用于基因治疗神经疾病的AAV-5假型载体
阅读：175发布：2020-05-25
专利汇可以提供用于基因治疗神经疾病的AAV-5假型载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用腺相关病毒(AAV) 基因 治疗 载体治疗影响运动功能(例如受 疾病 、脑和/或脊髓损伤影响的运动功能)的疾病的方法，所述腺相关病毒基因治疗载体包含腺相关病毒5(AAV5)衣壳蛋白和侧翼是AAV ITR的感兴趣的基因产物。特别地，本发明的基因治疗载体是通过注射进 脑脊液 (CSF)中、优选通过腰椎注射和/或注射进小脑延髓池中而施用的。，下面是用于基因治疗神经疾病的AAV-5假型载体专利的具体信息内容。
1.在哺乳动物对象中用作药物的腺相关病毒(AAV)基因治疗载体，其中所述基因治疗载体包含AAV血清型5衣壳蛋白及侧翼是AAV ITR的感兴趣的基因产物，并且其中所述基因治疗载体通过腰椎鞘内施用而施用。
2.权利要求1的AAV基因治疗载体，其中腰椎鞘内施用位于选自L4–L5、L3–L4、L1–L2和L2–L3的部位。
3.权利要求1或2的AAV基因治疗载体，其中所述AAV基因治疗载体是单链AAV基因治疗载体或者单体双链载体。
4.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述感兴趣的基因产物用于治疗或预防选自如下的病症：肌萎缩性侧索硬化(ALS)，脊髓性肌萎缩(SMA)，疼痛，亨廷顿病，阿尔兹海默病，Tay-Says病，弗里德赖希共济失调，共济失调性毛细血管扩张症，1型、2型和3型脊髓小脑性共济失调，A型、B型和C型尼曼皮克病，多巴反应性肌张力障碍，脆性X综合征，克拉伯病，2型糖原贮积症(Pompe)，原发性脊髓侧索硬化，佩利措伊斯-梅茨巴赫病，X连锁肾上腺脑白质营养不良，巨轴索神经病，多系统萎缩(MSA)，近位肌强直肌病，神经元蜡样脂褐质沉积症(Batten病)和癌症。
5.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述AAV ITR是AAV血清型2ITR。
6.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述感兴趣的基因产物选自：天冬氨酰氨基葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A，棕榈酰蛋白质硫酯酶，三肽基肽酶，溶酶体跨膜蛋白，多基因产物，半胱氨酸转运蛋白，酸性神经酰胺酶，酸性α-L-岩藻糖苷酶，保护蛋白/组织蛋白酶A，酸性β-葡糖苷酶，或者葡糖脑苷酯酶，酸性β-半乳糖苷酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，α-L-艾杜糖苷酸酶，半乳糖脑苷酯酶，酸性α-甘露糖苷酶，酸性β-甘露糖苷酶，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶A，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶，酸性β-半乳糖苷酶，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶，酸性鞘磷脂酶，NPC-1，酸性α-葡糖苷酶，β-己糖胺酶B，乙酰肝素N-硫酸酯酶，α-N-乙酰葡糖苷酶，乙酰辅酶A：α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶，α-N-乙酰基半乳糖苷酶，α-N-乙酰基半乳糖苷酶，α-Neuramidase，β-葡糖醛酸糖苷酶，β-己糖胺酶A，酸性脂肪酶，神经营养因子如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)，神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)，脑衍生神经营养因子(BDNF)，大脑多巴胺神经营养因子(CDNF)，胶质细胞系衍生性神经营养因子(GDNF)，睫状神经营养因子(CNTF)，生长因子胰岛素样生长因子(IGF-1)及用于下调缺陷基因的miRNA。
7.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述感兴趣的基因产物用于治疗或预防与运动神经元和/或DRG中的神经元相关的病症。
8.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述感兴趣的基因产物与表达控制元件可操纵地连接，所述表达控制元件包含产生所述感兴趣的基因产物的足够表达以获得治疗作用的启动子，其中所述启动子优选选自：巨细胞病毒(CMV)启动子，磷酸甘油酸酯激酶(PGK)，CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子元件与鸡β-肌动蛋白启动子的组合)，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，突触蛋白-1启动子，神经元特异性烯醇化酶(NSE)及可诱导启动子如基因开关或tet-操纵子衍生的启动子。
9.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述基因治疗载体在腰椎鞘内施用之前、同时或之后进一步施用到小脑延髓池中。
10.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中2×1013–2×1015个基因组拷贝/千克体重被施用给对象。
11.权利要求10的AAV基因治疗载体，其中8×1013–6×1014个基因组拷贝/千克体重被施用给对象。
12.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述对象不接受物质预处理，所述物质控制颅内压和/或可以破坏CNS微脉管系统的内皮细胞之间的细胞间紧密连接和/或促进药物如化疗药物递送至CNS。
13.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述对象在经腰椎鞘内施用所述AAV基因治疗载体之前不接受静脉内甘露醇预处理。
14.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述哺乳动物对象是人。
15.前述任一项权利要求的AAV基因治疗载体，其中所述AAV基因治疗载体不是自身互补的基因载体。
用于基因治疗神经疾病的AAV-5假型载体
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 中枢神经系统(CNS)是脊椎动物的复杂系统，包括脑和脊髓。周围神经系统是脑和脊髓之外的神经系统部分。脊髓将来自周围神经系统的感觉信息传导到脑，并且将来自脑的运动信息传导至各个效应器。
[0004] 已经研究了使用病毒载体的基因治疗方法，用于递送治疗剂以治疗CNS相关的各种疾病。腺相关病毒(AAV)载体具有许多优势，包括低毒性和免疫原性及转基因在CNS中长期表达(Kaplitt et al(1994)Nat Genet 8:148-154；Bartlett et al.(1998)Hum Gene Ther 9:1181-1186；Passini et al.(2002)J Neurosci 22:6437-6446)。因此，进一步研究AAV以进行CNS基因治疗。
[0005] 许多CNS疾病，例如肌萎缩性侧索硬化(ALS，也称作运动神经元病(MND))，影响在CNS中广泛分布的皮质和脊髓运动神经元。经常见到注射进CNS中的病毒载体转导注射部位附近的细胞，但是不转导所需的广泛区域的细胞。此外，注射进脑中是受制于安全考虑的外科手术侵入性方法。已进行了一些研究以评定使用腰椎穿刺(punction)的基因治疗方法。本领域中报道的缺点是通过腰椎穿刺转移的基因不能转导神经元组织，只转导脑膜成纤维细胞，除非是在脑实质内(intraparenchymally)注射(Finegold(1999)Hum Gene Ther 10:
1251-1257；Milligan(2005)Eur J Neurosci 21:2136-2148；Milligan(2005)Mol Pain 1:
9；Milligan(2006)Pain 126:294-308)，导致转基因表达低于2周(Milligan(2005)Eur J Neurosci 21:2136-2148；Milligan(2005)Mol Pain 1:9；Lin(2002)Neurosci Lett 317:
1-4；Lin(2002)Gene Ther 9:1247-1253)，需要多次注射(Milligan(2006)Pain 126:294-
308)或者需要预处理(Vulchanova(2010)Molecular Pain 6:31)。
1251-1257；Milligan(2005)Eur J Neurosci 21:2136-2148；Milligan(2005)Mol Pain 1:
9；Milligan(2006)Pain 126:294-308)，导致转基因表达低于2周(Milligan(2005)Eur J Neurosci 21:2136-2148；Milligan(2005)Mol Pain 1:9；Lin(2002)Neurosci Lett 317:
1-4；Lin(2002)Gene Ther 9:1247-1253)，需要多次注射(Milligan(2006)Pain 126:294-
308)或者需要预处理(Vulchanova(2010)Molecular Pain 6:31)。
[0006] Storek及同事(Storek(2008)PNAS 105(3):1055-1060)揭示了他们使用常规的单链rAAV2不能检测到转基因表达，因此他们检测了各种rAAV载体的修饰：用不同血清型的衣壳和双链自身互补的rAAV进行假型(pseudotype)。特别地，Storek等揭示了在鞘内施用时自身互补的AAV8在背根神经节有效并选择性转导初级感觉神经元，但是在脑中则不转导，且在单载体施用后即建立长期基因表达。
[0007] 因此，本领域仍需要可用于治疗或预防哺乳动物神经疾病的基因转移方法。特别需要没有上述一或多个缺点的转导神经元组织的基因转移方法。
[0008] 发明概述
[0009] 第一方面，本发明涉及在哺乳动物对象、优选人中用作药物的腺相关病毒(AAV)基因治疗载体，其中所述基因治疗载体包含AAV血清型5衣壳蛋白及侧翼是AAV ITR的感兴趣的基因产物，并且其中所述基因治疗载体通过腰椎鞘内施用而施用。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述腰椎鞘内施用位于选自L4-L5，L3-L4，L1-L2和L2-L3的部位。
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述AAV基因治疗载体是单链AAV基因治疗载体或者单体双链(monomeric duplex)载体。
[0012] 在一个优选的实施方案中，所述感兴趣的基因产物用于治疗或预防选自如下的病症：肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)，脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)(SMA)，疼痛，亨廷顿病(Huntington’s disease)，阿尔兹海默病，Tay-Says病(Tay-Says disease)，弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia)，共济失调性毛细血管扩张症(ataxia telangietacsia)，1型、2型和3型脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia)，A型、B型和C型尼曼皮克病(Niemann-Pick disease)，多巴反应性肌张力障碍(Dopa-responsive dystonia)，脆性X综合征(Fragile X syndrome)，克拉伯病(Krabbe disease)，2型糖原贮积症(Glycogen storage disease type 2)(Pompe)，原发性脊髓侧索硬化(Primary lateral sclerosis)，佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)，X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy)，巨轴索神经病(Giant axonal neuropathy)，多系统萎缩(Multiple system atrophy)(MSA)，近位肌强直肌病(Proximal myotonic myopathy)，神经元蜡样脂褐质沉积症(Neuronal Ceroid Lipofuscinosis)(Batten病)和癌症。
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述AAV ITR是AAV血清型2ITR。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述感兴趣的基因产物选自：天冬氨酰氨基葡糖苷酶(Aspartylglucosaminidase)，α-半乳糖苷酶A(α-Galactosidase A)，棕榈酰蛋白质硫酯酶(Palmitoyl Protein Thioesterase)，三肽基肽酶(Tripeptidyl Peptidase)，溶酶体跨膜蛋白(Lysosomal Transmembrane Protein)，多基因产物(Multiple gene products)，半胱氨酸转运蛋白(Cysteine transporter)，酸性神经酰胺酶(Acid ceramidase)，酸性α-L-岩藻糖苷酶(Acidα-L-fucosidase)，保护性蛋白/组织蛋白酶A(Protective protein/cathepsin A)，酸性β-葡糖苷酶(Acidβ-glucosidase)，或者葡糖脑苷酯酶(glucocerebrosidase)，酸性β-半乳糖苷酶(Acidβ-galactosidase)，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(Iduronate-2-sulfatase)，α-L-艾杜糖苷酸酶(α-L-Iduronidase)，半乳糖脑苷酯酶(Galactocerebrosidase)，酸性α-甘露糖苷酶(Acidα-mannosidase)，酸性β-甘露糖苷酶(Acidβ-mannosidase)，芳基硫酸酯酶B(Arylsulfatase B)，芳基硫酸酯酶A
(Arylsulfatase A)，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(N-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase)，酸性β-半乳糖苷酶(Acidβ-galactosidase)，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(N-Acetylglucosamine-1-phosphotransferase)，酸性鞘磷脂酶(Acid
sphingomyelinase)，NPC-1，酸性α-葡糖苷酶(Acidα-glucosidase)，β-己糖胺酶B(β-Hexosaminidase B)，乙酰肝素N-硫酸酯酶(Heparan N-sulfatase)，α-N-乙酰葡糖苷酶(α-N-Acetylglucosaminidase)，乙酰辅酶A：α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶(Acetyl-CoA:α-glucosaminide N-acetyltransferase)，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(N-
Acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase)，α-N-乙酰基半乳糖苷酶(α-N-
Acetylgalactosaminidase)，α-N-乙酰基半乳糖苷酶(α-N-Acetylgalactosaminidase)，α-Neuramidase，β-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)，β-己糖胺酶A(β-Hexosaminidase A)，酸性脂肪酶(Acid Lipase)，神经营养因子(neurotrophic factors)如神经生长因子(Nerve Growth Factor)(NGF)、神经营养蛋白-3(Neurotrophin-3)(NT-3)、神经营养蛋白-
4/5(Neurotrophin-4/5)(NT-4/5)、脑衍生神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor)(BDNF)、大脑多巴胺神经营养因子(Cerebral Dopamine Neurotrophic factor)(CDNF)、胶质细胞系衍生性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor)(GDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)(CNTF)，生长因子胰岛素样生长因子(growth factor Insuline-like growth factor)(IGF-1)及用于下调缺陷基因(faulty gene)的miRNA。
(Arylsulfatase A)，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(N-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase)，酸性β-半乳糖苷酶(Acidβ-galactosidase)，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(N-Acetylglucosamine-1-phosphotransferase)，酸性鞘磷脂酶(Acid
sphingomyelinase)，NPC-1，酸性α-葡糖苷酶(Acidα-glucosidase)，β-己糖胺酶B(β-Hexosaminidase B)，乙酰肝素N-硫酸酯酶(Heparan N-sulfatase)，α-N-乙酰葡糖苷酶(α-N-Acetylglucosaminidase)，乙酰辅酶A：α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶(Acetyl-CoA:α-glucosaminide N-acetyltransferase)，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(N-
Acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase)，α-N-乙酰基半乳糖苷酶(α-N-
Acetylgalactosaminidase)，α-N-乙酰基半乳糖苷酶(α-N-Acetylgalactosaminidase)，α-Neuramidase，β-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)，β-己糖胺酶A(β-Hexosaminidase A)，酸性脂肪酶(Acid Lipase)，神经营养因子(neurotrophic factors)如神经生长因子(Nerve Growth Factor)(NGF)、神经营养蛋白-3(Neurotrophin-3)(NT-3)、神经营养蛋白-
4/5(Neurotrophin-4/5)(NT-4/5)、脑衍生神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor)(BDNF)、大脑多巴胺神经营养因子(Cerebral Dopamine Neurotrophic factor)(CDNF)、胶质细胞系衍生性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor)(GDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)(CNTF)，生长因子胰岛素样生长因子(growth factor Insuline-like growth factor)(IGF-1)及用于下调缺陷基因(faulty gene)的miRNA。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述感兴趣的基因产物与表达控制元件可操纵地连接，所述表达控制元件包含产生所述感兴趣的基因产物的足够表达以获得治疗作用的启动子，其中所述启动子优选选自：巨细胞病毒(CMV)启动子，磷酸甘油酸酯激酶(PGK)，CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子元件与鸡β-肌动蛋白启动子的组合)，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，突触蛋白-1启动子，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，及可诱导启动子如基因开关或tet-操纵子衍生的启动子。
[0016] 在一个优选的实施方案中，所述基因治疗载体在腰椎鞘内施用之前、同时或之后进一步施用到小脑延髓池中。
[0017] 在一个优选的实施方案中，2×1013–2×1015、更优选8×1013–6×1014个基因组拷贝/千克体重被施用给对象。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述对象在经腰椎施用AAV基因治疗载体之前不接受静脉内甘露醇预处理。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述AAV基因治疗载体不是自身互补的基因载体。
[0020] 定义
[0021] “核酸构建体”定义为一种核酸分子，其分离自天然发生的基因，或者已经被修饰为含有以不是天然存在的方式组合或并列的核酸区段。核酸分子以核苷酸序列表示。任选地，核酸构建体中存在的核苷酸序列与一或多个控制序列可操纵地连接，所述控制序列指导肽或多肽在细胞或对象中产生或表达。
[0022] 术语“同源”当用于表示指定的(重组)核酸或多肽分子与指定的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，应理解为是指实际上所述核酸或多肽分子是由相同物种的宿主细胞或生物体产生的。术语“异源”可用于表示实际上所述核酸或多肽分子是由不同物种的宿主细胞或生物体产生的。
[0023] “表达控制序列”是指调节与其可操纵地连接的核苷酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核苷酸序列的转录和/或翻译时，该表达控制序列与所述核苷酸序列“可操纵地连接”。因此，表达控制序列可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号，及终止密码子。术语“表达控制序列”至少包含其存在被设计为影响表达的序列，及也可包含另外有利的成分。例如，前导序列和融合配体序列是表达控制序列。该术语也可以包括这样的核酸序列的设计，由此符合及不符合读框(in and out of frame)的不希望的潜在的起始密码子从序列中除去。其也可以包括这样的核酸序列的设计，由此不希望的潜在的剪接位点被除去。其包括指导添加polyA尾部的序列或聚腺苷酸化序列(pA)，即在mRNA的3’-末端的一串腺嘌呤残基，可以被称作polyA序列。其也可以被设计为增强mRNA稳定性。适用于昆虫细胞的影响转录和翻译稳定性的表达控制序列例如启动子以及实现翻译的序列如Kozak序列，是本领域技术人员熟知的。表达控制序列可以具有这种性质，即调节其可操纵地连接的核苷酸序列，由此实现更低的表达水平或更高的表达水平。
[0024] 如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是具有控制一或多个编码序列转录的功能的核酸片段，位于编码序列转录起始位点的转录方向上游，通过DNA-依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点及任何其它DNA序列的存在而结构性鉴别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接调节从启动子的转录量的任何其它核苷酸序列，包括例如弱化子或增强子以及沉默子。“组成型启动子”是在大多数组织中在大多数生理和发育条件下具有活性的启动子。“可诱导的”启动子是可生理学或发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂。“组织特异性启动子”是仅在特定类型组织或细胞中具有活性的启动子。
[0025] “3’UTR”或者“3’非翻译序列”(也称作3’非翻译区或者3’端)是指在基因编码序列下游发现的核酸序列，其包含例如转录终止位点及(在大多数但不是所有真核mRNA中的)聚腺苷酸化信号(例如AAUAAA或其变体)。在转录终止后，mRNA转录物在聚腺苷酸化信号下游可以被裂解并且可以添加poly(A)尾部，其参与mRNA转运至细胞质(发生翻译的位置)。
[0026] “载体”是核酸分子(典型为DNA或RNA)，其将荷载的核酸序列(典型为DNA或RNA)转移至宿主细胞中。三种常见类型的载体包括质粒、噬菌体和病毒。优选地，载体是病毒。含有启动子和可以可操纵地连接多核苷酸的克隆位点的载体是本领域熟知的。这种载体能在体外或在体内转录RNA，可商购自如Stratagene(La Jolla,Calif.)和Promega Biotech(Madison,Wis.)等来源。为了优化表达和/或体外转录，可能必须除去、添加或改变克隆的5’和/或3’非翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当的可变翻译起始密码子或者可能在转录或翻译水平干扰或降低表达的其它序列。或者，可以将共有的核糖体结合位点插入起始密码子的紧邻5’处以增强表达。
[0027] “病毒载体”是指包含以下一些或所有的载体：编码基因产物的病毒基因、控制序列和病毒包装序列。“细小病毒载体”被定义为重组产生的细小病毒或细小病毒颗粒，其包含在体内、离体或在体外被递送至宿主细胞中的多核苷酸。举例的细小病毒载体包括例如腺相关病毒载体。本文中，细小病毒载体构建体是指包含该病毒基因组或其一部分及转基因的多核苷酸。
[0028] 如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指具有控制一或多个编码序列转录的功能的核酸片段，位于编码序列的转录起始位点的转录方向上游，通过DNA-依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点及任何其它DNA序列的存在而结构性鉴别，所述任何其它DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、阻抑蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接调节从启动子的转录量的任何其它核苷酸序列，包括例如弱化子或增强子以及沉默子。“组成型”启动子是在大多数组织中在大多数生理和发育条件下具有活性的启动子。“可诱导”启动子是可生理学或发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂。“组织特异性启动子”是仅在特定类型组织或细胞中具有活性的启动子
[0029] 启动子可以是在细胞中示出转录活性的任何合适的启动子序列，包括突变、截短和杂合启动子，其可以得自编码与细胞同源(天然的)或异源(外源的)的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0030] 启动子可以是与被表达的编码序列天然相关的启动子。启动子也可以是与被表达的编码序列外源的组成型或可诱导启动子。用于哺乳动物细胞中的合适启动子例如是在Sambrook and Russell(2001)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中描述的那些启动子。用于酵母中的合适启动子例如包括糖分解启动子。
[0031] 本文中关于侧翼是另外的元件序列所用的术语“侧翼”表示在相对于所述序列上游和/或下游即5’和/或3’端存在一或多个侧翼元件。术语“侧翼”不意味着表示序列必须是连续的。例如，在编码转基因的核酸与侧翼元件之间可以有插入序列。“侧翼”是两个其它元件(例如ITR)的序列，表示一个元件位于序列的5’端，另一个位于序列的3’端；然而，在之间可以存在插入序列。在优选的实施方案中，(i)的核苷酸序列在每一侧具有细小病毒反向末端重复核苷酸序列。
[0032] 术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或者包含嘌呤和嘧啶碱基或者其它天然的、化学或等化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指大约5至大约100个核苷酸的单链或双链DNA的多核苷酸。然而，对于本发明而言，寡核苷酸长度没有上限。寡核苷酸也称作寡聚体或寡核苷酸，可以通过本领域已知的方法分离自基因或者化学合成。
[0033] 如本文所用，术语“治疗”等是指获得希望的药理学和/或生理学作用。该作用可以是预防性的，完全或部分预防疾病或其症状，和/或可以是治疗性的，部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不利影响。如本文所用，“治疗”涵盖了在哺乳动物、特别是人体中的任何治疗，包括：
[0034] (a)在可能易感疾病但是还未诊断患病的对象中预防疾病发生；
[0035] (b)抑制疾病，即阻止其发展；及
[0036] (c)减轻疾病，即，使疾病消退。
[0037] “序列相同性”和“序列相似性”可以通过使用整体或局部比对算法，根据两个序列的长度，对比两个肽或两个核苷酸序列而确定。相似长度的序列优选使用整体比对算法(例如Needleman Wunsch)进行对比，最优进行全长序列比对，而长度显著不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)进行对比。然后当序列(当最优通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT比对时)呈现出至少某一最小百分比序列相同性(如下文定义)时，可以称所述序列“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch整体比对算法以对比完整长度(全长)的两个序列，使得匹配数最大化及缺口(gap)数最小化。当两个序列具有相似长度时，整体比对适用于确定序列相同性。通常地，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认计分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认计分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。针对序列相同性百分比的序列比对和计分可以使用计算机程序确定，如GCG Wisconsin Package,Version10.3，得自Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA 92121-3752USA，或者使用开放源码软件如EmbossWIN version 2.10.0的程序“needle”(使用整体Needleman Wunsch算法)或者“water”(使用局部Smith Waterman算法)，其使用与上述GAP程序相同的参数，或者使用默认设置参数(对于“needle”和“water”二者以及对于蛋白质和DNA比对二者，默认缺口开放罚分是10.0，默认缺口延伸罚分是0.5；
默认计分矩阵对于蛋白质是Blossum62，对于DNA是DNAFull)。当序列整体长度上具有显著不同时，优选局部比对，如使用Smith Waterman算法的那些方法。或者，相似性或相同性百分比可以通过使用如FASTA、BLAST等算法搜索公众数据库确定。
默认计分矩阵对于蛋白质是Blossum62，对于DNA是DNAFull)。当序列整体长度上具有显著不同时，优选局部比对，如使用Smith Waterman算法的那些方法。或者，相似性或相同性百分比可以通过使用如FASTA、BLAST等算法搜索公众数据库确定。
[0038] 发明详述
[0039] 迄今为止将基因递送至CNS受到大小及CNS的复杂性的阻碍。在单次注射进脑实质之后，转基因表达是局部的且主要保持限于注入的区域。使用CSF作为递送病毒载体的方法，可以到达更大的区域。目前的研究示出使用AAV-5载体可以实现在CNS中更大区域转导的目标。这种治疗是非常可接受的，因为未观测到不利的临床迹象及明显的神经元缺失。神经元和神经胶质细胞均使用遍在的CAG启动子转导，在CNS外部未观测到转基因表达。使用细胞特异性启动子如GFAP启动子或者突触蛋白-1启动子，可以指导针对特定群的表达。我们已经表明皮质、小脑和室下区的区域示出转基因在神经元和神经胶质细胞中的表达。在脊髓中，运动神经元转导是普遍的，在背根神经节中神经元的转导也是普遍的。这些结果示出CNS介导的递送方法可用于递送基因进行基因治疗方法。可以由此获益的适应症是：运动神经元疾病，感觉相关的适应症及多种其它神经学适应症。
[0040] 第一方面，本发明涉及在哺乳动物对象中用作药物的腺相关病毒(AAV)基因治疗载体。优选地，所述基因治疗载体包含AAV血清型5衣壳蛋白和侧翼是AAV ITR的感兴趣的基因产物。更优选地，所述基因治疗载体施用至脑脊液(CSF)中，优选通过鞘内施用，和/或施用至小脑延髓池中，还更优选通过腰椎施用，和/或施用小脑延髓池中。本发明涉及如上述用作药物的AAV基因治疗载体。也就是说，本发明提供了通过治疗用于治疗人体或动物体的方法中的本发明的AAV基因治疗载体。本发明进一步涉及如上述AAV基因治疗载体，用于治疗病症，例如运动神经元疾病、感觉相关适应症和多种其它神经学病症。因此，本发明涉及本发明的AAV基因治疗载体用于制备用于治疗如本文进一步定义的疾病的方法中的药物。
[0041] 细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可以分为两个亚科：细小病毒亚科，其感染脊椎动物，及浓核病毒亚科，其影响昆虫。细小病毒亚科的成员在本文被称作细小病毒，包括依赖病毒属。从其属名可以推导，依赖病毒属成员的独特之处在于其通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染以在细胞培养物中有效感染。依赖病毒属包括AAV，其通常感染人(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或者灵长目动物(例如血清型1和4)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。关于细小病毒及浓核病毒亚科的其它成员的进一步信息在Kenneth I.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,"Chapter 69in Fields Virology(3d Ed.1996)中描述。
[0042] 所有已知AAV血清型的基因组结构非常相似。AAV的基因组是线性的单链DNA分子，其长度小于大约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复(inverted terminal repeat)序列(ITR)在非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、-2和-3)组成衣壳。末端145个nt是自身互补的且组构的，由此可以构成形成T-形发夹结构的能量稳定的分子内双链体。这些发夹结构发挥病毒DNA复制起点的功能，作为细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞感染野生型(wt)AAV之后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子表达，这两个Rep蛋白均具有在病毒基因组中复制的功能。在Rep ORF中的剪接事件导致实际上四种蛋白质(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)表达。然而，已经示出在哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA对于AAV载体产生是足够的。在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白质对于AAV载体产生也是足够的。
[0043] “重组细小病毒或AAV载体”(或者rAAV载体)在本文是指这样的一种载体，其包含一或多个感兴趣的多核苷酸序列、感兴趣的基因产物、感兴趣的基因或“转基因”，其侧翼是至少一个细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)。这种rAAV载体当存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时可以复制和包装成感染性病毒颗粒。当rAAV载体掺入更大的核酸构建体中时(例如染色体中或者用于克隆或转染的另一载体如质粒或杆状病毒中)，该rAAV载体典型被称作“前载体(pro-vector)”，其可以通过在存在AAV包装功能和必要的辅助功能条件下复制和衣壳化而被“拯救”。优选地，感兴趣的基因产物每一侧翼是AAV ITR。任何AAV ITR均可用于本发明的构建体中，包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8和/或AAV9的ITR。最优选AAV2的ITR。用于优选的本发明核酸构建体中的优选的ITR序列例如是SEQ ID NO:1(左侧或上游ITR)和SEQ ID NO:2(右侧或下游ITR)所示序列。
[0044] AAV能感染许多哺乳动物细胞。见例如Tratschin et al.(1985,Mol.Cell Biol.5:3251-3260)和Grimm et al.(1999,Hum.Gene Ther.10:2445-2450)。然而，人滑膜成纤维细胞的AAV转导比在相似的鼠细胞中明显更有效，Jennings et al.,Arthritis Res,3:1(2001)，AAV的细胞向性(tropicity)在血清型之间是不同的。见例如Davidson et al.(2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:3428-3432)所述，其论述了AAV2、AAV4和AAV5对哺乳动物CNS细胞的向性(tropism)和转导效力的差异，见Goncalves,2005,Virol J.2(1):43所述，其论述了修饰AAV向性的方法。
[0045] 用于本发明中的AAV基因治疗载体可以在哺乳动物细胞或者在昆虫细胞中产生。这两种方法均在本领域中描述。例如，Grimm et al.(2003Molecular Therapy 7(6):839-
850)揭示了以无辅助病毒及光可控方式产生AAV载体的方法，其基于仅两个质粒转染进
293T细胞中。他们揭示了一种产生包含AAV2ITR和AAV5衣壳蛋白的杂合AAV载体的方法。这个参考文献以其全部内容并入本文。进一步的信息也可见于Blits et al.(2010)(Journal of Neuroscience methods 185(2):257-263)。术语“杂合”和“假型(pseudotyped)”在本文可互换使用，用于描述Rep蛋白、ITR和/或衣壳蛋白来自不同血清型的载体。例如，ITR和Rep蛋白是AAV2血清型的，衣壳蛋白是AAV5血清型的。本文所用术语“嵌合的”是描述单基因如衣壳，其由衍生自不同血清型的至少两个序列组成。
850)揭示了以无辅助病毒及光可控方式产生AAV载体的方法，其基于仅两个质粒转染进
293T细胞中。他们揭示了一种产生包含AAV2ITR和AAV5衣壳蛋白的杂合AAV载体的方法。这个参考文献以其全部内容并入本文。进一步的信息也可见于Blits et al.(2010)(Journal of Neuroscience methods 185(2):257-263)。术语“杂合”和“假型(pseudotyped)”在本文可互换使用，用于描述Rep蛋白、ITR和/或衣壳蛋白来自不同血清型的载体。例如，ITR和Rep蛋白是AAV2血清型的，衣壳蛋白是AAV5血清型的。本文所用术语“嵌合的”是描述单基因如衣壳，其由衍生自不同血清型的至少两个序列组成。
[0046] AAV5可例如在哺乳动物细胞中产生，根据如下但不限于如下方法进行：载体基因组含有转基因表达盒，侧翼是衍生自AAV血清型2的两个反向末端重复序列(ITR)。所述病毒载体基因组的总长度可以是不超过4.7kB的野生型基因组大小，以保留有效的包装效力。单一衣壳由VP1(62kDa)、VP2(73kDa)或VP3(87kDa)的60个病毒蛋白质组成，比率为1:1:10。2
AAV载体的生产方法基于两个质粒经Ca(PO4)2转染进在滚瓶(850cm 表面积)中的人胚胎肾生产细胞(HEK293)中，随后通过过滤和层析技术纯化衣壳化的载体基因组。第一个质粒是病毒载体质粒，含有侧翼是AAV2ITR的表达构建体。第二个质粒是包装质粒，编码希望血清型的AAV rep 2型和cap 5型基因及腺病毒早期辅助基因E2A、VA、E4(pDP5；核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)。所述生产细胞系的基因组包含腺病毒E1，以提供辅助功能。在与两个质粒在含有10％胎牛血清(FCS)的Iscove's改良的Dulbecco's培养基(IMDM)中共转染后，将细胞在无血清的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)中孵育3天，使得载体产生。在滚瓶中的载体生产平均获得3×103个载体基因组/细胞或者4×1011个载体基因组/滚瓶(通过qPCR量化)的产率。随后，将细胞培养物用含有Triton-X-100的缓冲液裂解，细胞碎片通过低速离心除去。澄清的整体通过AVB琼脂糖亲和性层析纯化，用400kDa中空纤维组件(例如来自Spectrum Laboratories)浓缩和渗滤而配制在PBS/5％蔗糖中。
AAV载体的生产方法基于两个质粒经Ca(PO4)2转染进在滚瓶(850cm 表面积)中的人胚胎肾生产细胞(HEK293)中，随后通过过滤和层析技术纯化衣壳化的载体基因组。第一个质粒是病毒载体质粒，含有侧翼是AAV2ITR的表达构建体。第二个质粒是包装质粒，编码希望血清型的AAV rep 2型和cap 5型基因及腺病毒早期辅助基因E2A、VA、E4(pDP5；核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)。所述生产细胞系的基因组包含腺病毒E1，以提供辅助功能。在与两个质粒在含有10％胎牛血清(FCS)的Iscove's改良的Dulbecco's培养基(IMDM)中共转染后，将细胞在无血清的Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)中孵育3天，使得载体产生。在滚瓶中的载体生产平均获得3×103个载体基因组/细胞或者4×1011个载体基因组/滚瓶(通过qPCR量化)的产率。随后，将细胞培养物用含有Triton-X-100的缓冲液裂解，细胞碎片通过低速离心除去。澄清的整体通过AVB琼脂糖亲和性层析纯化，用400kDa中空纤维组件(例如来自Spectrum Laboratories)浓缩和渗滤而配制在PBS/5％蔗糖中。
[0047] 或者，用于本发明中的AAV基因治疗载体可以在昆虫细胞中产生，如先前由Urabe et al.(Journal of Virology 2006 80(4):1874-1885)所述。先前揭示的Rep和VP1、VP2和VP3序列中的修改也可用于本发明中，例如国际公开WO 2007/046703、WO 2007/148971、WO 2009/014445、WO 2009/104964和/或WO 2011/112089所述。
[0048] 可用于本发明中以在昆虫细胞中产生rAAV载体的AAV ITR和Rep序列可以衍生自任何AAV血清型基因组。通常地，AAV血清型在氨基酸和核酸水平具有显著同源的基因组序列。这提供了相同的一系列遗传功能以产生基本上生理和功能等价的病毒粒。关于各种AAV血清型的基因组序列及基因组相似性的综述见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini et al.(1997,J.Vir.71:6823-33)；Srivastava et al.(1983,J.Vir.45:555-64)；Chiorini et al.(1999,J.Vir.73:1309-1319)；Rutledge et al.(1998,J.Vir.72:309-319)；及Wu et al.(2000,J.Vir.74:8635-47)所述。rAAV血清型1、2、3、4和5是优选的用于本发明中的AAV核苷酸序列的来源。优选地，用于本发明中的AAV ITR序列衍生自AAV1、AAV2和/或AAV5。更优选地，用于本发明中的ITR序列是AAV2ITR。同样，Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选衍生自AAV1、AAV2和/或AAV5，更优选AAV2。
[0049] 在大多数血清型中，AAV Rep和ITR序列是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白是例如超过89％相同的，在AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间在基因组水平的总核苷酸序列相同性为大约82％(Bantel-Schaal et al.,1999,J.Virol.,73(2):939-947)。此外，已知在哺乳动物中的AAV颗粒产生中，许多AAV血清型的Rep序列和ITR有效交叉互补(即功能替代)其它血清型的相应序列。US2003148506报道了在昆虫细胞中AAV Rep和ITR序列也有效地交叉互补其它AAV Rep和ITR序列。
[0050] 已知AAV VP蛋白质决定AAV病毒粒的细胞向性。VP蛋白编码序列与不同AAV血清型中的Rep蛋白和基因相比是显著较低保守的。用于本发明中的编码病毒蛋白(VP)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列衍生自AAV5。最优选地，VP1、VP2和VP3是AAV5VP1、VP2和VP3。或者，VP1、VP2和VP3是野生型AAV5序列，如在SEQ ID NO:3(核苷酸序列)和SEQ ID NO:4(氨基酸序列)中示出。Rep和ITR序列交叉互补其它血清型相应序列的能力使得可以产生假型rAAV颗粒，其包含一种血清型(例如AAV5)的衣壳蛋白及另一种AAV血清型(例如AAV2)的ITR序列。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。本文中，假型rAAV颗粒可以称作“x/y”型，其中“x”表示ITR的来源，“y”表示衣壳蛋白的血清型，例如2/5rAAV颗粒具有来自AAV2的ITR及来自AAV5的衣壳蛋白。
[0051] 修饰的“AAV”序列也可以用于本发明中，例如在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9ITR、Rep或VP具有至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或更高的核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如具有大约75％至大约99％核苷酸序列相同性的序列)，可用于代替野生型AAV ITR、Rep或VP序列。
[0052] 尽管在许多方面与其它AAV血清型相似，但是AAV5与其它人和猿猴AAV血清型的不同超过其它已知人和猿猴血清型。鉴于此，在昆虫细胞中rAAV5的生产可以不同于其它血清型的生产。在本发明的方法用于生产rAAV5的情况中，优选一或多个构建体包含(在一个以上的构建体中总地包含)：包含AAV5ITR的核苷酸序列，包含AAV5Rep编码序列的核苷酸序列(即包含AAV5Rep78的核苷酸序列)和/或AAV5Cap编码序列。这种ITR、Rep和Cap序列可以根据所需修饰，以获得在昆虫细胞中rAAV5或假型rAAV5载体的有效产生。例如，Rep序列的起始密码子可以被修饰，VP剪接位点可以被修饰或消除，和/或VP1起始密码子可以被修饰以改良在昆虫细胞中rAAV5载体的产生，例如在WO 2007/046703、WO 2007/148971和/或WO 2009/014445中所揭示。本发明还包括嵌合的AAV5衣壳，其中例如AAV5的VP1部分或全部由衍生自AAV2的VP1置换，并且VP2和3衍生自AAV5(Urabe et al.,2006；WO2000/028004)。在这种嵌合的AAV5衣壳中，在这种嵌合的AAV5衣壳中，至少VP3应是AAV5或者衍生自AAV5，而VP1和VP2之一或这二者可以是不同的AAV血清型或者衍生自不同的AAV血清型。
[0053] 优选的腺病毒载体被修饰以降低宿主应答，如Russell(2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604)所综述，或者如US20080008690及Zaldumbide和Hoeben(Gene Therapy 2008:
239-246)所述。
239-246)所述。
[0054] 优选地，具有SEQ ID NO:5的核酸序列和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的Rep78蛋白用于本发明中，具有SEQ ID NO:7的核酸序列的Rep52蛋白用于本发明中。
[0055] “鞘内”施用用于指鞘内注射，即以任何水平的脑脊髓轴在脑脊液内施用，包括注射进脑室中(也见"Route of Administration".Data Standards Manual.Food and Drug Administration.Retrieved 11March 2011)。这通过脊髓鞘膜注射进蛛网膜下腔，由此到达CSF。这种施用方法可用于例如脊髓麻醉、化疗或者疼痛管理。这个途径也用于导入抗某些感染的药物，特别是在神经外科手术后。通过鞘内注射施用的物质避免了通过血脑屏障的需要。经鞘内施用的药物通常不含有任何防腐剂或其它潜在有害的无活性成分，这些成分有时在静脉内注射的药物中发现。鞘内递送方法被认为是比输注进中枢神经系统(CNS)组织本身的方法的侵入性低，因为输注入CNS中需要复杂的脑部手术。鞘内递送可以不需要专业的脑部注射中心而进行。
[0056] 脊柱的颈部区域称作颈椎(Cervical Spine)。这个区域由七块椎骨组成，缩写为C1至C7(上至下)。这些椎骨保护脑干和脊髓，支撑颅骨，使得头部可以大范围活动。第一块颈椎(C1)称作寰椎。寰椎是环形的，其支撑颅骨。C2称作枢椎。其是环形的，具有钝齿样结构(称作齿状突或齿突)，其伸入寰椎中。寰椎与枢椎一起可以使头部旋转。其它颈椎(C3至C7)是具有小棘突(指样突起)的盒子样形状，棘突从椎骨的后方伸出。在最后的颈椎下面的是12块胸椎。这些胸椎缩写为T1至T12(从上至下)。T1是最小胸椎T12是最大胸椎。胸椎比颈椎大，具有更长棘突。除了更长的棘突之外，肋骨附着增加胸椎的力量。这些结构使得胸椎比颈椎或腰椎更稳定。此外，胸廓和连接系统限制胸椎的活动范围，保护许多重要器官。腰椎具有5块椎骨，缩写为L1至L5(最大)。每块腰椎的大小和形状设计为承载大部分体重。腰椎的每个结构元件与颈部和胸部区域中的相似元件相比均更大、更广和更宽。腰椎比胸椎具有更大的活动范围，但是不如颈椎。腰椎关节突关节使得可以明显弯曲和伸展运动，但是限制旋转。骶骨位于骨盆后面。缩写为S1至S5的五块骨融合为三角形，形成骶骨。骶骨在连接脊柱与骨盆的两块髋骨之间。最下面的腰椎(L5)与骶骨连接(活动)。骶骨下面是5块另外的骨，融合在一起形成尾椎(尾骨)。
[0057] 在本发明的一个优选实施方案中，基因治疗载体通过腰椎注射施用。更优选地，腰椎鞘内施用位于选自如下的部位：L4–L5，L3–L 4，L1–L2和L2–L3。最优选地，基因治疗载体是通过在L4与L5之间的鞘内注射施用。在一个优选的实施方案中，基因治疗载体仅通过腰椎施用，即不在其它部位施用。
[0058] 或者或与先前优选的本发明实施方案组合，在本发明的一个优选实施方案中，基因治疗载体施用至小脑延髓池中。在一个优选实施方案中，基因治疗载体仅施用至小脑延髓池中，即在其它部位不施用。更优选地，施用至小脑延髓池是与鞘内施用组合进行的，或者换句话说，在鞘内施用之前、同时或之后施用。
[0059] 在另一个优选实施方案中，施用至小脑延髓池中是与腰椎施用组合进行的，由此优选地施用至小脑延髓池中是在腰椎施用之前、同时或之后进行的。优选在这个实施方案中，腰椎施用是在鞘内区域中。
[0060] 在最优选的实施方案中，基因治疗载体仅与腰椎施用组合施用至小脑延髓池，即在除了小脑延髓池和腰椎之外的其它部位不施用。优选在这个实施方案中，腰椎施用是在鞘内区域。
[0061] “小脑延髓池”是脑周围的脑膜的蛛网膜与软脑脊膜层之间的蛛网膜下腔中的三个主要开口(principal openings)之一。开口统称做脑池(cistern)。小脑延髓池位于小脑与延髓背侧面之间。在第四脑室产生的脑脊液通过外测孔和正中孔流入小脑延髓池。
[0062] 如本文所用，组合施用或者在鞘内施用“之前、同时或之后”施用是指施用至小脑延髓池与鞘内施用发生在优选少于2周、1周、4天、48小时、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟、10分钟或5分钟的时间间隔内。
[0063] 重组AAV载体可具有单链DNA或双链DNA。单链DNA(ssDΝA)AAV基因组在编码转基因表达之前必须转变为双链DΝA(dsDΝA)。这个步骤可以通过使用自身互补载体或单体双链载体而避免，所述载体包装反向重复载体基因组，其折叠为dsDNA而不需要DNA合成或者多个载体基因组之间的碱基配对，从而增加AAV介导的基因转移的效力。关于自身互补的AAV载体的综述，见例如McCarty,D.M.Molec.Ther.(2008)16:1648-1656。所谓的自身互补AAV载体(WO2001/092551)含有至少一个修饰的ITR，优选通过缺失末端决定位点(trs)修饰，且与单体双链AAV载体在设计上不同，其能够仅使用完整AAV ITR产生(WO2011/122950)。在一个优选的实施方案中，自身互补AAV载体不在本发明范围内。相反，如上所述的单体双链载体与自身互补载体序列不同，其可以有利地用于本发明中，因为其涉及的载体基因组除了完整ITR序列之外，是野生型AAV载体大小(即4.8kb)的一半(1/2)或比它小。
这具有在AAV载体中可以建立多个重复(2、4、8或更多倍表达单位的串联体)的优势，获得单体、二聚体、四聚体双链载体。在这种载体中表达单位的实例可以是含有shRNA或miRNA的载体。在本发明中，已经示出脑组织的广泛转导可以使用单链AAV基因治疗载体在腰椎注射后获得。因此，在本发明的一个优选实施方案中，AAV基因治疗载体是单链AAV基因治疗载体。
这具有在AAV载体中可以建立多个重复(2、4、8或更多倍表达单位的串联体)的优势，获得单体、二聚体、四聚体双链载体。在这种载体中表达单位的实例可以是含有shRNA或miRNA的载体。在本发明中，已经示出脑组织的广泛转导可以使用单链AAV基因治疗载体在腰椎注射后获得。因此，在本发明的一个优选实施方案中，AAV基因治疗载体是单链AAV基因治疗载体。
[0064] 本发明的AAV基因治疗载体实现了在腰椎鞘内施用后在中枢神经系统中的大面积转导。使用遍在启动子(CAG启动子)，神经元和神经胶质细胞在皮质、小脑和室下区中被转导。此外，在脊髓中，运动神经元转导是普遍的，在背根神经节中神经元的转导也是普遍的。因此，本发明的治疗方法可用于治疗严重CNS疾病。在一个优选的实施方案中，本发明的AAV基因治疗载体包含感兴趣的基因产物，其可用于治疗或预防选自如下的病症：肌萎缩性侧索硬化(ALS)，脊髓性肌萎缩(SMA)，疼痛，溶酶体贮积症(LSD)、亨廷顿病，阿尔兹海默病，Tay-Says病，弗里德赖希共济失调，共济失调性毛细血管扩张症，1型、2型和3型脊髓小脑性共济失调，A型、B型和C型尼曼皮克病，多巴反应性肌张力障碍，脆性X综合征，克拉伯病，2型糖原贮积症(Pompe)，原发性脊髓侧索硬化，佩利措伊斯-梅茨巴赫病，X连锁肾上腺脑白质营养不良，巨轴索神经病，多系统萎缩(MSA)，近位肌强直肌病，神经元蜡样脂褐质沉积症(Batten病)和各种形式CNS癌症，例如原发性CNS淋巴瘤、转移或继发性脑肿瘤、原发性脊髓肿瘤。CNS癌症包括例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、非霍奇金CNS淋巴瘤。
[0066] 表1
[0067]
[0068]
[0069] 在另一个优选实施方案中，感兴趣的基因产物用于治疗或预防与运动神经元和/或DRG中的神经元相关的病症。这些病症包括但不限于疼痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、原发性脊髓侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、进行性延髓麻痹(PBP)和假性延髓麻痹。
[0070] 在特别优选的实施方案中，本发明的AAV基因治疗载体包含可用于治疗或预防选自如下病症的感兴趣的基因产物：肌萎缩性侧索硬化(ALS)，脊髓性肌萎缩(SMA)，亨廷顿病，多系统萎缩(MSA)，及选自如下一组的溶酶体贮积症：法布里病、青少年Batten病(CNL3)、戈谢病1、2和3型、Hunter、Pompe、Sanfilippo A和Sanfilippo B。
[0071] 因此，在一个优选的实施方案中，感兴趣的基因产物选自：天冬氨酰氨基葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A，棕榈酰蛋白质硫酯酶，三肽基肽酶，溶酶体跨膜蛋白，多基因产物，半胱氨酸转运蛋白,酸性神经酰胺酶，酸性α-L-岩藻糖苷酶，保护性蛋白/组织蛋白酶A，酸性β-葡糖苷酶，或者葡糖脑苷酯酶，酸性β-半乳糖苷酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，α-L-艾杜糖苷酸酶，半乳糖脑苷酯酶，酸性α-甘露糖苷酶，酸性β-甘露糖苷酶，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶A，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶，酸性β-半乳糖苷酶，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶，酸性鞘磷脂酶，NPC-1，酸性α-葡糖苷酶，β-己糖胺酶B，乙酰肝素N-硫酸酯酶，α-N-乙酰葡糖苷酶，乙酰辅酶A:α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶，α-N-乙酰基半乳糖苷酶，α-N-乙酰基半乳糖苷酶，α-Neuramidase，β-葡糖醛酸糖苷酶，β-己糖胺酶A，酸性脂肪酶，神经营养因子如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、大脑多巴胺神经营养因子(CDNF)、胶质细胞系衍生性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)，及生长因子胰岛素样生长因子(IGF-1)。此外，miRNA序列也可用作下调某些基因的表达，例如在亨廷顿病的治疗中。
[0072] 本文提及的大多数疾病，除了亨廷顿病之外，均可以通过提供缺陷基因的正确形式而治疗。然而，亨廷顿病需要下调某基因，即位于4号人染色体的亨廷顿基因(也称作HTT、HD和IT15)。患有亨廷顿病的对象携带在基因5’端具有超过36个三核苷酸CAG重复的HTT基因。开发基于RNAi的亨廷顿病的治疗方法包括通过例如靶向外显子1的全部HTT敲低(突变和野生型基因)。其它方法例如是通过靶向HTT外显子1中CAG重复的仅突变HTT的等位基因特异性沉默及通过例如靶向外显子67中SNP的突变HTT表达的等位基因特异性抑制。
[0073] 在优选的实施方案中，感兴趣的基因产物与表达控制元件可操纵地连接，所述表达控制元件包含产生所述感兴趣的基因产物的足够表达以获得治疗作用的启动子。在真核细胞中转基因表达水平主要由转基因表达盒中的转录启动子决定。示出长期活性并且是组织、甚至是细胞特异性的启动子用于一些实施方案中。启动子的非限制性实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(Kaplitt et al.(1994)Nat.Genet.,8:148-164)、CMV/人β3-球蛋白启动子(Mandel et al.(1998)J.Neurosci.,18:4271-4284)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子元件与鸡β-肌动蛋白启动子的组合)(Klein et al.(2008)Mol Ther 16(1):89-96；Shevtsova et al(2004)Exp Physiol 90:53-59)、GFAP启动子(Xu et al.(2001)Gene Ther.,8:1323-1332；Lee et al.(2008)Glia 56:481-493)、突触蛋白-1启动子(Kuegler et al.(2001)Mol Cell Neurosci 17:78-96；Drinkut et al.(2012)Molecular Therapy 20:534-543)、1.8-kb神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Klein et al.(1998)Exp.Neurol.,150:183-194)、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki(1989)Gene,79:269-277)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子(Shipley et al.(1991)Genetics,10:1009-1018)。为了延长表达，可以将其它调节元件另外与转基因可操纵地连接，所述其它调节元件例如是土拨鼠肝炎病毒调节后元件(WPRE)(Donello et al.(1998)J.Virol.,72,5085-5092)或者牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点。Drinkut及同事应用神经胶质细胞(GFAP)启动子表达GDNF，并证实比从神经元特异性启动子表达更有益(Drinkut et al.,2012,supra)。或者或除使用特异性启动子外，使用可调节的表达元件如基因开关系统(Maddalena et al.(201)Molecular Therapy–Nucleic Acids 2:e106)或者四环素操纵子的衍生物(Gossen and Bujard(1992)PNAS 89:5547-5551)，可以实现经调节的表达。
[0074] 在本发明的一个优选实施方案中，AAV基因治疗载体包含AAV5衣壳蛋白、AAV2ITR及位于ITR之间的感兴趣的基因产物。优选地，所述基因治疗载体通过腰椎注射施用，可组合小脑延髓池注射。优选的基因产物和使用这种优选的AAV基因治疗载体治疗的疾病(治疗或预防)选自：治疗ALS的GDNF或IGF-1，治疗SMA的GDNF或IGF-1，下调缺陷的脊髓运动神经元生存蛋白(SMN)基因以治疗SMA的miRNA，实现HTT的等位基因特异性下调或两个等位基因的下调以治疗亨廷顿病的miRNA，治疗亨廷顿病的GDNF，治疗MSA的GDNF，治疗法布里病的α-半乳糖苷酶A，治疗青少年Batten病(CNL3)的溶酶体跨膜蛋白，治疗戈谢病1、2和3型的酸性β-葡糖苷酶或葡糖脑苷酯酶，治疗Hunter病的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，治疗Pompe病的酸性α-葡糖苷酶，治疗Sanfilippo A的乙酰肝素N-硫酸酯酶及治疗Sanfilippo B的α-N-乙酰葡糖苷酶。
[0075] 可以给予有需要的患者治疗有效量的本发明的AAV基因治疗载体或药物组合物。
[0076] 本发明的AAV基因治疗载体典型地包含于药物组合物中，任选与药物载体、稀释剂和/或佐剂组合。这种组合物包括足以提供希望的治疗或预防作用的有效量的核酸、核酸构建体、细小病毒毒粒或者药物组合物，及药物可接受的载体或赋形剂。“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。
[0077] “治疗有效量”是指在该剂量及需要的时间有效实现希望的治疗结果的量，例如消除(elevation)疾病的症状。核酸、核酸构建体、细小病毒毒粒或药物组合物的治疗有效量可以根据各种因素变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，及所述核酸、核酸构建体、细小病毒毒粒或药物组合物激发个体中希望的反应的能力。给药方案可以调节以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也典型是其中所述核酸、核酸构建体、细小病毒毒粒或药物组合物的任何毒性或有害作用由治疗益处胜过的量。
[0078] “预防有效量”是指在该剂量及需要的时间有效实现希望的预防结果的量，如阻止或抑制各种病症。预防剂量可以在疾病发病之前或在疾病早期阶段用于对象，预防有效量在一些情况中可以多于或少于治疗有效量。
[0079] 在特定的实施方案中，AAV基因治疗载体或药物组合物的治疗或预防有效量的范13 16 13 15 13
围可以是1×10 至1×10 个基因组拷贝(gc)/kg、优选2×10 至2×10 、更优选8×10 至
6×1014、甚至更优选大约2×1014gc/kg对象体重。注意该剂量值可以根据缓解的病症的严重度而变化。对于任何特定对象，可以根据个体需要和施用或监督所述组合物的施用的人员的专业判断而随时间调整。本文所述剂量范围只是举例，不限制可以由医学从业人员选择的剂量范围。
围可以是1×10 至1×10 个基因组拷贝(gc)/kg、优选2×10 至2×10 、更优选8×10 至
6×1014、甚至更优选大约2×1014gc/kg对象体重。注意该剂量值可以根据缓解的病症的严重度而变化。对于任何特定对象，可以根据个体需要和施用或监督所述组合物的施用的人员的专业判断而随时间调整。本文所述剂量范围只是举例，不限制可以由医学从业人员选择的剂量范围。
[0080] 优选地，在儿童中输注进CSF的体积低于大约20cc，在成人低于大约30cc。在非人灵长目动物中，可以将6cc安全地递送进CSF中，总体积为20-25cc。或者，抽吸至少一半的输注体积并用本发明的基因治疗载体置换，以达到最大大约50％体积的置换。
[0081] 此外，本发明的AAV基因治疗载体可以通过本领域已知的标准方法浓缩的形式施用，所述标准方法包括但不限于密度梯度离心(例如CsCl，碘克沙醇)、透析、超滤、离子交换(IEX)层析(例如阴离子，阳离子)、凝胶过滤、亲和层析、正切流动过滤(TFF)、旋转过滤柱(例如Centricon)。也可以进行外源病毒或辅助病毒清除，以改良用于本发明的AAV基因治疗载体的质量，例如在WO 2013/036118中描述。
[0082] 如本文所用，“药物可接受的载体”或“赋形剂”包括任何及所有生理学相容的溶剂、分散介质、包膜、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及无菌粉末，以即时制备无菌可注射溶液或分散液。这种介质和制剂针对药物活性物质的应用为本领域熟知。除了任何常规介质或制剂与活性化合物和/或注射部位不相容之外，其在本发明药物组合物中的应用包括在本发明中。
[0083] 补充的活性化合物也可以掺入本发明的药物组合物中。关于共同施用另外的治疗剂的指导可例如见于加拿大药剂师协会的Compendium of Pharmaceutical and Specialties(CPS)。
[0084] 例如Vulchanova(2010Molecular Pain 6:31)表明通过直接腰椎穿刺施用病毒载体尚未报道导致脊髓和DRG神经元的可观转导。Vulchanova等因此建议用甘露醇预处理以增强AAV5和AAV8载体渗透进入脊髓实质及渗入DRG神经元的细胞体。特别地，在小鼠中腰椎注射剂量为大约4×1012载体基因组/kg的AAV载体，需要在鞘内腰椎施用载体之前经静脉内用甘露醇预处理，以获得绿色荧光蛋白(GFP)在脊髓中的表达，并选择DRG神经元的亚集。
[0085] 用甘露醇预处理有缺点，已知甘露醇导致副作用。特别地，在输注甘露醇期间或之后常报道的副作用包括：肺充血、水和电解质紊乱、酸中毒、电解质流失、口干、口渴、明显多尿、尿潴留、水肿、头痛、视力模糊、抽搐、恶心、头晕、呕吐、鼻炎、臂痛、皮肤坏死、血栓性静脉炎、寒颤、眩晕、荨麻疹、脱水、低血压、心动过速、发热和心绞痛样胸痛(Mannitol IV FDAPrescribing Information)。
[0086] 在本发明的一个优选实施方案中，对象在施用AAV基因治疗载体之前不接受预处理。特别地，所述对象不接受物质预处理，所述物质控制颅内压和/或可以破坏CNS微脉管系统的内皮细胞之间的细胞间紧密连接和/或促进药物如化疗药递送至CNS。更优选地，所述对象在施用AAV基因治疗载体之前不用渗透剂预处理。渗透剂包括但不限于尿素、甘油、糖或糖醇如多元醇，例如甘露醇和高渗盐水。特别地，所述对象在腰椎鞘内施用AAV基因治疗载体之前不用甘露醇如静脉内施用甘露醇进行预处理。
[0087] 在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物对象包括但不限于鼠、大鼠、猿猴、家畜、运动动物(sport animal)、宠物和人。更优选地，哺乳动物对象是人。
[0088] 在另一方面，本发明涉及一种在昆虫细胞中产生重组细小病毒(例如rAAV)毒粒(包含如上述重组细小病毒(rAAV)载体)的方法。优选地，所述方法包括如下步骤：(a)在产生重组细小病毒(例如rAAV)载体的条件下培养如本文定义的昆虫细胞；及(b)回收所述重组细小病毒(例如rAAV)载体。应理解在所述方法中产生的重组细小病毒(rAAV)载体优选是感染性细小病毒或者AAV毒粒，其包含重组细小病毒(rAAV)载体核酸。昆虫细胞在培养中的生长条件及昆虫细胞中异源产物的产生是本领域熟知的，见例如上述关于昆虫细胞的分子工程的参考文献所述。产生本发明rAAV病毒粒的优选方法和构建体在例如WO2007/046703和WO2007/148971中揭示。
[0089] 优选地，产生重组细小病毒毒粒的方法进一步包括使用抗AAV抗体、优选固定的抗体的(包含)重组细小病毒(rAAV)载体(的毒粒)的亲和性纯化步骤。抗AAV抗体优选是单克隆抗体。特别合适的抗体是例如可得自骆驼或美洲驼的单链骆驼抗体或其片段(见例如Muyldermans,2001,Biotechnol.74:277-302)。用于亲和性纯化rAAV的抗体优选是特异性结合AAV衣壳蛋白上的表位的抗体，从而优选该表位是存在于一种以上AAV血清型的衣壳蛋白上的表位。例如所述抗体可以基于与AAV2衣壳蛋白的特异性结合而同时与AAV1、AAV3和AAV5衣壳蛋白也特异性结合而产生或者选择。
[0090] 在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其变化用语是以其非限制性含义使用，是指包括在该单词后面的事项，但是不排除未专门提及的事项。此外，关于一种元件所用的不定冠词“一个”不除外存在超过一个元件的可能性，除非文中明确要求是一个及仅一个所述元件。不定冠词“一个”因此通常是指“至少一个”。
[0093] 图1：AAV载体基因组的示意图。编码GOI(感兴趣的基因或感兴趣的基因产物)的表达盒在CAG启动子控制下，其前面是Kozak序列(gccaccatg…)，并且通过BGH聚腺苷酸化信号而聚腺苷酸化。在本发明实施例中，GOI是绿色荧光蛋白(GFP)。这个表达盒的侧翼是两个非编码ITR序列。使用用于生产的重组杆状病毒，该表达盒被包装进AAV-5衣壳中。
[0094] 图2：脑部转导的概括。代表性切片A-E取自脑部并针对GFP染色。观测到表达遍及脑部。
[0095] 图3：较高放大倍数的顶叶皮质。可观察到神经元和神经胶质细胞转导有若干层深。
[0096] 图4：较高放大倍数的枕叶皮质。可观察到神经元和神经胶质细胞转导有若干层深。
[0097] 图5：较高放大倍数的小脑。许多细胞是GFP阳性的。
[0098] 图6：颈髓的转导。可以见到在灰质终止的感觉纤维以及斑点状的上行纤维(a)。此外，可以观察到(c)来自运动神经元集合的GFP阳性运动神经元纤维(b)。在(d)中，一些神经胶质细胞也是GFP染色阳性。
[0099] 图7：胸髓的转导。在脊柱中可见到上升感觉纤维(a)。此外，可以观察到(c)来自运动神经元集合的GFP阳性运动神经元纤维(b)。在(d)中，观察到一些可以是下行或上行的纤维。
[0100] 图8：腰髓的转导。观测到在灰质终止的感觉纤维(a)。此外，在运动神经元集合中的GFP阳性运动神经元存在于脊髓的背外侧部分。这些运动神经元发出纤维经由脊髓的腹侧部分进入腹侧根(d)。
[0101] 图9：DRG的GFP染色切片，用苏木精复染。可以见到沿着脊髓的背根神经节转导。来自颈部(A、B)、胸部(C、D)和腰部(E、F)水平的DRG被转导。在较高放大倍数(右图，B、D、F)，根部中纤维通过其GFP表达而可见。几乎所有DRG神经元均被转导。
[0102] 图10：小脑针对GFP和NeuN(神经元标记)的双重染色。Bergmann胶质细胞(Bc)示出GFP表达，基于其形态学也可观测到Purkinje细胞(Pc)。
[0103] 图11：皮质针对GFP和NeuN的双重染色。箭头指向在皮质中表达GFP的神经元。
[0104] 图12：皮质针对GFP和GFAP(星形胶质细胞标记)的双重染色。箭头指向表达GFP的星形胶质细胞。三角指向具有神经元特性的细胞。
[0105] 图13：大脑和小脑切片的苏木精伊红染色。上左是小脑概观。上右是较高放大倍数的小脑分子层。精细排列的是大且圆的神经元(也见于插图)，Purkinje细胞。通常地，未观测到明显的浸润或不规则表示所述治疗是良好耐受的。
[0106] 图14：GFP染色的腰髓切片通过在腹侧角中存在大神经元的转基因而示出在腰髓中运动神经元的剂量依赖性转导。在动物CSF中注入5E13(A)、5E14(C)或8E14(E)基因组拷贝(GC)。示出较高放大倍数的腹侧角，其中运动神经元被定位、描绘(B、D和F)。实施例
[0107] 实施例1
[0108] 在这个实验中，在CAG启动子控制下编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV-5载体经鞘内输注到非人灵长目动物的CSF中。在注射后4周检测转基因表达。在所有脊髓水平的运动神经元及背根神经节(DRG)中均观测到GFP表达。此外，在小脑中，许多Bergman胶质细胞以及一些Purkinje细胞被转导。在大脑中，皮质在神经元和神经胶质细胞中也表达GFP。沿着室下区(SVZ)的细胞也被转导。总之，这些结果表明使用这种注射途径，大部分CNS区域被覆盖，针对CNS的基因治疗成为现实选项。
[0109] 实施例1.1：材料与方法
[0110] 1.1.1.载体的制备
[0111] rAAV血清型5(rAAV-5)的表达盒含有人cDNA，增强的绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA基因。表达在CAG启动子控制下，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的组合。GFP的前面是Kozak序列，并且其通过牛生长激素聚腺苷酸化(BGHpA)信号聚腺苷酸化。完整表达盒的侧翼是AAV-2的两个非编码反向末端重复(见图1)。重组AAV-5载体是使用杆状病毒表达系统类似先前所述制备(Urabe et al.,2002，Unzu et al.,2011，Kotin,2011回顾)。简而言之，用三个重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，所述三个重组杆状病毒其中一个编码用于复制和包装的REP，一个编码AAV-5衣壳的CAP-5，一个具有表达盒。使用AVB琼脂糖高效亲和介质(GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行纯化。载体使用针对转基因的引物-探针组合通过Q-PCR方法进行滴定，以基因组拷贝/ml(GC/ml)表示效价。
载体的效价是1.4E14GC/ml。
载体的效价是1.4E14GC/ml。
[0112] 1.1.2.动物和组织收集
[0113] 大约4kg的雄性食蟹猕猴(Macaca fascicularis)用于这项研究中。记录每天的健康观测及定期测量体重，以评估动物的健康情况。兽医报道在研究期间无异常症状。所有程序均经Institutional Animal Care and Use Committee at Valley Biosystems(Sacramento,CA,USA)许可。在开始程序之前，动物经测试AAV中和抗体的存在呈阴性(见下文)。为了进行所述程序，将动物用氯胺酮(Ketaset，7mg/kg)与盐酸右美托咪定(Dexdomitor，0.015mg/kg)的混合物麻醉。在手术后，所有动物均接受肌肉注射阿替美唑盐酸盐以从麻醉中恢复(Antisedan，0.15mg/kg)。在施用AAV-5之后1个月，将动物深度麻醉并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)及在PBS中的4％低聚甲醛(PFA)进行心脏灌注。收集脑和器官并加工以进行组织学分析。
[0114] 简而言之，将脑及颈部、胸部和腰部脊髓进行冠状切片成6-mm标本块，在4％PFA-PBS中固定过夜，第二天在30％(w/v)蔗糖中低温保护。为了进行组织学染色，使用滑动式切片机(Thermo Scientific Microm HM 450；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)将脑标本块切成40-lm系列切片。然后将切片置于低温保护溶液直至使用。
[0115] 1.1.3.AAV递送
[0116] 在诱导麻醉后，将动物头部置于立体定位框架中，以俯卧位屈曲，颈背部用聚乙烯吡咯酮碘和乙醇清洁。将附着1英寸23号注射针头的3ml注射器安装在显微操作器上，将针头手工操纵进入小脑延髓池。在脊髓L4和L5水平之间进行类似的腰椎硬膜穿刺。穿刺通过将小体积的脑脊液(CSF)抽吸入注射器得以证实，然后将注射器安靠于显微操作器上。然后调节注射器上三通阀，使用泵(3500Medfusion；Strategic Applications,Libertyville,IL)以0.5ml/分钟的流速注入3ml的载体。在完成注入后，将通道用0.2ml盐水冲洗。最后，抽吸小体积CSF以证实针头仍在CM中。经证实后，将针头缓慢移出。由此，每个动物在小脑延髓池中接受3ml及通过腰椎注射接受3ml。总共注入6ml的1.4E14GC/ml的AAV-5-CAG-GFP。
[0117] 相似地，动物可以用相同量和剂量的AAV-5-CAG-GFP处理，仅通过在L4-L5脊髓水平经腰椎注射施用(不注射进小脑延髓池中)。通过腰椎注射施用如下量的AAV-5-CAG-GFP：5E13(正常剂量)、5E14和8E14GC(高剂量)。
[0118] AAV的正常施用剂量是大约1E12GC和5E13GC。例如，Vulchanova(如前述)针对小鼠(20g)使用1E11GC AAV-5，其相当于5E12/kg。对于5kg的猴，使用2.5E13GC。此外，Gray et al(2013,Gene Therapy,20,450–459)使用2E12GC/6kg动物。因此，施用5.0E13GC的剂量在本领域可以被认为是正常剂量，5.0E14和8.4E14被认为是高剂量。
[0119] 由于蓝色染料的腰椎输注导致池穿刺的蓝染，如果基因治疗载体仅是腰椎施用则预期结果无差异。
[0120] 1.1.4.免疫组织化学
[0121] 对来自前额皮质至小脑和脊髓的四个6-mm脑标本块的40-lm冠状切片进行生色和免疫荧光染色。生色GFP染色如先前所述进行(Hadaczek et al.,2009)。简而言之，将切片在PBS中洗涤，用在PBS中1％H2O2–30％的乙醇封闭内源性过氧化物酶活性，在PBST(PBS加上0.1％Tween 20)中漂洗。然后将切片在Background Sniper封闭溶液(BS966G；Biocare Medical,Concord,CA)中保温，及在4℃与在Da Vinci Green稀释剂(PD900；Biocare Medical)中的GFP(兔抗-GFP，1:3000稀释；Millipore,Bedford,MA)的一级抗体保温直至24小时。第二天，在PBST中洗涤后，将切片在Rabbit Mach3Polymer HRP(RP531L；Biocare Medical)中在室温孵育以进行GFP染色，用3， -二氨基联苯胺(DAB)(DAB过氧化物酶底物试剂盒，SK-4100；Vector Laboratories,Burlingame,CA)显影。然后将切片安放在载玻片上，脱水，用Shandon-Mount(cat.No 1900333；Thermo Fisher Scientific)覆盖。
[0122] 为了确定GFP-阳性细胞的表型，进行双重免疫荧光染色。将脑切片用PBST洗涤，在20％正常马血清(NHS；Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)中封闭60分钟，然后在4℃与抗-GFP(兔或小鼠，1:200稀释；Millipore)以及特异于小神经胶质细胞(抗体-Iba1，兔多克隆抗体，1:500稀释；Biocare Medical)、神经元(抗-NeuN，小鼠单克隆抗体，1:300稀释；Millipore)、纤维性星形胶质细胞(抗-神经胶质细胞-纤维性酸性蛋白质[GFAP]，小鼠单克隆抗体，1:500稀释；Dako,Carpinteria,CA)的抗体孵育过夜。所有抗体均在Da Vinci Green稀释剂(PD900；Biocare Medical)中稀释。在与一级抗体孵育后，将切片在PBST中洗涤；与相应二级抗体(FITC-缀合的抗-兔抗体[1:200稀释；Jackson ImmunoResearch]或者Alexa 488-缀合的抗小鼠抗体[1:500稀释；Molecular Probes/Invitrogen,Carlsbad,CA]及Alexa 555-缀合的抗-小鼠抗体[1:500稀释；Molecular Probes/Invitrogen]或者Alexa
555-缀合的抗-兔抗体[1:500稀释；Molecular Probes/Invitrogen])在PBST中的混合物在室温孵育2小时；在PBS中洗涤；湿润安放(wet-mounted)在冰冻的载玻片上。将切片用含有
6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-的硬基质覆盖以鉴别所有细胞核(VectashieldH-1200；
Vector Laboratories)。
555-缀合的抗-兔抗体[1:500稀释；Molecular Probes/Invitrogen])在PBST中的混合物在室温孵育2小时；在PBS中洗涤；湿润安放(wet-mounted)在冰冻的载玻片上。将切片用含有
6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-的硬基质覆盖以鉴别所有细胞核(VectashieldH-1200；
Vector Laboratories)。
[0123] 1.1.5.在NHP中抗-AAV5抗体效价
[0124] 在施用载体之前，针对AAV衣壳的抗体效价通过在血液样品上的ELISA确定。简而言之，将在1mM碳酸盐缓冲液中的2E 10GC/ml的AAV衣壳溶液分散至96孔滴定平板中，在4℃保温过夜。第二天，洗涤平板并用在PBST中的5％脱脂乳溶液封闭。将血清在1:50至1:6400范围稀释，并在室温孵育1小时。然后将孔用PBST洗涤，并与辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗猴二级抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温孵育1小时。将细胞再次在PBST中洗涤，然后用3,3-,5,5-四甲基联苯胺(TMB)显影。通过加入盐酸终止反应，在平板分析仪(Bevan et al.,2011)上在450nm读取吸光度。
[0125] 1.1.6生物分布AAV
[0126] 施用前：从成年食蟹猕猴(Macaca fasciularis)中收集血液样品进行筛选及血清抗-AAV-5抗体效价的分析、血清临床化学和血液学评估。
[0127] CSF注入：将动物用氯胺酮(10mg/kg)IM和美托咪啶(15μg/kg)IM固定。将脊椎穿刺针置于腰部，在此为动物注射单剂量的(5mL，5分钟以上)AAV5-CAG-GFP至CSF。在这些动物中施用三种不同的剂量(5E14、5E13和5E12GC)。
[0128] 组织收获：将CSF注入的动物在注入后8周行安乐死。将每个动物用氯胺酮(10-15mg/kg，IM)和美托咪啶(15μg/kg)深度麻醉。给动物施用安乐死溶液。在证实深度麻醉之后(即无夹趾反应、角膜反射和颚音(jaw tone))，进行经胸切开术，取一片肝脏样品。收获脑和脊髓，组织环切刀切片进行分子学(Q-PCR)分析。剩余的组织保存在多聚甲醛中以进行组织学评估。
[0129] Q-PCR分析：使用针对GFP基因的引物，对组织进行标准Q-PCR方法分析。结果在表2中示出。
[0130] 1.2.结果
[0131] 所述程序由动物良好耐受。兽医未观测到体重下降，也未注意到临床症状。
[0132] 检测三种不同剂量的AAV：5E13GC、5E14GC和8.4E14GC。5E13GC可被认为是正规剂量，而5E14GC和8.4E14GC是高剂量。
[0133] 如图14所示，施用正规剂量(5E13GC)的AAV5A，导致几乎没有任何转导，证实本领域的共识即AAV5在鞘内施用之后仅不充分地转导神经元细胞。令人惊奇地，较高剂量的AAV5导致显著的运动神经元转导。图14示出当使用较高剂量时，运动神经元的转导增加。在背侧角，也观测到一些纤维，提示DRG神经元的转导。然而，主要的被转导细胞类型是运动神经元。
[0134] 进一步地，在脊髓、脑和肝脏中确定AAV基因组的存在。特别地，肝中AAV的存在表明AAV5从CNS中渗漏进入外周。已经熟知AAV载体在施用至CNS中时可以渗漏进入外周。例如，Haurigot et al(2013,J.Of Clin.Invest.,123:3254–3271)使用AAV9通过颅内注射进行全身调整，其对肝脏也有作用。有趣的是，与例如AAV9相反，大多数AAV5颗粒保留在脊髓内，播散至脑。肝脏不被AAV5入侵(表2)。
[0135] 表2：在CSF注射后AAV颗粒的存在。其中+++表示AAV基因组巨大量存在，++表示AAV基因组大量存在，+表示基因组存在，–表示未检测到AAV基因组存在。
[0136]
[0137] 如下观测结果得自用8.4E14GC进行的实验：在整个CNS包括大脑、小脑和脊髓中观测到GFP表达。表达在神经元和神经胶质细胞中均观测到。特别地，GFP表达主要在运动神经元中观测到。Vulchanova等还观测到在用甘露醇预处理后使用AAV5对神经元细胞的转导。然而，Vulchanova等观测到与运动神经元对比DRG神经元的更高的转导效力(及其神经突伸出至脊髓的背侧角)。因此，被转导的运动神经元/DRG的比率有利于使用甘露醇的DRG，以及使用高剂量AAV5的运动神经元，使得施用高剂量的AAV5特别适于治疗和/或预防运动神经元相关的病症。
[0138] 对一些脑切片的概观示出遍及整个脑部的良好表达，主要是在脑室壁邻近部位的表达(见图2)。在顶叶皮质中的表达示出遍及几层皮质的表达。一些星形胶质细胞也被转导(图3)。在皮质枕部也同样如此(图4)。在小脑中，小脑结构的沟回由转导的细胞明显示出(图5)。在脑的这部分中，观测到神经元和神经胶质细胞均被转导。
[0139] 在脊髓中，在脊髓全长的许多(如果不是所有)运动神经元被转导(图6、7和8)。在DRG中的神经元观察到相似情形(图9)。其也被大量转导以表达GFP。为了鉴别表达转基因的细胞，对神经元和星形胶质细胞进行双重染色。使用这种特异性CAG启动子，实现神经元和星形胶质细胞均转导(图10、11和12)。为了检验神经元丧失是否已经发生，对小脑切片进行H&E染色(图13)。基于剩余的Purkinje细胞层的存在，使用这种特殊方法未观测到神经毒性。
[0140] 1.3.讨论
[0141] 目前将基因递送至CNS受到其大小和CNS的复杂性的阻碍。在单次注射脑中后，转基因的表达是局部的且主要限于注入部位。使用CSF作为递送病毒载体的方法，可以达到较大的区域。本研究示出使用AAV-5载体在超过1E14GC/kg的相对较高剂量，可能实现在CNS中较大区域转导的这个目标。该治疗良好耐受，因为未观测到临床症状及明显的神经元丧失。神经元和神经胶质细胞均使用这种特异性CAG启动子转导。使用细胞特异性启动子，如GFAP启动子或突触蛋白-1启动子，可以指导特定群体表达。我们揭示了皮质、小脑和室下区示出转基因在神经元和胶质细胞中均表达。在脊髓中，运动神经元转导是普遍的，在背根神经节中神经元的转导也是普遍的。这些结果示出CNS介导的递送方法可用于递送用于基因治疗方法的基因。可以由此获益的适应症是：运动神经元疾病如肌萎缩性侧索硬化(ALS)，脊髓性肌萎缩(SMA)，或者感觉相关的适应症如疼痛。可以由此方法获益的其它神经学适应症例如是亨廷顿病，阿尔兹海默病，Tay-Says病，弗里德赖希共济失调，共济失调性毛细血管扩张症，脊髓小脑性共济失调(1型、2型和3型)，尼曼皮克病(A型、B型和C型)，多巴反应性肌张力障碍，脆性X综合征，克拉伯病，2型糖原贮积症(Pompe)，原发性脊髓侧索硬化，佩利措伊斯-梅茨巴赫病，X连锁肾上腺脑白质营养不良，巨轴索神经病，多系统萎缩(MSA)，近位肌强直肌病，及神经元蜡样脂褐质沉积症(Batten病)。
[0142] 相关的遗传缺陷大部分是已知的并且可以构建进AAV(-5)载体中。使用这种递送系统作为治疗剂，可以设想其逆转基因型并因此有希望也逆转表型。
[0143] 此外，鞘内递送方法被认为比输注进CNS本身侵入性低，因为脑部外科手术需要复杂的手术程序。鞘内方法具有另外的价值，即可以不需要由专业脑部注射中心进行。
[0144] 1.4.参考文献
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