用于基因治疗的经修饰的弗里德赖希共济失调基因及载体
阅读：876发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于基因治疗的经修饰的弗里德赖希共济失调基因及载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及经修饰的FXN基因，其提供可用于 治疗 弗里德赖希(Friedreich) 共济失调 的经编码的共济失调蛋白(frataxin)的增加的表达。，下面是用于基因治疗的经修饰的弗里德赖希共济失调基因及载体专利的具体信息内容。
1.一种编码包含在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的共济失调蛋白(FXN)的经修饰的核酸，其中所述核酸的表达水平高于SEQ ID NO：2的野生型FXN核酸序列的表达水平，且其中所述经修饰的核酸包含选自由以下各者组成的组的至少一个特性：GC水平为至少
55％、CpG二核苷酸数目不超过124，及密码子适应指数(CAI)为至少0.76。
2.权利要求1的经修饰的核酸，所述核酸包含选自由以下各者组成的组的至少一个特性：
(a)CAI为至少0.86、至少0.95或至少0.98；
(b)GC水平为至少57％、至少61％或至少69％；
(c)CpG二核苷酸的数目小于124；
(d)选自由如SEQ ID NO：3至9中所示的序列组成的组的核酸序列。
3.一种编码FXN的经修饰的核酸，其中所述核酸的表达水平高于SEQ ID NO：2的野生型FXN核酸序列的表达水平，且其中所述核酸包含以下各者中的至少一者：
(a)选自由SEQ ID NO：3至9组成的组的核酸序列；
(b)GC水平为至少55％；
(c)CpG二核苷酸数目不超过117；及
(d)CAI为至少0.86。
4.权利要求3的经修饰的核酸，其中所述核酸序列选自由SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7组成的组。
5.权利要求1的经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
6.一种载体，其包含权利要求1的经修饰的核酸。
7.一种载体，其包含权利要求3的经修饰的核酸。
8.权利要求7的载体，其中所述载体为重组腺相关病毒载体(rAAV)且所述核酸为自我互补的。
9.权利要求8的rAAV，其中所述rAAV包含选自由以下各者的衣壳组成的组的衣壳：
AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
10.权利要求9的rAAV，其中所述经修饰的核酸包含SEQ ID NO：7的序列，且其中衣壳选自AAV2i8的衣壳及AAV2-TT-S312N的衣壳。
11.权利要求10的rAAV，其中所述核酸进一步包含选自由以下各者组成的组的至少一个元件：至少一个AAV末端重复序列、增强子、启动子、终止密码子及聚腺苷酸化(polyA)信号序列。
12.权利要求11的rAAV，所述rAAV包含两个AAV末端重复序列、CBh启动子、编码胶原蛋白稳定序列(CSS)的序列、及牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGHpolyA)。
13.一种rAAV载体，其包含自5’至3’包含以下的核酸：
(a)AAV2末端重复序列；
(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：25的核酸序列；
(c)权利要求3的编码FXN的经修饰的核酸；
(d)CSS，其具有SEQ ID NO：24的序列；
(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：26的序列；及
(f)AAV2末端重复序列。
14.权利要求13的rAAV载体，其进一步包含AAV2i8衣壳，其中VP1包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，所述载体进一步包含自5’至3’包含以下的自我互补核酸：
(a)AAV2末端重复序列；
(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：25的核酸序列；
(c)编码FXN的经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的序列；
(d)CSS，其具有SEQ ID NO：24的序列；
(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：26的序列；及
(f)AAV2末端重复序列。
15.权利要求13的rAAV载体，其进一步包含AAV2-TT-S312N衣壳，其中所述VP1包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，所述载体进一步包含自5’至3’包含以下的自我互补核酸：
(a)AAV2末端重复序列；
(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：25的核酸序列；
(c)编码FXN的经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的序列；
(d)CSS，其具有SEQ ID NO：24的序列；
(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：26的序列；及
(f)AAV2末端重复序列。
16.一种用于治疗有需要的患者的弗里德赖希(Fr iedreich)共济失调(FRDA)的rAAV载体，其中所述rAAV包含选自由以下各者组成的组的编码FXN的经修饰的核酸：
(a)经修饰的核酸，其包含在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，其中所述核酸的表达水平高于SEQ ID NO：2的野生型FXN核酸序列的表达水平，且进一步包含至少55％的GC水平、不超过124的CpG二核苷酸数目、及至少0.76的密码子适应指数(CAI)；
(b)经修饰的核酸，其包含至少0.86的CAI、至少55％的GC水平、及不超过117的CpG二核苷酸数目；
(c)经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：5的核酸序列；及
(d)经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
17.权利要求16的经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
18.一种用于治疗有需要的患者的弗里德赖希共济失调的rAAV载体，其中所述载体包含权利要求3的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸。
19.一种药物组合物，其包含权利要求18的rAAV载体。
20.一种治疗受试者的FRDA的方法，所述方法包括施用权利要求18的rAAV载体。
21.权利要求20的方法，其中通过直接心脏施用或通过颅内施用来全身性施用所述rAAV载体。
22.权利要求21的方法，其中所述rAAV载体经颅内施用。
23.权利要求21的方法，其中直接向心脏施用所述rAAV载体。
24.权利要求21的方法，其中编码FXN的所述经修饰的核酸包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
25.一种治疗受试者中由降低水平的FXN介导的疾病、病症或病状的的方法，所述方法包括施用权利要求18的rAAV载体。
26.一种宿主细胞，其包含权利要求3的编码FXN的经修饰的核酸。
27.权利要求26的宿主细胞，其中所述细胞选自由以下各者组成的组：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293细胞、B-50或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。
28.权利要求27的宿主细胞，其中所述宿主细胞为适于在悬浮培养物中生长的HEK293。
29.权利要求27的宿主细胞，其中所述细胞为具有ATCC NO.PTA13274的HEK293细胞。
30.权利要求26的宿主细胞，所述细胞包含编码选自由以下各者组成的组的至少一种蛋白质的至少一种核酸：Rep蛋白、Cap蛋白、E1a蛋白、E1b蛋白、E2a蛋白、E4蛋白及VA RNA。
31.权利要求1的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸，其用于增加共济失调蛋白在细胞中的水平。
32.权利要求3的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸，其用于增加共济失调蛋白在细胞中的水平。
33.权利要求18的rAAV载体，其用于治疗受试者的弗里德赖希共济失调。
用于基因治疗的经修饰的弗里德赖希共济失调基因及载体
发明领域
[0001] 本发明涉及经修饰的共济失调蛋白(frataxin)(FXN)基因、包含经修饰的FXN基因的载体、使用经修饰的FXN基因及含有该等基因的载体通过提供表达水平增加的非突变(野生型)线粒体蛋白共济失调蛋白来治疗弗里德赖希(Friedreich)共济失调的方法，该弗里德赖希共济失调包括心肌病和/或与其相关联的神经退化性疾病。
[0002] 发明背景
[0003] 弗里德赖希共济失调(FRDA)与编码线粒体蛋白共济失调蛋白的FXN基因的表达的降低和/或该FXN基因的突变相关联。FRDA为常染色体隐性疾病，意指个体仅在其自双亲遗传缺陷基因时罹患此疾病。FRDA由导致mRNA及共济失调蛋白的蛋白水平降低的FXN基因的突变引起。缺陷的共济失调蛋白表达引起关键代谢变化，包括氧化还原失衡及ATP缺乏。
[0004] FRDA为影响儿童及青少年且导致进行性残疾及过早死亡的神经退化性疾病。神经体征与感觉神经元的退化相关联，且穿过周边神经及脊髓的感觉信息的流动受到严重影响。还存在来自小脑及脊髓的肌肉控制信号的一些损害。这些问题导致表征FRDA的平衡、协调及肌肉强度的逐渐丧失。此外，患者往往罹患很可能造成过早死亡的肥厚性心肌病。心脏增大、不规则心跳及心脏病的其他症状为明显的。
[0005] 据信，共济失调蛋白调节线粒体内使用氧以产生能量所需的铁的含量。共济失调蛋白似乎充当铁的储存库，仅在需要铁来合成线粒体中的酶时释放铁。因此，共济失调蛋白的缺乏导致这些酶的缺乏且进一步降低线粒体功能，这很可能解释了弗里德赖希共济失调影响神经系统及心脏的细胞的原因。
[0006] 到目前为止，不存在用于停止或减缓FRDA的负面影响的疗法。临床使用的或处于评估的当前治疗方法针对缓解症状且最大化生命质量。物理治疗及言语治疗已用于改良运动。此外，一些药物已用于治疗心脏病。因此，非常需要一种用于治疗与FRDA相关联的症状的新颖治疗方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本文公开及例示了编码共济失调蛋白(FXN)的经修饰的核酸及包含该经修饰的核酸的载体及通过向有需要的患者施用经修饰的核酸或包含该核酸的载体来治疗由降低水平的FXN介导的疾病的方法。
[0009] 本领域技术人员使用不超过常规实验的途径即可识别或能够确定本文中所描述的本发明的特定实施方案的许多等效物。此类等效物意欲由以下实施方案(E)涵盖。
[0010] E1.一种用于治疗人类受试者的FRDA的经修饰的FXN基因，其中经修饰的FXN基因已被修饰以改变GC核苷酸的含量和/或具有减少数目的CpG二核苷酸。
[0011] E2.如实施方案1的经修饰的FXN基因，其中由于CpG基序的甲基化，CpG二核苷酸的降低数目呈足以抑制基因表达的沉默的量。
[0012] E3.如实施方案1的经修饰的FXN基因，其中相对于野生型基因，GC核苷酸的含量大于10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
[0013] E4.如实施方案3的经修饰的FXN基因，其具有>0.75、>0.80、>0.85、>0.90或>0.95的密码子适应指数。
[0014] E5.如实施方案3的经修饰的FXN基因，其包含选自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：9中的任一者的序列。
[0015] E6.如实施方案1的经修饰的FXN基因，其中相对于野生型基因，GC核苷酸的含量小于10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
[0016] E7.如实施方案1的经修饰的FXN基因，其包括在病毒载体或质体中。
[0017] E8.如实施方案7的经修饰的FXN基因，其中病毒载体为自我互补的AAV序列。
[0018] E9.如实施方案8的经修饰的FXN基因，其中该病毒载体选自由以下各者组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV Hu.26、AAV2i8、AAV2G9、rhAAV10、rhAAV74、RHM4-1、RHM15-
1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03，及其组合和变体。
1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03，及其组合和变体。
[0019] E10.如实施方案8的经修饰的FXN基因，其中病毒载体为祖AAV载体。
[0020] E11.如实施方案8的经修饰的FXN基因，其中病毒载体为包括来自AAV2、AAV3B、AAV6或AAV8的AAV主链的组合且进一步包含来自AAV9的半乳糖(Gal)结合足迹的嵌合AAV。
[0022] E13.一种用于治疗有需要的受试者的与共济失调蛋白缺乏相关联的疾病的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的经修饰的FXN基因，其中该经修饰的FXN基因已被修饰以增加或减少GC核苷酸的含量和/或减少CpG二核苷酸的数目。
[0023] E14.如实施方案13的方法，其中经修饰的FXN基因编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的共济失调蛋白。
[0024] E15.如实施方案13的方法，其中经修饰的FXN基因在靶细胞中表达，其中所述靶细胞为心脏细胞或神经元细胞。
[0025] E16.如实施方案13的方法，其中经修饰的FXN基因在病毒或非病毒载体中递送至靶细胞。
[0026] E17.如实施方案16的方法，其中载体通过全身注射或通过直接心脏或颅内注射递送。
[0027] E18.一种治疗有需要的受试者的弗里德赖希共济失调(FRDA)的方法，该方法包括：提供包含经修饰的FXN基因的至少一个重组病毒载体，其中该经修饰的FXN基因已被修饰以增加或减少GC核苷酸的含量和/或减少CpG二核苷酸的量；及在使经修饰的FXN基因以在受试者的心脏和/或神经元组织中产生治疗有效量的共济失调蛋白的水平表达的条件下向受试者施用重组病毒载体。
[0028] E19.如实施方案18的方法，其中向受试者的神经元或心肌细胞施用重组病毒载体。
[0029] E20.一种用编码共济失调蛋白肽或其功能片段的经修饰的FXN基因转染的宿主细胞，其中经修饰的FXN基因已被修饰以增加或减少GC核苷酸的含量和/或减少CpG二核苷酸的数目。
[0030] E21.一种制备共济失调蛋白肽或其片段的方法，其包括：用编码共济失调蛋白肽或其功能片段的经修饰的FXN基因转染宿主细胞；及将宿主细胞保持在足以表达共济失调蛋白肽的生物条件下。
[0031] E22.如实施方案21的方法，其中经修饰的FXN基因相较于如SEQ ID NO：2中所示的野生型共济失调蛋白的核酸序列具有增加水平的GC核苷酸和/或降低水平的CpG二核苷酸。
[0032] E23.一种包含经修饰的FXN基因及医药学上可接受的载剂的药物组合物，其中经修饰的FXN基因具有增加或降低含量的GC核苷酸和/或减少数目的CpG二核苷酸。
[0033] E24.一种用于治疗FRDA的方法，其包括向需要治疗的受试者递送包含编码FXN基因的经修饰的多核苷酸序列的载体，其中FXN基因在靶细胞中表达，进而治疗受试者的FRDA。靶细胞优选为心脏或神经元细胞，且载体优选经由直接心脏或颅内注射递送至靶细胞。
[0034] E25.如实施方案1的经修饰的核酸，其中相对于野生型基因，经修饰的核酸具有降低的GC含量，该降低的GC含量比野生型基因小20％、30％、40％、50％或60％，同时仍具有与野生型相同的表达水平。可将沉默突变引入至编码序列中，以便减少基因的GC含量。
[0035] E26.一种具有降低水平的CpG二核苷酸的编码FXN的经修饰的核酸。
[0036] E27.一种用于治疗有需要的人类受试者的FRDA的编码FXN的经修饰的核酸(也被称作“经修饰的FXN基因”)，其中经修饰的FXN基因已被修饰以相对于如SEQ ID NO：2所示的编码FXN的野生型核酸序列增加GC含量且减少某些顺式基序。
[0037] E28.一种经修饰的FXN基因，其与存在于如SEQ ID NO：2所示的编码FXN的野生型核酸序列中的CpG二核苷酸的数目相比较，具有由于CpG基序的甲基化而呈抑制基因表达的沉默的量的减少数目的CpG二核苷酸。
[0038] E29.一种治疗受试者的FRDA的方法，该方法包括：提供包含实施方案1至12、23、及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因的至少一个重组病毒载体，且在使经修饰的FXN基因以在受试者的心脏和/或神经元组织中产生治疗有效量的共济失调蛋白的水平表达的条件下向受试者施用重组病毒载体。
[0039] E30.一种用于降低有需要的受试者的神经元及心肌细胞的弗里德赖希共济失调的影响或治疗该弗里德赖希共济失调的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的重组病毒载体，该重组病毒载体包含编码蛋白共济失调蛋白的经修饰的FXN核酸。
[0040] E31.一种用于治疗有需要的受试者的弗里德赖希共济失调的方法，其包括基于施用核酸的基因治疗，该核酸包含选自由序列SEQ ID NO：3-9组成的组的核苷酸序列。
[0041] E32.一种包含腺相关病毒(AAV)载体或其功能片段的组合物，该腺相关病毒载体包含经修饰的FXN基因，其中该AAV载体包含单链AAV载体基因组、双链AAV载体基因组或自我互补的(sc)AAV载体基因组。
[0042] E33.一种表达载体，其包含包括经修饰的FXN基因或其片段的多核苷酸。
[0043] E34.如实施方案33的载体，其中AAV包含选自由以下各者组成的组的血清型的衣壳：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rhAAV10、rhAAV74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1(SEQ ID NO：15)、AAV2.5(SEQ ID NO.13)、AAV6.1(SEQ ID NO：17)、AAV6.3.1(SEQ ID NO：18)、AAV9.45、AAV2i8(SEQ ID NO：29)、AAV2G9、AAV2-TT(SEQ ID NO：31)、AAV2-TT-S312N(SEQ ID NO：33)、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
[0044] E35.如实施方案34的载体，其进一步包含：AAV1.1衣壳，其中氨基酸残基265缺失(SEQ ID NO：15)；AAV 6.1衣壳，其中氨基酸残基265缺失(SEQ ID NO：17)；AAV 6.3.1衣壳，其中氨基酸残基265缺失且氨基酸残基531自Lys变为Glu(SEQ ID NO：18)。野生型AAV1衣壳的核苷酸序列显示于(SEQ ID NO：14)中，且野生型AAV6衣壳的核苷酸序列示于(SEQ ID NO：16)中。
[0045] E36.一种包含实施方案1至12、23、及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因的嵌合AAV病毒载体，其进一步包含包括来自AAV2、AAV3、AAV6、AAV8的AAV主链的组合的衣壳以及来自AAV9的半乳糖(Gal)结合足迹。特别地，将来自AAV9的半乳糖(Gal)结合足迹接枝至硫酸肝素结合AAV血清型2以改良转导效率。
[0046] E37.一种包含实施方案1至12、23及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因的嵌合AAV病毒载体，其进一步包括其中载体衣壳包含与AAV1和/或AAV6的265缺失突变组合的酪氨酸突变以及将半乳糖结合足迹添加至衣壳蛋白。
[0047] E38.一种包含实施方案1至12、23及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因的嵌合AAV病毒载体，其进一步包含嵌入AAV的HI结构环或AAV 2主链中的585aa位置的靶向肽。另外，祖AAV载体可用于治疗性体内基因治疗。值得注意地，与同时代的病毒或其部分相比，自祖病毒序列组装的病毒颗粒的使用在当前人群中呈现对预存免疫降低的易感性。
[0048] E39.一种宿主细胞，其包含实施方案1至12、23及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因。
[0049] E40.一种制备共济失调蛋白肽或其片段的方法，其包括：用实施方案1至12、23及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因转染宿主细胞，及将宿主细胞保持在足以表达共济失调蛋白肽的生物条件下。
[0050] E41.一种实施方案1至12、23及25至28中的任一者的经修饰的FXN基因在治疗弗里德赖希共济失调中的用途。
[0051] E42.一种包含用于治疗引起人类受试者的心脏组织中的神经元及细胞的退化的弗里德赖希共济失调的经修饰的FXN基因及医药学上可接受的载剂的药物组合物，其中经修饰的FXN基因具有增加量的GC核苷酸、减少量的GC核苷酸和/或具有减少数目的CpG二核苷酸数目。
[0052] E43.一种编码共济失调蛋白的表达优化核酸，其包含选自SEQ ID NO：3-9中的任一者的核酸序列。
[0053] E44.一种编码包含示于SEQ ID NO：1中的氨基酸的共济失调蛋白的经修饰的核酸，其中核酸具有至少55％的GC含量、与SEQ ID NO：2的核酸序列相比减少数目的CpG二核苷酸、至少0.8的密码子适应指数(CAI)，且其中其以与包含SEQ ID NO：2的核酸序列的野生型共济失调蛋白的表达水平相比更高的水平表达。
[0054] E45.如实施方案44的经修饰的核酸，其中CAI为至少0.86。
[0055] E46.如实施方案44的经修饰的核酸，其中CAI为至少0.95。
[0056] E47.如实施方案44的经修饰的核酸，其中CAI为至少0.98。
[0057] E48.如实施方案44至47中的任一者的经修饰的核酸，其中GC含量为至少61％。
[0058] E49.如实施方案44至47中的任一者的经修饰的核酸，其中GC含量为至少69％。
[0059] E50.如实施方案44至49中的任一者的经修饰的核酸，其中CpG二核苷酸的数目为约114至124。
[0060] E51.一种编码包含在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的共济失调蛋白(FXN)的经修饰的核酸，其中该核酸的表达水平高于SEQ ID NO：2的野生型FXN核酸序列的表达水平，且其中该经修饰的核酸包含选自由以下各者组成的组的至少一个特性：至少55％的GC含量、不超过124的CpG二核苷酸数目，及至少0.76的密码子适应指数(CAI)。
[0061] E52.如实施方案51的经修饰的核酸，该核酸包含选自由以下各者组成的组的至少一个特性：至少0.86、至少0.95或至少0.98的CAI；GC含量为至少57％、至少61％，或至少69％；CpG二核苷酸的数目小于124；及选自由如SEQ ID NO：3-9中所示的序列组成的组的核酸序列。
[0062] E53.一种编码FXN的经修饰的核酸，其中该核酸以与SEQ ID NO：2的野生型FXN核酸序列的表达水平相比更高的水平表达，且其中核酸包含以下各者中的至少一者：选自由SEQ ID NO：3-9组成的组的核酸序列；至少55％的GC含量；不超过117的CpG二核苷酸数目；及至少0.86的CAI。
[0063] E54.如实施方案53的经修饰的核酸，其中该核酸序列选自由SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7组成的组。
[0064] E55.如实施方案43至54中的任一者的经修饰的核酸，其包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
[0065] E56.如实施方案1至12、23、25至28及43至55中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含编码至少一个AAV末端重复序列(TR)的核酸序列。
[0066] E57.如实施方案55的经修饰的核酸，其中核酸为单链、双链和/或自我互补的。
[0067] E58.如实施方案57的经修饰的核酸，其中该核酸为自我互补的。
[0068] E59.如实施方案1至12、23、25至28及43至58中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含增强子。
[0069] E60.如实施方案59的经修饰的核酸，其中增强子为细胞巨大病毒(CMV)立即早期增强子。
[0070] E61.如实施方案1至12、23、25至28及43至60中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含启动子。
[0071] E62.如实施方案1至12、23、25至28及43至61中的任一者的经修饰的核酸，其中启动子为组成性的或经调节的。
[0072] E63.如实施方案62的经修饰的核酸，其中启动子为经调节的。
[0073] E64.如实施方案63的经修饰的核酸，其中启动子为诱导性的或可抑制的。
[0074] E65.如实施方案1至12、23、25至28及43至64中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含编码胶原蛋白稳定序列(collagen stabilization sequence；CSS)的核酸序列。
[0075] E66.如实施方案1至12、23、25至28及43至65中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含终止密码子。
[0077] E68.如实施方案67的经修饰的核酸，其中启动子选自由以下各者组成的组：鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV增强子/CBA启动子(CBh)，及合成CAG启动子。
[0078] E69.如实施方案68的经修饰的核酸，其中启动子为CBh启动子。
[0079] E70.如实施方案1至6、12、25至28及44至69中的任一者的经修饰的核酸，其进一步包含编码胶原蛋白稳定序列(CSS)的核酸序列。
[0080] E71.一种重组AAV载体(rAAV)，其包含实施方案1至12、23、25至28及43至70中的任一者的编码FXN的经修饰的核酸。
[0081] E72.如实施方案71的rAAV，其中该rAAV包含选自由来自以下各者的衣壳组成的组的衣壳：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、AAV2.5(SEQ ID NO.13)、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV2i8、AAV2G9、AAV9.45、AAV2i8G9、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N及AAV-LK03。
[0082] E73.如实施方案72的rAAV，其中该衣壳选自由AAV2-TT、AAV2-TT-S312N及AAV2i8衣壳组成的组。
[0083] E74.如实施方案73的rAAV，其中经修饰的核酸包含SEQ ID NO：7的序列，且其中衣壳选自AAV2i8衣壳及AAV2-TT-S312N衣壳。
[0084] E75.如实施方案74的rAAV，其中核酸进一步包含侧接编码FXN的序列的两个AAV末端重复序列，且进一步包含在编码FXN的序列上游的CBh启动子。
[0085] E76.如实施方案75的rAAV，该核酸进一步包含在编码FXN的序列的3’的胶原蛋白稳定序列(CSS；SEQ ID NO：25)。
[0087] E78.一种rAAV载体，其包含AAV2i8衣壳，其中VP1包含SEQ ID NO：29的氨基酸，且进一步包含自5’至3’包含以下的核酸：(a)AAV2末端重复序列(TR)；(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：26的核酸序列；(c)编码FXN的经修饰的核酸，其包含选自由SEQ ID NO：3-9组成的组的核酸序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：25的序列；(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：27的序列；及(f)AAV2TR。
[0088] E79.一种包含AAV2-TT衣壳的rAAV载体，其中VP1包含SEQ ID NO：31的氨基酸，且进一步包含自5’至3’包含以下的核酸：(a)AAV2TR；(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：26的核酸序列；(c)编码FXN的经修饰的核酸，其包含选自由SEQ ID NO：3-9组成的组的核酸序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：25的序列；(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：27的序列；及(f)AAV2TR。
[0089] E80.一种包含AAV2-TT-S312N衣壳的rAAV载体，其中VP1包含SEQ ID NO：33的氨基酸，且进一步包含自5’至3’包含以下的核酸：(a)AAV2TR；(b)CBh启动子，其包含SEQ ID NO：26的核酸序列；(c)编码FXN的经修饰的核酸，其包含选自由SEQ ID NO：3-9组成的组的核酸序列；(d)CSS，其具有SEQ ID NO：25的序列；(e)bGHpolyA信号序列，其具有SEQ ID NO：27的序列；及(f)AAV2TR。
[0090] E81.如实施方案71至80中的任一者的rAAV载体，其中编码FXN的经修饰的核酸包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
[0091] E82.一种用于治疗有需要的受试者的弗里德赖希共济失调的rAAV载体，其中该载体包含实施方案1至6、12、25至28及71至81中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸。
[0092] E83.一种药物组合物，其包含实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体及医药学上可接受的载剂。
[0093] E84.一种治疗受试者的FRDA的方法，该方法包括施用以下各者中的至少一者：实施方案1至12、23、25至28及43至70中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸；实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体；及实施方案83的药物组合物。
[0094] E85.如实施方案84的方法，其中全身性地施用或通过直接心脏或颅内施用来施用实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体。
[0095] E86.如实施方案85的方法，其中颅内施用实施方案71至82中的任一者的rAAV载体。
[0096] E87.如实施方案85的方法，其中直接向心脏施用实施方案71至82中的任一者的rAAV载体。
[0097] E88.如实施方案84的方法，其中编码FXN的经修饰的核酸包含SEQ ID NO：6的核酸序列。
[0098] E89.如实施方案84的方法，其中编码FXN的经修饰的核酸包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
[0099] E90.一种治疗由降低水平的FTX介导的疾病、病症或病状的方法，该方法包括施用以下各者中的至少一者：实施方案1至6、12、25至28及43至70中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸；实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体；及实施方案83的药物组合物。
[0100] E91.一种宿主细胞，其包含实施方案1至6、12、25至28及43至70中的任一者的编码FXN的经修饰的核酸。
[0101] E92.如实施方案91的宿主细胞，其中细胞选自由以下各者组成的组：VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293细胞、B-50或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080。
[0102] E93.如实施方案92的宿主细胞，其中宿主细胞为适于在悬浮培养物中生长的HEK293。
[0103] E94.如实施方案91至93中的任一者的宿主细胞，其中细胞为具有ATCC NO.PTA 13274的HEK293细胞。
[0104] E95.一种包含实施方案7至11、33至39及70至82中的任一者的rAAV载体的包装细胞，其中该细胞进一步包含编码AAV Rep蛋白的至少一种核酸、编码AAV Cap蛋白的至少一种核酸，及编码辅助功能的至少一种核酸。
[0105] E96.一种用于产生rAAV载体的方法，该方法包括在产生rAAV的条件下培养实施方案91至95中的任一者的细胞。
[0106] E97.如实施方案96的方法，其进一步包括分离所产生的rAAV。
[0107] E98.以下各者中的至少一者提高细胞中的共济失调蛋白水平的用途：实施方案1至6、12、25至28及43至70中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸；实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体；及实施方案83的药物组合物。
[0108] E99.如实施方案1至6、12、25至28及43至70中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸；实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体；及实施方案83的药物组合物，用于增加受试者的共济失调蛋白的含量。
[0109] E100.如实施方案1至6、12、25至28及43至70中的任一者的编码共济失调蛋白的经修饰的核酸；实施方案7至11、33至39及71至82中的任一者的rAAV载体；及实施方案83的药物组合物，用于治疗受试者的弗里德赖希共济失调。
[0111] 附图简述
[0112] 图1A及图1B。图1A及图1B均显示与野生型核酸相比来自编码FXN的所选经修饰的核酸的共济失调蛋白在HeLa细胞中的表达的结果(泳道1)。来自包含以下经修饰的核酸的HeLa细胞的提取物经检查以检测在细胞中产生的FXN。共济失调蛋白通过使用抗共济失调蛋白抗体的蛋白质印迹检测，该抗体使用与HRP(辣根过氧化酶)缀合以用于通过将蛋白质印迹曝光于光敏薄膜的化学发光检测的二级抗体来检测。泳道装载有来自用编码共济失调蛋白的以下经修饰的核酸转染的HeLa细胞的提取物：泳道1：野生型对照核酸；泳道2：IDT2；泳道3：IDT5；泳道4：JCAT；泳道5：GeneArt；泳道6：Genscr ipt(对照)；及泳道7：Genscript(低CpG)。
[0113] 图2A至图2F显示用于克隆至自我互补的rAAV载体pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA的各种经修饰的FXN基因构建体的序列，其中使用野生型FXN基因(SEQ ID NO：2)或其经修饰的形式(例如，SEQ ID NO：3-9)来替换EGFP标记基因。每个图显示WT FXN(图2A)或经修饰的FXN基因(图2B至图2F)。每一构建体包含(自5’至3’)AgeI切割位点、FXN/经修饰的FXN基因、AvrII切割位点、胶原蛋白稳定序列(CSS)、SpeI切割位点、bGHpolyA信号序列，及MluI切割位点。图2A显示pTRs-KS-CBh-WTFXN-bGHpolyA构建体(SEQ ID NO：19)；图2B显示整合的DNA技术IDT 1(IDT1)修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-IDT1FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：20)；图2C显示IDT3修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-IDT3FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：21)；图
2D显示IDT4修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-IDT4 FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：22)；图2E显示GenScript修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-GenScript FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：
23)；且图2F显示GenScript(低CpG)修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：24)，每一序列包括在图2A至图2F中自5’至3’如下指示的元件(例如，AgeI、AvrII、CSS、SpeI、bGHpolyA及MluI)：以粗体指示的AgeI切割位点(ACCGGT)；呈小写字母的FXN基因，通过下划线指示的AvrI I切割位点(CCTAGG)；通过双下划线指示的编码胶原蛋白稳定序列(CSS)的序列；以粗体带下划线指示的SpeI切割位点(ACTAGT)；以斜体指示的牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGHpolyA)；及以粗斜体指示的MluI切割位点(ACGCGT)。构建体中的FXN基因在AgeI切割位点上游的CBh启动子的控制下。CBh启动子的序列并未显示于图2A至图2F中，但示于SEQ ID NO：25中。
2D显示IDT4修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-IDT4 FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：22)；图2E显示GenScript修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-GenScript FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：
23)；且图2F显示GenScript(低CpG)修饰的FXN基因构建体pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)FXN-bGHpolyA(SEQ ID NO：24)，每一序列包括在图2A至图2F中自5’至3’如下指示的元件(例如，AgeI、AvrII、CSS、SpeI、bGHpolyA及MluI)：以粗体指示的AgeI切割位点(ACCGGT)；呈小写字母的FXN基因，通过下划线指示的AvrI I切割位点(CCTAGG)；通过双下划线指示的编码胶原蛋白稳定序列(CSS)的序列；以粗体带下划线指示的SpeI切割位点(ACTAGT)；以斜体指示的牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGHpolyA)；及以粗斜体指示的MluI切割位点(ACGCGT)。构建体中的FXN基因在AgeI切割位点上游的CBh启动子的控制下。CBh启动子的序列并未显示于图2A至图2F中，但示于SEQ ID NO：25中。
[0114] 图3显示描绘包括AgeI切割位点上游的CBh启动子的载体的各种限制(切割)位点及元件的pTRs-KS-CBh-eGFP克隆构建体的载体(质体)图。
[0115] 图4A及图4B显示说明对照组、经治疗的突变体及未治疗的突变体雄性(图4A)及雌性(图4B)小鼠的基线心脏表型的图。图4A在每一分组内自左至右显示对照雄性、经治疗突变小鼠及未治疗突变小鼠的心脏表型，其中所述分组为：EF(射血分数)、FS(缩短分数)；LV Vol_d(左心室容积舒张)；及LV Vol_s(左心室容积收缩)。图4B显示雌性小鼠群组的基线心脏表型：对照组(圆形)；经治疗突变小鼠(方形)；及未治疗突变小鼠(三角形)。
[0116] 图5A及图5B显示说明在5周龄(及对经治疗突变小鼠的治疗后14天)时与未经治疗Mck突变小鼠中的心脏表型相比较的经治疗Mck突变小鼠中的FRDA心脏表型的反转的图。图5A显示在rAAV-FXN注射14天之后的对照组(圆形)、经治疗突变(方形)及未治疗突变(三角形)的雄性小鼠的心脏表型。缩写词如下：AoV SV(主动脉瓣心搏出量)；AoV CO(主动脉瓣心输出量)；FS(缩短分数)；及LV Mass AW(左心室质量前壁)。图5B显示在rAAV-FXN注射14天之后的对照组(圆形)、经治疗突变(方形)及未治疗突变(三角形)的雄性小鼠的心脏表型。
缩写词如下：ES(射血分数)；FS(缩短分数)；AoV SV(主动脉瓣心搏出量)；AoV CO(主动脉瓣心输出量)。
缩写词如下：ES(射血分数)；FS(缩短分数)；AoV SV(主动脉瓣心搏出量)；AoV CO(主动脉瓣心输出量)。
[0117] 图6A至图6C显示说明在经治疗Mck突变组的rAAV-FXN治疗后的二十八(28)天的雄性及雌性对照小鼠(圆形)、经治疗突变雄性及雌性小鼠(方形)及未治疗突变雄性及雌性小鼠(三角形)的心脏功能的图。图6A显示对历时连续数周(即，3周龄(rAAV施用时间)、5周龄(rAAV施用后14天)及7周龄(rAAV施用后28天))的所有三个小鼠群组的左心室质量(LVM)超声心动图评估，其中在5周龄施用治疗剂。图6B显示历时连续数周的所有三个小鼠群组的缩短因素(SF)超声心动图评估。图6C显示历时连续数周的所有三个小鼠群组的心输出量超声心动图评估。数据为每组8个小鼠的平均值±S.E.M。使用多重t-测试比较(Sidak-Bonferroni method)将Mck突变小鼠的数据与Mck阳性对照组相比较。*p<0.05。
[0118] 发明详述
[0119] 定义
[0120] 除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域中一般技术者通常理解的含义。本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的且并不意欲限制本发明。如本发明的描述及所附权利要求书中所使用的，除非上下文中另有清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”还意欲包括复数形式。以下术语具有给定的含义：
[0121] 如本文中所使用，当指代可测量值(诸如生物活性的量、多核苷酸或多肽序列的长度、G及C核苷酸的含量、密码子适应指数、CpG二核苷酸的数目、剂量、时间、温度及其类似物)时，术语“约”意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
[0122] 如本文所用，术语“和/或”是指和涵盖相关所列项目中的一个或多个的任何及所有可能组合，以及当以替代性(“或”)解释时不具有组合。
[0123] AAV“rep”及“cap”基因指代编码腺相关病毒的复制及衣壳化蛋白质的多核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中被称作AAV“封装基因”。
[0124] 本发明提供重组腺相关病毒(rAAV)载体。“AAV”为腺相关病毒的缩写，且可用于指代病毒自身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语覆盖所有亚型和天然存在及重组的形式。缩写词“rAAV”指代重组腺相关病毒，其也被称作重组AAV载体(或“rAAV载体”)或简称为“AAV载体”。术语“AAV”包括例如各种血清型的AAV，例如，AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-
7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、AAV 10型(AAV-10，包括AAVrh10)、AAVrh74、AAV 12型(AAV-12)、禽类AAV、牛AAV、犬类AAV、马类AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV，及绵羊类AAV。
“灵长类AAV”指代感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”指代感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指代感染牛哺乳动物的AAV等等。
7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、AAV 10型(AAV-10，包括AAVrh10)、AAVrh74、AAV 12型(AAV-12)、禽类AAV、牛AAV、犬类AAV、马类AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV，及绵羊类AAV。
“灵长类AAV”指代感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”指代感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指代感染牛哺乳动物的AAV等等。
[0125] 出于若干原因，各种血清型的AAV是有吸引力的，最显著地，AAV被认为是非病原性的且野生型病毒可整合其基因组位点，特异性地整合至人类19号染色体(Linden等人，1996年，Proc Natl Acad Sci USA 93：11288-11294)。人类基因组中的AAV的插入位点被称作AAVS1。与随机整合相反的定点整合被认为很可能产生可预测的长期表达图谱。
[0126] 各种血清型的AAV的基因组序列以及自然末端重复序列(TR)的序列、Rep蛋白质及衣壳亚单元为本领域中已知的。此类序列可发现于文献中或诸如GenBank的公共数据库中。参见，例如，GenBank登录号NC-002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC-001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC-001729(AAV-3)、NC-001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC-006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)及NC-006261(AAV-8)；所述GenBank登录号的公开内容以引用的方式并入本文中。还参见，例如，Srivistava等人，1983，J.Virology 45：
555；Chiorini等人，1998，J.Virology 71：6823；Chiorini等人，1999，J.Virology 73：
1309；Bantel-Schaal等人，1999，J.Virology 73：939；Xiao等人，1999，J.Virology 73：
3994；Muramatsu等人，1996，Virology 221：208；Shade等人，1986，J.Virol.58：921；Gao等人，2002，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；Moris等人，2004，Virology 33：375-383；国际专利公开号WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379；WO 2014/
194132；WO 2015/121501；及美国专利第6,156,303号及第7,906,111号。
555；Chiorini等人，1998，J.Virology 71：6823；Chiorini等人，1999，J.Virology 73：
1309；Bantel-Schaal等人，1999，J.Virology 73：939；Xiao等人，1999，J.Virology 73：
3994；Muramatsu等人，1996，Virology 221：208；Shade等人，1986，J.Virol.58：921；Gao等人，2002，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；Moris等人，2004，Virology 33：375-383；国际专利公开号WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379；WO 2014/
194132；WO 2015/121501；及美国专利第6,156,303号及第7,906,111号。
[0127] 如本文所使用的“rAAV载体”是指包含不属于AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，通常为细胞的遗传转化所感兴趣的序列。在一些实施方案中，异源多核苷酸可通过至少一个，且有时通过两个AAV末端反向重复序列(ITRs)侧接。术语rAAV载体涵盖rAAV载体颗粒及rAAV载体质粒两者。rAAV载体可为单链(ssAAV)或自我互补的(scAAV)。“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”是指由至少一个AAV衣壳蛋白(通常通过野生型AAV的所有衣壳蛋白)及衣壳化多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。若颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因以外的多核苷酸)，则其通常被称作“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV颗粒的产生必定包括rAAV载体的产生，因此载体包含于rAAV颗粒之内。
[0128] 如本文所使用的“重组”意指载体、多核苷酸、多肽或细胞为克隆、限制性或连接步骤(例如与多核苷酸或包含于其中的多肽相关)和/或导致构建体不同于在自然界中发现的产物的其他程序的各种组合的产物。重组病毒或载体为包含重组性多核苷酸的病毒颗粒。所述术语各自包括原始病毒构建体的子代及原始多核苷酸构建体的复制品。
[0129] “AAV Rep”意指AAV复制蛋白及其类似物。
[0130] “AAV Cap”意指AAV衣壳蛋白、VP1、VP2及VP3及其类似物。在野生型AAV病毒中，三种衣壳基因vp1、vp2及vp3彼此重叠。参见，Grieger及Samulski，2005，J.Virol.79(15)：9933-9944。单个P40启动子允许所有三种衣壳蛋白vp1、vp2、vp3分别以约1：1：10的比率表达，其与rAAV生产互补。对于重组AAV载体的产生，VP1：VP2：VP3的所需比率在约1：1：1至约
1：1：100的范围内，优选在约1：1：2至约1：1：50的范围内，更优选在约1：1：5至约1：1：20的范围内。尽管VP1：VP2的所需比率为1：1，但VP1：VP2的比率范围可在1：50至50：1的范围内变化。
1：1：100的范围内，优选在约1：1：2至约1：1：50的范围内，更优选在约1：1：5至约1：1：20的范围内。尽管VP1：VP2的所需比率为1：1，但VP1：VP2的比率范围可在1：50至50：1的范围内变化。
[0131] 已知AAV血清型的衣壳的氨基酸序列的全面列表及比对由Marsic等人，2014，Molecular Therapy 22(11)：1900-1909提供，尤其在补充图1中。
[0132] 仅出于说明的目的，野生型AAV2包含通过重叠序列由三种蛋白(VP1、VP2及VP3；总共60个衣壳蛋白组成AAV衣壳)组成的AAV的较小(20nm至25nm)二十面体病毒衣壳。蛋白VP1(735aa；Genbank登录号AAC03780)、VP2(598aa；Genbank登录号AAC03778)及VP3(533aa；Genbank登录号AAC03779)在衣壳中以1：1：10的比率存在。即，对于AAV，VP1为全长蛋白，且VP2及VP3为VP1的进行性更短形式，相对于VP1具有增大的N端截短。
[0133] “AAV TR”意指在AAV基因组的末端或末端附近的回文末端重复序列，包含通常互补、对称地布置的序列，且包括天然AAV TR及其类似物的类似物。
[0134] “顺式基序”包括诸如在基因组序列的末端处或接近末端处发现且经辨识用于复制初始化的保守序列；内部位置处的隐含启动子或序列很可能用于转录初始化、剪接或终止。
[0136] “治疗有效量”意指必需向受试者提供治疗益处的活性剂的最小量。举例而言，对患者的“治疗有效量”为引发、改良、稳定、减缓进程或以其他方式引起病理症状、与病症相关联的疾病进程或生理条件的改良或屈服于病症的抵抗力的量。
[0138] “编码序列”意指“编码特定蛋白”或“编码核酸”的序列，其表示当置于适当的调节序列的控制下(可操作地连接于适当的调节序列)时，被体外或体内转录(在DNA的情况下)及翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸序列。编码序列的边界通过5’(氨基)端处的起始密码子及3’(羧基)端处的翻译终止密码子判定。编码序列可包括(但不限于)来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，和甚至合成DNA序列。
[0139] 关于病毒衣壳或颗粒，“嵌合”意指该衣壳或颗粒包括来自不同细小病毒(优选不同AAV血清型)的序列，如Rabinowitz等人美国专利6,491,907中所描述，该专利的公开内容以全文引用的方式并入于本文中。还参见Rabinowitz等人，2004，J.Virol.78(9)：4421-4432。尤其优选的嵌合病毒衣壳为AAV2.5衣壳，其具有含以下突变的AAV2衣壳的序列：263Q至A；265插入T；705N至A；708V至A；及716T至N。其中如WO 2006/066066中所描述将编码此类衣壳的核苷酸序列定义为SEQ ID NO：15。其他优选的嵌合AAV包括(但不限于)：描述于WO
2010/093784中的AAV2i8、描述于WO 2014/144229中的AAV2G9及AAV8G9，及AAV9.45
(Pulicherla等人，2011，Molecular Therapy 19(6)：1070-1078)。
2010/093784中的AAV2i8、描述于WO 2014/144229中的AAV2G9及AAV8G9，及AAV9.45
(Pulicherla等人，2011，Molecular Therapy 19(6)：1070-1078)。
[0140] 关于通过其他元件侧接的序列，“侧接”指相对于序列在上游和/或下游(即，5’和/或3’)存在一个或多个侧接元件。术语“侧接”并不意欲指示序列必需为连续的。举例而言，编码转基因的核酸与侧接元件之间可存在插入序列。通过两个其他元件(例如，TR)“侧接”的序列(例如，转基因)指示一个元件位于序列的5’且另一元件位于序列的3’；然而，可存在在其之间的插入序列。
[0141] “多核苷酸”意指通过磷酸二酯键连接的核苷酸的序列。在本文中在自5’至3’方向的方向上呈现多核苷酸。本发明的多核苷酸可为脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。其中多核苷酸为DNA分子，该分子可为基因或cDNA分子。在本文中通过单字母码指示核苷酸碱基：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸(腺)嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌核苷(I)及尿嘧啶(U)。可使用本领域技术人员所熟知的标准技术来制备本发明的多核苷酸。
[0142] 通过病毒“转导”细胞意指存在核酸自病毒颗粒至细胞的转移。
[0143] “经修饰的FXN基因”意指与编码FXN的野生型核酸(例如，SEQ ID NO：2)相比较具有至少一个修饰的编码FXN的经修饰的核酸(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸序列)，其中该修饰包括(但不限于)增加的GC含量、减少的GC含量或具有减少的CpG含量的FXN基因。优选，经修饰的FXN基因展现经改良的蛋白表达，例如，与由野生型基因提供的蛋白在细胞中的表达水平相比较，经编码蛋白在其他相同细胞中以可检测的较高水平表达。
[0144] 细胞的“转染”意指出于基因修饰细胞的目的将遗传物质引入至细胞中。转染可通过本领域中已知的各种方式实现，诸如磷酸钙、聚乙二亚胺、电穿孔及其类似物。
[0145] 除非另外规定，否则“多肽”涵盖肽及蛋白两者。
[0146] “基因转移”或“基因递送”是指用于可靠地将外来DNA插入至宿主细胞的方法或系统。此类方法可导致非整合式转移DNA的短暂表达、经转移复制子(例如，游离基因体)的染色体外复制及表达，或经转移遗传物质至宿主细胞的基因组DNA中的整合。
[0147] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”、“经转化细胞”及“经转导细胞”，所述“转化体”、“经转化细胞”及“经转导细胞”包括主要经转化细胞及自其衍生的后代而不考虑继代的数目。
[0148] “转基因”用于意指针对递送至靶细胞(在本文中亦称为“宿主细胞”)且包括在靶细胞中的表达的掺入载体(包括病毒载体)中的任何异源核苷酸序列及相关联表达控制序列，诸如启动子。本领域技术人员应理解，将基于促进转基因在靶细胞中的表达的能力选择表达控制序列。转基因的实例为编码治疗性多肽的核酸。
[0149] “载体”意指包含待体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒或病毒。
[0150] 当指代核酸或其片段时，“实质同源性”或“实质相似性”意指指示：当以适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳地对准时，在该序列的至少约95％至99％中存在核苷酸序列一致性。
[0151] “重组病毒载体”意指包含一个或多个异源序列(即，不属于病毒来源的多核苷酸序列)的重组性多核苷酸载体。在重组细小病毒载体的情况下，重组性多核苷酸通过至少一个、优选两个末端反向重复序列(ITR)侧接。
[0152] “同源”在关于肽使用时是指两种肽之间的氨基酸序列相似性。当两种肽中的氨基酸位置由相同氨基酸占据时，其在该位置同源。因此“实质上同源”意指很大程度上但不完全同源的氨基酸序列，且当该序列同源时其保留大部分或所有活性。如本文中所使用，如本文所使用的“实质上同源”意指序列与参考肽至少50％相同，且同源性为优选至少75％且更优选95％。当肽具有与未经修饰的肽实质上相同的活性或功能的时候，其它肽序列修饰包括在内，诸如本文公开的序列的氨基酸序列的微小变化、缺失、替代物或衍生物。氨基酸的衍生物可包括(但不限于)：三氟亮氨酸、六氟亮氨酸、5,5,5-三氟异亮氨酸、4,4,4-三氟缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、o-氟酪氨酸、m-氟酪氨酸、2,3-二氟酪氨酸、4-氟组氨酸、2-氟组氨酸、2,4-二氟组氨酸、氟脯氨酸、二氟脯氨酸、4-羟脯氨酸、硒甲硫氨酸、碲甲硫氨酸、硒半胱氨酸、硒色氨酸、4-氨基色氨酸、5-氨基色氨酸、5-羟色氨酸、7-氮杂色氨酸、4-氟色氨酸、5-氟色氨酸、6-氟色氨酸、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、2-丁炔基甘氨酸、顺式-巴豆基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、脱氢亮氨酸、脱氢脯氨酸、2-氨基-3-甲基-4-戊烯酸、叠氮基高丙氨酸、叠氮基丙氨酸(as idoalanine)、叠氮基正亮氨酸、p-乙炔基苯丙氨酸、p-叠氮基苯丙氨酸、p-溴苯基丙氨酸、p-乙酰基苯丙氨酸及苯并呋喃基丙氨酸。值得注意地，经修饰的肽将保留与未经修饰的肽相关联的活性或功能，经修饰的肽将大体上具有与未经修饰的序列的氨基酸序列“实质上同源”的氨基酸序列。
[0153] 多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比“序列一致性”，意指，当比对时，在比较两个序列时相同的碱基或氨基酸的百分比。可以多种不同方式判定序列相似性。为判定序列一致性，可使用方法及计算机程序(包括BLAST，在全球信息网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可用)比对序列。另一比对算法为FASTA，其在遗传学计算群组(Genetics Computing Group；GCG)包(来自Wis.，Madison，美国)中可用。用于比对的其他技术描述于Methods in Enzymology第266卷：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，Doolittle编，Academic Press公司中。尤其受关注的是允许序列中的空隙的比对程序。Smith-Waterman为一种允许序列比对中的空隙的算法。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。使用Needleman及Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。
[0154] 所关注的是BestFit程序，其使用Smith and Waterman的局部同源算法(1981，Advances in Applied Mathematics 2：482-489)以判定序列一致性。空隙产生罚分将大体在1至5、通常2至4的范围内，且在许多实施方案中将为3。空隙扩展罚分将大体在约0.01至0.20的范围内，且在许多情况下将为0.10。程序具有由经输入以相比较的序列判定的预设参数。优选，使用由程序判定的默认参数来判定序列一致性。还可从遗传学计算群组(GCG)包(来自Madison,WI，美国)商购此程序。
[0155] 所关注的另一程序为FastDB算法。FastDB描述于Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127页至149页，1988，Alan R.Liss公司中。
[0156] 基于以下参数通过FastDB计算百分比序列一致性：不匹配罚分：1.00；空隙罚分：1.00；空隙大小罚分：0.33；及连接罚分：30.0。
[0157] 本发明提供经修饰的FXN基因。本发明还提供核酸构建体，诸如载体，其包括作为其序列的部分，经修饰的FXN基因(例如，GC含量优化的FXN基因序列)与野生型FXN基因序列相比较包含更大或更小量的GC核苷酸，和/或与野生型FXN基因中存在的CpG二核苷酸的含量相比较，FXN基因序列具有降低水平的CpG二核苷酸。举例而言，本发明包括质粒和/或其他载体，其包括经修饰的FXN序列以及其他元件(诸如调节元件)。此外，本发明提供包括经修饰的FXN序列的包装的基因运载工具，诸如病毒衣壳。本发明还包括递送方法，且优选，通过将经修饰的序列递送至细胞以及促进细胞中的表达所需的元件来表达经修饰的FXN基因。本发明还提供基因治疗方法，其中向受试者施用经修饰的FXN基因序列，例如，作为载体的组分和/或经包装为病毒基因运载工具的组分。治疗可例如有效提高受试者的共济失调蛋白的含量且治疗受试者的共济失调蛋白缺乏。在随后部分中进一步论述本发明的这些方面中的每一者。
[0158] 用于共济失调蛋白的表达的经修饰的核酸
[0159] 本发明提供编码共济失调蛋白的经修饰的核苷酸序列。经修饰的核苷酸序列包括含有一个或多个修饰的野生型或天然FXN基因序列。
[0160] 在一个方面中，与来自SEQ ID NO：2的野生型核酸序列的共济失调蛋白在细胞中的表达相比较，经修饰的核酸序列提供共济失调蛋白在其他相同细胞中的可检测的更高表达水平。此可被称作“表达优化”或“增强表达”核酸，或简称为“经修饰的核酸”。
[0161] 如在本文中可互换地指代，“优化”或“经密码子优化”是指编码序列已相对于野生型编码序列(例如，共济失调蛋白的编码序列)经优化以提高编码序列的表达，例如，通过最小化罕见密码子的使用、降低CpG二核苷酸的数目、移除隐含剪接供体或受体位点、移除Kozak序列、移除核糖体进入位点，及类似者。
[0162] 修饰的实例包括消除一个或多个顺式作用基序及引入一个或多个Kozak序列。在一个实施方案中，消除一个或多个顺式作用基序且引入一个或多个Kozak序列。
[0163] 可被消除的顺式作用基序的实例包括：内部TATA盒；chi位点；核糖体进入位点；ARE、INS、和/或CRS序列元件；重复序列和/或RNA二级结构；(隐含)剪接供体和/或受体位点、分支点；及Sall。
[0164] 在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO：2的野生型FXN基因序列，GC含量(例如核酸序列中存在的G及C核苷酸的数目)增加。GC含量比野生型基因(SEQ ID NO：2)多优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、甚至更优选至少8％、更优选至少9％、甚至更优选至少10％、更优选至少12％、甚至更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少17％、甚至更优选至少20％、甚至更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少
60％且最优选至少70％。
60％且最优选至少70％。
[0165] 在另一实施方案中，GC含量以G(鸟嘌呤)及C(胞嘧啶)核苷酸在序列中的百分比表示。即，编码共济失调蛋白的野生型核酸(SEQ ID NO：1)的GC含量为约55％，而本发明的代表性经修饰的FXN基因的GC含量的范围为IDT-3(SEQ ID NO：8)约57％、Genescript(SEQ ID NO：6)57％；GeneArt(SEQ ID NO：5)61％及JCAT(SEQ ID NO：4)69％。因此，与如SEQ ID NO：2中所示的编码共济失调蛋白的野生型核酸序列约55％的GC含量相比较，本发明的经修饰的核酸包含至少57％、更优选至少61％的GC含量，甚至更优选至少69％的GC含量。
[0166] 在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸的GC含量大于包含SEQ ID NO：2的核酸序列的编码共济失调蛋白的野生型核酸的GC含量。本领域技术人员应理解，在知晓核酸代码的简并性的情况下，与编码蛋白的核酸序列无关，自其表达的共济失调蛋白的氨基酸序列优选为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0167] 在一个实施方案中，本发明的编码FXN的经修饰的核酸的GC含量与野生型FNX基因(SEQ ID NO：2)的GC含量相同(即，为约55％)。
[0168] 另外，编码共济失调蛋白的经修饰的核酸(即，经修饰的FXN基因)的密码子适应指数为优选至少0.74、优选至少0.76、甚至更优选至少0.77、更优选至少0.80、优选至少0.85、更优选至少0.86、更优选至少0.87、甚至更优选至少0.90、更优选至少0.95，且最优选至少0.98。
[0169] 在另一实施方案中，与编码FXN的野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO：2)相比较，经修饰的FXN序列具有降低水平的CpG二核苷酸，该含量减少约10％、20％、30％、50％或更多。
[0170] 已知，CpG二核苷酸的甲基化在真核细胞的基因表达的调节中起重要作用。特别地，真核细胞中的CpG二核苷酸的甲基化基本上用于经由干扰转录机制来沉默基因表达。因此，由于通过CpG基序的甲基化诱发的基因沉默，具有减少数目的CpG二核苷酸的本发明的核酸及载体将提供较高且长效的转基因表达水平。
[0171] 在一个实施方案中，经修饰的FXN基因包含比野生型FXN基因少的潜在CpG岛区域，即，128个。优选，经修饰的FXN基因包含约124个潜在CpG岛区域，更优选约123个，甚至更优选约117个，且更优选约114个潜在CpG岛区域。
[0172] 经修饰的FXN基因序列还可包括促进亚克隆至表达载体中的侧接限制位点。许多此类限制位点为本领域中熟知的且包括(但不限于)图2A至图2F、及图3(scAAV质粒载体pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH的质粒图)及表8(SEQ ID NO：19-23)中所显示的那些位点，诸如，AgeI、AvrII、SpeI及MluI。
[0173] 本发明还包括编码功能活性片段共济失调蛋白的序列SEQ ID NO：3至9中的任一者的片段。“功能活性”或“功能性共济失调蛋白”指示片段提供与全长共济失调蛋白相同或类似的生物活性。即，片段提供相同活性包括(但不限于)：校正主要Fe-S集群缺乏；降低线粒体铁积累(Puccio等人，2001，Nature Genetics 27：181-186；Seznec等人，2004，Human Mol.Genet.13：1017-1024)；及如Perdomini等人，2014，Nature Med.20(5)：542-547中所论述的其他缺乏。FXN或其功能片段的生物活性还涵盖逆转或防止Mck小鼠中与如本文中其他处表明的FRDA相关联的心脏表型。
[0174] 本发明包括含有经修饰的FXN基因序列及各种调节或对照元件的核酸载体。适用于基因表达的调节元件的精确性质将在自生物体至生物体及自细胞类型至细胞类型的范围内变化。大体而言，其包括引导所关注的细胞中的RNA转录的初始化的启动子。启动子可为组成性或经调节的。组成性启动子为使得可操作地连接的基因基本上始终表达的那些。经调节的启动子为可经活化或去活化的那些。经调节的启动子包括诱导性启动子，其通常为“关闭”但可经诱发以变为“打开”，及“可抑制”启动子，其通常为“打开”但可变为“关闭”。
许多不同调节子为已知的，包括温度、激素、细胞激素、重金属及调节蛋白。区别不是绝对的；组成性启动子可常常被调节至某一含量。在一些情况下，内源性路径可被利用以提供转基因表达的调节，例如，使用在病理条件改良时天然地下调的启动子。
许多不同调节子为已知的，包括温度、激素、细胞激素、重金属及调节蛋白。区别不是绝对的；组成性启动子可常常被调节至某一含量。在一些情况下，内源性路径可被利用以提供转基因表达的调节，例如，使用在病理条件改良时天然地下调的启动子。
[0175] 合适的启动子的实例包括：腺病毒启动子，诸如腺病毒主要晚期启动子；异源启动子，诸如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道融合性病毒启动子；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；白蛋白启动子；诱导性启动子，诸如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；金属硫蛋白启动子；
热休克启动子；α-1-抗胰蛋白酶启动子；B型肝炎表面抗原启动子；运铁蛋白启动子；脂蛋白元A-1启动子；鸡β肌动蛋白CBA)启动子，CBh启动子(SEQ ID NO：25)及CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子元件及启动子、第一外显子、及鸡β肌动蛋白基因的第一内含子，及家兔β血球蛋白基因的剪接受体)(Alexopoulou等人，2008，BioMed.Central Cell Biol.9：2)，及人类FXN启动子。启动子可为组织特异性启动子，诸如小鼠白蛋白启动子，其如同甲状腺素运载蛋白启动子(TTR)一样在肝细胞中具活性。
热休克启动子；α-1-抗胰蛋白酶启动子；B型肝炎表面抗原启动子；运铁蛋白启动子；脂蛋白元A-1启动子；鸡β肌动蛋白CBA)启动子，CBh启动子(SEQ ID NO：25)及CAG启动子(巨细胞病毒早期增强子元件及启动子、第一外显子、及鸡β肌动蛋白基因的第一内含子，及家兔β血球蛋白基因的剪接受体)(Alexopoulou等人，2008，BioMed.Central Cell Biol.9：2)，及人类FXN启动子。启动子可为组织特异性启动子，诸如小鼠白蛋白启动子，其如同甲状腺素运载蛋白启动子(TTR)一样在肝细胞中具活性。
[0176] 在另一方面中，编码FXN的经修饰的核酸进一步包含增加FXN蛋白的表达的增强子。许多增强子在本领域中已知，包括(但不限于)巨细胞病毒主要立即早期增强子。更特定而言，CMV MIE启动子包含三个区域：调节子、独特区域及增强子(Isomura及Stinski，2003，J.Virol.77(6)：3602-3614)。CMV增强子区域可与其他启动子或其部分组合，从而形成混合式启动子以进一步增加可操作地连接其的核酸的表达。举例而言，鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其部分可与CMV启动子/增强子或其部分组合，从而使CBA的形式称为“CBh”启动子，其表示鸡β肌动蛋白混合式启动子，如Gray等人(2011，Human Gene Therapy 22：1143-1153)中所描述。
[0177] 此外，控制元件可包括胶原蛋白稳定序列(CSS)、终止密码子、终止序列，及聚腺苷酸化信号序列，诸如(但不限于)牛生长激素聚A信号序列(bGHpolyA)，从而在真核mRNA的3’端处驱使聚腺苷“尾部”的有效添加(参见，例如，Goodwin及Rottman，1992，J.Biol.Chem.267(23)：16330-16334)。
[0178] 非病毒载体
[0179] 在一特定实施方案中，根据本发明使用的载体为非病毒载体。通常，非病毒载体可为包括描述经修饰的FXN基因或其变体的核酸序列的质粒。
[0180] 经包装的经修饰的FXN序列
[0181] 经修饰的FXN基因序列还可提供为经包装病毒载体的组分。大体而言，经包装病毒载体包括包装于衣壳中的病毒载体。病毒载体及病毒衣壳论述于随后部分中。包装于rAAV载体中的核酸可为单链(ss)、自我互补的(sc)或双链(ds)。
[0182] 病毒载体
[0183] 通常，携载转基因的病毒载体由编码转基因的多核苷酸、合适的调节元件及产生介导细胞转导的病毒蛋白所需的元件组装。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒及腺相关联病毒(AAV)载体。
[0184] 根据本发明的方法产生的经包装病毒载体的病毒载体组分包括至少一个转基因，例如，经修饰的FXN基因序列及用于控制经修饰的FXN基因序列的表达的相关联表达控制序列。
[0185] 在优选的实施方案中，病毒载体包括细小病毒基因组(诸如rep及cap缺失和/或由经修饰的FXN基因序列及其相关联表达控制序列替代的AAV基因组)的一部分。经修饰的FXN基因序列通常嵌入至与适合病毒复制的一个或两个AAV TR或TR元件相邻(即，由其侧接)(Xiao等人，1997，J.Virol.71(2)：941-948)，替代编码病毒rep及cap蛋白的核酸。还可包括适用于促进经修饰的FXN基因序列在靶细胞中的组织特异性表达的其他调节序列。
[0186] 本领域技术人员应理解，包含转基因且不具有病毒复制所需的病毒蛋白(例如，cap及rep)的AAV载体不能复制，这是由于此类蛋白质为病毒复制及包装所必要。此外，AAV为一种依赖病毒(Dependovirus)，原因在于其不能在无通过辅助病毒的细胞协同感染的情况下在细胞中复制。辅助病毒通常包括腺病毒或单纯疱疹病毒。替代地，如下文所论述，可提供给包装细胞的辅助功能(E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA)包括通过用编码各种辅助元件的一个或多个核酸转染细胞，和/或该细胞可包含编码辅助蛋白的核酸。举例而言，HEK 293由用腺病毒5DNA转化人类细胞而产生，且目前表达许多种腺病毒基因，包括(但不限于)E1及E3(参见，例如，Graham等人，1977，J.Gen.Virol.36：59-72)。因此，那些辅助功能可由HEK 293包装细胞提供，而无需通过例如编码其的质粒将其供应至细胞。
[0187] 病毒载体可为任何合适的核酸构建体，诸如DNA或RNA构建体，且可为单链、双链、或双螺旋(即，如WO 2001/92551中所描述的自我互补的)。
[0188] 本领域技术人员应理解，rAAV载体可进一步包括“填充片段”或“填充”序列(填充/填充片段)，其中包含转基因的核酸小于大约4.1kb至4.9kb大小时，最适合包装核酸进入AAV衣壳中。参见，Grieger及Samulski，2005，J.Virol.79(15)：9933-9944。即，AAV载体通常接受具有指定大小范围(通常约4kb至约5.2kb，或略多)的DNA的插入序列。因此，对于较短序列，于插入序列中包含填充/填充片段，以便将长度调整至接近或处于正常大小的病毒基因组序列，以让AAV载体接受用于包装进入病毒颗粒中。在各种实施方案中，填充/填充片段核酸序列为核酸的未翻译(非蛋白质编码)片段。在rAAV载体的特定实施方案中，异源多核苷酸序列具有小于4.7Kb的长度，且填充/填充片段多核苷酸序列具有的长度使其在与异源多核苷酸序列组合(例如，插入至载体)时，具有在约3.0kb至5.5Kb之间、或约4.0kb至5.0Kb之间，或约4.3kb至4.8Kb之间的总长度。
[0189] 内含子还可充当填充/填充片段多核苷酸序列，以便获得包装至病毒颗粒中的AAV载体的长度。充当填充/填充片段多核苷酸序列的内含子及内含子片段也可增强表达。举例而言，与在不存在内含子元件的情况下的表达相比较，包括内含子元件可增强表达(Kurachi等人，1995，J.Biol.Chem.270(10)：5276-5281)。此外，填充/填充片段多核苷酸序列为本领域中熟知且包括(但不限于)WO 2014/144486中所描述的那些。
[0190] 病毒衣壳
[0191] 经包装病毒载体的病毒衣壳组分可为细小病毒衣壳。AAV Cap及嵌合衣壳为优选的。合适的细小病毒衣壳组分的实例为来自细小病毒科的衣壳组分，诸如自发性细小病毒或依赖病毒。举例而言，病毒衣壳可为AAV衣壳(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1(WO 2015/013313的SEQ ID NO：5)、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03、蛇AAV、禽类AAV、牛AAV、大类AAV、马类AAV、绵羊类AAV、山羊AAV、虾AAV，及目前已知或后续发现的任何其他AAV。参见，例如，Fields等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。衣壳可衍生自以下各者中所公开的多个AAV血清型：美国专利第7,906,111号；Gao等人，2004，J.Virol.78：6381；Moris等人，2004，Virol.33：375；WO 2013/063379；WO 2014/194132；且包括WO 2015/121501中所公开的理想类型AAV(AAV-TT)变体，及WO 2015/013313中所公开的RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6，及其变体，且本领域技术人员应知晓，很可能存在尚未识别的执行相同或类似功能的其他变体，或可包括来自两个或多于两个AAV衣壳的组分。AAV Cap蛋白的全集包括VP1、VP2及VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可包含小于全集AAV Cap蛋白或可提供AAV Cap蛋白的全集。
[0192] AAV Cap蛋白中的一个或多个可为嵌合蛋白，其包括来自两个或多于两个病毒(优选两个或多于两个AAV)的AAV Cap的氨基酸序列，如Rabinowi tz等人，美国专利6,491,907中所描述，该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文中。举例而言，嵌合病毒衣壳可包括AAV1Cap蛋白或亚单元及至少一个AAV2Cap或亚单元。嵌合衣壳可例如包括具有一个或多个B19Cap亚单元的AAV衣壳，例如，AAV Cap蛋白或亚单元可由B19Cap蛋白或亚单元替换。举例而言，在优选的实施方案中，AAV衣壳的Vp3亚单元可由B19的Vp2亚单元替换。
[0193] 另一实施方案包括嵌合病毒株，其经合成包括来自AAV2、AAV3、AAV6、AAV8等的AAV主链的组合以及来自AAV9的半乳糖(Gal)结合足迹。腺相关病毒(AAV)为将硫酸乙酰肝素(HS)、半乳糖(Gal)或唾液酸(Sia)用作细胞表面结合的主要受体的辅助依赖型细小病毒。举例而言，AAV血清型2及3b利用HS.AAV1、4及5结合具有不同键联特异性的Sia，AAV血清型6辨识Sia及HS两者，而AAV9将Gal用于宿主细胞连接。特别地，来自AAV9的半乳糖(Gal)结合足迹接枝至硫酸肝素结合AAV血清型2上，且仅正交聚糖结合足迹的接枝改良转导效率。通过使用结构性比对及定点诱变将来自AAV9的Gal结合足迹掺入AAV2VP3主链或嵌合AAV2i8衣壳模板中来产生新双聚糖结合病毒株(AAV2G9)及嵌合肌肉向性病毒株(AAV2i8G9)。体外结合及转导测定通过用于细胞进入的AAV2G9确认HS及Gal受体两者的采用。转基因表达动力学的后续体内特征化及载体基因组生物分布特征指示通过此经合理改造的嵌合AAV病毒株的较快、持久、及经提高的转基因表达。类似经改良的转导特征用肝脏去靶向肌肉特异性AAV2i8G9嵌合体观察到(Shen等人，2013，J.Biol.Chem.288(4)：28814-28823)。此类新接枝组合完全地描述于WO2014/144229中，WO2014/144229的内容以引用的方式并入本文中。另外的肝去靶向AAV(诸如AAV9.45)描述于Pulicherla等人，2011，Molecular Therapy 19(6)：1070-1078中，其内容以全文引用的方式并入本文中，以供参考。
[0194] 在又一实施方案中，本发明提供用于治疗性体内基因治疗的祖AAV载体的使用。特别地，计算机衍生序列经重新合成且针对生物活性进行表征。此项工作引起九个功能性推定的祖AAV的产生及Anc80(AAV血清型1、2、8及9的经预测祖先)的识别(Zinn等人，2015，Cell Reports 12：1056-1068)。除了组装至病毒颗粒中之外，此类祖序列的预测及合成可通过使用描述于WO 2015/054653中的方法实现，WO 2015/054653的内容以引用的方式并入本文中。值得注意地，与当代病毒或其部分相比，自祖病毒序列组装的病毒颗粒的使用在当前人群中呈现对预存免疫性降低的易感性。
[0195] 经包装病毒载体的产生
[0196] 本发明包括由“宿主细胞”涵盖的包装细胞，所述包装细胞可经培养以产生本发明的经包装病毒载体。本发明的包装细胞大体上包括具有异源(1)病毒载体功能、(2)包装功能及(3)辅助功能的细胞。这些组分功能中的每一者论述于随后部分中。
[0197] 最初，载体可通过本领域技术人员已知的若干方法制得(参见，例如，WO 2013/063379)。优选的方法描述于Grieger等人，2015，Molecular Therapy 24(2)：287-297中，其内容出于所有目的以引用的方式并入本文中。简言之，将HEK293细胞的有效转染用作起点，其中将来自合格临床主细胞库的黏附HEK293细胞用于在允许快速及可调式rAAV产生的摇瓶及WAVE生物反应器中的无动物组分悬浮条件下生长。使用三重转染方法(例如，WO 96/
40240)，在转染之后48小时收获时，悬浮HEK293细胞系产生大于1×105含有颗粒(vg)/细胞的载体基因组或大于1×1014vg/L的细胞培养。更特定而言，三重转染是指用三个质粒转染包装细胞的事实：一个质粒编码AAV rep及cap基因，另一质粒编码各种辅助功能(例如，腺病毒或HSV蛋白，诸如E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA，且另一质粒编码转基因及其各种控制元件(例如，经修饰的FXN基因及CBh启动子)。
40240)，在转染之后48小时收获时，悬浮HEK293细胞系产生大于1×105含有颗粒(vg)/细胞的载体基因组或大于1×1014vg/L的细胞培养。更特定而言，三重转染是指用三个质粒转染包装细胞的事实：一个质粒编码AAV rep及cap基因，另一质粒编码各种辅助功能(例如，腺病毒或HSV蛋白，诸如E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA，且另一质粒编码转基因及其各种控制元件(例如，经修饰的FXN基因及CBh启动子)。
[0198] 为实现所需产量，优化多个变量：诸如选择支持生长及转染两者的兼容的无血清悬浮培养基，选择转染试剂、转染条件及细胞密度。基于离子交换层析方法，还开发了通用纯化策略，其导致AAV血清型1至6、8、9的高纯度载体预备及各种嵌合衣壳。此使用者友好制程可在一周内完成，导致较高的满至空颗粒比率(>90％全部颗粒)，提供纯化后产量(>1×1013vg/L)及适用于临床应用且关于所有血清型及嵌合颗粒通用的纯度。此可调式产生技术已用于针对视网膜新血管生成(AAV2)、B型血友病(scAAV8)、巨轴突神经病(scAAV9)及色素性视网膜炎(AAV2)产生GMP I期临床AAV载体，已向患者施用所述AAV载体。另外，整个载体产生中通过实施灌注方法的5倍增加的最小值需要在转染后的大量时间点自培养基收获rAAV。
[0199] 病毒载体功能
[0200] 本发明的包装细胞包括病毒载体功能以及包装及载体功能。病毒载体功能通常包括细小病毒基因组(诸如rep及cap缺失及由经修饰的FXN序列及其相关联表达控制序列替代的AAV基因组)的一部分。病毒载体功能包括导致用于包装的病毒载体的复制的充足表达控制序列。通常，病毒载体包括细小病毒基因组(诸如rep及cap缺失及由转基因及其相关联表达控制序列替代的AAV基因组)的一部分。转基因通常由两个AAV TR侧接，替代缺失的病毒rep及cap ORF。适当的表达控制序列(诸如适用于促进转基因在靶细胞中的组织特异性表达的组织特异性启动子及其他调节序列)包括在内。转基因通常为可经表达以产生治疗性多肽或标志物多肽的核酸序列。
[0201] “复式载体”在本文中可互换地被称作“二聚”或“自我互补的”载体。复式细小病毒颗粒可例如包含含有病毒颗粒DNA(vDNA)的细小病毒衣壳。vDNA为自我互补的以使得在自病毒衣壳释放之后其可形成发夹结构。复式vDNA似乎将可通过宿主细胞表达(即，转录及视情况翻译)的双链DNA提供至宿主细胞而无需第二链合成，常规细小病毒载体有此需要。复式/自我互补的rAAV载体为本领域中熟知的且描述于例如WO 2001/92551、WO 2015/006743及许多其他文献中。
[0202] 病毒载体功能可合适地提供为复式载体模板，如Samulski等人的美国专利第7,465,583号(针对关于复式载体的其教导，其全部公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述。复式载体为二聚自我互补的(sc)多核苷酸(通常，DNA)。复式载体基因组针对所选细小病毒衣壳(例如，AAV衣壳)内的衣壳化优选含有足够的包装序列。本领域技术人员将了解，复式vDNA在所有条件下可能不会以双链形式存在，但在促进互补核苷酸碱基的退火的条件下有此能力。“复式细小病毒颗粒”涵盖混合式、嵌合及靶向病毒颗粒。优选，复式细小病毒颗粒具有AAV衣壳，该衣壳可进一步为嵌合或靶向衣壳，如上文所描述。
[0203] 病毒载体功能可合适地提供为复式载体模板，如Samulski等人的美国专利第7,465,583号(针对关于复式载体的其教导其全部公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述。复式载体为二聚自我互补的(sc)多核苷酸(通常，DNA)。举例而言，由于链内碱基配对，复式载体的DNA可经所选以便形成双链发夹结构。复式DNA载体的两条链可包装于病毒衣壳内。复式载体提供与双链DNA病毒载体相当的功能且可缓解靶细胞将互补DNA合成至通常通过病毒囊封的单链基因组的需要。
[0204] 经所选用于病毒载体的TR(可解析及非可解析)优选为AAV序列，其中血清型1、2、3、4、5及6为优选的。可解析AAV TR无需具有野生型TR序列(例如，野生型序列可通过插入、缺失、截短或错义突变改变)，只要TR介导所需功能(例如，病毒包装、整合和/或原病毒救援及类似者)即可。TR可为充当AAV末端反向重复的合成序列，诸如如Samulski等人的美国专利第5,478,745号中所描述的“双D序列”，该美国专利的全部公开内容以全文引用的方式掺入本文中。通常但未必，TR来自相同细小病毒，例如，两个TR序列均来自AAV2。
[0205] 包装功能包括衣壳组分。衣壳组分优选来自细小病毒衣壳，诸如AAV衣壳或嵌合AAV衣壳功能。合适的细小病毒衣壳组分的实例为来自细小病毒科的衣壳组分，诸如自发性细小病毒或依赖病毒。举例而言，衣壳组分可选自AAV衣壳，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV Hu.26、AAV1.1(SEQ ID NO：15)、AAV2.5(SEQ ID NO：13)、AAV6.1(SEQ ID NO：17)、AAV6.3.1(SEQ ID NO：18)、AAV9.45、AAV2i8(SEQ ID NO：29)、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2-TT(SEQ ID NO：31)、AAV2-TT-S312N(SEQ ID NO：33)、AAV3B-S312N及AAV-LK03，及如尚未识别的或来自非人类灵长类源的其他新颖衣壳。衣壳组分可包括来自两个或多于两个AAV衣壳的组分。
[0206] 在一个更优选的实施方案中，VP衣壳蛋白中的一个或多个为嵌合蛋白，包含来自两个或多于两个病毒、优选两个或多于两个AAV的氨基酸序列，如Rabinowitz等人，美国专利6,491,907中所描述。嵌合衣壳在本文中描述为具有来自与另一血清型组合的一个血清型的足以修饰a)病毒产量、b)免疫反应、c)靶向、d)去靶向等的至少一个氨基酸残基。
[0207] 其他嵌合蛋白可通过Li等人，2008，Mol.Ther.16(7)：1252-1260中所示的指令制得，其内容以引用的方式并入本文中。特别地，将基于DNA改组的方法用于经由定向进化开发细胞型特异性载体。腺相关病毒(AAV)血清型1至9的衣壳基因组使用PCR随机地分段及重组以产生嵌合衣壳库。含有来自AAV1、2、8及9的基因组片段的单个感染性克隆(嵌合-1829)与先前经显示具有至AAV的低复制容许度的整合素负型仓鼠黑素瘤细胞系隔离。分子模型化研究表明AAV2促成对称的二十面体三重轴线处的表面环，而AAV1及9分别促成两倍及五倍对称相互作用。将C端结构域(AAV9)识别为黑素瘤向性至合理诱变的关键结构性决定子。嵌合-1829将硫酸乙酰肝素用作主要受体且比所有血清型更有效地转导黑素瘤细胞。很可能使用AAV或其他病毒衣壳序列将此技术应用于替代细胞/组织类型以产生作为人类基因转移的载体的一类新生物纳米颗粒。
[0208] 经包装病毒载体大体上包括由TR元件侧接的经修饰的FXN基因序列及表达控制序列，在本文中被称作“转基因”或“转基因表达盒”，其足以导致载体DNA的包装及经修饰的FXN基因序列在经转导细胞中的后续表达。病毒载体功能可例如作为质粒或扩增子的组分供应至细胞。病毒载体功能可染色体外地存在于细胞系内和/或可整合至细胞的染色体DNA中。
[0209] 可采用将携载病毒载体功能核苷酸序列引入至细胞宿主以供复制及包装的任何方法，包括但不限于：电穿孔、磷酸钙沈淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体，及与核定位信号组合的脂质体。在其中通过使用病毒载体的转染提供病毒载体功能的实施方案中，可使用用于产生病毒感染的标准方法。
[0210] 包装功能
[0211] 包装功能包括用于病毒载体复制及包装的基因。因此，例如，包装功能视需要可包括：病毒基因表达、病毒载体复制、自整合式状态救援病毒载体、病毒基因表达及将病毒载体包装至病毒颗粒中所需的功能。可使用诸如质粒或扩增子、杆状病毒或HSV辅助构建体的基因构建体将包装功能共同或单独地供应至包装细胞。包装功能可染色体外地存在于包装细胞内，但优选整合于细胞的染色体DNA中。实例包括编码AAV Rep及Cap蛋白的基因。
[0212] 辅助功能
[0213] 辅助功能包括建立包装细胞的活动性感染所需的辅助病毒元件，此为起始病毒载体的包装所需要的。实例包括衍生自腺病毒、杆状病毒和/或疱疹病毒的足以引起病毒载体的包装的功能。举例而言，腺病毒辅助功能通常将包括腺病毒组分E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA。包装功能可通过用所需病毒感染包装细胞而提供。可使用诸如质粒或扩增子的基因构建体将包装功能共同或单独地供应至包装细胞。参见，例如，如Rabinowitz等人，2002，J.Virol.76：791中所描述的pXR辅助质粒，及Grimm等人，1998，Human Gene Therapy 9：2745-2760中所描述的pDG质粒。包装功能可染色体外地存在于包装细胞内，但优选整合于细胞的染色体DNA(例如，HEK 293细胞中的E1或E3)中。
[0214] 可采用任何合适的辅助病毒功能。举例而言，在包装细胞为昆虫细胞的情况下，杆状病毒可充当辅助病毒。在AAV包装方法中还可将疱疹病毒用作辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的混合式疱疹病毒可有利地促进更可调式AAV载体产生方案。
[0215] 可采用将携载辅助功能的核苷酸序列引入至细胞宿主以供复制及包装的任何方法，包括但不限于：电穿孔、磷酸钙沈淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体，及与核定位信号组合的脂质体。在其中通过使用病毒载体的转染或使用辅助病毒的感染提供辅助功能的实施方案中，可使用用于产生病毒感染的标准方法。
[0216] 包装细胞
[0217] 在经包装病毒载体的产生中可采用本领域中已知的任何合适的容许或包装细胞。哺乳动物细胞或昆虫细胞为优选的。在本发明的实践中适用于包装细胞的产生的细胞的实例包括例如：诸如VERO的人细胞系、WI38、MRC5、A549、HEK 293细胞(其表达在组成性启动子的控制下的功能性腺病毒E1)、B-50或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080细胞系。在一个方面中，包装细胞能够在悬浮培养物中生长，更优选，细胞能够在无血清培养中生长。在一个实施方案中，包装细胞为在不含血清的培养基中悬浮生长的HEK293。在另一实施方案中，包装细胞为US专利第9,441,206号中所描述的HEK293细胞，且经保藏为ATCC NO.PTA 13274。大量rAAV包装细胞系在本领域中已知，包括(但不限于)WO 2002/46359中所公开的那些。
[0218] 用作包装细胞的细胞系包括昆虫细胞系。可根据本发明使用允许AAV的复制且可维持培养的任何昆虫细胞。实例包括：草地黏虫，诸如Sf9或Sf21细胞系；果蝇属细胞系；或蚊子细胞系，例如，白蚊伊蚊衍生细胞系。优选的细胞系为草地黏虫Sf9细胞系。将针对关于异源多肽的表达的昆虫细胞的使用的其教导、将核酸引入至此类细胞中的方法、及维持培养此类细胞的方法的以下参考文件并入本文中：Methods in Molecular Biology，Richard编，Humana Press，NJ(1995)；O’Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人，1989，J.Virol.63：3822-3828；Kajigaya等人，1991，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 88：4646-4650；Ruffing等人，1992，J.Virol.66：6922-6930；Kimbauer等人，1996，Virol.219：37-44；Zhao等人，2000，Virol.272：382-393；及Samulski等人，美国专利第6,204,059号。
[0219] 可使用本领域中已知的任何方法产生根据本发明的病毒衣壳，例如，通过来自杆状病毒的表达(Brown等人，(1994)Virology 198：477-488)。作为另一替代，本发明的病毒载体可使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生以如例如由Urabe等人，2002，Human Gene Therapy 13：1935-1943所描述的递送rep/cap基因及rAAV模板。
[0220] 在另一方面中，本发明提供在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中杆状病毒包装系统或载体可经构建以通过将这些基因改造至杆状病毒载体的多角体蛋白编码区域中且通过至宿主细胞中的转染产生病毒重组体来携载AAV Rep及Cap编码区域。在针对AAV使用Baculavirus产生时值得注意地是，优选，AAV DNA载体产物为类似分子的自我互补的AAV而无需使用至AAV ITR的突变。此似乎为昆虫细胞中的低效AAV rep基因巧合的副产物，其藉助于功能性Rep酵素活性的缺少产生自我互补的DNA分子。宿主细胞为感染杆状病毒的细胞或其中已引入编码杆状病毒辅助功能的额外核酸或其中包括这些杆状病毒辅助功能。这些杆状病毒病毒可表达AAV组分且随后促进衣壳的产生。
[0221] 在产生期间，包装细胞大体上包括一个或多个病毒载体功能以及足以引起病毒载体的复制及包装的辅助功能及包装功能。可使用基因构建体(诸如质粒或扩增子)将这些不同功能共同或单独地供应至包装细胞，且所述功能可染色体外地存在于细胞系内或整合于细胞的染色体中。
[0222] 可向细胞供应已并入的所陈述功能中的任何一个或多个，例如，具有染色体外地并入或整合于细胞的染色体DNA中的一个或多个载体功能的细胞系；具有染色体外地并入或整合于细胞的染色体DNA中的一个或多个包装功能的细胞系；或具有染色体外地并入或整合于细胞的染色体DNA中的辅助功能的细胞系。
[0223] rAAV纯化
[0224] rAAV载体可通过本领域的标准方法(诸如通过管柱层析法或氯化铯梯度)纯化。用于纯化rAAV载体的方法为本领域中已知的且包括以下各者中描述的方法：Clark等人，1999，Human Gene Therapy 10(6)：1031-1039；Schenpp及Clark，2002，Methods Mol.Med.69：427-443；美国专利第6,566,118号及WO 98/09657。
[0225] 治疗方法
[0226] 经修饰的FXN基因可用于弗里德赖希共济失调相关病症(诸如，退化性神经肌肉病症和/或与弗里德赖希共济失调相关联的心肌病)的基因治疗。个体可能需要基因治疗，此由于作为FXN基因的编码序列中的一个或多个突变的结果，FXN经不适当地表达，例如，具有不正确氨基酸序列，或在错误组织中或在错误时间处表达或表达不足。本发明的经修饰的FXN基因可用作基因治疗以提高蛋白共济失调蛋白的产量且藉此提高线粒体中的能量生产。参见，例如，美国专利第9,066,966号。
[0227] 本发明的载体的靶细胞为能够表达共济失调蛋白的细胞，诸如哺乳动物的心脏系统的那些，神经元细胞、肌肉细胞及其他细胞具有恰当细胞机制以处理前驱体从而产生具有共济失调蛋白活性的蛋白。
[0228] 药物组合物
[0229] 在特定实施方案中，本发明提供用于预防或治疗由共济失调蛋白的减少表达介导或与共济失调蛋白的减少表达相关联的疾病或病状(例如，弗里德赖希共济失调)的药物组合物。组合物包含治疗有效量的载体，该载体包含可增加FXN在细胞中的表达水平的经修饰的FXN基因。组合物包含载体，该载体包含编码FXN的经修饰的(例如，经优化)核酸，其中该组合物进一步包含医药学上可接受的载剂和/或其他药剂、医药剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂将通常为液体。作为注射介质，使用含有对于注射溶液而言常见的添加剂(诸如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲剂)的水为优选的。
[0230] 例示性医药学上可接受的载剂包括无菌、无热原质水及无菌、无热原质磷酸盐缓冲盐水。生理学上可接受的载剂包括医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂为在生物学上或其他方面不会不适宜的那些载剂，即，可向受试者施用该物质而不引起超过该物质的有利生物作用的不适宜生物作用。
[0231] 药物组合物可例如用于离体细胞的转染或直接向受试者施用病毒载体或细胞。
[0232] 优选以生物学上有效量向细胞施用包含经修饰的FXN基因的重组病毒载体。若体内向细胞施用病毒载体(例如，如下文所描述向受试者施用病毒)，则病毒载体的生物学上有效量为足以引起转基因在靶细胞中的转导及表达的量。
[0233] 在一个实施方案中，本发明包括通过单独地或在包含编码共济失调蛋白的经修饰的核酸的载体中(包括质粒、病毒、纳米颗粒、脂质体，或用于将核酸提供至细胞的任何已知方法)向细胞施用核酸来提高共济失调蛋白在细胞中的含量的方法。该方法包括一种方法，其中编码共济失调蛋白的mRNA的含量和/或所表达共济失调蛋白的含量可检测地大于共济失调蛋白(mRNA和/或蛋白)在并未施用核酸的其他相同细胞中的含量。本领域技术人员应理解，细胞可在体外培养或生长或可存在于生物体中(即，体内)。此外，细胞可表达内源性共济失调蛋白，使得共济失调蛋白在细胞中的含量可增加，和/或细胞可表达为野生型共济失调蛋白的突变体或变体的内源性共济失调蛋白，例如，具有SEQ ID NO：2的序列的共济失调蛋白，尤其当人类共济失调蛋白可存在多于一个野生型等位基因时。因此，与表达于其他相同但未经治疗的细胞中的共济失调蛋白的含量相比较共济失调蛋白的含量增加。
[0234] 本发明的另一方面为用含有经修饰的基因的载体体内治疗受试者的方法。可通过本领域中已知的用于施用病毒载体的任何方式向有需要的人类受试者或动物施用载体。
[0235] 可另外施用载体且将其作为照护标准的佐剂。即，载体可与另一治疗剂或化合物同步、同时或以本领域技术人员使用常规方法确定的确定给药间隔共施用。
[0236] 在一个方面中，本发明的rAAV可与包含与rAAV-FXN载体相同或不同的衣壳蛋白的空衣壳(即，不含有核酸分子的病毒衣壳)共施用。此由于本领域技术人员应理解，空衣壳的共施用可降低本发明的rAAV的免疫反应，例如，中和反应。即，空衣壳可充当允许rAAV-FXN载体的诱饵以避免如例如WO 2015/013313中所论述的中和抗体(Nab)免疫反应。
[0237] 全身施用的例示性施用模式包括(但不限于)：静脉内、皮下、皮内、肌内及关节内施用，及类似者，以及直接组织或器官注射。
[0238] 在一个实施方案中，载体经全身性地施用。本领域技术人员应理解，全身施用可将编码FXN的治疗性基因递送至受其中降低水平的FXN影响的所有组织，包括所有肌肉。
[0239] 尽管如此，本领域技术人员应理解，载体可直接递送至受FXN缺乏影响的区域，即，大脑及心脏。
[0240] 因此，在其他优选的实施方案中，通过直接注射将包含经修饰的FXN基因的发明性载体施用至心脏或中枢神经系统(CNS)组织中。
[0241] 在一个实施方案中，编码FNX的经修饰的核酸、载体或包含该载体的组合物经颅内递送，包括鞘内、神经内、脑内、心室内施用。
[0242] 在一个实施方案中，编码FNX的经修饰的核酸、载体或包含该载体的组合物通过利用心外注射随后小切口、利用冠状动脉内注射、利用心内膜心肌注射或利用可用于心脏的另一注射类型直接施用至心肌中递送至心脏。
[0243] 额外施用途径还可包含在直接目测下的载体的局部应用，例如，浅皮层应用或其他非定向性应用。载体还可例如鞘内或通过静脉注射递送至心室中。
[0244] 本发明的载体的靶细胞为罹患与弗里德赖希共济失调相关联的心肌病的受试者的心肌细胞。优选，受试者为人类、成人或儿童。然而，还预期兽医应用。
[0245] 本发明的载体的靶细胞还包括CNS(优选神经元)的细胞。递送至大脑以治疗弗里德赖希共济失调的神经退化性方面可通过鞘内施用。
[0246] 在一个方面中，全身性地(例如，静脉内)递送编码FNX的经修饰的核酸、载体或包含该载体的组合物以治疗FA相关联的心肌病和/或该疾病的神经退化性方面。
[0247] 在另一实施方案中，通过至少两个途径施用载体。即，可全身性地且亦直接地将载体施用至大脑和/或心脏或其任何组合中。
[0248] 若经由至少两个途径执行，则载体的施用可以但无需同步或同时。实际上，经由不同途径的施用可以每一施用之间的时间间隔单独地执行。通过本领域技术人员例行地判定适当的给药方案以实现每一个别患者的最大治疗益处。
[0249] 在一个方面中，本发明包括用于提高受试者的共济失调蛋白水平的编码本发明的共济失调蛋白的至少一个经修饰的核酸，包括(但不限于)载体或药物组合物中的核酸。
[0250] 在一个方面中，本发明包括用于治疗受试者的弗里德赖希共济失调的至少一个经修饰的核酸、包含该核酸的rAAV载体、及包含该核酸或该载体的药物组合物。
[0251] 除了如本领域中已知的FRDA的照护标准之外和/或与该照护标准并行，用途涵盖施用经修饰的核酸或包含经修饰的核酸的载体。
[0252] 可注射剂可呈熟知的形式，以液体溶液或悬浮液形式，以适用于在注射之前溶解或悬浮的固体形式或以乳液形式制备。
[0253] 具有经修饰的FXN基因的病毒载体的剂量将取决于施用模式、待治疗的疾病或病状、个别受试者的病状、特定病毒载体，及待递送的基因，且可以例行方式判定。用于实现疗效的例示性剂量为至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个转导单位或更多的病毒滴定量，优选约108至1013个转导单位，更优选1012个转导单位/kg体重。
[0254] 经修饰的FXN基因可作为具有适合于在靶细胞中表达的调节元件的DNA分子的组分经施用。经修饰的FXN基因可作为病毒质粒的组分(诸如rAAV载体)经施用。病毒颗粒可仅作为病毒颗粒经施用，无论在体内直接递送至门静脉脉管时抑或在离体治疗时，该离体治疗包含在体外将载体病毒颗粒施用至来自接受治疗的动物的细胞，随后引入返回至供体的经转导细胞。
[0255] 等效物
[0256] 前述书面说明书被视为足以使本领域技术人员实践本发明。前述描述及实例详述了本发明的某些例示性实施方案。然而，将了解，无论以文字呈现之前述内容如何详细，本发明可以许多方式实践，且本发明应根据所附权利要求书及其任何等效物解释。
[0257] 本文中所引用的全部参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书及类似者)及其中引用的参考文献就其尚未引用的程度而言以全文引用的方式特此并入本文中。
[0258] 例示性实施方案
[0259] 参考以下实验性实施例来进一步详细描述本发明。除非另外规定，否则提供这些实施例仅出于说明的目的，且不意欲为限制性的。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文所提供的教导而变得明显的任何及所有变化形式。实施例
[0260] 实施例1：自我互补的rAAV-FXN构建体的产生
[0261] 材料及方法
[0262] 载体构建
[0263] 将编码自我互补的AAV基因组的pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA构建体(在图3中图解显示)用作转基因表达构建体的主链(Gray等人，2011，Human Gene Therapy 22：1143-1153)。两个密码子优化FXN基因插入序列自pUC57中的GenScript订购，即，Genscript及Genscript(低CpG)，且用于替换主链载体中的EGFP。Genscript(SEQ ID NO：6)及Genscript(低CpG)(SEQ ID NO：7)经修饰的FXN基因如图3中所说明的各自可操作地连接至CBh启动子。GenScript FXN(SEQ ID NO：6及7)构建体包括如图2E(Genscript)及图2F(Genscript(低CpG))中所显示的N端AgeI位点、FXN终止密码子下游的胶原蛋白稳定序列(CSS)(5-CCCAGCCCACTTTTCCCCAA-3’)、CSS下游的牛生长激素(BGH)polyA序列、BGH polyA下游的MluI位点。插入至pTRs-KS-CBh-FXN-bGHpolyA构建体中的例示性插入序列显示于图2A至图
2F中且示于表8中。更特定而言，野生型共济失调蛋白基因(WT FXN；SEQ ID NO：2)经克隆至pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA中(图2A)；IDT1经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：11)经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT1-bGHpolyA中(图2B)；编码IDT3低表达经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：8)的核酸经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT3-bGHpolyA中(图2C)；IDT4经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：12)经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT4-bGHpolyA中(图2D)；Genscript(对照)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：6)经克隆至pTRs-KS-CBh-Genescript-bGHpolyA中(图2E)；且Genscript(低CpG)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：7)经克隆至pTRs-KS-CBh-Genescript(低CpG)-
bGHpolyA中(图2F)。编码FXN基因的每一插入序列经克隆至载体中，且该基因由5’侧上的AgeI位点及由3’侧上的AvrII切割位点侧接，随后是AvrII位点之后的CSS序列、CSS之后的SpeI切割位点、SpeI切割位点之后的bGHpolyA信号序列，及polyA信号序列之后的MluI切割位点。
2F中且示于表8中。更特定而言，野生型共济失调蛋白基因(WT FXN；SEQ ID NO：2)经克隆至pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA中(图2A)；IDT1经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：11)经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT1-bGHpolyA中(图2B)；编码IDT3低表达经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：8)的核酸经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT3-bGHpolyA中(图2C)；IDT4经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：12)经克隆至pTRs-KS-CBh-IDT4-bGHpolyA中(图2D)；Genscript(对照)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：6)经克隆至pTRs-KS-CBh-Genescript-bGHpolyA中(图2E)；且Genscript(低CpG)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：7)经克隆至pTRs-KS-CBh-Genescript(低CpG)-
bGHpolyA中(图2F)。编码FXN基因的每一插入序列经克隆至载体中，且该基因由5’侧上的AgeI位点及由3’侧上的AvrII切割位点侧接，随后是AvrII位点之后的CSS序列、CSS之后的SpeI切割位点、SpeI切割位点之后的bGHpolyA信号序列，及polyA信号序列之后的MluI切割位点。
[0264] 用AgeI及MluI(New England Biolabs，各别地R0552S及R0198S)消化、凝胶提取及使用ExTaq聚合酶(Clontech，RR001A)连接主链pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA及FXN基因构建体。连接反应转化至SURE细胞(Agilent，200227)，在37℃下放置于SOC回收培养基(目录号15544-034，Invitrogen)中历时一小时，随后用(10mg/ml)涂覆于LB板上。针对病毒产生的扩增测序及选择菌落。具有AAV血清型2衣壳的重组AAV(rAAV)载体如所描述通过三重转染方法在人胚肾293(HEK293)细胞中产生UNC载体核心(Grieger等人，2006，Nature Protocols 1：1412-1428)。替代地，类似地产生具有血清型2i8衣壳(SEQ ID NO：28的氨基酸序列)的rAAV载体。含有自我互补的基因组的高纯度重组病毒通过非离子碘克沙醇梯度接着离子交换层析回收。峰值级分由qPCR判定，随后以含有5％d-山梨醇的磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗析。病毒滴定量由qPCR判定(Gray等人，2010，J.Amer.Soc.Gene Therapy 18：570-578)。遵循体外初步测试(下文)，将GenScript(低CpG)用于产生具有在pTRs-KS-CBh-Genescript(低CpG)-bGHpolyA中的FXN终止密码子之前嵌入的HA标签
TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT的构建体。
TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT的构建体。
[0265] 北卡罗莱纳大学(UNC)载体核心用rAAV TK血清型产生具有FXN-HA构建体的病毒。
[0266] sc rAAV-FXN的体外测试
[0267] HEK293(ATCC：CRL-1573)及HeLa(ATCC：CCL-2)细胞维持于Dulbecco的经修饰的Eagle培养基中(DMEM，Gibco)。细胞生长培养基补充有9％的胎牛血清(FBS，Gibco)、3.4mM l-麸酰氨酸、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素(Gibco)。细胞在37℃下保持于5％CO2氛围中。量杆测定：细胞接种于24孔板中以使得其在24小时(h)内达至大约60％汇合，随后在MOI 10,000(VG/细胞)下用scAAV-FXN(在本文中可互换地被称作“rAAV-FXN”或“rAAV-FXN-HA”一式三份地模拟处理或感染。在转导后60h(h p.t.)，细胞系根据针对Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay的制造商协议(Abcam，ab109881)。使用ImageJ处理数据。
[0268] 蛋白质印迹：
[0269] 细胞接种于6孔板中以使得其在24h内达至大约60％汇合，随后在MOI 10,000(VG/细胞)下用scAAV-FXN模拟处理或感染。在转导后60h，用细胞溶解缓冲液(0.0625M三-HCl pH 6.8、10％甘油、2％SDS、5％2-巯基乙醇、0.02％(w/v)溴酚蓝)来溶解细胞。通过使用15-4％TGX凝胶来凝胶电泳分离十五(15)μl HeLa蛋白溶解物，且蛋白经电转染至硝化纤维素膜(NCM)。使用PBS-T中的5％脱脂奶粉阻断NCM。抗共济失调蛋白抗体(Abcam，18A5DB1)用于具有5％牛奶的PBS-T中。将具有5％乳抗体的PBS-T中的缀合辣根过氧化酶(HRP)二级抗体用于检测抗共济失调蛋白的存在。将WesternBright ECL蛋白质印迹检测试剂盒
(Advansta，K-12045-D50)用于根据每一制造商的说明书进行检测。
(Advansta，K-12045-D50)用于根据每一制造商的说明书进行检测。
[0270] 图1A至图1B显示与编码FXN(SEQ ID NO：1)的未优化(即，野生型)序列在HeLa细胞中的表达相比较的不同优化序列的表达的结果。更特定而言，图1A及图1B两者显示蛋白质印迹的像片，该像片显示共济失调蛋白(FXN)在用包含编码共济失调蛋白的插入序列的表达载体转染的HeLa细胞中的表达。图1A在暴露了1秒的WesternBright印迹薄膜的像片中显示FXN在HeLa细胞中的表达。图1B显示图1A中所显示的表明如暴露了1秒的WesternBright印迹薄膜的像片中所显示的FXN在HeLa细胞中的表达的实验的重复。图1A及图1B中的每一凝胶泳道显示与来自编码FXN的野生型核酸序列的表达相比较的来自本发明的经修饰的FXN基因的FXN的表达。即，泳道1显示由编码FXN的野生型非经修饰的核酸(SEQ ID NO：2)驱动的表达；泳道2显示由IDT2经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：3)驱动的表达；泳道3显示由IDT5经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：9)驱动的表达；泳道4显示由JCAT经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：4)驱动的表达；泳道5显示由GeneArt经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：5)驱动的表达；泳道6显示由GenScript(对照)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：6)驱动的表达；泳道7显示由Genscript(低CpG)经修饰的FXN基因(SEQ ID NO：7)驱动的表达；且泳道GFP显示编码绿色荧光蛋白的转基因的表达，由插入序列而非编码FXN的核酸编码的可检测标记。
[0271] 所显示数据表明若干经修饰的FXN核酸序列--尤其泳道4(JCAT)、5(GeneArt)、6(Genscript)及7(Genscript低CpG)--相对于野生型核酸序列(泳道1)提供共济失调蛋白在HeLa细胞中的更高表达。每一泳道中的肌动蛋白内参考物作为蛋白内参考物。
[0272] 核酸序列中的GC核苷酸含量(通常表达为序列中的核苷酸总数目的百分比)可具有多个影响，包括(但不限于)：mRNA的稳定性增加，二级结构及转基因通常受增加的GC含量负面地影响。因此，本领域技术人员应理解，相对于负面影响，经修饰的核酸的GC含量反映核酸的增加的稳定性与自其转录的mRNA之间的平衡，例如，在由增加的GC含量介导的二级结构上。
[0273] CAI(密码子适应指数)为同义密码子使用偏向的测量值。该指数使用来自物种的高表达基因的参考集以分析每一密码子的相对值，且基因的分值自该基因中的所有密码子的使用频率计算。指数评估在选择密码子使用的模式中选择已生效的程度。其可用于预测基因的表达水平且用于比较不同生物/物种中的密码子使用。对共济失调蛋白基因执行人类密码子优化以实现以下因素的平衡：转录效率--GC含量、CpG二核苷酸含量、隐含剪接位点等；翻译效率--密码子使用偏向、GC含量、mRNA二级结构、过早polyA位点、RNA不稳定基序、内部核糖体结合位点；及蛋白再折叠--密码子使用偏向、密码子及抗密码子的相互作用，RNA二级结构。
[0274] 基本上，密码子优化平衡这些变量以(优选)实现更高表达共济失调蛋白基因序列、增加信息(GC含量、DNA及RNA两者中的二级结构)的稳定性及类似者，如本领域中已知的。
[0275] CpG岛可由经转导细胞中的类Tol受体九(TLR9)辨识且可将免疫反应引发至外来(外源)DNA。因此，在一个实施方案中，本发明涵盖编码共济失调蛋白的经修饰的核酸，其中CpG岛的数目与编码共济失调蛋白的野生型核酸序列(例如，SEQ ID NO：2)中的CpG岛基序的数目相比已减少。
[0276] CAI、GC百分比含量及本文中例示的每一经修饰的FXN基因的潜在CpG岛区域数目显示于下文表1中。
[0277] 表1
[0278]
[0279] 即，对于编码FXN的野生型核酸(WT-FXN；SEQ ID NO：2)，核酸序列表明CAI为0.71且％GC含量为55％。相反地，JCAT经修饰的FXN基因表明CAI为0.98及GC含量为69％，其两者实质上高于WT-FXN的值。
[0280] 使用在http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html发现的公开可用软件识别潜在CpG岛。CpG岛软件使用由Gardiner-Garden及Frommer，1987，J.Mol.Biol.196(2)：261-282描述的方法报告潜在CpG岛区域。在1个碱基对(bp)时间间隔处使用跨越序列的200个bp窗口执行计算。将CpG岛定义为序列范围，其中Obs/Exp值大于
0.6且GC含量大于50％。如下计算窗口中的CpG二聚体的期望数目：窗口中的“C”的数目乘以窗口中的“G”的数目，除以窗口长度。因此，存在于核酸序列中的潜在CpG岛可易于通过将讨论的序列输入至由软件提供的窗口中来判定(通过“将原始序列或一个或多个FASTA序列粘贴至以下文字区域中。输入限制为100000个字符”的指令指示)。CpG岛往往发现于脊椎动物基因的5’区域中，因此，此程序可用于突出显示基因组序列中的潜在基因。
0.6且GC含量大于50％。如下计算窗口中的CpG二聚体的期望数目：窗口中的“C”的数目乘以窗口中的“G”的数目，除以窗口长度。因此，存在于核酸序列中的潜在CpG岛可易于通过将讨论的序列输入至由软件提供的窗口中来判定(通过“将原始序列或一个或多个FASTA序列粘贴至以下文字区域中。输入限制为100000个字符”的指令指示)。CpG岛往往发现于脊椎动物基因的5’区域中，因此，此程序可用于突出显示基因组序列中的潜在基因。
[0281] 由于较高表达水平及较高GC含量(55％)、较高CAI(0.86)及较低数目个CpG二核苷酸(117)，Genscript(低CpG)经修饰的FXN基因经选择用于产生以下所示的动物实验中所使用的scAAV-2i8载体。
[0282] 实施例2：弗里德赖希共济失调的小鼠模型中的体内治疗
[0283] 将本领域中公认的FRDA的小鼠模型(Perdomini等人，2014，Nature Med.20(5)：542)用于分析rAAV介导的FXN基因治疗的潜在功效。即，检查三组小鼠：未经治疗Mck阳性对照小鼠(Mck-Cre x FXN L3/WT)、未经治疗Mck突变小鼠(Mck-Cre x FXN L3/L-)，及接收包含FXN基因的rAAV的一剂量的经治疗Mck突变小鼠，其中经修饰的FXN基因包含SEQ ID NO：7的核酸序列(GenScript(低CpG))且FXN基因经克隆至如上文所描述的pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH构建体中以提供pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)-bGHpolyA。
[0284] 小鼠研究中使用的rAAV-FXN载体进一步包含AAV2i8衣壳。此外，pTRs-KS-CBh-Genscript(低CpG)-bGHpolyA构建体进一步包含编码可检测血球凝集素标签(rAAV-FXN-HA)的核酸序列，其中编码HA标签的序列位于经修饰的FXN基因的3’，使得共济失调蛋白的表达可易于通过检测HA的存在而检测及定位，例如，使用抗HA抗体，诸如抗HA小鼠mAb(HA.11克隆16B12，Covance Research Products公司，Princeton，NJ)。载体为指定的rAAV-FXN-HA。
[0285] 研究的三个动物组列于且描述于表2中。
[0286] 表2
[0287]
[0288]
[0289] A.生物标记物研究
[0290] 方法
[0291] 血浆中的半乳糖凝集素-3及H-FABP的测量
[0292] 在5周龄(治疗后2周)及8周龄(治疗后5周)时在异氟醚麻醉之后通过眼眶后穿刺采集血液。
[0293] 使用来自根据制造商的说明书的RayBiotech的小鼠半乳糖凝集素-3Elisa试剂盒在血浆中测量半乳糖凝集素-3。
[0294] 使用来自HycultBiotech的小鼠H-FABP Elisa试剂盒根据制造商的说明书在血浆中测量H-FABP。
[0295] 心脏均质物中的琥珀酸去氢酶活性的测量
[0296] 在处死之后，心脏经采集且每组4个小鼠的心脏的一半经快速冷冻以用于测量SDH活性。
[0297] 心脏均质物的SDH活性测量遵循来自Biovision的琥珀酸去氢酶活性比色测定试剂盒(目录#K660-100)的指令执行。
[0298] 组织中的人类共济失调蛋白的测量
[0299] 在处死之后，心脏(一半)、骨骼肌(腓肠肌)及肝组织经采集及快速冷冻以用于共济失调蛋白的测量。
[0300] 组织均质物的测量遵循人类共济失调蛋白Elisa试剂盒(Abcam；ab176112)的指令执行。
[0301] 组织学
[0302] 小脑(包括齿状核)、性腺、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、胰腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)、脾脏及颈椎、胸及腰椎为甲醛液固定的。随后使用EDTA溶液脱钙脊椎。所有器官经石蜡包埋以获得5μm厚部分；脊椎(包括脊髓及背根节)及心脏的横向部分。用苏木精及伊红染色所有器官；使用梅森氏(Masson)三色染色法评估心脏纤维化。
[0303] 超声心动图：
[0304] 通过Vevo-2100Visual Sonics回声仪上的30MHz线性探针(MS400)在经麻醉小鼠(异氟醚1-2％)中捕获的经胸超声心动影像。
[0305] 以下参数经测量以分析：a)心脏形态及心室收缩功能(短轴，SAX)：左心室端部舒张(LVEDD)及端部收缩直径(LVESD)、中隔(SW)及后壁厚度(PW)、左心室质量(LVM＝1.055×[(EDD+SW+PW)3-EDD3)])、射出及缩短分数及心输出量；b)血液动力学特征：肺及主动脉速度及检测心内压力变化的压力(AoV及RV功能)。
[0306] 小鼠
[0307] 小鼠保持在控制温度及湿度的动物设施中，该动物设施具有12h光-暗循环，可以自由饮水及摄取标准啮齿动物食物(D03，SAFE，Villemoisson-sur-Orge，法国)。所有动物程序及实验由针对动物照护及使用的地方道德委员会(Comité d'Ethique en Expérimentation Animale IGBMC-ICS)核准(Com'Eth 2011-007)。
[0308] 每天两次执行小鼠临床观察，每周一次记录体重及每2天记录摄食量，直至过程结束为止。
[0309] 对于生物分布及基因治疗研究，用异氟醚(1-2％)麻醉3周龄小鼠，且针对治疗组，将剂量为1×1013vg/kg的rAAV-FXN-HA载体经静脉注射至眼眶后静脉，且针对未经治疗MCK突变小鼠及对照组，则使用相等体积的盐水。
[0310] 在开始治疗之前2天(基线表型)、在5周龄(治疗后14天)及7周龄(治疗后28天)时，通过超声心动图，在异氟醚麻醉(1-2％)下，评估小鼠心脏功能。在5周龄及8周龄时，采集血液，如本文中其他处所详述，测量心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、半乳糖凝集素-3及琥珀酸去氢酶(SDH)的浓度。
[0311] 在处死之后，记录所有动物的体重、身长、心脏、脾脏、肾脏、肾上腺及肝脏重量。自每组4只动物采集肾上腺、小脑、颈椎、胸及腰椎、性腺(睾丸及卵巢)、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、雄性之前列腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)、脾脏及胸腺，用于病理评估及ELISA测定。
[0312] 采集每组其他4只动物的小脑(包括齿状核)、颈椎、胸及腰背根节、心脏、肾脏、肝脏、肺、性腺、胰腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)及脾脏，且迅速冷冻，用于分子生物学。
[0313] 结果
[0314] 潜在生物标记物的识别
[0315] 在三组小鼠中判定各种生物标记物的含量：未经治疗Mck阳性对照组、未经治疗Mck突变小鼠，及接受包含FXN基因且进一步包含编码HA标签肽的核酸的rAAV2i8(AAV-FXN-HA)的剂量的经治疗Mck突变小鼠。
[0316] 血浆中的半乳糖凝集素-3及H-FABP的测量
[0317] 在5周龄(对经治疗Mck突变小鼠的AAV治疗的2周)及8周龄(对经治疗Mck突变小鼠群组的rAAV治疗的5周)时在异氟醚麻醉之后通过眼眶后穿刺采集血液，且使用标准方法测量半乳糖凝集素-3及H-FABP的含量。
[0318] 半乳糖凝集素-3：
[0319] 在5周龄时，3个群组之间的半乳糖凝集素-3水平为相当的，即使与未经治疗Mck突变小鼠群组相比较未经治疗Mck阳性对照组及经治疗Mck突变小鼠群组中的半乳糖凝集素-3水平趋于更高。
[0320] 如表3中所显示，在8周龄时，未经治疗Mck突变组中的半乳糖凝集素-3水平明显地低于阴性对照组。实验性群组中的半乳糖凝集素-3水平趋于比阴性对照组更低，而实验群组与阳性对照组之间的半乳糖凝集素-3水平相当。
[0321] 表3
[0322]
[0323] 出人意料地，未治疗的Mck阳性对照组的小鼠在8周龄时比在5周龄时显示更高半乳糖凝集素-3水平，而针对未治疗的Mck突变小鼠群组及经治疗的Mck突变小鼠群组，在8周龄时的半乳糖凝集素-3水平与在5周龄时的水平相当。
[0324] 总的，其呈现出半乳糖凝集素-3对关于Mck小鼠的此研究而言并非适当的心脏生物标记物。未治疗的Mck突变小鼠群组中的小鼠在半乳糖凝集素-3为适当的生物标记物时并未显示此参数的预期增加。
[0325] H-FABP：
[0326] 使用标准检测方法在同一样本群组内的小鼠之间观测到H-FABP水平的极大可变性。
[0327] 如表4中所显示，可对在5周龄及8周龄两者时的3组小鼠之间的H-FABP血液水平进行比较。
[0328] 表4
[0329]
[0330]
[0331] 在每组中的5周龄及8周龄之间没有观测到H-FABP水平的显著改变。
[0332] 总之，由此看来，H-FABP对关于Mck小鼠的此研究而言并非适当的心脏生物标记物；在未经治疗Mck突变组中未观测到此参数的预期增加，且在同一群组中的小鼠之间观测到重要可变性。
[0333] 心脏均质物中的SDH活性
[0334] 使用标准方法测量来自在研究结束(8周龄、经治疗突变小鼠群组的AAV治疗的5周)时所采集的心脏的心脏均质物中的SDH活性。每组由四个(4)小鼠组成。
[0335] 表5中所显示的结果显示可在3组小鼠之间比较SDH活性。与未经治疗Mck突变组相比较，在未经治疗Mck阳性对照组中未观测到SDH活性降低。
[0336] 表5
[0337]
[0338] 在同一群组中的小鼠之间观测到SDH活性的重要可变性。此外，在未经治疗Mck阳性对照组中未观测到SDH活性的预期降低。
[0339] 心脏、骨骼肌及肝组织均质物中的共济失调蛋白水平
[0340] 如表6中所显示使用标准方法自在处死时采集的心脏、骨骼肌及肝脏测量人类共济失调蛋白水平。
[0341] 在未经治疗Mck阳性对照组及未经治疗Mck突变组的经检查组织(心脏、骨骼肌及肝脏)中的任一者中没有检测到人类共济失调蛋白(即，水平低于测定的检测下限[LLD])。
[0342] 在接受rAAV-FXN的经治疗Mck突变小鼠中，在水平为38.35+/-1.99ng/mg的心脏均质物中及在4.57+/-0.39ng/mg的较低浓度下的骨骼肌中检测到人类共济失调蛋白。此外，在肝脏中检测到人类共济失调蛋白的迹象(0.07+/-0.01ng/mg蛋白)。
[0343] 表6
[0344]
[0345] 这些数据表明用包含FXN基因的rAAV载体进行的治疗可增加弗里德赖希共济失调(FRDA)的小鼠模型的共济失调蛋白水平。另外，这些数据显示FXN水平可通过rAAV-FXN全身施用体内增加，使得心脏中的FXN水平增加，且在骨骼肌增加较小程度，其中在肝脏中水平低得多。因此，这些数据表明体内FXN水平可在受影响组织中选择性地增加，例如，心脏及骨骼肌，同时在FXN为非所需和/或所需(例如，关于肝脏)的情况下最小化FXN的递送。
[0346] 肉眼病理学
[0347] 未经治疗Mck阳性对照雄性小鼠与未经治疗及经AAV治疗的Mck突变动物相比较明显更长(9.39cm与8.89cm[+5.62％]。P＝0.011[t-测试])。未观测到其他显著肉眼可见损伤，尤其在雄性及雌性两者的心脏重量中未观测到肉眼可见损伤或显著变化。
[0348] 组织学
[0349] 心脏
[0350] 在一个未经治疗Mck阳性对照动物(#58)中观测到最小间质纤维化。所有其他3个未经治疗Mck阳性对照组心脏为正常的。
[0351] 然而，在经分析的所有4个未经治疗Mck突变动物中观测到最小(小鼠#38)及中度(小鼠#41、#49及81)间质纤维化。此损伤与小鼠#38(最小)及#81(轻微)中肿胀的心肌细胞的心内膜病灶相关联。在小鼠#41及#49中，纤维化与心肌细胞的中度巨噬细胞发炎、最小播散性肿胀及轻微液胞化相关联。在小鼠#41及#81中观测到阿尼契柯氏(Anitschkow)(鹰眼形)核。
[0352] 与未经治疗Mck突变群形成鲜明对比，在整个评估中，除在小鼠#47及#13中观测到极少阿尼契柯氏核以外，经rAAV-FXN治疗的Mck突变小鼠的心脏呈现正常。
[0353] 肾脏
[0354] 在所有群组中，常常在多个髓质小管的管腔中观测到显著矿化。频率针对未经治疗Mck阳性对照动物为4/4(尽管其表达Cre转基因)，针对未经治疗Mck突变动物为3/4，且针对接受一剂量的rAAV-FXN的经治疗Mck突变动物为2/4。与未经治疗Mck阳性对照组及未经治疗Mck突变组相比较，经rAAV治疗的Mck突变组中呈现矿化强度的降低。管状嗜碱性(再生)在2/4的未经治疗Mck阳性对照组中的动物中、在3/4的未经治疗Mck突变组中的动物中及在经AAV治疗的Mck突变组中的1个动物中观测到。
[0355] 肝脏：在一个未经治疗Mck阳性对照动物(#38)中观测到最小门静脉周发炎。
[0356] 肺脏：在一个未经治疗Mck突变动物(#41)中观测到轻微支气管周发炎。
[0357] 未观测到其他显著显微损伤。特别地，脊髓、背根节及小脑均正常。
[0358] 超声心动图
[0359] 治疗之前的基本表型
[0360] 超声心动图测量结果显示与未经治疗Mck阳性对照组相比较，未经治疗Mck突变雄性小鼠的左心室功能降低。此心机能不全通过左心室(LV)收缩性(缩短分数及射血分数)的减少及LV容积(收缩及舒张两者)的增加表征。在彼阶段中，在未经治疗Mck突变雌性小鼠中未观测到心脏表型。
[0361] 图4A显示通过3周龄(A)雄性及(B)雌性的超声心动图评估收缩功能及LV容积的图。资料为每组8个小鼠的平均值±S.E.M。使用多个t-测试比较(Sidak-Bonferroni法)将Mck突变(经治疗及未经治疗两者)小鼠的数据与未经治疗Mck阳性对照组进行比较。*p<0.05
[0362] rAAV治疗之后14天(5周龄)的结果：
[0363] 为调查用于治疗FRDA心肌病的基因治疗方法的潜能，以单独静脉内注射向3周龄突变小鼠(经治疗Mck突变组)施用剂量为1×1013vg/kg的AAV.FXN-HA。在注射之后14天(5周龄)，超声心动图测量结果显示经治疗Mck突变雄性的心脏血流动力学(心输出量)的改良及接近正常形态发展(收缩性、LV质量)。相反地，仍在未经治疗Mck突变小鼠中观测到心机能不全。出人意料地，在雌性中，在所有Mck突变小鼠(无论经治疗或未经治疗)中观测到心肌收缩性缺陷。
[0364] 图5A至图5B显示通过5周龄雄性(图5A)及雌性(图5B)的超声心动图评估收缩功能及LV容积。资料为每组8个小鼠的平均值±S.E.M。使用多个t-测试比较(Sidak-Bonferroni法)将突变小鼠的数据与对照组进行比较。*p<0.05.
[0365] rAAV治疗之后28天(7周龄)的结果：
[0366] 在rAAV治疗二十八(28)天(7周龄)，经治疗Mck突变雄性及雌性完全归一化且变得不能在彼此之间及与未经治疗Mck阳性对照小鼠区分开来。这样，在经治疗Mck突变小鼠中表明心脏疾病的完全校正(雄性)及预防(雌性)。相反地，未经治疗Mck突变小鼠出现急进性心机能不全，伴随左心室缩短分数及心输出量明显减少以及左心室肥大。
[0367] 图6A至图6C显示描绘使用对历时连续数周的未经治疗Mck阳性对照组、及经治疗及未经治疗Mck突变小鼠的左心室质量(LVm)、缩短分数(SF)及心输出量的超声心动图评估获得的数据的图。资料为每组8个小鼠的平均值±S.E.M。使用多个t-测试比较(Sidak-Bonferroni法)将Mck突变小鼠的数据与未经治疗Mck阳性对照群组进行比较。*p<0.05.[0368] 结论
[0369] 超声心动图的结果
[0370] 在此研究中，分析剂量为1×1013vg/kg的视情况进一步包含可检测血球凝集素标签(HA)载体的rAAV-FXN(在本文中被称作rAAV-FXN-HA)的疗效。此剂量比先前在同一Mck小鼠心脏特异性弗里德赖希共济失调小鼠模型中所描述的剂量低大约5倍，该弗里德赖希共济失调小鼠模型使用编码野生型FXN的rrhAAV10载体(Perdomini等人，2014，Nature Medicine 20(5)：542)。
[0371] 如图5A中所显示，在3周龄时，未经治疗Mck突变雄性小鼠开始出现左心室(LV)功能不全，在相同周龄的同一群组的雌性中未观测到该左心室功能不全(图5B)。在AAV.FXN-HA注射之后十四(14)天(在5周龄时)，在Mck突变雄性中观测到心脏表型的进行性校正，但该进行性校正在Mck突变雌性中较少。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，此差异可由于与雄性相比较雌性中的心脏表型的开始更晚或由于到目前为止此协议中所使用的小鼠数目的减少。
[0372] 这些结果表明经rAAV修饰的FXN的全身施用逆转FRDA的Mck突变小鼠模型中的心脏疾病表型。这些结果进一步表明经rAAV修饰的FXN施用可预防和/或逆转有需要的受试者的FRDA。
[0373] rAAV-FXN注射后二十八(28)天，在经治疗Mck突变雄性及雌性中观测到心脏功能的完全恢复，其表明利用所注射FXN转基因的病变的稳健校正。即，图6A至图6C中所显示的数据表明rAAV-FXN施用之后二十八(28)天的FRDA心脏表型的校正。更特定而言，图6A显示当未经治疗(三角形)Mck突变小鼠呈现明显地更高左心室质量(LVm)时，经治疗Mck突变小鼠及对照组(WT野生型Mck-Cre小鼠)两者的LVm为不可区分的(*p<0.05)。图6B显示数据，该数据表明在rAAV-FXN治疗之后28天，阳性对照组(WT L3Mck-Cre小鼠；圆形)及经治疗Mck突变(L-)小鼠(方形)两者表明实质上相同缩短分数(SF)测量结果。相反地，图6B表明未经治疗Mck突变小鼠(三角形)显示极大地减少的SF(*p<0.05)。另外，图6C显示资料：该数据表明在用rAAV进行治疗之后28天，与显示明显减少的心输出量(三角形；*p<0.05)的未经治疗Mck突变小鼠(三角形)相比较，经治疗Mck突变小鼠(方形)显现不可与对照小鼠(圆形)区分的心输出量。所有(经治疗及未经治疗)Mck突变小鼠使用多个t-测试比较(Sidak-Bonferroni法)与对照未经治疗小鼠进行比较。对于图6A至图6C中所显示的每一个图，指示*<0.05。
[0374] 这些数据充分地表明包含编码共济失调蛋白的经修饰的核酸的rAAV的施用可逆转和/或预防FRDA的本领域中公认的小鼠模型中的Mck表型。因此，这些数据证明经rAAV修饰的FXN介导的治疗可为用于治疗或预防有需要的受试者的降低水平的FRDA或由野生型(例如，功能性)共济失调蛋白介导的疾病、病症或病状的潜在有用疗法。尽管这些数据表明全身性地施用rAAV经修饰的FXN可治疗或预防FRDA，但这些结果进一步证明治疗还包括rAAV-FXN施用的其他(例如，更直接)途径，诸如(但不限于)，颅内或直接心脏施用。即，由于全身施用表明为疗法，故本领域技术人员基于本文中所提供的本发明应理解，更直接施用途径还可提供治疗益处。
[0375] 这些结果强有力地证明使用经修饰的FXN基因的rAAV载体递送的基因治疗为用于患有FRDA的患者及用于治疗或预防显示野生型/功能性共济失调蛋白水平减少的受试者的肾结石的潜在疗法。
[0376] 实施例3：在弗里德赖希共济失调的小鼠模型中体内施用rAAV-FXN的组织学研究[0377] 研究设计
[0378] 二十四(24)个8周龄C57BL6/N雄性及雌性小鼠经分析用于组织病理学分析。
[0379] 八(8)个小鼠持有与功能性经改造人类共济失调蛋白等位基因相关联的Mck-Cre转基因(MCK：Muscular Creatine Kinase)(Mck-Cre x FXN L3/WT；下文中被称作“Mck阳性对照小鼠”)。十六(16)个小鼠持有目前与无活性经改造共济失调蛋白等位基因相关联的相同转基因(Mck-Cre x FXN L3/L-；下文中被称作“Mck突变小鼠”)。在Mck突变小鼠当中，八(8)个注射编码共济失调蛋白的rAAV2i8(rAAV-FXN；1013vg/kg)(下文中为“经治疗Mck突变小鼠”)。剩余八(8)个Mck突变小鼠接受相等体积的盐水(下文中为“未经治疗Mck突变小鼠”)。阳性对照小鼠群组(Mck-Cre x FXN L3/WT)经施用盐水。参见下表7。
[0380] 表7
[0381]
[0382] 方法
[0383] 在处死之后，自所有动物记录体重、身长及心脏、脾脏、肾脏、肾上腺及肝脏重量。自每组四(4)个动物采集肾上腺、小脑、颈椎、胸及腰椎、性腺(睾丸及卵巢)、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、雄性前列腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)、脾脏及胸腺以用于病理评估及ELISA测定。
[0384] 每组4个其他动物的小脑(包括齿状核)、颈椎、胸及腰背根节、心脏、肾脏、肝脏、肺、性腺、胰腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)及脾脏经采集且迅速冷冻以用于分子生物学。
[0385] 组织学
[0386] 小脑(包括齿状核)、性腺、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、胰腺、骨骼肌(腓肠肌及比目鱼肌)、脾脏及颈椎、胸及腰椎为甲醛液固定的。随后使用EDTA溶液脱钙脊椎。所有器官经石蜡包埋以获得5μm厚部分，脊椎(包括脊髓及背根节)及心脏的横向部分。用苏木精及伊红染色所有器官。使用梅森氏三色染色法评估心脏纤维化。
[0387] ELISA测定
[0388] 在采集之后立即快速冷冻心脏的一半、肝脏的右叶、及比目鱼肌及腓肠肌。
[0389] 结果
[0390] 肉眼病理学
[0391] Mck阳性对照雄性小鼠与未经治疗Mck突变小鼠及经治疗Mck突变小鼠相比较明显更长(9.39cm与8.89cm[+5.62％]。P＝0.011[t-测试])。未观测到其他显著肉眼可见损伤，尤其在雄性及雌性两者的心脏重量中未观测到肉眼可见损伤或显著变化。
[0392] 组织学
[0393] 心脏
[0394] Mck-Cre x FXN L3/WT：在一个Mck阳性对照动物(#58)中观测到最小间质纤维化。所有其他3个阳性对照小鼠心脏为正常的。
[0395] 未经治疗Mck-Cre x FXN L3/L-：相反地，在经分析的所有4个未经治疗Mck突变小鼠中观测到最小(小鼠#38)及中度(小鼠#41、#49及81)间质纤维化。此损伤与小鼠#38(最小)及#81(轻微)中肿胀的心肌细胞的心内膜病灶相关联。在小鼠#41及#49中，纤维化与心肌细胞的中度巨噬细胞发炎、最小播散性肿胀及轻微液胞化相关联。在小鼠#41及#81中观测到阿尼契柯氏(鹰眼形)核。
[0396] 经治疗Mck-Cre x FXN L3/L-：与未经治疗Mck突变小鼠相反，除在小鼠#47及#13中观测到极少阿尼契柯氏核以外，经rAAV-FXN治疗的Mck突变小鼠的心脏呈现正常。
[0397] 肾脏
[0398] 在所有三组中，常常在多个髓质小管的管腔中观测到显著矿化。矿化频率针对Mck阳性对照动物为4/4，针对未经治疗Mck突变动物为3/4，且针对经rAAV-FXN治疗的Mck突变动物为2/4。与Mck阳性对照组及未经治疗Mck突变组相比较，经rAAV-FXN治疗的Mck突变组中呈现矿化强度的降低。管状嗜碱性(再生)在2/4的Mck阳性对照小鼠中的动物中、在3/4的未经治疗Mck突变组中的动物中及在经rAAV-FXN治疗的Mck突变组中的1个动物中观测到。
[0399] 肝脏：在一个Mck阳性对照动物(#38)中观测到最小门静脉周发炎。
[0400] 肺脏：在一个未经治疗Mck突变动物(#41)中观测到轻微支气管周发炎。
[0401] 未观测到其他显著显微损伤。特别地，所有群组的脊髓、背根节及小脑均为正常的。
[0402] 组织学结果
[0403] 关于组织学，在未经治疗Mck突变小鼠的心肌细胞中观测到的鹰眼核、肿胀及液胞化均为心脏退化的标志。与巨噬细胞发炎相关联之间质纤维化可对应于心肌细胞死亡。因此，未经治疗Mck突变小鼠的心肌细胞退化，意指细胞经受下降的功能及演变至细胞死亡及后续心脏衰竭的病变。
[0404] 引人注目地，rAAV-FXN全身递送逆转此表型且经rAAV治疗的Mck突变小鼠(雄性及雌性两者)呈现正常且未显示显著的心肌细胞退化迹象。这些数据表明rAAV-huFXN转导足以逆转内源性小鼠Fxn基因不活化影响。因此，这些数据进一步使证明经rAAV修饰的FXN介导的全身施用可逆转和/或预防由有需要的受试者的降低水平的野生型(功能性)共济失调蛋白降低水平的减少介导的疾病、病症或病状，诸如(但不限于)，弗里德赖希共济失调。如先前所指出，拥有本发明的教导的本领域技术人员应理解，可将其他施用途径(例如，包括颅内及至心脏的更直接途径)用于向有需要的受试者提供治疗益处。
[0405] 对肾脏的分析识别为不常见损伤的未经治疗Mck阳性对照组及未经治疗Mck突变动物两者的髓质中的肾结石(其为不常见损伤)的存在。由于未向这些动物提议特定膳食且考虑到其年龄，病变的频率及强度强有力地表明此并非偶发损伤，而系与基因型相关的损伤。引人关注地，此损伤强度通过rAAV-FXN治疗部分地降低，其表明肾结石发展涉及Fxn功能和/或蛋白水平的改变。因此，所谓的L3等位基因(其中小鼠共济失调蛋白基因由loxP序列侧接(尽管在内含子区域中))可为减效等位基因。此应与维持经上皮电解质活性传输的这些细胞中的线粒体的关键作用一致。就申请人的知识及信念而言，到目前为止，这些病变尚未报告于弗里德赖希共济失调临床观测中，或报告于FRDA小鼠模型中。
[0406] 因此，本发明涵盖治疗或预防肾脏疾病、病症或病状的方法，包括(但不限于)：有需要的受试者罹患或生长肾结石，其中肾脏疾病、病症或病状由受试者的降低水平的共济失调蛋白(例如，功能性和/或野生型共济失调蛋白)介导。
[0407] 在一个实施方案中，本发明包括评定受试者的共济失调蛋白水平；将受试者的共济失调蛋白水平与已知未罹患肾结石的受试者的共济失调蛋白水平相比较和/或将共济失调蛋白水平与针对其他健康个体判定的或本领域中已知的“标准共济失调蛋白水平”相比较，及在受试者的共济失调蛋白水平低于其他健康个体的共济失调蛋白水平和/或低于标准共济失调蛋白水平时向该受试者施用经rAAV修饰的共济失调蛋白，藉此治疗和/或预防受试者的肾结石。
[0408] 最终，HA染色可用于检测细胞内的rAAV-FXN-HA。首先，定量应表达FXN以恢复或维持心脏功能的细胞的数目将为重要的。其次，并未预期在肾脏中表达Mck基因(且因此由Mck启动子驱动的Cre重组酶)。是否检测肾脏中的rAAV-FXN-HA可有助于阐明肾结石形成是否为对髓质内稳定的HA-FXN的未预期直接影响。
[0409] 结论
[0410] 总之，本文中呈现的数据表明施用(甚至全身性地)编码经修饰的FXN基因的rAAV可治疗(预防和/或逆转)与共济失调蛋白的减少或缺失相关联的影响。因此，数据证明介导共济失调蛋白在细胞及有需要的受试者中的表达的rAAV可为用以治疗与共济失调蛋白的缺少或缺乏相关联或由共济失调蛋白的缺少或缺乏介导的疾病或病症(诸如(但不限于)弗里德赖希共济失调)的有用疗法。
[0411] 尽管已参考不同申请、方法、试剂盒及组合物描述所公开的教导，但应了解，可在不脱离本文中的教导及下文所主张的本发明的情况下进行各种变化及修改。提供前述实施例以更好地说明本发明的教导，且不意欲限制本文中所呈现的教导的范畴。虽然已在这些例示性实施方案方面描述本发明教导，但本领域技术人员将容易理解在不过度实验情况下这些例示性实施方案的大量变化及修改为可能的。所有所述变化及修改均在本教导的范畴内。
[0412] 本文中所引用的全部参考文献(包括专利、专利申请、论文、课本及类似者)及其中引用的参考文献至其尚未引用的程度，在此以全文引用的方式并入本文中。在所并入文献及类似材料中的一个或多个(包括(但不限于)定义术语、术语用法、所述技术等)与本申请案不同或抵触的情况下，以本申请案为准。
[0413] 前述描述及实施例详述本发明的某些特定实施方案，且描述本发明人预期的最佳模式。然而，将了解，无论以文字呈现之前述内容如何详细，本发明可以许多方式实践，且本发明应根据所附申请专利范围及其任何等效物解释。
[0414] 表8序列
[0415]
[0416]
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[0418]
[0419]
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[0421]
[0422]
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[0439]
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[0441]
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