一种用于检测肺癌的引物组及检测方法
阅读：59发布：2023-01-13
专利汇可以提供一种用于检测肺癌的引物组及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于检测 肺 癌的引物组及其检测方法，本发明的引物包括SEQ ID No.1--SEQ ID No.18，可对Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folate receptor、N-cadherin、CD133和hTERT 9个基因进行联合检测。通过PCR或 荧光 定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达 水 平；采用优化的PCR条件，使观察结果更显著，进一步提高本发明的适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR和荧光定量PCR检测的高准确度和灵敏度。实施本发明中用于肺癌检测的引物组，通过检测病人样本中靶基因的表达，可以简单、方便且准确地诊断肺癌。，下面是一种用于检测肺癌的引物组及检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测肺癌的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～i9对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQ ID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示，引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示，引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示，引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ ID No.14所示，引物h的正向引物如SEQ ID No.15所示，引物h的反向引物如SEQ ID No.16所示，引物i的正向引物如SEQ ID No.17所示，引物i的反向引物如SEQ ID No.18所示。
2.一种权利要求1所述引物组检测肺癌的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、
30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
3.一种权利要求1所述引物组检测肺癌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
一种用于检测肺癌的引物组及检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 肺癌是目前中国和全球最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在中国及全球范围内均居于首位。很多肺癌确诊时已经为中晚期或伴有远处转移，其5年生存率约为15％。由于低剂量螺旋CT等新的诊断技术的应用，肺癌的早期诊断能力得到很大提升。但是低剂量螺旋对中央型肺癌以及小肺癌(<3mm)诊断的假阳性率较高，其临床应用受到一定限制。因此，我们需要进一步发现新的肿瘤标志物来辅助肺癌的早期检测与辅助诊断。
[0003] 近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。
[0004] CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。
[0005] 采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。
[0006] 目前RT-PCR方法检测肺癌CTCs的标准还没有建立。我们通过检测肺癌患者的CTCs特征基因，确定肺癌CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物(包括NK和CAR-T免疫治疗)的疗效及制定个体化治疗方案。
[0007] 针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测方法，通过联合检测Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folate receptor、N-cadherin、CD133和hTERT9个基因实现肿瘤的早期检测。本发明设计和运用靶特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测肺癌的引物组及检测方法，
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测肺癌的引物组，包含：
[0010]
[0011]
[0012] 本发明的引物组可通过以下两种方法实现肺癌的检测。
[0013] 方法1：PCR方法。
[0014] (1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
[0015] (2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
[0016] 方法2：荧光定量PCR方法
[0017] (1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
[0018] (2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
[0019] (3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
[0020] 本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于肺癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folate receptor、N-cadherin、CD133和hTERT基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测肺癌检出率可达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非肺癌病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明
[0021] 图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。
[0022] 图2为实施例中非肺癌患者外周血样本检测阴性PCR图。
[0023] 图3为实施例中非肺癌患者癌组织样本检测阴性PCR图。
[0024] 图4为实施例中肺癌患者外周血样本检测阳性PCR图。
[0025] 图5为实施例中肺癌患者组织样本检测阳性PCR图。
[0026] 图中，M.100bp marker；1.B2M；2.Survivin；3.CK7；4.TTF-1；5.SKP2；6.CK19；7.Folate receptor；8.N-cadherin；9.CD133；10.hTERT。
具体实施方式
[0027] 本发明针对目前肺癌中的肿瘤驱动基因，通过联合检测Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folate receptor、N-cadherin、CD133和hTERT 9个基因实现肺癌的早期检测。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。
[0028] 根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。
通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。
通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。
[0029] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文[0030] 所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0032] 实施例1:基因选择
[0033] 多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-30％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。Yu Y,Xu G等人(Yu Y,Xu G,Cao Jet al.Combination of four gene markers to detect circulating tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced lung adenocarcinoma using real-time PCR.Oncology Letters,Volume 5,Number 4,2013,pp.1400-1406).同时检测Survivin、CK7、TTF-1、hTERT基因，结果表明联合检测4个基因用于肺癌早期诊断的敏感度为82.35％，准确率达86％。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对肺癌和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现Survivin、CK7、TTF-1、SKP2、CK19、Folate receptor、N-cadherin、CD133和hTERT组成的基因组对肺癌具有较高的检出率，达到98％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。
[0034] 实施例2:引物筛选
[0035] (1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-I序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；
[0036] 表1：PCR检测引物
[0037]
[0038]
[0039]
[0040] (2)外周血样品的处理
[0041] 收集某医院收治并经病理证实的肺癌患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4hr。
[0045] 2.4吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；
[0046] 2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。
[0047] (3)核酸的提取
[0048] 3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBuffer RLT Plus，吹打混匀；
[0049] 3.2将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；
[0050] 3.3加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；
[0051] 3.4将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0052] 3.5在RNeasyMinElute离心柱中加入700μL Buffer RW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0053] 3.6在RNeasyMinElute离心柱中加入500μL Buffer RPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0054] 3.7将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；
[0055] 3.8将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-free H2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。
[0056] (4)模板cDNA的获得
[0057] 4.1准确测得样品RNA浓度；
[0059]成分 体积
5×Mix 8μL
RNA 500ng
RNase-free H2O 至40μL
5×Mix 8μL
RNA 500ng
RNase-free H2O 至40μL
[0060] 4.3轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；
[0061] (5)普通PCR扩增
[0062] 用Taq DNA聚合酶配置反应体系，用引物为a-i和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物用1％凝胶检测；
[0063] 扩增体系
[0064]
[0065]
[0066] PCR反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
[0067] (6)荧光实时定量PCR扩增
[0068] 根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：
[0069]成分 体积
2×ChamQ SYBR qPCRMaster Mix 10μL
cDNA 2μL
引物-F 0.4μL
引物-R 0.4μL
RNase-free H2O 7.2μL
Total 20μL
2×ChamQ SYBR qPCRMaster Mix 10μL
cDNA 2μL
引物-F 0.4μL
引物-R 0.4μL
RNase-free H2O 7.2μL
Total 20μL
[0070] 95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；
[0071] 根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测肺癌的引物组。
[0072]
[0073]
[0074] 实施例3：效果验证
[0075] 根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对200个肿瘤样本进行检测。
[0076]
[0077]
[0078] 其中，其中，EPCAM的正向引物为AATGATGTGGACATAGCTGA，反向引物为TAGACCCTGCATTGAGAATT；VEGF的正向引物为GTGCCCGCTGCTGTCTAATG，反向引物为CACATCTGCAAGTACGTTCG。
[0079] 1～7号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～7号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6、7号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于肺癌的检测。进一步通过研究发现，5号引物组中，Survivin在细胞分化过程中参与了凋亡的调节，与肿瘤进展过程中有助于细胞的增殖相关；CK7、CK19的表达可提示上皮细胞来源的肿瘤；TTF-1是转录激活因子，在肺癌的发生发展过程中发挥着重要作用；SKP2参与细胞凋亡于周期的调控，与肿瘤的侵袭性与转移活性相关；Folate receptor是一种通过聚糖磷酯酰肌醇连接在细胞膜上的糖蛋白，在众多上皮来源的恶性肿瘤中过度表达；N-cadherin是重要的粘附分子，其表达下调或功能丧失与肿瘤失分化、浸润性生长、转移及不良预后明显相关；CD133是肿瘤干细胞表面标志物，表达越高代表肿瘤的恶性程度越高；hTERT是人端粒逆转录酶，在人肿瘤组织中过表达。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技术效果。综上所述，本发明中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出肺癌的细胞生物学特征。
[0080] 实施例4：特异性分析
[0081] 根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对正常人外周血样本(图1)、非肺癌病人的外周血(图2)和非肺癌病人肿瘤组织样本(图3)、肺癌病人的外周血样本(图4)和组织样本(图5)进行检测。结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非肺癌病人的外周血(图2)和肿瘤组织样本(图3)中检测到基因的低表达或者不表达。在肺癌病人的外周血样本(图4)和组织(图5)中可检测到多个基因的表达，分别为6/9和7/9，说明本发明中所述引物组具有高度的特异性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 肺移植用肺脏保存装置 | 2020-05-11 | 1015 |
| 检测肺栓塞的血清标志物及其应用 | 2020-05-12 | 774 |
| 一种肺炎支原体培养基 | 2020-05-11 | 409 |
| 应用于无心跳供体肺移植中肺脏低温、通气序贯保存的装置 | 2020-05-12 | 443 |
| 治疗肺病的中药组合物 | 2020-05-11 | 661 |
| 一种应用于单孔胸腔镜肺叶切除术中的拉绳式肺部牵引钳 | 2020-05-12 | 549 |
| 治疗肺病的中药组合物 | 2020-05-11 | 208 |
| 肺康宝中药复方剂及其制备方法 | 2020-05-13 | 728 |
| 富集肺癌细胞复合纳米微球的制备 | 2020-05-13 | 499 |
| 一种双关节肺裂钳 | 2020-05-11 | 24 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
肺热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈