一种含脂肪层的组织工程皮肤及其制备方法
专利汇可以提供一种含脂肪层的组织工程皮肤及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种含脂肪层的组织工程 皮肤 及其制备方法，本 发明 的特点是由皮下脂肪细胞、皮肤 成 纤维 细胞 、表皮细胞和 生物 支架 材料制成，是将脂肪细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有活性的含脂肪层的组织工程皮肤。所制备的含脂肪层的组织工程皮肤，不仅有一定的弹性、韧性，而且培养时间短、无明显免疫排斥反应，与天然皮肤及皮下脂肪组织的结构类似，在临床 治疗 中可发挥抗感染、 止血 和抑制瘢痕形成等多方面的作用。，下面是一种含脂肪层的组织工程皮肤及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种含脂肪层的组织工程皮肤，其特征在于：是由皮下脂肪细胞、 皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将脂肪细胞、皮肤成 纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成。
2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于：所述的生物支 架材料是机体可接受的生物可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、 透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种 的组合；其中的细胞外基质复合物包含I、III型胶原、层粘连蛋白、纤维 粘连蛋白的成分。
3.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于：所述的皮下脂 肪细胞是由自体或是同种异体来源的脂肪细胞、或脂肪前体细胞、或可向脂 肪细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞中的一种或是几种。
4.根据权利要求1所述的含脂肪层组织工程皮肤的制备方法，包括有 培养基的配制、生物支架材料的制备、以及组织工程皮肤的三维培养，其特 征在于，具体步骤如下：
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将F12商用培养液与胎牛血清 混合为基础液；再按5 00ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～ 500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng， 腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C 5～30mg，制备成基础培 养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b 基础培养基+氯化钙0.1～1mM
培养基c 基础培养基+氯化钙0.2～2mM
培养基d 基础培养基+氯化钙0.3～3mM
步骤2.制备生物支架材料：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶ 壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸 将其配制成浓度为6mg/ml～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体 积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的F12培养液，调pH 至7.2～7.4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养器皿中固 化，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的脂肪细胞按1×105～5×105个/ml的浓度混合于 凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成脂肪细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按105～106个/ml的浓度混合于凝胶 溶液中，将其滴加到已固化的脂肪细胞层上，固化后形成真皮细胞层，加 入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞， 加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出放在 培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b， 淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培 养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培 养期间每天换液；完成含脂肪层的组织工程皮肤的制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述步骤3和步 骤4合并，即将体外培养的脂肪细胞和成纤维细胞一起混入凝胶溶液中， 再将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后加入基础培养基培养2～4天， 每天换液。
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种含有脂肪层 的组织工程皮肤及其制备方法。
背景技术
研究表明，脂肪组织由于脂肪细胞分泌的细胞因子可促进创缘表皮细胞 生长爬行、真表皮连接形成，改善移植物的机械性能，对填补软组织缺损具 有美容效果，使其柔软度更接近正常皮肤。目前已经发现人的脂肪细胞能分 泌的细胞因子和生长因子有几十种之多。在生长因子方面，脂肪细胞分泌有 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 转换生长因子β(transfer growth factor，TGF-β)、胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor，IGF)等。这些生长因子均是参与创面愈 合中介导炎症反应和肉芽组织形成有关的重要生长因子，它们调节着创面修 复的各个阶段。不仅促进细胞的增殖与分化，而且刺激炎性细胞的趋化迁移 以及合成并分泌创面愈合所需的各种物质，包括抑制细胞生长的物质。在细 胞因子方面，脂肪细胞分泌的白细胞介素(interleukin，IL)和肿瘤坏死 因子(tumor necrosis factor，TNF)都参与创面的炎症反应过程。此外， 脂肪细胞分泌的血管紧张素、纤溶酶原激活物的抑制剂、性激素类(特别是 雌性激素)，与脂质蛋白代谢相关的脂蛋白脂酶、游离脂肪酸、抵抗素以及 视黄醛结合蛋白质等，均在不同层面水平以不同方式与组织修复发生关联。 脂素(Leptin)是脂肪细胞分泌的一种重要细胞因子，介导不同细胞内的信 号转导，在一些细胞可通过刺激JNK(c-Jun氨基末端激酶)促发STAT(信号 传导及转录激活因子)活性，将细胞外的刺激信号转入细胞核内，通过细胞 外信号调节激酶磷酸化，可使伤口边缘角质形成细胞的增殖能力明显增强。
通过以上说明，脂肪细胞在皮肤组织中有着极其重要的作用。目前的组 织工程全层皮肤是采用各种材料利用组织工程原理方法所制备的含表皮层 和真皮层的组织工程皮肤，但其不含有皮下脂肪层，不能再现天然皮肤的微 环境，表皮层和真皮层缺乏相应的细胞信号调控，难以发育成与天然皮肤一 致的结构层次；这样会在深度皮肤缺损应用中存在缺陷，不能控制瘢痕的形 成。因此研发含脂肪层的组织工程皮肤已成为皮肤组织工程学中的发展趋 势。经检索，未见有含脂肪层的组织工程皮肤产品及其应用的报道。
发明内容
本发明提出的含脂肪层的组织工程皮肤的特征在于，是由皮下脂肪细 胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将脂肪细胞、皮肤 成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有 活性的含脂肪层的组织工程皮肤。所述的生物支架材料是机体可接受的生物 可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨 素、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的组合；其中的细胞外基质复合 物包含I、III型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的成分。所述的皮下脂肪 细胞是由自体或是同种异体来源的脂肪细胞、或脂肪前体细胞、或可向脂肪 细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞，如骨髓间充质干细胞、 脂肪源性间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细 胞、神经干细胞中的一种或是几种。所述的皮肤成纤维细胞为自体或是同种 异体来源的皮肤成纤维细胞，或是可向皮肤成纤维细胞分化的干细胞，包括 胚胎干细胞和成体干细胞。所述的表皮细胞为自体或是同种异体来源的皮肤 表皮细胞，或是可向表皮细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。
本发明含脂肪层的组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基的配制、 生物支架材料的制备、以及组织工程皮肤的三维培养，具体步骤如下，
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将F12商用培养液与胎牛血清 混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～ 500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng， 腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养 基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙0.1～1mM
培养基c：基础培养基+氯化钙0.2～2mM
培养基d：基础培养基+氯化钙0.3～3mM
步骤2.制备生物支架材料：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶ 壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸 将其配制成浓度为6mg/ml～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体 积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的F12培养液，调pH 至7.2～7.4，制成凝胶溶液，即支架材料；再将尼龙膜浸透凝胶溶液，置 于培养器皿中固化，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的脂肪细胞按1×105～5×105个/ml的浓度混合于 凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成脂肪细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按105～106个/ml的浓度混合于凝胶 溶液中，将其滴加到已固化的脂肪细胞层上，待其固化后，形成真皮细胞层， 加入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞， 加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.皮肤的成熟和角化：取培养支架置于另一培养器皿中，把制备 的皮肤雏形取出放在培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2 天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液 面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面 平齐，培养2～4天，培养期间每天换液；完成含脂肪层的组织工程皮肤的 制备。所形成皮肤的表皮层分化层次清晰、基底膜连续完整，其成纤维细 胞层和脂肪细胞层结合紧密。
本发明技术方案中所述步骤3和步骤4可以合并，即将脂肪细胞和成 纤维细胞一起混入凝胶溶液中，再将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化 后加入基础培养基培养2～4天，每天换液。所形成皮肤的表皮层分化层次 清晰、基底膜连续完整，成纤维细胞和脂肪细胞无序的排列在一起，可以 根据临床需要制备不同厚度的皮肤。
本发明所制备的含脂肪层的组织工程皮肤，不仅具有一定的弹性和韧 性，厚度可以控制，而且具有收缩率小、无明显免疫排斥反应，与天然皮 肤结构相一致的特点。在临床治疗中主要功能有：(1)可作为修复深度皮 肤缺损的移植物；(2)主要用于凹陷畸形的修复，如颞部、颊部凹陷；(3) 作为烧伤患者的创面覆盖和自体皮替代物；(4)修复营养不良和感染创面。 在不稳定瘢痕及难治性溃疡病灶清除后，使用本发明所制备的含脂肪层的 组织工程皮肤移植可促进愈合、防止瘢痕和溃疡的复发。
本发明所制备的含脂肪层的组织工程皮肤中的脂肪细胞或可向脂肪细 胞分化的干细胞，在生物支架材料中呈三维方向生长，所形成的脂肪结构 与天然皮肤的相似；在培养过程中，脂肪细胞分泌生长因子促进表皮细胞 的增殖和分化，同时抑制成纤维细胞过分增殖，调节其合成、分泌胶原蛋 白，防止含脂肪层的组织工程皮肤收缩，最终形成与天然皮肤类似的结构。
按本发明制备方法所获得的含脂肪层的组织工程皮肤，与目前已有的 皮肤替代产品相比，具有以下优点：本发明的组织工程皮肤可增强创面愈 合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，可提 高人工皮肤移植成功率，并改善愈合质量；与天然皮肤结构类似，都具有 表皮层和真皮层以及皮下脂肪层，可大量生产、长期贮存。所制备的含脂 肪层的组织工程皮肤可以直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因 造成的皮肤缺损的修复，具有一定的弹性、韧性，其形状大小和厚度能根 据具体需求制备。
附图及其说明
附图1为本发明按实例1所制备的含脂肪层组织工程皮肤的照片，附 图2为本发明按实例2所制备的含脂肪层组织工程皮肤的照片，附图3为 本发明按实例3所制备的含脂肪层组织工程皮肤的照片。
具体实施方式
实施例1、
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将F12商用培养液与胎牛血清 混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2ng，氢化可的松10μg， 表皮细胞生长因子2μg，碱性成纤维细胞生长因子2ng，腺嘌呤12mg，转 铁蛋白5mg，维生素C5mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下 培养基，其中添加物的浓度为终浓度。
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙0.1mM
培养基c：基础培养基+氯化钙0.2mM
培养基d：基础培养基+氯化钙0.3mM
步骤2.制备生物支架材料：在4℃条件下，按质量比将胶原7∶壳聚 糖0.5∶透明质酸3∶硫酸软骨素0.5混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓 度为15mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血 清和10％的浓度为110mg/ml的F12培养液，用NaOH调pH值为7.2～7.4， 形成凝胶溶液；将准备好的尼龙膜(使用前裁剪成与所需皮肤的大小相适 应，并消毒)浸透凝胶溶液，置于培养皿中37℃环境固化45分钟，形成支 撑膜；
步骤3.将体外培养的脂肪细胞按5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液 中，再将其滴加至已固化的支撑膜表面，在37℃、5％CO2条件下固化45分 钟形成脂肪细胞层。所述脂肪细胞的获取和扩大培养，可以参照文献： Rodbell M.Metabolism of isolated fat cells.I.Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis.J Biol Chem 1964；239：503-508.
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶 液中，将其滴加到已固化的脂肪细胞层上，待其固化后，形成真皮细胞层， 加入基础培养基培养3天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按3×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入 培养基a，培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.皮肤的成熟和角化：将不锈钢培养支架(表面有通透网格、下 面有支腿的平板支架，高0.5～3mm，可由不锈钢、塑料、玻璃、高分子材 料或生物材料制作，并已消毒)另置一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取 出置于培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培 养基b，淹没皮肤表面，培养1天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐， 培养1天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2天，培养期 间每天换液；形成含脂肪层的组织工程皮肤(见图1)。该皮肤脂肪层和表 皮层都比较薄，皮肤厚度较小；使用前揭掉脂肪层下方的尼龙膜。
实施例2：
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将F12商用培养液与胎牛血清 混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素50ng，氢化可的松500 μg，表皮细胞生长因子10μg，碱性成纤维细胞生长因子40ng，腺嘌呤17mg， 转铁蛋白10mg，维生素C30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制 以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙1mM
培养基c：基础培养基+氯化钙2mM
培养基d：基础培养基+氯化钙3mM
步骤2.生物支架材料制备：在4℃条件下，按质量比将胶原10∶壳聚 糖1∶透明质酸2∶硫酸软骨素1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为 8mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和 10％的浓度为110mg/ml的F12培养液，调pH值为7.2～7.4，形成凝胶溶液； 再将准备好的尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养器皿中37℃环境固化50分钟， 形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的已向脂肪细胞方向分化的脂肪间充质干细胞按5 ×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再将其滴加至已固化的支撑膜表面， 在37℃、5％CO2条件下固化50分钟，形成脂肪细胞层；
步骤4.将体外培养的成纤维细胞按106个/ml的浓度混合于凝胶溶液 中，将其滴加到已固化的脂肪层上，待其固化后，形成真皮细胞层，加入基 础培养基培养4天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入 培养基a，培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.皮肤的成熟和角化：将不锈钢培养支架另置一培养器皿中，把 制备的皮肤雏形取出置于培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培 养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基c，液 面与皮肤表面平齐，培养1天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐， 培养3天，培养期间每天换液；形成含脂肪层的组织工程皮肤(见图2)。 该皮肤表皮层和脂肪层都比较厚，皮肤厚度较大，弹性较好；使用前揭掉 脂肪层下方的尼龙膜。
实施例3：
步骤1.配制培养基：按9∶1的体积比将F12商用培养液与胎牛血清 混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素40ng，氢化可的松100 μg，表皮细胞生长因子10μg，碱性成纤维细胞生长因子15ng，腺嘌呤15mg， 转铁蛋白6mg，维生素C30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以 下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙0.5mM
培养基c：基础培养基+氯化钙1mM
培养基d：基础培养基+氯化钙2mM
步骤2.在4℃条件下，按质量比将胶原9∶壳聚糖1∶透明质酸2.5∶ 硫酸软骨素1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml溶液，冰浴 下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为 110mg/ml的F12培养液，调pH为7.2～7.4，形成凝胶溶液；再将准备好 的尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养皿中37℃环境固化30分钟，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的脂肪细胞和皮肤成纤维细胞按1∶1～2的比例混 合，再按106个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜 表面，在37℃、5％CO2条件下固化50分钟，形成脂肪细胞和成纤维细胞的 混合层；加入基础培养基培养4天，每天换液。
步骤4.在上述混合层的表面，按5×105个/cm2的密度接种表皮细胞， 加入培养基a，培养1天，形成皮肤雏形；
步骤5.皮肤的成熟和角化：将不锈钢培养支架另置一培养器皿中，把 制备的皮肤雏形取出置于培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培 养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1天后更换为培养基c，液 面与皮肤表面平齐，培养2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐， 培养3天，培养期间每天换液；形成含脂肪层的组织工程皮肤(见图3)。 该皮肤的表皮层较厚，真皮成纤维细胞和脂肪细胞无序的排列在一起，厚 度适中，韧性较好；使用前揭掉皮肤下方的尼龙膜。
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