成20μm切片并直接安装到涂覆有凝胶的载玻片上。对于脑和脊髓，将组织切成30μm并作为自由浮动切片收集。对于免疫荧光，用一下抗体孵育组织：大鼠抗CD68(1：100；BioLegend 137001)、生物素大鼠抗MHCII(1：100；BD Pharmigen 553622)、兔抗GFP(1：500；Abcam ab290)、鸡抗GFP(1：1500，Abcam ab13970)、兔抗Iba1(1：1500；Wako#019-19741)、山羊抗mCherry(1：1000，Sicgen AB0040)、小鼠抗NeuN(1：500；Millipore MAB377)、兔抗MBP(1：200，Millipore AB980)、小鼠抗NF200(1：500，Millipore MAB5262)、小鼠抗α-肌动蛋白(1：400；Sigma)、兔抗von Willibrand因子(1：300；Chemicon)、DAPI(1：500；Molecular Probes)、Bodipy-鬼笔环肽(1：100；Molecular Probes)。使用适当的AlexaFluor-缀合的二抗(Invitrogen)来显现抗原。使用具有Airyscan共聚焦显微镜(Zeiss)的LSM 880、用于组织切片的高分辨率合并图像的Keyence BZ-X710数字显微镜系统或用于实时成像的Olympus FV1000共聚焦显微镜采集图像。使用IMARIS软件(Bitplane，Oxford Instruments)分析共聚焦图像栈。

[0138] 神经元交叉修正的量化。将来自移植有Cox8-GFP HSPC的三只YG8R小鼠和未经移植对照的腰椎脊髓切片的整个灰质区域用NeuN染色，并在LSM 880共聚焦显微镜(Zeiss)上以20×成像。使用ImagePro Plus软件(Media Cybernetics)概述和计数NeuN+神经元细胞，然后评估GFP阳性，其报告为总NeuN细胞的百分比(图8)。所有采集、过滤和处理步骤在所有样品之间的GFP通道上等同地进行。

[0139] 清除小鼠脊髓。如此前所述(Chung等,Structural and molecular interrogation of intact biological systems.Nature 497,332-337(2013),该文献通过引用并入本文)，处理来自移植后3个月具有DsRed+HSPC的小鼠的6mm段颈椎脊髓以进行光学清除。简言之，向PFA固定的组织中注入水凝胶单体溶液(4％PFA，4％丙烯酰胺，0.05％双丙烯酰胺)并热聚合。然后在含有SDS的硼酸盐缓冲液中于37℃被动提取脂质4周，直到组织被清除。在Rapidclear CS中孵育澄清的组织1天并使用Wilco培养皿固定。然后使用配备有10×水浸物镜的Olympus FV1200系统对组织成像(数值孔径：0.6；工作距离：3mm；堆叠尺寸：1.65mm；步长，5μm)。

[0140] 统计。没有动物被排除在实验之外。实验者尽可能不知道特定样品的基因型。未执行功率计算分析。除DRG空泡测量结果外，所有数据均显示标准方差。对于标准数据和线粒体PCR阵列数据，进行单因素方差分析(ANOVA)，然后进行事后学生t检验以使用GraphPad Prism 7.01(GraphPad Software，La Jolla，CA)确定统计学显著性。氧化应激测量结果采用单尾t检验，假设YG8R氧化水平更高。对于空泡测量结果，使用通过Bonferroni修正进行多次测试修正的Mann-Whitney非参数检验。体外实验以生物学上的三次重复进行。误差条表示s.e.m.。显著性水平表示如下：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。

[0141] 尽管已经参考上述实施例对本发明进行了描述，但应当理解，修改和变化涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明只由所附权利要求限定。

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