[0002] 本申请要求2012年9月7日提交的新加坡
专利申请号201206671-8的优先权的权益，其内容为了所有目的特此通过引用以其全部内容并入。
发明领域
[0003] 本发明一般涉及分子
生物学和生物化学领域并特别涉及抗
微生物肽与它们的使用方法及其用途。
[0004] 发明背景
[0005] 抗微生物剂为用于抑制微生物的生长或杀死微生物的剂。多种抗微生物剂诸如抗生素或
抗菌剂、抗
真菌剂、抗病毒剂或抗寄生虫剂为本领域已知的。最常见已知的抗微生物剂是抗生素，其可应用于医药部
门或非医药部门的多种应用。然而，由于在生活的方方面面中的抗生素滥用，抗生素抗性细菌在增加。微生物，诸如细菌对抗生素的抗性可从基本更大耐受性或减少的易感性到完全不受抗生素影响的范围。当微生物不能被抗生素或抗细菌剂控制或杀死时，尽管存在抗生素，微生物能够存活、繁殖并引起对宿主的
疾病或损害。此抗生素抗性微生物成为了显著的公共健康威胁。
[0006] 鉴于以上，需要提供可用于对抗微生物的可选的肽。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面中，提供了包含式I(SEQ ID NO:1)的肽：
[0009] [(R)a(X1)b(X2)c(X3)a(X4)b]n。
[0010] 在一个实例中，X1、X2和X4彼此独立地选自由K、R、G和A组成的组；X3为K、R、L、V、I、G或A。在一个实例中，a和b独立地被选择为从1到10的整数。在一个实例中，c是选自从0到5的整数。在一个实例中，n是至少1。
[0011] 在另一个方面中，提供了包含式VIII(SEQ ID NO:27)的肽：
[0012] X7[RGRK(X8)(X9)(R)f]n(X10)g。
[0013] 在一个实例中，X7为脂质基团。在一个实例中，X8和X9彼此独立地选自由缬
氨酸10
(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)和甘氨酸(G)组成的组。在一个实例中，X 选自由赖氨酸(K)和精氨酸(R)组成的组。在一个实例中，e和f彼此独立地为选自从0到2的整数。在一个实例中，n是至少1。
[0014] 在另一个方面中，提供了如在本文描述的肽，所述肽用于作为药物使用。
[0015] 在另一个方面中，提供了包含如在本文描述的肽的组合物。
[0016] 在另一个方面中，提供了用于
治疗细菌感染或去除细菌的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文描述的肽。
[0017] 在另一个方面中，提供了中和内毒素的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文描述的肽。
[0018] 在另一个方面中，提供了治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文描述的肽。
[0019] 在另一个方面中，提供了去除
生物膜的方法。所述方法包括施用有效量的如在本文描述的肽。
[0020] 在另一个方面中，提供了如在本文描述的肽在制造用于治疗细菌感染、或去除细菌、或中和内毒素、或治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的药物中的用途。
[0021] 在另一个方面中，提供了包含如在本文描述的肽和其
说明书的
试剂盒。
[0023] 参考详细描述，同时结合非限制性实例和附图进行考虑，将更好地理解本发明，其中：
[0024] 图1显示了C8V2D对抗
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的体外(in vitro)时间-杀灭动
力学(time-kill kinetics)测定的点图。因此，图1显示了本发明的示例性肽在杀灭微生物中有效。
[0025] 图2显示了局部毒性测试后的
角膜的摄影图像。在局部毒性测试中，角膜清晰度通过裂隙灯
显微镜术检查，在应用了V2D和C8V2D之后每天追踪，持续4天。
[0026] 图3(A)显示了阐明肽的脂质修饰的长度对其有效地中和来自大肠杆菌(E.coli)的脂多糖的能力的影响的点图。(B)显示了阐明肽的脂质修饰的长度对其有效地中和来自铜绿假单胞菌的脂多糖的能力的影响的点图。
[0027] 图4显示了显示通过本公开内容的肽和脂质-修饰的肽从脂多糖置换bodipy TR尸胺(BC)
荧光探针的曲线图。图4显示了BC被本公开内容的脂质修饰的肽有效地置换。因此，说明了本公开内容的脂质修饰的肽在中和脂多糖中是有效的。
[0028] 图5显示了从对本公开内容的肽和脂质修饰的肽对脂多糖透化的影响的研究中获得的结果的柱状图。内侧左柱示出了1.5625(μg/ml)，向x轴的右手边递增浓度。图5显示了本公开内容的脂质修饰的肽在诱导脂多糖透化中是有效的。
[0029] 图6显示了本公开内容的脂质修饰的肽在改变金黄色葡萄球菌(S.aureus)DM4001(A)或大肠杆菌ATCC8739(B)的膜电位中的作用。细菌中膜电位的变化以DiSC3-5的荧光强度的变化中观察，其以每秒计数(c.p.s.)的形式展示。因此，图6显示了，本公开内容的脂质修饰的肽在引起金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两者的膜电位变化中是有效的。
[0030] 图7显示了如通过
背光测定所观察的，本公开内容的脂质修饰的肽对金黄色葡萄球菌内膜的透化程度。图7显示了，本公开内容的脂质修饰的肽C16-V2D有效透化金黄色葡萄球菌内膜。
[0031] 图8显示了对本公开内容的脂质修饰肽在引起从模拟细菌膜(A)或红血细胞(B)的脂质体中的
钙黄绿素渗漏中的作用的研究的结果。因此，图8显示了本公开内容的脂质修饰肽选择性引起细菌膜的膜渗漏且不针对
哺乳动物红血细胞。
[0032] 图9显示了本公开内容的脂质修饰的肽或脂肽的设计。认为本公开内容的脂质修饰的肽或脂肽通过静电和疏
水相互作用与脂多糖结合。(A)显示了本公开内容的脂质修饰的肽的实例的结构。(B)显示了脂多糖的结构。(C)显示了本公开内容的脂质修饰的肽与脂多糖之间的静电或疏水相互作用。
[0033] 图10显示了本公开内容的肽联合第二治疗剂(加替沙星和B2088)对被铜绿假单胞菌(ATCC 9027)感染的小鼠角膜的体内测试的结果。图10显示了本发明的肽与抗生素的联合导致对铜绿假单胞菌的有效抑制。
[0034] 图11显示了本公开内容的肽联合第二治疗剂(加替沙星和B2088/99)对被铜绿假单胞菌(ATCC 9027)感染的小鼠角膜的体内测试的结果。图11显示了本发明的肽与抗生素的联合提供了导致对铜绿假单胞菌的最有效抑制的协同效应。
[0035] 图12显示了B2088(即V2D)和B2088_99(即G2二聚体)对抗(a)铜绿假单胞菌ATCC 9027和(B)铜绿假单胞菌ATCC 27853菌株的杀菌性质。注意到B2088_99(即G2二聚体)减少细菌细胞活力50％的肽的有效剂量(ED50)比B2088(即V2二聚体)低两倍。因此，图12显示了本公开内容的肽对细菌的有效杀灭。
[0036] 图13显示了B2088(即V2二聚体)和B2088_99(即G2二聚体)对抗铜绿假单胞菌的时间-杀灭动力学。注意到在1x和2x MIC下B2088_99(即G2二聚体)表现对两种铜绿假单胞菌菌株更快的杀灭动力学。因此，图13显示了，本公开内容的肽引起了比对照更快的杀灭细菌。
[0037] 图14显示了B2088(即V2二聚体)和B2088_99(即G2二聚体)的外膜(OM)渗透性测定的结果。测量了引起NPN荧光强度50％增加所需的肽浓度(PC50)。B2088_99(即G2二聚体)的PC50比B2088(即V2二聚体)更高，表明B2088(即V2D)具有与B2088_99(即G2二聚体)相比更高的透化作用。
[0038] 图15显示了B2088(即V2二聚体)和B2088_99(即G2二聚体)与(A)脂多糖(LPS)和(B)脂质A的相互作用。Bodipy置换测定表明，B2088肽比B2088_99(即G2二聚体)对LPS的结合强2倍并对脂质A的结合强超过10倍。(C)显示了显示外部添加LPS对肽的抑制活性的作用的竞争性抑制测定的结果。结果表明，B2088_99(即G2二聚体)可不具有如B2088(即V2二聚体)的更高的LPS中和作用。这些结果进一步证实了，与B2088
2+
相比，肽B2088_99(即G2二聚体)对LPS弱结合。(D)显示了Mg 离子对B2088(即V2二
2+
聚体)和B2088_99(即G2二聚体)的最小抑制浓度值(MIC)的影响。Mg 离子使革兰氏阴性菌的外膜稳定并拮抗阳离子剂的渗透性。图15D显示了B2088(即V2二聚体)对脂质
2+
A和LPS的结合极为依赖于Mg 浓度。
[0039] 表格简述
[0040] 表1A显示了如通过脂质修饰的V2-二聚体(C2-C14V2D)和V2-二聚体(V2D)的最小抑制值(MIC)表示的抗微生物活性的比较。表1A显示了脂质修饰的C8-V2-二聚体与未修饰的V2二聚体肽相比在抑制微生物铜绿假单胞菌、甲
氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的显著改善。
[0041] 表1B显示了脂质修饰的G2-二聚体(C2-C14G2D)和G2-二聚体(G2D)的最小抑制值的比较。表1B显示了脂质修饰的C8-G2-二聚体和C10-G2-二聚体与未修饰的G2二聚体肽相比在抑制微生物铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)和肺炎克雷伯氏菌中的显著改善。
[0042] 表2A显示了V2D、C8-V2D和C10-V2D对抗一系列甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的抗细菌活性的比较。表2A显示了，在16株测试的金黄色葡萄球菌之中，C8-V2D二聚体对8个菌株提供了2倍改善且对1个菌株提供了4倍改善。因此，提供了56.3％的整体改善。C10-V2D二聚体对10个菌株提供了2倍改善。因此，提供了62.5％的整体改善。
[0043] 表2B显示了V2D、C8-V2D和C10-V2D对抗一系列铜绿假单胞菌的抗细菌活性。表2B显示了，在10株测试的铜绿假单胞菌之中，C8-V2D二聚体对7个菌株提供了2倍改善且对1个菌株提供了4倍改善。因此，提供了80％的整体改善。C10-V2D二聚体对7个菌株提供了2倍改善且对1个菌株提供了4倍改善。因此，提供了80％的整体改善。
[0044] 表3A显示了本公开内容的肽和脂质修饰的肽的溶血活性。表3A证明了，本公开内容的脂质修饰的肽有利地不引起溶血。
[0045] 表3B显示了与V2D相比的C8V2D体外(in vitro)毒性研究的结果。表3B显示了本公开内容的脂质修饰的肽的实例为体外无毒的。
[0046] 表3C显示了在体内局部和急性毒性测试中C8V2D的安全性浓度。表3C显示，当局部地应用时，本公开内容的肽在超过3mg/kg耐受；当静脉内应用时，本公开内容的肽在约6.25mg/kg耐受；当
腹腔内应用时，本公开内容的肽在约100mg/kg耐受。
[0047] 表4A显示了V2D和脂质修饰的V2D中和50％来自大肠杆菌的脂多糖(LPS)的有效浓度。表4A显示了本公开内容的脂质修饰的肽在中和来自大肠杆菌的脂多糖中是有效的。
[0048] 表4B显示了V2D和脂质修饰的V2D中和50％来自铜绿假单胞菌的脂多糖(LPS)的有效浓度。表4B显示了本公开内容的脂质修饰的肽在中和来自铜绿假单胞菌的脂多糖中是有效的。
[0049] 表5显示了V2D、C6V2D和C8V2D与5种不同抗生素对抗细菌的部分抑制浓度指数(fractional inhibition concentration index)。表5显示了本公开内容的脂质修饰的肽的C6-V2二聚体在测试的5个抗生素中的3个抗生素中具有抗铜绿假单胞菌的更好协同作用。与C6-V2二聚体相比，C8-V2二聚体具有抗铜绿假单胞菌的更弱作用。与之相比，当针对大肠杆菌测试时，本公开内容的脂质修饰的肽的C8-V2二聚体比未脂质修饰的肽具有好得多的协同作用。
[0050] 表6显示了B2088(即V2D)和B2088_99(即G2D)的最小抑制浓度(MIC)。
[0051] 表7显示了如通过ED50(杀死50％细菌细胞的有效剂量)测量的B2088(即V2D)和B2088_99(即G2D)的杀菌性质。
[0052] 表8显示了B2088(即V2D)和B2088_99(即G2D)与多种类型的抗生素之间的协同。多药物抗性菌株铜绿假单胞菌DR4877用于实验。部分抑制浓度(FIC)指数用于表征本公开内容的肽联合抗生素的协同作用。FIC指数<0.5协同；加和性，0.51.0；无差异，14，拮抗。
[0053] 发明的详细描述
[0054] 抗微生物肽通常以阳离子疏水小肽为特征。如本领域通常已知的，包含疏水部分在本领域中被认为对于针对细菌的膜的抗微生物作用是关键的。在本文提供了这样的抗微生物肽的实例。即，在一个方面中，提供了包含式I(SEQ ID NO:1)的肽：
[0055] [(R)a(X1)b(X2)c(X3)a(X4)b]n，
[0056] 其中，X1、X2和X4彼此独立地选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)和丙氨酸3
(A)组成的组；且X为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。
[0057] 同时，与流行理论相反地，本公开内容的
发明人出乎意料地地发现，可以在不包括疏水氨基酸的肽中观察到增强的抗微生物作用。因此，本公开内容还提供了具有通过省略1 2 3 4
疏水氨基酸增强的有效抗微生物作用的肽。例如，式I(SEQ ID NO:1)的X、X、X和X 可
1 2 3 4
彼此独立地选自非疏水氨基酸组成的组。在一个实例中，X、X、X和X 可互相相同或不同。
1 2 3 4 1 2 3 4
在一个实例中，X、X、X和X 可以不是疏水氨基酸。在一个实例中，X 、X、X和X 可以不是缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨
1 2 3 4 1 2 3 4
酸(W)。在一个实例中，X、X、X和X 可以是中性氨基酸。在一个实例中，X 、X、X和X
1 2 3 4
可以是阳离子氨基酸。在一个实例中，X、X、X和X 可以彼此独立地为包括但不限于以下的氨基酸：精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。
1 2 3 4
在一个实例中，X、X、X和X 可以是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在
1
一个实例中，X可以是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在一个实例中，
2 3
X可以是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在一个实例中，X 可以是赖氨
4
酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在一个实例中，X可以是赖氨酸(K)、精氨酸
1 2 3 4
(R)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。X、X、X和X 可以是上述氨基酸的任何组合。即，在一个
1 2 3
实例中，X可以是赖氨酸(K)，X 可以是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)，X 可以是精氨酸(R)且
4 1 2
X可以是赖氨酸(K)。在又另一个实例中，X 可以是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)，X 可以是赖
3 4
氨酸(K)，X可以是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)且X 可以是精氨酸(R)。
[0058] 在一个实例中，当n是至少2时，每个肽序列被连接到至少2个赖氨酸(K)残基。如在本文使用的，“连接”是指当肽的两个序列以允许每个肽分支彼此自由地移动的方式互相偶联或连接。为了被“连接”，2个序列相互紧密邻近是必需的。在一个实例中，如在本文描述的肽的多个
单体通过共价键被赖氨酸(K)残基连接。
[0059] 如在本文使用的，术语“肽”指分离的肽。另外的，如在本文使用的，术语“氨基酸”包括天然存在和非天然存在的L-氨基酸和D-氨基酸、拟肽(peptidomimetic)氨基酸和、不是由标准手段制备或仅发现于翻译后修饰之后或作为代谢中间产物的
蛋白质中的非标准氨基酸。
[0060] 在一个实例中，赖氨酸(K)键是在C末端。术语“C末端”在本文根据其如本领域通常已知的定义使用，即，所述术语可与任何以下用语可互换地使用，诸如羧基末端(carboxyl-terminus)、羧基末端(carboxy-terminus)、C末端尾巴(C-terminal tail)、C末端(C-terminus)或COOH末端，其是指以自由羧基(-COOH)结束的氨基酸链的末端。如在本文书写的，如在本文描述的肽被表示为C末端在右边和N末端在左边。
[0061] 当本公开内容的肽被提供为被赖氨酸(K)键连接的分支的肽，例如当n为2时，1 2 3 4 1 2 3 4
肽是二聚体并可具有以下结构：[(R)a(X)b(X)c(X)a(X)b]2KK或[(R)a(X)b(X)c(X)a(X)
4 3 2 1
b]-K-K-[(X)b(X)a(X)c(X)b(R)a]。
[0062] 在另一方面，当n为3时，肽是三聚体并可具有以下结构：[(R)a(X1)b(X2)c(X3)a(X4)b]3K2K。
[0063] 在一个实例中，当n为4时，肽是四聚体并可具有以下结构：[(R)a(X1)b(X2)c(X3)4
a(X)b]4K3K。
[0064] 在一个实例中，X2可为赖氨酸(K)且X4可为精氨酸(R)。在此实例中，肽可包含式II(SEQ ID NO:2)：
[0065] [(R)a(X)c(K)b(X)c(R)a(X)c(K)b]n(K)nK。
[0066] 在一个实例中，式II(SEQ ID NO:2)的X可以是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在一个实例中，式II(SEQ ID NO:2)的X可以是甘氨酸(G)。在一个实例中，式II(SEQ ID NO:2)的X可以是丙氨酸(A)。
[0067] 在一个实例中，a和b可独立地选自从1到10的整数。在一个实例中，a和b可以彼此相同或不同。在一个实例中，a可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实例中，b可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。因此，在一个实例中，a可以是1且b可以是1；a可以是1且b可以是2；a可以是1且b可以是3；a可以是1且b可以是4；a可以是1且b可以是5；a可以是1且b可以是6；a可以是1且b可以是7；a可以是1且b可以是8；a可以是1且b可以是9；a可以是1且b可以是10；a可以是2且b可以是1；a可以是3且b可以是
1；a可以是4且b可以是1；a可以是5且b可以是1；a可以是6且b可以是1；a可以是7且b可以是1；a可以是8且b可以是1；a可以是9且b可以是1；a可以是10且b可以是
1；a可以是2且b可以是2；a可以是2且b可以是3；a可以是2且b可以是4；和其任何组合。
[0068] 在一个实例中，c可以是选自从0到5的整数。在一个实例中，c可以是0、1、2、3、4或5。
[0069] 在一个实例中，n可以是至少1，可以是至少2，可以是至少3或4。在一个实例中，n可以是选自从1到8的整数。因此，n可以是1、2、3、4、5、6、7或8。在另一个实例中，n可以不是选自从1到4的整数。因此，n可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8。
[0070] 在一个实例中，式II(SEQ ID NO:2)的肽可包括但不限于[(R)a(X)c(K)b(X)c(R)a(X)c(K)b]2KK(SEQ ID NO:3，其为二聚体)，[(R)a(X)c(K)b(X)c(R)a(X)c(K)b]2KK[(K)b(X)c(R)a(X)c(K)b(X)c(R)a](SEQ ID NO:4，其为三聚体)，和[(R)a(X)c(K)b(X)c(R)a(X)c(K)b]4(K)3K(SEQ ID NO:5，其为四聚体)。
[0071] 在一个实例中，当X3为精氨酸(R)且X4为赖氨酸(K)时，肽可包含式III(SEQ ID NO:6)：
[0072] [R(X5)dRK(X6)eRR]n(K)n-1K。
[0073] 在一个实例中，X5和X6可彼此相同或彼此不同。在一个实例中，X5和X6可以彼此独立地是包括但不限于以下的氨基酸：精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、5 6
脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。在一个实例中，X和X 可以是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或精氨酸
5 6 5
(R)。在一个实例中，X可以是甘氨酸(G)且X 可以是甘氨酸(G)。在一个实例中，X 可以
6 5 6
是丙氨酸(A)且X可以是甘氨酸(G)。在一个实例中，X 可以是精氨酸(R)且X 可以是甘
5 6 5
氨酸(G)。在一个实例中，X可以是甘氨酸(G)且X 可以是丙氨酸(A)。在一个实例中，X
6 5 6
可以是丙氨酸(A)且X可以是丙氨酸(A)。在一个实例中，X 可以是精氨酸(R)且X 可以
5 6
是丙氨酸(A)。在一个实例中，X可以是甘氨酸(G)且X 可以是精氨酸(R)。在一个实例
5 6 5
中，X可以是丙氨酸(A)且X 可以是精氨酸(R)。在一个实例中，X 可以是精氨酸(R)且
6
X可以是精氨酸(R)。
[0074] 在一个实例中，d和e可彼此独立地为选自从0到2的整数。在一个实例中，d或e可以是0、1或2。在一个实例中，d可以是0、1或2。在一个实例中，e可以是0、1或2。因此，d可以是0且e可以是0；d可以是0且e可以是1；d可以是0且e可以是2；d可以是1且e可以是0；d可以是1且e可以是1；d可以是1且e可以是2；d可以是2且e可
以是0；d可以是2且e可以是1；或d可以是2且e可以是2。
[0075] 在一个实例中，其中X5是丙氨酸(A)且d是1，式III(SEQ ID NO:6)可包含式IV(SEQ ID NO:7)：
[0076] [RARK(X6)eRR]n(K)n-1K。
[0077] 在一个实例中，e可以是选自从0到2的整数。在一个实例中，e可以是0、1或2。
[0078] 在一个实例中，n可以是至少1，可以是至少2，可以是至少3或可以是至少4。在一个实例中，n可以是整数。在一个实例中，当n是整数时，n可以是1、2、3、4、5、6、7或8。在一个实例中，n可以不是整数。因此，n可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、
7、7.5或8。
[0079] 在一个实例中，X6可以是甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。因此，式IV的肽可包括但不限于(RARKGGRR)2KK(SEQ ID NO:44)、(RARKGRR)2KK(SEQ ID NO:45)、(RARKARR)2KK(SEQ ID NO:46)、(RARKAARR)2KK(SEQ ID NO:8)和(RARKRR)2KK(SEQ ID NO:9)。
[0080] 在一个实例中，其中X5是甘氨酸(G)且d是1，式III(SEQ ID NO:6)可包含式V(SEQ ID NO:10)：
[0081] [RGRK(X6)eRR]n(K)n-1K。
[0082] 在一个实例中，X6可以是缬氨酸(V)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在一个实例中，式V的肽可包括但不限于(RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:11；或与术语“B2088_99”、“B2088/99”、“G2D”和“G2D-二聚体”可互换地使用)、(RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:12)、(RGRKGRR)2KK(SEQ ID NO:13)、(RGRKRR)2KK(SEQ ID NO:14)、(RGRKAARR)2KK(SEQ ID NO:15)、(RGRKARR)2KK(SEQ ID NO:16)、(RGRKGGRR)2KKRRGGKRGR(SEQ ID NO:17)、(RGRKGRR)2KKRRGKRGR(SEQ ID NO:18)、(RGRKRR)2KKRRKRGR(SEQ ID NO:19) 和(RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:47；或与术语“B2088”、“V2D”和“V2D-二聚体”可互换地使用)。
[0083] 在一个实例中，当d和e是0，式III(SEQ ID NO:6)可包含式VI(SEQ ID NO:20)：
[0084] [RRKRR]n(K)n-1K。
[0085] 在一个实例中，式VI的肽可以包括但不限于(RRKRR)2KK(SEQ ID NO:21)和(RRKRR)2KKRRKRR(SEQ ID NO:22)。
[0086] 在一个实例中，其中X1是赖氨酸(K)，X3是精氨酸(R)和X4是赖氨酸(K)，式II(SEQ ID NO:2)的肽可包含式VII(SEQ ID NO:23)：
[0087] [(R)a(K)b(X)c(R)a(K)b]n(K)n-1K。
[0088] 在一个实例中，式VII(SEQ ID NO:23)的X可以是非疏水氨基酸。换句话说，式VII(SEQ ID NO:23)的X可以不是疏水氨基酸。在一个实例中，式VII(SEQ ID NO:23)的X可以是精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。
[0089] 在一个实例中，式VII(SEQ ID NO:23)的X可以是G或A。在一个实例中，式VII的X可以包括但不限于[(R)a(K)bXc(R)a(K)b]2KK(SEQ ID NO:24)、[(R)a(K)bXc(R)a(K)b]2KK[(K)b(R)aXc(K)b(R)a](SEQ ID NO:25)、和[(R)a(K)bXc(R)a(K)b]4K3K(SEQ ID NO:26)。
[0090] 在另一个方面，提供了包含式VIII(SEQ ID NO:27)的肽：
[0091] X7[RGRK(X8)(X9)(R)f]n(X10)g。
[0092] 在一个实例中，X7是脂质基团。在一个实例中，X7可以是-RCONH，其中R可包括但7
不限于任选地被羟基、羰基或烯基取代的烷基。例如，X可以是CmH2m-1-CONH，其中m可以是选自从1到25的整数。在本公开内容的肽的一些实例中，m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。当m是25，脂质基团是修饰的蜡酸。脂质基团还可包括带有单个双键或多个双键的顺式或反式不饱和
脂肪酸，其可以是合成的或源自天然的(诸如由微生物产生的脂肪酸)。
[0093] 例如，X7可包括但不限于(CH3)-CONH-、C3H7-CO-NH-、C5H11-CO-NH-、C7H15-CO-NH-、C9H19-CO-NH-、C11H23-CO-和C15H31-CO-NH-。在一个实例中，脂质基团共价连接到肽。
[0094] 在本公开内容中，附着到脂质基团的肽可以用术语“脂肽”或“脂质修饰的肽”可互换地描述。
[0095] 本公开内容的脂质修饰的肽的脂质基团可以通过使用本领域已知的方法偶联到肽，例如使用固相肽合成(SPPS)。简言之，SPPS的通用原则为使用偶联-洗涤-脱保护-洗涤过程的重复循环。即，将肽固定化到固相，例如小固体珠或
树脂，其可为不溶的和/或多孔的。固定后，用功能性单元处理肽。然后，将固定化的肽的游离N末端胺偶联到单个N端保护的氨基酸单元。然后，使用适当试剂诸如哌啶脱保护此单元，暴露了游离N末端胺，其可用于附着到下一个含有游离羧基的N端保护的氨基酸。在每个步骤中过滤反应混合物，且在过滤过程期间保留固定在珠或树脂的肽，而冲走液相试剂和合成的副产物。为了合成脂质修饰的肽，在偶联过程中使用了含游离
羧酸、具有期望
碳长度的脂肪酸，而不是含游离羧酸的N端保护的氨基酸。在偶联过程所用的试剂类似于在偶联两个氨基酸所用的那些。在肽通过切割试剂诸如三氟乙酸(TFA)从珠或树脂切割下来之前，生长中的肽将保持共价地附着到珠或树脂。在切割之后，肽或脂质修饰的肽将使用高效液相色谱(HPLC)收集并纯化。
[0096] 本公开内容的肽可被偶联到脂肪酸，所述脂肪酸在一个末端具有COOH基。例如，肽可被偶联到棕榈酸 棕榈酸偶联到本公开内容的肽的N末端的NH2基。
[0097] 本公开内容的肽的脂质基团可使用适当肽
偶联剂诸如，但不限于苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟
磷酸膦(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺等等偶联。
[0098] 在一个实例中，X8和X9可彼此独立。在一个实例中，X8和X9可互相相同或彼此不8 9
同。在一个实例中，X和X 可以是精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯
8 9
氨酸(P)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或缬氨酸(V)。在一个实例中，X和X 可
8
以是缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或甘氨酸(G)。在另一个实例中，X
9
和X可以是缬氨酸(V)或甘氨酸(G)。
[0099] 在一个实例中，X10可以是精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯10
氨酸(P)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。在一个实例中，X 可以是阳离子氨基酸诸如组氨酸
10
(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。在一个实例中，X 可以是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
[0100] 在一个实例中，f和g可彼此独立地为选自0到2的整数。在一个实例中，f或g可为0、1或2。在一个实例中，f可以是0、1或2。在一个实例中，g可以是0、1或2。因此，f可以是0且g可以是0；f可以是0且g可以是1；f可以是0且g可以是2；f可以是1且g可以是0；f可以是1且g可以是1；f可以是1且g可以是2；f可以是2且g可以是0；f可以是2且g可以是1；或f可以是2且g可以是2。
[0101] 在一个实例中，n是至少1。在一个实例中，n可以是1、2、3、4、5、6、7或8。
[0102] 在一个实例中，其中 X8和 X9是 缬 氨 酸 (V)，式VII(SEQ ID NO:27)可 称 为 脂 质 修 饰 的 V2 二 聚 体 或 V2D或 B2088( 即 (RGRKVVRR)2KK)；SEQ ID NO:47)。在一个实例中，肽可包括但不限于 (CH3-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ
ID NO:28 或 C2-V2- 二 聚 体 )、(C3H7-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:29
或 C4-V2- 二 聚 体 )、(C5H11-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:30 或
C6-V2- 二 聚 体 )、(C7H15-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:31 或 C8-V2- 二
聚 体 )、(C9H19-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:32 或 C10-V2- 二 聚
体 )、(C11H23-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:33 或 C12-V2- 二 聚 体 )、
(C13H23-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:34 或 C14-V2- 二 聚 体 ) 和
(C15H31-CO-NH-RGRKVV)2KK(SEQ ID NO:35 或 C16-V2- 二 聚 体 )。 在 一 个 实 例中，肽 可以 是 (C7H15-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:31 或 C8-V2- 二 聚 体 ) 和(C9H19-CO-NH-RGRKVVRR)2KK(SEQ ID NO:32或C10-V2-二聚体)。如在表1A、表2A、表2B、表4A和表4B中所示的，与未脂质修饰的肽相比，这些脂质修饰的肽具有改善的抗微生物活性。
[0103] 在一个实例中，其中X8和X9是甘 氨酸(G)，式VIII(SEQ ID NO:27) 可称为 脂质 修饰 的G2二聚 体或G2D或 B2088_99或B2088/99(即(RGRKVVRR)2KK)；
SEQ ID NO:11)。在一个实例中，肽可包括但不限于(CH3-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:36 或 C2-G2- 二 聚 体 )、(C3H7-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:37
或 C4-G2- 二 聚 体 )、(C5H11-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:38 或
C6-G2- 二 聚 体 )、(C7H15-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:39 或 C8-G2- 二
聚 体 )、(C9H19-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:40 或 C10-G2- 二 聚
体 )、(C11H23-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:41 或 C12-G2- 二 聚 体 )、
(C13H23-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:42 或 C14-G2- 二 聚 体 ) 和
(C15H31-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:43 或 C16-G2- 二 聚 体)。 在 一 个 实 例中，肽 可以 是 (C7H15-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:39 或 C8-G2- 二 聚 体 ) 和(C9H19-CO-NH-RGRKGGRR)2KK(SEQ ID NO:40或C10-G2-二聚体)。如在表1B中所示的，与未脂质修饰的肽相比，这些脂质修饰的肽具有改善的抗微生物活性。
[0104] 在一个实例中，如在本文描述的肽可被化学修饰。在一个实例中，化学修饰可包括但不限于酰胺化、乙酰化、钉针(stapling)、用对应的D-氨基酸置换至少一个L-氨基酸、引入非天然氨基酸或用非天然氨基酸置换至少一个氨基酸和脂化。如在本文使用的，术语“脂化”是指导致脂质基团共价结合到肽链的修饰。脂化可包括但不限于N-豆蔻酰化、棕榈酰化、GPI锚添加、异戊烯化、细菌蛋白的脂化(S-二酰基甘油)和其它类型的脂化。
[0105] 在一个实例中，如在本文所述的肽还可包含第二治疗剂。当如在本文所述的肽与第二治疗剂诸如抗生素组合时，本公开内容的发明人发现出乎意料的协同作用。不希望受理论所束缚，发明人认为如在本文所述的肽的脂质基团在敏化脂多糖中是重要的。认为本公开内容的肽通过经由静电相互作用或疏水相互作用有效结合到脂多糖而中和脂多糖(参见图9C对于本公开内容的脂质修饰的肽与脂多糖之间的相互作用的阐述)。通过破坏脂多糖结构的完整性来中和脂多糖。由于脂多糖是保护革兰氏阴性细菌免受抗微生物剂攻击的主要屏障，对脂多糖的中和引起革兰氏阴性细菌更容易受到其他抗微生物剂影响。因此，破坏脂多糖结构完整性的能力有利地允许本公开内容的肽与其他抗微生物剂有效地协同。即，如在本文所述的肽与第二治疗剂诸如抗生素的组合，协同地杀灭微生物。如在本文使用的，术语“协同”是指比通过本公开内容的肽和第二治疗剂所观察到的抗微生物剂效果之和更大的效果。即，本公开内容的肽与第二治疗剂的组合提供了比本公开内容的肽和第二治疗剂的单个效果之和更大的抗微生物剂效果。
[0106] 当本公开内容的肽和第二治疗剂为：(1)共配制且在组合的制剂中同时施用或递送；(2)作为单独制剂交替递送或平行递送；或(3)通过其他
治疗方案时，可以获得协同作用。当以交替疗法递送时，当顺序地施用或递送本公开内容的肽和第二治疗剂，例如以单独片剂、丸剂或胶囊，或通过在单独
注射器中不同注射时，可获得协同作用。通常，在交替治疗期间，顺序地即、连续地施用有效剂量的本公开内容的每种肽和第二治疗剂。说明出乎意料的协同作用的示例性结果在以下实验部分的
实施例8和实施例11中提供。
[0107] 如在本文使用的，术语“抗微生物剂”是指剂，诸如本公开内容的肽，其能够消除、减少或
预防由微生物引起的疾病。如在本文使用的，术语“微生物(microbes)”或“微生物(mircoorganism)”以其最广泛意义使用并因此不限于原核微生物的范围。而是，术语“微生物”包括细菌、古细菌、
酵母、真菌、
原生动物和藻类在其范围内。
[0108] 在另一方面中，提供了用于治疗细菌感染或去除细菌的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文所述的肽。术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和其语法变化形式是指治疗性(therapeutic)治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施两者，其中目标在于防止或减缓(减轻)不期望的生理状况、紊乱或疾病或获得有益的或期望的临床结果。此类有益或期望的临床结果包括但不限于，减轻症状；缩减状况、紊乱或疾病的程度；稳定(即不恶化)状况、紊乱或疾病的状态；延迟或缓和状况、紊乱或疾病进展；减轻状况、紊乱或疾病状态；缓解(无论是部分地或完全地)，无论是可检测的或不可检测的；或增强或改善状况、紊乱或疾病。治疗包括诱发临床显著的细胞应答，而没有过度水平的
副作用。治疗还包括相对于如果没有接受治疗情况下的预期存活的延长存活。
[0109] 在一个实例中，细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。因此，细菌可以是下列属，包括但不限于醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线菌属(Actinomyces)、
土壤杆菌属(Agrobacterium spp.)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、无形体属(Anaplasma spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、巴尔通体属(Bartonella spp.)、博德特氏杆菌属(Bordetella spp.)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp.)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia spp.)、嗜衣原体属(Chlamydophila spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、棒杆菌属(Corynebacterium spp.)、柯克斯体属(Coxiella)、埃立克体属(Ehrlichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、李斯特菌属(Listeria)、Methanobacterium extroquens、多形细杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、支原体属(Mycoplasma spp.)、奈瑟氏菌属(Neisseria spp.)、巴氏杆菌属(Pasteurella spp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、罗沙利
马体属(Rochalimaea spp.)、罗氏菌属(Rothia)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus spp.)、密螺旋体属(Treponema spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、和耶尔森菌属(Yersinia spp.)。在一个实例中，细菌感染可由包括但不限于下列的细菌引起：橙黄弗拉托菌(Acetobacter aurantius)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、衣氏放线菌(Actinomyces Israelii)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、嗜吞噬无形体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无形体(Anaplasma marginale)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaminogenica)(产黑色素普雷沃菌(Prevotella melaminogenicus))、巴尔通体韩瑟勒巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、支气管败血博德特氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德氏菌菌群(Burkholderia cepacia complex)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、肉芽肿荚膜菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、
胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体属(Chlamydophila)(诸如肺炎嗜衣原体(C.pneumonia)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤
风梭菌(Clostridium tetani))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、伯 纳特 柯克 斯体(Coxiella bumetii)、查菲 埃立 克体 (Ehrlichia chaffeensis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、
鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、恶臭肠球菌(Enterococcus maloratus)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、
阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干
酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、Methanobacterium extroquens、多形细杆菌、藤黄微球菌、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)、
牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacterium diphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、
发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、穿通支原体(Mycoplasma penetrans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、土拉巴氏杆菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、放射型根瘤菌(Rhizobium Radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia quintana)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次氏体(Rickettsia trachomae)、亨氏罗沙利马体(Rochalimaea henselae)、五日热罗沙利马体(Rochalimaea quintana)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus.avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球 菌(Streptococcus faceium)、粪链 球菌(Streptococcus faecalis)、野 鼠链球菌(Streptococcus ferus)、鹑鸡链 球菌(Streptococcus gallinarum)、乳 链球菌(Streptococcus lactis)、草绿 色链 球菌(Streptococcus mitior)、轻型 链球 菌(Streptococcus mitis)、变 形 链 球 菌(Streptococcus mutans)、口 腔 链 球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、家鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血 链球 菌(Streptococcus sanguis)、表 兄 链 球菌(Streptococcus sobrinus)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗点状弧菌(Vibrio comma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
[0110] 在一个实例中，细菌可以是药物抗性的。在一个实例中，细菌感染可引起诸如但不限于下列的状况：肺炎、肺结核、脑膜炎、腹泻病、形成生物膜、脓毒症(sepsis)、李斯特菌病、肠胃炎、中毒性休克综合征、出血性大肠炎、溶血性尿毒症综合征、莱姆病、胃和十二指肠溃疡、人类埃立克体病、伪膜性结肠炎、霍乱、沙门氏菌病、猫抓热、
坏死性筋膜炎(GAS)、链球菌中毒性休克综合征、医院和社区相关的感染、动脉粥样硬化、婴儿猝死综合症(SIDS)、伤口感染、败血病(septicemia)、胃肠道疾病、医院获得性心内膜炎和血流感染。
[0111] 具有有效的免疫刺激性质的脂多糖(LPS)内毒素，为革兰氏阴性细菌的外膜小叶中完整结构组分。LPS在微生物细胞生长和分裂期间连续地流出且在细胞死亡期间大量地释放，通常作为抗细菌感染的抗生素疗法的结果。在释放到血流之后，LPS团聚体被LPS-结合
血浆蛋白(LBP)分解以形成LPS-LBP复合物，所述LPS-LBP复合物刺激宿主单核细胞和巨噬细胞分泌多种细胞因子(例如TNF-α、IL-6、IL-8)和促炎介质(例如，NO和
活性氧气物质)。此先天免疫系统的活化触发了导致称为败血性休克的严重临床综合征的级联放大的免疫应答，如果不进行治疗，败血性休克可快速促使多器官衰竭或死亡。因此，存在提供中和内毒素的方法的需要。相应地，在另一个方面，提供了中和内毒素的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文所述的肽。
[0112] 在一个实例中，内毒素可以是细菌内毒素或真菌内毒素。在一个实例中，内毒素可以是多糖、脂磷壁酸、脂多糖或脂寡糖。
[0113] 细菌可对人造成的另一个问题是生物膜的形成。生物膜的形成是牵涉医疗领域和非医疗领域两者中多个机构的重要问题。生物膜形成发生在微生物细胞互相粘附并嵌入到表面上的胞外
聚合物(EPS)的基质中时。微生物在被生物大分子(例如，多糖、核酸和蛋白)和营养物富集的这样被保护的环境中的生长允许增强的微生物对话(cross-talk)和增加的
毒力。由于生物膜可在任何支持环境中发展，需要可去除或防止生物膜形成的方法或组合物。因此，存在提供去除或防止生物膜形成的方法的需要。
[0114] 在另一个方面，通过了去除生物膜的方法。所述方法包括施用有效量的如在本文所述的肽。在一个实例中，生物膜可出现在表面上。在本文使用的术语“表面(surface)”或“表面(surfaces)”是指无论医疗或工业的任何表面，其提供
流体诸如液体或空气与固体之间的界面。在流体和固体之间的界面可为间断的，且可由流动或停
滞流体、
气溶胶或用于气传流体暴露的其他手段所引起。在一些实例中，表面是指其机械结构与细菌或真菌粘附相容的平面。在本文所述的肽和方法的背景中，用语“表面”包含无论一次性或非一次性的、医疗的或非医疗的各种仪器(instrument)和装置(device)的内面和外面。非医疗用途的实例包括船体、船坞、
食品加工器、
搅拌机、机器、容器、水箱、净水器、
净化系统、食品工业中的
防腐剂、个人护理产品诸如香波、面霜、润肤霜、洗手液、肥皂等等。医疗用途的实例包括医疗装置的整个范围。此类“表面”可包括无论是一次性的或预期用于重复使用的各种仪器和装置的内面和外面。实例包括适合于医疗用途物品的整个范围，包括手术刀、针、
剪刀、和侵入性手术、治疗或诊断程序中使用的其他装置；可植入医疗装置，包括人造血管、
导管和用于去除或向患者递送流体的其他装置、
人工心脏、人工肾脏、整形外科针、平板和
植入物；导管和其它管子(包括泌尿和胆道管、气管内管、外周可插入中心静脉导管、
透析导管、长期隧道中心静脉导管(long term tunnelled central venous catheters)、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、漂浮导管(Swan-Ganz catheter)、
导尿管、腹膜导管)、泌尿装置(包括长期尿道装置、组织粘合尿道装置、人工尿道括约肌、尿道扩张器)、分流器(包括心室或动静脉分流器(arterio-venpus shunt))；
假体(包括乳房植入物、阴茎假体、血管移植假体、
心脏瓣膜、人工关节、人工喉、
耳科植入物)、血管导管端口、伤口引
流管、脑积水分流器、起搏器和可植入的
除颤器、牙科植入物、填充物、假牙等等。其他实例对这些领域中从业人员而言将是容易明显的。发现于医疗环境中的表面也包括医疗器材(equipment)零件的内面和外面、在健康护理机构中的人员穿戴或携带的医疗设备(medical gear)。此类表面可包括用于医
疗程序或准备医疗器械的区域中的案台和固定装置，在呼吸治疗中使用的管子和滤毒罐，所述呼吸治疗包括施用氧气、施用
喷雾器中的溶解药物和施用麻醉剂。还包括预期为医疗机构中对感染性生物的生物屏障，诸如手套、围裙和面罩。用于生物屏障的通常使用的材料可以是乳胶基或非乳胶基的。非乳胶基生物屏障的实例可包括乙烯基。其他此类表面可包括并非预期为无菌的用于医疗或牙科器材的把手和缆线。另外，此类表面可包括管和其他器械(apparatus)的那些非无菌的外表面，所述管和其他器械发现于在其中血或体液或其他有害
生物材料通常遇到的区域中。在一个实例中，生物膜可被包含于尿管和医疗植入物中。
[0115] 在另一个方面中，提供了治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的方法。所述方法包括施用药学上有效量的如在本文所述的肽。如在本文使用的，术语“真菌”(和其衍生物，诸如“真菌感染”)包括但不限于提及以下属的生物(或由于生物的感染)：
犁头霉属(Absidia)、阿耶罗菌属(Ajellomyces)、节皮菌属(Arthroderma)、曲霉属(Aspergillus)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)、枝孢霉属(Cladophialophora)、球孢子菌属(Coccidioides)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克
银汉霉属(Cunninghamella)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、外瓶霉属(Exophiala)、线黑粉菌属(Filobasidiella)、着色芽生菌属(Fonsecaea)、镰刀菌属(Fusarium)、地丝菌属(Geotrichum)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、何德霉属(Hortaea)、伊萨酵母属(Issatschenkia)、马杜拉分支菌属(Madurella)、马拉色菌属(Malassezia)、小孢子菌属(Microsporum)、微孢子虫(Microsporidia)、毛霉属(Mucor)、丛赤壳属(Nectria)、拟青霉属(Paecilomyces)、副球孢子菌属(Paracoccidioides)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、肺囊虫属(Pneumocystis)、假阿利什菌属(Pseudallescheria)、根霉属(Rhizopus)、红酵母属(Rhodotorula)、足放线病菌属(Scedosporium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、孢子丝菌属(Sporothrix)、毛癣菌属(Trichophyton)、和毛孢子菌属(Trichosporon)。在一个实例中，真菌可包括但不限于伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎阿耶罗菌(Ajellomyces dermatitidis)、苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae)、粉节皮菌(Arthroderma fulvum)、
石膏样节皮菌(Arthroderma gypseum)、内弯节皮菌(Arthroderma incurvatum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)和万博节 皮菌 (Arthroderma vanbreuseghemii)、黄 曲 霉(Aspergillus flavus)、烟 曲 霉(Aspergillus fumigatus)和黑曲霉(Aspergillus niger)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)和菌膜念珠菌(Candida pelliculosa)、卡氏枝孢霉(Cladophialophora carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和Coccidioides posadasii、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、小克银汉霉属(Cunninghamella Sp)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)、新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、裴氏着色芽生菌(Fonsecaea pedrosoi)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、威尼克何德霉(Hortaea werneckii)、东方伊萨酵母(Issatschenkia orientalis)、灰色马杜拉分支菌(Madurella grisae)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、球形马拉色菌(Malassezia globosa)、钝形马拉色菌(Malassezia obtusa)、厚皮马拉色菌(Malassezia Pachydermatis)、限制马拉色菌(Malassezia restricta)、斯洛菲马拉色菌(Malassezia slooffiae)、合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)、犬小孢子菌(microsporum canis)、粉小孢子菌(Microsporum fulvum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、微孢子虫(Microsporidia)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、红球丛赤壳(Nectria haematococca)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)、米根霉(Rhizopus oryzae)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、尖端足放线病菌(Scedosporium apiospermum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、申克孢子丝菌(Sporothnx schenckii)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)和紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)、和阿氏毛孢子菌(Trichosporon asahii)、皮状毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、皮瘤毛孢子菌(Trichosporon inkin)和粘性毛孢子菌(Trichosporon mucoides)。
[0116] 在另一个方面中，提供了包含如在本文所述的肽和其说明书的试剂盒。
[0117] 在另一个方面中，提供了如在本文所述的肽，用于作为药物使用。在一个实例中，药物还可包含第二治疗剂。
[0118] 在另一个方面中，提供了包含如在本文所述的肽的组合物。在一个实例中，组合物还可包含第二治疗剂。
[0119] 在一个实例中，如在本文所述的方法、用途或试剂盒还可包含第二治疗剂。在一个实例中，如在本文所述的方法还包含施用第二治疗剂。在一个实例中，如在本文所述的药物还可包含第二治疗剂。在一个实例中，药物可与第二治疗剂一起施用。在一个实例中，试剂盒还可包括第二治疗剂。
[0120] 在一个实例中，第二治疗剂可与本公开内容的肽分别或一起施用。在一个实例中，第二治疗剂可以为另外的或不同的抗微生物剂。在一个实例中，抗微生物剂可包括但不限于抗真菌剂、抗病毒剂、抗细菌剂或抗生素或抗寄生虫剂。在一个实例中，抗微生物剂是抗生素。
[0121] 在一个实例中，抗生素可包括但不限于氨苄西林、巴氨西林、卡茚西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、三唑巴坦、替卡西林-克拉维酸、
萘夫西林、头孢菌素I代、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢美唑、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢地尼、头孢布烯、头孢哌
酮、头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟酯、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、地红霉素、红霉素、林可霉素、醋竹桃霉素、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星、曲伐沙星、奥索利酸、吉米沙星、培氟沙星、亚胺培南-西司他丁、美罗培南、氨曲南、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、
链霉素、妥布霉素、巴龙霉素、替考拉宁、万古霉素、地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、土霉素、
四环素、金霉素、磺胺米隆、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑、利福布汀、利福平、利福喷汀、利奈唑胺、链阳性菌素、奎奴普丁、达福普汀、杆菌肽、氯霉素、磷霉素、异烟肼、乌洛托品、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、呋喃西林、新生霉素、多粘菌素、大观霉素、甲氧苄啶、多粘菌素、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、琥乙红霉素、咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、
艾莎康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑、特比萘芬、阿莫罗芬、萘替芬、布替萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯
甲酸、环吡酮、托萘酯、十一碳烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近及它们的组合。在一个实例中，抗生素可包括但不限于萘啶酸、庆大霉素、红霉素、链霉素和卡那霉素。
[0122] 术 语“减 少(decrease)”、“降 低 (reduced)”、“降 低 (reduction)”、“减 少(decrease)”、“去除(removal)”或“抑制(inhibit)”都在本文使用以通常意指减少统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“降低(reduced)”、降低(reduction)”或“减少(decrease)”、“去除(removal)”或“抑制(inhibit)”意指相对于参考水平减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多达并包括100％减少(例如相对于参考样品不存在水平)、或相对于参考水平(例如，如在此所述的肽不存在时)在10-100％之间的任何减少。
[0123] 在另一个方面中，提供了本公开内容的肽在制备用于治疗细菌感染、或去除细菌、或中和内毒素、或治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的药物中的用途。在一个实例中，用途还可包含提供用于向需要其的患者施用本公开内容的肽。在一个实例中，其中药物将向需要其的受试者施用。
[0124] 在一个实例中，受试者或患者可以是动物、哺乳动物、人类，包括但不限于分类为以下的动物：牛、猪、马、犬、狼、猫、鼠、羊(ovine)、禽、鱼、山羊(caprine)、乌鸦、蛙、或海豚。在一个实例中，患者可以是人类。
[0125] 在一个实例中，如在本文所述的肽可被提供为组合物或药物组合物。如在本文所述的组合物可以取决于所期望的是局部治疗还是全身治疗而以多种方式施用。施用可以是局部的，肺(例如，通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通
过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)或全身诸如经口和/或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输液；或颅内例如鞘内或心室内施用。在一个实例中，施用的途径可选自由全身性施用、口服施用、静脉施用和肠胃外施用组成的组。
[0126] 用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小袋剂(sachet)或片剂。
增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或
粘合剂可以是期望的。
[0127] 用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可包含缓冲剂、稀释剂和其他适合的添加剂，诸如，但不限于渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
[0128] 如在本文所述的组合物包括但不限于溶液、糊剂、膏剂、霜剂、水凝胶、乳剂、包含脂质体的制剂和包衣。这些组合物可从包括，但不限于预成型的液体、自乳化固体和自乳化半固体的各种组分产生。
[0129] 可方便地以单位剂型展现的如在本文所述的制剂，可根据在制药工业中公知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与药学载体或赋形剂相关联的步骤。通常，通过如下制备制剂：将活性成分与液体载体或细碎地分开的固体载体或两者一致地和紧密地关联，且然后如必要的话，使产品成形。
[0130] 如在本文所述的组合物可被配制为许多可能剂型中任一种，所述可能剂型包括但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。如在本文所述的组合物还可被配制为在含水介质、非水介质或混合介质中的悬浮液。水性悬液还可包含增加悬浮液粘性的物质，包括例如羧甲基
纤维素钠、脱水山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可包含稳定剂。
[0131] 在一个实例中，药物组合物可被配制并作为
泡沫使用。药物泡沫包括制剂诸如，但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体。尽管在性质上基本类似，这些制剂在终产品的组分和一致性上变化。
[0132] 如在本文所述的组合物可另外地包含通常发现于药物组合物中的其他附属组分。因此，例如，组合物可包含另外的、相容的、药学上活性物质，诸如例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂、或可包含在物理地配制本发明的组合物的多种剂型中有用的另外物质，诸如染料、
调味剂、防腐剂、抗
氧化剂、
遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入时，此类物质不应当过度地干扰本公开内容的组合物的组分的生物活性。制剂可被灭菌且如果期望的话，可与助剂相混合，所述助剂例如
润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、
着色剂、调味物质和/或芳香物质等等，其不与制剂的肽有害地相互作用。
[0133] 如在本文使用的术语“药学上有效的量”在其含义内包括足够但无毒的量的如在本文所述的化合物，以提供期望的效果，即，引起至少1.0的微生物数目的对数减少(Log reduction)，其意指在10个残余中少于1个微生物。本公开内容的修饰肽可提供至少约2.0、或至少约3.0、或至少约4.0、或至少约5.0、或至少约6.0、或至少约7.0的微生物数目的对数减少。所需的确切量将取决于诸如被治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、被治疗状况的严重性、被施用的特定剂、施用的模式等等因素，从受试者到受试者变化。因此，详细说明确切的“有效的量”是不可能的。然而，对于任何给定的病例，适当的“有效的量”可由本领域中普通技术人员之一仅使
用例行实验确定。
[0134]
给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，疗程持续从若干天到若干月，或直至实现治愈或取得疾病状态的减少。最佳给药时间表可从患者体内药物累积的测量结果中计算。施用医生可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复
频率。最佳剂量可基于组合物的相对效价而变化，且可通常基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50或基于在本文所述的实例来评估。通常，剂量为从0.01μg至100g/kg体重，且可每日一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次、每年一次或更多次地被提供。治疗医师可基于测量的
停留时间和在体液或组织中的药物浓度评估给药的重复频率。在成功治疗后，让受试者经受维持疗法以阻止疾病状态的复发是可期望的，其中组合物以维持剂量施用，范围从0.01μg至100g/kg体重，每日一次或更多次到每2年一次。
[0135] 在一个实例中，组合物可以下列之间的量使用：从约0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、
50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg、
130μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、170μg/kg、180μg/kg、190μg/kg、200μg/kg、210μg/kg、220μg/kg、230μg/kg、240μg/kg、250μg/kg、260μg/kg、270μg/kg、
280μg/kg、290μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、
45mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg的任一个到约0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、
5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg、130μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、
160μg/kg、170μg/kg、180μg/kg、190μg/kg、200μg/kg、210μg/kg、220μg/kg、230μg/kg、240μg/kg、250μg/kg、260μg/kg、270μg/kg、280μg/kg、290μg/kg、500μg/kg、
1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、
125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、300mg/kg患者体重的任一个。
[0136] 在一个实例中，被施用组合物的浓度为约1mg/kg到约100mg/kg患者体重、约5mg/kg到约100mg/kg患者体重、约10mg/kg到约100mg/kg患者体重、约20mg/kg到约100mg/kg患者体重、约30mg/kg到约100mg/kg患者体重、约1mg/kg到约50mg/kg患者体重、约5mg/kg到约50mg/kg患者体重、约10mg/kg到约50mg/kg患者体重。
[0137] 如在本文使用的，在制剂组分的量或浓度的背景中的术语“约”，典型地意指陈述值的+/-5％、更典型地陈述值的+/-4％、更典型地陈述值的+/-3％、更典型地陈述值的+/-2％、甚至更典型地陈述值的+/-1％、且甚至更典型地陈述值的+/-0.5％。
[0138] 在本文阐述的本发明可不存在未在本文具体地公开的任何要素或多种要素、限制或多种限制的情况下被适合地实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展性地理解并没有限制。另外，在本文采用的术语和表达已被用作描述的术语并没有限制，且在此类术语和表达的使用中不预期排除显示与描述的特征的任何等价物或其部分，然而意识到在本发明要求保护的范围之内多种
修改是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，在本文公开的在其中实现的本发明的修改和变化可诉诸于本领域技术人员，且此类修改和变化被认为在本发明的范围之内。
[0139] 如在本文使用的术语“基本上由……组成”是指对于给定实例所需的那些要素。该术语允许不实质地影响本发明的该实例的
基础和新颖性或功能特征的另外要素的存在。
[0140] 术语“由……组成”是指如在本文所述的组合物、方法和其分别的组分，其排除了没有在给定实例中列举的任何要素。
[0141] 本发明已在本文被宽泛并一般地描述。落入上位公开之内的每个更下位物质和子类(subgeneric)分组也形成了本发明的部分。这包括本发明的一般描述，伴随从整群(genus)中去除了任何主题的附带条件或负面限制，而不管删除的材料是否在本文被特别地列出。
[0142] 其他实施方案在以下
权利要求和非限定实施例之内。另外，在本发明的特征或方面按照马库什组描述的情况下，本领域技术人员将意识到本发明还特此按照马库什组的任何个别成员或成员的亚组描述。
[0143] 实验部分
[0144] 实施例1敏感性试验-基本筛选
[0145] 材料和方法：
[0146] 在此研究中所用的V2-二聚体和全部脂肽(图1A)购自Mimotopes。通过溶解到无菌水中以制得1000μg/mL储备溶液来制备所有肽。使用如临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI))描述的肉汤大量稀释(broth macro-dilution)方法在Mueller Hinton肉汤(MHB)中进行最小抑制浓度(MIC)的确定。然后，阳离子调整的MHB(CA-MHB)用于在测试管中制备化合物的两倍系列稀释物。接种物
5
悬浮液的浓度也使用MHB调整到约5x10菌落形成单位(CFU)/mL。在读数之前，细菌与化合物在35℃孵育24小时。在此研究中，所用的
革兰氏阳性菌株为金黄色葡萄球菌DM4001和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)DM9808。所用的革兰氏阴性菌株为肺炎克雷伯氏菌DM4299、铜绿假单胞菌ATCC23155和大肠杆菌ATCC27922。
[0147] 表1A.抗菌活性：V2D、脂质修饰的V2D(C2-C14)的MIC值
[0148]
[0149]
[0150] 表1B.抗菌活性：G2D、脂质修饰的G2D(C2-C14)的MIC值
[0151]
[0152] [a]未确定
[0153] 相比于V2D，C8-V2D和C10-V2D显示了针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌改善的抗微生物活性(表1A)。相比于G2D，C8-G2D和V10-G2D的抗微生物活性显示了针对革兰氏阳性细菌改善的抗微生物活性(表1B)。
[0154] 实施例2敏感性试验-对V2D、C8-V2D和C10-V2D进一步筛选
[0155] 材料和方法：
[0156] 在此研究中所用的细菌在以下表2A和表2B中列出。所用的方法为如以上实施例1所述。
[0157] 结果：
[0158] 表2A.V2D、C8-V2D和C10-V2D针对一系列甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的抗菌活性
[0159]
[0160] 图2B.V2D、C8-V2D和C10-V2D针对一系列MSSA和MRSA菌株的抗菌活性
[0161]
[0162] 金黄色葡萄球菌(MSSA和MRSA)
[0163] 测试的全部菌株：16
[0164] i)C8V2D-对于8个菌株提高2倍。对于1个菌株提高4倍。
[0165] 改善％＝56.3％
[0166] ii)C10V2D-对于10个菌株提高2倍。
[0167] 改善％＝62.5％
[0168] 铜绿假单胞菌
[0169] 测试的全部菌株：10
[0170] i)C8V2D-对于7个菌株提高2倍。对于1个菌株提高4倍。
[0171] 改善％＝80％
[0172] ii)C10V2D-对于7个菌株提高2倍。对于1个菌株提高4倍。
[0173] 改善％＝80％
[0174] 实施例3时间-杀灭动力学
[0175] 材料与方法
[0176] 在时间-杀灭研究中所用的细菌从18-20小时的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板分5 6
离。然后，在0.31mM
磷酸盐缓冲液中悬浮接种物并调整以获得含10到10 CFU/mL的细菌悬浮液。然后，用各种浓度的C8V2D处理接种物。混合物在35℃下孵育。在0分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时和24小
时移出培养物等分试样，用于平板活菌计数。使用戴伊恩格利(D/E)中和肉汤(Dey-Engley Neutralization Broth)10倍系列稀释等分试样，且然后使用表面涂布平板方法将20μL的每份稀释物平铺到TSA平板。然后，平板在
35℃下孵育持续48小时到72小时。细胞活力通过计算平板上生长的菌落评价。杀菌活性被定义为与在每次测定开始时的未处理对照相比，用抗微生物剂处理的培养物中活菌计数的3个对数单位(3-log)的减少。为了评价抗微生物剂在平板上携带污染的可能性，存在和不存在5c和6的情况下，检查了系列稀释物中的测试菌株作为对照。在此研究中所用的细菌为铜绿假单胞菌ATCC23155。
[0177] 参见图1，在本实施例的体外时间-杀灭动力学测定中观察到2x和4x MIC下20-30分钟内减少3个对数单位。因此，证明C8V2D可快速杀灭铜绿假单胞菌。
[0178] 实施例4体外和体内毒性
[0179] 4A.溶血性测定
[0180] 材料和方法
[0181] 新西兰白兔的新鲜红血细胞(RBC)用于此实验。获得的RBC在3000rpm离心10分钟。去除上清液并用无菌PBS缓冲液(20mM,100mM NaC1,pH 7)洗涤2次。将RBC在PBS中进一步稀释至8％储存溶液。将肽以期望存储浓度溶解于PBS中。当将化合物与RBC混合时，获得了4％RBC的期望浓度。对于C14V2D和C16V2D，将它们以期望存储浓度溶解于二甲基甲酰胺((CH3)2NCH；DMF)。当将化合物与RBC混合时，获得了4％RBC和0.5％DMF的期望浓度。使用了小于1％的DMF浓度，因为它具有对RBC可忽略的溶血活性。将混合物加入到1.5mL离心管中并在37℃下孵育1小时。孵育之后，血液在4℃下3000rpm离心3分钟。将100μL的上清液转入透明的96孔平板。使用酶标仪(microplate reader)(TECAN Infinite 200M Pro)在576nm下测量吸光度。将2％Triton X-100用作阳性对照。PBS用作阴性对照。释放的血红蛋白的量使用以下公式计算：
[0182]
[0183] 结果：
[0184] 表3A.肽和脂质修饰的肽二聚体的溶血活性
[0185]a
[0186] 在20mg/mL时溶血性％＝3.3％。b
[0187] 在PBS中的值。在DMF中HC10为173.3±35.2mg/mL。c
[0188] 在DMF中的值。C16V2D不能溶于PBS。d
[0189] 选择性＝HC10/MIC
[0190] HC10是诱导从红血细胞释放10％血红蛋白的肽浓度。表3A显示了V2D和C2-C10V2D是非溶血性的直到2000μg/mL。因此，V2D和C2-C10V2D为对细菌膜非常特异性的。C12V2D表现出更有力的溶血活性，且C14和C16V2D在更低浓度下引起显著溶血性。
通常，溶血活性随偶联到肽二聚体的脂质长度而增加，且因此选择性随脂质长度的增加而减少。
[0191] 4B.体外毒性测试
[0192] 乳酸盐脱氢酶测定
[0193] 通过乳酸盐脱氢酶(LDH)测定确定筛选的单个化合物的细胞毒性。简言之，将人角膜
成纤维细胞以每孔10,000细胞的
密度平铺于96孔不透明白色平板(SPL Life Sciences Inc)。将各种浓度的测试化合物和对照添加到适当孔，使得终体积为每孔中100μL。在暴露到测试化合物4小时后，将平板从37℃
培养箱中取出并平衡到22℃持续30分钟。将100微升的Cyto-TOX ONE试剂(Promega Inc.USA)添加到每个孔中，且LDH测定根据制造商的说明书进行。使用酶标仪(Tecan Infinite 200Pro,Switzerland)在560nm的激发
波长和590nm的发射波长下评价荧光。暴露到1％Triton X-100的细胞用作阳性对照并处理作为LDH的最大释放。使用以下公式确定每种化合物的比细胞毒性百分比(I＝强度)：
[0194] 细胞毒性％＝[(I实验)－(I阴性对照)]/[(I阳性对照)－(I阴性对照)]×100[0195] 4C.细胞活性(ATP)测定
[0196] 将细胞以每孔10,000细胞的密度平铺于96孔不透明白色平板(SPL LifeSciences Inc.Korea)。将各种浓度的测试化合物和对照添加到适当孔，使得终体积为每孔中100μL。在暴露到测试化合物4小时后，将平板从37℃培养箱中取出并平衡到22℃持续
30分钟。将100微升的CellTiter-Glo试剂(Promega Inc.USA)添加到每个孔中，且ATP测定根据制造商的说明书进行。使用酶标仪(Tecan Infinite 200Pro,Switzerland)评价发光。暴露到1％Triton X-100的细胞用作阳性对照。使用以下公式确定每种化合物的细胞活力百分比(L＝检测的发光)：
[0197] 活力％＝[(L阴性对照)－(L实验)]/[(L阴性对照)－(L阳性对照)]×100
[0198] 结果：
[0199] 表3B.C8V2D相比于V2D的体外毒性
[0200]
[0201] [a]毒性浓度(TC50)为诱导50％细胞毒性并降低50％细胞活力。
[0202] 4D.体内局部和急性毒性测试。
[0203] 材料和方法：
[0204] 将购自新加坡国立大学(National University of Singapore)的野生型C57BL6(6-8周龄)(20-30克重)小鼠用于此研究。所有的动物在1周适应环境后利用并放到具有受控
温度(23±2℃)、12小时光暗周期和湿度(55-60％)的
空调房中。所有动物按照视觉与眼科学研究协会(Association for Research in Vision and Ophthalmology)(ARVO)对于在眼科和视觉研究中动物的使用(the Use of Animals in Ophthalmic,and Vision Research)的
声明、对于实验室动物的照料和使用(Care and Use of laboratory animals)的指南(国家研究委员会(National Research Council))进行并处于新加坡健康实验医学中心(Singhealth Experimental Medical Centre)(SEMC)的监管之下。为了调查角膜毒性，已随机选择三只正常和健康野生型小鼠并用10mM PBS中1mg/ml和3mg/ml的C8V2D处理。以5次/天局部应用C8V2D持续4天。应用后，角膜清晰度已通过裂隙灯显微术每天追踪检查持续到第4天。为了研究急性全身性毒性，通过静脉内和腹膜内途径施用C8V2D。选择两个小鼠用于每个途径并通过24小时仔细监测以观察与记录任何死亡、发病或有毒迹象。肉眼尸检(Gross necropsy)将对任何死亡或濒死动物进行。
[0205] 结果：
[0206] 表3C.C8V2D在体内局部和急性毒性测试中的安全性浓度
[0207]
[0208] 体外和体内毒性曲线两者都显示C8V2D是安全的。C8V2D是新颖的广谱抗微生物剂，其基于体外和体内研究是无毒的。
[0209] 实施例5脂多糖(LPS)中和研究
[0210] 研究本公开内容的肽和脂质修饰的肽对革兰氏阴性细菌LPS的可能影响
[0211] 材料和方法
[0212] 通过使用具有对制造商的方案较小修改的Pierce鲎
变形细胞溶解产物(LAL)发色内毒素定量试剂盒(Thermo Scientific)评价脂多糖(LPS)中和。LAL包含在LPS存在下在一系列反应中被激活的酶。在级联反应中被激活的最后的酶从发色底物中将发色团分裂为对硝基苯胺(PNA)，并产生黄色。将在405nm下
光度测量释放的PNA的量，其与在系统中LPS的量成比例。简言之，首先在加热模
块中在37℃下平衡微孔板10分钟。然后，将期望浓度的脂质修饰的肽用移液器吸取到微孔板的孔中并在37℃下孵育5分钟。然后，混合物与LAL在37℃下孵育10分钟，随后与2mM底物溶液在37℃孵育。10分钟后，将25％乙酸加入到每个孔中以停止反应且在405-410nm下测量吸光度。然后，确定中和50％的LPS的有效浓度(NC50)。在此研究中，使用了来自大肠杆菌0111:B4(Sigma Aldrich)的LPS和来自铜绿假单胞菌10(Sigma Aldrich)的LPS。
[0213] 结果
[0214] 表4A.V2D和脂质修饰V2D中和大肠杆菌50％LPS的有效浓度值
[0215]
[0216] 表4B.V2D和脂质修饰V2D中和铜绿假单胞菌50％LPS的有效浓度值(NC50)
[0217]
[0218] 结果：
[0219] 具有更长脂质长度(n≥6)的脂质修饰的肽可有效中和LPS。显著地中和LPS的临界链长度为n＝6。对于大肠杆菌的LPS，相比于V2D对LPS中和的改善为：C6V2D＝7.8倍；C8V2D＝20倍且C10V2D＝38倍(参见图3A和表4A)。
[0220] 类似的模式对铜绿假单胞菌的LPS的中和获得(图2B和表4B)。然而，中和50％的铜绿假单胞菌LPS所需的浓度比大肠杆菌LPS更高。相比于V2D对LPS中和的改善为：C6V2D＝1.6倍；C8V2D＝2.6倍且C10V2D＝3.2倍(参见图3A和表4A)。
[0221] 实施例6 LPS-Bodipy置换测定
[0222] 研究脂质修饰肽与脂多糖的结合能力
[0223] Bodipy TR尸胺(BC)为在LPS结合测定中所用的荧光探针。BC对LPS的脂质A部分的结合通过离子桥形成
复合体。外膜透化物(permeabiliser)如多粘菌素B将从LPS的脂质A中置换出BC，导致去猝灭作用，其将引起荧光强度增加。将Bodipy TR尸胺溶解于DMF并用TRIS缓冲液(50mM,pH 7.4)稀释。将等体积的100μg/mL LPS和10μM的Bodipy TR尸胺混合在一起且将混合物的等分试样添加到SPL 96黑色孔平板(SPL Life Sciences)中的期望浓度的脂质修饰肽。将40μM多粘菌素B用作实验中的阳性对照。通过TECAN infinite 200酶标仪以580nm的激发波长和620nm的发射波长测量荧光读数。
[0224] 图4显示了通过本公开内容的肽和脂质修饰肽从Bodipy置换BC。通常，由于所有肽结合LPS比C8-C16V2D更强，获得了S形曲线(曲线还没有平台)。数据显示，脂肽可结合到LPS并从脂质A中置换Bodipy。
[0225] 实施例7 NPN外膜透化作用测定
[0226] 研究肽和脂肽对外膜或LPS的透化作用的影响
[0227] 材料和方法
[0228] 由于组成外膜的外部小叶的脂多糖(LPS)分子的存在，外膜能够阻止外部疏水分子诸如1-N-苯基萘胺(NPN)的进入。为了调查抗微生物剂脂质修饰肽(脂肽)是否可透化细菌的外膜，使用了在磷脂环境中显示高荧光性然而在水环境中发荧光低的NPN。在指数生长期的早期收集临床分离株大肠杆菌ATCC 8739并悬浮于5mM HEPES缓冲溶液中(pH 7下2mM EDTA)直到获得在670nm下0.35的光密度[OD630]。通过溶解NPN到丙酮并用5mM HEPES缓冲液稀释来制备40μM NPN储存溶液(C10H7NHC6H5)。然后，将细菌悬浮液加入到在96黑色孔平板(SPL Life Sciences)中的40μM NPN溶液中。将期望浓度的脂肽加入孔板中并彻底地混合。在孔板中的NPN的终浓度是20μM。将5mM HEPES的添加用作在实验中的阴性对照。通过TECAN infinite 200酶标仪以355nm的激发波长和405nm的发射波长测量荧光读数。
[0229] 结果：如图5所观察到的，NPN测定显示了本公开内容的脂质修饰的肽可透化脂多糖。C8V2D-C14V2D比V2D具有更佳的透化效果。
[0230] 实施例8脂肽与可商购抗生素的协同性研究
[0231] 目的：研究作为协同剂的脂肽中和LPS的显著性
[0232] 材料和方法
[0233] 使用棋盘微量稀释方法用MHB确定了V2D、C8V2D和C10V2D与其他可商购的抗生素的协同相互作用。简言之，通过肉汤微量稀释方法确定在协同性研究中所用的每个抗生素的MIC。根据更早确定的每个化合物和每个抗生素的MIC制备浓度范围。测试的浓度范围为从1×MIC到0.03×MIC的范围(或进一步被稀释直到获得了最小总部分抑制浓度，FIC)。制备化合物和抗生素的两倍稀释物并在灭菌的测试管中混合。然后，加入包含细菌5
的悬浮物，以形成约5x 10CFU/mL的最终接种物。然后，在35℃孵育测试管24小时。将来自每个测试管的等分试样(200μL)加入到无菌96-孔平底平板(SPL Life Sciences)。使用TECAN Infinite 200酶标仪通过测量600nm光密度下的吸光度确定MIC90。所用的抗生素为萘啶酸、庆大霉素、红霉素、链霉素和卡那霉素。使用根据公式∑FIC＝FICA+FICB的式计算总FIC，其中FICA或FICB＝剂A或B联合MIC/剂A或B单独MIC。∑FIC值被解释为以下：∑FIC值≤0.5表示协同，0.5-0.75的∑FIC值表示部分协同，且0.75到4表示无差异，且∑FIC值≥4表示拮抗。
[0234] 结果：
[0235] 表5.V2D、C6V2D和C8V2D与5种不同抗生素对抗铜绿假单胞菌和大肠杆菌的部分抑制浓度指数
[0236]
[0237] 铜绿假单胞菌：
[0238] C6V2D具有更佳的协同作用(测试的3/5抗生素)。C8V2D具有更弱的作用。
[0239] 大肠杆菌：
[0240] C8V2D比V2D具有更佳得多的协同作用(测试的5/5抗生素)。C6V2D也还显示了良好的协同相互作用。
[0241] 本公开内容的脂质修饰的肽还被认为在亚微克和亚MIC(最小抑制浓度)值下起作用以增加现有抗生素的活性，甚至对抗性形式的假单胞菌属。协同作用在下列表中被阐述。
[0242] 实施例9脂肽的内膜靶向性质
[0243] 目的：研究脂肽与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的内膜相互作用
[0244] 9A.DisC3-5
细胞质膜去极化测定
[0245] 材料和方法
[0246] 2.5细胞质膜去极化测定
[0247] DisC3-5(3,3'-碘化二丙基硫杂二碳氰化物(3,3’-dipropylthiadicarbocyanide iodide)，Invitrogen)为根据细菌细胞的细胞质膜电位在细胞和介质之间分配的膜电位敏感染料。DisC3-5到极化的细胞质膜的分配将自猝灭荧光强度。耗散膜电位的膜活性抗微生物剂的加入将引起染料释放到周围介质且将观察到荧光的增加。调查了脂肽对分离株金黄色葡萄球菌(DM4001)和大肠杆菌ATCC8739的膜电位的影响。简言之，在指数生长期的早期收集临床分离株金黄色葡萄球菌(DM4001)或大肠杆菌ATCC8739并用5mM HEPES缓冲液(pH 7下0.1M KCl和0.2mM EDTA)悬浮直到获得620nm下0.09的光密度[OD620]。对于脂肽，细胞悬浮物与0.4μΜ的DiSC3-5在37℃孵育30分钟直至DiSC3-5摄入达到最大。使用Photon Technology International Model 814荧光分光光度计，监测荧光读数持续500秒，直至在660nm激发波长和675nm发射波长获得稳定的基线。将期望浓度的脂肽加入到搅拌的比色杯中且监测荧光
信号直到读数被稳定。
[0248] 结果
[0249] 图6显示了在(A)金黄色葡萄球菌DM4001和(B)大肠杆菌ATCC 8739存在下本公开内容的脂质修饰肽对DiSC3-5的荧光强度的影响。如图6所示的，脂质修饰的肽的脂质尾部长度越长，观察到的DiSC3-5去极化程度越高。事实上，C8V2D至C16V2D能够引起细菌细胞膜的有效去极化。
[0250] 9B.脂肽类似物的膜损伤作用
[0251] 材料和方法：
[0252] 使用活/死Baclight细菌活力试剂 盒(Live/Dead BacLight BacterialViability Kit)(Molecular Probes,Invitrogen)评价细菌膜损伤的程度，所述试剂盒利用SYTO 9绿色荧光核酸
染色剂和红色荧光核酸染色剂碘化丙啶两者，以其不同的能力渗透健康细菌细胞。SYTO9染料可渗透具有完整和受损的膜细菌，而碘化丙啶仅可渗透具有受损细菌的细菌，由此当存在两种染料时引起在SYTO 9染色剂的荧光的减少。因此，具有完整细胞膜的细菌染色绿色荧光，而具有受损膜的细菌染色红色荧光。简言之，在指数生长期的早期收集临床分离株金黄色葡萄球菌(DM4001)并用0.9％盐水溶液洗涤两次(活的培养物)。在70％2-丙醇中重悬部分培养物以制备具有完全透化膜的死培养物。在37℃下孵育活和死培养物两者1小时，随后重悬到0.9％盐水溶液中直到获得在670nm下0.30的光密度[OD670]。将期望浓度的脂肽与活培养物悬浮液在37℃下分别孵育10分钟和30分钟。
然后，将混合物的等分试样和标准加入到在96孔平底黑色平板(Corning Life Sciences)中的等体积的染料混合物(10μΜSYTO 9染色剂和60μΜ碘化丙啶)并彻底地混合。使用TECAN infinite 200酶标仪，将用于激发的波长固定在485nm以获得从500nm到700nm的发射
光谱。使用以下式确定绿色对红色比(G/R)：
[0253]
[0254] 使用G/R比标准曲线定量膜损伤的百分比(％)，所述G/R比标准曲线使用0、10％、50％、90％和100％活培养物悬浮液的细菌混合物产生。一组标准溶液通过将不同体积的活培养物悬浮液与死培养物悬浮液混合到一起而获得。
[0255] 结果
[0256] 如图7所示，对于V2D到C14V2D没有观察到对膜完整性的影响。然而，对于C16V2D在高浓度下(1×MIC及以上)观察到了减少的膜完整性。因此，证明用具有16碳长度的脂质基团修饰的肽可引起对细菌膜完整性的破坏。结果表明，细菌细胞膜的透化需要非常长的脂质尾部(增加的疏水性)。因此，尽管C8-C14V2D显示能够去极化细菌膜，对膜完整性的破坏需要更长的脂质基团。
[0257] 实施例10使用钙黄绿素封装的脂质体的膜选择性研究
[0258] 材料和方法
[0259] 将处于自猝灭浓度的钙黄绿素与脂质体水合，以封装钙黄绿素。由于自猝灭，观察荧光强度为低的。当脂质体被抗微生物剂破坏时，染料将被释放并被
溶剂稀释。这将降低自猝灭的程度并导致荧光强度的增加。在此测定中使用的所有磷脂购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster)且没有进一步纯化地被使用。在此研究中使用的磷脂为1,2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷脂酰
乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-磷脂酰(l'-外消旋-甘油)(钠盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)，DOPG)和大肠杆菌总脂质提取物。使用
薄膜水合方法制备装载到大
单层囊泡(LUV)的钙黄绿素。由于细菌内膜中的主要组分为DOPE和DOPG，具有DOPE/DOPG＝3/1比例的脂质分子为模拟细菌膜的通用模型的通常公认的模型。类似地，DOPC的脂质体组成是模拟RBC膜的通用模型以研究化合物的选择性的通常公认的模型。将DOPE/DOPG＝3/1的脂质或DOPC溶解于甲醇/氯仿(体积比1:2)。在氮气下干燥溶剂，随后冻干至少1小时。然后，干燥的脂质薄膜与钙黄绿素溶液(80mM钙黄绿素，pH 7的50mM HEPES缓冲液)水合至30mM的终脂质浓度。水合的脂质囊泡(lipid vesicle)经受在液氮中冷冻且在水浴中解冻的7个循环。在迷你-
挤出机(Avanti Polar Lipid Inc.)中使用聚碳酸酯膜(Whatman，孔径100nm)进行10个循环的挤出，以制备100nm的同质LUV。使用使用了Sephadex G-50的凝胶过滤柱，将钙黄绿素封装的囊泡从游离钙黄绿素中分离。通过总磷确定测定确定洗脱的脂质体的浓度。将钙黄绿素封装的LUV的等分试样转移到搅拌的比色杯。然后，将期望浓度的脂肽(溶解于50mM HEPES)加入以分别获得1/2、1/4和1/8的期望的脂质对氧杂蒽酮(xanthone)类似物比和
1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128的期望的脂对脂肽比。在比色杯中的脂质体的终浓度是50μΜ。将0.1％Triton X-100加入作为阳性对照以确定完全渗漏时的强度。使用TECAN infinite 200酶标仪在490nm的激发和520nm发射波长下监测荧光发射强度30分钟。使用以下式计算渗漏的百分比(L％)：L％＝[(It cal0)/(I∞-I0)]×100％，其中I0和It分别为加入氧杂蒽酮类似物/脂肽之前和之后的强度，且I∞是在0.1％Triton X-100加入之后的强度。
[0260] 结果
[0261] 在本公开内容中，使用人工脂质膜研究了脂肽与脂质膜的相互作用。在当前膜选择性研究中，DOPE/DOPG＝3/1的脂质组成用于模拟细菌膜。测定显示了，本公开内容的脂肽能够在细菌内膜中诱导～50％钙黄绿素渗漏(图8A)。为了观察本公开内容的脂质修饰肽的选择性，还构建了模拟红血细胞膜的脂质体。图8B显示了，与在模拟细菌膜的脂质体中观察到的钙黄绿素渗漏(图8A)相比，本公开内容的脂质修饰肽没有引起显著红血细胞膜破坏。相应地，本研究的结果表明了，DOPE为提供与脂质修饰肽的静电相互作用的主要组分，因此提供了本公开内容的脂质修饰肽针对细菌膜的优秀选择性。
[0262] 实施例11本公开内容的肽联合抗生素的协同性研究
[0263] 最低抑制浓度的确定
[0264] 使用肉汤微量稀释方法确定最低抑制浓度(MIC)。细菌细胞(表6中所示)在Mueller Hinton肉汤(MHB)中过夜生长。将100μL的MHB中调整的接种物加入到肉汤中5 6
溶解的肽或抗生素的100μL每份稀释物，以便在每个孔中
收获10cfu/mL到10cfu/mL的细胞终密度。在35℃孵育平板24小时且每30分钟监测在600nm的吸光度(OD600)。阳性对照孔包含肉汤和生物体(无肽/抗生素)，且阴性对照管仅包含肉汤。记录了肽对于每个临床分离株或参考生物体的MIC，作为肽/抗生素抑制测试生物体的可见生长的最低浓度。
2+
为了研究Mg 对分支肽的MIC的影响，MgCl2的浓度在MHB中变化且如以前确定MIC。
[0265] 表6.B2088和B2088_99的最低抑制浓度(MIC)
[0266]
[0267] aPa是铜绿假单胞菌，且Kp是肺炎克雷伯氏菌
[0268] 表7.如通过ED50(杀灭50％细菌细胞的有效剂量)测量的B2088和B2088_99的杀菌性质
[0269]
[0270] 部分抑制浓度指数(FICI)的确定
[0271] 为了确定肽联合其他抗生素的FICI，使用了多药物抗性菌株铜绿假单胞菌DR4877。在测试之前，在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中制备至少2×MIC的每种药物(多价肽和抗生素)的储备溶液。在96-孔微量滴定平板上通过垂直地
覆盖多价肽的两倍系列稀释物(即沿纵坐标)到抗生素的系列稀释物(即，沿横坐标)来装配棋盘。每个孔由单独的和与MHB组合的100μL系列稀释的肽或抗生素以及100μL接种物(OD600＝0.08)组成。微量滴定平板在35℃下孵育24小时。通过目视检查并通过OD600测量两者确定抑制。将使用以下公式计算部分抑制浓度指数：
[0272]
[0273] 用于表征抗生素组合的FIC指数如下：FIC指数<0.5协同；0.51.0，加和性；14，拮抗。还比较了肽与作为标准的多粘菌素B的协同作用。
[0274] LPS和Mg2+对MIC的影响：为了检查肽和LPS的相互作用，在1×MIC的肽浓度下，外源地加入的后者浓度为MHB中的(0.001-100μg/mL)。评估了抑制％且确定了50％抗细菌活性(IC50)所需LPS的量。
[0275] 表8.在B2088和B2088_99与多种类别的抗生素之间的协同性。多药物抗性菌株铜绿假单胞菌DR4877用于实验。
[0276]
[0277] 实施例12本公开内容的肽的细菌活性的研究
[0278] 细菌活力测定：
[0279] 细菌活性对两种革兰氏阴性细菌(Pa 9027和Pa 27853)进行。培养物在TS琼脂中生长过夜且接种少量分离的菌落以获得等于0.5马克
法兰氏标准(McFarland6
standard)的混
浊度。用10mM磷酸盐缓冲液将细胞浓度调整到10CFU/mL且分离到不同的
5
管以取得10CFU/mL的终浓度。将肽加入到单独管中以获得1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC、
2MIC和4MIC的浓度。管在37℃下孵育22小时。进行了系列稀释且将100μL的悬浮液等分到MHA平板。平板在37℃下孵育24小时用于菌落计数。在0小时和22小时进行阳性对照。
[0280] 图12显示了B2088和B2088_99两者对抗多种铜绿假单胞菌菌株的细菌性质。图12显示了B2088_99的有效剂量显著低于B2088。
[0281] 时间-杀灭动力学分析：
[0282] 杀菌作用的动力学通过以前报道的测定进行。简言之，将少量过夜生长的铜绿假单胞菌菌株从胰蛋白酶大豆琼脂平板中收集且用美国药典的磷酸盐缓冲液(pH7.2)悬浮。6
将悬浮液调整到10CFU/mL的初始接种物并与多种浓度的B2088和B2088_99在35℃下孵
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育。在多个时间间隔取出0.1mL等分试样，使用相同缓冲液稀释10-10倍，铺板于胰蛋白酶大豆琼脂平板并在35℃下孵育。在24小时孵育后计数菌落并表示为CFU/mL。不含肽的缓冲液充当阳性对照，且使用下面公式评价细菌活力％：
[0283] 细菌活力＝1-(CFU/mL)肽/(CFU/mL)对照*100
[0284] 图13显示了B2088和B2088_99对抗铜绿假单胞菌的时间-杀灭动力学。在1×MIC和2×MIC下B2088_99表现了对抗铜绿假单胞菌菌株更快的杀灭动力学。
[0285] 外膜(OM)渗透性测定：
[0286] 为了探测肽的OM渗透性，膜不可渗透的探针N-苯基-1-萘基胺(NPN)在本研究中被使用。过夜培养的铜绿假单胞菌ATCC 9027细胞通过在4℃下3000rpm离心收集。洗涤产生的小团两次并重悬于5mM HEPES缓冲液(pH 7.2)至0.4的OD600。将细胞放置于10mm搅动的比色杯中且将NPN加入至10μΜ的终浓度。加入适当浓度的B2088且在Quanta Master荧光分光光度计(Photon Technology International,New Jersey,USA)监测荧光强度的增加。将激发和发射波长分别设置在350nm和410nm，具有2nm和5nm滑动宽度。相对于加入50μM多粘菌素B之后的NPN荧光强度中的增加，计算NPN摄入％。
[0287] 图14显示了B2088比B2088_99在引起外膜通透性上更有效。
[0288] 对于LPS和脂质A结合分支肽的Bodipy TR尸胺(BC)置换测定：
[0289] BC与LPS/脂质形成了紧密的复合物，其导致了其荧光强度的猝灭。当加入了可与LPS相互作用的肽/分子，伴随其荧光的去猝灭，从复合物中置换BC。测定在5mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中进行。将10μΜ的染料加入搅拌的
石英比色杯中的LPS或脂质A。使用580nm的激发波长进行荧光测量且监测在620nm的发射强度。通过多种浓度的肽的加入进行置换测定。多粘菌素B用作阳性对照。使用以下公式计算BC占有率：
[0290] OF＝F0-F/F0-Fmax。
[0291] 其中，F0是游离BC的荧光强度，Fmax是LPS-BC复合物的荧光强度且F是肽或多粘菌素B加入之后的荧光强度。图15显示了，B2088比B2088_99对脂多糖结合强两倍以上且对脂质A的结合强10倍以上。
[0292] 总之，如以上提供的结果表明了，从B2088去除疏水缬氨酸残基(即B2088_99)导致了增强的杀菌和杀灭动力学性质。然而，似乎外膜渗透性和对脂质A的强结合被疏水缬氨酸残基的去除损害。为了证实这些结果，研究了B2088和B2088_99与多种类别的抗生素的FIC指数。如在表8所示，B2088相比于B2088_99对多种抗生素对抗多药物抗性铜绿假单胞菌具有更佳的敏化能力。
[0293] 动物感染模型
[0294] 为了证实B2088相比于B2088_99具有更佳的抗微生物活性的体外结果，调查了它们去除小鼠模型中角膜感染的能力。使用了铜绿假单胞菌ATCC 9027感染的动物模型。如图10所显示的，在联合1/2剂量的加替沙星的0.5mg/mL的B2088，观察到感染的完全灭菌且活性比B2088_99更高(图11)。
