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细胞糖胺聚糖组合物及其制备和使用方法

阅读:177发布:2020-11-16

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1.一种来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸乙酰肝素的组合物,其中所述组合物基本上不含硫酸软骨素。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏表1或表2中列出的一种或多种基因的细胞系。
3.如权利要求1或权利要求2中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞系:硫酸软骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-1
(HSNDST1)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2(HSNDST2)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)或胶原蛋白18(COL18A1)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏硫酸软骨素合酶1(ChSy)的细胞系。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于不产生硫酸软骨素的细胞。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于表1或表2中列出的一种或多种基因是转基因的细胞系。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一个或多个是转基因的细胞系:硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-3(HSNDST3)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-4(HSNDST4)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶1(HS6ST1)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2(HS6ST2)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶3(HS6ST3)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶4(HS6ST4)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1a(HS3ST1A)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1b(HS3ST1B)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1 2(HS3ST2)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶3a或3b(HS3ST3a或3b)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶3(HS3ST4)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶5(HS3ST5)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶6(HS3ST6)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(HGSNAT)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)或胶原蛋白18(COL18A1)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸乙酰肝素。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中所述硫酸乙酰肝素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物,其中所述硫酸乙酰肝素至少95%不含硫酸软骨素。
11.一种来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸软骨素的组合物,其中所述组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸质素和/或透明质酸。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏表4或表5中列出的一种或多种基因的细胞系。
13.如权利要求11或权利要求12中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素
4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。
14.如权利要求11至13中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素和/或透明质酸的细胞。
15.如权利要求11至14中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于表4或表5中列出的一种或多种基因是转基因的细胞系。
16.如权利要求11至15中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一个或多个是转基因的细胞系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;
骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。
17.如权利要求11至16中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸软骨素。
18.如权利要求11至17中任一项所述的组合物,其中所述硫酸软骨素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
19.如权利要求11至18中任一项所述的组合物,其中所述组合物至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
20.一种来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸皮肤素的组合物,其中所述组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。
21.如权利要求20所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏表4或表5中列出的一种或多种基因的细胞系。
22.如权利要求20或权利要求21中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;
骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。
23.如权利要求20至22中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素和/或透明质酸的细胞。
24.如权利要求20至23中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于表4或表5中列出的一种或多种基因是转基因的细胞系。
25.如权利要求20至24中任一项所述的组合物,其中所述组合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一个或多个是转基因的细胞系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;
骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。
26.如权利要求20至25中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸皮肤素。
27.如权利要求20至26中任一项所述的组合物,其中所述硫酸皮肤素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
28.如权利要求20至27中任一项所述的组合物,其中所述硫酸皮肤素至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。
29.一种来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸角质素的组合物,其中所述组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和/或透明质酸。
30.如权利要求29所述的组合物,其中所述组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或透明质酸的细胞。
31.如权利要求29或权利要求30所述的组合物,其中所述组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸角质素。
32.如权利要求29至31中任一项所述的组合物,其中所述硫酸角质素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
33.如权利要求29至32中任一项所述的组合物,其中所述硫酸角质素至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或透明质酸。
34.一种来源于经遗传修饰的细胞系的包含透明质酸的组合物,其中所述组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和/或硫酸角质素。
35.如权利要求34所述的组合物,其中所述组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或硫酸角质素的细胞。
36.如权利要求34或权利要求35所述的组合物,其中所述透明质酸至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
37.如权利要求34至36中任一项所述的组合物,其中所述透明质酸至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或硫酸角质素。
38.一种药物组合物,其包含如权利要求1至37中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
39.一种包含缺乏表1、2、4或5中列出的一种或多种基因的细胞的组合物。
40.如权利要求39所述的组合物,其中所述细胞缺乏以下各项中的一个或多个:硫酸软骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖醛酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-1(HSNDST1)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2(HSNDST2)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-
6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)、胶原蛋白18(COL18A1)、GalNAc转移酶2(CSGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶
2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、骨粘连蛋白2(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)或不变链(Cd74)。
41.如权利要求39或权利要求40所述的组合物,其中所述细胞缺乏硫酸软骨素合酶1(ChSy1)。
42.如权利要求39至41中任一项所述的组合物,其中所述细胞缺乏硫酸软骨素。
43.如权利要求39至42中任一项所述的组合物,其中所述细胞缺乏硫酸乙酰肝素。
44.如权利要求39至43中任一项所述的组合物,其中所述细胞缺乏硫酸皮肤素。
45.如权利要求39至44中任一项所述的组合物,其中所述细胞缺乏硫酸角质素。
46.如权利要求39至45中任一项所述的组合物,其中所述细胞缺乏透明质酸。
47.如权利要求39至46中任一项所述的组合物,其中所述细胞对于表1、2、4或5中列出的一种或多种基因是转基因的。
48.如权利要求39至47中任一项所述的组合物,其中所述细胞对于以下各项中的一个或多个是转基因的:硫酸软骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖醛酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-1(HSNDST1)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2(HSNDST2)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖
2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)、胶原蛋白18(COL18A1)、GalNAc转移酶2(CSGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;
骨粘连蛋白1)(Spock1)、骨粘连蛋白2(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)或不变链(Cd74)。
49.如权利要求39至48中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸的硫酸乙酰肝素组合物。
50.如权利要求39至48中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸的硫酸软骨素组合物。
51.如权利要求39至48中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸的硫酸皮肤素组合物。
52.如权利要求39至48中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸的硫酸角质素组合物。
53.如权利要求39至48中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或硫酸乙酰肝素的透明质酸组合物。
54.如权利要求39至53中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生具有确定的硫酸化模式的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
55.如权利要求39至54中任一项所述的组合物,其中所述细胞产生至少95%不含蛋白质和核酸污染物的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
56.如权利要求39至55中任一项所述的组合物,其中所述细胞是CHO细胞、小鼠胚胎纤维细胞、293细胞、HeLa细胞、人成纤维细胞、人胚胎干细胞、干细胞、F9细胞、来源于人类心脏的祖细胞(hCMPC)、肿瘤细胞或其他动物细胞。
57.如权利要求39至56中任一项所述的组合物,其中所述细胞来自哺乳动物
58.如权利要求39至57中任一项所述的组合物,其中所述细胞来自人。
59.一种制备基本上纯的糖胺聚糖的方法,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸,所述方法包括使用如权利要求39至58中任一项所述的细胞系,其中所述方法包括步骤:(a)使用适当的生长培养基来生长如权利要求39至58中任一项所述的细胞系,(b)通过离心来分离所述生长培养基与所述细胞。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素。
61.如权利要求60所述的方法,其中所述硫酸乙酰肝素基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
62.如权利要求59所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸软骨素。
63.如权利要求62所述的方法,其中所述硫酸软骨素基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
64.如权利要求59所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸皮肤素。
65.如权利要求64所述的方法,其中所述硫酸皮肤素基本上不含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸。
66.如权利要求59所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸角质素。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述硫酸角质素基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸。
68.如权利要求59所述的方法,其中所述糖胺聚糖为透明质酸。
69.如权利要求68所述的方法,其中所述透明质酸基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或硫酸乙酰肝素。
70.如权利要求59至69中任一项所述的方法,其中所述方法包括通过离子交换柱分级分离所述混合物。
71.如权利要求59至70中任一项所述的方法,其中所述方法包括通过核酸酶消化去除污染核酸。
72.如权利要求59至71中任一项所述的方法,其中所述方法包括通过蛋白酶消化去除污染蛋白质。
73.如权利要求59至72中任一项所述的方法,其中所述方法包括通过离子交换分级分离所得产物。
74.如权利要求59至73中任一项所述的方法,其中所述方法包括脱盐。
75.如权利要求59至74中任一项所述的方法,其中所述方法不需要使用酶。
76.如权利要求59至75中任一项所述的方法,其中所述方法不需要使用软骨素酶。
77.如权利要求24至31中任一项所述的组合物,其中所述糖胺聚糖至少95%不含蛋白质和核酸污染物。
78.一种制备能够产生基本上纯的糖胺聚糖的细胞系的方法,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸,所述方法包括将细胞系遗传修饰成对于表1、2、4或5中的基因是转基因的或缺乏表1、2、4或5中的基因。
79.如权利要求78所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素。
80.如权利要求79所述的方法,其中所述硫酸乙酰肝素基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
81.如权利要求78所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸软骨素。
82.如权利要求81所述的方法,其中所述硫酸软骨素基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。
83.如权利要求78所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸皮肤素。
84.如权利要求83所述的方法,其中所述硫酸皮肤素基本上不含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸。
85.如权利要求78所述的方法,其中所述糖胺聚糖为硫酸角质素。
86.如权利要求85所述的方法,其中所述硫酸角质素基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸。
87.如权利要求78所述的方法,其中所述糖胺聚糖为透明质酸。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述透明质酸基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或硫酸乙酰肝素。
89.一种试剂盒,其包含如权利要求39至58中任一项所述的细胞和制备基本上纯的糖胺聚糖的使用说明书,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。
90.如权利要求89所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含如权利要求59至77中任一项所述的方法的说明书。
91.一种治疗有需要的个体的血栓形成、炎症、癌症、生物感染、神经退行性疾病或创伤的方法,所述方法包括施用有效量的如权利要求1至37中任一项所述的组合物或如权利要求38所述的药物组合物。
92.如权利要求91所述的方法,其中所述血栓形成包括静脉血栓形成、深静脉血栓形成、静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、Budd-Chiari综合征、Paget-Schroetter病、脑静脉窦血栓形成、海绵窦血栓形成、动脉血栓形成、中、心肌梗死或肝动脉血栓形成。
93.如权利要求91所述的方法,其中所述炎症包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、屑病关节炎、多发性硬化(MS)、脑脊髓炎、重症肌无、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、变应性哮喘、自身免疫性甲状腺炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、银屑病、综合征、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎(UC)、炎性肠病(IBD)、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、Wegener肉芽肿病、慢性活动性肝炎、Stevens-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、Graves病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎、间质性纤维化、Hashimoto甲状腺炎、自身免疫性多腺体综合征、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,I型糖尿病)、胰岛素抵抗性糖尿病(2型糖尿病)、免疫介导的不育症、自身免疫性Addison病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性脱发、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、Guillain-Barre综合征、僵人综合征、急性风湿热、交感性眼炎、Goodpasture综合征、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征或变态反应、Behcet病、X连淋巴组织增生综合征(SH2D1A/SAP缺乏症)、高IgE综合征或移植物抗宿主病(GVHD)。
94.如权利要求91所述的方法,其中所述癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞性白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK-细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B-细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、非乳腺性佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、Krukenberg瘤、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性棒状瘤、恶性特里顿瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞淋巴瘤、纵膈生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合Mullerian瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌症、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节型黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤学、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺Paget病、Pancoast瘤、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾腺癌、肉瘤、施万鞘瘤神经鞘瘤病(Schwannomatosis)、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、塞莱(Sertoli-Leydig)细胞瘤、性索间质瘤、Sezary综合征、Signet细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、表浅扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、Verner Morrison综合征、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、Warthin瘤或Wilms瘤。
95.如权利要求91所述的方法,其中所述微生物感染包括病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
96.如权利要求91所述的方法,其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆、传染性海绵状脑病、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调7型或脊髓小脑性共济失调17型。
97.如权利要求91所述的方法,其中所述创伤包括割伤、撕裂伤、擦伤、撕脱伤、刺伤、穿透伤、枪伤、血肿或挤压伤。
98.用于治疗血栓形成、炎症、癌症、微生物感染、神经退行性疾病或创伤的如权利要求
1至38中任一项所述的组合物或如权利要求38所述的药物组合物。

说明书全文

细胞糖胺聚糖组合物及其制备和使用方法

交叉引用

[0001] 本申请要求于2015年12月18日提交的美国申请序列号62/269,879的权益,其通过引用以其全文并入本文。

背景技术

[0002] 由于糖胺聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸质素和透明质酸特异性地结合多种蛋白质,因此它们在细胞和组织特异性生理学、病理生理学和发育中发挥着重要作
用。这些蛋白质包括酶、细胞外信号传导分子、趋化因子、脂质结合蛋白或膜结合蛋白、粘附蛋白和致病蛋白,从而使得糖胺聚糖在炎症过程、细胞生长和分化、血液学、细胞-细胞和细胞-基质相互作用、脂质转运和清除/代谢以及宿主防御和病毒感染中具有重要的生物学作
用。
发明内容
[0003] 本文公开了来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸乙酰肝素的组合物,其中该组合物基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏表1或表2中列出的一种或多种基因的细胞系。在一些实
施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞系:硫酸软
骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子
(ChPF)、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝
素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-1(HSNDST1)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2
(HSNDST2)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-
6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、
ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基
转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素
酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚
糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白
聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3
(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)或胶原蛋白18(COL18A1)。在
一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏硫酸软骨素合酶1(ChSy)的细胞系。在
一些实施方案中,该组合物来源于不产生硫酸软骨素的细胞。在一些实施方案中,该组合物
来源于经遗传修饰成对于表1或表2中列出的一种或多种基因是转基因的细胞系。在一些实
施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一个或多个是转基因的细胞
系:硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-3(HSNDST3)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转
移酶-4(HSNDST4)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶1(HS6ST1)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移
酶2(HS6ST2)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶3(HS6ST3)、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶4
(HS6ST4)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1a(HS3ST1A)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-
O-磺基转移酶1b(HS3ST1B)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1 2(HS3ST2)、硫酸乙
酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶3a或3b(HS3ST3a或3b)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基
转移酶3(HS3ST4)、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶5(HS3ST5)、硫酸乙酰肝素(葡糖
胺)3-O-磺基转移酶6(HS3ST6)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(HGSNAT)、糖醛酸-2-硫酸酯酶
(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸
基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、
Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰
肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂
酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合
蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/
TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)或胶原蛋白18(COL18A1)。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成
缺乏Chsy1的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hs2st
的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Glce的细胞系。
在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst1的细胞系。在一些
实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst2的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2的细胞系。在一些实施
方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst3的细胞系。在一些实施方案中,
该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst4的细胞系。在一些实施方案中,该组合
物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1和Sulf1的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于
经遗传修饰成缺乏Chsy1和Sulf2的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修
饰成缺乏Chsy1、Sulf1和Sulf2的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰
成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3是转基因的细胞系。在一些实
施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst4是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1
并且被修饰成对于Hs6st1是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传
修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合
物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st3是转基因的细胞系。在一些实
施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hs6st1和Hs6st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺
乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st1是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于
经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,
该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st3a是转基因的细胞系。在
一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st3b是转
基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成
对于Hs3st4是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏
Chsy1并且被修饰成对于Hs3st5是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经
遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st6是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该
组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st1是转基
因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对
于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传
修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st3a或Hs3st3b是转基因的细胞
系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于
Hs6st1、Hs6st2和Hs3st4是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修
饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st5是转基因的细胞系。在一些实施
方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和
Hs3st6是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、
Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs6st1是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3和Hs6st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺
乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs6st3是转基因的细胞系。在一
些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成
对于Hsndst4和Hs6st1是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰
成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs6st2是转基因的细胞系。
在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修
饰成对于Hsndst4和Hs6st3是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传
修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st1是转基因的细胞
系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且
被修饰成对于Hsndst3和Hs3st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经
遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st3a是转基因
的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st3b是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组
合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和
Hs3st4是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、
Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st5是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3和Hs3st6是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺
乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st1是转基因的细胞系。在一
些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成
对于Hsndst4和Hs3st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰
成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st3a是转基因的细胞系。
在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修
饰成对于Hsndst4和Hs3st3b是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st4是转基因的细
胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并
且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st5是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于
经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st6是转基因
的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st1是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st2是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st3a是
转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st3b是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st4是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st5是
转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st6是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st1是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st2是
转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st3a是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st3b是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st4是
转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st5是转基因的细胞系。在一些实施方
案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st6是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物包含具有确
定的硫酸化模式的硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素至少95%不含蛋白
质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素至少95%不含硫酸软骨素。在一些实
施方案中,该硫酸乙酰肝素至少99%不含蛋白质和核酸。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝
素至少99%不含硫酸软骨素。
[0004] 本文还提供了来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸软骨素的组合物,其中该组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案
中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏表4或表5中列出的一种或多种基因的细胞系。在一
些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞系:
GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(Chsy1)、硫
酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨
素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3
(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软
骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡
糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖
(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小
蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯酰3-
羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;
骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2
(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不
变链(Cd74)和CD44(Cd44)。在一些实施方案中,该组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸
角质素、硫酸皮肤素和/或透明质酸的细胞。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修
饰成对于表4或表5中列出的一种或多种基因是转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组
合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一个或多个是转基因的细胞系:GalNAc转移酶
1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT和GalNAcT活性)
(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2
(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-
O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移
酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1
(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶
(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白
聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶
原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖
(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)
(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。在一些实施方案中,该组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸软骨素。在一些实施方案中,该硫酸软骨素至少95%不含
蛋白质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸软骨素至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸
皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该硫酸软骨素至少99%不含蛋白
质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸软骨素至少99%不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤
素、硫酸角质素和/或透明质酸。
[0005] 本文进一步提供了来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸皮肤素的组合物,其中该组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施
方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏表4或表5中列出的一种或多种基因的细胞系。
在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成缺乏以下各项中的一个或多个的细胞
系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT
和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软
骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2
(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、
软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5
差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转
移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经
蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前
胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、
Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白
聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4
(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。在一些实施方案中,该组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素和/或透明质酸的细胞。在
一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成对于表4或表5中列出的一种或多种基因是
转基因的细胞系。在一些实施方案中,该组合物来源于经遗传修饰成对于以下各项中的一
个或多个是转基因的细胞系:GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、
硫酸软骨素合酶1(GlcAT和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素
聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨
素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺
基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫
酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫
酸皮肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M
(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖
(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖
(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白
聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、
蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。在一些
实施方案中,该组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸皮肤素。在一些实施方案中,该硫
酸皮肤素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素至少95%
不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素至少99%不含蛋白质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素至少99%不含
硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。
[0006] 本文还提供了来源于经遗传修饰的细胞系的包含硫酸角质素的组合物,其中该组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和/或透明质酸。在一些实施方案
中,该组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或透明质酸的细胞。在一些实施方案中,该组合物包含具有确定的硫酸化模式的硫酸角质素。在一
些实施方案中,该硫酸角质素至少95%不含蛋白质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫
酸角质素至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或透明质酸。在一些实
施方案中,该硫酸角质素至少99%不含蛋白质和核酸污染物。在一些实施方案中,该硫酸角
质素至少99%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或透明质酸。
[0007] 本文进一步提供了来源于经遗传修饰的细胞系的包含透明质酸的组合物,其中该组合物基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和/或硫酸角质素。在一些实施
方案中,该组合物来源于不产生硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或硫酸角质素的细胞。在一些实施方案中,该透明质酸至少95%不含蛋白质和核酸污染物。在
一些实施方案中,该透明质酸至少95%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或
硫酸角质素。在一些实施方案中,该透明质酸至少99%不含蛋白质和核酸污染物。在一些实
施方案中,该透明质酸至少99%不含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和/或硫酸角
质素。
[0008] 本文还提供了包含如任一上述实施方案所述的任一组合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0009] 本文进一步提供了包含缺乏表1、2、4或5中列出的一种或多种基因的细胞的组合物。在一些实施方案中,所述细胞缺乏以下各项中的一个或多个:硫酸软骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫酸乙酰肝
素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖醛酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基
转移酶-1(HSNDST1)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2(HSNDST2)、硫酸酯酶1
(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、
PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3
(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶
(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖
3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚
糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、
共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)、胶原蛋白18(COL18A1)、GalNAc转移
酶2(CSGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合
因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-
O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转
移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮
肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮
肤素4-O-磺基转移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M
(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖
(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖
(Dcn)、双糖链蛋白聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、骨粘连蛋
白2(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)
(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)或不变链(Cd74)。在一些实施方案中,该细胞缺乏硫酸软骨素
合酶1(ChSy1)。在一些实施方案中,该细胞缺乏硫酸软骨素。在一些实施方案中,该细胞缺
乏硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中,该细胞缺乏硫酸皮肤素。在一些实施方案中,该细胞
缺乏硫酸角质素。在一些实施方案中,该细胞缺乏透明质酸。在一些实施方案中,该细胞对
于表1、2、4或5中列出的一种或多种基因是转基因。在一些实施方案中,该细胞对于以下各
项中的一个或多个是转基因的:硫酸软骨素合酶1(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转
移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(HS2ST)、葡糖
醛酸差向异构酶(GLCE)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-1(HSNDST1)、硫酸乙酰肝
素N-脱乙酰酶/磺基转移酶-2(HSNDST2)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、磺酸胺酶
(SGSH)、N-乙酰转移酶(AANAT、ARD1A、GNPNAT1、HGSNAT、MAK10、NAT1、NAT2、NAT5、NAT6、NAT8、NAT8L、NAT9、NAT10、NAT11、NAT12、NAT13、NAT14、NAT14)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、α-N-乙酰葡糖苷酶(NAGLU)、PAPS合酶(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(XYLT1)、木糖基转移酶2(XYLT2)、半乳糖基转移酶1(B4GALT1)、半乳糖基转移酶2(B4GALT2)、葡糖苷酸基转移
酶1(UDPGT)、Exostosin-样糖基转移酶3(EXTL3)、Exostosin糖基转移酶1(EXT1)、
Exostosin糖基转移酶2(EXT2)、乙酰肝素酶(HPSE)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)、磷脂酰
肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(GPC4)、磷脂
酰肌醇蛋白聚糖5(GPC5)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(GPC6)、共结合蛋白聚糖1(SDC1)、共结合
蛋白聚糖2(SDC2)、共结合蛋白聚糖3(SDC3)、共结合蛋白聚糖4(SDC4)、β聚糖(BGCAN/
TGFBR3)、CD44V3(CD44V3)、神经纤毛蛋白1(NRP1)、丝甘蛋白(SRGN)、基底膜聚糖(PLC)、聚集蛋白(AGRN)、胶原蛋白18(COL18A1)、GalNAc转移酶2(CSGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1
(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软骨素聚合因子2
(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2(Chst12)、软骨素4-
O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、软骨素6磺基转移
酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1
(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶
(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经蛋白
聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前胶
原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白聚糖
(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、骨粘连蛋白2(Spock2)、睾丸蛋白
聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)
(Cspg4)或不变链(Cd74)。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1。在一些实施
方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hs2st。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成
缺乏Chsy1和Glce。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst1。在一些
实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst2。在一些实施方案中,该细胞经遗传
修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1
和Hsndst3。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1和Hsndst4。在一些实施方
案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1和Sulf1。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺
乏Chsy1和Sulf2。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Sulf1和Sulf2。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成
缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成
缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st2是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成
缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st3是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成
缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hs6st1和Hs6st2是转基因的。在一些实施
方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st1是转基因的。在一些实施
方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st2是转基因的。在一些实施
方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st3a是转基因的。在一些实
施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st3b是转基因的。在一些
实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st4是转基因的。在一些
实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st5是转基因的。在一些
实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs3st6是转基因的。在一些
实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st1是
转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、
Hs6st2和Hs3st2是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修
饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st3a或Hs3st3b是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗
传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st4是转基因的。在一些实施方
案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2和Hs3st5是转基因
的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1并且被修饰成对于Hs6st1、Hs6st2
和Hs3st6是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs6st1是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs6st2是转基因的。
在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3和Hs6st3是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、
Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs6st1是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs6st2是转
基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修
饰成对于Hsndst4和Hs6st3是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏
Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st1是转基因的。在一些实施方
案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和
Hs3st2是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st3a是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st3b是转基因的。
在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst3和Hs3st4是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、
Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st5是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3和Hs3st6是转
基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修
饰成对于Hsndst4和Hs3st1是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏
Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st2是转基因的。在一些实施方
案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和
Hs3st3a是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st3b是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗
传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st4是转基因的。
在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于
Hsndst4和Hs3st5是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、
Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4和Hs3st6是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和
Hs3st1是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st2是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和
Hs3st3a是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st3b是转基因的。在一些实施方案中,
该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2
和Hs3st4是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和Hs3st5是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst3、Hs6st1/2和
Hs3st6是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st1是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和
Hs3st2是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st3a是转基因的。在一些实施方案中,
该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2
和Hs3st3b是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st4是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和
Hs3st5是转基因的。在一些实施方案中,该细胞经遗传修饰成缺乏Chsy1、Hsndst1和
Hsndst2并且被修饰成对于Hsndst4、Hs6st1/2和Hs3st6是转基因的。在一些实施方案中,该
细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸的硫酸乙酰肝素
组合物。在一些实施方案中,该细胞产生基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质
素和/或透明质酸的硫酸软骨素组合物。在一些实施方案中,该细胞产生基本上不含硫酸软
骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸的硫酸皮肤素组合物。在一些实施方案中,该细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸的硫酸角质
素组合物。在一些实施方案中,该细胞产生基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质
素和/或硫酸乙酰肝素的透明质酸组合物。在一些实施方案中,该细胞产生具有确定的硫酸
化模式的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该细胞产生至少95%不含蛋白质和核酸污染物的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸
皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该细胞产生至少99%不含蛋白质
和核酸污染物的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该细胞是CHO细胞、小鼠胚胎纤维细胞、293细胞、HeLa细胞、人成纤维细
胞、人胚胎干细胞、干细胞、F9细胞、来源于人类心脏的祖细胞(hCMPC)、肿瘤细胞或其他动物细胞。在一些实施方案中,该细胞来自哺乳动物。在一些实施方案中,该细胞来自人。
[0010] 本文还提供了制备基本上纯的糖胺聚糖的方法,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸,该方法包括使用如任一上述实施方案所
述的任一细胞系,其中该方法包括步骤:(a)使用适当的生长培养基来生长如任一上述实施
方案所述的任一细胞系,(b)通过离心来分离该生长培养基与该细胞。在一些实施方案中,
该糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素基本上不含硫酸软骨素、
硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸软骨素。在一些实施方案中,该硫酸软骨素基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或
透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸皮肤素。在一些实施方案中,该硫酸皮肤
素基本上不含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸角质素。在一些实施方案中,该硫酸角质素基本上不含硫酸软骨素、硫酸
皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为透明质酸。在一些实施方案中,该透明质酸基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或硫酸乙酰
肝素。在一些实施方案中,该方法包括通过离子交换柱分级分离混合物。在一些实施方案
中,该方法包括通过核酸酶消化去除污染核酸。在一些实施方案中,该方法包括通过蛋白酶
消化去除污染蛋白质。在一些实施方案中,该方法包括通过离子交换分级分离所得产物。在
一些实施方案中,该方法包括脱盐。在一些实施方案中,该方法不需要使用酶。在一些实施
方案中,该方法不需要使用软骨素酶。在一些实施方案中,该糖胺聚糖至少95%不含蛋白质
和核酸污染物。在一些实施方案中,该糖胺聚糖至少99%不含蛋白质和核酸污染物。
[0011] 本文还提供了制备能够产生基本上纯的糖胺聚糖的细胞系的方法,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸,该方法包括将细胞系
遗传修饰成对于表1、2、4或5中的基因是转基因的或缺乏表1、2、4或5中的基因。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素基本上不含硫酸
软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸软骨素。在一些实施方案中,该硫酸软骨素基本上不含硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质
素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为硫酸皮肤素。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素基本上不含硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施
方案中,该糖胺聚糖为硫酸角质素。在一些实施方案中,该硫酸角质素基本上不含硫酸软骨
素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和/或透明质酸。在一些实施方案中,该糖胺聚糖为透明质
酸。在一些实施方案中,该透明质酸基本上不含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或硫酸乙酰肝素。
[0012] 本文还提供了试剂盒,其包含如任一上述实施方案所述的任一种细胞和制备基本上纯的糖胺聚糖的使用说明书,该糖胺聚糖选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、
硫酸角质素和透明质酸。在一些实施方案中,该试剂盒包含针对如任一上述实施方案所述
的任何方法的说明书。
[0013] 本文进一步提供了治疗有需要的个体的血栓形成、炎症、癌症、微生物感染、神经退行性疾病或创伤的方法,该方法包括施用有效量的如任一上述实施方案所述的任一组合
物或其药物组合物。在一些实施方案中,该血栓形成包括静脉血栓形成、深静脉血栓形成、
静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、Budd-Chiari综合征、Paget-
Schroetter病、脑静脉窦血栓形成、海绵窦血栓形成、动脉血栓形成、中、心肌梗死或肝动脉血栓形成。在一些实施方案中,该炎症包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨
关节炎、屑病关节炎、多发性硬化(MS)、脑脊髓炎、重症肌无、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、变应性哮喘、自身免疫性甲状腺炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、银屑病、 综合征、
克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎(UC)、炎性肠病(IBD)、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫
血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、Wegener肉芽肿病、慢性活动性肝炎、Stevens-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、Graves病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎、间质性纤维化、Hashimoto甲状腺炎、自身免疫性多腺体综合征、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,I型糖尿病)、胰岛素抵抗性糖尿病(2型糖尿病)、免疫介导的不育
症、自身免疫性Addison病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性脱发、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、Guillain-Barre
综合征、僵人综合征、急性风湿热、交感性眼炎、Goodpasture综合征、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征或变态反应、Behcet病、X连淋巴组织增生综合征(SH2D1A/SAP缺乏症)、高
IgE综合征或移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方案中,该癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸细胞白血病、急性淋巴母细胞性白
血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急
性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞性白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK-细胞白血病、
AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B-细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、非乳腺性佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血
病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、Krukenberg瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性棒状瘤、恶性特里顿瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞淋巴瘤、纵膈生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合Mullerian瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌症、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节型黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤学、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺Paget病、Pancoast瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾腺癌、肉瘤、施万鞘瘤神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、塞莱细胞瘤、性索间质瘤、Sezary综合征、Signet细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、表浅扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T
细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、VernerMorrison综合征、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、Warthin瘤或Wilms瘤。在一些实施方案中,该微生物感染包括
病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。在一些实施方案中,该神经退行性疾病包括阿尔茨海默
病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆、传染性海绵状脑病、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2
型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调7型或脊髓小脑
性共济失调17型。在一些实施方案中,该创伤包括割伤、撕裂伤、擦伤、撕脱伤、穿刺伤、穿透伤、枪伤、血肿或挤压伤。
[0014] 本文还提供了用于治疗血栓形成、炎症、癌症、微生物感染、神经退行性疾病或创伤的如任一上述实施方案所述的组合物或其药物组合物。
附图说明
[0015] 本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图,将会获得对本发明的特征和优点的
更好理解,在附图中:
[0016] 图1示出了HS链的示意图,图示出抗凝血酶和FGF/FGFR的结合位点。HS生物合成所需的各种基因以斜体表示。Xylt,木糖基转移酶;Galt,半乳糖基转移酶;Ext,exostosins,GlcNAc和GlcA转移酶;Ndst,GlcNAc N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶;Hs6st,葡糖胺基6-O-磺基转移酶;Hs3st,葡糖胺基3-O-磺基转移酶;Hs2st,糖醛基2-O-磺基转移酶;HsGlce,糖醛基C5差向异构酶。
[0017] 图2示出了在转染指导RNA以敲除CS生产后的SURVEYOR突变测定。从已经用pSpCas9和针对CSGalNAcT2、ChPF或ChSy1的sgRNA瞬时转染的细胞中提取基因组DNA。对含
有sgRNA靶标的基因组基因座进行PCR扩增。将PCR扩增子纯化并用SURVEYOR核酸酶消化。将
消化产物在琼脂糖凝胶上可视化。每个突变产物的大小与基于PCR扩增子内突变位置的预
期分子量相匹配。
[0018] 图3示出了用以检测转染细胞表面上的CS的流式细胞术。用pSpCas9和靶向ChPF、CSGalNAcT2或ChSy1的sgRNA转染CHO-S细胞。用软骨素酶ABC处理细胞,然后在用流式细胞
术分析之前,将其与抗体2B6(其检测软骨素酶处理后剩余的4-O-硫酸化CS断链(stub))和
Cy3缀合的二级抗体一起温育。
[0019] 图4示出了用以筛选敲除CS合成的克隆细胞系的流式细胞术。将来源于有限稀释克隆的克隆群体用软骨素酶ABC处理,然后与抗体2B6一起温育以鉴别缺乏CS合成的细胞
系。示出了代表性实验。总共筛选了100多个集落。
[0020] 图5A-B示出了对所靶向和筛选的细胞系中的GAG产生的测量。从所筛选的细胞系的条件培养基中纯化GAG。图5A示出了将一部分GAG在透UV的板中与软骨素酶或肝素裂解酶
一起温育并测量所得的吸光度变化。图5B示出了用软骨素酶或肝素裂解酶彻底消化一部分
GAG。剩余的硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素在DEAE-Sephacel上纯化并通过咔唑测定法进行定
量。
[0021] 图6示出了CHO-S和CS敲除细胞的HS二糖组成。从CHO-S和ChSy1敲除克隆的条件培养基中纯化GAG。用肝素裂解酶彻底消化HS,然后用苯胺标记并通过LC/MS进行分析。同位素
标准二糖提供了鉴别和定量每种二糖的手段。示出的数据是平均值±S.E.M。
[0022] 图7示出了转染以改变HS生产后的SURVEYOR突变测定。从已经用pSpCas9和针对Ndst1、Ndst2、Hs2st或Glce的sgRNA瞬时转染的细胞中提取基因组DNA。对含有sgRNA靶标的
基因组基因座进行PCR扩增。将PCR扩增子纯化并用SURVEYOR核酸酶消化。将消化产物在琼
脂糖凝胶上可视化。每个突变产物的大小与基于PCR扩增子内突变位置的预期分子量相匹
配。
[0023] 图8示出了用以检测转染细胞表面上FGF2与HS结合的变化的流式细胞术。用pSpCas9和靶向Ndst1、Ndst2、Hs2st、Glce、Hs6st1和Ndst1/Ndst2的sgRNA转染ChA27细胞。
在通过流式细胞术分析之前,将细胞与生物素化的FGF2和链霉亲和素-藻红蛋白一起温育。
[0024] 图9示出了通过FGF2结合筛选HS结构改变的集落。将来源于有限稀释克隆的克隆群体与FGF2一起温育以鉴别具有改变的HS合成的细胞系。示出了代表性实验。总共筛选了
每种靶基因的约50个集落。
[0025] 图10A示出了克隆ChA27的NDST1/NDST2双KO中NDST2的氨基酸序列与未修饰的序列的比对。KO中缺失8个氨基酸。氨基酸序列从使用位于CRISPR/Cas遗传靶位点侧翼的引物
扩增的PCR产物的DNA序列分析中获得。
[0026] 图10B示出了克隆ChA27的HS2ST KO中HS2ST的氨基酸序列与未修饰的序列的比对。一个基对插入在氨基酸198的位置处形成提前终止密码子。从使用位于CRISPR/Cas遗
传靶位点侧翼的引物扩增的PCR产物的DNA序列分析中获得氨基酸序列。
[0027] 图11示出了在使用CRISPR/Cas进行各种基因敲除之前和之后克隆ChA27的HS二糖组成。从克隆细胞系的条件培养基中纯化GAG。用肝素裂解酶彻底消化HS,然后用苯胺标记
并通过LC/MS进行分析。同位素标准二糖提供了鉴别和定量每种二糖的手段。示出的数据是
来自单个克隆细胞系的HS的单次分析。指出了每个图的基因敲除。

具体实施方式

[0028] 糖胺聚糖(GAG)在质量、二糖组成和硫酸化模式方面显示出多样性,该多样性源自于其通过细胞酶的合成。基于核心二糖结构,GAG被分为四类:硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)和透明质酸(HA)。蛋白质在细胞中被各种不同的
GAG进一步修饰(即糖基化),从而产生蛋白聚糖。
[0029] 本文公开了从遗传修饰的细胞中纯化的GAG,该GAG包括至少一种特定GAG的均匀组合物,该特定GAG基本上不含一种或多种污染GAG。在一些实施方案中,该组合物是其基本
上未受选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸中的一种或多种GAG的污染的
硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中,该组合物是基本上未受选自硫酸乙酰肝素、硫酸角质素
和透明质酸中的一种或多种GAG的污染的硫酸软骨素/硫酸皮肤素。在一些实施方案中,该
组合物是基本上未受选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸中的一种或
多种GAG的污染的硫酸角质素。在一些实施方案中,该组合物是基本上未受选自硫酸乙酰肝
素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的一种或多种GAG的污染的透明质酸。
[0030] 从GAG的核心二糖链修饰得到GAG以在每个类型的GAG内产生多样性。修饰包括硫酸化、脱乙酰化和差向异构化。本文还公开了包括具有确定的硫酸化模式的特定GAG在内的
GAG。在一些实施方案中,该GAG包括一种或多种选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤
素和硫酸角质素的GAG,其各自具有确定的硫酸化模式。在一些实施方案中,该GAG包括一种
或多种选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素的GAG,其各自具有确定
的差向异构化模式。在一些实施方案中,该GAG是具有确定的硫酸化模式的硫酸乙酰肝素。
在一些实施方案中,该GAG是具有确定的差向异构化模式的硫酸乙酰肝素。
硫酸乙酰肝素组合物
[0031] 由于硫酸乙酰肝素特异性地结合多种蛋白质,其在细胞和组织特异性的生理学、病理生理学和发育中发挥着重要作用。在一些实施方案中,蛋白质包括酶、细胞外信号传导
分子、趋化因子、脂质结合蛋白或膜结合蛋白、粘附蛋白和致病蛋白。在一些实施方案中,本文公开的组合物和方法的硫酸乙酰肝素可用于影响炎性过程、干细胞分化、正常细胞和癌
细胞的生长和分化、血细胞分化、细胞-细胞和细胞-基质相互作用、脂质转运和清除/代谢、宿主防御以及病毒和细菌感染。
[0032] 通过修饰为沿硫酸乙酰肝素链的短寡聚区域引入硫酸乙酰肝素组合物的多样性或修饰模式。在一些实施方案中,这些修饰在硫酸乙酰肝素上产生特异性蛋白质结合位点。
在一些实施方案中,该修饰包括向二糖内的化合物残基的四个或更多个位置添加硫酸
基团以及葡糖醛酸残基的差向异构化,以便产生艾杜糖醛酸。在其他实施方案中,这些修饰
不会进行完全,从而产生含有多种寡聚结构的硫酸乙酰肝素链。在一些情况下,特定蛋白质
与硫酸乙酰肝素链上的寡糖的结合由寡糖内硫酸化的程度和模式决定。
[0033] 硫酸乙酰肝素由重复二糖(与N-乙酰葡糖胺连接的葡糖醛酸β1-4)的线性链组成,该线性链的分子量在5至50kDa的范围内是多分散的,平均分子量为30kDa。可以修饰糖残基
中的某些位置,包括产生葡糖胺或N-硫酸化的葡糖胺的在N-乙酰葡糖胺残基C2位处的N-脱
乙酰化或N-脱乙酰化和N-硫酸化。还可以在3位和6位处将葡糖胺残基O-硫酸化,不过3-O-
硫酸化较为罕见,其在药物肝素中更为普遍。可将葡糖醛酸的C2位O-硫酸化,不过这在葡糖
醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸之前更常见。差向异构化还改变艾杜糖醛酸与后面从β1-4至
α1-4的残基之间的连接,并且这种修饰也在肝素中更为普遍。硫酸乙酰肝素由多达100个二
糖单元组成,其中二糖单元在整个硫酸乙酰肝素链中被不同程度地修饰。该链的特定子
域被高度硫酸化,而其他区域被中度硫酸化或未硫酸化。在体内建立这些修饰的总体水平
和模式的逐步机制尚不清楚,但O-硫酸化和差向异构化通常遵循N-硫酸化。
[0034] 在某些实施方案中,本文提供了具有特定修饰模式的来源于能够进行特定硫酸乙酰肝素生物合成的细胞系的硫酸乙酰肝素组合物。在各个实施方案中,如本文所用的,特定
的硫酸乙酰肝素生物合成以非限制性实例的方式包括(1)通过遗传修饰增加或减少细胞系
中的(a)硫酸乙酰肝素聚合;(b)硫酸乙酰肝素硫酸化;(c)硫酸乙酰肝素中糖醛酸基团的差
向异构化;(d)硫酸乙酰肝素磷酸化和/或(e)硫酸乙酰肝素中GlcNAc基团的脱乙酰化;和/
或(2)促进(a)硫酸乙酰肝素键断裂;(b)连接硫酸乙酰肝素与核心蛋白的连接区域的键断
裂;(c)硫酸乙酰肝素与连接区域之间的键断裂;(d)硫酸乙酰肝素的硫酸化(例如,N-硫酸
化和/或O-硫酸化);(e)硫酸乙酰肝素中GlcN基团的乙酰化;(f)硫酸乙酰肝素中GlcNAc基
团的脱乙酰化;(g)硫酸乙酰肝素磷酸化;和/或(h)硫酸乙酰肝素中糖醛酸基团的差向异构
化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰抑制硫酸乙酰肝素的硫酸化。在具体的实施方
案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸乙酰肝素的硫酸化。在其他实施方案中,细胞系的遗传修
饰抑制硫酸乙酰肝素的差向异构化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸乙
酰肝素的差向异构化。
[0035] 在一些实施方案中,所述硫酸乙酰肝素组合物来源于具有调节(例如,增加或抑制)糖基转移酶的遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素组合物来源于具
有遗传修饰的细胞系,该遗传修饰抑制适于将硫酸乙酰肝素连接至核心蛋白的连接区域的
合成、硫酸乙酰肝素合成的开始、硫酸乙酰肝素的合成,或其组合。在一些实施方案中,该硫酸乙酰肝素组合物来源于具有遗传修饰的细胞系,该遗传修饰调节(例如,增加或抑制)硫
酸乙酰肝素木糖基转移酶、硫酸乙酰肝素半乳糖基转移酶、硫酸乙酰肝素葡糖醛酸基转移
酶、硫酸乙酰肝素N-乙酰葡糖胺转移酶或其组合中的一种或多种。在更具体的实施方案中,
细胞系的遗传修饰调节(例如,增加或减少)木糖基转移酶I型、木糖基转移酶II型、半乳糖
基转移酶I型、半乳糖基转移酶II型、葡糖醛酸基转移酶I型、葡糖醛酸基转移酶II型、N-乙
酰葡糖胺转移酶I型、N-乙酰葡糖胺转移酶II型或其组合中的一种或多种。
[0036] 在某些实施方案中,所述硫酸乙酰肝素组合物来源于具有调节硫酸化的遗传修饰的细胞系,特别是针对一种或多种磺基转移酶进行了遗传修饰的细胞系。在具体的实施方
案中,该硫酸乙酰肝素组合物来源于经遗传修饰以调节(例如,抑制或增加)硫酸乙酰肝素
O-磺基转移酶、硫酸乙酰肝素N-磺基转移酶或其组合中的一种或多种(非限制性实例)的细
胞系。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系调节(例如,抑制或增加)硫酸乙酰肝素O-
磺基转移酶,如(葡糖胺基团的)6-O磺基转移酶、(葡糖胺基团的)3-O磺基转移酶、(糖醛酸
部分,例如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸的)2-O磺基转移酶、(连接四糖中的半乳糖的)6-O磺基转
移酶或其组合中的一种或多种(非限制性实例)。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系调
节连接四糖中的木糖的2-O磷酸化。
[0037] 在某些实施方案中,所述硫酸乙酰肝素组合物来源于改变或破坏硫酸乙酰肝素性质(例如,改变或破坏硫酸乙酰肝素的N-乙酰化、N-硫酸化、2-O硫酸化、3-O硫酸化和6-O硫
酸化的含量、硫酸乙酰肝素的差向异构化、硫酸乙酰肝素的链长或其组合)的经遗传修饰的
细胞系,该改变或破坏是与内源性硫酸乙酰肝素相比且其量足以产生具有改变或破坏的硫
酸乙酰肝素对蛋白质配体的结合、硫酸乙酰肝素依赖性信号传导途径或其组合的硫酸乙酰
肝素组合物。在具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸乙酰肝素的性质,使其改变
硫酸乙酰肝素信号传导。在其他具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸乙酰肝素
的性质,使其改变硫酸乙酰肝素与蛋白质的结合。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞
系改变硫酸乙酰肝素的性质,使其改变硫酸乙酰肝素结合和硫酸乙酰肝素信号传导。在一
些实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸乙酰肝素的性质,使其在不存在硫酸乙酰肝素
抑制剂的情况下改变经受硫酸乙酰肝素结合、信号传导或其组合的任何蛋白质(包括多肽)
的结合、信号传导或其组合。在一些实施方案中,蛋白质的非限制性实例是生长因子。在具
体的实施方案中,生长因子的非限制性实例是成纤维细胞生长因子(FGF)或血管内皮生长
因子(VEGF)。
[0038] 尽管已经在一些蛋白质中鉴别出肝素结合共有序列,但结合机制是多变的。从硫酸乙酰肝素的角度来看,硫酸化程度和硫酸化模式可以化学地(离子地)和几何学地增加短
寡聚区域对某些氨基酸序列(通常涉及碱性氨基酸)的亲和力。
[0039] 通过利用可大量获得并且可被分别成片段或化学修饰的商用肝素进行结合和竞争研究,已经推断出许多归因于硫酸乙酰肝素的功能。然而,肝素是来源于猪内脏的分级分
离的高度硫酸化形式的硫酸乙酰肝素,并且具有较高的抗凝血酶结合能力和抗凝血活性。
高度硫酸化赋予肝素强阳离子交换性能,并且与具有低得多的硫酸化程度并且通常缺乏抗
凝血活性的天然存在硫酸乙酰肝素并不相似。在过去的十年中,通过合成或化学酶法获得
肝素样分子的尝试已取得显著进展,但大多数可用的材料都基于肝素的结构并且由dp2-
dp12的寡糖组成,该结构并未复制天然存在HS的长度或组成多样性。在大多数情况下,用于
引导寡糖组装的模板是基于针对已知配体的少数特征性结合位点。此外,短寡聚体序列不
会复制硫酸化结构域在较长的硫酸乙酰肝素链上的排列。
硫酸软骨素组合物
[0040] 硫酸软骨素是由交替的糖(N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸)链组成的硫酸化糖胺聚糖(GAG)。硫酸软骨素链是可变长度的无支链多糖,含有两种交替的单糖:D-葡糖醛酸
(GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)。一些GlcA残基差向异构化为L-艾杜糖醛酸
(IdoA);此时所得的二糖被称为硫酸皮肤素。通常发现硫酸软骨素作为蛋白聚糖的一部分
附接至蛋白质。硫酸软骨素链可具有超过100种单独的糖,每种糖可以在不同的位置以不同
的数量硫酸化。硫酸软骨素链与某些蛋白质的丝氨酸残基上的羟基基团连接。尚不清楚蛋
白质究竟是如何被选择用于附接糖胺聚糖。糖基化的丝氨酸通常跟随着甘氨酸并具有相邻
的酸性残基,但该基序并不总能预测糖基化。GAG链的附接始于固定模式的四个单糖:Xyl-
Gal-Gal-GlcA。每个糖均通过特定的酶附接,从而允许对GAG合成进行多个水平的控制。木
糖与内质网中的蛋白质附接,而其余的糖与高尔基体中的链附接。每个单糖均可以保持未
硫酸化、硫酸化一次或硫酸化两次。在最常见的情况下,N-乙酰基-半乳糖胺的4和6位的羟
基被硫酸化,一些链在2位具有葡糖醛酸。硫酸化由特定的磺基转移酶介导。这些不同位置
处的硫酸化赋予软骨素GAG链特定的生物活性。
[0041] 硫酸软骨素是细胞外基质的主要组分,并且在维持组织的结构完整性方面较为重要。这种功能对于较大的聚集蛋白聚糖是典型的:聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋
白聚糖和神经蛋白聚糖,统称为lectican。
[0042] 作为聚集蛋白聚糖的一部分,硫酸软骨素是软骨的主要成分。硫酸软骨素的紧密堆积和高度带电荷的硫酸基团产生静电排斥,这提供了软骨对压缩的抗性的大部分。软骨
中硫酸软骨素的损失是骨关节炎的主要原因。硫酸软骨素对骨关节炎患者的效果可能是许
多反应的结果,包括其抗炎活性、蛋白聚糖和透明质酸合成的刺激,以及抑制蛋白水解酶、
化氮和其他有助于损害软骨基质并导致关节软骨细胞死亡的物质的合成的软骨细胞
分解代谢活性的降低。已发现硫酸软骨素降低软骨细胞中IL-1β-诱导的核因子-κB(NF-κB)易位。
[0043] 硫酸软骨素由于其负电荷而容易与细胞外基质中的蛋白质相互作用。这些相互作用对于调节多种细胞活动非常重要。lectican是脑部细胞外基质的主要部分,其中软骨素
糖链作为神经元周围网络的一部分起到稳定正常脑突触的作用。硫酸软骨素蛋白聚糖的水
平在中枢神经系统损伤后大大增加,在损伤的中枢神经系统中它们起到防止受损神经末梢
再生的作用。虽然这些功能并没有如硫酸乙酰肝素的功能的功能一样得到良好表征,但仍
持续发现硫酸软骨素蛋白聚糖具的新作用。
[0044] 在皮质发育中,硫酸软骨素由Sub Plate表达,并且充当神经元从心室区迁移的停止信号。然后在此停止的神经元可以程序化用于进一步迁移到皮质板中的特定层。
[0045] 软骨素的功能在很大程度上取决于其作为一部分的整个蛋白聚糖的性质。这些功能可大致分为结构作用和调节作用。然而,这种划分并非绝对的,一些蛋白聚糖兼具结构作
用和调节作用。
[0046] 在某些实施方案中,本文提供了具有特定修饰模式的来源于能够进行特定硫酸软骨素生物合成的细胞系的硫酸软骨素组合物。在各个实施方案中,如本文所用的,特定的硫
酸软骨素生物合成以非限制性实例的方式包括(1)通过遗传修饰增加或减少细胞系中的
(a)硫酸软骨素聚合;(b)硫酸软骨素硫酸化;(c)硫酸软骨素磷酸化和/或(d)硫酸软骨素中
GlcNAc基团的脱乙酰化;和/或(2)促进(a)硫酸软骨素键断裂;(b)连接硫酸软骨素与核心
蛋白的连接区域的键断裂;(c)硫酸软骨素与连接区域之间的键断裂;(d)硫酸软骨素的硫
酸化(例如,N-硫酸化和/或O-硫酸化);(e)硫酸软骨素中GalN基团的乙酰化;(f)硫酸软骨
素中GlcNAc基团的脱乙酰化;和/或(g)硫酸软骨素磷酸化。在具体的实施方案中,细胞系的
遗传修饰抑制硫酸软骨素的硫酸化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸软
骨素的硫酸化。在一些实施方案中,细胞系的遗传修饰抑制硫酸软骨素的差向异构化。在一
些实施方案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸软骨素的差向异构化。
[0047] 在一些实施方案中,所述硫酸软骨素组合物来源于具有调节(例如,增加或抑制)糖基转移酶的遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,该硫酸软骨素组合物来源于具有遗
传修饰的细胞系,该遗传修饰抑制适于将硫酸软骨素连接至核心蛋白的连接区域的合成、
硫酸软骨素合成的开始、硫酸软骨素的合成或其组合。在一些实施方案中,该硫酸软骨素组
合物来源于具有遗传修饰的细胞系,该遗传修饰调节(例如,增加或抑制)硫酸软骨素
GalNAc转移酶、硫酸软骨素半乳糖基转移酶、硫酸软骨素葡糖醛酸基转移酶、硫酸软骨素N-
乙酰葡糖胺合酶、硫酸软骨素聚合因子或其组合中的一种或多种。在更具体的实施方案中,
细胞系的遗传修饰调节(例如,增加或减少)GalNAc转移酶1、GalNAc转移酶2、硫酸软骨素合
酶1、硫酸软骨素合酶2、硫酸软骨素合酶3、硫酸软骨素聚合因子、硫酸软骨素聚合因子2或
其组合中的一种或多种。
[0048] 在某些实施方案中,所述硫酸软骨素组合物来源于具有调节硫酸化的遗传修饰的细胞系,特别是针对一种或多种磺基转移酶进行了遗传修饰的细胞系。在具体的实施方案
中,该硫酸软骨素组合物来源于经遗传修饰以调节(例如,抑制或增加)硫酸软骨素O-磺基
转移酶(非限制性实例)的细胞系。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系调节(例如,
抑制或增加)硫酸软骨素O-磺基转移酶,如软骨素4-O-磺基转移酶1、软骨素4-O-磺基转移
酶2、软骨素4-O-磺基转移酶3、软骨素4-O-磺基转移酶5、软骨素6-O-磺基转移酶、软骨素6-O-磺基转移酶2或其组合中的一种或多种(非限制性实例)。在一些实施方案中,遗传修饰的
细胞系调节连接四糖中的木糖的2-O磷酸化。
[0049] 在某些实施方案中,所述硫酸软骨素组合物来源于改变或破坏硫酸软骨素性质(例如,改变或破坏硫酸软骨素的N-乙酰化、4-O硫酸化和6-O硫酸化的含量、硫酸软骨素的
差向异构化、硫酸软骨素的链长或其组合)的经遗传修饰的细胞系,该改变或破坏是与天然
存在的硫酸软骨素相比且其量足以产生具有改变或破坏的硫酸软骨素对蛋白质配体的结
合、硫酸软骨素依赖性信号传导途径或其组合的硫酸软骨素组合物。在具体的实施方案中,
遗传修饰的细胞系改变硫酸软骨素的性质,使其改变硫酸软骨素信号传导。在其他具体的
实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸软骨素的性质,使其改变硫酸软骨素与蛋白质的
结合。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸软骨素的性质,使其改变硫酸软
骨素结合和硫酸软骨素信号传导。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸软骨素
的性质,使其在不存在硫酸软骨素抑制剂的情况下改变经受硫酸软骨素结合、信号传导或
其组合的任何蛋白质(包括多肽)的结合、信号传导或其组合。
硫酸皮肤素组合物
[0050] 硫酸皮肤素是硫酸软骨素的修饰形式,其中一部分D-葡糖醛酸酯残基被差向异构化为L-艾杜糖醛酸酯。硫酸皮肤素多见于皮肤中,但也存在于血管、心脏瓣膜、肌和肺中。
硫酸皮肤素被认为在包括但不限于凝血、心血管疾病、癌发生、感染、伤口修复和纤维化的
生理过程中起作用。在黏多糖代谢病和心血管二尖瓣变性(包括二尖瓣脱垂和二尖瓣关闭
不全)中观察到硫酸皮肤素的异常累积。
[0051] 在某些实施方案中,本文提供了具有特定修饰模式的来源于能够进行特定硫酸皮肤素生物合成的细胞系的硫酸皮肤素组合物。在各个实施方案中,如本文所用的,特定的硫
酸皮肤素生物合成以非限制性实例的方式包括(1)通过遗传修饰增加或减少细胞系中的
(a)硫酸皮肤素聚合;(b)硫酸皮肤素硫酸化;(c)硫酸皮肤素中葡糖醛酸基团的差向异构
化;(d)硫酸皮肤素磷酸化和/或(e)硫酸皮肤素中GlcNAc基团的脱乙酰化;和/或(2)促进
(a)硫酸皮肤素键断裂;(b)连接硫酸皮肤素与核心蛋白的连接区域的键断裂;(c)硫酸皮肤
素与连接区域之间的键断裂;(d)硫酸皮肤素的硫酸化(例如,N-硫酸化和/或O-硫酸化);
(e)硫酸皮肤素中GalN基团的乙酰化;(f)硫酸皮肤素中GlcNAc基团的脱乙酰化;(g)硫酸皮
肤素磷酸化,和/或(h)硫酸皮肤素中葡糖醛酸基团的差向异构化。在具体的实施方案中,细
胞系的遗传修饰抑制硫酸皮肤素的硫酸化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰增加
硫酸皮肤素的硫酸化。在其他实施方案中,细胞系的遗传修饰抑制硫酸皮肤素的差向异构
化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸皮肤素的差向异构化。
[0052] 在一些实施方案中,所述硫酸皮肤素组合物来源于具有调节(例如,增加或抑制)糖基转移酶的遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素组合物来源于具有遗
传修饰的细胞系,该遗传修饰抑制适于将硫酸皮肤素连接至核心蛋白的连接区域的合成、
硫酸皮肤素合成的开始、硫酸皮肤素的合成或其组合。在一些实施方案中,该硫酸皮肤素组
合物来源于具有遗传修饰的细胞系,该遗传修饰调节(例如,增加或抑制)硫酸软骨素
GalNAc转移酶、硫酸软骨素半乳糖基转移酶、硫酸软骨素葡糖醛酸基转移酶、硫酸软骨素N-
乙酰葡糖胺合酶、硫酸软骨素聚合因子或其组合中的一种或多种。在更具体的实施方案中,
细胞系的遗传修饰调节(例如,增加或减少)GalNAc转移酶1、GalNAc转移酶2、硫酸软骨素合
酶1、硫酸软骨素合酶2、硫酸软骨素合酶3、硫酸软骨素聚合因子、硫酸软骨素聚合因子2或
其组合中的一种或多种。
[0053] 在某些实施方案中,所述硫酸皮肤素组合物来源于具有调节硫酸化的遗传修饰的细胞系,特别是针对一种或多种磺基转移酶进行了遗传修饰的细胞系。在具体的实施方案
中,该硫酸皮肤素组合物来源于经遗传修饰以调节(例如,抑制或增加)硫酸皮肤素O-磺基
转移酶(非限制性实例)的细胞系。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系调节(例如,
抑制或增加)硫酸皮肤素O-磺基转移酶,如硫酸皮肤素4-O-磺基转移酶(非限制性实例)。在
一些实施方案中,遗传修饰的细胞系调节(例如,抑制或增加)硫酸皮肤素差向异构酶,如硫
酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶1、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样或其组合(非限制
性实例)。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系调节连接四糖中的木糖的2-O磷酸化。
[0054] 在某些实施方案中,所述硫酸皮肤素组合物来源于改变或破坏硫酸皮肤素性质(例如,改变或破坏硫酸皮肤素的N-乙酰化、4-O硫酸化和6-O硫酸化的含量、硫酸皮肤素的
差向异构化、硫酸皮肤素的链长或其组合)的经遗传修饰的细胞系,该改变或破坏是与天然
存在的硫酸皮肤素相比且其量足以产生具有改变或破坏的硫酸皮肤素对蛋白质配体的结
合、硫酸皮肤素依赖性信号传导途径或其组合的硫酸皮肤素组合物。在具体的实施方案中,
遗传修饰的细胞系改变硫酸皮肤素的性质,使其改变硫酸皮肤素信号传导。在其他具体的
实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸皮肤素的性质,使其改变硫酸皮肤素与蛋白质的
结合。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸皮肤素的性质,使其改变硫酸皮
肤素结合和硫酸皮肤素信号传导。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸皮肤素
的性质,使其在不存在硫酸皮肤素抑制剂的情况下改变经受硫酸皮肤素结合、信号传导或
其组合的任何蛋白质(包括多肽)的结合、信号传导或其组合。
硫酸角质素组合物
[0055] 硫酸角质素(KS),也称硫酸角质,是特别在角膜、软骨和骨中发现的若干种硫酸化糖胺聚糖(结构碳水化物)中的任一种。硫酸角质素还在中枢神经系统中合成,其在中枢神
经系统中参与发育和损伤后的胶质瘢痕形成。硫酸角质素是高度水合的大分子,其在关节
中可以充当吸收机械冲击的缓冲物。
[0056] 与其他糖胺聚糖类似,硫酸角质素是由重复二糖单元组成的线性聚合物。硫酸角质素以这样的蛋白聚糖存在,其中硫酸角质素链附接至被称为核心蛋白的细胞表面蛋白或
细胞外基质蛋白。硫酸角质素核心蛋白包括光亮蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、Mimecan、纤调蛋白聚糖、PRELP、骨黏附蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。硫酸角质素内的基本重复二糖单元是-
3Galβ1-4GlcNAcβ1-。其可以在Gal单糖或GlcNAc单糖之一或二者的碳位6(C6)处被硫酸化。
然而,特定硫酸角质素类型的详细一级结构被认为是最好由以下三个区域组成:1)连接区,
在其一端硫酸角质素链与核心蛋白连接,2)重复区,由-3Galβ1-4GlcNAcβ1-重复二糖单元
组成,以及3)链封端区,存在于硫酸角质素链相对于蛋白质连接区的相对端。单糖甘露糖存
在于硫酸角质素I型(KSI)的连接区内。KSII重复区内的二糖可以是岩藻糖基化的,并且N-
乙酰神经氨酸封闭所有硫酸角质素II型(KSII)链和高达70%的KSI型链的末端。
[0057] 在某些实施方案中,本文提供了具有特定修饰模式的来源于能够进行特定硫酸角质素生物合成的细胞系的硫酸角质素组合物。在各个实施方案中,如本文所用的,特定的硫
酸角质素生物合成以非限制性实例的方式包括(1)通过遗传修饰增加或减少细胞系中的
(a)硫酸角质素聚合;(b)硫酸角质素硫酸化;(c)硫酸角质素中基团的差向异构化;(d)硫酸
角质素磷酸化和/或(e)硫酸角质素中基团的脱乙酰化;和/或(2)促进(a)硫酸角质素键断
裂;(b)连接硫酸角质素与核心蛋白的连接区域的键断裂;(c)硫酸角质素与连接区域之间
的键断裂;(d)硫酸角质素的硫酸化(例如,N-硫酸化和/或O-硫酸化);(e)硫酸角质素中基
团的乙酰化;(f)硫酸角质素中基团的脱乙酰化;(g)硫酸角质素磷酸化和/或(h)硫酸角质
素中基团的差向异构化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰抑制硫酸角质素的硫酸
化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传修饰增加硫酸角质素的硫酸化。在其他实施方案
中,细胞系的遗传修饰抑制硫酸角质素的差向异构化。在具体的实施方案中,细胞系的遗传
修饰增加硫酸角质素的差向异构化。
[0058] 在一些实施方案中,所述硫酸角质素组合物来源于具有调节(例如,增加或抑制)糖基转移酶的遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,该硫酸角质素组合物来源于具有遗
传修饰的细胞系,该遗传修饰抑制适于将硫酸角质素连接至核心蛋白的连接区域的合成、
硫酸角质素合成的开始、硫酸角质素的合成或其组合。
[0059] 在某些实施方案中,所述硫酸角质素组合物来源于具有调节硫酸化的遗传修饰的细胞系,特别是针对一种或多种磺基转移酶进行遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,遗
传修饰的细胞系调节(例如,抑制或增加)硫酸角质素差向异构酶。
[0060] 在某些实施方案中,所述硫酸角质素组合物来源于改变或破坏硫酸角质素性质(例如,改变或破坏硫酸角质素的N-乙酰化、4-O硫酸化和6-O硫酸化含量、硫酸角质素的差
向异构化、硫酸角质素的链长或其组合)的经遗传修饰的细胞系,该改变或破坏是与天然存
在的硫酸角质素相比且其量足以产生具有改变或破坏的硫酸角质素对蛋白质配体的结合、
硫酸角质素依赖性信号传导途径或其组合的硫酸角质素组合物。在具体的实施方案中,遗
传修饰的细胞系改变硫酸角质素的性质,使其改变硫酸角质素信号传导。在其他具体的实
施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸角质素的性质,使其改变硫酸角质素与蛋白质的结
合。在更具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸角质素的性质,使其改变硫酸角质
素结合和硫酸角质素信号传导。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系改变硫酸角质素的
性质,使其在不存在硫酸角质素抑制剂的情况下改变经受硫酸角质素结合、信号传导或其
组合的任何蛋白质(包括多肽)的结合、信号传导或其组合。
透明质酸组合物
[0061] 透明质酸,也称乙酰透明质酸,是一种阴离子型非硫酸化糖胺聚糖,广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织。由于透明质素是非硫酸化的,在质膜而非高尔基体中形成,
并且可以非常大,其分子量通常达到数百万,因此在糖胺聚糖中,透明质酸是独特的。作为
细胞外基质的主要成分之一,乙酰透明质酸显著地促进细胞增殖和运动,并且还可能参与
一些恶性肿瘤的进展。
[0062] 乙酰透明质酸是唯一在质膜的细胞质中合成的糖胺聚糖,其中生长的聚合物突出到细胞外环境中。因此,乙酰透明质酸可具有通常在104个二糖(作为钠盐为约3.7×106D)的
范围内的不确定且非常大的聚合度,并且端到端长度为约10μm(约1nm/双糖)。因此,乙酰透明质酸的单个分子可以伸展至典型哺乳动物细胞的周长的一半左右。葡糖醛酸残基(pKa 
4-5)上的羧基基团在生理pH和离子强度下主要带负电,使得乙酰透明质酸是聚阴离子。乙
酰透明质酸的阴离子性质连同糖苷键周围的空间限制在大多数生物学环境中赋予单个乙
酰透明质酸分子相对刚性的无规卷曲结构。乙酰透明质酸链占据较大的流体动力学体积,
使得单个高分子量的分子基本上在3-5mg/ml生理溶液中基本上占据所有溶剂。这种排列产
生尺寸选择性屏障,其中小分子可以自由扩散,而较大分子被部分或完全排除。这样的溶液
具有膨胀压力并且展现出带有粘弹性的高粘度,这样的情况存在于人眼的玻璃体液和关节
中。关节滑液中的乙酰透明质酸对于在关节运动过程中分配负荷和保护软骨表面是必不可
少的。因此,在眼睛和关节组织中,乙酰透明质酸的物理特性与组织功能直接相关。
[0063] 在某些实施方案中,本文提供了具有特定修饰模式的来源于能够进行特定乙酰透明质酸生物合成的细胞系的乙酰透明质酸组合物。在各个实施方案中,如本文所用的,特定
的乙酰透明质酸生物合成以非限制性实例的方式包括(1)通过遗传修饰增加或减少细胞系
中的(a)乙酰透明质酸聚合;(b)乙酰透明质酸磷酸化和/或(c)乙酰透明质酸中基团的脱乙
酰化;和/或(2)促进(a)乙酰透明质酸键断裂;(b)连接乙酰透明质酸与核心蛋白的连接区
域的乙酰透明质酸;(c)乙酰透明质酸与连接区域之间的键断裂;(d)乙酰透明质酸中基团
的乙酰化;(e)乙酰透明质酸中基团的脱乙酰化和/或(f)乙酰透明质酸磷酸化。
[0064] 在一些实施方案中,所述乙酰透明质酸组合物来源于具有调节(例如,增加或抑制)糖基转移酶的遗传修饰的细胞系。在一些实施方案中,该乙酰透明质酸组合物来源于具
有遗传修饰的细胞系,该遗传修饰抑制适于将乙酰透明质酸连接至核心蛋白的连接区域的
合成、乙酰透明质酸合成的开始、乙酰透明质酸的合成或其组合。
[0065] 在某些实施方案中,所述乙酰透明质酸组合物来源于改变或破坏乙酰透明质酸性质的经遗传修饰的细胞系,该改变或破坏是与天然存在的乙酰透明质酸相比且其量足以产
生具有改变或破坏的乙酰透明质酸对蛋白质配体的结合、乙酰透明质酸依赖性信号传导途
径或其组合的乙酰透明质酸组合物。在具体的实施方案中,遗传修饰的细胞系改变乙酰透
明质酸的性质,使其改变乙酰透明质酸信号传导。在其他具体的实施方案中,遗传修饰的细
胞系改变乙酰透明质酸的性质,使其改变乙酰透明质酸与蛋白质的结合。在更具体的实施
方案中,遗传修饰的细胞系改变乙酰透明质酸的性质,使其改变乙酰透明质酸结合和乙酰
透明质酸信号传导。在一些实施方案中,遗传修饰的细胞系改变乙酰透明质酸的性质,使其
在不存在乙酰透明质酸抑制剂的情况下改变经受乙酰透明质酸结合、信号传导或其组合的
任何蛋白质(包括多肽)的结合、信号传导或其组合。
细胞产生
[0066] 尽管所有动物细胞均产生糖胺聚糖,如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸,但其大小、组成、二糖组成和硫酸化结构域的分布显著不同。二糖
亚基和硫酸化结构域的不同排列是重要的,因为它们决定蛋白质配体结合特征并由此确定
链的生物学特性。来自经培养的细胞的糖胺聚糖,诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮
肤素、硫酸角质素和透明质酸,显示出与动物组织中所见类似的相关大小、二糖组成和硫酸
化结构域分布。细胞表达以可再现的方式促进糖胺聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸
皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的生产,该生产的规模将允许研究人员检查糖胺聚糖如硫
酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的生物学特性以及分离和鉴
别生物学相关序列,该序列随后可以作为合成生物学相关寡糖的模型。
[0067] 细胞表面和细胞外基质糖胺聚糖结构,诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸,变化极大但能够以组织、发育阶段和病理生理学特异性的方式再现。例如,
在硫酸乙酰肝素生物合成途径中,硫酸乙酰肝素链被合成并且随后被超过25种特异性酶修
饰(图1)。硫酸乙酰肝素生物合成途径中酶的不同表达模式进而导致不同细胞类型和组织
中不同的硫酸乙酰肝素组成。本文公开了通过转染或突变改变生物合成酶的表达模式而工
程化改造细胞表面的组成和细胞培养物(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中所分泌的糖胺聚
糖链的方法和所得的组合物。相应地,本文公开了经工程化改造用于产生糖胺聚糖如硫酸
乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的细胞,该糖胺聚糖具有可再
现的组成、硫酸化模式和配体结合特性。本文还公开了以降低的成本生产以克为规模的糖
胺聚糖组合物如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸皮肤素组合物、硫酸角质素
组合物和透明质酸组合物的方法。
[0068] 本文描述了使用细胞表达系统以可再现的方式以一定规模生产具有不同组成或确定硫酸化模式的糖胺聚糖,诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和
透明质酸,该规模允许研究人员检查糖胺聚糖的生物学性质。在一些实施方案中,细胞表达
系统包括经遗传修饰的细胞,从该细胞得到具有确定硫酸化模式的硫酸乙酰肝素组合物。
在一些实施方案中,经遗传修饰的细胞缺乏编码修饰硫酸乙酰肝素链的酶的一种或多种基
因。在一些实施方案中,经遗传修饰的细胞对于编码修饰硫酸乙酰肝素链的酶的一种或多
种基因是转基因的。在一些实施方案中,该基因编码修饰硫酸乙酰肝素链的酶,该酶选自硫
酸酯酶、N-脱乙酰酶、合酶、乙酰半乳糖胺基转移酶、聚合因子、磺基转移酶、差向异构酶、N-脱乙酰酶/磺基转移酶、硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、磺酸胺酶、N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖苷酶、木糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡糖苷酸基转移酶、乙酰肝素酶中的一种或多种。在一些实施方案中,该基因编码蛋白聚糖核心蛋白,如任何膜蛋白聚糖(例
如,磷脂酰肌醇蛋白聚糖、共结合蛋白聚糖或任何分泌的蛋白聚糖(例如,丝甘蛋白、基底膜聚糖、胶原蛋白XVIII或聚集蛋白)。在一些实施方案中,该基因选自硫酸软骨素合酶1或3
(ChSy)、硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(CSGalNAcT2)、软骨素聚合因子(ChPF)、硫
酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶(Hs2st)、葡糖醛酸差向异构酶(GLce)、硫酸乙酰肝素N-脱乙酰
酶/磺基转移酶-1、2、3或4(Ndst1-4)、6-O-磺基转移酶1、2、3(Hs6st1-3)、3-O-磺基转移酶
1、2、3、4、5、6(Hs6st1-6)、硫酸酯酶1(Sulf1)、硫酸酯酶2(Sulf2)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gusb)、半乳糖胺-6硫酸酯酶(GalNs)、α-L-艾杜糖苷酸酶(idua)、磺酸胺酶(Sgsh)、葡糖胺N-乙酰转移酶(HGSNAT)、糖醛酸-2-硫酸酯酶(Ids)、α-N-乙酰葡糖苷酶(Naglu)、PAPS合酶
(PAPSS1、PAPSS2)、木糖基转移酶1(Xylt1)、木糖基转移酶2(Xylt2)、半乳糖基转移酶1
(B4galt1)、半乳糖基转移酶2(B4galt2)、葡糖苷酸基转移酶1(Glcat1)、Exostosin-样糖基
转移酶3(Extl3)、Exostosin糖基转移酶1(Ext1)、Exostosin糖基转移酶2(Ext2)、乙酰肝素
酶(Hpse)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(Gpc1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(Gpc2)、磷脂酰肌醇蛋白聚
糖3(Gpc3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(Gpc4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(Gpc5)、磷脂酰肌醇蛋白
聚糖6(Gpc6)、共结合蛋白聚糖1(Sdc1)、共结合蛋白聚糖2(Sdc2)、共结合蛋白聚糖3
(Sdc3)、共结合蛋白聚糖4(Sdc4)、β聚糖(Ggcan/Tgfbr3)、cd44v3(Cd44v3)、神经纤毛蛋白1(Nrp1)、CD47(Cd47)、丝甘蛋白(Srgn)、基底膜聚糖(plc)、聚集蛋白(Argn)和胶原蛋白18
(Col18a1)。
[0069] 本文描述了使用细胞表达系统以可重复的方式以一定规模生产具有不同组成或确定硫酸化模式的糖胺聚糖,诸如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和
透明质酸,该规模允许研究人员检查糖胺聚糖的生物学性质。在一些实施方案中,细胞表达
系统包括经遗传修饰的细胞,从该细胞得到具有确定硫酸化模式的硫酸软骨素组合物。在
一些实施方案中,经遗传修饰的细胞缺乏编码修饰硫酸软骨素链的酶的一种或多种基因。
在一些实施方案中,经遗传修饰的细胞对于编码修饰硫酸软骨素链的酶的一种或多种基因
是转基因的。在一些实施方案中,该基因编码修饰硫酸软骨素链的酶,该酶选自GalNAc转移
酶、硫酸软骨素合酶、硫酸软骨素聚合因子、磺基转移酶或差向异构酶中的一种或多种。在
一些实施方案中,该基因编码蛋白聚糖核心蛋白,如任何蛋白聚糖(例如,聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、骺蛋白聚糖、IX型前胶原,α2、DSD-1-蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、血栓调节蛋白、Endocan、皮屑蛋白、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、睾丸蛋白聚糖1、睾丸蛋白聚糖2、Lubricin、NG2、不变链或CD44)。在一些实施方案中,该基因选自GalNAc转移酶1(CsGalNAcT1)、GalNAc转移酶2(CsGalNAcT2)、硫酸软骨素合酶1(GlcAT
和GalNAcT活性)(Chsy1)、硫酸软骨素合酶3(Chsy3)、硫酸软骨素聚合因子(Chpf)、硫酸软
骨素聚合因子2(Chpf2)、软骨素4-O-磺基转移酶1(Chst11)、软骨素4-O-磺基转移酶2
(Chst12)、软骨素4-O-磺基转移酶3(Chst13)、软骨素4-硫酸盐6-O-磺基转移酶5(Chst15)、
软骨素6磺基转移酶-1(Chst3)、软骨素6-O-磺基转移酶2(Chst7)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5
差向异构酶1(Dse)、硫酸皮肤素葡糖醛酸C5差向异构酶样(Dsel)、硫酸皮肤素4-O-磺基转
移酶(Chst14)、聚集蛋白聚糖(CSPG1)(Agc1)、多功能蛋白聚糖/PG-M(CSPG2)(Vcan)、神经
蛋白聚糖(CSPG3)(Ncan)、短小蛋白聚糖(BCAN)(Bcan)、骺蛋白聚糖(Dspg3)(Epyc)、IX型前
胶原,α2(Col9a2)、DSD-1-蛋白聚糖,磷酸蛋白聚糖(Ptprz1)、血栓调节蛋白(Thbd)、
Endocan(Esm1)、皮屑蛋白(脯氨酰3-羟化酶1)(Lepre1)、饰胶蛋白聚糖(Dcn)、双糖链蛋白
聚糖(Bgn)、睾丸蛋白聚糖1(Spock1;骨粘连蛋白1)(Spock1)、睾丸蛋白聚糖2(Spock2,骨粘连蛋白2)(Spock2)、睾丸蛋白聚糖2(Spock3;骨粘连蛋白3)(Spock3)、蛋白聚糖-4
(Lubricin)(Prg4)、NG2(CSPG4)(Cspg4)、不变链(Cd74)和CD44(Cd44)。
[0070] 本文公开了来源于经遗传修饰的细胞系的包含糖胺聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸的组合物。该遗传修饰的细胞系是包含细胞群体
的细胞系。在一些实施方案中,该细胞选自293T细胞、3T3细胞、4T1细胞、721细胞、9L细胞、A2780细胞、A2780ADR细胞、A2780cis细胞、A172细胞、A20细胞、A253细胞、A431细胞、A-549细胞、ALC细胞、B16细胞、B35细胞、BCP-1细胞、BEAS-2B细胞、bEnd.3细胞、BHK-21细胞、BR 
293细胞、BxPC3细胞、C2C12细胞、C3H-10T1/2细胞、C6/36细胞、C6细胞、Cal-27细胞、CGR8细胞、CHO细胞、COR-L23细胞、COR-L23/CPR细胞、COR-L23/5010细胞、COR-L23/R23细胞、COS-7细胞、COV-434细胞、CML T1细胞、CMT细胞、CT26细胞、D17细胞、DH82细胞、DU145细胞、DuCaP细胞、E14Tg2a细胞、EL4细胞、EM2细胞、EM3细胞、EMT6/AR1细胞、EMT6/AR10.0细胞、FM3细胞、H1299细胞、H69细胞、HB54细胞、HB55细胞、HCA2细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、
Hepa1c1c7细胞、High Five细胞、HL-60细胞、HMEpC细胞、HT-29细胞、HUVEC细胞、Jurkat细胞、J558L细胞、JY细胞、K562细胞、KBM-7细胞、Ku812细胞、KCL22细胞、KG1细胞、KYO1细胞、LNCap细胞、Ma-Mel细胞、MC-38细胞、MCF-7细胞、MCF-10A细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-
157细胞、MDA-MB-361细胞、MDCK II细胞、MG63细胞、MOR/0.2R细胞、MONO-MAC 6细胞、MRC5细胞、MTD-1A细胞、MyEnd细胞、NCI-H69/CPR细胞、NCI-H69/LX10细胞、NCI-H69/LX20细胞、NCI-H69/LX4细胞、NIH-3T3细胞、NALM-1细胞、NW-145细胞、OPCN/OPCT细胞、Peer细胞、PNT-
1A/PNT 2细胞、PTK2细胞、Raji细胞、RBL细胞、RenCa细胞、RIN-5F细胞、RMA/RMAS细胞、S2细胞、Saos-2细胞、Sf21细胞、Sf9细胞、SiHa细胞、SKBR3细胞、SKOV-3细胞、T2细胞、T-47D细胞、T84细胞、U373细胞、U87细胞、U937细胞、VCaP细胞、Vero细胞、WM39细胞、WT-49细胞、X63细胞、YAC-1细胞、YAR细胞或ATCC目录中描述的其他动物细胞。在一些情况下,该细胞为动
物细胞。在一些情况下,该细胞为哺乳动物细胞。在一些情况下,该细胞为小鼠细胞、大鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人类细胞。
[0071] 通过包括但不限于RNAi;CRISPR/CAS;转基因细胞;来自转基因动物的细胞;来自敲除动物的细胞;利用质粒的转染;或利用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒的感
染等方法产生遗传修饰的细胞系。
[0072] 在一些情况下,经遗传修饰的细胞系在遗传上缺乏一种或多种基因或者一种或多种靶基因。在遗传上缺乏的细胞系通过本领域技术人员已知的多种技术制备。在一些情况
下,利用表达降低或消除靶基因表达的RNAi或shRNA的质粒或病毒来转化或转染细胞。在一
些情况下,利用降低或消除靶基因表达的双链siRNA来转染细胞。在一些情况下,当使用
CRISPR/Cas系统从细胞系的基因组中消除靶基因时,产生经遗传修饰的细胞系。在一些情
况下,细胞系来源于缺乏靶基因的经遗传修饰的动物,或敲除动物。
[0073] 在一些情况下,经遗传修饰的细胞系对于一种或多种基因或者一种或多种靶基因是转基因的。转基因细胞系通过本领域技术人员已知的多种技术制备。在一些情况下,利用
表达该基因的质粒或病毒来转化或转染细胞。在一些情况下,利用表达靶基因的病毒(诸如
逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或感染动物细胞的其他病毒)来感染细胞。在一些情况下,转基因取代细胞系中的内源基因,从而产生“敲入”细胞系。在一些情况下,使用
CRISPR/Cas技术产生“敲入”细胞系。在一些情况下,转基因细胞来源于靶基因是转基因的
动物。
[0074] 本文还描述了用于生物医学和药物研究的研究组合物。在一些情况下,研究组合物包括但不限于细胞外基质、微阵列、96孔板中的结构文库、配体结合测定、配体结合竞争
测定、体外和体内生物学实验。在一些情况下,细胞外基质组合物用于细胞培养。
生产糖胺聚糖组合物的方法
[0075] 本文公开了包含确定修饰模式的糖胺聚糖组合物,如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸皮肤素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物,其来源于本文所
述的经遗传修饰的细胞系。从培养的细胞中纯化糖胺聚糖组合物如硫酸乙酰肝素组合物、
硫酸软骨素组合物、硫酸皮肤素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物的方法是本
领域技术人员已知的。在一些实施方案中,从细胞培养基中纯化该组合物。在一些实施方案
中,从裂解的细胞中纯化该组合物。在一些实施方案中,使用色谱柱纯化该组合物。在一些
实施方案中,使用离子交换柱如阴离子交换柱纯化该组合物。在一些实施方案中,使用亲和
柱纯化该组合物。在一些实施方案中,使用大小排阻柱纯化该组合物。在一些实施方案中,
使用诸如蛋白酶和/或核酸酶等酶或消化DS、KS、CS、HS或透明质酸(HA)的酶从污染蛋白质
和/或核酸中纯化该组合物。在一些实施方案中,使用大小排阻柱从污染盐中纯化该组合
物。细胞系可以在有或没有血清(优选没有)的标准细胞培养条件下生长。为了增加产量,可
使用不同的生长培养基和添加剂。为了增加产量,细胞可以在不同大小和许多不同类型的
生物反应器中生长,包括但不限于大桶、中空纤维和一次性塑料。可通过使用不同的生长培
养基和添加剂以及通过调节生长条件参数(如氧水平和pH)来增加生物反应器中的产量。用
于小规模生产和大规模生产的纯化方法是类似的,但是具有更大试剂体积和/或柱树脂
积的更大规模生产的产量增加。
[0076] 在一些实施方案中,本文所述的处理包括用于纯化糖胺聚糖组合物如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸皮肤素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物的
其他处理步骤。例如,在一些实施方案中,从被均质化的样品中纯化糖胺聚糖组合物。在具
体的实施方案中,均质化以任何合适的方式实现,其非限制性实例包括利用碱性溶液(例
如,0.1N NaOH)、超声处理、组织研磨或其他化学试剂。
[0077] 在一些实施方案中,使用任何合适的纯化技术来纯化本文所述的糖胺聚糖组合物如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸皮肤素组合物、硫酸角质素组合物和透明
质酸组合物。在某些实施方案中,该纯化技术包括电泳、色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、分子筛色谱法、亲和色谱法、排阻、过滤、沉淀、渗透、重结晶、氟相纯化、蒸馏、萃取、层析聚焦等。
[0078] 在另一个非限制性实例中,使用含有10mM EDTA、蛋白酶抑制剂(10mM NEM、1mM PMSF、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂A和0.5μg/ml亮抑酶肽)的冷冻盐酸胍/两性洗涤剂提取缓冲
液来提取包含肝素和/或硫酸乙酰肝素组合物的细胞或条件培养基。将提取的样品离心以
去除不溶的残余物。任选地对沉淀物进行重新提取并离心。在DEAE-Sephacel柱上通过阴离
子交换色谱法以结合和洗脱程序从提取物中纯化肝素和/或硫酸乙酰肝素。使用Sephadex 
G-25凝胶过滤将洗脱的肝素和/或硫酸乙酰肝素组合物脱盐,随后冻干并在生理学上可接
受的缓冲液中再水合。其他细节和替代纯化程序可见于Esko,J.Special Considerations 
for  Proteoglycans  and  Glycosaminoglycans  and  Their 
Purification.2000.Curr.Protoc.Mol.Biol.22:17.2.1-17.2.9,其通过引用以其全文并
入本文。
[0079] 在一些实施方案中,发现肝素和/或硫酸乙酰肝素组合物自然地附接至核心蛋白(一起形成蛋白聚糖)。在某些实施方案中,本文所用的纯化过程是包括将核心蛋白与肝素
和/或硫酸乙酰肝素切割开的方案的方法(例如,利用蛋白酶如非特异性蛋白酶(例如,链霉
蛋白酶)进行处理以切割该蛋白;或通过化学手段(β-消除化学法)进行处理)。在其他实施
方案中,本文所述的纯化方法不包括将核心蛋白与肝素和/或硫酸乙酰肝素切割开的方案。
在一些实施方案中,使用酶进一步纯化肝素和/或硫酸乙酰肝素组合物,所述酶包括但不限
于DNA酶、RNA酶、软骨素酶ABC、透明质酸酶及其组合。
药物组合物
[0080] 本文公开了药物组合物,其包含来源于如本文所述的经遗传修饰细胞系的具有确定修饰模式的一种或多种糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质
酸)组合物以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中,使用一种或
多种生理学上可接受的载体以常规方式配制药物组合物,该生理学上可接受的载体包括例
如有利于活性化合物加工成适于药用的制剂的赋形剂和助剂。在某些实施方案中,合适的
制剂取决于所选择的施用途径。本文所述的药物组合物的概述见于例如Remington:The 
Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing 
Company,1995);Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack 
Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975;Liberman,H.A.和Lachman,L编著,
Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;和Pharmaceutical 
Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh编著(Lippincott Williams&
Wilkins1999)。
[0081] 如本文所用的,药物组合物是指一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物与其他化学组分(如载
体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂)的混合物。在某些情况下,该药物组合物有利于向个体或细胞施用具有确定修饰模式的糖胺聚糖组合物,如硫酸乙酰肝素组
合物、硫酸软骨素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物。在实施本文提供的治疗或
使用方法的某些实施方案中,治疗有效量的本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如
硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物在药物组合物中施用于患有待
治疗的疾病、病症或病况的个体。在具体的实施方案中,该个体是人。如本文所讨论的,本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质
酸)组合物可单独使用或与一种或多种附加治疗剂联合使用。
[0082] 在某些实施方案中,将一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物与一种或多种其他活性药物成
分组合。在一些情况下,一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰
肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物与其他活性药物成分一起充当药物组合
物中的赋形剂。在一些情况下,一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫
酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物充当药物组合物中的佐剂。在一
些情况下,一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软
骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物增强药物组合物中其他组分的活性。在一些实施方案
中,该其他组分是蛋白质、核酸、脂质或小分子。
[0083] 在某些实施方案中,本文所述的药物制剂以包括以下多种施用途径中的一种或多种在内的任何方式施用于个体:如口服、肠胃外(例如,静脉内、皮下、肌肉内)、鼻内、颊部、局部、直肠或经皮的施用途径(非限制性实例)。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液
体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、快速熔融制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合的立即释放和控制释放制剂。
[0084] 包含本文所述化合物的药物组合物任选地以常规方式制备,仅举例来说,该常规方式是诸如通过常规混合、溶解、颗粒化、制糖衣、磨细、乳化、包封、包埋或压缩工艺。
[0085] 在某些实施方案中,本文所述的药物组合物包含作为活性成分的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖组合物,如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、
硫酸角质素组合物和透明质酸组合物,其呈游离酸或游离碱形式或者药学上可接受的盐形
式。在一些实施方案中,本文所述的化合物以结晶或冻干形式使用。在某些实施方案中,使
用本文所述化合物的活性代谢物或前药。在一些情况下,本文所述的化合物作为不同的立
体异构体存在。所有立体异构体都包含在本文提供的化合物范围内。在某些实施方案中,本
文所述的化合物以非溶剂化或溶剂化形式存在,其中溶剂化形式包含任何药学上可接受的
溶剂,例如水、乙醇等。本文提出的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物的溶剂形式也被认为是本文所公开的。
[0086] 在一些实施方案中,“载体”包括药学上可接受的赋形剂,并且其选择是基于与本文公开的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明
质酸)组合物的相容性和所需剂型的释放曲线特性。示例性载体材料包括例如粘合剂、悬浮
剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。参见,例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth编著(Easton,Pa.:Mack 
Publishing Company,1995);Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975;Liberman,H.A和Lachman,L编著,
Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;和Pharmaceutical 
Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh编著(Lippincott Williams&
Wilkins1999)。
[0087] 此外,在某些实施方案中,将本文所述的药物组合物配制成剂型。因此,在一些实施方案中,本文提供了包含本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫
酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物的剂型,该剂型适于施用于个体。在某些实施方
案中,合适剂型的非限制性实例包括水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液、固体口服剂型、气溶胶、控制释放制剂、快速熔融制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合的立即释放和控制释放制剂。
[0088] 本文所述的药物固体剂型任选地包括本文所述的其他治疗化合物,以及一种或多种药学上可接受的添加剂,诸如相容的载体、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂防腐剂或其一种或多种组合。在一些方面,使用包覆程序,如Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版(2000)中描述的包覆程序,在具有确定
修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物的制
剂周围提供薄膜包衣。在一个实施方案中,本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫
酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物是颗粒形式,并且化合物颗粒中
的一些或全部被包覆。在某些实施方案中,本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫
酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物的颗粒中的一些或全部被微囊
化。在一些实施方案中,本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸
软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物的颗粒未被微囊化且是未包覆的。
[0089] 在某些实施方案中,本文所述的药物组合物是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中,制剂被分成含有适量的一种或多种治疗化合物的单位剂量。在一些实施
方案中,单位剂量是包含不连续量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊
以及小瓶或安瓿中的粉末。任选地将水性悬浮液组合物包装在单剂量的不可重新封闭的容
器中。在一些实施方案中,使用多剂量的可重新封闭的容器。在某些情况下,多剂量容器包
含组合物中的防腐剂。仅举例来说,用于肠胃外注射的制剂存在于单位剂型(其包括但不限
于安瓿)或存在于添加有防腐剂的多剂量容器中。
治疗方法
[0090] 除了应用于研究,硫酸乙酰肝素和其他糖胺聚糖以及蛋白聚糖具有在许多医学治疗中作为药物或营养制剂中的功能成分的潜在应用,该医学治疗包括血栓形成、炎症、癌
症、微生物感染、神经退行性疾病和创伤愈合等。药用肝素是一种广泛使用的可商业制备的
级分,其由于抗凝血特性而在治疗上使用以治疗和预防血栓形成疾病。然而,肝素具有许多
负面属性,包括引起血小板减少和出血性出血的倾向。这种倾向可以通过工程化改造细胞
以产生硫酸乙酰肝素/肝素组合物来减少,该硫酸乙酰肝素/肝素组合物保留显著的抗凝血
酶结合但血小板因子4(PF4)结合减少。肝素还具有天然较高的结构多样性,这可导致治疗
剂量窗口的显著波动。由遗传修饰的细胞系产生的确定的硫酸乙酰肝素组合物将会相较于
目前可用的疗法提供明显的优势和改进。
[0091] 已经从海洋无脊椎动物生物体制备了多种新的硫酸乙酰肝素/肝素结构。初步表征已经鉴别出独特的抗凝血特性,这种独特的抗凝血特性似乎与相比于肝素显著减少的出
血效果和其他优势相关。已经从有肺腹足动物(蜗)——褐玛瑙螺(A.fulica)中分离出
一种类似于硫酸乙酰肝素和肝素、被称为acharan sulfate(AS)的独特无脊椎动物结构。尽
管硫酸化含量较低且结构简单,但AS表现出多种药用特性,包括bFGF促有丝分裂、抗凝血、
炎症模型中的抗血管生成、免疫刺激、降血糖、降血脂、肿瘤抑制、抗菌以及对创伤愈合的帮助等。这些新型组合物中的一些可能需要新的酶和其他因子,然而,一旦对它们有了解,可
以将细胞工程化改造以产生足量的这些结构,从而在商业上利用这些医学应用。
[0092] 因此,本文公开了通过施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物来治疗有需要的
受试者的疾病的方法。在一些实施方案中,该疾病包括本领域技术人员已知的血栓形成、炎
症、癌症、微生物感染、神经退行性疾病、创伤愈合以及已知与糖胺聚糖和/或硫酸乙酰肝素有关的其他疾病中的一种或多种。
[0093] 在一些实施方案中,本文公开的组合物或药物组合物通过本领域已知的任何途径施用于受试者,发现其有效治疗血栓形成、炎症、癌症、微生物感染、神经退行性疾病和创伤愈合等。在一些实施方案中,本文公开的组合物或药物组合物通过口服、直肠、舌下、唇下、颊部、硬脑膜外、大脑内、脑室内、局部、经皮、鼻内、动脉内、关节内、心内、皮内、皮下、病灶内、肌肉内、眼内、骨内、腹膜内、鞘内、静脉内、经粘膜或本领域技术人员已知的任何其他施用途径来施用。
血栓形成的治疗
[0094] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的血栓形成的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖组合物,如
硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物。在一些实
施方案中,该血栓形成包括静脉血栓形成、深静脉血栓形成、门静脉血栓形成、肾静脉血栓
形成、颈静脉血栓形成、Budd-Chiari综合征、Paget-Schroetter病、脑静脉窦血栓形成、海绵窦血栓形成、动脉血栓形成、中风、心肌梗死、肝动脉血栓形成、急性冠脉综合征心房颤动或肺栓塞。在一些实施方案中,该血栓形成的治疗减轻肿胀、疼痛、触痛、皮肤变色、呼吸短促、胸痛、心率加快、咳嗽或其他血栓形成症状。在一些实施方案中,该方法预防或消除血。在一些实施方案中,该方法预防或消除血凝块而不引起肝素诱导的血小板减少。
炎症的治疗
[0095] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的炎症的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖组合物,如硫酸
乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物。在一些实施方
案中,该炎症包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化(MS)、脑脊髓炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、变应性哮喘、自身免疫性甲状腺炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、银屑病、 综合征、克罗恩病、口疮性溃疡、虹膜
炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎(UC)、炎性肠病(IBD)、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性
血小板减少、多软骨炎、Wegener肉芽肿病、慢性活动性肝炎、Stevens-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、Graves病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎、间质性肺纤维化、Hashimoto甲状腺炎、自身免疫性多腺体综合征、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,I型糖尿病)、胰岛素抵抗性糖尿病(2型糖尿病)、免疫介导的不育症、自身免疫性Addison病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性脱发、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、Guillain-Barre综合征、僵人综合征、急性风湿
热、交感性眼炎、Goodpasture综合征、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征或变态反应、
Behcet病、X连锁淋巴组织增生综合征(SH2D1A/SAP缺乏症)、高IgE综合征或移植物抗宿主
病(GVHD)。在一些实施方案中,该炎症的治疗减轻疼痛、发红、肿胀、关节功能丧失、发热、发冷、疲劳、头痛、食欲不振、肌肉僵硬或与炎症或炎性疾病相关的其他症状。
癌症的治疗
[0096] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确的修饰模式的糖胺聚糖组合物,如硫酸
乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸角质素组合物和透明质酸组合物。在一些实施方
案中,该癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白
血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼
粒细胞性白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK-细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B-细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、明细胞
肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、非乳腺性佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、Krukenberg瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性棒状瘤、恶性特里顿瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞淋巴瘤、纵膈生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合Mullerian瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌症、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节型黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤学、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺Paget病、Pancoast瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹
膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾腺癌、肉瘤、施万鞘瘤神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、塞莱细胞瘤、性索间质瘤、Sezary综合征、Signet细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、表浅扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血
病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、Verner Morrison综合征、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、Warthin瘤、Wilms瘤或其他类型癌症。在一些实施方案中,该癌症包括一种或多种上述癌症的转移。
[0097] 特别地,可以通过任何合适的度量来衡量治疗癌症的功效。在一些实施方案中,基于治疗增生性疾病如癌症的效果来衡量治疗功效。通常,本发明的方法和组合物对于治疗
增生性疾病(例如,良性或恶性的癌症)的治疗功效可通过该方法和组合物促进对肿瘤细胞
增殖的抑制、对肿瘤血管形成的抑制、肿瘤细胞的根除和/或至少一种肿瘤的大小减小从而
人的增生性疾病得到治疗的程度来衡量。本文讨论了在确定治疗功效时要考虑的几个参
数。临床医生可建立针对特定情况的参数的适当组合。本发明方法在治疗癌症(例如,减小
肿瘤大小或根除癌细胞)方面的进展可使用任何合适的方法确定,如目前在临床中用于追
踪肿瘤大小和癌症进展的那些方法。在一些实施方案中,用于评估癌症治疗的主要功效参
数优选是肿瘤大小的减小。肿瘤大小可使用任何合适的技术来确定,如测量尺寸或使用可
用的计算机软件(如维克森林大学(Wake Forest University)开发的能够准确评估肿瘤体
积的FreeFlight软件)估计肿瘤体积。可通过使用例如CT、超声、SPECT、螺旋CT、MRI、照片等进行肿瘤可视化来确定肿瘤的大小。在治疗期结束后手术切除肿瘤的实施方案中,肿瘤组
织的存在和肿瘤大小可通过对将要切除的组织进行总体分析来确定以及/或者通过对所切
除的组织进行病理学分析来确定。
[0098] 理想情况下,由于治疗,肿瘤的生长是稳定的(即,一个或多个肿瘤的大小增加不超过1%、5%、10%、15%或20%,并且/或者不转移)。在一些实施方案中,肿瘤稳定至少约
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更久。在一些实施方案中,肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中,肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10年或更久。在一些实施方案中,肿瘤的大小减少至少约5%(例如,至少约10%、15%、20%或25%)。在一些实施方案中,肿瘤大小减少至少约30%(例如,至少约35%、40%、45%、
50%、55%、60%或65%)。在一些实施方案中,肿瘤大小减少至少约70%(例如,至少约
75%、80%、85%、90%或95%)。在一些实施方案中,肿瘤被完全消除或减小至低于检测水平。在一些实施方案中,受试者在治疗后保持无肿瘤(例如,缓解)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12周或更久。在一些实施方案中,受试者在治疗后保持无肿瘤至少约1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中,受试者在治疗后保持无肿瘤至少约1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更久。
[0099] 在治疗期结束后对肿瘤进行手术切除时,可通过测量切除组织坏死(即死亡)的百分比来确定本发明方法在减小肿瘤大小方面的功效。在一些实施方案中,如果切除组织的
坏死百分比大于约20%(例如,至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%),更优选约90%或更高(例如,约90%、95%或100%),则治疗是治疗有效的。最优选地,切除组织的坏死百分比为约100%,即,不存在或检测不到肿瘤组织。
[0100] 可以采用许多次要参数来确定本发明方法的功效。次要参数的实例包括但不限于新肿瘤的检测、肿瘤抗原或标志物(例如,CEA、PSA或CA-125)的检测、活组织检查、外科手术降级(即,肿瘤的外科手术阶段从无法切除到可切除的转换)、PET扫描、存活、疾病无进展生存、疾病进展时间生活质量评估(如临床受益反应评估)等,所有这些可以表明人类癌症的
整体进展(或衰退)。活组织检查在检测组织内癌细胞的根除方面特别有用。放射免疫检测
(RAID)被用于定位肿瘤以及使用由肿瘤产生和/或与肿瘤相关的标志物(抗原)(“肿瘤标志
物”或“肿瘤相关抗原”)的血清水平对肿瘤进行分期,并且可用作治疗前诊断预测、复发的治疗后诊断指标以及治疗效果的治疗后指标。可作为治疗功效指标进行评估的肿瘤标志物
或肿瘤相关抗原的实例包括但不限于癌胚抗原(CEA)前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、
CA19-9、神经节苷脂分子(例如,GM2、GD2和GD3)、MART-1、热休克蛋白(例如,gp96)、唾液酸化Tn(STn)、酪氨酸酶、MUC-1、HER-2/neu、c-erb-B2、KSA、PSMA、p53、RAS、EGF-R、VEGF、MAGE和gp100。其他肿瘤相关抗原是本领域已知的。RAID技术与内窥镜检测系统相结合还可以有
效区分小肿瘤与周围组织。
[0101] 在一些实施方案中,通过以下结果中的一个或多个证明人类患者中的癌症治疗:(a)肿瘤完全消失(即,完全反应),(b)与治疗前的肿瘤大小相比,治疗期结束后肿瘤大小减
少约25%至约50%持续至少四周,(c)与治疗期前的肿瘤大小相比,治疗期结束后肿瘤大小
减少至少约50%持续至少四周,以及(d)与治疗期前的肿瘤相关抗原水平相比,治疗期结束
后特定肿瘤相关抗原水平降低至少2%(例如,降低约5%、10%、20%、30%、40%、50%、
60%、70%、80%或90%)持续约4-12周。尽管肿瘤相关抗原水平降低至少2%是优选的,但
肿瘤相关抗原水平的任何降低都证明了患者的癌症得到治疗。例如,对于不可切除的局部
晚期胰腺癌,与治疗期前的CA19-9水平相比,治疗期结束后CA19-9肿瘤相关抗原水平降低
至少10%持续4-12周可以证明治疗。类似地,对于局部晚期直肠癌,与治疗期前的CEA水平
相比,治疗期结束后CEA肿瘤相关抗原水平降低至少10%持续4-12周可以证明治疗。
[0102] 关于生活质量评估如临床受益反应标准,根据本发明的治疗的治疗益处可通过疼痛强度、镇痛药消耗量和/或Karnofsky表现量表得分来证明。Karnofsky表现量表允许根据
患者的功能损伤对患者进行分类。Karnofsky表现量表的得分为0-100。一般而言,较低的
Karnofsky得分预示着生存的不良预后。因此,备选地或另外地,人类患者中的癌症的治疗
通过以下各项得以证明:(a)与治疗前患者报告的疼痛强度相比,患者报告的疼痛强度降低
至少50%(例如,降低至少60%、70%、80%、90%或100%),如在治疗结束后的12周内的任意连续四周内降低至少50%,(b)与治疗前患者报告的镇痛药消耗量相比,患者报告的镇痛
药消耗量至少减少50%(例如,减少至少60%、70%、80%、90%或100%),如在治疗结束后的12周内的任意连续四周内减少至少50%,和/或(c)与治疗期前患者报告的Karnofsky表
现量表得分相比,患者报告的Karnofsky表现量表得分至少增加20分(例如,增加至少30分、
50分、70分或90分),如在治疗结束后的12周内的任意连续四周内增加至少20分。
[0103] 尽管参考测试和/或其他测试的备选或另外的结果可证明治疗功效,但仍期望通过前述结果的一种或多种(任意组合)来证明人类患者的增生性疾病(例如,良性或恶性的
癌症)的治疗。
[0104] 在一些实施方案中,优选地在受试者没有明显不良事件的情况下减小肿瘤大小。不良事件根据国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)的癌症治疗评估计划
(Cancer Therapy Evaluation Program,CTEP)进行分类或“分级”,0级代表最小的不良副
作用,而4级代表最严重的不良事件。NCI毒性量表(1999年4月公布)和常见毒性标准手册
(1999年8月更新)可通过NCI获得,或在针对由NCI癌症治疗和诊断部门赞助的试验药物临
床试验的参与者的研究者手册(1998年3月更新)中获得。理想地,本文所述的方法与如由
CTEP/NCI分级的最小不良事件相关,例如,0级、1级或2级不良事件。然而,尽管优选,但肿瘤大小减小不是必需的,因为即使肿瘤细胞被根除(如坏死),肿瘤的实际尺寸也可能不会缩
小。根除癌细胞足以实现治疗效果。同样地,肿瘤大小的任何减小都足以实现治疗效果。
[0105] Cancer Facts and Figures 2001,American Cancer Society,New York,N.Y.中进一步描述了对人类的各种癌症的检测、监测和评级。因此,临床医生可使用标准测试来确
定本发明方法的各个实施方案对于治疗癌症的功效。然而,除了肿瘤大小和扩散之外,临床
医生还可以在评估治疗功效时考虑患者的生活质量和存活率。
微生物感染的治疗
[0106] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的微生物感染的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖和/或硫
酸乙酰肝素组合物。在一些实施方案中,该微生物感染包括细菌感染。在一些实施方案中,
该细菌感染是芽孢杆菌(Bacillus),如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)或蜡状芽孢杆
菌(Bacillus cereus);巴尔通氏体(Bartonella),如汉氏巴尔通氏体(Bartonella 
henselae)或五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana);博德特氏菌(Bordetella),如百
日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis);疏螺旋体(Borrelia),如布氏疏螺旋体
(Borrelia burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia 
afzelii)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis);布鲁氏菌(Brucella),如流产布鲁氏
菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella 
melitensis)或猪布鲁氏菌(Brucella suis);弯曲杆菌(Campylobacter),如空肠弯曲杆菌
(Campylobacter jejuni);衣原体(Chlamydia)或嗜衣原体(Chlamydophila),如肺炎衣原
体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体
(Chlamydophila psittaci);梭菌(Clostridium),如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、
艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风
梭菌(Clostridium  tetani);棒状杆菌(Corynebacterium),如白喉棒杆菌
(Corynebacterium diphtheriae);肠球菌(Enterococcus),如粪肠球菌(Enterococcus 
faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium);埃希氏杆菌(Escherichia),如大肠杆菌
(Escherichia coli);弗朗西斯氏菌(Francisella),如土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella 
tularensis);嗜血菌(Haemophilus),如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae);螺杆菌
(Helicobacter),如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori);军团菌(Legionella),如嗜肺军
团菌(Legionella pneumophila);钩端螺旋体(Leptospira),如问号钩端螺旋体
(Leptospira interrogans)、圣罗萨氏钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺
旋体(Leptospira weilii)或野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii);李斯特菌
(Listeria),如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes);分枝杆菌
(Mycobacterium),如麻风分枝杆菌(Mycobacterium  leprae)、结核分枝杆菌
(Mycobacterium tuberculosis)或溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans);支原体
(Mycoplasma),如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae);奈瑟氏球菌(Neisseria),如淋病
奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis);
假单胞菌(Pseudomonas),如绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);立克次氏体
(Rickettsia),如立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii);沙门氏菌(Salmonella),如
伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);志贺氏
菌(Shigella),如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei);葡萄球菌(Staphylococcus),如金黄
色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐
生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus);链球菌(Streptococcus),如无乳链球菌
(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌
(Streptococcus pyogenes);密螺旋体(Treponema),如彻白密螺旋体(Treponema 
pallidum);弧菌(Vibrio),如霍乱弧菌(Vibrio cholerae);耶尔森氏菌(Yersinia),如鼠
疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)或
假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。在一些实施方案中,该微生物感染包
括病毒感染。在一些实施方案中,该病毒感染包括以下病毒的感染:腺病毒科,如腺病毒;疱疹病毒科,如单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-
barr)病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型;乳头瘤病毒科,如人乳头瘤病毒;多瘤病毒科,如BK病毒或JC病毒;痘病毒科,如天花;嗜肝DNA病毒,如乙型肝炎病毒;细小病毒科,如人博卡病毒或细小病毒;星状病毒科,如人星状病毒;嵌杯状病毒科,如诺瓦克病毒;小核糖核酸病毒科,如柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒;冠状病毒科,如严重急性呼吸综合症病毒;黄病毒科,如丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革病毒、西尼罗病毒;披膜病毒科,如风疹病毒;戊型肝炎病毒科,如戊型肝炎病毒;逆转录病毒科,如人免疫缺陷病毒
(HIV);正粘病毒科,如流感病毒;沙粒病毒科,如瓜纳瑞托病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、丘波病毒、萨比亚病毒;布尼亚病毒科,如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒;丝状
病毒科,如埃博拉病毒、马尔堡病毒;副粘病毒科,如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒;弹状病毒科,如狂犬病病毒;丁型肝炎病毒;或呼肠孤病毒科,如轮状病毒、环状病毒、科蜱病毒、版纳病毒。在一些实施方案中,该微生物感染包括真菌感染。在一些实施方案中,该微生物感染包括真菌感染。在一些实施方
案中,该真菌感染包括放线菌病、变应性支气管肺曲霉病、曲霉肿、曲霉菌病、足癣、蛙粪霉病、蛙粪霉、黑色毛结节菌病、芽生菌病、克鲁斯假丝酵母、假丝酵母病、慢性肺曲霉病、金孢子菌、壶菌病、球孢子菌病、霉病、隐球菌病、加特隐球酵母、深皮肤癣菌病、皮肤癣菌、皮癣菌疹、皮肤癣菌病、毛内癣菌、昆虫病原真菌、流行性淋巴管炎、食管假丝酵母病、
exothrix、真菌性脑膜炎、真菌血症、地霉菌、白地霉、组织胞浆菌病、瘢痕疙瘩性芽生菌病、蝉团孢霉、石膏样小孢子菌、僵病、霉菌病、鼓膜霉菌病、neyzygites remaudierei、
nezyzygites slavi、奔马性赭粉菌、ophiocordyceps arborescens、ophiocordyceps 
coenomyia、巨针线形虫草、垂穗线形虫草、口腔假丝酵母病、副球孢子菌病、致病性双态性真菌、青霉病、毛结节菌病、毛孢节菌、肺孢子虫性肺炎、假性阿利什利菌病、赛多孢子菌病、孢子丝菌病、癣、颜面癣、头癣、体癣、股癣、面癣、隐匿癣、黑癣、足癣、花斑癣、vomocytosis、白鼻综合症、zeaspora或接合菌病。在一些实施方案中,该微生物感染的治疗减少一种或多
种症状,如发热、腹泻、疲劳或疼痛。
遗传疾病的治疗
[0107] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的遗传疾病的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖和/或硫酸
乙酰肝素组合物。在一些实施方案中,该遗传疾病包括软骨成长不全IB型;骨发育不全症II
型;畸型发育不全;多发性骨骺发育不良AR型;脊椎骨骺干骺端发育不全Pakistani型
(PAPSS2型);雄激素增多症;Brachyolmia AR型;Schneckenbecken发育不良;EDS早衰形式;
Larsen-样综合征B3GAT3型;遗传性运动和感觉神经病变,未知类型;贝尔麻痹;颞前轴前短指综合征(Temtamy pre-axial brachydactyly syndrome);症状性隐性轴前短指;脊椎骨
骺发育不良Omani型;软骨发育异常伴多处脱位;肱骨脊骨发育障碍;拉尔森综合征AR型;
Desbuquois综合症;双相障碍抑郁症;膈疝;小眼;EDS Kosho型;EDS肌肉挛缩型;EDS VIB型;ATCS或其他遗传疾病。在一些实施方案中,该方法减轻病症的症状。在一些实施方案中,该方法完全消除病症的症状。在一些实施方案中,该方法治愈该病症。在一些实施方案中,
该方法消除对病症的替代疗法的需要。在一些实施方案中,该方法延迟该病症的更严重症
状的发作。
神经退行性疾病的治疗
[0108] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的神经退行性疾病的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖和/
或硫酸乙酰肝素组合物。在一些实施方案中,该神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森
病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆、传染性海绵状脑病、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2型、脊髓小脑
共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调7型或脊髓小脑性共济失调17
型。在一些实施方案中,该方法减轻神经退行性疾病的症状,如记忆丧失、定向障碍、精神错乱、情绪和/或人格障碍、震颤、动作迟缓、肌强直、平衡障碍、言语障碍、choria、肌张力障碍、共济失调、吞咽障碍、易激惹、悲伤、冷漠、社交退缩、失眠、疲劳、自杀念头、虚弱、言语障碍、肌肉痉挛、协调受损、蹒跚、步态不稳、动作失控、言语不清、声音变化或头痛。在一些实施方案中,该方法延迟更严重症状的发作。在一些实施方案中,延迟达1、2、3、4、5、6周或更久,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
20、25、30年或更久。
创伤的治疗
[0109] 在一些实施方案中,本文提供了治疗有需要的受试者的创伤的方法,其包括向该受试者施用有效量的一种或多种本文所述的具有确定修饰模式的糖胺聚糖和/或硫酸乙酰
肝素组合物。在一些实施方案中,该创伤包括割伤、撕裂伤、擦伤、撕脱伤、穿刺伤、穿透伤、枪伤、血肿或挤压伤。在一些实施方案中,该方法减少与创伤相关的症状或并发症,如引流、脓、发热或淋巴结肿胀。在一些实施方案中,该方法加速创伤的愈合时间。在一些实施方案
中,该方法治疗糖尿病创伤。在一些实施方案中,该方法治疗神经损伤。在一些实施方案中,该方法治疗脊髓损伤。
定义
[0110] 如本文所用的,术语“糖胺聚糖”或“GAG”是指由重复二糖单元组成的较长的无支链多糖。重复单元(角质素除外)由氨基糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以及糖醛酸
(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)或半乳糖组成。
[0111] 如本文所用的,术语“蛋白聚糖”是指高度糖基化的蛋白质。碱性蛋白聚糖单元包含具有一个或多个共价附接的糖胺聚糖或GAG链的核心蛋白。
[0112] 如本文所用的,术语“核心蛋白”是指蛋白聚糖的蛋白质组分。
[0113] 如本文所用的,术语“硫酸乙酰肝素”是指具有所述结构的线性多糖。硫酸乙酰肝素由重复的二糖单元组成。重复的二糖单元可包括β-D-葡糖醛酸(GlcA)、2-脱氧-2-乙酰氨
基-α-D-吡喃葡萄糖基(GlcNAc)、α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)、2-O-磺基-α-L-艾杜糖醛酸
(IdoA2S)、2-脱氧-2-磺酰胺-α-D-吡喃葡萄糖基(GlcNS)、2-脱氧-2-磺酰胺-α-D-吡喃葡萄糖基-6-O-硫酸盐(GlcNS6S)或2-脱氧-2-磺酰胺-α-D-吡喃葡萄糖基-3,6-O-二硫酸盐
(GlcNS3S6S)或2-脱氧-2-磺酰胺-α-D-吡喃葡萄糖基-3-O-硫酸盐(GlcNS3S)中的一种或多
种。
[0114] 如本文所用的,术语“硫酸软骨素”是指具有所述结构的线性多糖。硫酸软骨素由重复的二糖单元组成。重复的二糖单元可包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰半乳糖胺-
4-硫酸盐(GalNAc4S)、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐(GalNAc6S)、N-乙酰半乳糖胺-4,6-二硫
酸盐(GalNAc4S6S)和β-D-葡糖醛酸(GlcA)、D-葡糖醛酸-2-硫酸盐(GlcA2S)、D-葡糖醛酸-
3-硫酸盐(GlcA3S)、L-艾杜糖醛酸(IdoA)、L-艾杜糖醛酸-2-硫酸盐(IdoA2S)中的一种或多
种。
[0115] 如本文所用的,术语“硫酸化模式”、“确定的硫酸化模式”和“确定的修饰模式”是指对糖胺聚糖进行的酶促修饰,包括但不限于包括硫酸化、脱乙酰化和差向异构化。这还包括具有确定的二糖组成的糖胺聚糖组合物。
[0116] 如本文所用的,术语“经遗传修饰的细胞系”是指对细胞系的基因组进行了特异性修饰的细胞系。在一些实施方案中,该细胞系是哺乳动物细胞系。在一些实施方案中,该细
胞系是人或鼠细胞系。在一些实施方案中,修饰包括基因敲除,由此细胞系变得在遗传学上
缺乏一种或多种基因。在一些实施方案中,修饰包括制备转基因细胞系,由此细胞系获得在
野生型细胞系中不存在的遗传物质或在活性启动子控制下的遗传物质。
[0117] 如本文所用的,术语“在遗传上缺乏”是指基因组被修饰成缺失一种或多种感兴趣的基因。在一些实施方案中,使用cre/lox系统、CRISPR、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、miRNA或本领域已知的其他遗传修饰或诱变方法进行该修饰。
[0118] 如本文所用的,术语“转基因”是指基因组被修饰成包含编码一种或多种感兴趣的基因的其他遗传物质。在一些实施方案中,使用转染、病毒感染、cre/lox敲入、CRISPR/cas介导的敲入或本领域已知的将遗传物质引入到细胞中的其他方法进行该修饰。
[0119] 术语“受试者”、“个体”、“受体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用,并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者,特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人、家畜和农场动物,以及实验室动物、动物园动物、斑点动物或宠物,诸如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。在一些实施方案中,该哺乳动物是人。
[0120] 如本文所用的,术语“治疗”是指为了获得效果而施用药剂或进行手术。就完全或部分预防疾病或其症状而言,该效果可以是预防性的,并且/或者就实现疾病和/或疾病症
状的部分或完全治愈而言,该效果可以是治疗性的。如本文所用的,“治疗”可包括治疗哺乳动物特别是人的疾病,并且包括:(a)预防疾病(例如,包括可能与原发疾病相关或由原发疾
病引起的疾病)或疾病症状在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中的发
生;(b)抑制该疾病,即阻止其发展;以及(c)缓解该疾病,即引起疾病消退。治疗可以指治疗或改善或预防疾病的任何成功的标志,包括任何客观或主观的参数,诸如症状的减少、缓
解、减轻或使疾病变得更能被患者忍受;减慢退化或衰退的速率;或使退化的最终点的衰弱
减少。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数;包括医师检查的结果。因此,术语“治
疗”包括施用本文公开的化合物或药剂以预防或延迟、减轻或阻止或抑制与疾病相关的病
况症状的发展。术语“治疗效果”是指减少、消除或预防受试者的疾病、疾病症状或疾病的不良影响。
[0121] 在某些实施方案中,“与……联合”“联合治疗”和“组合产品”是指同时向患者施用第一治疗剂和本文所用的化合物。当联合施用时,每种组分可以同时施用或在不同时间点以任何顺序施用。因此,每种组分可以分开施用,但在时间上足够接近以提供所需的治疗效
果。
[0122] “剂量单位”是指适合作为待治疗的特定个体的单位剂量的物理上离散的单位。每个单位可含有预定量的活性化合物,该预定量被计算用于产生与所需药物载体相关的期望
治疗效果。剂量单位形式的规格可以由以下两项决定:(a)活性化合物的独特特性和要实现
的特定治疗效果,以及(b)在混合这种活性化合物的领域中固有的局限性。
[0123] “药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备通常安全无毒且期望的药物组合物的赋形剂,并且包括对于兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是
固体、液体、半固体,或者在气溶胶组合物的情况下,可以是气态的。
[0124] 术语“药学上可接受的”、“生理学上可耐受的”及其语法变体在指代组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用并且表示该物质能够施用于人,或者在施用于人后不会产生达到禁止施用该组合物的程度的不良生理效果。
[0125] “治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。
[0126] 如本文所用的,术语“基本上不含”是指组合物中不存在一种或多种污染物中的大部分或全部,该污染物是诸如通常天然与之关联的物质。因此,“基本上不含”一种或多种不具有所需的确定修饰模式和/或生物学效果和/或治疗效果的污染糖胺聚糖的本文所述的
具有确定修饰模式的糖胺聚糖组合物(如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合物、硫酸角
质素组合物和透明质酸组合物)没有或几乎没有污染物。例如,硫酸乙酰肝素组合物“基本
上不含”天然与其一起发现的诸如以下的污染物:其他糖胺聚糖如硫酸软骨素、硫酸角质素
和/或透明质酸;核酸;和/或蛋白质,具有非常少的污染物或没有污染物,例如组合物中的
小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1%或小于0.5%由污染物组成。在一些实施方案中,该组合物60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含一种或多种污染糖胺聚糖、核酸和/或蛋白质。在一些实施方案中,该组合物至少95%不含污染糖
胺聚糖、核酸和/或蛋白质。在一些实施方案中,该组合物至少99%不含污染糖胺聚糖、核酸和/或蛋白质。
[0127] 如本文所用的,术语“基本上纯的”是指该组合物不含通常天然与其关联的大部分或全部物质。因此,本文所述的具有确定修饰模式的“基本上纯的”糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和透明质酸)组合物不包含不具有所需的确定修饰模式和/或
生物效果和/或治疗效果的其他污染糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素组合物、硫酸软骨素组合
物、硫酸角质素组合物和透明质酸)组合物。例如,“基本上纯的”硫酸乙酰肝素组合物不含天然与其一起发现的大多数其他糖胺聚糖,如:硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸;核酸;和/或蛋白质。在一些实施方案中,该组合物60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%不含污染糖胺聚糖、核酸和/或蛋白质。在一些实施方案中,该组合物至少95%不含污染的糖胺聚糖、核酸和/或蛋白质。在一些实施方案中,该组合物至少
99%不含污染糖胺聚糖、核酸和/或蛋白质。
实施例
[0128] 给出以下实施例是为了说明本发明的各个实施方案,并不意味着以任何方式限定本发明。本发明的实施例以及本文所述的方法是优选实施方案的当前代表性实施方案,是
示例性的,并不旨在限定本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途,这
些都包括在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。
实施例1:遗传改变的细胞系和由此得到的硫酸乙酰肝素组合物
细胞培养
[0129] 在37℃和5%CO2下,在旋转平台(130rpm)上的125ml摇床培养瓶(VWR)中的含有8mM GlutaMAX(Life Technologies)的30ml CD CHO表达培养基(Life Technologies)中常
规地培养CHO-S细胞(Life Technologies)。为了产生GAG,如所述培养细胞。简言之,将细胞以0.2×106个细胞/ml接种在加有8mM GlutaMAX的CD CHO表达培养基中。在第3天、第5天和
第7天,将3毫升CD CHO EfficientFeed B添加至烧瓶中。在第10天收获条件培养基。将细胞
从培养基中旋出(5000rpm,10分钟,进行两次),并将上清液在-20℃下储存直至进一步处
理。已经将该过程按比例扩大到多个1升烧瓶(每个300ml)以大批量生产。
CHO-S细胞的CRISPR/Cas修饰
[0130] 通过Cas9与指导RNA序列的瞬时共表达实现CHO-S细胞中GAG生物合成基因的突变。使用参考文献Rhonda C,Pedersen LE等人,Biotechnol Bioeng.2014Aug;111(8):
1604-16中描述的“CRISPy”来设计指导RNA(sgRNA)序列。sgRNA的序列示于表4中。购买用于每种sgRNA的寡核苷酸(ValueGene)并将其连接成pSpCas9(BB)-2A-puro(Addgene)。使用
FreeStyle MAX转染试剂(Life Technologies)用连接的质粒转染CHO-S细胞。转染48小时
后,将培养基更换为常规生长培养基,并使细胞恢复24小时。使用QuickExtract DNA提取溶
液(Epicenter)从细胞中提取DNA。通过PCR使用Herculase II(Aglient Technologies)和
PCR引物来扩增靶向的基因组区域。使用SURVEYOR核酸酶测定法(Integrated  DNA 
Technologies)检测遗传突变。
[0131] 通过有限稀释克隆的转染群体来产生克隆细胞系。将细胞在含有6mM GlutaMAX(Life Technologies)的CD FortiCHO培养基(Life Technologies)中稀释至10个细胞/ml,
并将200μl接种到96孔板的每个孔中。将板在37℃,5%CO2的湿润室中温育。12天后,检查该板的集落形成。将集落依次转移至24孔板和6孔板,然后使用抗体2B6通过流式细胞术或通
过硫酸乙酰肝素对FGF2结合的改变筛选细胞表面硫酸软骨素。将缺乏硫酸软骨素或具有改
变的FGF2结合的集落转移至含有8mM GlutaMAX的20ml CD  CHO表达培养基(Life 
Technologies)中以供进一步的生长和分析。
[0132] 为了确定克隆细胞系中的特异性突变,对靶向基因组区域进行PCR扩增。将纯化的PCR产物克隆到pUC19中,随后将其转化到大肠杆菌中并从接种的集落中分离以供测序
(Genewiz)。
细胞表面硫酸软骨素的检测
[0133] 使用抗体2B6(Amsbio)通过流式细胞术检测细胞表面硫酸软骨素。该抗体对通过软骨素酶ABC消化揭示的4-O-硫酸化硫酸软骨素断链表位具有特异性。将0.2×106个细胞
置于V形底96孔板(Corning)的每个孔中。为了筛选6孔板中的集落,将200μl培养基转移到
96孔板中。将细胞洗涤到含有10mU/ml软骨素酶ABC(Amsbio)的新鲜培养基中,并在37℃下
温育30分钟。将第二孔作为对照与单独的新鲜培养基一起温育。消化后,用200μl冷却的
dPBS(Lonza)洗涤细胞两次,并与2B6在加有0.1%BSA(Sigma)的dPBS中的1:200稀释液在4
℃下温育1小时。然后再次洗涤细胞,并与山羊抗-小鼠IgG-Cy3(Jackson ImmunoResearch)
的1:100稀释液在4℃下温育1小时。再次洗涤细胞,并在Guava PCA-96上通过流式细胞术进
行分析。
检测结合至细胞表面的FGF2
[0134] 使重组的人FGF2(Shenandoah Biotechnology)结合至在dPBS中的肝素-琼脂糖柱,并使用在dPBS中的0.6mg/ml磺基-NHS-LC-生物素(Thermo)进行生物素化。在室温下温
育1小时后,用dPBS洗涤柱子,然后在加有2M NaCl的dPBS中洗脱结合的生物素-FGF2。随后
将该物质用于测量FGF2与细胞表面的结合。
[0135] 将0.2×106个细胞(在筛选集落时,200μl培养基)转移到96孔V底板(Corning)中并洗涤到dPBS中。在4℃下将细胞与生物素-FGF2在含有0.1%BSA的PBS中的1:500稀释液中
温育1小时。洗涤细胞,并在4℃下将其与链霉亲和素-藻红蛋白(eBioscience)在含有0.1%
BSA的PBS中的1:1000稀释液中温育30分钟。在dPBS中最终洗涤后,在Guava PCA-96上通过
流式细胞术对细胞进行分析。糖胺聚糖的纯化
[0136] 从CHO-S条件培养基中纯化糖胺聚糖(GAG)。首先,将条件培养基在DEAE-Sephacel上分级分离,平衡并用pH 6.0的50mM NaAcO、250mM NaCl洗涤,并用pH 6.0的50mM NaAcO、
1M NaCl洗脱。对于来自靶向Ndst1和Ndst2的细胞的GAG制剂,在平衡/洗涤缓冲液中将NaCl
的浓度降低至150mM。将所得的洗脱液在MilliQ水中稀释6倍。然后,添加CaCl2至5mM。添加
60Kunitz DNA酶I(Sigma)并在37℃下温育过夜。第二天,添加链霉蛋白酶(Sigma)至0.5mg/
ml并在37℃下温育3小时。再次如前所述通过DEAE纯化该制剂,并在于10%乙醇中平衡的
PD-10柱上脱盐。将脱盐的GAG在SpeedVac上干燥并在-20℃下储存。在一些情况下,通过将
干燥的GAG重悬于0.4M NaOH中并在4℃下温育过夜对GAG进行β-消除。添加乙酸来中和该溶
液,在PD-10上脱盐并在SpeedVac上干燥。
GAG量化
[0137] 如前所述,通过咔唑测定法定量GAG。简言之,在95℃下将高达100μl的纯化GAG与在H2SO4中的10μl 4M氨基磺酸铵和500μl25mM四酸钠一起温育5分钟。冷却至室温后,添加在乙醇中的20μl 0.1%咔唑,并将样品加热至95℃持续15分钟。通过520nM处的吸光度测量
样品中的葡糖醛酸。将使用0-10μg葡糖醛酸平行制备的样品用作标准曲线。
[0138] 为了特异性地测量硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的产生,用肝素裂解酶或软骨素酶ABC(Amsbio)彻底消化纯化的GAG,并将剩余的GAG再纯化并通过咔唑测定法进行定量。如前
所述产生肝素裂解酶。对于硫酸软骨素定量,在pH 7.0的50mM NaAcO、5mM CaAcO中用各
2.5mU/ml的肝素裂解酶I型、II型和III型在37℃下消化过夜。对于硫酸乙酰肝素定量,在pH 
8.0的50mM Tris、50mM NaAcO中用5mU/ml软骨素酶ABC在37℃下消化过夜。
[0139] 或者,通过裂解酶消化UV吸光度检测样品中的硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。将40μl纯化的GAG用水稀释5倍并转移至96孔透UV的板中。将22μl 10x肝素裂解酶(500mM NaAcO、
5mM CaAcO,pH 7.0)或10x软骨素酶缓冲液(500mM Tris、500mM NaAcO,pH8.0)添加至孔中。
在添加各1mU的肝素裂解酶I型、II型、III型或1mU软骨素酶ABC之前,在250nm处进行基线吸
光度测量。将孔用封口膜密封并在37℃下温育30分钟,然后在250nm下进行另一次测量。5分
钟后重复测量以验证反应是否已完成。
硫酸乙酰肝素二糖分析
[0140] 如前所述,通过GRIL-LC/MS测定硫酸乙酰肝素的二糖组成。简言之,对于每次分析,将5μg纯化的硫酸乙酰肝素干燥并重悬于含有各2mU/ml的肝素裂解酶I型、II型和III型
的100μl肝素裂解酶缓冲液(50mM NaAcO、5mM CaAcO,pH 7.0)中。将样品在37℃下消化过
夜,然后在SpeedVac上干燥。通过与苯胺和还原剂一起温育来进行每个样品的苯胺标记。还
原剂由溶解在1.4ml DMSO(Sigma)中的150mg NaCNBH4(Sigma)和0.6ml醋酸(Fisher)组
成。向每个样品添加17μl苯胺(Sigma),然后立即添加17μl还原剂。将样品涡旋以使干燥的硫酸乙酰肝素成为溶液,然后在37℃下温育过夜。随后将标记的样品在SpeedVac上完全干
燥并在-20℃下储存,直至通过加利福尼亚大学圣地亚哥分校(University  of 
California,San Diego)的Glycotechnology Core Resource经由LC/MS进行分析。
细胞外基质(ECM)的制备
[0141] 为了制备涂有明胶的基底,将组织培养板与0.1%明胶一起温育30分钟。已建立的程序用于制备无细胞的脱细胞基质。简言之,将ChA27衍生的细胞系在24孔板的孔中培养直
至高度融合。用1ml PBS洗涤细胞两次,然后用1ml洗涤缓冲液I(100mM Na2HPO4,pH 9.6、2mM MgCl2、2mM EGTA)洗涤两次。向每个孔添加1ml裂解缓冲液(8mM Na2HPO4,pH 9.6、1%NP-40)并在37℃下温育15分钟;然后取出该裂解缓冲液,并用1ml新鲜的裂解缓冲液替换,继续温
育40-60分钟。用1ml洗涤缓冲液II(300mM KCl、10mM Na2HPO4,pH 7.5)洗涤基质两次,并用
1ml dH2O洗涤四次。可将基质在4℃下储存在PBS中数周。
实施例2:硫酸软骨素缺乏的CHO细胞
[0142] 组织培养细胞在其表面上表达蛋白聚糖并将蛋白聚糖分泌到培养基中。通过阴离子交换色谱法制备分泌的蛋白聚糖,然后酶促消化核酸组分,然后进行蛋白酶消化和β-消
除以从糖胺聚糖(GAG)链中消除核心蛋白,然后在阴离子交换柱上将GAG链与消化的组分分
离。对于硫酸乙酰肝素制剂,随后将硫酸软骨素(CS)从野生型CHO细胞材料中消化。为了避
免这种消化步骤、节省软骨素酶的成本并消除任何可能的CS污染,从用于硫酸乙酰肝素产
生的CHO细胞中遗传地消除CS表达。硫酸乙酰肝素和CS由共同的前体合成。通过酶ExtL3催
化地将N-乙酰葡糖胺残基添加至从高尔基体中的核心蛋白延伸的四糖引物(参见图1)来引
发硫酸乙酰肝素链。然后通过由Ext1和Ext2催化的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺二糖的添加来
延长硫酸乙酰肝素链。或者,添加N-乙酰半乳糖胺引发CS链合成。硫酸乙酰肝素和CS的引发
是独立的,因此消除负责CS引发的酶消除了CS合成,没有明显影响硫酸乙酰肝素合成。靶向
的候选基因部分基于CHO-K1mRNA表达谱,其揭示了CHO细胞中表达的CS合成基因的子集。鉴
别CS链引发的三个候选基因:软骨素合酶1(ChSy1)、软骨素聚合因子(ChPF)和CS N-乙酰半
乳糖胺转移酶2(CSGalNAcT2)。对这三种基因分别进行遗传靶向以消除CS链产生。通过用表
达Cas9的载体和特异性靶向每个基因的sgRNA进行转染使基因失活。电泳显示,在SURVEYOR
核酸酶消化后,转染产生二重带,指示由于插入缺失(插入/缺失)突变导致的错配(图2)。对
靶向的细胞群体的流式细胞术揭示,ChPF的失活不会改变CS合成,而ChSy1和CSGalNAcT2的
靶向突变减少了大部分细胞中的CS合成(图3)。当通过将靶向三种基因的sgRNA混合进行二
重和三重转染时,通过流式细胞术没有观察到差异(数据未示出)。
[0143] 随后有限稀释克隆从靶向ChSy1或CSGalNAcT2的群体中分离缺乏CS生物合成的克隆细胞系。最初通过流式细胞术筛选克隆的细胞系(图4)。然后通过对纯化的GAG进行裂解
酶消化来评估单个克隆细胞系中的CS缺乏。通过裂解酶消化后UV吸光度的变化来分析从单
个克隆细胞系分离的GAG链。GAG链的平行的ABC酶和肝素裂解酶I型、II型和III型消化物在
分光光度计上的透UV板中温育。所有克隆在用肝素裂解酶消化后均表现出吸光度增加(图
5A)。
[0144] 选择在ABC酶消化后吸光度相较于背景没有显示出增加的各个克隆。虽然CS缺乏细胞系是由ChSy1和CSGalNAcT2基因的失活引起的,但用于硫酸乙酰肝素生产的细胞系的
最终选择是基于硫酸乙酰肝素生产的绝对水平。硫酸乙酰肝素生产水平在CS缺乏细胞系中
有所不同(图5B)。选择ChA27(ChSy1缺乏)是因为该细胞通过咔唑和吸光度测定始终表现出
较高的硫酸乙酰肝素水平。细胞系中产生的硫酸乙酰肝素的二糖分析显示ChSy1缺乏细胞
系(数据未示出)之间或CHO-S细胞与ChSy1缺乏细胞系之间没有差异(图6)。
[0145] 为了对所选克隆进行最终验证,通过咔唑测定法定量GAG制剂,然后用软骨素酶ABC(ABC酶)或肝素裂解酶I型、II型和III型进行消化。在所选克隆中,用ABC酶消化不改变
定量,而用肝素裂解酶消化完全消除了GAG链,证明在这些细胞中不存在CS,因此不存在CS
合成(图5B)。在125ml摇瓶中,硫酸乙酰肝素的产量为10-12mg/升。
实施例3:具有改变的硫酸乙酰肝素修饰酶表达的ChA27细胞:工程化改造的ChA27细胞
硫酸乙酰肝素表达
[0146] 通过改变特定硫酸乙酰肝素修饰酶的表达来工程化改造产生硫酸乙酰肝素的具有不同生物学特性的ChA27细胞系。通过硫酸乙酰肝素生物合成基因在CHO-K1中的表达数
据(未公开的数据)和硫酸乙酰肝素二糖组成来指导靶向敲除的基因的选择(图6)。分别使
编码N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Ndst1)、N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶2(Ndst2)、硫酸乙酰
肝素2-O-磺基转移酶(Hs2st)和硫酸乙酰肝素C5-差向异构酶(Glce)的基因失活。阻断这些
酶的表达将会通过减少或防止N-乙酰葡糖胺残基的N-硫酸化、葡糖醛酸和艾杜糖醛酸残基
的2-O-硫酸化以及葡糖醛酸残基向艾杜糖醛酸的差向异构化而改变硫酸乙酰肝素链的组
成。由于这些修饰是各个配体结合位点的重要组分,因此来自工程化改造的细胞系的硫酸
乙酰肝素相对于未修饰的ChA27细胞将会具有独特的配体结合特征,因此将会具有不同的
生物学特性。通过转染表达Cas9的载体和靶向特定生物合成基因的sgRNA来敲除感兴趣的
基因。电泳揭示,在SURVEYOR核酸酶消化后转染产生二重带(图7)。
[0147] 通过流式细胞术,降低的FGF2细胞表面结合鉴别出缺乏这些基因的Hs2st、Glce和Ndst1/Ndst2双重敲除的细胞(图8)。通过FGF2结合和流式细胞术,Ndst1或Ndst2的单突变
不会产生不同的群体。通过流式细胞术,随后的有限稀释克隆分离出缺乏各种硫酸乙酰肝
素修饰(降低的FGF2结合)的克隆细胞系(图9)。预期有一系列工程化改造的细胞系具有多
种遗传修饰(对于一些修饰,参见表1)。
实施例4:结构特性
[0148] 为了证明分离的细胞系缺乏各种酶活性,对靶基因进行测序(图10)。然后从细胞系中制备硫酸乙酰肝素并通过二糖分析进行分析(图11)。
实施例5:硫酸乙酰肝素配体结合特性
[0149] 以在各种生物系统中测试硫酸乙酰肝素的方式标准来自各种细胞系的硫酸乙酰肝素的生物活性。由于硫酸乙酰肝素的生物活性主要由配体结合特性所引起,因此通过结
合固定在96-孔板上的硫酸乙酰肝素,由流式细胞术测试了由各种细胞系产生的硫酸乙酰
肝素与一组配体的结合(参见表3)。
实施例6:硫酸乙酰肝素的生物学特性
[0150] 硫酸乙酰肝素修饰酶中的突变导致小鼠中多种发育缺陷和胚胎干细胞的体外分化。根据突变的酶,ESC表现出不同的发育缺陷,并且靶向特定基因可能产生更复杂的一系
列发育影响,原因在于许多修饰酶是具有潜在不同但重叠的功能的多同工型家族的成员。
[0151] 例如,Hs2st-/-ESC系完全缺乏2-O-硫酸基团,但硫酸化的减少似乎通过N-硫酸化和6-O-硫酸化的增加得以补偿。细胞在神经元分化条件下显示出增殖和发育的显著缺陷,
而造血分化似乎正常进行。替代地,当通过硫酸酯酶基因(Sulf1/2-/-)的失活增加6-O-硫
酸化时,在神经元分化条件下发育缺陷的程度较小,但出现造血分化缺陷。因此,各种硫酸
乙酰肝素修饰酶的表达水平似乎对6-O-硫酸化水平以及可能对其他修饰的水平施加非常
严格的控制,并由此对确定寡糖结构及其蛋白质结合特异性的硫酸乙酰肝素链组成同样施
加严格的控制。
[0152] 由于硫酸乙酰肝素的粘附和配体结合特性,细胞外基质(ECM)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和GAG还在细胞和组织生长和分化中发挥重要作用。来源于经遗传修饰细胞系的
脱细胞基质将会含有具有不同的生长因子结合特性的硫酸乙酰肝素,因此其可用于在ESC
分化方面生物学地表征所表达的硫酸乙酰肝素结构。该表征将会有助于选择用于特定细胞
生理学和病理生理学研究的重要硫酸乙酰肝素结构。
[0153] 组织培养细胞衍生的ECM已经用于分析ECM组分在各种分化条件下的影响。此处,从各种工程化改造的细胞系制备的ECM被用于测试不同的硫酸乙酰肝素组合物在指导小鼠
胚胎干细胞(ESC)分化中的影响。
实施例7:癌症的治疗
[0154] 向患有肿瘤(如肝细胞癌)的受试者施用有效剂量的具有确定硫酸化模式的硫酸乙酰肝素组合物。在施用该治疗后,受试者显示出肿瘤尺寸减小并且预后和存活时间改善。
当对一组受试者(例如10、20、30名或更多名患者)施用该治疗并将结果与另一组受试者(例
如10、20、30名或更多名接受不同治疗的患者)比较时,接受硫酸乙酰肝素治疗的患者比接
受其他治疗的患者具有更好的预后。
实施例8:神经退行性疾病的治疗
[0155] 向患有神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病)的受试者施用有效剂量的具有确定硫酸化模式的硫酸乙酰肝素组合物。在施用该治疗后,受试者表现出症状减轻、疾病进展减
慢且存活时间增加。当对一组受试者(例如10、20、30名或更多名患者)施用该治疗并将结果
与另一组受试者(例如10、20、30名或更多名接受不同治疗的患者)比较时,接受硫酸乙酰肝
素治疗的患者比接受其他治疗的患者具有更好的预后。
实施例9:微生物感染的治疗
[0156] 向患有微生物感染(如MRSA)的受试者施用有效剂量的具有确定硫酸化模式的硫酸乙酰肝素组合物。在施用该治疗后,受试者表现出症状改善并且感染得到缓解。当对一组
受试者(例如10、20、30名或更多名患者)施用该治疗并将结果与另一组受试者(例如10、20、
30名或更多名接受不同治疗的患者)比较时,接受硫酸乙酰肝素治疗的患者比接受其他治
疗的患者恢复地更快。
表1.产生修饰的硫酸乙酰肝素的细胞系
表2:用于产生修饰的HS的遗传修饰细胞系的酶
表3:结合至产生修饰的HS的细胞系的细胞表面配体
[0157] 表4:产生修饰的CS/DS的遗传修饰细胞系的酶
[0158] 表5:用于糖胺聚糖合成的遗传修饰细胞系的酶
[0159] 尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案,但对于本领域技术人员显而易见的是,这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况
下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解,本文中所述的本发明实施方案的各种替代方
案均可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围,并由此涵盖这些权利
要求范围内的方法和结构及其等同物。
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