抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用
阅读：681发布：2023-03-08
专利汇可以提供抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及抗 肿瘤 溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用。本发明嵌合蛋白的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.4或如SEQ ID NO.5所示。嵌合蛋白的制备方法如下：构建嵌合基因；将嵌合基因经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌摇瓶培养， 超 声波 破碎 ，将收集的上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白。本发明的嵌合蛋白，可使抗肿瘤和抗血栓两种作用得以同时体现。，下面是抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于：由序列表SEQ ID NO.1所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQ ID NO.2所示的linker氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所示的SEC2氨基酸序列构成，linker将SEC2和SAK连接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。
2.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，其特征在于步骤如下：
1)构建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQ ID NO.9所示；
2)将得到的嵌合基因sak-linker-sec2，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的质粒pET28a-sak-linker-sec2；
3)将质粒pET28a-sak-linker-sec2转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白的方法，其特征在于步骤如下：
1)构建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
2)将得到的嵌合基因sec2-linker-sak，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的质粒pET28a-sec2-linker-sak；
3)将质粒pET28a-sec2-linker-sak转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1所述的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。
技术领域
本发明涉及抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用，属于微生物学，分子生物学和基因工程领域。
背景技术
2009年，美国ASCO主席在介绍肿瘤进展时提到，癌症的第一死亡原因是癌症本身和癌症复发，第二位死因就是血栓。癌症与血栓的关系非常密切，重视癌症血栓的预防和治疗已成为临床医生今后工作的重点之一。
1865年，法国医生Armand Trousseau首次报道了胃癌患者容易形成静脉血栓，不久，Billroth又于1878年发现了血栓中存在癌细胞，进一步提出癌变可引起凝血功能紊乱。临床上把肿瘤相关性血栓称为Trousseau综合症。大量的病理、实验和临床研究证实了这一现象，而且还发现，几乎所有的癌症患者都存在局部或全部高凝状态。
癌症患者的血栓性疾病包括深静脉血栓(deep venous thlmmbosis，DVT)、肺栓塞(pulmonary embolism，PE)、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation，DIC)、门静脉血栓(portal vein thmrnbosis，PVT)和动脉血栓栓塞(arterial thromboembolism，AT)、游走性浅表血栓性静脉炎(migratory thrombophlebitis superficial)等，其中下肢DVT最为常见。
癌症患者血栓形成的发病机理相当复杂，至今尚未完全明确。多种因素通过不同途径共同导致了癌症患者的血栓易患倾向，主要包括抗癌治疗、肿瘤细胞的表达物及释放物和致癌基因等因素。
抗癌治疗导致血栓形成，主要是手术治疗期间形成血栓，化疗药物和放射治疗诱发血栓形成以及患者在接受中心静脉穿刺置管治疗期间，管周纤维蛋白鞘导致血栓形成。
癌症患者所患的血栓性疾病与肿瘤细胞表达和释放的物质关系密切。肿瘤细胞可通过释放促凝因子或炎性因子来直接或间接地激活凝血级联反应，另一方面，炎性因子亦可刺激肿瘤细胞释放更多的促凝因子而加剧血液的高凝状态。肿瘤细胞表达和释放的三种主要促凝物质为：组织因子(TF)、癌促凝物质(cancer procoagulant CP)和丝氨酸蛋白酶(hepsin)。
新近的研究表明，某些致癌基因在促进细胞恶变的同时也能够引起凝血功能紊乱。如Yu J等证实，导致癌症产生的某些基因病变如Ras基因活化或p53基因失活能够造成组织因子(TF)的过度表达，诱发凝血病变。
最近的研究还显示，血栓形成参与了肿瘤的进展、血管生成和转移等机制。除了癌症治疗形成血栓可视为外界因素外，其余两种因素所形成的血栓都是应机体癌变出现的。研究发现，血栓的形成有利于肿瘤发生和发展的机制可能是纤维蛋白沉积于肿瘤细胞周围为肿瘤生长提供了2个便利条件：一方面为肿瘤细胞附着提供了基质，利于其局部扩散和蔓延；另一方面，纤维蛋白凝血块和相关的凝血因子能够上调血管内皮细胞生长因子的表达(VEGF)，从而为新生血管创造了条件。
金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxins，SEC2)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的加工，也不受组织相容性复合体(MHC)的限制，在APC之外与T细胞受体Vβ链形成MHCII-SE-TCRVβ复合物，在极低浓度时就能刺激大部分有TCRVβ序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。SEC2可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(Sag-dependentcell-mediated T-cell-derived cytotoxicity，SDCC)，从而产生系统的抗肿瘤反应。
葡激酶(staphylokinase，SAK)是由具有溶原性的金黄色葡萄球菌在指数期后期产生、分泌的一种胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用机制是激活体内溶栓系统，即通过激活纤溶酶原(Plg)转变成纤溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓药物，同其它的溶栓药物比较，葡激酶具有溶栓活力强，溶栓作用专一，免疫原性低以及过敏反应少等多种特点，而且当血栓被溶解后，葡激酶的对纤溶酶原的激活作用会受到人体内α2抗纤溶酶的抑制，避免了出血反应。
目前，治疗肿瘤及血栓的药物都为单一功能的药物，同时具有抗肿瘤及溶栓功能的药物还未见报道。基于SEC2的抑瘤活性和SAK的溶栓活性，若将这两种活性蛋白嵌合在一起，构建出一种既抗肿瘤又溶栓的双功能嵌合蛋白，对于治疗癌症并发血栓的病例具有重要意义。
1865年，法国医生Armand Trousseau首次报道了胃癌患者容易形成静脉血栓，不久，Billroth又于1878年发现了血栓中存在癌细胞，进一步提出癌变可引起凝血功能紊乱。临床上把肿瘤相关性血栓称为Trousseau综合症。大量的病理、实验和临床研究证实了这一现象，而且还发现，几乎所有的癌症患者都存在局部或全部高凝状态。
癌症患者的血栓性疾病包括深静脉血栓(deep venous thlmmbosis，DVT)、肺栓塞(pulmonary embolism，PE)、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation，DIC)、门静脉血栓(portal vein thmrnbosis，PVT)和动脉血栓栓塞(arterial thromboembolism，AT)、游走性浅表血栓性静脉炎(migratory thrombophlebitis superficial)等，其中下肢DVT最为常见。
癌症患者血栓形成的发病机理相当复杂，至今尚未完全明确。多种因素通过不同途径共同导致了癌症患者的血栓易患倾向，主要包括抗癌治疗、肿瘤细胞的表达物及释放物和致癌基因等因素。
抗癌治疗导致血栓形成，主要是手术治疗期间形成血栓，化疗药物和放射治疗诱发血栓形成以及患者在接受中心静脉穿刺置管治疗期间，管周纤维蛋白鞘导致血栓形成。
癌症患者所患的血栓性疾病与肿瘤细胞表达和释放的物质关系密切。肿瘤细胞可通过释放促凝因子或炎性因子来直接或间接地激活凝血级联反应，另一方面，炎性因子亦可刺激肿瘤细胞释放更多的促凝因子而加剧血液的高凝状态。肿瘤细胞表达和释放的三种主要促凝物质为：组织因子(TF)、癌促凝物质(cancer procoagulant CP)和丝氨酸蛋白酶(hepsin)。
新近的研究表明，某些致癌基因在促进细胞恶变的同时也能够引起凝血功能紊乱。如Yu J等证实，导致癌症产生的某些基因病变如Ras基因活化或p53基因失活能够造成组织因子(TF)的过度表达，诱发凝血病变。
最近的研究还显示，血栓形成参与了肿瘤的进展、血管生成和转移等机制。除了癌症治疗形成血栓可视为外界因素外，其余两种因素所形成的血栓都是应机体癌变出现的。研究发现，血栓的形成有利于肿瘤发生和发展的机制可能是纤维蛋白沉积于肿瘤细胞周围为肿瘤生长提供了2个便利条件：一方面为肿瘤细胞附着提供了基质，利于其局部扩散和蔓延；另一方面，纤维蛋白凝血块和相关的凝血因子能够上调血管内皮细胞生长因子的表达(VEGF)，从而为新生血管创造了条件。
金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxins，SEC2)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的加工，也不受组织相容性复合体(MHC)的限制，在APC之外与T细胞受体Vβ链形成MHCII-SE-TCRVβ复合物，在极低浓度时就能刺激大部分有TCRVβ序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。SEC2可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(Sag-dependentcell-mediated T-cell-derived cytotoxicity，SDCC)，从而产生系统的抗肿瘤反应。
葡激酶(staphylokinase，SAK)是由具有溶原性的金黄色葡萄球菌在指数期后期产生、分泌的一种胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用机制是激活体内溶栓系统，即通过激活纤溶酶原(Plg)转变成纤溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓药物，同其它的溶栓药物比较，葡激酶具有溶栓活力强，溶栓作用专一，免疫原性低以及过敏反应少等多种特点，而且当血栓被溶解后，葡激酶的对纤溶酶原的激活作用会受到人体内α2抗纤溶酶的抑制，避免了出血反应。
目前，治疗肿瘤及血栓的药物都为单一功能的药物，同时具有抗肿瘤及溶栓功能的药物还未见报道。基于SEC2的抑瘤活性和SAK的溶栓活性，若将这两种活性蛋白嵌合在一起，构建出一种既抗肿瘤又溶栓的双功能嵌合蛋白，对于治疗癌症并发血栓的病例具有重要意义。
发明内容
针对癌症患者易形成血栓的问题，本发明基于SEC2的抗肿瘤活性和SAK的抗血栓作用，构建一种抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，使抗肿瘤和抗血栓两种作用得以同时体现。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：一种抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于：由序列表SEQ ID NO.1所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQ ID NO.2所示的linker氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所示的SEC2氨基酸序列构成，linker将SEC2和SAK连接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。
利用大肠杆菌表达系统生产上述抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的方法如下：
1)构建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQ ID NO.9所示；
2)将得到的嵌合基因sak-linker-sec2，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的质粒pET28a-sak-linker-sec2；
3)将质粒pET28a-sak-linker-sec2转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
利用大肠杆菌表达系统生产上述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的方法如下：
1)构建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
2)将得到的嵌合基因sec2-linker-sak，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的质粒pET28a-sec2-linker-sak；
3)将质粒pET28a-sec2-linker-sak转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。
本发明，根据实际需要选择嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，当药物制剂以抗肿瘤为主时以嵌合蛋白SEC2-linker-SAK为佳，当药物制剂以溶栓为主时以嵌合蛋白SAK-linker-SEC2为佳。
以本发明的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK为有效成分，添加药学上常规的辅料，可制备具有抗肿瘤溶栓双效的各种药物制剂。
本发明的有益效果是：本发明所构建的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白既保留了SAK的溶栓活性又不减SEC2的抗肿瘤功能，是理想的溶栓抗癌双效生物制剂。本发明采用重叠延伸剪接技术，构建嵌合基因，通过大肠杆菌原核表达系统和Ni亲和层析纯化法，成功获得了高蛋白纯度的嵌合蛋白，并经体外溶栓实验和体外抑瘤实验证明了，本发明的嵌合蛋白分别与SAK和SEC2具有相同的活性，成功实现了溶栓抗癌双效生物制剂的构建。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：一种抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于：由序列表SEQ ID NO.1所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQ ID NO.2所示的linker氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所示的SEC2氨基酸序列构成，linker将SEC2和SAK连接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。
利用大肠杆菌表达系统生产上述抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的方法如下：
1)构建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQ ID NO.9所示；
2)将得到的嵌合基因sak-linker-sec2，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的质粒pET28a-sak-linker-sec2；
3)将质粒pET28a-sak-linker-sec2转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
利用大肠杆菌表达系统生产上述的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的方法如下：
1)构建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
2)将得到的嵌合基因sec2-linker-sak，经酶切后，插入到载体质粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位点，构建出表达嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的质粒pET28a-sec2-linker-sak；
3)将质粒pET28a-sec2-linker-sak转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；
4)将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞。
5)用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔；处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。
本发明，根据实际需要选择嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，当药物制剂以抗肿瘤为主时以嵌合蛋白SEC2-linker-SAK为佳，当药物制剂以溶栓为主时以嵌合蛋白SAK-linker-SEC2为佳。
以本发明的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK为有效成分，添加药学上常规的辅料，可制备具有抗肿瘤溶栓双效的各种药物制剂。
本发明的有益效果是：本发明所构建的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白既保留了SAK的溶栓活性又不减SEC2的抗肿瘤功能，是理想的溶栓抗癌双效生物制剂。本发明采用重叠延伸剪接技术，构建嵌合基因，通过大肠杆菌原核表达系统和Ni亲和层析纯化法，成功获得了高蛋白纯度的嵌合蛋白，并经体外溶栓实验和体外抑瘤实验证明了，本发明的嵌合蛋白分别与SAK和SEC2具有相同的活性，成功实现了溶栓抗癌双效生物制剂的构建。
具体实施方式
实施例1抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白SAK-linker-SEC2的制备
(一)带有嵌合基因sak-linker-sec2的表达质粒构建
为了保证嵌合蛋白中，SAK和SEC2不会发生结构和功能的影响，本发明采用由9个丙氨酸组成的柔性连接肽(linker)连接SAK和SEC2。通过重叠延伸剪接技术构建嵌合基因，连接到表达载体pET28a(+)上，并转化大肠杆菌BL21(DE3)。
1、嵌合基因sak-linker-sec2的构建：
经PCR方法分别克隆得到编码SAK的基因sak(其DNA序列如SEQID NO.6所示)和编码SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.7所示的)，并在sak的3’端和sec2的5’端分别加上编码连接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQ ID NO.8所示)，然后以linker为互补末端经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因sak-linker-sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.9所示)。同时，为了实现嵌合基因sak-linker-sec2连接到表达质粒pET-28a(+)上并能成功表达，通过PCR方法在嵌合基因sak-linker-sec2的5’端加上EcoRI酶切位点及保护碱基，在嵌合基因sak-linker-sec2的3’端加上终止密码子，XhoI酶切位点及保护碱基。
2、构建重组质粒：
将带有酶切位点的嵌合基因sak-linker-sec2经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，插入到表达载体pET28(+)的EcoRI/XhoI位点，T4连接酶16℃连接过夜，得到连接反应液。
3、大肠杆菌的化学转化：
将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，经化学方法转化(42℃水浴热激)，之后，将菌液涂布于LB平板上，37℃培养过夜，以筛选阳性克隆。
4、阳性克隆的筛选：
在含有Kan抗性的LB平板培养基上，挑取阳性克隆，培养后提取质粒经EcoRI和XhoI双酶切验证，确定嵌合基因sak-linker-sec2是否被插入到表达质粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)对得到的重组质粒进行测序确认。
试验结果：
经双酶切验证和测序分析综合表明，表达SAK-linker-SEC2的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pET28a-sak-linker-sec2的重组大肠杆菌。
(二)SAK-linker-SEC2的诱导表达及纯化
1、SAK-linker-SEC2的诱导表达
将带有重组质粒pET28a-sak-linker-sec2的重组大肠杆菌接种于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的10ml LB培养基中，培养12～16小时，次日按2％的接种量，将培养好的菌液接种到含有Kan(40μg/ml)的200ml LB培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用1mM IPTG进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明选择在菌体生长不是很活跃的30℃作为诱导温度，诱导4-5h。
2、SAK-linker-SEC2的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20℃过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。
用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔。处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。
将上清液低速上样于Ni-NTA亲和层析柱，平衡缓冲液(30mMTris-HCl，300mM NaCl pH7.6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30mM Tris-HCl，300mM NaCl，50-300mM咪唑pH7.6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组SAK-linker-SEC2。
本发明中，载体质粒pET28a(+)编码了三个用于纯化的标签，C端6×Histag，t7tag和N端6×Histag，本发明选择了N端6×Histag。利用Ni离子特异性螯合His的特点，实现含有6×Histag的SAK-linker-SEC2与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6×Histag与Ni离子的结合实现SAK-linker-SEC2的洗脱。
试验结果：经SDS-PAGE验证，成功表达并纯化出嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(三)体外溶栓活性分析
具体实施如下：
称取125mg琼脂糖(电泳级)，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，人纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，人纤维蛋白原2.2ml(6mg/ml)，倒入80mm平板内冷却，制成人纤维蛋白平板，用前于4℃放置半个小时。
打孔上样，每个孔的直径为2mm，上样量为10μl，SAK和SAK-linker-SEC2的浓度为50μg/ml，每个样品设置3个重复，于37℃恒温湿盒内放置24h后，测溶栓直径并进行活性比较。
实验结果：
SAK的溶栓直径平均为24.68mm，SAK-linker-SEC2的溶栓直径平均为24.72mm，二者的溶栓活性基本相同。
(四)体外淋巴细胞(PBMC)增殖活性分析
具体实施如下：
取正常人新鲜外周血5ml，抗凝后(肝素，终浓度0.2mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000rpm离心15min，取出中间的云雾层(PBMC)，再加入等量D-Hanks液混匀，3000rpm离心10min，弃上清，然后用3-5ml D-Hanks液重悬PBMC，3000rpm离心10min，重复一次，加入适量的含有10％血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以1×105个/孔的量加入到96孔板中，于CO2含量为5％，37℃的恒温细胞培养箱中培养12h，次日用含有10％血清的DNEM培养基将待测样品稀释至20ng/ml和200ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，以BSA阴性作为对照，PHA-P作为阳性对照，每样3个复孔；5％CO2，37℃培养72h；取出96孔板，按50μl/孔加入MTT，5％CO2，37℃培养4h；3000rpm离心10min，加入DMSO 120μl/孔，37℃溶解20min；酶标仪上570nm测定各孔的吸光值。
实验结果：
从鼠脾淋巴细胞的增值情况可以看出，无论是较低浓度的20ng还是较高浓度的200ng，SAK-linker-SEC2和肠毒素SEC2的增值率是相同的。结果见表1
表1鼠脾淋巴细胞增殖实验
(五)体外抑瘤活性分析
具体实施如下：
取正常人新鲜外周血5ml，抗凝后(肝素，终浓度0.2mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000rpm离心15min，取出中间的云雾层(PBMC)，加入等量D-Hanks液混匀，3000rpm离心10min，弃上清，用3-5mlD-Hanks液重悬PBMC，3000rpm离心10min，重复一次，加入适量的含有10％血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以2×105个/孔的量加入到96孔板中；倒掉Hella细胞培养瓶中旧培养基，加入2-3ml D-Hanks液洗去残留的培养基，或用少量胰酶涮洗一次，加入1-2ml胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，将胰酶倒掉，加入少量含有10％血清的DMEM培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，计数。将Hella细胞以1×104个/孔的量加入到96孔板中，用含有10％血清的DMEM培养基将待测样品稀释至20ng/ml和200ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，仅加Hella细胞作为肿瘤细胞对照孔，仅加与实验孔等量的PBMC和待测样品作为本底释放孔，每样3个复孔，5％CO2，37℃培养36h；取出96孔板，加入50μl/孔MTT，5％CO2，37℃培养4h；3000rpm离心10min，加入DMSO 120μl/孔，37℃溶解20min，酶标仪上570nm测定各孔的吸光值。并按照下面的公式计算抑瘤率：
实验结果：
从抑瘤效果上看，在20ng和200ng两种不同浓度下，SAK-linker-SEC2都表现出和肠毒素SEC2相同的活力。结果见表2
表2体外抑瘤实验
实施例2嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的制备
(一)带有嵌合基因sec2-linker-sak的表达质粒构建
1、嵌合基因sec2-linker-sak的构建：
经PCR方法分别克隆得到编码SAK的基因sak(其DNA序列如SEQID NO.10所示)和编码SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.11所示的)，并在sec2的3’端和sak的5’端分别加上编码连接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQ ID NO.8所示)，然后以linker为互补末端经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因sec2-linker-sak(其DNA序列如SEQ ID NO.12所示)。同时，为了实现嵌合基因sec2-linker-sak连接到表达质粒pET-28a(+)上，并能成功表达，通过PCR方法在嵌合基因sec2-linker-sak的5’端加上EcoRI酶切位点及保护碱基，在嵌合基因sec2-linker-sak的3’端加上终止密码子，XhoI酶切位点及保护碱基。
2、构建重组质粒：
将带有酶切位点的嵌合基因sec2-linker-sak经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，插入到表达载体pET28(+)的EcoRI/XhoI位点，T4连接酶16℃连接过夜，得到连接反应液。
3、大肠杆菌的化学转化：
将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，经化学方法转化(42℃水浴热激)，之后，将菌液涂布于LB平板上，37℃培养过夜，以筛选阳性克隆。
4、阳性克隆的筛选：
在含有Kan抗性的LB平板培养基上，挑取阳性克隆，培养后提取质粒经EcoRI和XhoI双酶切验证，确定嵌合基因sec2-linker-sak是否被插入到表达质粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)对得到的重组质粒进行测序确认。
试验结果：
经双酶切验证和测序分析综合表明，表达SEC2-linker-SAK的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pET28a-sec2-linker-sak的重组大肠杆菌。
(二)SEC2-linker-SAK的诱导表达及纯化
1、SEC2-linker-SAK的诱导表达
将带有重组质粒pET28a-sec2-linker-sak的重组大肠杆菌接种于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的10ml LB培养基中，培养12～16小时，次日按2％的接种量，将培养好的菌液接种到含有Kan(40μg/ml)的200ml LB培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用1mM IPTG进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明选择在菌体生长不是很活跃的30℃作为诱导温度，诱导4-5h。
2、SEC2-linker-SAK的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20℃过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。
用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔。处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。
将上清液低速上样于Ni-NTA亲和层析柱，平衡缓冲液(30mMTris-HCl，300mM NaCl pH7.6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30mM Tris-HCl，300mM NaCl，50-300mM咪唑pH7.6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组SEC2-linker-SAK。
本发明中，载体质粒pET28a(+)编码了三个用于纯化的标签，C端6×Histag，t7tag和N端6×Histag，本发明选择了N端6×Histag。利用Ni离子特异性螯合His的特点，实现含有6×Histag的SEC2-linker-SAK与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6×Histag与Ni离子的结合实现SEC2-linker-SAK的洗脱。。
试验结果：经SDS-PAGE验证，成功表达并纯化出嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示
(三)体外溶栓活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
SAK的溶栓直径平均为24.68mm，SEC2-linker-SAK的溶栓直径平均为18.40mm，嵌合蛋白溶栓活性明显降低。
(四)体外淋巴细胞(PBMC)增殖活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
从鼠脾淋巴细胞的增值情况可以看出，无论是较低浓度的20ng还是较高浓度的200ng，SEC2-linker-SAK和肠毒素SEC2的增值率是相同的。结果见表3
表3鼠脾淋巴细胞增殖实验
(五)体外抑瘤活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
从抑瘤效果上看，在20ng和200ng两种不同浓度下，SEC2-linker-SAK都表现出和肠毒素SEC2相同的活力。结果见表4
表4体外抑瘤实验
序列表
<110>辽宁大学
<120>抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用
<160>12
<210>1
<211>136
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
SSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGKGNELLSPHYVEF
PIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKN
KKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
AAAAAAAAA
<210>3
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAH
DLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCY
FSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRN
TISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIEN
NGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTK
NG
<210>4
<211>384
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
SSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGKGNELLSPHYVEF
PIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKN
KKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKKAAAAAAAA
AESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLA
HDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNC
YFSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKR
NTISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIE
NNGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTT
KNG
<210>5
<211>384
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAH
DLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCY
FSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRN
TISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIEN
NGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTK
NGAAAAAAAAASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGK
GNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPS
AKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIE
KK
<210>6
<211>408
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaa 408
<210>7
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa 720
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gctgctgctg ctgctgctgc tgctgct 27
<210>9
<211>1155
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaagc tgctgctgct 420
gctgctgctg ctgctgagag tcaaccagac cctacgccag atgagttgca caaatcaagt 480
gagtttactg gtacgatggg taatatgaaa tatttatatg atgatcatta tgtatcagca 540
actaaagtta tgtctgtaga taaatttttg gcacatgatt taatttataa cattagtgat 600
aaaaaactaa aaaattatga caaagtgaaa acagagttat taaatgaaga tttagcaaag 660
aagtacaaag atgaagtagt tgatgtgtat ggatcaaatt actatgtaaa ctgctatttt 720
tcatccaaag ataatgtagg taaagttaca ggtggtaaaa cttgtatgta tggaggaata 780
acaaaacatg aaggaaacca ctttgataat gggaacttac aaaatgtact tataagagtt 840
tatgaaaata aaagaaacac aatttctttt gaagtgcaaa ctgataagaa aagtgtaaca 900
gctcaagaac tagacataaa agctaggaat tttttaatta ataaaaaaaa tttgtatgag 960
tttaacagtt caccatatga aacaggatat ataaaattta ttgaaaataa cggcaatact 1020
ttttggtatg atatgatgcc tgcaccaggc gataagtttg accaatctaa atatttaatg 1080
atgtacaacg acaataaaac ggttgattct aaaagtgtga agatagaagt ccaccttaca 1140
acaaagaatg gataa 1155
<210>10
<211>411
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaata a 411
<210>11
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatgga 717
<210>12
<211>1155
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggagct 720
gctgctgctg ctgctgctgc tgcttcaagt tcattcgaca aaggaaaata taaaaaaggc 780
gatgacgcga gttattttga accaacaggc ccgtatttga tggtaaatgt gactggagtt 840
gatggtaaag gaaatgaatt gctatcccct cattatgtcg agtttcctat taaacctggg 900
actacactta caaaagaaaa aattgaatac tatgtcgaat gggcattaga tgcgacagca 960
tataaagagt ttagagtagt tgaattagat ccaagcgcaa agatcgaagt cacttattat 1020
gataagaata agaaaaaaga agaaacgaag tctttcccta taacagaaaa aggttttgtt 1080
gtcccagatt tatcagagca tattaaaaac cctggattca acttaattac aaaggttgtt 1140
atagaaaaga aataa 1155
(一)带有嵌合基因sak-linker-sec2的表达质粒构建
为了保证嵌合蛋白中，SAK和SEC2不会发生结构和功能的影响，本发明采用由9个丙氨酸组成的柔性连接肽(linker)连接SAK和SEC2。通过重叠延伸剪接技术构建嵌合基因，连接到表达载体pET28a(+)上，并转化大肠杆菌BL21(DE3)。
1、嵌合基因sak-linker-sec2的构建：
经PCR方法分别克隆得到编码SAK的基因sak(其DNA序列如SEQID NO.6所示)和编码SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.7所示的)，并在sak的3’端和sec2的5’端分别加上编码连接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQ ID NO.8所示)，然后以linker为互补末端经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因sak-linker-sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.9所示)。同时，为了实现嵌合基因sak-linker-sec2连接到表达质粒pET-28a(+)上并能成功表达，通过PCR方法在嵌合基因sak-linker-sec2的5’端加上EcoRI酶切位点及保护碱基，在嵌合基因sak-linker-sec2的3’端加上终止密码子，XhoI酶切位点及保护碱基。
2、构建重组质粒：
将带有酶切位点的嵌合基因sak-linker-sec2经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，插入到表达载体pET28(+)的EcoRI/XhoI位点，T4连接酶16℃连接过夜，得到连接反应液。
3、大肠杆菌的化学转化：
将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，经化学方法转化(42℃水浴热激)，之后，将菌液涂布于LB平板上，37℃培养过夜，以筛选阳性克隆。
4、阳性克隆的筛选：
在含有Kan抗性的LB平板培养基上，挑取阳性克隆，培养后提取质粒经EcoRI和XhoI双酶切验证，确定嵌合基因sak-linker-sec2是否被插入到表达质粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)对得到的重组质粒进行测序确认。
试验结果：
经双酶切验证和测序分析综合表明，表达SAK-linker-SEC2的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pET28a-sak-linker-sec2的重组大肠杆菌。
(二)SAK-linker-SEC2的诱导表达及纯化
1、SAK-linker-SEC2的诱导表达
将带有重组质粒pET28a-sak-linker-sec2的重组大肠杆菌接种于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的10ml LB培养基中，培养12～16小时，次日按2％的接种量，将培养好的菌液接种到含有Kan(40μg/ml)的200ml LB培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用1mM IPTG进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明选择在菌体生长不是很活跃的30℃作为诱导温度，诱导4-5h。
2、SAK-linker-SEC2的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20℃过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。
用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔。处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。
将上清液低速上样于Ni-NTA亲和层析柱，平衡缓冲液(30mMTris-HCl，300mM NaCl pH7.6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30mM Tris-HCl，300mM NaCl，50-300mM咪唑pH7.6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组SAK-linker-SEC2。
本发明中，载体质粒pET28a(+)编码了三个用于纯化的标签，C端6×Histag，t7tag和N端6×Histag，本发明选择了N端6×Histag。利用Ni离子特异性螯合His的特点，实现含有6×Histag的SAK-linker-SEC2与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6×Histag与Ni离子的结合实现SAK-linker-SEC2的洗脱。
试验结果：经SDS-PAGE验证，成功表达并纯化出嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(三)体外溶栓活性分析
具体实施如下：
称取125mg琼脂糖(电泳级)，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，人纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，人纤维蛋白原2.2ml(6mg/ml)，倒入80mm平板内冷却，制成人纤维蛋白平板，用前于4℃放置半个小时。
打孔上样，每个孔的直径为2mm，上样量为10μl，SAK和SAK-linker-SEC2的浓度为50μg/ml，每个样品设置3个重复，于37℃恒温湿盒内放置24h后，测溶栓直径并进行活性比较。
实验结果：
SAK的溶栓直径平均为24.68mm，SAK-linker-SEC2的溶栓直径平均为24.72mm，二者的溶栓活性基本相同。
(四)体外淋巴细胞(PBMC)增殖活性分析
具体实施如下：
取正常人新鲜外周血5ml，抗凝后(肝素，终浓度0.2mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000rpm离心15min，取出中间的云雾层(PBMC)，再加入等量D-Hanks液混匀，3000rpm离心10min，弃上清，然后用3-5ml D-Hanks液重悬PBMC，3000rpm离心10min，重复一次，加入适量的含有10％血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以1×105个/孔的量加入到96孔板中，于CO2含量为5％，37℃的恒温细胞培养箱中培养12h，次日用含有10％血清的DNEM培养基将待测样品稀释至20ng/ml和200ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，以BSA阴性作为对照，PHA-P作为阳性对照，每样3个复孔；5％CO2，37℃培养72h；取出96孔板，按50μl/孔加入MTT，5％CO2，37℃培养4h；3000rpm离心10min，加入DMSO 120μl/孔，37℃溶解20min；酶标仪上570nm测定各孔的吸光值。
实验结果：
从鼠脾淋巴细胞的增值情况可以看出，无论是较低浓度的20ng还是较高浓度的200ng，SAK-linker-SEC2和肠毒素SEC2的增值率是相同的。结果见表1
表1鼠脾淋巴细胞增殖实验
(五)体外抑瘤活性分析
具体实施如下：
取正常人新鲜外周血5ml，抗凝后(肝素，终浓度0.2mg/ml)，与等量的D-Hanks液混匀，小心地加在等量的淋巴细胞分离液上面，3000rpm离心15min，取出中间的云雾层(PBMC)，加入等量D-Hanks液混匀，3000rpm离心10min，弃上清，用3-5mlD-Hanks液重悬PBMC，3000rpm离心10min，重复一次，加入适量的含有10％血清的新鲜DMEM培养基，计数。将PBMC以2×105个/孔的量加入到96孔板中；倒掉Hella细胞培养瓶中旧培养基，加入2-3ml D-Hanks液洗去残留的培养基，或用少量胰酶涮洗一次，加入1-2ml胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，将胰酶倒掉，加入少量含有10％血清的DMEM培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，计数。将Hella细胞以1×104个/孔的量加入到96孔板中，用含有10％血清的DMEM培养基将待测样品稀释至20ng/ml和200ng/ml两个浓度，加入到96孔板中，仅加Hella细胞作为肿瘤细胞对照孔，仅加与实验孔等量的PBMC和待测样品作为本底释放孔，每样3个复孔，5％CO2，37℃培养36h；取出96孔板，加入50μl/孔MTT，5％CO2，37℃培养4h；3000rpm离心10min，加入DMSO 120μl/孔，37℃溶解20min，酶标仪上570nm测定各孔的吸光值。并按照下面的公式计算抑瘤率：
实验结果：
从抑瘤效果上看，在20ng和200ng两种不同浓度下，SAK-linker-SEC2都表现出和肠毒素SEC2相同的活力。结果见表2
表2体外抑瘤实验
实施例2嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的制备
(一)带有嵌合基因sec2-linker-sak的表达质粒构建
1、嵌合基因sec2-linker-sak的构建：
经PCR方法分别克隆得到编码SAK的基因sak(其DNA序列如SEQID NO.10所示)和编码SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQ ID NO.11所示的)，并在sec2的3’端和sak的5’端分别加上编码连接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQ ID NO.8所示)，然后以linker为互补末端经重叠延伸剪接技术(SOE-PCR)扩增得到嵌合基因sec2-linker-sak(其DNA序列如SEQ ID NO.12所示)。同时，为了实现嵌合基因sec2-linker-sak连接到表达质粒pET-28a(+)上，并能成功表达，通过PCR方法在嵌合基因sec2-linker-sak的5’端加上EcoRI酶切位点及保护碱基，在嵌合基因sec2-linker-sak的3’端加上终止密码子，XhoI酶切位点及保护碱基。
2、构建重组质粒：
将带有酶切位点的嵌合基因sec2-linker-sak经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，插入到表达载体pET28(+)的EcoRI/XhoI位点，T4连接酶16℃连接过夜，得到连接反应液。
3、大肠杆菌的化学转化：
将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌BL21感受态细胞中，经化学方法转化(42℃水浴热激)，之后，将菌液涂布于LB平板上，37℃培养过夜，以筛选阳性克隆。
4、阳性克隆的筛选：
在含有Kan抗性的LB平板培养基上，挑取阳性克隆，培养后提取质粒经EcoRI和XhoI双酶切验证，确定嵌合基因sec2-linker-sak是否被插入到表达质粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)对得到的重组质粒进行测序确认。
试验结果：
经双酶切验证和测序分析综合表明，表达SEC2-linker-SAK的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pET28a-sec2-linker-sak的重组大肠杆菌。
(二)SEC2-linker-SAK的诱导表达及纯化
1、SEC2-linker-SAK的诱导表达
将带有重组质粒pET28a-sec2-linker-sak的重组大肠杆菌接种于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的10ml LB培养基中，培养12～16小时，次日按2％的接种量，将培养好的菌液接种到含有Kan(40μg/ml)的200ml LB培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用1mM IPTG进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明选择在菌体生长不是很活跃的30℃作为诱导温度，诱导4-5h。
2、SEC2-linker-SAK的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20℃过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。
用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300W；处理时间：6×9sec，9sec间隔。处理后，6000rpm离心10min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。
将上清液低速上样于Ni-NTA亲和层析柱，平衡缓冲液(30mMTris-HCl，300mM NaCl pH7.6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30mM Tris-HCl，300mM NaCl，50-300mM咪唑pH7.6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，SDS-PAGE分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组SEC2-linker-SAK。
本发明中，载体质粒pET28a(+)编码了三个用于纯化的标签，C端6×Histag，t7tag和N端6×Histag，本发明选择了N端6×Histag。利用Ni离子特异性螯合His的特点，实现含有6×Histag的SEC2-linker-SAK与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6×Histag与Ni离子的结合实现SEC2-linker-SAK的洗脱。。
试验结果：经SDS-PAGE验证，成功表达并纯化出嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示
(三)体外溶栓活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
SAK的溶栓直径平均为24.68mm，SEC2-linker-SAK的溶栓直径平均为18.40mm，嵌合蛋白溶栓活性明显降低。
(四)体外淋巴细胞(PBMC)增殖活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
从鼠脾淋巴细胞的增值情况可以看出，无论是较低浓度的20ng还是较高浓度的200ng，SEC2-linker-SAK和肠毒素SEC2的增值率是相同的。结果见表3
表3鼠脾淋巴细胞增殖实验
(五)体外抑瘤活性分析
具体实施：同实施例1
实验结果：
从抑瘤效果上看，在20ng和200ng两种不同浓度下，SEC2-linker-SAK都表现出和肠毒素SEC2相同的活力。结果见表4
表4体外抑瘤实验
序列表
<110>辽宁大学
<120>抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用
<160>12
<210>1
<211>136
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
SSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGKGNELLSPHYVEF
PIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKN
KKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
AAAAAAAAA
<210>3
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAH
DLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCY
FSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRN
TISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIEN
NGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTK
NG
<210>4
<211>384
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
SSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGKGNELLSPHYVEF
PIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKN
KKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKKAAAAAAAA
AESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLA
HDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNC
YFSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKR
NTISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIE
NNGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTT
KNG
<210>5
<211>384
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAH
DLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCY
FSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRN
TISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIEN
NGNTFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTK
NGAAAAAAAAASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDGK
GNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPS
AKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIE
KK
<210>6
<211>408
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaa 408
<210>7
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa 720
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gctgctgctg ctgctgctgc tgctgct 27
<210>9
<211>1155
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaagc tgctgctgct 420
gctgctgctg ctgctgagag tcaaccagac cctacgccag atgagttgca caaatcaagt 480
gagtttactg gtacgatggg taatatgaaa tatttatatg atgatcatta tgtatcagca 540
actaaagtta tgtctgtaga taaatttttg gcacatgatt taatttataa cattagtgat 600
aaaaaactaa aaaattatga caaagtgaaa acagagttat taaatgaaga tttagcaaag 660
aagtacaaag atgaagtagt tgatgtgtat ggatcaaatt actatgtaaa ctgctatttt 720
tcatccaaag ataatgtagg taaagttaca ggtggtaaaa cttgtatgta tggaggaata 780
acaaaacatg aaggaaacca ctttgataat gggaacttac aaaatgtact tataagagtt 840
tatgaaaata aaagaaacac aatttctttt gaagtgcaaa ctgataagaa aagtgtaaca 900
gctcaagaac tagacataaa agctaggaat tttttaatta ataaaaaaaa tttgtatgag 960
tttaacagtt caccatatga aacaggatat ataaaattta ttgaaaataa cggcaatact 1020
ttttggtatg atatgatgcc tgcaccaggc gataagtttg accaatctaa atatttaatg 1080
atgtacaacg acaataaaac ggttgattct aaaagtgtga agatagaagt ccaccttaca 1140
acaaagaatg gataa 1155
<210>10
<211>411
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60
acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta 120
tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt 180
gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa 240
ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa 300
acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt 360
aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaata a 411
<210>11
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatgga 717
<210>12
<211>1155
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg 60
atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct 120
gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat 180
tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa 240
gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat 300
gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga 360
aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga 420
aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 480
ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca 540
tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg 600
atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat 660
aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggagct 720
gctgctgctg ctgctgctgc tgcttcaagt tcattcgaca aaggaaaata taaaaaaggc 780
gatgacgcga gttattttga accaacaggc ccgtatttga tggtaaatgt gactggagtt 840
gatggtaaag gaaatgaatt gctatcccct cattatgtcg agtttcctat taaacctggg 900
actacactta caaaagaaaa aattgaatac tatgtcgaat gggcattaga tgcgacagca 960
tataaagagt ttagagtagt tgaattagat ccaagcgcaa agatcgaagt cacttattat 1020
gataagaata agaaaaaaga agaaacgaag tctttcccta taacagaaaa aggttttgtt 1080
gtcccagatt tatcagagca tattaaaaac cctggattca acttaattac aaaggttgtt 1140
atagaaaaga aataa 1155
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种血培养仪检测系统 | 2020-05-13 | 909 |
| 营养血液培养基 | 2020-05-11 | 981 |
| 肝细胞无血清培养基 | 2020-05-12 | 308 |
| 一种血液培养方法 | 2020-05-12 | 615 |
| 副猪嗜血杆菌培养基 | 2020-05-12 | 596 |
| 血液微生物培养瓶 | 2020-05-13 | 794 |
| 一种造血干细胞培养基 | 2020-05-12 | 209 |
| 全自动血培养仪 | 2020-05-11 | 556 |
| 血液培养瓶 | 2020-05-11 | 8 |
| 血液培养瓶 | 2020-05-11 | 314 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈