繁殖用在移植中的间质干细胞（MSC）的方法
阅读：971发布：2022-01-25
专利汇可以提供繁殖用在移植中的间质干细胞（MSC）的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法，并且尤其是繁殖脂肪来源干细胞的方法，所述方法包括：在特定条件下，在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育从包含MSC的组织或器官得到的分离的细胞。本发明进一步涉及分离的细胞群体和用于进行该方法的 试剂 盒 。，下面是繁殖用在移植中的间质干细胞（MSC）的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
(a)从身体组织或器官分离细胞；以及
(b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集MSC的细胞群体。
2.一种用于繁殖脂肪来源干细胞(ASC)的方法，所述方法包括：
(a)从吸脂抽取物分离基质血管成分(SVF)细胞；以及
(b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集ASC的细胞群体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞凋亡诱导剂是TNF超家族配体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞凋亡诱导剂选自由Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子(TNF)α、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子样细胞凋亡微弱诱导剂(TWEAK)或它们的组合所组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生长培养基进一步包括额外的活性剂，所述额外的活性剂选自由生长因子、激素、细胞因子以及它们的任意组合所组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，用所述细胞凋亡诱导剂的所述孵育持续约3天、5天、7天、10天、14天、17天、20天或23天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，用所述细胞凋亡诱导剂的所述孵育持续14天。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中，所述含细胞凋亡诱导剂的培养基每3天或每4天被更新。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)之后，将所述分离的细胞在无细胞凋亡诱导剂条件下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天；随后用细胞凋亡诱导剂进行孵育。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL，并且其中，在用FasL孵育之前，用TNFα预孵育所述分离的细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述用TNFα预孵育进行1天至4天。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL，并且其中，FasL的浓度为约0.1ng/ml至约100ng/ml。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在用所述细胞凋亡诱导剂孵育之后，去除所述细胞凋亡诱导剂，并且使所述细胞分化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，使所述细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述分化的细胞移植入有需要的患者。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述细胞分化为脂肪组织、骨组织或软骨。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞分化为脂肪组织，并且其中，所述患者需要乳房修复。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞分化为骨组织，并且其中，所述患者需要骨科损伤治疗、骨重建或骨修复。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞分化为软骨组织，并且其中，所述患者需要软骨细胞移植、半月板治疗或关节软骨修复。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，所述患者需要整容手术。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，所述将所述分化的细胞移植用于治疗皮肤病症。
23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述将所述分化的细胞移植用于缓解或抑制患者中免疫相关的疾病。
24.根据权利要求16所述的方法，其中，所述患者经历器官移植或组织移植。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述器官移植选自由骨髓移植、肝移植、肾移植、血管移植或心脏移植所组成的组。
26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述免疫相关的疾病是移植物抗宿主病。
27.根据权利要求16所述的方法，其中，所述将所述分化的细胞移植用于治疗患者的中风或心力衰竭。
28.根据权利要求16所述的方法，其中，所述将所述分化的细胞移植用于治疗克罗恩病患者的肛门瘘或肛周瘘。
29.根据权利要求16所述的方法，其中，所述将所述分化的细胞移植用于血管修复。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞为同种异体的或自体的。
31.一种间质干细胞生长培养基，包括细胞培养基和细胞凋亡诱导剂。
32.根据权利要求31的间质干细胞生长培养基，进一步包括血清或血清替代品。
33.一种制造品，所述制造品包括：
a.容器，所述容器容纳间质干细胞生长培养基，其中，所述间质干细胞生长培养基包括细胞培养基和细胞凋亡诱导剂；以及
b.使用所述间质干细胞生长培养基体外繁殖间质干细胞的说明。
34.根据权利要求33所述的制造品，其中，所述间质干细胞为脂肪来源干细胞。
35.根据权利要求33所述的制造品，其中，所述间质干细胞生长培养基进一步包括血清或血清替代品。
36.一种通过权利要求1至30中任一项所述的方法得到的富集的细胞群体。
37.根据权利要求36所述的富集的细胞群体用于在移植手术中进入有需要的患者。
繁殖用在移植中的间质干细胞(MSC)的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞移植领域，并且具体地，本发明提供一种体外繁殖间质干细胞的方法。
背景技术
[0002] 以下列出了被认为与本公开的主题背景相关的文献：
[0003] [1]Bunnell,B.A.et al.(2008)Methods 45(2):115-120.
[0004] [2]Shoshani,O.et al.(2015)RNA and Disease 2:e780.
[0005] [3]Ikebe,C.and Suzuki,K.(2014)BioMed Research International Article ID 51512.
[0006] [4]Ma,S.et al.(2014)Cell Death and Differentiation 21:216-225.[0007] [5]WO 2007/138597.
[0008] [6]Rippo,M.R.et al.(2013)Cell Death and Disease 4:e594.
[0009] [7]Funcke,J.B.et al.(2015)FASEB J.29:3065-3075.
[0010] [8]US 5,851,832.
[0011] [9]US 2002/0098166.
[0012] [10]Dominici,M.et al.(2006)Cytotherapy 8(4):315–317.
[0013] [11]Schreml et al.(2009)Cytotherapy 11(7):947-57.
[0014] [12]Yoshimura et al.(2006)J.of Cellular Physiology 208:64-76.
[0015] [13]Mark,P.et al.Stem Cells International Volume 2013(2013),Article ID 698076,8pages.
[0016] [14]Anderson,P.et al.(2016)PLOS ONE 8(10):e76979.
[0018] 间质干细胞(MSC)是多能祖细胞，其能分化为多种特定细胞类型，包括脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。MSC存留于成人组织中并且保留广泛的分化潜能(1)。
[0020] 同种异体或自体的MSC可用于治疗各种疾病，包括移植物抗宿主病、血液系统恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、器官移植，以及骨或软骨疾病(3)。此外，MSC可用在整容应用或整形手术中。
[0021] 因此，期望建立用于MSC分离和扩增的方案以得到用于进一步临床使用的富集的细胞群体。可以体外扩增从各种组织分离的MSC，同时保持它们分化为特定细胞谱系的潜能(4)。TNF超家族成员介导半胱天冬酶活化的途径，并且从而经由直接或间接机制介导细胞凋亡。促凋亡TNF超家族调节因子尤其包括TNFα、TNFβ、Fas、Fas-配体、TNF-相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和肿瘤坏死因子样细胞凋亡微弱诱导剂(TWEAK)。
[0022] 公开WO 2007/138597(5)涉及通过使从骨髓中分离的异质细胞群体与促细胞凋亡剂接触来从该细胞群体中选择干细胞的方法。Rippo等人(6)报道了低Fas-配体(FasL)水平促进源自于人类骨髓的MSC的增殖，而较高水平抑制它们分化为脂肪细胞。该作者总结了FasL/Fas体系在骨髓MSC生物学中的作用，并且可能在骨质疏松症中具有临床意义。Funcke等人(7)报道了TRAIL通过ERK1/2活化促进人类前脂肪细胞增殖，并且提出了TRAIL在调节脂肪组织体内稳态中的作用。
发明内容
[0023] 在第一方面，本发明提供了一种用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
[0024] (a)从身体组织或器官分离细胞；以及
[0025] (b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集MSC的细胞群体。
[0026] 在某些实施方式中，本发明的方法在体外进行。
[0027] 在某些实施方式中，本发明的方法用分离的细胞进行，并且并不涉及步骤(a)。
[0028] 在另一方面，本发明提供了一种用于繁殖脂肪来源干细胞(ASC)的方法，所述方法包括：
[0029] (a)从吸脂抽取物分离基质血管成分(SVF)细胞；以及
[0030] (b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集ASC的细胞群体。
[0031] 在某些实施方式中，MSC或ASC用在移植中。
[0032] 在某些实施方式中，所述细胞凋亡诱导剂是TNF超家族配体。
[0033] 在某些实施方式中，所述细胞凋亡诱导剂选自由Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子(TNF)α、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、肿瘤坏死因子样细胞凋亡微弱诱导剂(TWEAK)以及它们的组合所组成的组。
[0034] 在特定实施方式中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL。
[0035] 在某些实施方式中，所述生长培养基进一步包括额外的活性剂，所述额外的活性剂选自由生长因子、激素、细胞因子以及它们的任意组合所组成的组。
[0036] 在其它实施方式中，除细胞凋亡诱导剂之外，所述生长培养基不包括额外的活性剂。
[0037] 在一个实施方式中，用所述细胞凋亡诱导剂的所述孵育持续约3天至约23天。在某些实施方式中，用所述细胞凋亡诱导剂的所述孵育持续3天、5天、7天、10天、14天、17天、20天或23天。
[0038] 在一特定实施方式中，用所述细胞凋亡诱导剂的所述孵育持续14天。
[0039] 在一个实施方式中，所述含细胞凋亡诱导剂的培养基每3天或每4天被更新。
[0040] 在某个实施方式中，在分离细胞(上述方法的步骤(a))之后，将所述分离的细胞在无细胞凋亡诱导剂下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天；随后用细胞凋亡诱导剂进行孵育。
[0041] 在一个实施方式中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL，并且在用FasL孵育之前，用TNFα预孵育所述分离的细胞。
[0042] 在一个实施方式中，所述用TNFα预孵育进行1天至4天。
[0043] 在一个实施方式中，所述细胞凋亡诱导剂为FasL，并且FasL的浓度为约0.1ng/ml至约100ng/ml。
[0044] 在一个实施方式中，在用所述细胞凋亡诱导剂孵育之后，去除所述细胞凋亡诱导剂，并且使所述细胞分化。
[0045] 在某些实施方式中，使所述细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞。具体地，在适用于特定谱系分化的培养基和试剂存在下孵育所述细胞。
[0046] 在一个实施方式中，本发明的方法进一步包括将所述分化的细胞移植入有需要的患者。
[0047] 在一个实施方式中，所述细胞分化为脂肪组织、骨组织或软骨。
[0048] 在一特定实施方式中，所述细胞分化为脂肪组织，并且所述患者需要乳房修复。
[0049] 在另一特定实施方式中，所述细胞分化为骨组织，并且所述患者需要骨科损伤治疗、骨重建或骨修复。
[0050] 在另一特定实施方式中，所述细胞分化成软骨组织，并且所述患者需要软骨细胞移植、半月板治疗或关节软骨修复。
[0051] 在一个实施方式中，所述患者需要整容手术。
[0052] 在另一实施方式中，所述将所述分化的细胞移植用于治疗皮肤病症。
[0053] 在另一实施方式中，所述将所述分化的细胞移植用于缓解或抑制患者中免疫相关的疾病。在一特定实施方式中，所述患者经历器官移植或组织移植。
[0054] 在一个实施方式中，所述器官移植选自由骨髓移植、肝移植、肾移植、血管移植或心脏移植所组成的组。
[0055] 在一个实施方式中，所述免疫相关的疾病是移植物抗宿主病(GvHD)。
[0057] 在另一实施方式中，所述将所述分化的细胞移植用于治疗克罗恩病患者的肛门瘘或肛周瘘。
[0058] 在另一实施方式中，所述将所述分化的细胞移植用于血管修复。
[0059] 在某些实施方式中，所述细胞为同种异体的或自体的。
[0060] 在另一方面，本发明提供了一种间质干细胞生长培养基，包括细胞培养基和细胞凋亡诱导剂。
[0061] 在又一方面，本发明提供了一种制造品，所述制造品包括：
[0062] a.容器，所述容器容纳间质干细胞生长培养基，其中，所述间质干细胞生长培养基包括细胞培养基和细胞凋亡诱导剂；以及
[0063] b.使用所述间质干细胞生长培养基体外繁殖间质干细胞的说明。
[0064] 在一特定实施方式中，所述间质干细胞为脂肪来源干细胞。
[0065] 在一实施方式中，所述间质干细胞生长培养基进一步包括血清或血清替代品。
[0066] 在另一方面中，本发明提供一种通过本发明的方法得到的富集的细胞群体。
[0068] 为了更好地理解本文公开的主题并且示例出在实践中如何实施，现参见附图，仅通过非限制性实例的方法对实施方式进行描述，其中：
[0069] 图1示出了经20ng/ml FasL孵育后细胞产率变化的柱状图。该数据显示为与未暴露在FasL中的对照细胞相比，用FasL孵育的细胞的倍数变化。数据示出了在细胞一次、二次或三次传代(P1、P2、P3)后的结果。
[0070] 图2为示出了在含FasL的培养基处理14天后收集的漂浮SVF细胞的荧光染色的示意图。细胞用别藻蓝蛋白(APC)膜联蛋白V(在横轴上示出)和藻红蛋白(PE)PI(在纵轴上示出)染色，并且使用流式细胞仪测量荧光。Unst细胞—未染色的。
[0071] 图3A为示出了不用FasL(对照)或用FasL培养的荧光染色的MSC的百分比。染色用流式细胞仪进行分析。图3B和图3C为示出了不用FasL(对照)[图3B]或用FasL[图3C]培养的MSC的荧光染色的示意图。细胞用针对CD105的抗体(在横轴上示出)和针对CD73的抗体(在纵轴上示出)进行染色。将细胞分成表达高CD73或表达低CD73的细胞。
[0072] 图4A为示出了大集落的照片。图4B为示出了小集落的照片。图4C为示出了具有未处理的SVF细胞(对照，上部)、用FasL处理二十天(“长期处理”、中部)或者用FasL处理3天(“短期处理”、下部)的板的照片。图4D为示出了大集落数目的图。图4E为示出了小集落数目的图。图4F为示出了集落总数的图。
[0073] 图5为示出了茜素红染色的用成骨培养基培养生长的MSC的图。细胞在之前已暴露至FasL，或者未暴露至FasL(对照)。P<0.01，重复实验三次。下部的照片示出了在茜素红染色的培养物中分化的成骨细胞；左边照片—对照，细胞在无FasL下生长，右边照片—细胞在FasL的存在下生长。
[0074] 图6为示出了油红O染色的在含脂肪形成培养基的培养物中生长的MSC。细胞在之前已暴露至FasL，或者未暴露至FasL(对照)。P＝0.419，重复实验三次。下部的照片示出了在油红O染色的培养物中分化的脂肪细胞；左边照片—对照，细胞在无FasL下生长，右边照片—细胞在FasL的存在下生长。
[0075] 图7为示出了在间质干细胞(MSC)的存在下生长的活化的小鼠脾细胞的培养基中，干扰素γ(IFNγ)的量(IFNγpg/ml)的图。MSC在之前已暴露至FasL，或者未暴露至FasL(对照)。
具体实施方式
[0076] 本发明基于以下令人惊讶的观察结果：与未用FasL孵育的细胞相比，从吸脂抽取物中分离的且在Fas-配体(FasL)的存在下体外培养的基质血管成分(SVF)细胞迅速地增殖，相对快速地在培养物中达到细胞覆盖，并且产生较高数目的集落形成单位(CFU)，尤其是大CFU(即，含更多细胞的CFU)。
[0077] 因此，尽管培养的时间相对较短，但是仍可假定这些细胞具有高分化能力。
[0078] 因此，本发明人开发了一种用于在分化前繁殖来自组织的人类间质干细胞的方法，并且随后以快速且可靠的方式培养扩增该间质干细胞以产生准备好分化为所需分化细胞的大量细胞。
[0079] 因此，本发明提供了一种用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
[0080] (a)从身体组织或器官分离细胞；以及
[0081] (b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集MSC的细胞群体。
[0082] 本发明方法的目的在于在短时间内极大地增加间质干细胞的数量，使它们能够分化且由此得到适用于移植且用于各种治疗适应症(包括再生治疗)的细胞群体。
[0083] 因此，本发明提供了一种用于繁殖在移植中使用的间质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：
[0084] (a)从身体组织或器官分离细胞；以及
[0085] (b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集MSC的细胞群体。
[0086] 如本领域所已知的，术语“间质干细胞”(MSC)是指能够分化成各种细胞类型的多能基质细胞。国际细胞治疗协会最近将MSC限定为具有以下特征：(1)在保持在标准培养条件下时，具有塑性粘附；(2)表达CD105、CD73和CD90，而不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19，以及HLA-DR表面分子。第三，MSC在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞(10)。用于分离、纯化和扩增培养物中人类间质干细胞的方法是本领域所已知的，例如参见主要涉及从骨髓中分离间质干细胞的U.S.专利No.5486359。
[0087] 骨髓是占据长骨的骨髓腔、一些哈弗斯管、松质骨或海绵骨的骨小梁间空间的软组织。研究表明骨髓含有具有分化为软骨、骨或其它结缔组织细胞的能力的细胞(Beresford,J.N.:Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow,Clin.Orthop.240:270,1989)。被称为多能基质干细胞或间质干细胞的这些细胞具有通过活化而分化成数种不同类型细胞系(即，骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等)的能力。然而，间质干细胞以极低量与各种各样的其它细胞(即，红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞等)一起存在于组织中。
[0088] 如本文中所使用的，术语“身体组织或器官”是指受试者身体中含有间质干细胞的任何组织或器官，包括但不限于脂肪组织、外周血、骨髓、牙髓、羊水、羊膜、绒毛膜、绒膜绒毛(chorion villi)、蜕膜、胎盘、脐带、脐带血、华通氏胶。
[0090] 在某些实施方式中，本发明提供了一种繁殖间质干细胞(MSC)的方法，该方法包括在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中体外孵育分离的细胞至少3天，其中，所述细胞从身体组织或器官中得到，从而得到富集MSC的细胞群体。
[0091] 在一个实施方式中，本发明的间质干细胞是脂肪来源干细胞。
[0092] 因此，在一特定实施方式中，本发明提供一种用于繁殖脂肪来源干细胞(ASC)的方法，所述方法包括：
[0093] (a)从吸脂抽取物分离SVF细胞；以及
[0094] (b)在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育在(a)中得到的分离的细胞至少3天，从而得到富集ASC的细胞群体。
[0095] 可选地，所述分离步骤(a)包括暴露至使组织分解(也称为胶原酶消化)的蛋白水解酶(例如，胶原酶，如胶原酶型I)或蛋白水解酶的混合物中。用于进行细胞的胶原酶消化的方案是本领域所熟知的，并且用于进行胶原酶消化的数种化合物是可商购的(例如，Cytori Therapeutics的 GMP)。胶原酶型I可以以0.1％至0.3％来添加。可选地，可将中性蛋白酶(例如，Dispase II)添加至消化反应中。例如，如在下文实施例中所示，可以0.375mg/ml的浓度加入胶原酶，在37℃、搅拌下持续60分钟。如本文所使用的，术语“繁殖”是指从身体组织或器官，例如从吸脂抽取物分离的间质干细胞的数目在体外的扩增、增加、增殖或提高。
[0096] 术语“脂肪来源干细胞(ASC)”和“脂肪来源间质干细胞(MSC)”在本文中互换使用，并且涉及从脂肪组织分离的MSC。
[0097] 如本文中所使用的，“脂肪组织”是指主要由脂肪细胞组成的结缔组织。除了脂肪细胞之外，脂肪组织包括以下基质血管成分(SVF)的细胞：前脂肪细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、多种免疫细胞(诸如脂肪组织噬细胞)、干细胞和内皮前体细胞。
[0098] 如本文中所使用的，术语“基质血管成分(SVF)”涉及脂肪组织的制备，其中，脂肪组织是前脂肪细胞、间质干细胞(MSC)、内皮祖细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞以及脂肪组织巨噬细胞的丰富来源。
[0099] 用于分离脂肪来源的干细胞以及从吸脂抽取物分离SVF细胞的方法是本领域所已知的(1，11-12)。例如，脂肪组织可通过抽吸辅助的吸脂术、超声波辅助的吸脂术和脂肪切除术或它们的组合来从患者中移除。组织提取应当以无菌或灭菌方式来进行。
[0100] 对于抽吸辅助的吸脂术过程，通过将套管插入至患者内存在的脂肪组织库(depot)中或插入到患者内存在的脂肪组织库附近，随后将脂肪组织抽取到抽吸装置中来收集脂肪组织。与注射器相连的小套管可适用于收获相对适量的脂肪组织(例如，0.1ml至几百毫升)。如果需要大量的组织，则可在手术中采用更大的套管和自动抽吸装置。
[0101] 在下文的实施例部分中，提供了从吸脂抽取物分离脂肪来源干细胞或SVF细胞的示例性方案。
[0102] 如本文中所使用的，术语“细胞凋亡诱导剂”(也定义为“促凋亡剂”)是指能够促进程序性细胞死亡的药剂(例如，化学品或多肽)。可用在本发明中的示例性细胞凋亡诱导剂包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)超家族配体。
[0103] 目前有超过40种不同的配体-受体系统被认为属于TNF超家族。属于TNF超家族且可用在本发明中的示例性细胞凋亡诱导剂包括但不限于Fas配体(FasL)、TNFα、Trail(Apo2配体)和Tweak(Apo3配体)。这种TNF超家族细胞凋亡诱导剂可为生化合成或从细胞提取物中纯化的重组多肽。它们可以以单体、二聚体或多聚体的形式来应用。
[0104] 因此，在一些实施方式中，根据本发明的细胞凋亡诱导剂为TNF超家族配体。在另一实施方式中，细胞凋亡诱导剂选自由FasL、TNFα、TRAIL和TWEAK所组成的组。
[0105] 在一特定实施方式中，细胞凋亡诱导剂为FasL。用在本发明中的FasL的非限制性实例包括超级FasL(superFasL)、APO010或MegaFasL(R&D)，所有的这些为FasL的六聚体。FasL的六聚体形式的活性是三聚体形式的100倍。FasL的其它形式，诸如Fc-FasL或FasL单体也涵盖在本发明中。
[0106] 培养基中细胞凋亡诱导剂的浓度为约1ng/ml至约100ng/ml w/v，例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml w/v的细胞凋亡诱导剂。在细胞凋亡诱导剂为FasL的特定实施方式中，培养基包括约1ng/ml至约100ng/ml w/v的FasL，例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml w/v的FasL。
[0107] 如上所述，用于繁殖间质干细胞(MSC)的方法包括在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育从身体组织或器官分离的细胞指定的时段。如本领域所已知的，术语“孵育”是指使细胞在细胞培养箱中于恰当的温度和气体混合物(典型地，对于哺乳动物细胞，37℃，5％CO2)下生长并保持。如在本发明的上下文中，“在含细胞凋亡诱导剂的生长培养基中孵育分离的细胞”是指使分离的细胞与细胞凋亡诱导剂接触。
[0108] 在一些实施方式中，根据本发明的方法为用细胞凋亡诱导剂孵育至少3天，即，3天或更多天。在一特定实施方式中，孵育约3天至约23天，具体地，孵育约3天、5天、7天、10天、14天、17天、20天或23天。
[0109] 在其它实施方式中，用细胞凋亡诱导剂孵育14天，且在一特定实施方式中，细胞凋亡诱导剂为FasL，并且用FasL孵育该分离的细胞14天，其中，培养基每3至4天被更新。在一特定实施方式中，FasL以50ng/ml的量来提供。
[0110] 在一些实施方式中，含细胞凋亡诱导剂的培养基每3天或每4天被更新，即，用具有相同含量的新鲜培养基来更换。
[0111] 在一些实施方式中，在细胞分离1至7天后开始用FasL孵育。在特定实施方式中，根据本发明的方法是在步骤(a)之后，将分离的细胞在无细胞凋亡诱导剂下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，随后用细胞凋亡诱导剂孵育。
[0112] 在一特定实施方式中，在细胞分离3天后开始用FasL孵育。即，根据该实施方式，在分离后，用不含FasL的培养基孵育细胞3天。
[0113] 在一个实施方式中，在用FasL孵育之前，用可例如通过增加Fas的表达来影响对FasL细胞应答(即，使细胞对其作用敏感)的分子预孵育分离的细胞。TNFα是这种致敏分子的实例。
[0114] 因此，在一些实施方式中，根据本发明的方法中，细胞凋亡诱导剂为FasL，且在用FasL孵育之前，用TNFα预孵育分离的细胞。在又一特定实施方式中，用TNFα预孵育1天至4天。
[0115] 在一些实施方式中，根据本发明的方法中，细胞凋亡诱导剂为FasL，并且FasL的浓度为约0.1ng/ml至约100ng/ml。
[0116] 在某些实施方式中，除了至少一种细胞凋亡诱导剂之外，用额外的活性剂孵育细胞，该额外的活性剂选自由生长因子、激素、细胞因子以及它们的任何组合所组成的组。在一特定非限制性实例中，可用死亡受体3(DR3，也被称为TNFRSF25)的一种或多种拮抗剂来孵育细胞。这种拮抗剂包括但不限于抗DR3抗体，其可例如商购自abcam、R&D Systems和其它供应商。
[0117] 如下文实施例中所示，与未经处理的细胞相比，用Fas-配体处理14天使CD31-/CD34+细胞的百分比增加。此外，用Fas-配体处理导致CD29+/CD105+转变为CD29+/CD105-。
[0118] 如本领域所已知的，术语CD34是指细胞表面糖蛋白中的分化抗原簇且起着细胞-细胞附着因子的作用。其还可介导干细胞对骨髓细胞外基质或直接对基质细胞的附着。通常在脐带和骨髓中发现作为祖细胞、基质干细胞的亚单位、内皮祖细胞等表达表面糖蛋白34的细胞(CD34+细胞)。如果CD34+细胞不表达正常存在于内皮细胞、血小板、巨噬细胞和枯否细胞、粒细胞、T/NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性粒细胞中的CD31(即，CD31-细胞)，则被认为是较低分化的细胞。
[0119] 如本领域所已知的，术语CD105(内皮糖蛋白)是指在血管生成内皮细胞中丰富表达的增殖相关且缺氧诱导的蛋白。据报道，人类间质干细胞在无血清培养基中培养后，表现出CD105表达的降低，并且在这些细胞中CD29的表达较高(13)。此外，据报道，与CD105+ASC相比，CD105-鼠ASC具有分化成脂肪细胞和骨细胞更高的能力且体外更好地抑制T细胞增殖(14)。
[0120] 因此，不希望受理论的束缚，用细胞凋亡诱导剂孵育引起细胞群体朝向较低分化状态转变并且使它们的“干性(stemness)”增加。
[0121] 如上所述，本发明提供了用于繁殖用在如本发明所限定的移植中的间质干细胞(MSC)的方法，从而得到富集MSC的细胞群体。如本文所使用的，术语“富集”是指使细胞群体中MSC的相对数目增多、增加或提高为至少细胞群体的约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。
[0122] 在用细胞凋亡诱导剂完成孵育期后，将繁殖的细胞从培养物中移除并重新接种，且现在可根据培养条件分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、成纤维细胞或肌细胞中的任何一种。用于分化成每种所需细胞类型的条件是本领域所熟知的，且包括在含特定试剂的培养基中孵育细胞。
[0123] 因此，在一些实施方式中，根据本发明的方法中，在用细胞凋亡诱导剂孵育之后，移除所述细胞凋亡诱导剂，并且使所述细胞分化。在其它特定实施方式中，使细胞分化成脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞，且在本发明中称为“分化细胞”。
[0124] 如本文中所使用的，术语“使分化”是指在适用于分化成任何所需细胞类型的条件下孵育细胞。这种条件是本领域所熟知的且尤其包括在含特定类型试剂的培养基中进行孵育。
[0125] 例如，间质干细胞脂肪形成培养基含有使间质干细胞易于分化为脂肪形成谱系的试剂(即，地塞米松、IBMX、胰岛素和吲哚美辛)。这种培养基是可商购的，例如Lonza的hMSC脂肪形成分化BulletKitTM培养基或干细胞科技的MesenCultTM脂肪形成分化培养基。随后通过提供与脂肪形成分化相关的定量值的各种方法来验证向脂肪细胞的分化。可使用其它培养基来诱导向其它细胞类型的分化(例如，间质干细胞软骨形成分化培养基、间质干细胞成骨分化培养基或间质干细胞神经分化培养基(Promocell))。繁殖的ASC也可转分化为除它们自身之外的生殖性来源的细胞，例如，心肌生成转分化、内皮(血管)转分化、胰腺(内分泌)转分化、神经原性转分化和肝脏转分化，同时支持造血功能。
[0126] 在又一实施方式中，根据本发明的方法进一步包括将分化的细胞移植到有需要的患者中。
[0127] 如本文中所使用的，术语“有需要的患者”是指患有通过移植分化细胞可减轻、治愈、治疗的疾病且使其症状缓解的受试者。
[0128] 因此，分化细胞可用于大量临床应用以及整容应用和整形手术中的移植，例如，目前处于III/IV期临床试验的下列适应症中：乳房重建(恢复)、卵巢功能早衰、复杂肛周瘘、肛瘘和克罗恩氏病。ASC也可用于细胞库。额外的应用包括皮肤再生、皮肤病症、肝再生、肌肉再生、血管修复、骨科损伤治疗、骨重建或骨修复、软骨移植、半月板治疗或关节软骨修复，以及骨质疏松症治疗。
[0129] 本发明的分化细胞也可用于免疫治疗。例如，在经受伴随器官转移(例如，骨髓移植、肝移植、肾移植、血管移植或心脏移植)的患者中用于缓解移植物抗宿主病(GvHD)。在其它实施方式中，根据本发明的分化细胞可用于治疗中风或心力衰竭。
[0130] 移植可为同种异体的或自体的。
[0131] 如本文所限定的，术语“移植”是指通过手术或注射将分化细胞转移至有需要的患者中。供体和受体可为同一个体或不同的个体。这分别是移植物为自体或同种异体的情况。当实施同种异体移植时，应当采取降低植入物排异的措施。这种措施目前在人类治疗中实施且是本领域所熟知的。
[0132] 以下是间质源细胞用作补充器官缺失或损伤细胞的外源细胞的实例：U.S.专利No.5,736,396描述了将培养扩增谱系诱导的间质干细胞引入到原始自体宿主中，用于间质组织再生或修复。
[0134] 可利用本领域已知的任何技术并且基于患者治疗适应症根据医师判断来进行分化细胞的移植。例如，可在组织缺陷(例如，骨骼缺陷)位点注射分化细胞，或者用生物相容性支架或基质体外孵育分化细胞，并且在缺失位点植入该支架。
[0135] 本发明的分化细胞也可用于基因疗法。对于成功的长期基因疗法，需要高频率的稳定表面所需外源基因的遗传修饰细胞。因此，本发明的分化细胞可被修饰为表达基因产物。
[0136] 如本文中所使用的，术语“基因产物”是指蛋白、肽或功能性RNA分子(即，多核苷酸)。这些基因产物的实例包括胰岛素，淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶，核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，三酰甘油脂肪酶，弹性蛋白酶，淀粉酶，凝血因子(诸如，凝血因子VIII和因子IX)，UDP葡萄糖醛酸基转移酶，鸟氨酸转氨酶，和细胞色素p450酶，以及腺苷脱氨酶，用于血清腺苷的处理或低密度脂蛋白的内吞作用，血清胸腺因子，胸腺体液因子，促胸腺生成素，胃泌素，促胰液素，胆囊收缩素，生长激素抑制素，血清素和物质P。
[0137] 在另一方面中，本发明提供了含细胞培养培养基和细胞凋亡诱导剂的间质干细胞生长培养基。
[0138] 如本文中所限定的，“细胞培养基”或“生长培养基”是指设计用于支持细胞生长的液体或凝胶。不同类型的培养基可用于不同类型细胞的生长。细胞培养培养基的实例涵盖杜氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)以及其变型，F10营养混合物，Ham's F12营养混合物，最小基本培养基(MEM)，RPMI培养基1640和伊氏改良的杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)。
[0139] 所有这些培养基是熟知且可商购的。例如，DMEM通常包括氨基酸、无机盐、葡萄糖、酚红、Hepes丙酮酸钠和维生素。培养基通常补充有抗生素/抗真菌剂，诸如青霉素、链霉素和两性霉素B。培养基可含有不同的葡萄糖含量。在一个实施方式中，培养基具有高葡萄糖含量，例如Gibco的高葡萄糖DMEM。
[0140] 细胞培养基可进一步包括血清。
[0141] 在本发明的上下文中，术语“血清(serum)”或“血清(sera)”是指添加至细胞培养培养基中的补充物，用于提供广谱大分子，用于脂质物质和微量元素的载体蛋白，附着和扩散因子，低分子量营养素，以及激素和生长因子。典型地，血清从哺乳动物血液制剂中分离得到。适用于本发明的血清的非限制性实例为胎小牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS)。也可使用血清替代品。术语“血清替代品”是指含在培养中支持细胞生长所需蛋白的血清代替物，例如血清替代品可包括纯化的(优选热处理的)血清白蛋白、转铁蛋白和胰岛素。这些蛋白可为任何来源的，它们可例如为哺乳动物蛋白，例如牛血清白蛋白、转铁蛋白和胰岛素。这些血清替代品是可商购的，例如来自Sigma-Aldrich。培养基中的血清浓度为用于细胞生长常规所用的范围，即，约1％至约20％。在一具体实施方式中，血清的浓度为约10％(v/v)。在又一具体实施方式中，培养基包括10％FCS或FBS，如，HycloneTM胎牛血清。
[0142] 在间质干细胞生长培养基中所使用的细胞凋亡诱导剂如本文所限定，即，能够促进程序性细胞死亡的试剂。如上所述，可使用的示例性细胞凋亡诱导剂包括但不限于，肿瘤坏死因子(TNF)超家族配体，例如，FasL、TNFα、Trail(Apo2配体)和Tweak(Apo3配体)。培养基中细胞凋亡诱导剂的浓度为约1ng/ml至约100ng/ml w/v，例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml w/v的细胞凋亡诱导剂。在一特定实施方式中，细胞凋亡诱导剂为FasL。在另一特定实施方式中，培养基包括约1ng/ml至约100ng/ml w/v的FasL，例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml w/v的FasL
[0143] 本发明的间质干细胞生长培养基可进一步包括适用于细胞生长的额外组分，包括但不限于生长因子、细胞因子、抗体和载体。
[0144] 本发明的间质干细胞生长培养基可在4℃下制备且储存直至使用，并且在使用前升温至37℃。在又一方面中，本发明提供了一种制造品，所述制造品包括：
[0145] a.容器，所述容器容纳间质干细胞生长培养基，其中，所述间质干细胞生长培养基包括细胞培养基和细胞凋亡诱导剂；以及
[0146] b.使用所述间质干细胞生长培养基体外繁殖间质干细胞的说明。
[0147] 在又一实施方式中，所述生长培养基进一步包括血清或血清替代品。
[0148] 如本文中所限定的，术语“容器”是指容器、袋、杯、瓶、碗、箱、生物反应器、罐、烧瓶或可用于容纳且储存如本文所限定的间质干细胞生长培养基的小瓶。
[0149] 如本文所使用的术语“约”是指可以偏离所提及的值的至多1％，更尤其是高于5％，更尤其10％，更尤其15％，且在一些情况下高至20％大于或小于所提及的值，偏离范围包括整数值，且如果适用，也可偏离非整数值，构成连续范围。
[0150] 实施例
[0151] 无需进一步详述，据认为，本领域技术人员能够通过上文描述来最大程度地利用本发明。因此，以下优选的具体实施方式应被解释为仅仅为说明性的，并不以任何方式对本发明产生限制。
[0152] 本文中未具体描述的本领域已知的标准分子生物学方案通常按照基本如Sambrook&Russell,2001来进行。
[0153] 本文中未具体描述的本领域已知的标准药物化学方法通常按照基本如由Pergamon出版社的多个作者和编辑者的系列“Comprehensive Medicinal Chemistry”来进行。
[0154] 实验方案
[0155] 吸脂抽取物
[0156] 在知情同意之后，根据Yoshimura,K.等人.2006,J Cellular physiology 208:64-76的详细描述，利用IRB-改善的方案从肥胖或之前肥胖的供体得到吸脂抽取物。吸脂抽取物主要包括生理盐水、血液和脂肪组织碎片。
[0157] 通过以1200rpm离心5分钟来将吸脂抽取物分离成两部分：脂肪浮动的脂肪部分(也称为“脂肪组织提取物”)以及流体部分。将脂肪部分吸入到干净的管中。从脂肪部分分离的细胞被称为“经处理的脂肪组织提取物细胞”(PLA，60万细胞/1ml脂肪组织抽吸物)并且从流体部分分离的细胞被称为“吸脂抽取液细胞”(LAF，6万细胞/1ml脂肪组织抽取物)。
[0158] 从经处理的脂肪组织提取细胞得到基质血管成分细胞
[0159] 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤从脂肪部分分离的细胞(PLA细胞)，并且以1200rpm离心5分钟。重悬细胞并在37℃、搅拌下用胶原酶(0.375mg/ml，Sigma Aldrich)消化60分钟。随后，通过加入10％的胎小牛血清(FCS)来中和胶原酶，并且通过在1400rpm下进一步离心15分钟的步骤来从脂肪和脂肪细胞中分离出基质血管成分(SVF)细胞。接下来，计数SVF细胞，并且以每6cm平皿2×105细胞的密度或以6孔板中每孔2×105细胞的密度铺板。
[0160] 在FasL存在下的细胞繁殖
[0161] 在细胞培养箱中，于37℃、5％CO2下，且在下文所述的条件下于Fas-配体的存在下孵育从不同供体得到的不同脂肪组织提取物(脂肪部分)分离的SVF细胞若干次。示例性的孵育方案包括：在八个板上接种细胞，其中四个板用补充有10％FCS和50ng/ml的Fas-配体(Enzo life sciences)的杜氏改良的伊格尔培养基(DMEM)来孵育，而四个板用补充有10％FCS的DMEM来孵育(作为对照)。
[0162] 或者，用SVF细胞接种六个孔。在这种情况下，三个孔用补充有10％FCS和50ng/ml的Fas-配体的DMEM来孵育，而三个孔用补充有10％FCS的DMEM来孵育(作为对照)。
[0163] 每72小时，同时更换对照组和处理组中的培养基。在接种后14天，当处理板和未处理板均达到细胞覆盖状态时，通过胰蛋白酶从板上移除细胞，并且用自动细胞计数器进行计数。每个板/孔独立地计数。用额外的参数，例如活细胞和死细胞的数目以及集落形成单位的大小和数目来评估测试的细胞。如下所详述的，利用流式细胞术检查细胞的表面分子表达。
[0164] 同样，在如上所述的Fas-配体的存在下对从不同供体得到的不同脂肪组织提取物(脂肪部分)分离的SVF细胞较短的时段的孵育，即，接种后(0h)持续72小时(直至第一次更换培养基)。
[0165] 流式细胞术
[0166] 对于FACS(荧光激活细胞分选仪)分析，将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并重新5
悬浮在PBS中。将细胞分装在FACS管(1×10 细胞/管)中，并用ViViD胺反应性染料(LIVE/可固定紫色死细胞染色)进行染色，对1.5μl/样品在37℃下于黑暗中染色30分钟。
在洗涤后，用6-色板在37℃下于黑暗中孵育细胞30分钟，其中6-色板含有：
悬浮在PBS中。将细胞分装在FACS管(1×10 细胞/管)中，并用ViViD胺反应性染料(LIVE/可固定紫色死细胞染色)进行染色，对1.5μl/样品在37℃下于黑暗中染色30分钟。
在洗涤后，用6-色板在37℃下于黑暗中孵育细胞30分钟，其中6-色板含有：
[0167] 5μl的PE/Cy7抗人CD73(BioLegend,San Diego,CA,USA)
[0168] 5μl的Alexa Fluor 488抗人CD29(BioLegend,San Diego,CA,USA)
[0169] 5μl的PE抗人CD34(BioLegend,San Diego,CA,USA)
[0170] 5μl的APC抗人CD105(BioLegend,San Diego,CA,USA)
[0171] 5μl的APC-eFluor 780抗人CD31(eBiosience,San Diego,CA,USA)
[0172] 5μl的BV650抗人CD45(BD Biosciences,San Diego,CA,USA)。
[0173] 用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)分析标记的细胞。
[0174] 膜联蛋白V染色
[0175] 用冷的BioLegend细胞染色缓冲液(Cat.No 420201)洗涤细胞两次，并随后使细胞以1×106细胞/ml的浓度重新悬浮在膜联蛋白V结合缓冲液中。将100μl的细胞悬浮液转移到5ml的测试管中。加入5μl的APC膜联蛋白V，随后加入10μl的PI溶液(Cat.No 421301)或7-AAD(Cat.No 420403/420404)。使细胞轻缓地涡旋，并于黑暗中在室温(25℃)下孵育15分钟。向每个管中加入400μl膜联蛋白V结合缓冲液(Cat.No.422201)并且通过流式细胞术进行分析。
[0176] 吉姆萨(Giemsa)染色
[0177] 用100％甲醇固定集落，洗涤并用吉姆萨染色，随后再次洗涤，并在显微镜下进行观察。
[0178] 实施例1在FasL存在下培养基质血管成分(SVF)细胞
[0179] 如上所述，得到并接种来自吸脂抽吸物的脂肪部分的SVF细胞。随后，将细胞分成三个实验组：一组细胞在FasL(50ng/m)的存在下孵育72小时(3天)，另一组细胞在上述浓度的FasL的存在下孵育约14天，第三组不用FasL孵育且用作对照。对所得到的细胞群体进行分析，且结果如下所示。
[0180] 细胞计数
[0181] 在接种后14天，处理板和未处理板均达到细胞覆盖状态(P0)。通过胰蛋白酶从板上移除细胞，并用自动细胞计数仪进行计数(每个板独立进行计数)。在下表1中示出了每个测试组得到的活细胞的数目。
[0182] 表1在Fas-配体存在下孵育3天或14天的细胞的细胞计数
[0183]实验组 对照 FASL处理14天 FASL处理3天
细胞数目百万/平皿 0.43±0.05 0.66±0.09 0.32±0.04
细胞数目百万/平皿 0.43±0.05 0.66±0.09 0.32±0.04
[0184] 从表1中可明显看出，用FasL处理14天的组中的细胞数目为对照组中细胞数目的约1.5倍(P＝0.0043)，并且为用FasL处理3天的组中的细胞数目的2倍。
[0185] 如下表2中所示，当细胞以1.5X104细胞/孔的浓度接种在24孔板时，FasL处理对细胞数目的效果甚至更为显著。在这些情况下，用FasL处理14天的组中的细胞数目为对照组中细胞数目的约2.5倍(P＝0.003)。
[0186] 表2在Fas-配体的存在下孵育且铺板在24-孔板中的细胞的细胞计数
[0187]实验组 对照 FASL处理14天
细胞数目百万/平皿 0.094±0.01 0.24±0.05
细胞数目百万/平皿 0.094±0.01 0.24±0.05
[0188] 使脂肪来源的干细胞(ASC，在本文中也被称为间质干细胞(MSC))传代数次。在达到细胞覆盖后，用胰蛋白酶消化细胞，并使细胞重新培养一次、两次或三次传代(称为P1、P2或P3)。每次培养时间为约10天至14天，并且当80％至90％的细胞达到细胞覆盖时使细胞进行传代。随着每次传代，细胞变得更大。在每次测试的传代中，在细胞达到～90％细胞覆盖后，用20ng/ml FasL处理细胞6天。随后，通过胰蛋白酶消化来分解MSC，并利用细胞计数仪进行计数。如图1中所看出的，与细胞历经的传代次数无关，与未用FasL孵育的对照组相比，FasL处理使MSC的数目增加。细胞的数目增加20％至80％。
[0189] 此外，在培养14天后，收集漂浮细胞，并用荧光标记的膜联蛋白V(细胞凋亡检测标记)和碘化丙啶(PI)(退变细胞的荧光标记物)进行染色，以评估培养物中死亡细胞的数目。利用流式细胞仪进行分析。如图2中所示，用膜联蛋白V和PI对细胞进行的染色表明用FasL处理的细胞正在经历早期或晚期凋亡。显然，用FasL处理14天的组中的死亡细胞的数目是其它组中的14倍。
[0190] 不希望受理论的限制，这些结果表明用FasL孵育诱导敏感细胞中高速的凋亡细胞死亡，从而能够更稳定地增殖且产生更大集落形成单位的富集细胞的培养物，如下所述。
[0191] 表面分子表达
[0192] 如上所详述进行的，利用流式细胞术检查表面分子的表达。如下表3中所示，与未处理的细胞相比，用Fas-配体处理14天使细胞CD31-/CD34+的百分比增加。此外，用Fas-配体处理14天导致随着传代从CD29+/CD105+向CD29+/CD105-转移，这在对照组中未见。
[0193] 所得到的细胞具有间质干细胞MSC特征。
[0194] 表3表面标记物的表达
[0195]
[0196] 从P0开始，在存在或不存在FasL的条件下培养MSC。根据制造商的说明，通过流式细胞术分析MSC表面标记物CD73(Biolegend,San Diego,CA,USA)和CD105(Biolegend,San Diego,CA,USA)。如图3中所示，在P0时的FasL处理引起生长的MSC内细胞亚群的变化。该处理使表达CD73的MSC百分比提高近乎一倍。同时，FasL处理使CD105阳性细胞的百分比降低近乎一半。即，处理增加了CD73高群体，并且减少了CD105(+)细胞。
[0197] 集落形成单位(CFU)的表征
[0198] 随后，评估用FasL孵育的培养物中集落形成单位(CFU)的数目，如图4中所证实。对于该测定，将细胞以每6cm平皿2000个细胞的浓度进行铺板，一式三份。在FasL的存在下，孵育细胞20天或3天。在接种后20天，固定Fas-配体处理或未处理的板，且用吉姆萨染色。在培养物中检测到CFU的大集落(图4A)和CFU的小集落(图4B)。
[0199] 如图4C所示，在全部的测试条件下形成了集落形成单位。显然，处理组中的集落形成单位的总数高于未处理组中的集落形成单位，并且用FasL处理较长处理时段(20天)的培养物中与用FasL处理较短处理时段(3天)的培养物中相似，如下表4中所示。
[0200] 然而，有趣的是，在用FasL孵育20天的细胞中形成大的集落，而在用FasL孵育3天的细胞中形成小的集落，如图4A和图4B中分别所证实。
[0201] 显然，尽管在Fas-配体存在下孵育3天的细胞培养物中CFU的总数与在Fas-配体存在下孵育20天的细胞培养物中CFU的数目相似，但是在用Fas-配体孵育20天的细胞中，大集落的百分比较高，如下表4所示。
[0202] 表4：形成的大集落和小集落的数目
[0203] FASL处理20天 FASL处理3天 未处理
大集落的数目 43±5 18±3 23±4
小集落的数目 13±4 37±7 21±6
集落的总数 56±7 55±8 44±3
大集落的数目 43±5 18±3 23±4
小集落的数目 13±4 37±7 21±6
集落的总数 56±7 55±8 44±3
[0204] 利用显微镜计数来评估集落(CFU)的数目。这些结果同样也在图4D(大集落的数目)、图4E(小集落的数目)和图4F(集落的总数)中得以证明。
[0205] 从上述结果可以明显看出，与未处理的细胞和仅结构3天处理的细胞相比，用FasL处理20天导致大集落的数目增加。此外，用Fas-配体仅处理3天的细胞的特征在于，与经受FasL处理20天的细胞相比，小集落的数目增加。已知的是，大集落从早期祖细胞形成(例如，干细胞和祖细胞)。因此，似乎FasL可能优选支持/选择早期祖干细胞。
[0206] 所有细胞中的约2％发育成集落。
[0207] 实施例2诱导分化
[0208] 骨分化-如上所述，得到并接种来自吸脂抽吸物的脂肪部分的SVF细胞。随后，将细胞分成两个实验组：一个组的细胞在FasL(SuperFasL 50ng/ml)的存在下孵育，而第二组在不存在FasL下孵育且用作对照。
[0209] 在孵育7天至10天后(存在或不存在FasL)，当细胞培养物达到细胞覆盖后，在各种诱导培养基中培养MSC以诱导分化成骨细胞或脂肪细胞。
[0210] 在一组实验中，在骨生成诱导培养基 Osteogenesis Differentiation Kit(Gibco)中培养MSC。该试剂盒含有体外诱导人类间质干细胞分化成骨细胞所需的各种试剂。在所有的情况下，每3天至4天更换该诱导培养基。
[0211] 在21天后，在分化培养基的存在下，用4％福尔马林固定细胞(RT下，20分钟)，并且在pH 4.2，用2％茜素红(Sigma)染色(RT下，10分钟)。茜素红是用于鉴定人类间质干细胞的分化培养物中含钙骨细胞的常用染色剂。在图5中可以看出，FasL处理的MSC证实了优于未处理对照的骨分化。利用Olympus IX71显微镜用DP51照相机拍摄照片。
[0212] 分化为脂肪细胞-在另一组实验中，在含10μg/mL胰岛素、1x 10-6M地塞米松、0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和50μM吲哚美辛(所有均来自于Sigma)的脂肪形成培养基中培养MSC。在21天后，用4％福尔马林固定细胞(在室温“RT”下，20分钟)，并且用0.5％油红O(Sigma)染色10分钟(在RT下)。油红O常用于选择性染色并检测培养细胞中中性脂类。如在图6中可以看出，FasL处理的MSC证实了脂肪分化与未处理对照相当。利用Olympus IX71显微镜用DP51照相机拍摄照片。
[0213] 免疫抑制-接下来，检查细胞的免疫抑制性质以测试在FasL的存在下MSC的生长是否影响它们的免疫抑制特性。
[0214] 在利用原代小鼠脾细胞的测试中检测细胞的免疫抑制性质。利用包括机械研磨脾脏并通过100μm过滤器过滤的标准方案得到小鼠脾细胞，使细胞经受红细胞(RBC)裂解缓冲液，随后用培养基(RPMI)洗涤。在如上得到的铺满的人类MSC(即，存在或不存在FasL下生长的MSC)上每孔接种0.3X106细胞(利用含0.3X106百万细胞/ml RPMI的溶液)。对照组包括在不存在MSC下生长的脾细胞。利用小鼠抗-小鼠CD3单克隆抗体(1μg/ml)活化脾细胞96小时。利用ELISA通过测量分泌到培养基中IFNγ的水平来测量脾细胞的活化水平。根据制造上的说明(PeproTech)来进行测量。如图7所示，与未用MSC孵育的活化脾细胞相比，未处理的MSC和FasL-处理的MSC显著地减弱了来自活化的脾细胞的IFNγ分泌。
[0215] 显然，如通过脾细胞活化测定所确定，与对照MSC相比，FasL处理不会损害MSC免疫抑制性质。
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