一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感
器的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本
发明属于新型功能材料与
生物传感检测技术领域，提供了
一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球作为检测
抗体标记物，制备了一种检测
肿瘤标志物
抗原的电化学免疫传感器。
背景技术
[0002] 肝癌是一种对人体危害很大的
疾病，也是所有癌症中死亡率，死亡速度最快的
恶性肿瘤之一。肝癌癌肿瘤标志物AFP、CEA的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的
鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的
治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和
预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
[0003] 目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、
食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
[0004] 本发明成功构建了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。聚多巴胺功能化的酚醛树脂硬碳微球是三维的微孔球状结构，多孔结构能够促进电活性物质的在材料表面的
吸附，缩短离子在孔径间的传输距离，减小材料的电荷转移
电阻，提高了
导电性能。功能化后的碳球能与贵金属
纳米粒子形成稳定的化学键，能有效吸附贵金属纳米粒子，同时还能减小纳米粒子的团聚效应。金
银核壳纳米粒子相对于单金属纳米粒子，拥有更多的催化点位，对过
氧化氢的还原反应表现出协同催化作用，大大提高了材料的电催化性能。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。
[0006] 本发明的目的之一是提供一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法。
[0007] 本发明的目的之二是将所制备的基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。
[0008] 本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0009] 1. 一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
[0010] （1）将直径为4 mm的玻碳
电极用Al2O3
抛光粉打磨，超纯
水清洗干净；
[0011] （2）将上述玻碳电极置于0.1 %的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2 V下，运行30 35 s；
~
[0012] （3）继续将6 µL、8 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲~洗，4 °C
冰箱中干燥；
[0013] （4）继续将3 µL、0.8 1.5mg/mL的
牛血清
白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯~水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
[0014] （5）滴加6 µL、20 fg/mL 100 ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水~冲洗电极表面，4 °C冰箱中干燥；
[0015] （6）将6 µL、1 3 mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体~孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。
[0016] 2.所述的Au@AgNPs，制备步骤如下：
[0017] 将64 mL、1 3 mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115 °C回流加热10 ~ 15 min, 加入12.5 13.5 mL、38.8 mmol/L的
柠檬酸钠，至溶液
颜色有黄色变为酒红~ ~
色，制得AuNPs溶液；
[0018] 取5 7 mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的400 600 μL、7.1 mmol/L~ ~的
硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10 mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。
[0019] 3.所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，制备步骤如下：
[0020] （1）酚醛树脂微孔碳球的制备
[0021] 取20 mL超纯水水，8 mL无水
乙醇，0.1 mL、
质量分数为25 %的
氨水加入烧杯中，搅拌10 20 min；依次加入0.2 0.4 g
苯酚和0.25 0.35 mL、质量分数为37%的甲醛溶~ ~ ~液，在30 °C恒温水浴下搅拌反应24 h；将转移到聚四氟乙烯
高压釜中100 °C下老化24 h，离心洗涤，所得固体在40 °C
真空干燥箱中干燥16 24 h；将干燥好的固体与KOH按质量比~
4：1混合，
研磨1h，进行活化处理，后放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化完成后，从电阻炉内取出，用10 %的
盐酸浸泡1 h，离心洗涤，干燥，备用；
[0022] 所述碳化具体步骤如下：以1 °C/min的速度升温至350 °C，恒温保持1 h；然后以2 °C/min升温至700 °C，恒温保持2 h；后冷却至室温；
[0023] （2）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的制备
[0024] 将30 50 mg的酚醛树脂微孔碳球超声分散在15 mL、10 mmol/L的pH=8.5的三羟~甲基氨基甲烷缓冲液中，加入10 15 mg的盐酸多巴胺，在室温条件下震荡24 h；加入5 ~ ~
7 mL的上述制备的Au@AgNPs继续震荡1 h；用超纯水离心洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥16 20 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球固体粉末；
~
[0025] （3）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液的制备[0026] 将2 6 mg的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球超声分散于1 mL的pH=~7.0的
磷酸盐缓冲溶液中，再加入100 μL、80 120 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和~
900 μL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4 °C恒温振荡
培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，4 °C下保存备用。
[0027] 4.肿瘤标志物的检测，步骤如下：
[0028] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为
工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH=5.6 8.0磷酸盐缓~冲溶液中进行测试；
[0029] （2）用时间-
电流法对分析物进行检测，输入
电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
[0030] （3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
[0031] （4）利用工作曲线法，得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。
[0032] 上述所述肿瘤标志物选自AFP或CEA。
[0033] 本发明所用原材料均可在化学
试剂公司或生物制药公司购买。
[0034] 本发明的有益成果
[0035] （1）采用负载Au@AgNPs的聚多巴胺功能化的酚醛树脂微孔碳球作为抗体标记物。聚多巴胺功能化的酚醛树脂硬碳微球是三维的微孔球状结构，多孔结构能够促进电活性物质的在材料表面的吸附，缩短离子在孔径间的传输距离，减小材料的电荷转移电阻，提高了导电性能。碳球具有大的
比表面积，功能化后的碳球能与贵金属纳米粒子形成稳定的化学键，能有效吸附贵金属纳米粒子，同时还能减小纳米粒子的团聚效应。金银核壳纳米粒子相对于单金属纳米粒子，拥有更多的催化点位，对过氧化氢的还原反应表现出协同催化作用，大大提高了材料的电催化性能。
[0036] （2）一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器对肿瘤标志物的检测，对AFP其线性范围20 fg/mL 100 ng/mL，
检测限为6.7 fg/mL；对CEA其线性范围~30 fg/mL 100 ng/mL，检测限为10 fg/mL；表明一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂~
微孔碳球的免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
[0037] 现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
[0038]
实施例1一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
[0039] （1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
[0040] （2）将上述玻碳电极置于0.1 %的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2 V下，运行30 s；
[0041] （3）继续将6 µL、8 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；
[0042] （4）继续将3 µL、0.8 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
[0043] （5）滴加6 µL、20 fg/mL 100 ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水~冲洗电极表面，4 °C冰箱中干燥；
[0044] （6）将6 µL、1 mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。
[0045] 实施例2一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
[0046] （1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
[0047] （2）将上述玻碳电极置于0.1 %的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2 V下，运行32 s；
[0048] （3）继续将6 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；
[0049] （4）继续将3 µL、1.2 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
[0050] （5）滴加6 µL、20 fg/mL 100 ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水~冲洗电极表面，4 °C冰箱中干燥；
[0051] （6）将6 µL、2 mg/mL的负载Au@Ag NPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。
[0052] 实施例3一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
[0053] （1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
[0054] （2）将上述玻碳电极置于0.1 %的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2 V下，运行35 s；
[0055] （3）继续将6 µL、12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；
[0056] （4）继续将3 µL、1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
[0057] （5）滴加6 µL、20 fg/mL 100 ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水~冲洗电极表面，4 °C冰箱中干燥；
[0058] （6）将6 µL、3 mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。
[0059] 实施例4所述的Au@AgNPs，制备步骤如下：
[0060] 将64 mL、1 mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115 °C回流加热10 min, 加入12.5 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠，至溶液颜色有黄色变为酒红色，制得AuNPs溶液；
[0061] 取5 mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的400 μL、7.1 mmol/L的硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10 mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。
[0062] 实施例5所述的Au@AgNPs，制备步骤如下：
[0063] 将64 mL、2 mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115 °C回流加热12 min, 加入13.0 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠，至溶液颜色有黄色变为酒红色，制得AuNPs溶液；
[0064] 取6 mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的500 μL、7.1 mmol/L的硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10 mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。
[0065] 实施例6所述的Au@Ag NPs，制备步骤如下：
[0066] 将64 mL、3 mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115 °C回流加热15 min, 加入13.5 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠，至溶液颜色有黄色变为酒红色，制得AuNPs溶液；
[0067] 取7 mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的600 μL、7.1 mmol/L的硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10 mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。
[0068] 实施例7 所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，制备步骤如下：
[0069] （1）酚醛树脂微孔碳球的制备
[0070] 取20 mL超纯水水，8 mL无水乙醇，0.1 mL、质量分数为25 %的氨水加入烧杯中，搅拌10 min；依次加入0.2 g苯酚和0.25 mL、质量分数为37%的甲醛溶液，在30 °C恒温水浴下搅拌反应24 h；将转移到聚四氟乙烯高压釜中100 °C下老化24 h，离心洗涤，所得固体在40 °C真空干燥箱中干燥16 h；将干燥好的固体与KOH按质量比4：1混合，研磨1h，进行活化处理，后放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化完成后，从电阻炉内取出，用10 %的盐酸浸泡1 h，离心洗涤，干燥，备用；
[0071] 所述碳化具体步骤如下：以1 °C/min的速度升温至350 °C，恒温保持1 h；然后以2 °C/min升温至700 °C，恒温保持2 h；后冷却至室温；
[0072] （2）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的制备
[0073] 将30 mg的酚醛树脂微孔碳球超声分散在15 mL、10 mmol/L的pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加入10 mg的盐酸多巴胺，在室温条件下震荡24 h；加入5 mL的上述制备的Au@AgNPs继续震荡1 h；用超纯水离心洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥16 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球固体粉末；
[0074] （3）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液的制备[0075] 将2 mg的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球超声分散于1 mL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入100 μL、80 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4 °C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，4 °C下保存备用。
[0076] 实施例8 所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，制备步骤如下：
[0077] （1）酚醛树脂微孔碳球的制备
[0078] 取20 mL超纯水水，8 mL无水乙醇，0.1 mL、质量分数为25 %的氨水加入烧杯中，搅拌15 min；依次加入0.3 g苯酚和0.30 mL、质量分数为37%的甲醛溶液，在30 °C恒温水浴下搅拌反应24 h；将转移到聚四氟乙烯高压釜中100 °C下老化24 h，离心洗涤，所得固体在40 °C真空干燥箱中干燥20 h；将干燥好的固体与KOH按质量比4：1混合，研磨1h，进行活化处理，后放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化完成后，从电阻炉内取出，用10 %的盐酸浸泡1 h，离心洗涤，干燥，备用；
[0079] 所述碳化具体步骤如下：以1 °C/min的速度升温至350 °C，恒温保持1 h；然后以2 °C/min升温至700 °C，恒温保持2 h；后冷却至室温；
[0080] （2）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的制备
[0081] 将40 mg的酚醛树脂微孔碳球超声分散在15 mL、10 mmol/L的pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加入12.5 mg的盐酸多巴胺，在室温条件下震荡24 h；加入6 mL的上述制备的Au@AgNPs继续震荡1 h；用超纯水离心洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥18 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球固体粉末；
[0082] （3）负载Au@Ag NPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液的制备[0083] 将4 mg的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球超声分散于1 mL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入100 μL、100 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4 °C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，4 °C下保存备用。
[0084] 实施例9 所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，制备步骤如下：
[0085] （1）酚醛树脂微孔碳球的制备
[0086] 取20 mL超纯水水，8 mL无水乙醇，0.1 mL、质量分数为25 %的氨水加入烧杯中，搅拌20 min；依次加入0.4 g苯酚和0.35 mL、质量分数为37%的甲醛溶液，在30 °C恒温水浴下搅拌反应24 h；将转移到聚四氟乙烯高压釜中100 °C下老化24 h，离心洗涤，所得固体在40 °C真空干燥箱中干燥24 h；将干燥好的固体与KOH按质量比4：1混合，研磨1h，进行活化处理，后放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化完成后，从电阻炉内取出，用10 %的盐酸浸泡1 h，离心洗涤，干燥，备用；
[0087] 所述碳化具体步骤如下：以1 °C/min的速度升温至350 °C，恒温保持1 h；然后以2 °C/min升温至700 °C，恒温保持2 h；后冷却至室温；
[0088] （2）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的制备
[0089] 将50 mg的酚醛树脂微孔碳球超声分散在15 mL、10 mmol/L的pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加入15 mg的盐酸多巴胺，在室温条件下震荡24 h；加入7 mL的上述制备的Au@AgNPs继续震荡1 h；用超纯水离心洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥20 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球固体粉末；
[0090] （3）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液的制备[0091] 将6 mg的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球超声分散于1 mL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入100 μL、120 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4 °C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，4 °C下保存备用。
[0092] 实施例10 肿瘤标志物AFP的检测，步骤如下：
[0093] （1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH=5.6 8.0磷酸盐缓~冲溶液中进行测试；
[0094] （2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
[0095] （3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
[0096] （4）利用工作曲线法，测定样品中AFP的线性范围为20 fg/mL 100 ng/mL，检测~限为6.7 fg/mL。
[0097] 实施例11肿瘤标志物CEA的检测
[0098] 按照实施例10的方法对样品中CEA进行检测，其线性范围30 fg/mL 100 ng/mL，~检测限为10 fg/mL。
