技术领域
[0001] 本
发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种角膜的脱细胞方法。
背景技术
[0002] 角膜病是全球范围内第二致盲眼病，并且以每年150～200万病例的速度递增。角膜移植是目前
治疗角膜盲唯一有效的方法，但供体角膜来源的极端匮乏制约着角膜移植的开展。角膜基质如动物等动物的角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、
生物物理特性和光学特性，但异种移植后强烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要
抗原，而作为角膜基质架构的胶原
纤维在种系间高度保守，抗原性很低，无细胞的异种角膜移植后不产生排斥反应。因此，将动物的基质细胞完全脱去，使之成为无细胞的角膜基质可能是人角膜基质的理想替代物。
[0003] 但
现有技术生产的无细胞角膜基质在脱细胞过程中，采用的是胰酶、EDTA(
乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)、脱
氧胆酸钠、SDS(十二
烷基磺酸钠)等
表面活性剂，此类方法虽然能去除细胞成分，但反应剧烈，对角膜基质破坏严重，其中使用胰酶处理易导致角膜基质降解，使用表面活性剂易导致表面活性剂残留，产生细胞毒性，在移植后容易引起毒性反应，不能达到良好的
生物相容性。
发明内容
[0004] 本发明的主要目的在于提供一种去除角膜中免疫原细胞成分和可溶性蛋白的同时能够完整保留角膜基质胶原结构的角膜脱细胞方法，从而提高脱细胞角膜基质的生物相容性和抗降解能
力。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供一种角膜的脱细胞方法，包括以下步骤：
[0006] A、将摘取的动物角膜置于
水中，振荡处理，以使上皮层脱落；
[0007] B、将所述角膜置于脱细胞
试剂中，振荡处理；
[0008] C、将所述角膜置于水中，振荡处理；
[0009] D、交替重复步骤B和步骤C，以使基质细胞和内皮细胞脱落；
[0010] 其中，所述脱细胞试剂含有NaCl和EDTA。
[0011] 优选地，所述脱细胞试剂为：浓度为2～5mol/L的NaCl溶液与浓度为0.5～5g/L的EDTA溶液的
混合液。
[0012] 优选地，所述脱细胞试剂的PH值为7.0～7.4；所述脱细胞试剂和/或水的
温度为2～37℃。
[0013] 优选地，所述NaCl溶液的浓度为3mol/L，所述EDTA溶液的浓度为3g/L。
[0014] 优选地，所述步骤A的振荡时间为5～10h，期间，每隔1～2h更换一次水。
[0015] 优选地，所述步骤B的振荡时间为1～2h。
[0016] 优选地，所述步骤C的振荡时间为1～2h。
[0017] 优选地，在实施所述步骤D的持续时间内，每隔1～2h更换一次脱细胞试剂或水。
[0018] 优选地，所述步骤A、步骤B、步骤C或步骤D的振荡转速为100～200rpm。
[0019] 本发明采用物理脱细胞方法，通过脱细胞试剂和水的交替使用，反复改变组织渗透压，能够有效的去除容易引起免疫反应的角膜细胞成分和可溶性蛋白，同时，本发明所使用的试剂温和，能够完整的保留角膜基质胶原结构。
附图说明
[0020] 图1为本发明的角膜脱细胞方法一
实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)
染色照片对比图，其中，1A为脱细胞处理前的苏木精-伊红(HE)染色照片图，1B为脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片图；
[0021] 图2为本发明的角膜脱细胞方法一实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的透射电镜照片对比图，其中，2A为脱细胞处理前的透射电镜照片图，2B为脱细胞处理后的透射电镜照片图。
[0022] 图3为采用本发明的角膜脱细胞方法进行脱细胞之后，移植给兔的动物实验60天后的苏木精-伊红(HE)染色照片对比图，其中，3A为移植前且未经脱细胞处理的苏木精-伊红(HE)染色照片图，3B为经脱细胞处理移植后的苏木精-伊红(HE)染色照片图。
[0023] 本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0024] 应当理解，此处所描述的具体实施方式为实现本发明目的的最佳实施方式，其仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025] 本发明提供一种角膜的脱细胞方法，在第一实施例中，所述角膜的脱细胞方法包括以下步骤：
[0026] A、将摘取的动物角膜置于水中，然后在恒温
振荡器中以200rpm(转/每分钟)的转速振荡处理5h(小时)，期间，每隔1h换一次水，以使上皮层脱落。所述动物包括猪、
牛、羊等动物，所用的水包括注射水、纯水、生理盐水等。在振荡处理过程中，角膜基质的
胶原蛋白吸水蓬松，角膜逐渐吸水变厚，所述角膜基质细胞和内皮细胞逐渐破裂，角膜上皮层逐渐脱落。在振荡处理结束时，所述角膜呈飞碟状，所述角膜上皮层全部脱落。
[0027] B、将所述角膜置于含有浓度为5mol/L的NaCl和5g/L的EDTA的脱细胞试剂中，然后在恒温振荡器中以100rpm的转速振荡处理2h。通过高渗溶液脱水剂的处理，角膜细胞碎片、杂蛋白和多糖等易引起免疫反应的成分被析出。
[0028] C、将所述角膜置于水中，在恒温振荡器中以200rpm的转速振荡处理1h，所述角膜细胞再次处于低渗环境中，使未涨破的细胞
破碎。
[0029] D、交替重复步骤B和步骤C累计40h，以使基质细胞和内皮细胞脱落。这样，通过所述含有NaCl与EDTA的混合液的脱细胞试剂与水的交替作用，以物理的方法反复改变组织渗透压，从而温和地去除角膜基质中免疫原细胞成分和可溶性蛋白的方法制备的脱细胞角膜基质。
[0030] 其中，所述NaCl溶液用于提供高渗溶液环境，使易引起免疫反应的成分被析出；所述EDTA溶液用于保护所述角膜基质的胶原蛋白结构。
[0031] 通过步骤A快速去除角膜上皮层，以及通过脱细胞试剂和水的交替使用，反复改变组织渗透压的方法，上述方法反应温和，能逐步去除角膜基质中免疫原细胞成分和可溶性蛋白，从而有利于得到完好的具有良好的生物相容性和抗降解能力的脱细胞角膜基质。
[0032] 第二实施例中，所述角膜的脱细胞方法包括以下步骤：
[0033] A、将摘取的动物角膜置于水中，然后在恒温振荡器中以100rpm(转/每分钟)的转速振荡处理10h，期间，每隔2h换一次水，以使上皮层脱落。
[0034] B、将所述角膜置于含有浓度为2mol/L的NaCl和0.5g/L的EDTA的脱细胞试剂中，然后在恒温振荡器中以200rpm的转速振荡处理1h。
[0035] C、将所述角膜置于水中，然后在恒温振荡器中以100rpm的转速振荡处理2h。
[0036] D、交替重复步骤B和步骤C累计70h，以使基质细胞和内皮细胞脱落。
[0037] 第三实施例中，在第二实施例的
基础上，采用以下参数进行实施：
[0038] 所述脱细胞试剂的pH值为7.0；所述脱细胞试剂和/或水的温度为37℃。
[0039] 所述NaCl溶液的浓度为3mol/L，所述EDTA溶液的浓度为3g/L。
[0040] 第四实施例中，与第三实施例相比，所述脱细胞试剂的pH值为7.4；所述脱细胞试剂和/或水的温度为25℃。
[0041] 第五实施例中，与第四实施例相比，所述脱细胞试剂和/或水的温度为2℃。
[0042] 图1至图2，以猪角膜为实验对象，采用本发明提供的角膜的脱细胞方法，得到以下实验结果：
[0043] 取依据上述方法以及现有技术的后续方法所制得的猪脱细胞角膜基质进行形态学HE染色观察、超微结构透射电镜观察。结果显示：
[0044] 图1中，1A为脱细胞处理前的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中正常角膜具有完整的全层角膜上皮层和
单层角膜内皮细胞，角膜基质内存在大量基质细胞；1B为脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中脱细胞处理后，角膜中未观察到任何完整的细胞，如上皮层和内皮细胞。
[0045] 图2中，2A为脱细胞处理前天然猪角膜的透射电镜照片图，2B为脱细胞处理后的透射电镜照片图，2B显示脱细胞角膜中胶原纤维排列整齐，与2A对比观察，脱细胞处理后的角膜基质胶原结构与天然角膜胶原结构一致，说明脱细胞过程未对角膜胶原结构造成破坏。
[0046] 图3中，3A为移植前且未经脱细胞处理的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中正常角膜具有完整的全层角膜上皮层和单层角膜内皮细胞，角膜基质内存在大量基质细胞；3B为经脱细胞处理移植后的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中经脱细胞处理然后移植给兔进行动物实验60天后，猪脱细胞角膜基质与兔角膜愈合完好，且猪脱细胞角膜基质完全整合且没有降解，兔基质细胞与上皮层细胞已经长入所述猪脱细胞角膜。由此，可进一步确认采用本发明提供的角膜脱细胞方法未破坏角膜基质胶原结构。
[0047] 上述实施方式仅仅为实现本发明目的的最佳实施方式，本发明并不局限于以上实施方式，在上述实施方式公开的技术内容下，还可以进行各种变化。凡是利用本发明
说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的
专利保护范围内。
