技术领域
[0001] 本
发明涉及一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，属于
生物检测技术领域。
背景技术
[0002] 胶原蛋白是人体内含量最高的
蛋白质，是细胞外基质的主要成分，它形成的分子
支架,为
皮肤、骨骼、肌
腱等结缔组织提供结构完整性和机械强度_ENREF_1。胶原蛋白具有非常特别的
氨基酸序列，它要求每三个氨基酸中必须有一个甘氨酸，形成Gly-X-Y的特征性的重复序列，其中X和Y
位置的氨基酸经常是脯氨酸和羟脯氨酸。正常结缔组织的胶原蛋白呈现独特的三重螺旋结构，三条肽链由于链间氢键的相互作用精密堆积在一起。在
肿瘤、关节炎等众多病理条件下，胶原蛋白分子的三重螺旋结构会被蛋白酶破坏，生成部分解折叠结构的变性胶原，影响胶原蛋白的正常生理功能。因此，变性胶原蛋白是众多重要
疾病的关键生物标记物，建立变性胶原蛋白的高效检测方法，对这些疾病的病理机制的解析和准确诊断至关重要。
[0003] 目前胶原蛋白的检测方法主要是组织
染色法，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。其它的方法包括胶原蛋白
抗体，衍生自胶原结合蛋白的肽，以及选自
噬菌体表达的肽。这些方法存在操作复杂、探针结合能
力弱、特异性不佳等
缺陷，同时，它们通常是对所有胶原蛋白的同时检测，包括具有三重螺旋结构的天然胶原和变性胶原。只有变性的胶原蛋白才是导致胶原相关疾病的关键因素，因此，亟需建立针对变性胶原蛋白的高特异性的检测方法。设计合成一种对变性胶原蛋白具有特异性结合能力的新型多肽探针，对癌症、心
血管疾病和器官
纤维化等众多疾病的检测与疗效评价具有重要意义。
发明内容
[0004] 鉴于此，本发明提供了一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法。本方法利用富含(Hyp-Hyp-Gly)n重复氨基酸序列的多肽对变性的胶原蛋白具有良好的结合能力,设计的一种新型多肽探针，
生物相容性好，特异性强，合成工艺简单，检测方便。该探针为癌症，心血管疾病和器官纤维化等重要疾病的分子
水平的诊断，提供了一种新的有潜力的检测方法。
[0005] 本发明的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其包括以下步骤：
[0006] (1)多肽探针的设计
[0007] 新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp-Hyp-Gly)n重复序列；②、多肽序列的特
定位置修饰发光物质；
[0008] (2)多肽探针的制备
[0009] 固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；
[0010] (3)体外组织成像
[0011] 在
组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用
荧光显微镜观察拍照；
[0012] (4)体内成像
[0013] 将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
[0014] 所述步骤(1)中多肽探针的序列为X-(Gly)m-(Hyp-Hyp-Gly)n(m为0-8之间的整数,n为4-20之间的整数)；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。
[0015] 所述步骤(1)中发光物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、
磷光分子、
半导体量子点、
碳量子点、
硅量子点、硫量子点、磷量子点、
钙钛矿量子点、上转化稀土
纳米材料、长余辉纳米材料中的一种或几种。所述发光物质连接在胶原多肽的N端。
[0016] 所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
[0017] a)将80-250mg的
树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0018] b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
[0019] c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
[0020] d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0021] e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽。显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
[0022] f)称取发光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，
混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；
[0023] g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的
质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；
[0024] h)向反应液加入
冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
[0025] 所述步骤(3)中组织切片为冰冻切片或
石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μL DAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
[0026] 所述步骤(3)中的组织切片，包括模型动物组织切片和病理组织切片。其中病理组织切片，可为良性肿瘤组织、
恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、
炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸
碱腐蚀组织、
辐射损伤组织等。
[0027] 所述步骤(4)中多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1X PBS中，实验活体包括小鼠、大鼠、斑
马鱼、猴等各种模型动物。
[0028] 本发明的有益效果是：
[0029] 1.富含(Hyp-Hyp-Gly)n序列的新型多肽探针，为变性胶原蛋白的诊断提供了新的方法；
[0030] 2.生物相容性好，特异性强；
[0031] 3.合成工艺简单，检测方便。
附图说明
[0032] 下面结合附图和
实施例1对本发明作进一步描述。
[0033] 图1为本发明(Gly-Hyp-Hyp)8-Gly的热变曲线及一阶导数图；
[0034] 图2为本发明的正常大鼠肌腱组织和去细胞化大鼠肌腱组织荧光染色显微镜图；
[0035] 图3为本发明的大鼠不同部位损伤组织的荧光显微镜图；
[0036] 图4为本发明的平滑肌瘤、肝纤维化、胃癌、直肠癌组织病理切片的荧光显微镜图。
[0037] 图5为本发明的食管癌、
乳腺癌、肝癌、
肺癌组织病理切片的荧光显微镜图。
具体实施方式
[0038] 以下将结合附图对本发明进行详细说明，如图1、2、3、4所示，本实施例的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其包括以下步骤：
[0039] (1)多肽探针的设计
[0040] 新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp-Hyp-Gly)n重复序列；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；
[0041] (2)多肽探针的制备
[0042] 固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；
[0043] (3)体外组织成像
[0044] 在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
[0045] (4)体内成像
[0046] 将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
[0047] 所述步骤(1)中多肽探针的序列为X-(Gly)m-(Hyp-Hyp-Gly)n(m为0-8之间的整数,n为4-20之间的整数)；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。
[0048] 所述步骤(1)中发光物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、
钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的一种或几种。所述发光物质连接在胶原多肽的N端。
[0049] 所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
[0050] a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0051] b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
[0052] c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
[0053] d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0054] e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽。显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
[0055] f)称取发光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；
[0056] g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；
[0057] h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
[0058] 所述步骤(3)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μL DAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
[0059] 所述步骤(3)中的组织切片，包括模型动物组织切片和病理组织切片。其中病理组织切片，可为良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织、辐射损伤组织等。
[0060] 所述步骤(4)中多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1X PBS中，实验活体包括小鼠、大鼠、斑马鱼、猴等各种模型动物。
[0061] 实施例1
[0062] (1)多肽探针的设计
[0063] 设计的多肽序列为FAM-Gly-(Hyp-Hyp-Gly)8，其中FAM为羧基荧光素；
[0064] (2)多肽探针的制备
[0065] 1.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0066] 2.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
[0067] 3.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
[0068] 4.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0069] 5.重复步骤3、4，直到合成目标序列的多肽Gly-(Hyp-Hyp-Gly)8。向反应器中加入FAM(10eq)和HBTU(10eq),向溶液中滴加DIEA(16eq),37℃反应20小时，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。
[0070] 6.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs。
[0071] 7.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后
风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
[0072] (3)体外组织成像
[0073] 大鼠肌腱组织冰冻切片上加0.5mL封闭液，放置30min后吸走液体。使用100μL 15μM探针溶液染色，4℃孵育2hrs。吸去染色液后，使用1x PBS洗涤3次，洗掉未结合探针。滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照，如图2所示。
[0074] 大鼠眼
角膜组织、膀胱组织、胃组织、肠组织、
耳朵组织和肾组织冰冻切片上加0.5mL封闭液，放置30min后吸走液体。使用100μL 15μM探针溶液染色，4℃孵育2hrs。吸去染色液后，使用1x PBS洗涤3次，洗掉未结合探针。滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照，如图3所示。
[0075] 病理组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照，如图4、图5所示。
[0076] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。
