靶向TIM-1的嵌合抗原受体
阅读：191发布：2022-01-10
专利汇可以提供靶向TIM-1的嵌合抗原受体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了嵌合 抗原 受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)特异性结合T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1(TIM-1)蛋白。本发明还涉及经修饰的免疫细胞，例如T细胞或NK细胞，所述经修饰的免疫细胞包含此类CAR、编码CAR的核酸、编码CAR的载体；以及制备此类组合物的方法。本发明还涉及 治疗 性使用这些CAR和经修饰的免疫细胞来治疗与表达TIM-1的细胞相关的疾患、病症或 疾病 (例如，癌症)的方法。，下面是靶向TIM-1的嵌合抗原受体专利的具体信息内容。
1.一种分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域包含结合TIM-1的抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的分离的CAR，其中所述抗体或其抗原结合片段选自以下的组：
单克隆抗体；单特异性抗体；聚特异性抗体；人源化抗体；人抗体；四聚抗体；四价抗体；多特异性抗体；单链抗体；结构域特异性抗体；单结构域抗体；结构域缺失抗体；scFc融合蛋白；
单链抗体；嵌合抗体；合成抗体；重组抗体；杂合抗体；突变抗体；CDR移植抗体；包含Fab的抗体片段；F(ab')2片段；Fab'片段；Fv片段；单链Fv(scFv)片段；Fd片段；dAb片段；双链抗体；
纳米抗体；二价纳米抗体；鲨鱼可变IgNAR结构域；VHH抗体；骆驼抗体；以及微抗体。
4.根据权利要求1所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域包含人IgG抗体或其抗原结合片段、Fab或scFv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域结合TIM-1的细胞外粘蛋白结构域区域，任选地结合氨基酸序列LPRQNH(SEQ ID NO:97)或TIM-1的位置192-197处的氨基酸残基(SEQ ID NO:315)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域与抗体竞争结合TIM-1，所述抗体包含与Ab 1.29、Ab2.70.2或Ab 2.59.2的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:207)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:255或SEQ ID NO:257所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的VL链；并且包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的VH链。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:207)具有至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:255或SEQ ID NO:257所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少
95％、至少98％、至少99％或100％同一性的VL链；并且包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab
2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:
252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的VH链。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域包含通过柔性接头与可变重(VH)链连接的可变轻(VL)链。
9.根据权利要求8所述的分离的CAR，其中所述柔性接头是G4S接头，所述G4S接头任选地与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:251所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域与scFv
129H、129L、272H、272L、2592H或2592L的氨基酸序列(SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:
259、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262或SEQ ID NO:263所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域包含抗体VL链和抗体VH链，并且其中：
(i)所述VL链位于所述CAR的N末端(所述VL链位于所述CAR中的所述VH链的N末端)；或者
(ii)所述VH链位于所述CAR的N末端(所述VH链位于所述CAR中的所述VL链的N末端)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域通过接头、间隔区或铰链与所述跨膜结构域接合，所述接头、间隔区或铰链任选地来源于以下的组中的一种或多种：CD28、CD8α、免疫球蛋白恒定区或其变体、免疫球蛋白铰链区、IgG4铰链区、免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、免疫球蛋白CH2结构域、免疫球蛋白CH3结构域和/或它们的任何组合。
13.根据权利要求12所述的分离的CAR，其中所述接头、所述间隔区或所述铰链来源于CD28，所述CD28任选地与CD28H的氨基酸序列(SEQ ID NO:214)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:264所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域与细胞毒性剂缀合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的CAR，其中所述跨膜结构域包含来源于选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ及CD3ζ。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的CAR，其中所述跨膜结构域来源于CD28，所述CD28任选地与CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)具有至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:265所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域是淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fc受体亚基、IL-2受体亚基、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10和DAP12的细胞内信号传导结构域。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ，所述CD3ζ任选地与CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)具有至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:269所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的分离的CAR，所述分离的CAR还包含一个或多个共刺激结构域，所述一个或多个共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：MHC I类分子、TNF受体蛋白质、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll配体受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-
3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6以及与CD83特异性结合的配体。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的CAR，所述分离的CAR还包含一个或多个共刺激结构域，所述一个或多个共刺激结构域来源于选自由CD28、4-1BB(CD137)和DAP10组成的组的蛋白质，所述CD28、4-1BB(CD137)和DAP10任选地与CD28CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:217)、BBCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:216)或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:218)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的分离的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，所述CD28跨膜结构域包含CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)；所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导结构域，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域包含CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)；并且所述抗原结合结构域包含scFv，所述scFv包含以下的氨基酸序列：
(i)272H(SEQ ID NO:210)；
(ii)2592H(SEQ ID NO:212)；或
(iii)2592L(SEQ ID NO:213)。
22.根据权利要求21所述的分离的CAR，其中所述抗原结合结构域通过CD28铰链与所述跨膜结构域接合，所述CD28铰链任选地与CD28H的氨基酸序列(SEQ ID NO:214)具有至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:
264所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性。
23.根据权利要求21或22所述的分离的CAR，所述分离的CAR还包含一个或多个共刺激结构域，所述一个或多个共刺激结构域来源于CD28、4-1BB或DAP10，所述CD28、4-1BB或DAP10任选地与CD28CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:217)、BBCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:
216)或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:218)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少
95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性。
24.一种分离的CAR，所述分离的CAR包含的氨基酸序列与以下的氨基酸序列具有至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性：
(i)272H-BB(SEQ ID NO:222)；
(ii)272H-CD28(SEQ ID NO:223)；
(iii)272H-DAP10(SEQ ID NO:224)；
(iv)2592H-BB(SEQ ID NO:226)；
(v)2592H-CD28(SEQ ID NO:227)；
(vi)2592H-DAP10(SEQ ID NO:228)；或
(vii)2592L-CD28(SEQ ID NO:229)；
或与SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:
277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
25.一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码根据权利要求1-24中任一项所述的CAR。
26.一种载体，所述载体包含根据权利要求25所述的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的载体，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或体外转录载体。
28.根据权利要求25所述的分离的核酸序列或根据权利要求26或权利要求27所述的载体，所述分离的核酸序列或所述载体还包含编码以下的序列：
(i)信号肽，所述信号肽任选地与SEQ ID NO:230的氨基酸序列具有至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:280所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
(ii)T2A核糖体跳跃序列，所述T2A核糖体跳跃序列任选地与SEQ ID NO:231的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:281所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％或100％同一性；
(iii)选择性标记，任选地其中所述选择性标记是截短的CD19(tCD19)，所述截短的CD19(tCD19)任选地与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:282所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
(iv)启动子
(v)聚(A)尾；
(vi)3'UTR；
(vii)自杀机制；
(viii)共抑制受体诸如CTLA-4或PD-1(“iCAR”)的一个或多个信号传导结构域；和/或(ix)在肿瘤微环境内富含的基质金属蛋白酶存在下切割的底物肽(“掩蔽的CAR”)。
29.一种重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞包含根据权利要求1-24中任一项所述的CAR或包含根据权利要求25-28中任一项所述的编码CAR的核酸序列或载体。
30.根据权利要求29所述的重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞是原代人细胞或其他哺乳动物细胞或来源于所述原代人细胞或其他哺乳动物细胞。
31.根据权利要求29或30所述的重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞是免疫细胞，所述免疫细胞任选地选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、NK/T细胞、巨噬细胞及单核细胞。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞选自T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
33.根据权利要求30-33中任一项所述的重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞是T细胞或T细胞祖细胞。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞经进一步修饰或选择以掺入以下特征中的一种或多种：
(i)表达另一种CAR，任选地激活或抑制CAR；
(ii)包含自杀基因；
(iii)对另一种抗原任选地肿瘤抗原有特异性；
(iv)为pp65CMV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、EBV特异性T细胞、水痘病毒特异性T细胞、流感病毒特异性T细胞和/或腺病毒特异性T细胞；
(v)过表达促存活信号；
(vi)逆转抗存活信号；
(vii)过表达Bcl-xL或BCL-2；
(viii)抑制细胞死亡基因的表达或抑制所述细胞死亡基因的功能，所述细胞死亡基因包括但不限于Bak或Bax；
(ix)过表达hTERT；
(x)消除Fas表达；
(xi)表达TGFβ显性负性受体；
(xii)与野生型T细胞相比，减少或消除其内源性TCR的表达；
(xiii)逃避免疫抑制介体；和/或
(xiv)包括归巢机制。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的重组或分离的细胞，其中所述细胞：
(i)当所述CAR结合TIM-1时，表现出抗肿瘤细胞毒性；
(ii)当暴露于TIM-1表达细胞后，增加细胞因子和/或趋化因子的产生，所述细胞因子和/或趋化因子任选地为以下中的一种或多种：GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13及IFN-γ；
(iii)任选地通过乳酸脱氢酶产生所测量的，在暴露于TIM-1表达细胞后表现出细胞毒活性；
(iv)当所述CAR结合TIM-1时，被激活或刺激而增殖。
36.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学有效量的根据权利要求1-24中任一项所述的CAR或根据权利要求29-35中任一项所述的重组或分离的细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
37.如权利要求36所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种特异性结合一种或多种肿瘤相关抗原的另外的剂。
38.一种在受试者中刺激免疫细胞介导的响应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的经修饰以表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域，其中当所述CAR结合TIM-
1时，所述经修饰的免疫细胞被激活或刺激而增殖，从而刺激所述受试者中的免疫细胞介导的响应。
39.一种治疗受试者中与表达TIM-1的细胞的不期望的增殖相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的经基因修饰以表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域，其中当所述CAR结合TIM-1时，所述经修饰的免疫细胞被激活或刺激而增殖，从而治疗与表达TIM-1的细胞的不期望的增殖相关的所述疾病、病症或疾患。
40.根据权利要求38或39所述的方法，所述方法用于治疗选自以下的疾患：癌症、自体免疫、感染和炎症性病症。
41.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的经修饰以表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中如通过细胞因子和趋化因子的产生增加所测量的，所述经修饰的免疫细胞诱导免疫响应，所述细胞因子和趋化因子任选地为以下中的一种或多种：GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13及IFN-γ。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞是T细胞，所述T细胞任选地是自体T细胞或供体来源的T细胞。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗受试者中的癌症，并且其中：
(i)所述癌症是实体肿瘤，所述实体肿瘤任选地选自由以下组成的组：癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤及皮肤癌；
(ii)所述肿瘤细胞表达TIM-1；
(iii)所述癌症选自肾细胞癌、卵巢透明细胞癌及肺癌；
(iv)所述方法减少肿瘤生长和/或缩小肿瘤体积；和/或
(v)所述治疗的受试者对至少一种化学治疗剂具有抗性。
45.根据权利要求38-44中任一项所述的方法，所述方法还包括：
(i)向所述受试者施用另一种疗法，任选地其中所述疗法是化学疗法、放射疗法、基于毒素的疗法、基于放射化学的疗法或手术疗法；和/或
(ii)与另一种治疗剂组合施用，任选地其中所述治疗剂增加表达CAR分子的细胞的功效和/或所述治疗剂改善与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用。
46.根据权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞是根据权利要求29-35中任一项所述的重组或分离的细胞，或者其中所述免疫细胞表达根据权利要求
1-24中任一项所述的CAR或包含根据权利要求25-28中任一项所述的编码CAR的核酸或载体。
47.一种在受试者中扩增经修饰的免疫细胞群的方法或在受试者中产生持久存在的经修饰的免疫细胞群的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达根据权利要求1-24中任一项所述的CAR的免疫细胞、包含根据权利要求25-28中任一项所述的编码CAR的核酸或载体的免疫细胞、或为根据权利要求29-35中任一项所述的重组或分离的细胞的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞在施用后持续存在于所述受试者体内至少一个月，任选地其中所述经修饰的免疫细胞群包含施用于所述受试者的至少一种经修饰的免疫细胞、施用于所述受试者的所述经修饰的免疫细胞的子代，或它们的组合，和/或记忆T细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞群在施用后在所述受试者中持续存在至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年或至少三年。
49.一种产生表达CAR的免疫细胞的方法，所述方法包括向免疫细胞中引入根据权利要求25-28中任一项所述的编码CAR的分离的核酸序列或载体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述表达CAR的免疫细胞：
(i)如通过流式细胞术或免疫荧光测定法所测定的，基于所述CAR的表达而分离，所述表达CAR的免疫细胞任选地富集CD3和tCD19表达；和/或
(ii)通过暴露于以下而被刺激生长：磁珠；可溶性抗体，所述可溶性抗体任选包括OKT3；和/或细胞因子，所述细胞因子任选地包括IL-2。
靶向TIM-1的嵌合抗原受体
[0001] 相关申请公开
[0002] 本申请要求2017年1月13日提交的美国临时申请序列号62/445,976的权益，该美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
[0003] 序列公开
技术领域
[0005] 本文公开的发明涉及与抗原T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域1(TIM-1)蛋白结合的嵌合抗原受体(CAR)和此类CAR的用途。具体地，提供了嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含结合TIM-1的抗原结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导结构域。包括编码抗TIM-1 CAR构建体的核苷酸序列以及包含抗TIM-1 CAR构建体的氨基酸序列。还提供了包含编码此类构建体的核酸的载体、表达此类构建体的细胞、药物组合物，以及制备和使用此类组合物的方法。
背景技术
[0006] 卵巢癌表示最致命的妇科恶性肿瘤，在美国每年有超过22,000名妇女被诊断为患有卵巢癌并且有超过14,000名妇女死亡(Siegel等人，CA Cancer J Clin 2016；66(1):7-30)。五年存活率在过去的40年里已经略有提高，但对于患有转移性卵巢癌的患者来说仍然保持在30％以下(最多)，转移性卵巢癌是大多数病例被确诊的阶段(Siegel等人，CA Cancer J Clin 2016；66(1):7-30)。某些卵巢癌亚型具有甚至更严重的预后。卵巢透明细胞癌(OCCC)取决于位置占上皮性卵巢癌病例的5-25％，其中日本的患病率高于世界其他地区(Okamoto等人，Int J Gynecol Cancer 2014年11月；24(9):S20-5)。OCCC在晚期阶段预后不佳，对挽救治疗的响应率非常低并且无进展存活期小于6个月(Crotzer等人，Gynecol Oncol.2007；105:404-408；Mabuchi等人，J Gynecol Oncol.2016；27:e31；Takano等人，Int J Gynecol Cancer.2008；18:937-942)。因此，为了提高存活率并将该癌症的治疗意图转向治愈性意图，需要对传统卵巢癌治疗实践采用正交方法。
[0007] 肾细胞癌是另一种重大的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的3％和肾肿瘤的95％。在欧盟，2012年报告了每100,000人中约85例新病例和35例死亡。美国的比率为相当的，其中仅2015年就有约61,000例新病例。目前，完全手术切除是患有局部晚期RCC或有限转移性疾病的患者的肾细胞癌的唯一治愈性治疗。然而，这些患者具有发展成全身性进展的高风险，并且完全转移性疾病的选项甚至更受限。
[0008] 嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗代表了一种新兴类型的免疫疗法，凭借该免疫疗法，患者淋巴细胞经遗传修饰以表达允许识别特异性抗原的受体。在抗原识别后，这些修饰的T细胞通过信号传导结构域而被激活，从而将它们转化为有效的杀伤细胞。虽然这种方法已经在许多患有化疗-难治性血液恶性肿瘤的患者中显示出治愈潜力(Kalos等人，Sci Transl Med.2011；3:95ra73；Maus等人，Cancer Immunol Res.2013；1:26-31；Porter等人，N Engl J Med.2011；365:725-733)，但是在实体瘤中尚未实现类似的成功。有几个原因可以解释这种功效差异，所述原因包括：免疫抑制性肿瘤微环境的存在；肿瘤对T细胞介导的杀伤的敏感性较低；以及缺乏使在靶、脱肿瘤毒性最小化所需的肿瘤选择性靶向(Lamers等人，J Clin Oncol 2006；24:e20-22)。
[0009] 已经描述了编码T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM)蛋白的基因家族(三种在人中并且八种在小鼠中)。Kuchroo等人，Nat Rev Immunol 3:454-462(2003)；McIntire等人，Nat Immunol 2:1109-1116(2001)。TIM基因家族成员位于染色体区中，
5q33.2在人中并且11B1.1在小鼠中，并且与过敏和自体免疫性疾病有关。Shevach,Nat Rev Immunol 2:389-400(2002)；Wills-Karp等人，Nat Immunol 4:1050-1052(2003)。
5q33.2在人中并且11B1.1在小鼠中，并且与过敏和自体免疫性疾病有关。Shevach,Nat Rev Immunol 2:389-400(2002)；Wills-Karp等人，Nat Immunol 4:1050-1052(2003)。
[0010] 一种TIM家族成员TIM-1也被称为甲型肝炎病毒细胞受体(HAVcr-1)，并且最初被发现是甲型肝炎病毒(HAV)的受体(Kaplan等人，EMBO J 15(16):4282-96(1996))。该基因后来被克隆为肾损伤分子1(KIM-1)(Ichimura等人，J Biol Chem 273:4135-4142(1998)；Han等人，Kidney Int 62:237-244(2002))。
[0011] Kaplan等人从表达该受体的原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞系的cDNA文库中分离出了甲型肝炎病毒的细胞受体。参见美国专利号5,622,861。Feigelstock等人，J Virology 72(8):6621-6628(1998)描述了人同源物hHAVcr-1(aka TIM-1)。相同的分子在PCT公开号WO 97/44460和WO 98/53071以及美国专利号6,664,385中被描述为肾损伤相关分子(KIM)，发现所述肾损伤相关分子(KIM)在肾损伤后在肾组织中上调。
[0012] TIM-1是1型膜蛋白，其含有新的六半胱氨酸免疫球蛋白样结构域和富含苏氨酸/丝氨酸/脯氨酸(T/S/P)的粘蛋白结构域。最初在大鼠中鉴定出了TIM-1。已经在小鼠、非洲绿猴和人中发现了TIM-1(Feigelstock等人，J Virol 72(8):6621-8(1998)。非洲绿猴直向同源物与人TIM-1最密切相关，在358个比对的氨基酸中显示出77.6％的氨基酸同一性。大鼠和小鼠直向同源物分别表现出50％(155/310)和45.6％(126/276)的氨基酸同一性，尽管比对序列的区段短比非洲绿猴的序列区段更短。靶向TIM-1的Ig样结构域的单克隆抗体已显示为在体外具有抗甲型肝炎病毒感染的保护作用。Silberstein等人，J Virol 75(2):717-25(2001)。此外，KIM-1显示为在正常肾脏中以低水平表达，而其在缺血后肾脏中的表达显著增加。Ichimura等人，J Biol Chem 273(7):4135-42(1998)。
[0013] TIM-1映射到人5号染色体的某一区域，该区域在参与哮喘的鼠同线区域中被称为Tapr。Tapr是一种主要的T细胞调节基因座，其控制气道高反应性的发展。Wills-Karp,Nature Immunology 2:1095-1096(2001)；McIntire等人，Nature Immunology 2:1109-1116(2001)。
发明内容
[0014] 本发明涉及靶向TIM-1的嵌合抗原受体。
[0015] 在一个实施方案中，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)包含结合TIM-1的抗原结合结构域、跨膜结构域以及至少一个细胞内信号传导结构域。
[0016] CAR的抗原结合结构域可以是结合TIM-1的抗体或其抗原结合片段。
[0017] 在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自以下的组：单克隆抗体；单特异性抗体；聚特异性抗体；人源化抗体；四聚抗体；四价抗体；多特异性抗体；单链抗体；结构域特异性抗体；单结构域抗体；结构域缺失抗体；scFc融合蛋白；单链抗体；嵌合抗体；合成抗体；重组抗体；杂合抗体；突变抗体；CDR移植抗体；包含Fab的抗体片段；F(ab')2；Fab'片段；Fv片段；单链Fv(scFv)片段；Fd片段；dAb片段；双链抗体(diabody)；纳米抗体；二价纳米抗体；
鲨鱼可变IgNAR结构域；VHH抗体；骆驼抗体；以及微抗体。
鲨鱼可变IgNAR结构域；VHH抗体；骆驼抗体；以及微抗体。
[0018] 在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人IgG抗体或其抗原结合片段。
[0019] 在一个优选实施方案中，抗原结合结构域是Fab或scFv。
[0020] 在一些方面，抗原结合结构域可以结合TIM-1的细胞外粘蛋白结构域区域。
[0021] 在另一个方面，抗原结合结构域可以结合与TIM-1的位置192-197处的氨基酸残基(SEQ ID NO:315)对应的氨基酸序列LPRQNH(SEQ ID NO:97)。
[0022] 在另一个方面，该抗体或其抗原结合片段可以与抗体竞争结合TIM-1，所述抗体包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:207)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:255或SEQ ID NO:257所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的VL链；
并且包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性或与SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的VH链。
并且包含与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性或与SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的VH链。
[0023] 在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL链，该VL链与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:
207)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:255或SEQ ID NO:257所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；并且包含VH链，该VH链与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性，或与SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
207)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:255或SEQ ID NO:257所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；并且包含VH链，该VH链与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:206)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性，或与SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:256所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0024] 抗原结合结构域的VL链和VH链可以通过柔性接头连接。在一个优选实施方案中，柔性接头是(G4S)3aka(GGGGSGGGGSGGGGS)接头，所述接头任选地与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:251所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0025] 在某些实施方案中，抗原结合结构域可与scFv 1.29H、1.29L、2.70.2H、2.70.2L、2.59.2H或2.59.2L的氨基酸序列(SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262或SEQ ID NO:263所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0026] 在一个方面，抗原结合结构域的VL链位于CAR的N末端(VL链位于CAR中的VH链的N末端)。
[0027] 在另一方面，抗原结合结构域的VH链位于CAR的N末端(VH链位于CAR中的VL链的N末端)。
[0028] 在一些实施方案中，抗原结合结构域通过接头、间隔区或铰链与跨膜结构域接合，所述接头、间隔区或铰链任选地来源于以下的组中的一种或多种：CD28、CD8α、免疫球蛋白恒定区或其变体、免疫球蛋白铰链区、IgG4铰链区、免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、免疫球蛋白CH2结构域、免疫球蛋白CH3结构域和/或它们的任何组合。
[0029] 在某些实施方案中，所述接头、间隔区或铰链来源于CD28，该CD28任选地与CD28H的氨基酸序列(SEQ ID NO:214)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:264所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0030] 在一个方面，抗原结合结构域可以与细胞毒性剂缀合。
[0031] 跨膜结构域可包含来源于选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ或TCRζ。在一个优选实施方案中，跨膜结构域来源于CD28，该CD28任选地与CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:265所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0032] 细胞内信号传导结构域可以是淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fc受体亚基或IL-2受体亚基的细胞内信号传导结构域。在一个优选实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ，该CD3ζ任选地与CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:269所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0033] 本发明的CAR还可包含一个或多个共刺激结构域，该一个或多个共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1)、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10；以及与CD83特异性结合的配体。
[0034] 在一个优选实施方案中，该一个或多个共刺激结构域来源于选自由CD28、4-1BB(CD137)和DAP10组成的组的蛋白质，该一个或多个共刺激结构域任选地与CD28CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:217)、BBCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:216)或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:218)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0035] 在一个方面，抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含2.70.2H的氨基酸序列(SEQ ID NO:210)；跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，该CD28跨膜结构域包含CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)；细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导结构域，该CD3ζ细胞内信号传导结构域包含CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)。
[0036] 在另一个方面，抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含2.59.2H的氨基酸序列(SEQ ID NO:212)或2592L的氨基酸序列(SEQ ID NO:213)；跨膜结构域包含CD28跨膜结构域，该CD28跨膜结构域包含CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)；细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导结构域，该CD3ζ细胞内信号传导结构域包含CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)。
[0037] 抗原结合结构域可以通过CD28铰链与跨膜结构域接合，该CD28铰链任选地与CD28H的氨基酸序列(SEQ ID NO:214)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:264所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0038] 本发明的CAR还可包含一个或多个共刺激结构域，该一个或多个共刺激结构域来源于CD28、4-1BB或DAP10，该一个或多个共刺激结构域任选地与CD28CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:217)、BBCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:216)或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:218)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0039] 在一个方面，CAR包含与2592H-BB的氨基酸序列(SEQ ID NO:220)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:270所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0040] 在一个方面，CAR包含与2592H-BB的氨基酸序列(SEQ ID NO:221)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:271所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0041] 在一个方面，CAR包含与2.70.2H-BB的氨基酸序列(SEQ ID NO:222)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:
272所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
272所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0042] 在一个方面，CAR包含与2.70.2H-CD28的氨基酸序列(SEQ ID NO:223)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:
273所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
273所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0043] 在一个方面，CAR包含与2.70.2H-DAP10的氨基酸序列(SEQ ID NO:224)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:
274所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
274所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0044] 在一个方面，CAR包含与2592H-BB的氨基酸序列(SEQ ID NO:225)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:275所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0045] 在一个方面，CAR包含与2592H-BB的氨基酸序列(SEQ ID NO:226)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:276所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0046] 在一个方面，CAR包含与2.59.2H-CD28的氨基酸序列(SEQ ID NO:227)或2.59.2L-CD28的氨基酸序列(SEQ ID NO:229)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:277或SEQ ID NO:279所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0047] 在一个方面，CAR包含与2.59.2H-DAP10的氨基酸序列(SEQ ID NO:228)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:
278所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
278所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0048] 在一些实施方案中，当所述CAR结合TIM-1时，表达本发明的CAR的细胞毒性免疫细胞可以被激活或刺激而增殖。
[0049] 在一些实施方案中，CAR当在细胞毒性免疫细胞的表面上表达时，指导细胞毒性免疫细胞杀伤表达TIM-1的细胞。
[0050] 在一些实施方案中，细胞毒性免疫细胞是T淋巴细胞。
[0051] 本发明还提供了重组或分离的细胞，该重组或分离的细胞表达根据任何前述实施方案的至少一种CAR。在一些实施方案中，细胞可以是人细胞或其他哺乳动物细胞。在一个优选实施方案中，细胞是原代人细胞或来源于原代人细胞。
[0052] 在一些实施方案中，重组或分离的细胞可以是免疫细胞。在一个方面，该免疫细胞选自T淋巴细胞和B淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、NK/T细胞、巨噬细胞和单核细胞。在另一个方面，免疫细胞是T细胞或T细胞祖细胞。
[0053] 在一些实施方案中，免疫细胞选自T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。在一个方面，前述实施方案的T细胞经修饰，以使得与野生型T细胞相比，其内源性TCR不表达、不进行功能性表达或以降低的水平表达。
[0054] 在另一个方面，任何前述实施方案的免疫细胞可以是MHC+或MHC-。
[0055] 在一些实施方案中，根据任何前述的重组或分离的细胞可以进一步修饰以掺入以下修饰中的一种或多种：表达另一种CAR，任选地激活或抑制CAR；包含在特定条件下可表达的自杀基因；对另一种抗原任选地肿瘤抗原有特异性；过表达促存活信号；逆转抗存活信号；过表达Bcl-xL或BCL-2；抑制细胞死亡基因(包括但不限于Bak或Bax)的表达或抑制该细胞死亡基因的功能；过表达hTERT；消除Fas表达；表达TGFβ显性负性受体；逃避免疫抑制介体；和/或包括归巢机制。在一些实施方案中，细胞选自pp65CMV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、EBV特异性T细胞、水痘病毒特异性T细胞、流感病毒特异性T细胞和/或腺病毒特异性T细胞。
[0056] 本发明进一步提供一种药物组合物，该药物组合物包含药学有效量的根据任何前述的细胞或CAR。
[0057] 本发明还提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，该嵌合抗原受体(CAR)包含结合TIM-1的抗原结合结构域、跨膜结构域以及至少一个细胞内信号传导结构域。
[0058] 分离的核酸可以编码具有前述方面和实施方案的任何特征的CAR。
[0059] 在一个方面，分离的核酸序列还包含T2A核糖体跳跃序列，该T2A核糖体跳跃序列任选地与SEQ ID NO:231的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性或与SEQ ID NO:281所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0060] 在一些实施方案中，分离的核酸序列还包含编码选择性标记的序列。在一个方面，选择性标记是截短的CD19(tCD19)，该截短的CD19(tCD19)任选地与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:282所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0061] 在另一方面，分离的核酸序列还包含编码自杀机制的序列。
[0062] 在另一个方面，分离的核酸序列还包含共抑制受体(诸如CTLA-4或PD-1(“iCAR”))的一个或多个信号传导结构域；和/或表达在肿瘤微环境内富含的基质金属蛋白酶存在下切割的底物肽(“掩蔽的CAR”)。
[0063] 在另一个方面，分离的核酸序列还包含信号肽，该信号肽任选地与SEQ ID NO:230的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:280所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0064] 本发明还提供了一种载体，该载体包含根据任何前述实施方案的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
[0065] 载体还可以包含T2A核糖体跳跃序列，该T2A核糖体跳跃序列任选地与SEQ ID NO:231的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性，或与SEQ ID NO:281所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
100％同一性，或与SEQ ID NO:281所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0066] 载体还可以包含编码选择性标记的核酸序列。在一些实施方案中，选择性标记可以是截短的CD19(tCD19)，该截短的CD19(tCD19)任选地与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或与SEQ ID NO:282所编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0067] 载体可以选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
[0068] 在一个方面，载体还包含启动子。
[0069] 在另一方面，载体是体外转录的载体。
[0070] 在另一方面，载体还包含聚(A)尾和/或3'UTR。
[0071] 本发明还提供了分离的细胞，该分离的细胞包含根据任何前述实施方案的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
[0072] 在一些实施方案中，细胞是细胞毒性免疫细胞，该细胞毒性免疫细胞任选地选自T+ +细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
[0073] 在一些实施方案中，当CAR结合TIM-1时，细胞表现出抗肿瘤细胞毒性。
[0074] 在一些实施方案中，CAR表达细胞在暴露于TIM-1表达细胞后增加细胞因子和趋化因子的产生。在一个优选实施方案中，产生的细胞因子和趋化因子是以下中的一种或多种：GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13或IFN-γ。
[0075] 在一些实施方案中，任选地通过乳酸脱氢酶产生所测量的，细胞在暴露于TIM-1表达细胞后表现出细胞毒活性。
[0076] 在一些实施方案中，细胞可以对另一种抗原任选地肿瘤抗原有特异性；可以选自pp65CMV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、EBV特异性T细胞、水痘病毒特异性T细胞、流感病毒特异性T细胞和/或腺病毒特异性T细胞；可进一步修饰以过表达促存活信号、逆转抗存活信号、过表达Bcl-xL或BCL-2、抑制细胞死亡基因(包括但不限于Bak或Bax)的表达或抑制该细胞死亡基因的功能、过表达hTERT、缺乏Fas、或表达TGFβ显性负性受体；可进一步修改以逃避免疫抑制介体；还包括归巢机制；和/或还可以包含另一种CAR，任选地激活或抑制CAR。
[0077] 本发明还提供一种治疗或药物组合物，该治疗或药物组合物包含治疗有效量的根据任何前述实施方案的CAR或分离的细胞。
[0078] 本发明还包括一种免疫治疗方法，该免疫治疗方法包括施用治疗有效量的根据任何前述实施方案的CAR或分离的细胞或含有该CAR或分离的细胞的组合物。在一些实施方案中，该方法可用于治疗选自以下的疾患：癌症、自体免疫、感染和炎症性病症。
[0079] 本发明还包括一种在受试者中刺激免疫细胞介导的响应的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的经修饰以表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域，其中当CAR结合TIM-1时，该经修饰的免疫细胞被激活或刺激而增殖，从而刺激受试者中的免疫细胞介导的响应。
[0080] 本发明还提供了一种治疗受试者中与表达TIM-1的细胞的不期望的增殖相关的疾病、病症或疾患的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的经基因修饰以表达CAR的免疫细胞，该CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域，其中当CAR结合TIM-1时，该经修饰的免疫细胞被激活或刺激而增殖，从而治疗与表达TIM-1的细胞的不期望的增殖相关的疾病、病症或疾患。
[0081] 本发明另外包括一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的经修饰以表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含(i)结合TIM-1的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，以及(iii)至少一个细胞内信号传导结构域。
[0082] 在一些实施方案中，通过细胞因子和趋化因子的产生来测量受试者中的免疫响应。在一个优选实施方案中，细胞因子和趋化因子是GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13或IFN-γ。
[0083] 在一些实施方案中，经修饰的免疫细胞是T细胞。T细胞可以是自体T细胞或供体来源的T细胞。
[0084] 在一些实施方案中，该方法用于治疗为实体瘤的癌症。癌症可选自由以下组成的组：癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤及皮肤癌。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达TIM-1。
[0085] 在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌、卵巢透明细胞癌或肺癌。在一个优选实施方案中，癌症是卵巢透明细胞癌或肾细胞癌。
[0086] 上述方法的经修饰的免疫细胞可以局部、肠内或肠胃外地施用。
[0087] 在一些实施方案中，经修饰的免疫细胞减少肿瘤生长和/或缩小肿瘤体积。
[0088] 该方法的受试者可以对至少一种化学治疗剂具有抗性。
[0089] 在一个方面，该方法还包括向受试者施用另一种疗法。在一些实施方案中，该疗法是化学疗法、放射疗法、基于毒素的疗法、基于放射化学的疗法或手术疗法。
[0090] 对于任何前述方法，经修饰的细胞可以与另一种治疗剂组合施用。在一些实施方案中，该治疗剂增加表达CAR分子的细胞的功效。在一些实施方案中，该治疗剂改善与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用。
[0091] 这些方法的经修饰的免疫细胞可表达根据任何前述的CAR或根据任何前述的编码所述CAR的核酸。
[0092] 本发明还提供了一种在受试者中产生持久存在的经修饰的免疫细胞群的方法，该方法包括向受试者施用包含编码根据任何前述实施方案的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞在施用后持续存在于受试者体内至少一个月。持久存在的经修饰的免疫细胞群可包括施用于受试者的至少一种经修饰的免疫细胞、施用于受试者的经修饰的免疫细胞的子代，或它们的组合。在一些实施方案中，持久存在的经修饰的免疫细胞群包含记忆T细胞。在一些实施方案中，持续存在的经修饰的免疫细胞群在施用后在受试者中持续存在至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年或至少三年。
[0093] 本发明还包括一种在受试者中扩增经修饰的免疫细胞群的方法，该方法包括向受试者施用免疫细胞，该免疫细胞包含编码根据任何前述实施方案的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中施用的经修饰的免疫细胞在受试者中产生子代细胞群。在一些实施方案中，子代细胞群在施用后在受试者中持续存在至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少十二个月、至少十八个月、至少两年或至少三年。
[0094] 本发明还考虑一种药物组合物，该药物组合物包含免疫细胞，该免疫细胞经修饰以表达编码根据任何前述实施方案的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂。该组合物还可包含一种或多种特异性结合一种或多种肿瘤相关抗原的另外的剂。该组合物可适用于局部、肠内或肠胃外施用。
[0095] 本发明还包括一种产生表达CAR的免疫细胞的方法，该方法包括向免疫细胞中引入编码根据任何前述实施方案的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。本发明还包括一种产生表达CAR的免疫细胞的方法，该方法包括向免疫细胞中引入根据任何前述实施方案的核酸序列。
[0096] 本发明还提供了一种产生表达CAR的免疫细胞的方法，该方法包括用根据任何前述实施方案的载体转导免疫细胞。
[0097] 在产生表达CAR的免疫细胞的方法的一个方面，如通过流式细胞术或免疫荧光测定法测定的，基于所述CAR的表达来分离表达CAR的免疫细胞。在这些方法的另一个方面，表达CAR的免疫细胞富集CD3和tCD19表达。在这些方法的另一个方面，通过暴露于磁珠、可溶性抗体和/或细胞因子来刺激表达CAR的免疫细胞生长。在一个方面，通过暴露于OKT3和IL-2来刺激表达CAR的免疫细胞生长。
[0099] 图1包含TIM-1 CAR的一般示意图。
[0100] 图2A至图2C包含示出各种TIM-1 CAR的示意图。图2A示出了CAR的一种可能组构：抗TIM-1ScFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28细胞质/共刺激结构域及CD3ζ细胞质/细胞内信号传导结构域。图2B示出了来源于以下三种不同抗体的VL区和VH区的两种不同的抗TIM-1ScFv构型(VL-接头-VH和VH-接头-VL)：Ab 1.29、Ab 2.70.2和Ab 2.59.2。这六种scFv的序列在SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:213中提供。图2C示出了编码各种TIM-1 CAR的六种不同基因构建体。
这些CAR基因构建体的特征为信号肽之后依次为抗TIM-1ScFv、CD28铰链和跨膜结构域、CD28/4-1BB/DAP10共刺激结构域、CD3ζ细胞内信号传导结构域、T2A核糖体跳跃序列以及编码截短的CD19的基因。
这些CAR基因构建体的特征为信号肽之后依次为抗TIM-1ScFv、CD28铰链和跨膜结构域、CD28/4-1BB/DAP10共刺激结构域、CD3ζ细胞内信号传导结构域、T2A核糖体跳跃序列以及编码截短的CD19的基因。
[0101] 图3包含示出了制备用于体外测定的分离的CAR表达细胞的潜在方法的流程图。
[0102] 图4包含TIM-1 CAR T细胞的示例性流式细胞术分析的列表结果。分析指示了活细胞的百分比(“活”)、为CD3+的活细胞的百分比(“CD3”)、为CD4+的CD3+细胞的百分比(“CD4+ +[CD3]”)、为CD8的CD3 细胞的百分比(“CD8[CD3]”)、表达TIM-1 CAR的活细胞的百分比(“TIM-1 CAR”)以及表达截短的CD19的CD3+细胞的百分比(“CD19[CD3]”)。
[0103] 图5A至图5E包含表明暴露于各种细胞类型后TIM-1 CAR T细胞的IFN-γ产量(pg/mL)的数据。图5A示出了(从左至右)对照载体转导的细胞、129H(129H-CD28)CAR T细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞、129HtCD19(129H-CD28+tCD19)CAR T细胞、272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞以及七种其他培养基或细胞对照的IFN-γ产量。图5B示出了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞、272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞以及其他七种培养基或细胞对照的IFN-γ产量。对于图5A和图5B，在暴露于(从左至右)不与细胞共培养、Caki-1(肾癌)细胞、A549(肺癌)细胞和IGROV-1(卵巢癌)细胞后测量IFN-γ产量。图5C示出了在暴露于(从左至右)EL4(非TIM-1表达)细胞、A549细胞、Caki-1细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后，(从左至右)2592H(2592H-CD28)CAR T细胞、2592L(2592L-CD28)CAR T细胞和模拟物转导细胞的IFN-γ产量。
图5D示出了在暴露于EL4细胞(左)和IGROV-1细胞(右)后，(从左至右)模拟物转导细胞、
2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和272H(272H-CD28)CAR T细胞的IFN-γ产量。图5E示出了在与(从左至右)IGROV-1细胞、在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞以及培养基对照一起孵育22h后，2592H(2592H-CD28)CAR T细胞(左)和模拟物转导细胞(右)的IFN-γ产量。
图5D示出了在暴露于EL4细胞(左)和IGROV-1细胞(右)后，(从左至右)模拟物转导细胞、
2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和272H(272H-CD28)CAR T细胞的IFN-γ产量。图5E示出了在与(从左至右)IGROV-1细胞、在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞以及培养基对照一起孵育22h后，2592H(2592H-CD28)CAR T细胞(左)和模拟物转导细胞(右)的IFN-γ产量。
[0104] 图6A至图6B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的GM-CSF产量的数据。在图6A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图6B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L(2592L-CD28)CAR T细胞的这些水平。
[0105] 图7A至图7B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的IL-6产量的数据。在图7A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图7B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0106] 图8A至图8B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的TNF-α产量的数据。在图8A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图8B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0107] 图9A至图9B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的RANTES产量的数据。在图9A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图9B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0108] 图10A至图10B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的IL-10产量的数据。在图10A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图10B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图10B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0109] 图11A至图11B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的IL-4产量的数据。在图11A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图11B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图11B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0110] 图12A至图12B包含报告了在暴露于(从左至右)培养基对照、EL-4细胞、Caki-1细胞、A549细胞、IGROV-1细胞和在抗TIM-1抗体存在下的IGROV-1细胞后的IL-13产量的数据。在图12A中报告了(从左至右)对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图12B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的这些水平；并且在图12B中报告了模拟物转导细胞、2592H(2592H-CD28)CAR T细胞和2592L CAR T细胞的这些水平。
[0111] 图13A至图13C含有TIM-1 CAR的体外细胞毒性数据，如通过检测培养基中的乳酸脱氢酶所指示的。在每个分组中，左侧栏报告对EL4细胞的细胞毒性，并且右侧栏报告对IGROV-1细胞的细胞毒性。在图13A中，报道了对照载体转导的细胞、272H(272H-CD28)CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞在与癌细胞的各种比率下的细胞毒性。在图13B中，报道了模拟物转导细胞和2592L CAR T细胞的细胞毒性。在图13C中，报道了模拟物转导细胞和2592H(2592H-CD28)CAR T细胞的细胞毒性。
[0112] 图14包含示出了制备用于体内测定的分离的CAR表达细胞的潜在方法的流程图。
[0113] 图15A至图15B包含如在图14中所制造的细胞的生长图(图15A)和细胞活力评定(图15B)，所述细胞为模拟物转导细胞和用2592HtCD19(2592H-CD28+tCD19)构建体、2592LtCD19构建体和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)构建体转导的细胞。
[0114] 图16包含指示了用于转导细胞的流式细胞术表征的三种抗体混合物的表格。
[0115] 图17包含如在图14中所制造、通过图16的Ab1配置检测到的转导细胞的流式细胞术分析的列表结果。
[0116] 图18包含24小时功能测定的结果，该24小时功能测定测量暴露于A549细胞、Caki-1细胞、IGROV-1细胞、EL4细胞和单独的培养基的1:1比率的模拟物转导细胞、2592HtCD19(2592H-CD28+tCD19)CAR T细胞、2592LtCD19CAR T细胞和272HtCD19(272H-CD28+tCD19)CAR T细胞的IFN-γ产量。还包括单独的癌细胞对照。在每种情况下，出于测定目的而将细胞在缓冲液中1:4稀释。
[0117] 图19包含用于体内抗TIM-1 CAR T功效研究的小鼠治疗组的示意图。
[0118] 图20A至图20B包含SCID-beige小鼠中体内抗TIM-1 CAR T功效研究的结果。将2.5×106个IGROV-1细胞单独递送，或与7.5×106个模拟物转导细胞或CAR转导细胞一起递送。在第0天将该混合物通过皮下递送注射到SCID-beige小鼠的右胁腹，除了对照组具有5只小鼠外，每组10只小鼠。图20A示出了每周两次测量的肿瘤大小(mm3)。线(从上到下)对应于没有CAR T递送(生理盐水)、模拟CAR T、2592H_tCD19CAR T、2592L_tCD19CAR T以及272H_tCD19CAR T。图20B示出了在第20天测量的肿瘤大小的比较。该数据对应于与(从左至右)仅生理盐水、7.5×106个模拟物转导细胞、7.5×106个2592H_tCD19CAR T细胞和7.5×106个
272H_tCD19CAR T细胞混合的2.5×106个IGROV-1细胞。将肿瘤大小报告为平均体积±SEM，然后使用Mann-Whitney检验进行统计学分析。CAR T细胞处理显示出对肿瘤生长的显著抑制(*，p＝0.02；**，p＝0.002)。
272H_tCD19CAR T细胞混合的2.5×106个IGROV-1细胞。将肿瘤大小报告为平均体积±SEM，然后使用Mann-Whitney检验进行统计学分析。CAR T细胞处理显示出对肿瘤生长的显著抑制(*，p＝0.02；**，p＝0.002)。
[0119] 图21包含卵巢癌鼠模型中体内存活测定的结果。向具有已建立的IGROV-1肿瘤细胞的SCID-beige小鼠腹膜内注射生理盐水(第1组，虚线)、7.5×106个模拟CAR T细胞(第26
组，实线，实心点)或7.5×10个抗TIM-1 CAR T细胞(第3组，实线、空心点)。该图示出了小鼠存活结果。对数秩(Mantel-Cox)检验显示，接受抗TIM-1 CAR-T细胞的小鼠(第3组)在统计学上比仅接受生理盐水的小鼠(第1组，p＝0.0043**)或接受模拟CAR-T细胞的小鼠(第2组，p<0.0001****)存活更长时间。
组，实线，实心点)或7.5×10个抗TIM-1 CAR T细胞(第3组，实线、空心点)。该图示出了小鼠存活结果。对数秩(Mantel-Cox)检验显示，接受抗TIM-1 CAR-T细胞的小鼠(第3组)在统计学上比仅接受生理盐水的小鼠(第1组，p＝0.0043**)或接受模拟CAR-T细胞的小鼠(第2组，p<0.0001****)存活更长时间。
具体实施方式
[0120] 本发明的一个方面总体涉及新型TIM-1结合嵌合抗原受体(CAR)的构建和用途。具体地，本发明的CAR包含结合TIM-1的抗原结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导结构域。本发明还提供了编码这些CAR的多核苷酸、包含编码这些CAR的多核苷酸的载体、包含表达这些CAR的细胞的组合物，以及制备和使用这些CAR和CAR表达细胞的方法。本发明还提供了治疗受试者中与恶性TIM-1表达相关的疾患(诸如癌症)的方法。这些CAR，特别是包含编码这些CAR的核酸序列的分离的细胞，可用于治疗与表达TIM-1的细胞的不期望的增殖相关的疾病、病症或疾患。在特定的实施方案中，这些细胞可用于治疗癌症。
[0121] CAR靶：TIM-1
[0122] 本发明的CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域与T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1蛋白(TIM-1)结合，所述TIM-1也被称为HAVCR1、HAVCR、HAVCR-1、KIM-1、KIM1、TIM、TIM1、TIMD-1、TIMD1、CD365及甲型肝炎病毒细胞受体1。通常，TIM-1属于I型细胞表面糖蛋白组，其结构包括N末端免疫球蛋白(Ig)样结构域、具有不同长度的粘蛋白结构域、单个跨膜结构域以及C末端短细胞质尾区。在人中，TIM-1由染色体5上的HAVCR1基因编码，其中基因位置为5q33.3(NCBI)。人TIM-1具有作为GenBank Acc.No.AAC39862.1提供的氨基酸序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，TIM-1是作为SEQ ID NO:315提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
[0123] T细胞免疫球蛋白粘蛋白1/肾损伤分子1(TIM-1/KIM1)是在健康组织中具有有限表面表达的蛋白质。在卵巢癌的情况下，>93％的OCCC肿瘤经测试为TIM-1表达阳性的，而其他类型的卵巢癌为TIM-1阴性的(Lin等人，Am J Surg Pathol.2007；31:371-381)。以下实例描述了包含TIM-1结合结构域的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体可用于治疗表达TIM-1的恶性肿瘤。预计健康组织中TIM-1表达的缺乏将提供具有有限的在靶效应、脱靶效应的有利治疗窗口。据申请人所知，该目标从未用于基于T细胞的干预。
[0124] 历史上一种治疗方法适用于所有癌症治疗方法已被证明大部分不成功。相反，选择性地靶向和利用特定癌症类型的缺陷的合理设计的疗法已引起了前所未有的治疗响应，并将继续是最成功的。我们已经鉴定了有效的抗TIM-1抗体，该有效的抗TIM-1抗体当被格式化为CAR构建体时，识别TIM-1+靶细胞并激活CAR T细胞。另外，当在体内施用时，抗TIM-1 CAR T细胞阻止TIM-1+卵巢肿瘤细胞的生长。这种针对OCCC的有效CAR T免疫疗法的开发代表了卵巢癌治疗的显著进步。此外，预计该方法也适用于治疗其他TIM-1+癌症，包括肾细胞癌。
[0125] 本文的实例说明了通过使用来源于人全长抗体的抗TIM-1scFv，靶向作为在诸如卵巢透明细胞癌的某些癌症中选择性表达的靶标的TIM-1的潜力。
[0126] 抗原结合结构域
[0127] 本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导结构域。该抗原结合结构域包含结合TIM-1的靶特异性结合元件。
[0128] 抗原结合结构域可以来源于结合TIM-1的多肽。在一些实施方案中，多肽可以是受体或结合TIM-1的受体的一部分。在另一个实施方案中，抗原结合结构域可以来源于结合TIM-1的配体，所述配体包括但不限于HAVC、TIM-4及TIM-1本身。
[0129] 在另一个实施方案中，抗原结合结构域可以来源于结合TIM-1的抗体或其抗原结合片段。抗体片段的实例包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段、双链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，诸如scFv。
[0130] 单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
[0131] 抗体片段可以通过各种技术制备，所述技术包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞的产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，诸如包含不天然存在的排列的片段，诸如具有通过合成接头(例如肽接头)接合的两个或更多个抗体区或链的片段，和/或可能不是通过对天然存在的完整抗体进行酶消化而产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。
[0132] 在一些方面，抗原结合结构域可以来源于具有一种或多种特定功能特征的抗体或其抗原结合片段，所述一种或多种特定功能特征为诸如结合特性，包括与特定表位(诸如与其他抗体的表位相似或重叠的表位)结合、与其他抗体竞争结合的能力，和/或特定的结合亲和力。在一个优选实施方案中，抗体或其抗原结合片段与TIM-1结合。在某些方面，它们结合人TIM-1，诸如SEQ ID NO:315中所示的人TIM-1。在另一个方面，抗体或其抗原结合片段与Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2竞争结合TIM-1。在另一个方面，抗体或其抗原结合片段与Ab 1.29和Ab 2.70.2或Ab 2.59.2结合相同的表位仓(参见美国专利号8,067,544B2)。
[0133] 在一些实施方案中，抗原结合结构域结合这样的表位，所述表位含有在TIM-1的细胞外结构域内(或完全在其内)和/或在TIM-1的细胞外部分的膜-近侧区域内(或完全在其内)的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，抗体结合这样的表位，所述表位含有TIM-1的粘蛋白结构域、TIM-1的IgV样结构域、和/或TIM-1的细胞外部分的膜-最近侧10、90、80、75、70、65、60、55、50、45、44、43、43、41或40个氨基酸部分内的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，这种部分或结构域是抗原结合结构域与TIM-1结合所必需的。在一些实施方案中，表位含有(或还含有)TIM-1的粘蛋白结构域内或完全在其内的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，此类部分或结构域是抗原结合结构域与TIM-1结合所必需的。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合这样的肽，所述肽包含此类部分的序列或由其组成或基本上由其组成，并且不包含全长TIM-1的完整序列。例如，抗原结合结构域可以以TCR样方式结合，在该TCR样方式中它结合来源于MHC沟中的TIM-1的肽，但不具有对MHC的反应性。
[0134] 在一些实施方案中，表位含有在TIM-1的一部分内的一个或多个氨基酸、在TIM-1的所述部分内或包含TIM-1的所述部分，TIM-1的所述部分对应于SEQ ID NO:315中所示的人TIM-1序列的残基192-197，诸如具有SEQ ID NO:97所示序列的部分。在一些实施方案中，表位可包含一个或多个相邻残基。在一个具体方面，表位可包含氨基酸序列PMPLPRQNHEPVAT。在一些实施方案中，抗原结合结构域可包含已知结合此类表位的抗TIM-1抗体的序列。在一个方面，本发明的CAR可以包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含美国专利号8,067,544中公开的抗TIM-1抗体序列，该抗TIM-1抗体序列的序列以引用方式并入本文。
[0135] 在一些实施方案中，表位包括在TIM-1的对应于SEQ ID NO:315中所示的人TIM-1序列的位置64处的组氨酸的位置的氨基酸(诸如组氨酸)；在一些实施方案中，此类氨基酸对于抗原结合结构域与TIM-1的结合是重要的。在一些实施方案中，表位包括在TIM-1的对应于SEQ ID NO:315中所示的人TIM-1序列的位置67处的谷氨酸的位置的氨基酸(诸如谷氨酸)；在一些实施方案中，此类氨基酸对于抗原结合结构域与TIM-1的结合是重要的。
[0136] 在一些实施方案中，表位与参照抗体(诸如Ab 1.29、Ab 2.70.2、或Ab 2.59.2)所特异性结合的表位相同、相似、重叠，或含有一个或多个相同的氨基酸。在一些实施方案中，相同的一个或多个氨基酸对于提供的抗体和参照抗体的结合是重要的。
[0137] 在一些实施方案中，抗TIM-1抗原结合结构域与不相关的非TIM-1蛋白结合的程度为抗原结合结构域与人TIM-1结合的小于约40％。在一些实施方案中，提供的抗原结合结构域是这样的抗原结合结构域，其中与非人TIM-1或其他非TIM-1蛋白的结合为抗体与人TIM-1结合的小于或为约30％，小于或为约20％，或小于或为约10％。
[0138] 在一些实施方案中，抗原结合结构域竞争结合和/或结合TIM-1的相同或重叠表位，如Ab 1.29、Ab 2.70.2或Ab 2.59.2或其抗原结合片段。
[0139] 在一些实施方案中，抗原结合结构域来源于具有重链和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链和轻链CDR不同于诸如Ab 1.29、Ab 2.70.2和Ab 2.59.2的抗体中存在的CDR。例如，在所提供的抗体及其抗原结合片段中，抗体及其抗原结合片段竞争结合和/或结合如抗体所结合的TIM-1的相同或重叠表位，但仍包含不同的CDR，例如不同的重链和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所提供的抗体含有重链和轻链CDR，所述重链和轻链CDR不同于命名为Ab 1.29的抗体中存在的CDR，诸如存在于SEQ ID NO:202所示的VH区和/或SEQ ID NO:203所示的VL区中。在一些实施方案中，所提供的抗体含有重链和轻链CDR，所述重链和轻链CDR不同于命名为Ab 2.70.2的抗体中存在的CDR，诸如存在于SEQ ID NO:204所示的VH区和/或SEQ ID NO:205所示的VL区中。在一些实施方案中，所提供的抗体含有重链和轻链CDR，所述重链和轻链CDR不同于命名为Ab 2.59.2的抗体中存在的CDR，诸如存在于SEQ ID NO:206所示的VH区和/或SEQ ID NO:207所示的VL区中。
[0140] 在一些实施方案中，与TIM-1阴性细胞(例如本领域已知和/或在此描述的特定细胞)相比，抗原结合结构域、包含此抗原结合结构域的CAR和包含此类CAR的细胞显示出对TIM-1表达细胞的结合偏好。在一些实施方案中，观察到结合偏好，其中与非TIM-1表达细胞相比，测量到与表达TIM-1的细胞的显著更高程度的结合。在某些情况下，观察到的与TIM-1或TIM-1表达细胞结合的总程度与观察到的与非TIM-1特异性结构域、CAR或细胞结合的总程度大致相同、至少一样大或更大。在任何提供的实施方案中，结合特性(诸如亲和力或竞争)的比较可以通过相同或类似测定的测量进行。
[0141] 在一些实施方案中，抗原结合结构域包含scFv，该scFv包含TIM-1结合抗体的CDR序列。CDR可以使用常规方法确定，给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种容易地确定，包括Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of Immunological Interest"，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996),"Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,"J.Mol.Biol.262,732-745."(“Contact”编号方案)；Lefranc M P等人，"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,"Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77("IMGT"编号方案)；以及Honegger A和Pluckthun A,"Yet another numbering scheme for
immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,"J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70,("Aho"编号方案)中描述的方案。
immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,"J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70,("Aho"编号方案)中描述的方案。
[0142] 在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的序列还包含前导序列或信号序列。在抗原结合结构域包含scFv的实施方案中，前导序列可位于scFv的氨基末端。在一些实施方案中，当重链可变区是N末端时，前导序列可以位于重链可变区的氨基末端。在一些实施方案中，当轻链可变区是N末端时，前导序列可以位于轻链可变区的氨基末端。前导序列可包含任何合适的前导序列。在本发明的实施方案中，前导序列可包含SEQ ID NO:280所示的核酸序列。在一些实施方案中，前导序列可包含编码SEQ ID NO:230所示氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，前导序列可包含SEQ ID NO:230所示的氨基酸序列。在本发明的分离细胞的成熟形式中，可不存在前导序列。
[0143] 在一个优选实施方案中，抗原结合结构域包含scFv，其包含Ab 1.29、2.70.2或2.59.2的CDR序列。
[0144] 优选地，本发明的CAR中的抗原结合结构域是抗TIM-1scFv，其中抗TIM-1scFv的核酸序列包含SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262或SEQ ID NO:263中所示的序列。在一个实施方案中，抗TIM-1scFV包含编码SEQ ID NO:
208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明CAR的抗TIM-1scFV部分包含SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213中所示的氨基酸序列。
208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明CAR的抗TIM-1scFV部分包含SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:213中所示的氨基酸序列。
[0145] 具体地，在一个优选实施方案中，本发明的CAR中的抗原结合结构域来源于Ab 2.59.2、Ab 2.70.2或Ab 1.29的抗体或其抗原结合片段。Ab 2.59.2包含VL链SEQ ID NO:
207(由SEQ ID NO:257编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:250(由SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299和SEQ ID NO:300编码)；以及VH链SEQ ID NO:206(由SEQ ID NO:256编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246和SEQ ID NO:247(由SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296和SEQ ID NO:297编码)。Ab 2.70.2包含VL链SEQ ID NO:205(由SEQ ID NO:255编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244(由SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293和SEQ ID NO:294编码)；以及VH链SEQ ID NO:204(由SEQ ID NO:254编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240和SEQ ID NO:241(由SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291编码)。Ab
1.29包含VL链SEQ ID NO:203(由SEQ ID NO:253编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:
236、SEQ ID NO:237和SEQ ID NO:238(由SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287和SEQ ID NO:288编码)；以及VH链SEQ ID NO:202(由SEQ ID NO:252编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:
233、SEQ ID NO:234和SEQ ID NO:235(由SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285编码)。
207(由SEQ ID NO:257编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:250(由SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299和SEQ ID NO:300编码)；以及VH链SEQ ID NO:206(由SEQ ID NO:256编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246和SEQ ID NO:247(由SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296和SEQ ID NO:297编码)。Ab 2.70.2包含VL链SEQ ID NO:205(由SEQ ID NO:255编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244(由SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293和SEQ ID NO:294编码)；以及VH链SEQ ID NO:204(由SEQ ID NO:254编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240和SEQ ID NO:241(由SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:291编码)。Ab
1.29包含VL链SEQ ID NO:203(由SEQ ID NO:253编码)，该VL链具有轻链CDR SEQ ID NO:
236、SEQ ID NO:237和SEQ ID NO:238(由SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287和SEQ ID NO:288编码)；以及VH链SEQ ID NO:202(由SEQ ID NO:252编码)，该VH链具有重链CDR SEQ ID NO:
233、SEQ ID NO:234和SEQ ID NO:235(由SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285编码)。
[0146] 铰链
[0147] 在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域和跨膜结构域之间的接头、间隔区或铰链序列。本领域的普通技术人员将理解，铰链序列是促进柔性的短氨基酸序列(参见例如Woof等人，Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可以是从任何合适的分子衍生或获得的任何合适的序列。在一些实施方案中，可以基于CAR和TIM-1结合表位之间的距离来优化铰链序列的长度，例如，较长的铰链可为对于膜近侧TIM-1表位最佳的。
[0148] 在一些实施方案中，CAR，例如其抗原结合部分，还包括铰链、接头或间隔区。铰链可以来源于或包括免疫球蛋白Fc区的至少一部分，所述免疫球蛋白Fc区为例如IgG1 Fc区、IgG2 Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgE Fc区、IgM Fc区，或IgA Fc区。在某些实施方案中，间隔区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA免疫球蛋白Fc区的至少一部分，该至少一部分落入其CH2和CH3结构域内。在一些实施方案中，间隔区还可包括相应免疫球蛋白铰链区的至少一部分。在一些实施方案中，铰链来源于或包括修饰的免疫球蛋白Fc区的至少一部分，所述修饰的免疫球蛋白Fc区为例如修饰的IgG1 Fc区、修饰的IgG2 Fc区、修饰的IgG3 Fc区、修饰的IgG4 Fc区、修饰的IgE Fc区、修饰的IgM Fc区，或修饰的IgA Fc区。修饰的免疫球蛋白Fc区可具有一个或多个突变(例如，点突变、插入、缺失、复制)，从而导致一个或多个氨基酸取代、修饰或缺失，该一个或多个氨基酸取代、修饰或缺失导致间隔区结构域与Fc受体(FcR)的结合受损。在一些方面，修饰的免疫球蛋白Fc区可以设计为具有一个或多个突变，该一个或多个突变导致一个或多个氨基酸取代、修饰或缺失，该一个或多个氨基酸取代、修饰或缺失导致间隔区结构域与一个或多个FcR的结合受损，所述一个或多个FcR包括但不限于FcγRI、FcγR2A、FcγR2B1、FcγR2B2、FcγR3A、FcγR3B、FcεRI、FcεR2、FcαRI、Fcα/μR或FcRn。
[0149] 在一些方面，免疫球蛋白恒定区的一部分充当抗原结合结构域(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。间隔区可具有这样的长度，所述长度与不存在间隔区相比提供抗原结合后细胞的响应性增强。在一些实例中，间隔区的长度为或约12个氨基酸，或长度不超过12个氨基酸。示例性间隔区包括这样的间隔区，所述间隔区具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸，或约10至15个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔区具有约12个氨基酸或更少，约119个氨基酸或更少，或约
229个氨基酸或更少。示例性间隔区包括CD28铰链、单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链，或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔区包括但不限于Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际专利申请公开号WO2014031687；美国专利号8,
822,647或公开申请号US2014/0271635中描述的那些。
229个氨基酸或更少。示例性间隔区包括CD28铰链、单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链，或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔区包括但不限于Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际专利申请公开号WO2014031687；美国专利号8,
822,647或公开申请号US2014/0271635中描述的那些。
[0150] 在一些实施方案中，铰链序列来源于人CD8-α分子或CD28分子。在一个优选实施方案中，铰链序列来源于CD28。在一个实施方案中，CD28铰链序列包含编码CD28H的核酸序列(SEQ ID NO:264)。在一个实施方案中，铰链具有CD28H的氨基酸序列(SEQ ID NO:214)。在一些实施方案中，间隔区具有的氨基酸序列显示出与SEQ ID NO:214至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。
[0151] 跨膜结构域
[0152] 关于跨膜结构域，CAR可以设计为包含与CAR的抗原结合结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然与CAR中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代而进行选择或修饰，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0153] 跨膜结构域可以来自天然来源或来自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。通常，跨膜结构域表示跨膜蛋白的单个跨膜α螺旋，也称为整合蛋白。在本发明中特别使用的跨膜区可以来源于(即至少包含以下的跨膜区)CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ或CD3ζ和/或含有上述的功能变体的跨膜区，所述功能变体为例如保留上述的结构(例如跨膜)性质的大部分的那些功能变体。
[0154] 或者，跨膜结构域可以是合成的，在合成的情况下其将主要包含疏水残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。本发明的跨膜结构域在膜中是热力学稳定的。它可以是单个α螺旋、跨膜β桶、短杆菌肽A的β-螺旋或任何其他结构。跨膜螺旋的长度通常为约20个氨基酸。
[0155] 优选地，本发明的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含CD28TM的核酸序列(SEQ ID NO:265)。在一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含编码CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)的核酸序列。在一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含CD28TM的氨基酸序列(SEQ ID NO:215)。
[0156] 任选地，优选长度在2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头，可以在CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间形成连接基。甘氨酸-丝氨酸双联体可以提供合适的接头。
[0157] 细胞内信号传导结构域
[0158] 本发明的CAR的细胞内信号传导结构域或其他细胞质结构域触发或引发已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的激活。术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指这样的蛋白质部分，该蛋白质部分转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短的部分代替完整的链，只要它转导效应功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。
[0159] 用于本发明CAR的细胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列；和共同受体，所述共同受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导；以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能的合成序列。
[0160] 仅通过一个细胞内信号传导结构域产生的信号可能不足以完全激活免疫细胞，并且还可能需要次级信号或共刺激信号。例如，T细胞激活可以说是由以下两种不同类型的细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的细胞质信号传导序列(原代细胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号的细胞质信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。原代细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的原代细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，该信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
[0161] 在本发明中特别使用的含有ITAM的原代细胞质信号传导序列的实例包括来源于淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fc受体亚基、IL-2受体亚基、CD3ζ、FcRγ、FcR β、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10和DAP12的细胞内信号传导结构域的那些原代细胞质信号传导序列。特别优选的是，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域包含来源于CD3ζ的细胞质信号传导序列。
[0162] 在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域包含CD3ζCYP的核酸序列(SEQ ID NO:269)。在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域包含编码CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)的核酸序列。在一个实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域包含CD3ζCYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:219)。
[0163] 在一个优选实施方案中，CAR的细胞质结构域可以设计成自身包含CD3-ζ信号传导结构域，或与在本发明的CAR中使用的任何其它所需的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指CAR的一部分，该部分包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，该细胞表面分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所必需的。
[0164] 据报道，各种共刺激结构域赋予不同的特性。例如，4-1BB共刺激结构域在体内异种移植模型中显示出增强的持久性(Milone等人，Mol Ther 2009；17:1453-1464；Song等人，Cancer Res 2011；71:4617-4627)，而与DAP10缔合的CAR与体内持久性降低有关(Barber等人，Gene Ther 2011；18:509-516)。另外，这些不同的共刺激结构域产生不同的细胞因子谱，所述不同的细胞因子谱继而可能对靶细胞介导的细胞毒性和肿瘤微环境产生影响。实际上，NK细胞中的DAP10信号传导与Th1的增加和对CD8+T细胞中Th2型细胞因子产生的抑制有关(Barber等人，Blood 2011；117:6571-6581)。
[0165] 共刺激分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll配体受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CRTAM、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、与CD83特异性结合的配体，等等。因此，虽然本发明主要以CD28、DAP10和/或4-1BB区域作为共刺激信号传导元件的实例，但其他共刺激元件也在本发明的范围内。
[0166] 本发明的CAR的细胞内信号传导结构域内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，优选长度在2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头，可以形成连接基。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
[0167] 在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和来源于CD28的共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和来源于DAP10的共刺激结构域。在又一个实施方案中，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和来源于4-1BB的共刺激结构域。
[0168] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自CD28的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自CD28的共刺激结构域包含SEQ ID NO:267所示的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:269所示的核酸序列。
[0169] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自CD28的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自CD28的共刺激结构域包含编码SEQ ID NO:217的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO:219的氨基酸序列的核酸序列。
[0170] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含来源于CD28的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中来源于CD28的共刺激结构域包含SEQ ID NO:217所示的氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。
[0171] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自DAP10的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自DAP10的共刺激结构域包含SEQ ID NO:268所示的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:269所示的核酸序列。
[0172] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自DAP10的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自DAP10的共刺激结构域包含编码SEQ ID NO:218的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO:219的氨基酸序列的核酸序列。
[0173] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含来源于DAP10的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中来源于DAP10的共刺激结构域包含SEQ ID NO:218所示的氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。
[0174] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自4-1BB的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自4-1BB的共刺激结构域包含SEQ ID NO:266所示的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:269所示的核酸序列。
[0175] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自4-1BB的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自4-1BB的共刺激结构域包含编码SEQ ID NO:216的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO:219的氨基酸序列的核酸序列。
[0176] 在一个实施方案中，本发明的CAR中的细胞内信号传导结构域被设计为包含源自4-1BB的共刺激结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中源自4-1BB的共刺激结构域包含SEQ ID NO:216所示的氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:219所示的氨基酸序列。
[0177] 示例性的抗TIM-1 CAR构建体
[0178] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含129H-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:270)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:220的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列。
[0179] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含129L-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:271)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:221的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列。
[0180] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-BB的核酸序列(SEQ ID NO:272)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:222的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列。
[0181] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:273)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:223的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列。
[0182] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-DAP10的核酸序列(SEQ ID NO:274)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:224的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列。
[0183] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272L-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:275)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:225的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列。
[0184] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-BB的核酸序列(SEQ ID NO:276)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:226的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列。
[0185] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:277)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:227的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列。
[0186] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-DAP10的核酸序列(SEQ ID NO:278)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:228的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列。
[0187] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592L-CD28的核酸序列(SEQ ID NO:279)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:229的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列。
[0188] 在一些实施方案中，编码前述示例性CAR的核酸序列还包含T2A核糖体跳跃序列和编码tCD19的序列。
[0189] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-BB_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:302)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:301的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
[0190] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-CD28_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:304)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:303的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:303的氨基酸序列。
[0191] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含272H-DAP10_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:306)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:305的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:305的氨基酸序列。
[0192] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-BB_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:308)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:307的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:307的氨基酸序列。
[0193] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-CD28_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:310)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:309的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列。
[0194] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592H-DAP10_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:312)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:311的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列。
[0195] 在一个实施方案中，本发明的CAR包含2592L-CD28_tCD19的核酸序列(SEQ ID NO:314)。在一个实施方案中，本发明的CAR包含编码SEQ ID NO:313的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:313的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:313的氨基酸序列。
[0196] 进一步修饰
[0197] 本发明的CAR，编码其的核苷酸序列，编码其的载体和包含编码所述CAR的核苷酸序列的细胞可以进一步修饰、工程化、优化或附加，以提供或选择各种特征。这些特征可包括但不限于功效、持久性、靶特异性、降低的免疫原性、多靶向、增强的免疫响应、扩增、生长、降低的脱肿瘤作用、降低的受试者毒性、改善的靶细胞毒性、改善的肿瘤浸润性、检测、选择、靶向等。例如，可以将细胞工程化以表达另一种CAR、自杀机制，并且可以对细胞进行修饰以去除或修饰内源受体或分子(例如TCR和/或MHC分子)的表达。
[0198] 在一些实施方案中，编码CAR的载体或核酸序列进一步编码其他基因。可以构建载体或核酸序列以允许使用多种技术共表达多种基因，所述多种技术包括共转染两种或更多种质粒，使用多种或双向启动子，或创建双顺反子或多顺反子载体。多顺反子载体的构建可包括对IRES元件或2A肽(例如T2A、P2A、E2A或F2A)的编码。在一个具体实施方案中，编码CAR的核酸序列或载体还使用T2A核糖体跳跃序列编码tCD19。在一个实施方案中，T2A核糖体跳跃序列包含SEQ ID NO:281的核酸序列。在一个实施方案中，T2A核糖体跳跃序列包含编码SEQ ID NO:231的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，T2A核糖体跳跃序列包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列。
[0199] 在一个实施方案中，tCD19包含SEQ ID NO:282的核酸序列。在一个实施方案中，tCD19包含编码SEQ ID NO:232的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，tCD19包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列。
[0200] CAR表达细胞可以进一步包含对一种或多种内源基因的破坏。在一些实施方案中，内源基因编码TCRα、TCRβ、CD52、糖皮质激素受体(GR)、脱氧胞苷激酶(dCK)或免疫检查点蛋白(诸如程序性死亡-1(PD-1))。
[0201] 对实体瘤的功效
[0202] 可以进一步修饰本发明的CAR和表达这些CAR的细胞以提高针对实体瘤的功效。这种增加的功效可以通过肿瘤细胞毒性、肿瘤浸润和对肿瘤免疫抑制介体的逃避或抗性的增加来测量。在一些实施方案中，增强的抗肿瘤功效可以通过增加的TCR信号传导、增加的细胞因子释放、增强的肿瘤细胞杀伤、增加的已建立肿瘤的T细胞浸润、改善的肿瘤运输、减弱的肿瘤诱导的功能减退以及改善的迁移和趋化性来表征。
[0203] 在一个方面，进一步修饰CAR表达细胞以逃避或中和免疫抑制介体的活性，免疫抑制介体包括但不限于前列腺素E2(PGE2)和腺苷。在一些实施方案中，这种逃避或中和是直接的。在其他实施方案中，这种逃避或中和是通过用一种或多种结合配偶体(例如埃兹蛋白)抑制蛋白激酶A(PKA)来介导的。在一个具体实施方案中，表达CAR的细胞进一步表达肽“调节性亚基I锚定破坏物”(RIAD)。RIAD被认为抑制蛋白激酶A(PKA)与埃兹蛋白的结合，因此阻止PKA介导的TCR激活抑制(Newick等人，Cancer Res 2016年8月；76(15增刊)：摘要nr B27)。
[0204] 在一些实施方案中，本发明的CAR表达细胞可以诱导与表位扩散一致的广泛抗肿瘤免疫响应。
[0205] 在一些实施方案中，本发明的CAR表达细胞还包含归巢机制。例如，细胞可以转基因地表达一种或多种刺激性趋化因子或细胞因子或其受体。在特定的实施方案中，对细胞进行遗传修饰以表达一种或多种刺激性细胞因子。在某些实施方案中，使用一种或多种归巢机制以使本发明的细胞对抑制性肿瘤微环境具有抗性。在一些实施方案中，CAR表达细胞被进一步修饰以在CAR激活后释放诱导型细胞因子，例如以吸引或激活先天免疫细胞到所靶向的肿瘤(所谓的第四代CAR或TRUCKS)。在一些实施方案中，CAR可以共表达归巢分子(例如CCR4或CCR2b)，以增加肿瘤运输。
[0206] 控制CAR表达
[0207] 在一些情况下，调节CAR或CAR表达细胞CAR的活性可为有利的。例如，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶诱导细胞凋亡(参见例如Di等人，N Engl.J.Med.2011年11月3日；365(18):1673-1683)，可以用作本发明CAR疗法中的安全开关。在另一个实例中，CAR表达细胞还可以表达可诱导的半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，该可诱导的半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))后导致激活半胱天冬酶-9和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有二聚化(CID)结合结构域的化学诱导物，该二聚化(CID)结合结构域在CID存在下介导二聚化。这导致CAR表达细胞的诱导性和选择性消耗。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可提供安全开关，以避免CAR表达细胞的任何毒性。参见例如Song等人，Cancer Gene Ther.2008；15(10):667-75；；Clinical Trial
Id.No.NCT02107963；和Di Stasi等人，N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
Id.No.NCT02107963；和Di Stasi等人，N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
[0208] 用于调节本发明的CAR治疗的替代策略包括利用灭活或关闭CAR活性的小分子或抗体，例如通过耗尽CAR表达细胞、例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白αvβ3、α4、αI3/4β3、α4β7、α5β1、αvβ3、αv)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但在细胞质结构域内缺少一个或多个区域的形式)。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，该截短的表皮生长因子受体(EGFR)缺乏信号传导能力但保留了由能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗 )识别的表位，从而施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后
耗尽CAR表达细胞(参见例如WO2011/056894，和Jonnalagadda等人，Gene Ther.2013；20(8)
853-860)。
耗尽CAR表达细胞(参见例如WO2011/056894，和Jonnalagadda等人，Gene Ther.2013；20(8)
853-860)。
[0209] 在一些实施方案中，CAR细胞包含编码自杀多肽(例如RQR8)的多核苷酸。参见例如WO2013153391A，该专利的全部内容由此以引用方式并入。在包含多核苷酸的CAR细胞中，自杀多肽可以在CAR细胞的表面表达。自杀多肽还可以在氨基末端包含信号肽。另一种策略包括表达高度紧密的标记/自杀基因，该高度紧密的标记/自杀基因结合来自本文所述的CAR表达细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位，所述靶表位结合利妥昔单抗，从而(例如通过ADCC)导致CAR表达细胞的选择性耗尽(参见例如Philip等人，Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于耗尽本文所述的CAR表达细胞的其他方法包括施用CAMPATH，CAMPATH是选择性结合并靶向成熟淋巴细胞(例如CAR表达细胞)以例如通过诱导ADCC进行破坏的单克隆抗CD52抗体。在其他实施方案中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性靶向CAR表达细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少CAR表达细胞的数量。在其他实施方案中，CAR配体(例如抗独特型抗体)可以与诱导细胞杀伤的剂(例如毒素)偶联，从而减少CAR表达细胞的数量。或者，CAR分子本身可以配置成使得活性可以被调节，例如打开和关闭，如下所述。
[0210] 在一些实施方案中，需要可调节CAR活性的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。在一些实施方案中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域，被分隔在单独的多肽或成员上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，所述二聚化开关在二聚化分子存在下可以使多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。本文和国际公开号WO 2015/090229中提供了此类可调节CAR的另外的描述和示例性构造，该国际公开的全部内容由此以引用方式并入。
[0211] 在一个方面，RCAR包含两个多肽或构件：1)细胞内信号传导构件，其包含细胞内信号传导结构域(例如本文所述的原代细胞内信号传导结构域)，和第一开关结构域；2)抗原结合构件，其包含抗原结合结构域和第二开关结构域，该抗原结合结构域例如如本文所述特异性结合本文所述的肿瘤抗原。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域可以设置在细胞内信号传导构件上，在抗原结合构件上，或两者上。除非另有说明，否则当在此描述RCAR的构件或元件时，顺序可以如所提供的那样，但也包括其他顺序。换句话说，在一个实施方案中，顺序如文中所述，但在其他实施方案中，顺序可以是不同的。例如，跨膜区一侧上的元件的顺序可以与实例不同，例如，开关结构域相对于细胞内信号传导结构域的放置可以是不同的，例如相反的。
[0212] 在一些实施方案中，表达CAR的免疫细胞可以仅瞬时表达CAR。例如，可以用包含编码本发明CAR的核酸序列的mRNA转导本发明的细胞。在这种情况下，本发明还包括可以直接转染到细胞中的RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法包括用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后加入聚A以产生构建体，该构建体含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和聚A尾，通常长度为50-2000个碱基。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导入细胞。
[0213] 靶特异性
[0214] 本发明的CAR表达细胞可以进一步包含一种或多种另外的CAR。这些额外的CAR可以是或可以不是TIM-1特异性的。在一些实施方案中，一种或多种另外的CAR可以充当抑制或激活CAR。在一些方面，靶向TIM-1的CAR是刺激性或激活CAR；在其他方面，其是共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,2013年12月；5(215):215ra172)，例如这样的CAR，所述CAR识别除了TIM-1以外的抗原，由此通过靶向TIM-1的CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体的结合而被减少或抑制，例如以减少脱靶效应。
[0215] 在一些实施方案中，本发明的CAR表达细胞可以进一步包含一种或多种另外的CAR，所述一种或多种另外的CAR可以靶向选自以下的组的一种或多种抗原：BCMA；BCR-Ab1；BST2；CAIX；CD19；CD20；CD22；CD123；CD171；CD30；CD33；CD38；CD44v6；CD44v7/8；CEA；CLL-
1；EGFRvIII；EGP-2；EGP-40；ERBB2(Her2/neu)；EPCAM；新生乙酰胆碱受体；FBP；FLT3；叶酸受体α；GD2；GD3；Her3(ErbB3)；Her4(ErbB4)；k-轻链；KDR；MAD-CT-1；MAD-CT-2；MAGE-A1；
MARTI；ML-IAP；MYCN；癌胚抗原(h5T4)；NKG2D配体PDK1；PDL1；PSCA；PSMA；PRSS21；ROR1；
SLAMF7；TAG-72；Tn Ag；TSLPR；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；IL-13Ra2；间皮素；IL-11Ra；
VEGFR2；LeY；CD24；PDGFR-β；SSEA-4；CD20；MUC1；EGFR；NCAM；前列腺酶；PAP；ELF2M；肝配蛋白B2；FAP；IGF-I受体；CAFX；LMP2；gpl00；酪氨酸酶；EphA2；岩藻糖基GM1；sLe；神经节苷脂GM3；TGS5；HMWMAA；OAcGD2；OR51E2；叶酸受体β；TEM1/CD248；TEM7R；CLDN6；TSHR；GloboH；
GPR20；GPRC5D；CXORF61；CD97；CD179a；ADRB3；ALK；聚唾液酸；PANX3；PLAC1；NY-BR-1；NY-ESO-1；UPK2；TIM-1；HAVCRl；LY6K；TARP；WT1；LAGE-la；ETV6-AML；SPA17；XAGE1；Tie 2；Fos相关抗原1；p53；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；幸存(surviving)；端粒酶；
PCTA-1；大鼠肉瘤Ras突变体；hTERT；肉瘤易位断点；ERG；NA17；PAX3；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；RhoC；TRP-2；CYP1B1；BORIS、SART3；PAX5；OY-TES1；LCK；AKAP-4；SSX2；RAGE-1；RU1；
RU2；人豆荚蛋白(legumain)；HPV E6；HPV E7；肠羧酸酯酶；mut hsp70-2；CD79a；CD79b；
CD72；LAIR1；CD89；LILRA2；CD300LF；CLEC12A；EMR2；FCRL5；GPC3；IGLL1；以及LY75。
1；EGFRvIII；EGP-2；EGP-40；ERBB2(Her2/neu)；EPCAM；新生乙酰胆碱受体；FBP；FLT3；叶酸受体α；GD2；GD3；Her3(ErbB3)；Her4(ErbB4)；k-轻链；KDR；MAD-CT-1；MAD-CT-2；MAGE-A1；
MARTI；ML-IAP；MYCN；癌胚抗原(h5T4)；NKG2D配体PDK1；PDL1；PSCA；PSMA；PRSS21；ROR1；
SLAMF7；TAG-72；Tn Ag；TSLPR；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；IL-13Ra2；间皮素；IL-11Ra；
VEGFR2；LeY；CD24；PDGFR-β；SSEA-4；CD20；MUC1；EGFR；NCAM；前列腺酶；PAP；ELF2M；肝配蛋白B2；FAP；IGF-I受体；CAFX；LMP2；gpl00；酪氨酸酶；EphA2；岩藻糖基GM1；sLe；神经节苷脂GM3；TGS5；HMWMAA；OAcGD2；OR51E2；叶酸受体β；TEM1/CD248；TEM7R；CLDN6；TSHR；GloboH；
GPR20；GPRC5D；CXORF61；CD97；CD179a；ADRB3；ALK；聚唾液酸；PANX3；PLAC1；NY-BR-1；NY-ESO-1；UPK2；TIM-1；HAVCRl；LY6K；TARP；WT1；LAGE-la；ETV6-AML；SPA17；XAGE1；Tie 2；Fos相关抗原1；p53；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；幸存(surviving)；端粒酶；
PCTA-1；大鼠肉瘤Ras突变体；hTERT；肉瘤易位断点；ERG；NA17；PAX3；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；RhoC；TRP-2；CYP1B1；BORIS、SART3；PAX5；OY-TES1；LCK；AKAP-4；SSX2；RAGE-1；RU1；
RU2；人豆荚蛋白(legumain)；HPV E6；HPV E7；肠羧酸酯酶；mut hsp70-2；CD79a；CD79b；
CD72；LAIR1；CD89；LILRA2；CD300LF；CLEC12A；EMR2；FCRL5；GPC3；IGLL1；以及LY75。
[0216] 在一些实施方案中，本发明CAR的抗原结合结构域是经过亲和力调节的。具体地，调节抗TIM-1 CAR抗原结合结构域的亲和力以区分过表达TIM-1的细胞(例如肿瘤细胞)与在生理水平表达TIM-1的正常组织。这可以通过例如使用靶抗原亲和力变化超过三个数量级的表达CAR的T细胞来实现(Liu等人，Cancer Res 2015年9月；75(17):3596-607)。另外，体内异种移植模型可用于评估经亲和力调节的抗TIM-1 CAR对正常人组织的毒性(Johnson等人，Sci Transl Med 2015年2月；7(275):275ra22)。
[0217] 在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域是免疫缀合物或是免疫缀合物的一部分，其中抗原结合结构域与一种或多种异源分子缀合，所述异源分子为例如但不限于细胞毒性剂、成像剂、可检测部分多聚化结构域或其他异源分子。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或酶活性毒素。在一些实施方案中，抗原结合结构域与一种或多种细胞毒性剂缀合，该一种或多种细胞毒性剂为例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
[0218] 其他
[0219] 在一些实施方案中，可以进一步遗传修饰本发明的CAR表达细胞以表达转化生长因子(TGF)β受体(DNR)的显性负性形式。
[0220] 在另一个实施方案中，CAR表达细胞可以对另一种抗原有特异性，所述另一种抗原在某些情况下包括肿瘤抗原。在一些实施方案中，可以选择转化的宿主细胞对一种或多种强病毒抗原的特异性，或者宿主细胞可以经转化以显示对这些抗原的特异性。在具体的实施方案中，细胞是pp65CMV特异性T细胞、CMV特异性T细胞、EBV特异性T细胞、水痘病毒特异性T细胞、流感病毒特异性T细胞和/或腺病毒特异性T细胞。
[0221] 为了增加持久性，可以进一步修饰本发明的细胞以过表达促存活信号、逆转抗存活信号、过表达Bcl-xL、过表达hTERT、缺乏Fas，或表达TGFβ显性负性受体。细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的施用也可以促进持久性。
[0222] 载体
[0223] 本发明还提供了插入本发明DNA的载体。来源于逆转录病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为除了具有灵活的基因组外，它们还允许遗传稳定性和高表达。此外，逆转录病毒载体的临床经验为优化其使用中的功效和安全性提供了指导。
[0224] 简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接，并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可适用于真核生物的复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
[0225] 本发明的表达构建体也可用于使用标准基因递送方案进行核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,
466，该等专利的全部内容以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
466，该等专利的全部内容以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
[0226] 可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
[0227] 此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、γ逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点，启动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种选择性标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0228] 已经开发了许多基于病毒的系统来用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并递送至受试者的体内或离体细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是pFSG或pFB。
[0229] 另外的启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，这些另外的启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时启动子功能被保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎单独元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
[0230] 可以使用各种启动子序列，包括但不限于立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、伸长生长因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、艾普斯登-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够启动多核苷酸序列表达的分子开关，该分子开关当需要此类表达时可操作地连接，或者当不需要所述表达时关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0231] 为了评定CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可含有选择性标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体进行转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可以携带在单独的一段DNA上并用于共转染过程。选择性标记和报告基因都可以侧接有适当的调控序列以实现在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
[0232] 在一个优选实施方案中，选择性标记基因包含编码截短的CD19(tCD19)的核酸序列。
[0233] 报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调控序列的功能。通常，报告基因是这样的基因，所述基因不存在于接受者生物体或组织中或由所述受体生物体或组织表达，并且编码这样的多肽，所述多肽的表达表现为一些易于检测的性质，诸如酶活性。在DNA已经导入接受者细胞后适当时间时测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶，分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，具有显示出最高水平的报告基因表达的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0234] 转导
[0235] 将基因导入细胞并将其表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地导入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转入宿主细胞中。
[0236] 用于将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域中熟知的。例如参见Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸导入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
[0237] 用于将所关注的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA载体和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人细胞)中的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒，等等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0238] 用于将多核苷酸导入宿主细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒；以及基于脂质的体系，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体体系是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
[0239] 在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸导入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、含有胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或“塌缩”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，从而可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，该脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类别。
[0240] 适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得；二鲸蜡醇磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20摄氏度下储存。氯仿用作唯一的溶剂是因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体的特征可为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有通过水性介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并将水和溶解的溶质捕获在脂质双层之间(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5:505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
[0241] 无论用于将外源核酸导入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定法来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的剂。
[0242] 本发明的细胞
[0243] 还提供了细胞、细胞群和含有所述细胞的组合物，例如，包含编码抗TIM-1嵌合抗原受体的核酸序列的细胞。在这些组合物中有用于施用(诸如用于过继性细胞疗法)的药物组合物和制剂。还提供了将细胞和组合物施用于受试者(例如患者)的治疗方法。
[0244] 细胞类型
[0245] 因此还提供了表达抗TIM-1 CAR的细胞。细胞通常是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞，更通常地是原代人细胞，例如同种异体或自体同源的供体细胞。用于导入CAR的细胞可以从样品中分离，所述样品为例如生物样品，例如从受试者获得或来源于受试者的样品。在一些实施方案中，细胞分离自的受试者是患有疾病或疾患的受试者或需要细胞疗法的受试者或将施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预的人，所述特定治疗干预为例如过继性细胞疗法，对于过继性细胞疗法，细胞被分离、处理和/或工程化。在一些实施方案中，细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，诸如先天或适应性免疫系统的细胞，例如骨髓或淋巴的细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多能干细胞和多潜能干细胞，包括诱导的多潜能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型(诸如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群)的一个或多个亚群，诸如按照功能、激活状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌谱和/或分化程度定义的那些亚群。
[0246] 关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体同源的。方法中包括现成的方法。在一些方面，例如对于现有技术，细胞是多潜能的和/或多能的，诸如干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)，或缺乏T细胞受体功能或被工程化为缺乏T细胞受体功能的T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括如本文所述从受试者中分离细胞、制备、加工、培养和/或工程化它们，并在冻存之前或之后将它们重新导入同一患者体内。
[0247] T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群中有初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(例如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)，或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞及δ/γT细胞。
[0248] 在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，等等。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
[0249] 在一些实施方案中，细胞来源于细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物及猪。
[0250] 细胞采集
[0251] 在扩增和遗传修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织及肿瘤。在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员可获得和已知的任何数量的T细胞系。在一些实施方案中，细胞可以来源于健康供体、来自被诊断患有癌症的患者、来自被诊断患有自体免疫或炎性疾病的患者，或来自被诊断具有感染的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。
[0252] 因此，一些实施方案中的细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、液体和其他样品以及来自一个或多个加工步骤的样品，所述一个或多个加工步骤为例如分离、离心、基因工程(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。生物样品可以是直接从生物来源或被处理的样品获得的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括来源于它们的加工样品。
[0253] 在一些方面，细胞来源于或分离自的样品是血液或血液来源的样品，或者是单采血液成分法产品或白细胞去除术产品，或者来源于单采血液成分法产品或白细胞去除术产品。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或来源于上述的细胞。在细胞疗法(例如过继性细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体同源和同种异体来源的样品。
[0254] 在一些实例中，来自受试者的循环血液的细胞是例如通过单采血液成分法或白细胞去除术获得的。样品在一些方面含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板；并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
[0255] 本文还提供了从根据任何上述方法的转化细胞获得的细胞系。本文还提供了对免疫抑制治疗具有抗性的经修饰细胞。在一些实施方案中，根据本发明的分离的细胞包含编码CAR的多核苷酸。
[0256] 细胞纯化
[0257] 在一些实施方案中，细胞的分离包括一种或多种基于制备和/或非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，将细胞洗涤、离心，和/或在一种或多种试剂的存在下孵育，例如以去除不需要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质分离细胞，该一种或多种性质为例如密度、粘附性质、大小、灵敏度和/或对特定组分的抗性。
[0258] 在一些实施方案中，将从受试者收集的血细胞洗涤，例如以去除血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，所述生物相容性缓冲液为诸如不含Ca++/Mg++的PBS。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0259] 在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(诸如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一个具体实施方案中，表面标记是tCD19。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于这种标记的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面分离包括基于细胞的表达或一种或多种标记(通常是细胞表面标志)的表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性结合此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和将已经结合所述抗体或结合配偶体的细胞与未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞分离。
[0260] 这种分离步骤可以基于阳性选择，在所述阳性选择中保留已经结合试剂的细胞以供进一步使用；和/或阴性选择，在所述阴性选择中保留未与抗体或结合配偶体结合的细胞。在一些实例中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，当没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离时，阴性选择可为特别有用的。
[0261] 在一些实施方案中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，诸如后续的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，诸如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起孵育，所述多种抗体或结合配偶体中的每一者对靶向阴性选择的标记有特异性。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
[0262] 例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，诸如对于一种或多种表面标记为阳性的或表达高水平的一种或多种表面标记的细胞，所述细胞为例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。例如，可以使+用CD3缀合的磁珠(例如， M-450 CD3/CD28T细胞扩增仪)来扩增CD3T细
胞。
胞。
[0263] 在一些实施方案中，通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗尽特定细胞群，以进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来实现，所述抗体或其他结合剂特异性结合分别在所述阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记。
[0264] 在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(例如B细胞、单核细胞)或其他白细胞(例如CD14)上表达的标记，将T细胞从PBMC样品中分离。在一些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高水平表达的标记进行阳性或阴性选择，可以将这种CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
[0265] 在一些实施方案中，对CD8+细胞进一步富集或耗尽初始、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞富集以增强功效，诸如以改善施用后的长期存活率、扩增和/或移植，所述长期存活率、扩增和/或移植在一些方面在此类亚群中为特别稳健的。参见Terakura等人，(2012)Blood.1:72-82；Wang等人，(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞进一步增强了功效。
[0266] 在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。PBMC可以富集或耗尽CD62L- CD8+和/或CD62L+CD8级分，诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体。
[0267] 在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集为基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，其为基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，分离富集TCM细胞的CD8+群体是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，以及对表达CD62L的细胞进行阳性选择或富集而进行的。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞富集是用基于CD4表达选择的阴性细胞级分开始进行的，所述阴性细胞级分经受基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。此类选择在一些方面是同时进行的，并且在其他方面为以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分都被保留并在方法的后续步骤中使用，任选地在一个或多个其他阳性或阳性选择步骤之后使用。
[0268] 在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料一起孵育，所述小的可磁化或磁响应材料为例如磁响应颗粒或微粒，诸如顺磁珠粒(例如，诸如Dyna珠粒或MACS珠粒)。磁响应材料，例如颗粒，通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如抗体)，所述结合配偶体特异性结合存在于需要分离的(例如需要阴性或阳性选择的)一个或多个细胞或细胞群上存在的分子(例如表面标记)。
[0269] 在一些实施方案中，磁性颗粒或珠粒包含与特异性结合构件(诸如抗体或其他结合配偶体)结合的磁性响应材料。在磁性分离方法中使用了许多众所周知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday，美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342 B中描述的那些磁性颗粒，所述专利据此以引用方式并入。胶体大小的颗粒，诸如在Owen的美国专利号4,795,698和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些，是其他实例。
[0270] 孵育通常在这样的条件下进行，凭借所述条件，抗体或结合配偶体或分子(诸如二抗或其他试剂，所述二抗或其他试剂特异性结合附接至磁性颗粒或珠粒的此类抗体或结合配偶体)，特异性结合样品中细胞上的细胞表面分子(如果存在的话)。
[0271] 在一些方面，将样品置于磁场中，具有附接于其上的磁响应颗粒或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引到磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在相同的选择步骤期间进行阳性选择和阴性选择的组合，其中保留阳性级分和阴性级分并进一步处理或进行进一步的分离步骤。
[0272] 在某些实施方案中，将磁响应颗粒包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对特异于一种或多种标记的一抗进行包被而附接至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠粒，然后加入用细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
[0273] 在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附接至随后将被孵育、培养和/或工程化的细胞；在一些方面，颗粒保持附接至要施用于患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化颗粒或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体，等等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
[0274] 在某些实施方案中，使用进行方法的分离、细胞制备、分离、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一种或多种步骤的系统、装置或设备来进行分选或分离。在一些方面，该系统用于在封闭或无菌环境中执行这些步骤中的每一个步骤，例如以最小化错误、用户处理和/或污染。在一个实例中，该系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中描述的系统。
[0275] 在一些实施方案中，系统或设备在集成系统或独立系统中和/或以自动或可编程方式执行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个步骤，例如全部步骤。在一些方面，该系统或设备包括与系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，该计算机和/或计算机程序允许用户编程、控制、评定处理、分离、工程化和配置步骤的结局和/或调整所述处理、分离、工程化和配置步骤的各个方面。
[0276] 在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群，在所述流式细胞术中在流体流中运载针对多个细胞表面标记染色的细胞。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)-分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统的组合来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人，(2008)J Biophoton.1(5):355-376。在两种情况下，细胞都可以用多种标记标记，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞亚群。
[0277] 在一些实施方案中，将抗体或结合配偶体用一种或多种可检测标记物标记，以促进阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，在流体流中进行基于对一种或多种细胞表面标记有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合的细胞分离，诸如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片)例如与流式细胞检测系统的组合进行分离。这些方法允许基于多个标记同时进行阳性和阴性选择。
[0278] 在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞从外周血制备白细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心。
[0279] 在任何上述分离步骤中，分离不需要导致100％富集或去除表达特定标记的特定细胞群或细胞。例如，特定类型细胞(诸如表达标记的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，而不需要导致完全不存在不表达标记的细胞。同样，特定类型细胞(诸如表达标记的细胞)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，而不需要导致所有此类细胞的完全去除。
[0280] 细胞制备和扩增
[0281] 在一些实施方案中，提供的方法包括培育(cultivation)、孵育、培养(culture)和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育和/或工程化耗尽的细胞群的方法和培养起始组合物。
[0282] 因此，在一些实施方案中，将细胞群在培养起始组合物中孵育。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器为例如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。
[0283] 在一些实施方案中，在基因工程之前或与基因工程结合地孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。
[0284] 在一些实施方案中，将组合物或细胞在刺激条件或刺激剂的存在下孵育。此类条件包括被设计用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活、用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程(例如导入重组抗原受体)的条件。本发明的细胞可以在对所述细胞进行基因修饰之前或之后，使用如通常例如但不限于在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,
172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法进行激活和扩增。所述条件可包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子)和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体)以及被设计用于激活细胞的任何其他剂。
172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法进行激活和扩增。所述条件可包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子)和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体)以及被设计用于激活细胞的任何其他剂。
[0285] T细胞可以在体外或体内扩增。通常，本发明的T细胞可以例如通过以下方式扩增：与刺激T细胞表面上的CD3TCR复合物和共刺激分子的剂接触以产生T细胞的激活信号。例如，化学物质(诸如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或如植物凝集素(PHA)的有丝分裂凝集素)可用于产生T细胞的激活信号。
[0286] 在一些实施方案中，T细胞群体可以通过以下方式体外刺激：与例如抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)与钙离子载体的结合接触。在一些实施方案中，可以通过与鼠源CD3单克隆抗体(Muromonab-CD3)(OKT3)接触来体外刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合所述辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基(Minimal Essential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo 5，(Lonza))，所述适当的培养基可含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-
2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、IL-21、TGFp和TNF，或本领域技术人员已知的任何其他用于细胞生长的添加剂。在一个优选实施方案中，通过暴露于OKT3和IL-2来体外刺激T细胞。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉及还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包含RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，为无血清的或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在要注入受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件(例如，适当的温度(例如，37摄氏度)和大气(例如，空气加5％CO2))下。已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。
2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、IL-21、TGFp和TNF，或本领域技术人员已知的任何其他用于细胞生长的添加剂。在一个优选实施方案中，通过暴露于OKT3和IL-2来体外刺激T细胞。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉及还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包含RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，为无血清的或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在要注入受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件(例如，适当的温度(例如，37摄氏度)和大气(例如，空气加5％CO2))下。已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。
[0287] 在一些实施方案中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增本发明的分离的细胞。细胞也可以在体内扩增，例如在将所述细胞施用于受试者后在受试者的血液中扩增。
[0288] 在一些实施方案中，通过以下方式来扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(例如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5个、10个、20个，或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，达足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ-照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德(rad)范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
[0289] 在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如冻存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻并随后解冻的步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除细胞群中的单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮于冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用各种已知冷冻溶液和参数中的任何一种冷冻溶液和参数。一个实例涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基1:1稀释，使DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以每分钟1度的速率冷冻至-80摄氏度，并储存在液氮储罐的气相中。
[0290] 治疗应用
[0291] 通过上述方法获得的分离细胞，或来源于此类分离的细胞的细胞系，可用作治疗受试者的疾病、病症或疾患的药物。在一些实施方案中，此类药物可用于治疗癌症。
[0292] 细胞起源
[0293] 出于本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群，细胞可以是对受试者异种的、同种异体的或自体同源的细胞。通常，细胞对受试者是自体同源的。
[0294] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，例如过继性T细胞疗法)通过自体移植进行，在所述自体移植中从要接受所述细胞疗法的受试者分离和/或以其他方式制备细胞，或者从来源于该受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且将所述细胞在分离和处理后施用于同一受试者。
[0295] 在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，例如过继性T细胞疗法)通过同种异体移植进行，在所述同种异体移植中从除了要接受所述细胞疗法或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类或超型。
[0296] 受试者
[0297] 本文提及的受试者可以是任何活的受试者。在一个优选实施方案中，受试者是哺乳动物。本文提到的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，诸如兔。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪类(猪)；或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马类(马)。哺乳动物可为灵长目、猿(Ceboids)目或猴(Simoids)目(猴子)或类人目(Anthropoids)(人和类人猿)。
[0298] 在一些实施方案中，施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，例如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以为任何合适的年龄，包括婴儿、青少年、青年、成人和老年受试者。在一些实例中，患者或受试者是用于疾病、过继性细胞疗法和/或用于评定毒性结局(诸如细胞因子释放综合征(CRS))的经验证的动物模型。
[0299] 在一些实施方案中，例如在用另一种免疫疗法和/或其他疗法(包括化学疗法、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT)治疗后，受试者具有持续或复发的疾病。在一些实施方案中，尽管受试者已经变成对另一种疗法具有抗性，但施用有效地治疗了所述受试者。在一些实施方案中，受试者未复发但被确定具有复发风险，诸如高复发风险，因此预防性地施用所述化合物或组合物，例如以降低复发的可能性或预防复发。
[0300] 在一些实施方案中，所述方法包括将CAR表达细胞或含有所述细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，诸如患有与TIM-1表达相关的疾病、病症或疾患，具有患与TIM-1表达相关的疾病、病症或疾患风险或怀疑患有与TIM-1表达相关的疾病、病症或疾患的受试者。在一些实施方案中，例如通过过继性细胞疗法，诸如过继性T细胞疗法，将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或疾患的受试者。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有疾病或疾患或具有该疾病或疾患风险的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗(例如，改善)疾病或疾患的一种或多种症状，诸如通过减轻表达TIM-1的癌症中的肿瘤负荷。
[0301] 功能活性
[0302] 在一个实施方案中，本发明包括一种类型的细胞疗法，其中对分离的细胞进行基因修饰以表达抗TIM-1 CAR，并将CAR细胞输注到需要的受试者中。这种施用可以以TIM-1靶向的方式促进细胞激活(例如，T细胞激活)，使得疾病或病症细胞为被靶向进行破坏的。在细胞是T细胞的情况下，与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，从而导致长期持久性，该长期持久性可能导致对TIM-1相关疾病、病症或疾患的持续控制。
[0303] 在一个实施方案中，本发明的分离的细胞可以经历体内扩增并且可以持续延长量的时间。在另一个实施方案中，当分离的细胞是T细胞时，本发明的分离的T细胞进化成特异性记忆T细胞，该特异性记忆T细胞可以被重新激活以抑制任何另外的TIM-1表达细胞生长。在遇到并后续消除表达替代抗原的靶细胞时，CAR T细胞可在体内分化成中枢记忆样状态。
[0304] 不希望受任何特定理论的束缚，由分离的CAR修饰的免疫细胞引发的抗肿瘤免疫响应可以是主动或被动免疫响应。此外，CAR介导的免疫响应可以是过继性免疫治疗方法的一部分，在所述过继性免疫治疗方法中CAR修饰的免疫细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域有特异性的免疫响应。
[0305] 在某些实施方案中，以任何数量的方式修饰CAR表达细胞，使得所述CAR表达细胞的治疗或预防功效增强。例如，CAR可以直接地或通过接头间接地缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR)与靶向部分缀合的实践是本领域中已知的。参见例如Wadhwa等人，J.Drug Targeting 1995；3(2):111-127和美国专利号5,087,616。
[0306] 在一些方面，一旦将细胞施用于受试者(例如，人)，就通过许多已知方法中的任何方法来测量工程化的细胞群和/或抗体的生物活性。待评定的参数包括工程化的或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原的体内(例如通过成像评定)或离体(例如通过ELISA或流式细胞术评定)特异性结合。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法测量工程化的细胞破坏靶细胞的能力，所述任何合适的方法为例如在Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人，Immunological Methods,285(1):
25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施方案中，细胞的生物学活性也可以通过测定某些细胞因子的表达和/或分泌来测量，所述细胞因子为例如GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、CD107a，或IL-2。
25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施方案中，细胞的生物学活性也可以通过测定某些细胞因子的表达和/或分泌来测量，所述细胞因子为例如GM-CSF、IL-6、RANTES(CCL5)、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、CD107a，或IL-2。
[0307] 在一些方面，通过评定临床结局来测量生物活性，诸如肿瘤负荷或负载的减少、肿瘤的稳定化、无进展存活率，或总体存活率。
[0308] 靶细胞
[0309] 可以治疗的癌症包括未血管化或尚未显著血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可包括实体瘤。要用本发明的CAR治疗的癌症的类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良恶性肿瘤，以及恶性肿瘤(例如，肉瘤、癌和黑素瘤)。还包括成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
[0310] 血液系统癌症是血液癌或骨髓癌。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
[0311] 实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。诸如肉瘤和癌的实体瘤的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、成胶质细胞瘤(又称多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移瘤)。
[0312] 优选地，本发明的CAR表达细胞用于治疗肿瘤细胞对表面TIM-1表达呈阳性的癌症。具体地，本发明的细胞可用于治疗TIM-1阳性卵巢癌、肾细胞癌和肺癌。通常，可以通过已知方法鉴定TIM-1阳性肿瘤细胞。例如，可以使用抗TIM-1抗体，通过免疫荧光或流式细胞术来鉴定肿瘤细胞上的TIM-1表达。或者，可以通过对靶细胞的CAR细胞毒性来在功能上测量TIM-1表达。
[0313] 测试CAR的识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域已知的。例如，Clay等人，J.Immunol.,163:507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)或白细胞介素2(IL-2))释放的方法。另外，如Zhao等人，J.Immunol.,174:4415-4423(2005)中所述，可以通过测量细胞的细胞毒性来评估CAR功能。
[0314] 活组织检查是从个体取出组织和/或细胞。这种取出可以是从个体收集组织和/或细胞，以便对取出的组织和/或细胞进行实验。该实验可以包括确定个体是否患有和/或正遭受某种疾患或疾病状态的实验。疾患或疾病可以是例如癌症。关于检测宿主中表达TIM-1的肿瘤细胞的存在，包含宿主细胞的样品可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的一部分的样品，例如核或细胞质级分、完整蛋白质级分或核酸级分。如果样品包含全细胞，则所述细胞可以是宿主的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
[0315] 其他靶
[0316] 本发明的CAR，特别是本发明的CAR表达免疫细胞，也可用于治疗、预防或诊断涉及在健康或患病细胞中表达TIM-1的任何其他疾患、病症或疾病。例如，本发明还考虑了在受试者中治疗或预防免疫功能障碍、特应性皮炎、过敏、类风湿性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、甲型肝炎病毒感染、埃博拉病毒感染、登革热病毒感染、气管疾病、或角膜和结膜疾病的方法，所述方法包括施用根据本发明的表达CAR的细胞。例如，由于TIM-1的粘蛋白结构域中的六个氨基酸插入与对特应性疾病的保护有关，本发明考虑施用表达靶向TIM-1的粘蛋白结构域的CAR的细胞作为治疗或预防特应性疾病的方法。
[0317] 施用模式
[0318] 本发明的组合物可以多种方式施用，具体取决于是需要局部治疗还是全身治疗。
[0319] 在过继性细胞疗法的情况下，施用用于过继性细胞疗法的细胞的方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)中。参见例如Themeli等人，(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人，(2013)Biochem Biophys Res Commun
438(1):84-9；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
438(1):84-9；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
[0320] 通常，施用可以是局部、肠胃外或肠内施用。
[0321] 本发明的组合物通常适用于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征如下的任何施用途径：对受试者的组织进行物理开口并通过组织中的所述开口施用药物组合物，由此通常导致直接施用于血流中、肌肉中，或内脏器官中。因此，肠胃外施用包括但不限于通过以下方式施用药物组合物：注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物，等等。具体地，预期肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、滑膜内注射或输注；以及肾脏透析输液技术。在一个优选实施方案中，肠胃外施用本发明的组合物包括皮下或腹膜内施用。
[0322] 适于肠胃外施用的药物组合物的制剂通常一般包含活性成分与药学上可接受的载体(诸如无菌水或无菌等渗盐水)的组合。此类制剂可以以适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂量形式制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂、乳剂，糊剂，等等。此类制剂还可包含一种或多种另外的成分，所述一种或多种另外的成分包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，以用于在用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构之后肠胃外施用重构的组合物。肠胃外制剂还包括水溶液，所述水溶液可含有赋形剂(诸如盐、碳水化合物)和缓冲剂(优选pH为3至9)，但是对于一些应用，肠胃外制剂可更适合地配制成无菌非水溶液，或配制成干燥形式以与合适的媒介物(诸如无菌无热原水)一起使用。示例性肠胃外施用形式包括在无菌水溶液(例如，丙二醇水溶液或葡萄糖水溶液)中的溶液剂或混悬剂。如果需要的话，则可以适当地缓冲此类剂型。其它可肠胃外施用的可用制剂包括包含微晶形式的活性成分或在脂质体制备物中的制剂。用于肠胃外施用的制剂可以配制成立即释放和/或改良释放。改良释放制剂包括延迟释放、缓释、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。
[0323] 术语“口服的”、“肠内的”、“肠内地”、“口服地”、“非肠胃外的”、“非肠胃外地”等是指通过沿着消化道的途径或模式向个体施用化合物或组合物。组合物的“口服”施用途径的实例包括但不限于从口腔吞咽液体或固体形式的组合物、通过鼻空肠管或胃造口管施用组合物、十二指肠内施用组合物，以及直肠施用(例如，使用用于消化道的肠道下段的栓剂)。
[0324] 优选地，包含分离的TIM-1 CAR表达细胞的配制组合物适于通过注射施用。
[0325] 用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂、半固体剂、单相组合物、多相组合物(例如，水包油、油包水)、泡沫剂、微海绵、脂质体、纳米乳剂、气溶胶泡沫剂、聚合物、富勒烯及粉末剂。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可为必需的或期望的。
[0327] 用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液也可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂(诸如但不限于渗透促进剂、梳理化合物(carder compound)和其他药学上可接受的载体或赋形剂)。
[0328] 本发明的药物组合物包括但不限于溶液剂、乳剂及含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，所述多种组分包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。
[0329] 可以方便地以单位剂型存在的本发明的药物组合物可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂缔合的步骤。通常，通过以下步骤来制备制剂：将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地缔合，然后(如果需要的话)将产品成形。
[0330] 本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，诸如但不限于片剂、胶囊剂、液体糖浆、软凝胶、栓剂、气溶胶及灌肠剂。本发明的组合物还可以配制成水性、非水性或混合介质中的混悬剂。水性混悬剂还可以含有增加混悬剂的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬剂也可含有稳定剂。
[0331] 在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以配制并用作泡沫剂。药物泡沫剂包括制剂，诸如但不限于乳剂、微型乳剂、乳膏剂、凝胶剂和脂质体。虽然本质上基本相似，但这些制剂的组分和最终产品的稠度不同。在细胞水平上增强寡核苷酸摄取的剂也可以加入到本发明的药物和其他组合物中。例如，阳离子脂质(诸如lipofectin(美国专利号5,705,188))、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(诸如聚赖氨酸(WO 97/30731))，也增强对寡核苷酸的细胞摄取。
[0332] 本发明的组合物可另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分。因此，例如，组合物可含有另外的相容药学活性物质，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有可用于物理配制本发明组合物的各种剂型的另外物质，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮色剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类物质在加入时不应过度干扰本发明组合物的各组分的生物活性。制剂可以经灭菌，并且(如果需要的话)与助剂混合，所述助剂为例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，所述助剂不会与制剂的核酸有害地相互作用。
[0333] 包含抗TIM-1-CAR表达细胞群的制剂可包括药学上可接受的赋形剂。包含在制剂中的赋形剂将具有不同的目的，取决于例如CAR构建体、所用细胞的亚群以及施用模式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、感染用水、甘油，乙醇以及它们的组合，稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张度剂、填充剂及润滑剂。包含抗TIM-1 CAR表达细胞群的制剂将通常在不存在任何非人组分(的情况下，诸如在动物血清(例如，牛血清白蛋白)中制备和培养。
[0334] 制剂或组合物还可含有多于一种活性成分，所述多于一种活性成分可用于用结合分子或细胞治疗的特定适应症、疾病或疾患，所述多于一种活性成分优选为具有与所述结合分子或细胞互补的活性的那些活性成分，其中各自相应的活性不会不利地彼此影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包含其他药物活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，药物活性剂或药物可包含免疫检查点抑制剂，例如靶向PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、KIR、CD244、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、TIM3和/或A2aR的药物。这些抑制剂的实例包括但不限于pidilizumab、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、MDX-1105、BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A、MSB0010718C、tremelimumab和易普利姆玛单抗(ipilimumab)，它们可以单独施用或与其他药剂(例如，GM-CSF)组合施用。
[0335] 在一些方面，药物组合物可以采用定时释放系统、延迟释放系统和缓释递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位的敏化之前，并且有足够的时间来引起待治疗部位的敏化。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可以避免重复施用组合物，从而增加受试者和医生的便利性。
[0336] 给药
[0337] 在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或疾患的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的抗TIM-1 CAR细胞。在一些实施方案中，通过定期评定所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于疾患，重复治疗直至发生对疾病症状的所需抑制。然而，其他剂量方案可为有用的并且可以被确定。所需剂量可通过以下方式来递送：单次推注施用组合物、多次推注施用组合物，或连续输注施用组合物。
[0338] 在某些实施方案中，在基因工程化的表达CAR的细胞的情况下，向受试者施用范围为约100万至约1000亿个的细胞，诸如1百万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或者由前述任何两个值定义的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如、约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞，约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由前述任何两个值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约
450亿个细胞)或这些范围之间的任何值和/或此类数量的细胞/千克受试者体重。例如，在一些实施方案中，细胞或细胞群的施用可包括施用约103至约109个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有细胞数的整数值。
450亿个细胞)或这些范围之间的任何值和/或此类数量的细胞/千克受试者体重。例如，在一些实施方案中，细胞或细胞群的施用可包括施用约103至约109个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有细胞数的整数值。
[0339] 细胞或细胞群可以一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，所述有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施方案中，所述有效量的细胞可以在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时序在管理医生的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群可以从任何来源获得，诸如血库或供体。虽然个体需求变化，但是针对特定疾病或疾患确定给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量取决于接受者的年龄、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效应的性质。在一些实施方案中，肠胃外施用有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。在一些实施方案中，施用可以是静脉内施用。在一些实施方案中，可以通过在肿瘤内注射来直接进行施用。
[0340] 出于本发明的目的，施用的本发明CAR材料的量或剂量应足以在合理的时间范围内在受试者或动物中实现治疗或预防响应。例如，本发明的CAR材料的剂量应足以在从施用时间开始约2小时或更长时间(例如约12小时至约24小时或更长时间)内与抗原结合，或检测、治疗或预防疾病。在某些实施方案中，该时间段可甚至更长。剂量将通过具体的本发明CAR材料的功效和动物(例如，人)的状况以及待治疗的动物(例如，人)的体重来确定。
[0341] 出于本发明的目的，一种测定法可用于确定施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定法包括例如在向哺乳动物施用给定剂量的表达本发明的CAR、多肽或蛋白质的T细胞后，比较此类T细胞进行的靶细胞裂解或IFN-γ分泌的程度，其中一组哺乳动物中的每一个哺乳动物都给予不同剂量的T细胞。可以通过本领域已知的方法来测定在施用一定剂量后靶细胞裂解或IFN-γ分泌的程度。
[0342] 在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗性干预(诸如抗体或工程化的细胞或受体或剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依次施用。在一些实施方案中，将细胞或抗体与一种或多种另外的治疗剂或与另一种治疗干预结合，同时或以任何顺序依次共同施用。在一些情况下，将细胞与在时间上足够接近的另一种疗法共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效应，或反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之前施用细胞或抗体。在一些实施方案中，在一种或多种另外的治疗剂之后施用细胞或抗体。
[0343] 在实施方案中，在施用(例如，输注)CAR细胞之前、同时或之后，向受试者施用淋巴细胞清除性化学疗法。在一个实例中，在施用细胞之前向受试者施用淋巴细胞清除性化学疗法。例如，淋巴细胞清除性化学疗法在CAR细胞输注之前1-4天(例如，1天、2天、3天或4天)结束。在实施方案中，施用多剂量的CAR细胞，例如如本文所述。在实施方案中，在施用(例如，输注)本文所述的CAR表达细胞之前、同时或之后，向受试者施用淋巴细胞清除性化学疗法。淋巴细胞清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除性化学疗法、清髓性淋巴细胞清除化学疗法、全身照射，等等。淋巴细胞清除剂的实例包括但不限于抗胸腺细胞球蛋白、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD52抗体、抗CD2抗体、TCRαβ阻断剂、抗CD20抗体、抗CD19抗体、波替单抗(Bortezomib)、利妥昔单抗、抗CD154抗体、雷帕霉素、CD3免疫毒素、氟达拉滨、环磷酰胺、白消安、美法仑、莫须瘤(Mabthera)、他克莫司、阿法赛特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、OKT3、OKT4、OKT8、OKT11、芬戈莫德(fingolimod)、抗CD40抗体、抗BR3抗体、Campath-1H、抗CD25抗体、神经钙蛋白抑制剂、霉酚酸酯和类固醇，这些淋巴细胞清除剂可以单独使用或组合使用。
[0344] 变体
[0345] 包括在本发明范围内的是本文所述的本发明CAR的功能部分。当用于提及CAR时，术语“功能部分”是指本发明的CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留该部分或片段作为其一部分的CAR(亲本CAR)的生物活性。所述功能部分包括例如CAR的那些保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的部分。关于亲本CAR，功能部分可包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
[0346] 所述功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端处包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中未发现。理想地，所述另外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更理想地，与亲本CAR的生物活性相比，所述另外的氨基酸增强了生物活性。
[0347] 包括在本发明范围内的是本文所述的本发明CAR的功能变体。如本文所用的术语“功能变体”是指与亲本CAR具有实质上或显著序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，该功能变体保留其作为变体的CAR的生物学活性。功能变体包括例如本文所述CAR(亲本CAR)的那些保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力的变体。关于亲本CAR，功能变体可以例如与亲本CAR的氨基酸序列至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多同一。
[0348] 所述功能变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。另外或替代地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选所述非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本CAR相比，功能变体的生物活性增强。
[0349] 本发明CAR的氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸取代，在所述氨基酸取代中具有某些物理和/或化学性质的一种氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理性质的另一种氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电的极性氨基酸对另一种酸性/带负电的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)的取代；具有非极性侧链的氨基酸对另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)的取代；碱性/带正电的极性氨基酸对另一种碱性/带正电的极性氨基酸酸(例如，Lys、His、Arg等)的取代；具有极性侧链的不带电荷的氨基酸对另一种具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)的取代；具有β-支链侧链的氨基酸对另一种具有β-支链侧链的氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)的取代；具有芳香族侧链的氨基酸对另一种具有芳香侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)的取代，等等。
[0350] 而且，可以基于载体设计向序列中添加或从序列中去除氨基酸。
[0351] CAR可基本上由本文所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如，其他氨基酸)不会实质上改变功能变体的生物学活性。
[0352] 本发明实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以为任何长度，即可以包含任何数量的氨基酸，前提条件是CAR(或其功能部分或功能变体)保留其生物活性，例如特异性结合抗原、检测哺乳动物的病患病细胞，或治疗或预防哺乳动物的疾病等的能力。例如，CAR可以是约50至约5000个氨基酸长，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个氨基酸。
[0353] 本发明实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸以代替一种或多种天然存在的氨基酸。这些合成氨基酸是本领域已知的，包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
[0355] 本发明实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可通过本领域已知的方法获得。CAR可以通过任何合适的制备多肽或蛋白质的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适方法描述于参考文献中，例如Chan等人，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；Peptide and Protein Drug Analysis，Reid,R.编辑，Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping，Westwood等人编辑，Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2001；和美国专利号5,449,752。
而且，可以使用标准重组方法，使用本文所述的核酸来重组地产生多肽和蛋白质。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人，Current Protocols in
Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,N Y,1994。
此外，本发明的一些CAR(包括其功能部分和功能变体)可以从来源(诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如，大鼠、人)等)中分离和/或纯化。分离和纯化方法是本领域中熟知的。或者，本文所述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可由公司商业合成。就此而言，本发明的CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
而且，可以使用标准重组方法，使用本文所述的核酸来重组地产生多肽和蛋白质。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人，Current Protocols in
Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,N Y,1994。
此外，本发明的一些CAR(包括其功能部分和功能变体)可以从来源(诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如，大鼠、人)等)中分离和/或纯化。分离和纯化方法是本领域中熟知的。或者，本文所述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可由公司商业合成。就此而言，本发明的CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
[0356] 定义
[0357] 术语“4-1BB”或“BB”是指具有作为GenBank Acc.No.AAA53133.1提供的氨基酸序列的TNFR超家族成员，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:216提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
[0358] 如本文所用，“5'帽”(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，该经修饰的鸟嘌呤核苷酸已在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前面”或5'端。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于由核糖体进行识别和抗RNA酶的保护至关重要。帽加成与转录偶联，并且共转录地发生，使得每一者都影响另一者。在转录开始后不久，将正合成的mRNA的5'末端与与RNA聚合酶缔合的帽合成复合物结合。该酶促复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，诸如其稳定性或翻译效率。
[0359] 术语“同种异体的”或“供体来源的”是指来源于与导入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。据说当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体是彼此同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
[0360] 术语“抗肿瘤细胞毒性”通常是指由本发明CAR或包含本发明CAR的细胞暴露于靶肿瘤细胞引起的任何杀细胞活性。该活性可以通过已知的细胞毒性测定(包括IFN-γ产量测定)来测量。
[0361] 如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。在一个方面，抗原是TIM-1。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。该术语以最广泛的含义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段(包括片段抗原结合(Fab)片段)、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))、双链抗体及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括基因工程和/或其他修饰形式的免疫球蛋白，诸如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体，多特异性(例如，双特异性)抗体、双链抗体、三体抗体和四体抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包括完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
[0362] 术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))、单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段、双链抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个具体实施方案中，抗体片段是scFv。
[0363] 如本文所用，“抗体重链”是指在所有抗体分子的天然存在的构象下，在所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较大的多肽链。
[0364] 如本文所用，“抗体轻链”是指在所有抗体分子的天然存在的构象下，在所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较小的多肽链。κ轻链和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
[0365] 术语“抗原”或“Ag”是指引发免疫响应的分子。该免疫响应可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽在内，都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫响应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用一种以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫响应的多肽。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以被产生、合成，或可以来源于生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。这种生物样品可包括但不限于具有其他生物组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。在一个方面，抗原是TIM-1。
[0366] 术语“抗原结合结构域”是指嵌合抗原受体的一个或多个细胞外结构域，该一个或多个细胞外结构域对特定抗原具有特异性。
[0367] 本文所用的术语“单采血液成分法”是指本领域公认的体外过程，借助该过程，供体或患者的血液从供体或患者体内取出并穿过分离出所选特定成分的设备并例如通过再输送将其余部分返回到供体或患者的循环。因此，在“单采血液成分法”的情况下，是指使用单采血液成分法获得的样品。
[0368] 术语“自体同源的”是指来源于物质后来被重新导入的同一个体的任何物质。
[0369] 术语“结合”是指两个分子之间的有吸引力的相互作用，该相互作用导致其中分子彼此非常接近的稳定缔合。分子结合的结果有时是分子复合物的形成，在所述分子复合物中将组分保持在一起的吸引力通常是非共价的，因此通常在能量上弱于共价键。
[0370] 术语“癌症”是指以异常细胞的不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，包括但不限于卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病等。
[0371] 术语“CD28”是指蛋白质分化组28，其是在T细胞上表达的蛋白质中的一种，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。该蛋白质可与NCBI参考号：NP_006130或其具有刺激活性的片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0372] 术语“CD3ζ”或者“ζ”、“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”被定义为作为GenBan Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等同残基，并且“CD3ζ细胞内信号传导结构域”或者“ζ细胞内信号传导结构域”或“TCR-ζ细胞内信号传导结构域”被定义为来自CD3ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，该氨基酸残基或其功能衍生物足以在功能上传递T细胞激活所必需的初始信号。在一个方面，“CD3ζ细胞内信号传导结构域”是作为SEQ ID NO:219提供的序列。
[0373] 术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，该一组多肽当在免疫效应细胞中时为细胞提供对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性和细胞内信号产生。在一些实施方案中，CAR包含至少细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该细胞质信号传导结构域包含来源于如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，所述二聚化开关在二聚化分子存在下可以使多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个功能性信号传导结构域，该一个或多个功能性信号传导结构域来源于如下定义的至少一种共刺激分子。在一个方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即，CD137)、DAP10和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含来源于共刺激分子的功能信号传导结构域和来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含来源于一个或多个共刺激分子的两个功能信号传导结构域和来源于一个或多个刺激分子的功能信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含来源于一个或多个共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一个方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR还包含在细胞外抗原结合结构域的N末端的前导序列，其中该前导序列任选地被在CAR的细胞加工和定位期间从抗原结合结构域(例如，scFv)切割到细胞膜上。
[0374] 如本文关于抗体所用，术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以足以类似于第二抗体或其抗原结合部分的结合的方式与表位结合，使得与第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合相比，第二抗体存在下第一抗体与其同源表位结合的结果可检测地降低。替代地，在第一抗体存在的情况下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低，可以是但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体能够抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体无需抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，当每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合时，无论是抑制到相同的、更大的还是更小的程度，抗体都被称为彼此“交叉竞争”结合它们相应的表位。竞争性抗体和交叉竞争抗体都包括在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分结合)，本领域技术人员将基于本文提供的教导理解为，这种竞争和/或交叉竞争抗体被包含并且可用于本文公开的方法。
[0375] 本领域中已知术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“构架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
[0376] 术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导由T细胞进行的共刺激响应(诸如但不限于增殖)。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，所述细胞表面分子有助于有效的免疫响应。共刺激分子包括但不限于选自由以下组成的组的蛋白质：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、Toll配体受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-
76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6以及与CD83特异性结合的配体。在实施方案中，编码的共刺激结构域包含4-1BB、CD28或DAP10。在一个实施方案中，共刺激结构域包含BBCYP、CD28CYP或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218)，或编码此类氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268)。
76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6以及与CD83特异性结合的配体。在实施方案中，编码的共刺激结构域包含4-1BB、CD28或DAP10。在一个实施方案中，共刺激结构域包含BBCYP、CD28CYP或DAP10CYP的氨基酸序列(SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218)，或编码此类氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:268)。
[0377] 术语“细胞因子”是指参与细胞信号传导的广泛类型的小蛋白质。通常，它们的释放对它们周围细胞的性质有一些影响。细胞因子可以作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和/或内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子由多种细胞产生，所述多种细胞包括免疫细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞)以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。“趋化因子”是通常参与介导趋化性的细胞因子家族。
[0378] 术语“DAP10”是指在人体中由HSCT基因所编码的蛋白质。它也可以称为HCST、KAP10、PIK3AP或造血细胞信号转导物。在一些实施方案中，DAP10可具有Genbank登录号：Q9UBK5.1中提供的序列。
[0379] 短语“与TIM-1表达相关的疾病”包括但不限于与TIM-1表达相关的疾病或与表达TIM-1的细胞相关的疾患，包括例如诸如癌症或恶性肿瘤或癌前病变等增生性疾病；或与表达TIM-1的细胞相关的非癌症相关适应症。与TIM-1相关的非癌症相关适应症包括甲型肝炎病毒、埃博拉病毒、登革热病毒、特应性皮炎、过敏、类风湿性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮和免疫功能障碍。表达TIM-1的各种癌症的实例包括但不限于卵巢癌、肾癌、肺癌等。
[0380] “有效量”或“有效治疗量”是指足以预防或治疗个体的疾病、病症或疾患的剂量。对治疗或预防用途有效的量将取决于例如所治疗的疾病或病症的阶段和严重程度，患者的年龄、体重和一般健康状况，以及处方医师的判断。剂量的大小还将由选择的活性剂，施用方法，施用时序和频率，可能伴随特定活性剂施用的任何不良副作用的存在、性质和程度，以及所需的生理效应来确定。本领域技术人员将理解，各种疾病或疾患可能需要涉及多次施用的延长治疗，可能在每轮或多轮施用中使用本发明的CAR材料。
[0381] 术语“铰链”、“间隔区”或“接头”是指通常在多肽构建体的两个或更多个结构域之间编码的可变长度的氨基酸序列，该氨基酸序列用以赋予柔性、改善的空间组构、接近性等。
[0382] 如本文所用，“人抗体”是指这样的抗体，所述抗体具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用本领域技术人员已知的或在此公开的任何制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的这种定义包括含有至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体。一个此类实例是包含鼠轻链多肽和人重链多肽的抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，Nature Biotechnology,14:309-314,1996；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:6157-6162,1998；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381,1991；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581,1991)。人抗体也可以通过对动物进行免疫来制备，其中人免疫球蛋白基因座已被转基因地导入而代替内源基因座，例如内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠。该方法描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,
825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。或者，可以通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞来制备人抗体(此类B淋巴细胞可以从个体中回收或从cDNA的单细胞克隆中回收，或者可以在体外免疫)。参见例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页，1985；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95,1991；和美国专利号5,750,373。
825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。或者，可以通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞来制备人抗体(此类B淋巴细胞可以从个体中回收或从cDNA的单细胞克隆中回收，或者可以在体外免疫)。参见例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页，1985；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95,1991；和美国专利号5,750,373。
[0383] “iCAR”是嵌合抗原受体，其含有抑制性受体信号传导结构域。这些结构域可以基于例如保护素D1(PD1)或CTLA-4(CD152)。在一些实施方案中，进一步转导本发明的CAR表达细胞以表达iCAR。在一个方面，添加该iCAR以限制CAR表达细胞对肿瘤细胞的功能活性。
[0384] 如本文所用，“免疫细胞”是指在功能上参与先天和/或适应性免疫响应的起始和/或执行的造血起源细胞。
[0385] 本文使用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进用包含CAR的核酸序列转导的细胞(例如CAR T细胞)的免疫效应功能。例如在CAR T细胞中，免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。细胞内信号传导结构域包括淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fc受体亚基、IL-2受体亚基、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ，CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10和DAP12的细胞内信号传导结构域。
[0386] “分离的”生物组分(例如分离的嵌合抗原受体或细胞或载体或蛋白质或核酸)是指已经从其环境或该组分天然存在于的生物体细胞中的其他生物组分(例如，其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)中实质上分离或纯化的组分。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
[0387] 在scFv的情况下使用的术语“接头”是指肽接头，其由单独或组合使用的氨基酸(诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并且包含氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:200)的一个或多个重复。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:201)。
[0388] 术语“掩蔽的CAR”是指还包含掩蔽肽的CAR表达细胞。该掩蔽肽可以防止脱靶细胞杀伤。掩蔽肽通常是CAR构建体的N末端，并且可以阻断细胞结合非预期靶标的能力。当掩蔽肽遇到肿瘤时可以从CAR表达细胞切割下来，从而允许CAR表达细胞攻击其靶标而不杀死脱靶细胞。
[0389] 术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或支化的、单链或双链的RNA或DNA，或它们的杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA序列、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸(诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶、其他糖和连接基团(例如氟代核糖和硫醇盐)以及核苷酸分支。在例如通过缀合与标记组分聚合后，可以进一步修饰核苷酸的序列。该定义中包括的其他类型的修饰是帽，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及导入将多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的构件。多核苷酸可通过化学合成获得或来源于微生物。术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因包括基因组序列中的内含子和外显子，或仅包括cDNA中的编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，基因还指这样的核酸片段，其表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质，并且包含调控序列。
[0390] 术语“OKT3”或“鼠源CD3单克隆抗体(Muromonab-CD3)”或“Orthoclone OKT3”是指单克隆抗CD3抗体。
[0391] “药学上可接受的载体”或“赋形剂”是指在配制期间常规用于免疫原性组合物中和/或用于允许储存的化合物或材料。
[0392] 如本文所用，术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的、由细胞合成机制或导入的合成机制识别的DNA序列。
[0393] 术语“重组”是指具有半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未发现的排列与另一多核苷酸连接。
[0394] 术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中所述轻链可变区和重链可变区是连续连接的(例如通过合成接头(例如，短柔性多肽接头))，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留其所来源于的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以以任一顺序具有VL可变区和VH可变区，例如相对于多肽的N末端和C末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。接头可包含框架序列的部分。
[0395] “信号肽”(也称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是存在于大多数目的为朝向分泌途径的新合成蛋白质的N末端处的短肽。信号肽的核心可含有一段长的疏水性氨基酸。信号肽可以从成熟多肽切割下来或可以不从成熟多肽切割下来。
[0396] 术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过以下方式作用：在细胞内传递信息，以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而起效应子作用，来通过限定的信号传导途径调控细胞活性。
[0397] 术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，所述分子提供针对免疫细胞信号传导途径的至少一些方面，以刺激性方式调节免疫细胞激活的细胞质信号传导序列。在一个方面，信号是初级信号，其通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而被引发，并且其导致对T细胞响应的介导，所述T细胞响应包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可含有信号传导基序，该信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。在本发明中特别使用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于来源于以下的含有ITAM的细胞质信号传导序列：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CARS中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:219提供的氨基酸序列，或编码这种氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:269)，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
[0398] 术语“受试者”旨在包括可以引发免疫响应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
[0399] 本文所用术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如如本文所述由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
[0400] “T2A核糖体跳跃序列”是指这样的氨基酸序列，该氨基酸序列在翻译时引起对核糖体上新生多聚蛋白的切割，从而允许多个基因的共表达。在一个方面，T2A核糖体跳跃序列可包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，或编码此氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:281)。
[0401] 术语“tCD19”是指CD19蛋白的截短形式、B淋巴细胞抗原CD19，也称为CD19(分化簇19)，其是人中由CD19基因所编码的蛋白质，并且在B细胞表面上存在。tCD19构建体是所述蛋白质的任何截短形式，使得编码该构建体的核酸序列可以被转导到宿主细胞中并在该细胞的表面上表达以用于检测、选择和/或靶向目的。在一个方面，tCD19是SEQ ID NO:232的氨基酸序列，或编码此氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:282)。
[0402] 术语“TIM-1”是指由HAVCR1基因在人中编码的T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1蛋白。TIM-1也称为HAVCR1、HAVCR、HAVCR-1、KIM-1、KIM1、TIM、TIM-1、TIM1、TIMD-1、TIMD1、CD365及甲型肝炎病毒细胞受体1。TIM-1具有作为GenBank Acc.No.AAC39862.1提供的氨基酸序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，TIM-1是作为SEQ ID NO:315提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
[0403] 术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或导入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。
[0404] 术语“跨膜结构域”暗示任何在膜中热力学稳定的三维蛋白质结构。该三维蛋白质结构可以是单个α螺旋、跨膜β桶、短杆菌肽A的β-螺旋，或任何其他结构。跨膜螺旋的长度通常为约20个氨基酸。通常，跨膜结构域表示跨膜蛋白的单个跨膜α螺旋，也称为整合蛋白。
[0405] 如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指由一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂，诸如本发明CAR)的施用引起的对增殖性疾病的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善，或对增殖性疾病的一种或多种症状(优选地，一种或多种明显症状)的改善。在具体的实施方案中，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指患者不一定能辨别的对增殖性疾病的至少一个可测量的物理参数(诸如肿瘤生长)的改善。在其他实施方案中，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指物理地(通过例如可辨别症状的稳定化)、生理地(通过例如生理参数的稳定化)或两者来抑制增殖性疾病的进展。在其他实施方案中，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指肿瘤大小或癌细胞计数的减少或稳定化。另外，如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及由此产生的词语不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。就此而言，本发明的方法可以提供对哺乳动物中癌症的任何量的任何水平的治疗或预防。此外，本发明方法提供的治疗或预防可包括对所治疗或预防的疾病(例如，癌症)的一种或多种疾患或症状的治疗或预防。而且，为了本文的目的，“预防”可以包括延迟疾病的发作或所述疾病的症状或疾患。
[0406] 术语“异种”是指来源于不同物种的动物的移植物。
[0407] 在以下实施例中更详细地描述了这些实验的实验细节。提供这些实施例是为了说明而不是限制要求保护的发明。
[0408] 实施例
[0409] 实施例1：设计和合成抗TIM-1 CAR变体
[0410] 根据图1的一般示意图产生抗TIM-1 CAR。对于六个变体，图2A提供了CAR构建体的更详细的示意图。CAR结构基于第二代CAR形式(Gacerez等人，J Cell Physiol,2016年12月；231(12):2590-8)。存在来自抗TIM1杂交瘤克隆1.29、2.70.2或2.59.2的在Hv-接头-Lv或Lv-接头-Hv取向上的六种不同的TIM-1-反应性单变化可变片段(scFv)(图2B)。这些抗TIM-1scFv是通过将重链(VH)和轻链(VL)区的可变区与以下的15个氨基酸的甘氨酸(G)-丝氨酸(S)接头融合而形成的：(G4S)3接头(SEQ ID NO:201)、GGGGS的3个重复(SEQ ID NO:200)。将这些单独地框内克隆到含有CD28铰链结构域(CD28的残基135-152或SEQ ID NO:
214)、CD28的跨膜结构域(CD28的残基153-179或SEQ ID NO:215)、CD28的共刺激区域(CD28的残基180-220或SEQ ID NO:217)，接着是CD3ζ信号传导结构域(CD3ζ的残基52-164或SEQ ID NO:219)的CAR构建体中。这些构建体中的每一个中的scFv结构域基于轻链可变结构域和重链可变结构域的顺序、scFv亲和力和表位仓(scFv所结合的TIM-1细胞外结构域上的区域)而变化。这些scFv来源于完全人抗TIM-1抗体，其最小化了最近临床试验中使用的免疫原性(特别是基于鼠的scFv)的潜在问题(Maus等人，Cancer Immunol Res 2013；1:26-31；
Kershaw等人，Clin Cancer Res 2006；12:6106-6115；Lamers等人，Blood 2011；117:72-
82)。抗TIM-1抗体序列(1.29和2.70.2对比2.59.2)显示为结合TIM-1上的不同表位(美国专利号8,067,544)。这些scFv所来源于的抗体的全部细节可以在美国专利号8,067,544中找到。
214)、CD28的跨膜结构域(CD28的残基153-179或SEQ ID NO:215)、CD28的共刺激区域(CD28的残基180-220或SEQ ID NO:217)，接着是CD3ζ信号传导结构域(CD3ζ的残基52-164或SEQ ID NO:219)的CAR构建体中。这些构建体中的每一个中的scFv结构域基于轻链可变结构域和重链可变结构域的顺序、scFv亲和力和表位仓(scFv所结合的TIM-1细胞外结构域上的区域)而变化。这些scFv来源于完全人抗TIM-1抗体，其最小化了最近临床试验中使用的免疫原性(特别是基于鼠的scFv)的潜在问题(Maus等人，Cancer Immunol Res 2013；1:26-31；
Kershaw等人，Clin Cancer Res 2006；12:6106-6115；Lamers等人，Blood 2011；117:72-
82)。抗TIM-1抗体序列(1.29和2.70.2对比2.59.2)显示为结合TIM-1上的不同表位(美国专利号8,067,544)。这些scFv所来源于的抗体的全部细节可以在美国专利号8,067,544中找到。
[0411] 然后基于如图2C中所绘示的细胞内共刺激结构域的组成进一步改变CAR结构：CD28(SEQ ID NO:217)对比4-1BB(4-1BB的残基214-255或SEQ ID NO:216)对比DAP10
(DAP10的残基70-93或SEQ ID NO:218)。简而言之，合成的CAR构建体以信号肽开始，接着是通过与TIM-1的细胞外部分结合的接头分开的可变重链和可变轻链序列(VH-接头-VL，scFv)。scFv在框架内具有CD28铰链和跨膜结构域，随后是细胞内共刺激结构域(来源于CD28、4-1BB或DAP10)，并且最后是CD3ζ信号传导结构域。在所有情况下，使用高保真DNA聚合酶执行PCR。
(DAP10的残基70-93或SEQ ID NO:218)。简而言之，合成的CAR构建体以信号肽开始，接着是通过与TIM-1的细胞外部分结合的接头分开的可变重链和可变轻链序列(VH-接头-VL，scFv)。scFv在框架内具有CD28铰链和跨膜结构域，随后是细胞内共刺激结构域(来源于CD28、4-1BB或DAP10)，并且最后是CD3ζ信号传导结构域。在所有情况下，使用高保真DNA聚合酶执行PCR。
[0412] 为了促进高纯度的转导T细胞的获得，将CAR变体构建体设计为包括由T2A核糖体跳跃元件(SEQ ID NO:231)从CAR构建体分隔的截短的CD19(tCD19)标记序列(CD19的残基1-327，或SEQ ID NO:232)(图2C)。当翻译时，tCD19变成在CAR T细胞的细胞表面上表达。这允许纯化步骤富集转导的CAR+细胞群。
[0413] 总之，经设计并克隆(框内)到逆转录病毒载体中的CAR变体如下。基于来源于Ab 1.29的scFv的两种变体：129L-CD28和129H-CD28。基于来源于Ab 2.70.2的scFv的四种变体：272L-CD28；272H-CD28；272H-BB；以及272H-DAP10。基于来源于Ab 2.59.2的scFv的四种变体：2592L-CD28；2592H-CD28；2592H-BB；以及2592H-DAP10。参见表1。用T2A核糖体跳跃序列和编码tCD19表达的基因进一步合成许多这些构建体。
[0414] 表1
[0415]
[0416] 载体：将上述抗TIM-1构建体克隆到逆转录病毒载体pFB-neo(Stratagene.Palo Alto.CA)或pSFG中。pSFG载体已用于临床试验中T细胞的类似逆转录病毒转导(Hollyman等人，J Immunother 2009；32:169-180；Pule等人，Nat Med 2008；14:1264-1270)。用SalI和NotI限制酶消化pFB-neo DNA。将消化产物上样到琼脂糖凝胶上，切下消化的条带，并用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。
[0417] 实施例2：产生抗TIM-1 CAR T细胞
[0418] 细胞培养和逆转录病毒转导：将上述逆转录病毒原种用于使用优化的方法(Cubillos-Ruiz等人，Oncotarget 2010；1:329-33；Huarte等人，Blood 2008；112:1259-
1268；Stephen等人，Immunity 2014；41:427-439)、方案和先前在Celdara Medical开发的资源来转导来自健康供体的人T细胞。
1268；Stephen等人，Immunity 2014；41:427-439)、方案和先前在Celdara Medical开发的资源来转导来自健康供体的人T细胞。
[0419] 对于一些变体，细胞培养、逆转录病毒转导和纯化方案汇总于图3中。通过流式细胞术分析所得的转导细胞(图4)。对于一些变体的纯化，方案如下。来自健康供体的人PBMC(HemaCare)是用于CAR转导的T细胞的来源。将供体PBMC解冻，在完全培养基中重构，然后通过离心沉淀。随后将细胞重悬于完全培养基中，然后通过与IL-2和抗CD3一起孵育48h来激活。在刺激后，将细胞暴露于编码抗TIM-1 CAR变体的逆转录病毒上清液，置于抗CD3存在下包被有retronectin的平板中，然后进行离心接种(spinoculation)。还执行了使用空载体的模拟转导来充当实验中的CAR-对照。在第3天，更换培养基并重复离心接种，然后将T细胞扩增数天。在第5天，纯化细胞。对于用以tCD19基因为特征的构建体转导的那些细胞，使用抗CD19抗体进行该纯化以选择性纯化来自该群体的所有CD19+细胞。使用来自不同供体(例如，图4，第二列)的细胞产生CAR T细胞。使用该方法进行一轮纯化后，CD3+CD19+纯度(通过流式细胞术测定)超过80％。如果需要的话，通过第二轮纯化可以达到>90％的CD3+CD19+纯度。
[0420] 对于体内测定，将细胞如图14中那样培养、转导、收获、纯化和扩增。图15A和图15B分别说明了在制造过程中宿主细胞的生长和活力，表明抗TIM-1 CAR表达不会对T细胞赋予有害效应，诸如在IL-2存在下的毒性或受损的T细胞增殖。图17示出了对所得细胞的流式细胞术分析。
[0421] 实施例3：抗TIM-1 CAR T细胞的体外功能活性
[0422] 抗TIM-1 CAR T细胞产生：如实施例2和图3所述产生抗TIM-1 CAR T细胞。
[0423] IFNγ诱导测定：IFNγ诱导报告抗TIM-1 CAR变体的体外刺激和细胞毒性，即它们+在暴露于TIM-1靶细胞时激活CAR T细胞的能力。IFNγ是一种重要的效应细胞因子，其产量的增加指示CAR T细胞是否已被刺激，且其充当效应细胞:靶细胞接合的生物标记。基本上，仅当CAR T细胞与表达靶TIM-1蛋白的细胞一起孵育时IFNγ的存在指示选择性靶标接合。
[0424] 我们一式三份地共培养IGROV-1细胞和CAR T细胞变体，在24h时收集上清液，并通过ELISA测量IFNγ产量。
[0425] 当与TIM-1+卵巢癌细胞系IGROV-1一起孵育时，用实施例1中描述的scFv序列产生的几种CAR T细胞变体能够刺激IFNγ的产生(图5A至图5E)。为了证明靶向TIM-1的CAR T细胞的特异性体外靶向，将CAR T暴露于其他TIM-1+和TIM-1-癌细胞系：TIM-1+ A549(肺腺癌)细胞；TIM-1+ Caki-1(肾细胞癌)细胞；和TIM-1- EL4(鼠淋巴瘤)细胞。为了确保IFNγ产生不是逆转录病毒转导程序的非特异性效应，我们模拟转导T细胞并将它们与TIM-1+ IGROV-1细胞一起孵育(图5A至图5E)。为了测试IFNγ产量增加是由于抗TIM-1 CAR与IGROV-1细胞的细胞表面TIM-1之间的相互作用，我们还使用scFv序列所来源的全长抗体，检查了与针对TIM-1的封闭抗体一起共孵育的结果(图5C和图5E)。
[0426] 类似地，图18示出了对如图14中产生的CAR T细胞的该体外功能活性测定的结果。
[0427] 体外细胞因子产量测定：对治疗有效性重要的另一个参数是影响体内免疫环境的效应细胞因子的产量。我们一式三份地共培养IGROV-1细胞和CAR T细胞变体，在24h时收集上清液，并通过通过Luminex测量细胞因子产量。还在相同条件下将CAR T细胞与A549细胞、Caki-1细胞、(另外的TIM-1+癌细胞系)和EL-4细胞(TIM-1-对照)一起共培养。另外，为了证实TIM-1结合是细胞因子产生的原因，在一种条件下，在scFv所来源的全长抗体存在下，将CAR T细胞与IGROV-1细胞一起共培养。在每种情况下，模拟物转导细胞用作对照。参见图6至图12中的结果。
[0428] 体外细胞毒性测定：为了测定抗TIM-1 CAR T细胞对TIM-1+细胞的特异性，使用基于乳酸脱氢酶释放的标准细胞毒性测定法来测定CAR T细胞对TIM-1+细胞(IGROV-1人卵巢癌细胞)和TIM-1-细胞(EL4鼠淋巴瘤)的毒性潜能。IGROV-1卵巢癌细胞系用作这些实验的有用的初始靶标群体(Bernard等人，Cancer Res 1985；45:4970-4979)，因为IGROV-1细胞表达TIM-1靶抗原并且充当卵巢透明细胞癌模型(Domcke等人，Nat Commun 2013；4:2126)。
[0429] 在每个孔中，将104个IGROV-1细胞铺板并与表达不同抗TIM-1 CAR变体的效应T细胞以1:1(效应细胞:靶细胞)、5:1、10:1和20:1的比率一起共培养。还进行了几项对照条件，包括：仅培养基；仅CAR T细胞(效应物自发释放)；仅IGROV-1细胞(靶标自发释放)；和最大IGROV-1毒性(用Triton-X 100处理过的细胞)。在共培养物中铺板细胞后二十二小时，将共培养物离心并收集上清液。加入测定试剂(含有心肌黄酶和INT底物中间体)并使反应进行。在孵育结束时，加入终止溶液并测定样品吸光度。如上所述，基于总裂解对照，使用一式三份执行的实验样品的校正吸光度值来计算细胞毒性百分比。
[0430] 图13A至图13D显示了就对TIM-1+细胞的细胞裂解而言，用抗TIM-1 CAR转导的T细胞和模拟物转导细胞的该测定的结果。还证实了TIM-1细胞特异性细胞毒性，因为IGROV-1细胞被杀死而TIM-1- EL4细胞未受影响(图13A至图13D)。
[0431] 为此目的，也可以使用OVCAR-5卵巢癌细胞，因为它们表达TIM-1靶抗原并且也已经显示出对抗TIM-1抗体有响应(美国专利号8,067,544)。
[0432] 实施例4：鼠IGROV-1肿瘤模型中的体内TIM-1 CAR T抗肿瘤活性
[0433] 小鼠：SCID-beige雌性，6周(参见表2)。
[0434] 表2
[0435]
[0436] IGROV-1细胞制备：将IGROV-1细胞解冻。在接种前一天将细胞通过(passed)。收获细胞，用RPMI洗涤一次，然后在不含补充物的RPMI中制成50×106/ml的细胞悬浮液。使用胰蛋白酶制备IGROV-1细胞。
[0437] CAR T细胞制备：通过将抗TIM-1 CAR构建体逆转录病毒转导到PBMC(健康人志愿者)中来产生抗TIM-1 CAR T细胞；通过纯化富集抗TIM-1阳性细胞(CD3+/CD19t+)，并根据图14进一步制备。
[0438] 将CAR T细胞解冻，计数并立即检查活力。将小瓶从液氮储存中取出并置于干冰上。然后将小瓶在37℃的水浴中温热直至留下小的冰晶。此时，在旋涡下逐滴加入1mL温热的RPMI。从小瓶中取出2mL混合物并置于15mL锥形瓶中。然后将4mL温热的RPMI加入15mL锥形瓶中。将管在10℃下以1000rpm离心5min。将细胞重悬于1mL RPMI中，然后计数两次并分析活力。不使用时将管置于冰上。
[0439] 在没有补充物的RPMI中制备75×106/ml的CAR T细胞悬浮液。
[0440] 细胞施用：在第0天，在小鼠右胁腹接种150μl RPMI中的2.5×106个IGROV-1细胞+7.5×106个CAR T细胞。对于每组，基于CAR-T计数，将1体积的IGROV-1制剂加入到2体积的CAR-T制剂中。在注射期间将CAR-T/IGROV混合物留在冰上。在细胞制备后立即开始细胞注射并且花费大约1小时完成。
[0441] 1体积的IGROV-1细胞悬液用于第1组(注射50μl)；
[0442] 1体积的IGROV-1细胞悬液+2体积的模拟CAR-T用于第2组；
[0443] 1体积的IGROV-1细胞悬液+2体积的2592H_tCD19用于第3组；
[0444] 1体积的IGROV-1细胞悬液+2体积的2592L_tCD19用于第4组；
[0445] 1体积的IGROV-1细胞悬液+2体积272H_tCD19用于第5组；
[0446] 结果：每周测量肿瘤大小两次。每天执行一般健康检查，并记录每只小鼠的死亡日期。研究在第56天终止。完整结果请参见图20A。还在第20天执行肿瘤大小比较，结果在图20B中。将肿瘤大小报告为平均体积±SEM，然后使用Mann-Whitney检验进行统计学分析(*，p＝0.02；**，p＝0.002)。因此，皮下施用抗TIM-1 CAR T细胞抑制TIM-1+IGROV-1细胞的生长。
[0447] 实施例5：荷瘤小鼠中CAR T细胞的持久性
[0448] 与安全性和潜在的长期保护相关的重要参数是CAR T细胞的持久性，CAR T细胞的持久性可响应于肿瘤复发(Song等人，Cancer Res 2011；71:4617-4627)。为了测量体内持久性，首先在雌性NSG小鼠(3只小鼠/组)中腹膜内建立IGROV-1细胞(3×106个细胞)。在植入后第10天，腹膜内施用0.5×107个抗TIM-1 CAR T细胞。使用对CAR变体特异的Q-PCR，在过继性转移后第14天和第28天测定CAR T细胞的存在。待分析的组织隔室将包括血液、肿瘤组织、骨髓和脾脏。通过Q-PCR测量的信号量将用于估计所分析的每个组织存在的CAR T细胞的相对数量，并提供比较两种CAR变体的存活率和增殖潜力的手段。
[0449] 实施例6：TIM-1 CAR T对鼠IGROV-1肿瘤模型中的存活率的体内效应。
[0450] 小鼠：SCID-beige雌性，6周(参见表3)。
[0451] 表3
[0452]第1组：生理盐水 第2组：模拟CAR-T 第3组：2592H_tCD19
sb-383 sb-388 sb-398
sb-384 sb-389 sb-399
sb-385 sb-390 sb-400
sb-386 sb-391 sb-401
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[0453] IGROV-1肿瘤建立：将IGROV-1细胞解冻并在接种前经过一天。在第0天，将IGROV-1细胞使用胰蛋白酶收获并用RPMI洗涤一次，并且使表3中所示的每只小鼠腹膜内接种在不含补充物的200μL RPMI中的2.5×106个IGROV-1细胞。
[0454] CAR T细胞制备：分别通过用使用模拟CAR构建体(pSFG._tCD19)或抗TIM-1 CAR构建体(pSFG.CX272H_tCD19)产生的逆转录病毒转导PBMC(来自健康人供体)，来产生模拟CAR T细胞和抗TIM-1 CAR T细胞。根据图14，将成功转导的细胞纯化，扩增并冷冻直至使用。
[0455] CAR T细胞施用：在第2天、第9天和第16天的每一天，将模拟CAR T细胞和抗TIM-1 CAR T细胞解冻，计数，并立即检查活力。在没有补充物的RPMI中制备37.5×106个细胞/ml的活细胞悬浮液，并保持在冰上直至完成施用于小鼠(在约1h内)。第2组中的每只小鼠腹膜内施用7.5×106个模拟CAR-T细胞，第3组中的每只小鼠腹膜内施用不含补充物的200μL RPMI中的7.5×106个抗TIM-1 CAR-T细胞。第1组中的每只小鼠腹膜内施用200μL生理盐水。
[0456] 结果：监测小鼠并每天记录死亡。当观察到不良临床症状(诸如严重的嗜睡、弓背姿势或不动)时，对小鼠实施安乐死。图21中的图表显示了小鼠存活结果。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析第1组至第3组之间的存活比较。接受抗TIM-1 CAR-T细胞的小鼠(第3组)在统计学上比仅接受生理盐水的小鼠(第1组，p＝0.0043**)或接受模拟CAR-T细胞的小鼠(第2组，p<0.0001****)存活更长时间。因此，抗TIM-1 CAR T细胞的施用延长了卵巢癌体内模型中的存活。
[0457] 示例性序列
[0458] i.2592最小结合表位2592表位97 2592最小结合表位(2592表位)的氨基酸序列，SEQ ID NO:97LPRQNH
[0459] ii.接头区亚基G4S 200接头区亚基(G4S)的氨基酸序列，SEQ ID NO:200GGGGS[0460] iii.接头区G4S接头201接头区(G4S接头)的氨基酸序列，SEQ ID NO:201GGGGSGGGGSGGGGS
[0461] iv.Ab 129 VH 129 VH 202 Ab 129 VH(129 VH)的氨基酸序列，SEQ ID NO:202[0462]
[0463] v.Ab 129 VL 129 VL 203 Ab 129 VL(129 VL)的氨基酸序列，SEQ ID NO:203[0464]
[0465] vi.Ab 272 VH 272 VH 204 Ab 272 VH(272 VH)的氨基酸序列，SEQ ID NO:204[0466]
[0467] vii.Ab 272 VL 272 VL 205 Ab 272 VL(272 VL)的氨基酸序列，SEQ ID NO:205[0468]
[0469] viii.Ab 2592 VH 2592 VH 206 Ab 2592 VH(2592 VH)的氨基酸序列，SEQ ID NO:206
[0470]
[0471] ix.Ab 2592 VL 2592 VL 207 Ab 2592 VL(2592 VL)的氨基酸序列，SEQ ID NO:207
[0472]
[0473] x.129 hv-接头-lv 129H 208 129 hv-接头-lv(129H)的氨基酸序列，SEQ ID NO:208
[0474]
[0475] xi.129 lv-接头-hv 129L 209 129 lv-接头-hv(129L)的氨基酸序列，SEQ ID NO:209
[0476]
[0477] xii.272 hv-接头-lv 272H 210 272 hv-接头-lv(272H)的氨基酸序列，SEQ ID NO:210
[0478]
[0479] xiii.272 lv-接头-hv 272L 211 272 lv-接头-hv(272L)的氨基酸序列，SEQ ID NO:211
[0480]
[0481] xiv.2592 hv-接头-lv 2592H 212 2592 hv-接头-lv(2592H)的氨基酸序列，SEQ ID NO:212
[0482]
[0483] xv.2592 lv-接头-hv 2592L 213 2592 lv-接头-hv(2592L)的氨基酸序列，SEQ ID NO:213
[0484]
[0485] xvi.CD28铰链结构域CD28H 214 CD28铰链结构域(CD28H)的氨基酸序列，SEQ ID NO:214 VKGKHLCPSPLFPGPSKP
[0486] xvii.CD28跨膜结构域CD28TM 215 CD28跨膜结构域(CD28TM)的氨基酸序列，SEQ ID NO:215FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0487] xviii.4-1BB共刺激结构域BBCYP 216 4-1BB共刺激结构域(BBCYP)的氨基酸序列，SEQ ID NO:216KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
[0488] xix.CD28共刺激结构域CD28CYP 217 CD28共刺激结构域(CD28CYP)的氨基酸序列，SEQ ID NO:217 SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
[0489] xx.DAP10共刺激结构域DAP10CYP 218 DAP10共刺激结构域(DAP10CYP)的氨基酸序列，SEQ ID NO:218 LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG
[0490] xxi.CD3ζ细胞内结构域CD3ζCYP 219 CD3ζ细胞内结构域(CD3ζCYP)的氨基酸序列，SEQ ID NO:219
[0491]
[0492] xxii.129H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)129H-CD28 220 129H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(129H-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:220
[0493]
[0494] xxiii.129L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)129L-CD28 221 129L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(129L-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:221
[0495]
[0496] xxiv.272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-BB 222 272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-BB)的氨基酸序列，SEQ ID NO:222
[0497]
[0498] xxv.272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-CD28 223 272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:223
[0499]
[0500] xxvi.272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-DAP10 224 272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-DAP10)的氨基酸序列，SEQ ID NO:224
[0501]
[0502] xxvii.272L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272L-CD28 225 272L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272L-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:225
[0503]
[0504]
[0505] xxviii.2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-BB 226 2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-BB)的氨基酸序列，SEQ ID NO:226
[0506]
[0507] xxix.2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-CD28 227 2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:227
[0508]
[0509] xxx.2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-DAP10 228 2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-DAP10)的氨基酸序列，SEQ ID NO:228
[0510]
[0511] xxxi.2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592L-CD28 229 2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD 3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592L-CD28)的氨基酸序列，SEQ ID NO:229
[0512]
[0513] xxxii.信号肽信号230信号肽(信号)的氨基酸序列，SEQ ID NO:230 METPAQLLFLLLLWLPDTTG
[0514] xxxiii.T2A核糖体跳跃序列T2A 231 T2A核糖体跳跃序列(T2A)的氨基酸序列，SEQ ID NO:231 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
[0515] xxxiv.截短的CD19 tCD19 232截短的CD19(tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:232[0516]
[0517] xxxv.Ab 129 CDR H1 Ab129 CDR 1 233 Ab 129 CDR H1(Ab129 CDR 1)的氨基酸序列，SEQ ID NO:233 GGSVSSGGYY
[0518] xxxvi.Ab 129 CDR H2 Ab129 CDR 2 234 Ab 129 CDR H2(Ab129 CDR 2)的氨基酸序列，SEQ ID NO:234IYYTGST
[0519] xxxvii.Ab 129 CDR H3 Ab129 CDR 3 235 Ab 129 CDR H3 (Ab129 CDR 3)的氨基酸序列，SEQ ID NO:235 DYDWSFHFDY
[0520] xxxviii.Ab 129 CDR L1 Ab129 CDR 4 236 Ab 129 CDR L1(Ab129 CDR 4)的氨基酸序列，SEQ ID NO:236QGIRND
[0521] xxxix.Ab 129 CDR L2 Ab129 CDR 5 237 Ab 129 CDR L2(Ab129 CDR 5)的氨基酸序列，SEQ ID NO:237 AAS
[0522] xl.Ab 129 CDR L3 Ab129 CDR 6 238Ab 129 CDR L3(Ab129 CDR 6)的氨基酸序列，SEQ ID NO:238LQHNSYP
[0523] xli.Ab 272CDR H1Ab272 CDR 1 239Ab 272CDR H1(Ab272 CDR 1)的氨基酸序列，SEQ ID NO:239 GFIFSRYG
[0524] xlii.Ab 272 CDR H2 Ab272 CDR 2 240 Ab 272 CDR H2(Ab272 CDR 2)的氨基酸序列，SEQ ID NO:240IWYDGSNK
[0525] xliii.Ab 272 CDR H3 Ab272 CDR 3 241 Ab 272 CDR H3(Ab272 CDR 3)的氨基酸序列，SEQ ID NO:241 DYYDNSRHHWGFDY
[0526] xliv.Ab 272 CDR L1 Ab272 CDR 4 242 Ab 272 CDR L1(Ab272 CDR 4)的氨基酸序列，SEQ ID NO:242 RSSRSLLDSDDGNTYLD
[0527] xlv.Ab 272 CDR L2 Ab272 CDR 5 243 Ab 272 CDR L2(Ab272 CDR 5)的氨基酸序列，SEQ ID NO:243TLSYRAS
[0528] xlvi.Ab 272 CDR L3 Ab272 CDR 6 244 Ab 272 CDR L3(Ab272 CDR 6)的氨基酸序列，SEQ ID NO:244MQRVEFPIT
[0529] xlvii.Ab 2592 CDR H1 Ab2592 CDR 1 245 Ab 2592 CDR H1(Ab2592 CDR 1)的氨基酸序列，SEQ ID NO:245GGSISSDGY
[0530] xlviii.Ab 2592 CDR H2 Ab2592 CDR 2 246 Ab 2592 CDR H2(Ab2592 CDR 2)的氨基酸序列，SEQ ID NO:246 IYYSGST
[0531] xlix.Ab 2592 CDR H3 Ab2592 CDR 3 247 Ab 2592 CDR H3(Ab2592 CDR 3)的氨基酸序列，SEQ ID NO:247 ESPHSSNWYSGFDC
[0532] l.Ab 2592 CDR L1 Ab2592 CDR 4 248 Ab 2592 CDR L1(Ab2592 CDR 4)的氨基酸序列，SEQ ID NO:248 QSIGSR
[0533] li.Ab 2592 CDR L2 Ab2592 CDR 5 249 Ab 2592 CDR L2(Ab2592 CDR 5)的氨基酸序列，SEQ ID NO:249 YAS
[0534] lii.Ab 2592 CDR L3 Ab2592 CDR 6 250 Ab 2592 CDR L3(Ab2592 CDR 6)的氨基酸序列，SEQ ID NO:250HQSSNLPFT
[0535] liii.接头区亚基G4S 316接头区亚基(G4S)的核酸序列，SEQ ID NO:316 GGTGGTGGTGGTTCT
[0536] liv.接头区G4S接头251接头区(G4S接头)的核酸序列，SEQ ID NO:251
[0537]
[0538] lv.Ab 129 VH 129 VH 252 Ab 129 VH(129 VH)的核酸序列，SEQ ID NO:252[0539]
[0540] lvi.Ab 129 VL 129 VL 253 Ab 129 VL(129 VL)的核酸序列，SEQ ID NO:253[0541]
[0542] lvii.Ab 272 VH 272 VH 254 Ab 272 VH(272 VH)的核酸序列，SEQ ID NO:254[0543]
[0544] lviii.Ab 272 VL 272 VL 255 Ab 272 VL(272 VL)的核酸序列，SEQ ID NO:255[0545]
[0546] lix.Ab 2592 VH 2592 VH 256 Ab 2592 VH(2592 VH)的核酸序列，SEQ ID NO:256
[0547]
[0548] lx.Ab 2592 VL 2592 VL 257 Ab 2592 VL(2592 VL)的核酸序列，SEQ ID NO:257[0549]
[0550] lxi.129 hv-接头-lv 129H 258 129 hv-接头-lv(129H)的核酸序列，SEQ ID NO:258
[0551]
[0552] lxii.129 lv-接头-hv 129L 259 129 lv-接头-hv(129L)的核酸序列，SEQ ID NO:259
[0553]
[0554] lxiii.272 hv-接头-lv 272H 260 272 hv-接头-lv(272H)的核酸序列，SEQ ID NO:260
[0555]
[0556] lxiv.272 lv-接头-hv 272L 261 272 lv-接头-hv(272L)的核酸序列，SEQ ID NO:261
[0557]
[0558]
[0559] lxv.2592 hv-接头-lv 2592H 262 2592 hv-接头-lv(2592H)的核酸序列，SEQ ID NO:262
[0560]
[0561] lxvi.2592 lv-接头-hv 2592L 263 2592 lv-接头-hv(2592L)的核酸序列，SEQ ID NO:263
[0562]
[0563] lxvii.CD28铰链结构域CD28H 264 CD28铰链结构域(CD28H)的核酸序列，SEQ ID NO:264
[0564]
[0565] lxviii.CD28 跨膜结构域CD28TM 265 CD28跨膜结构域(CD28TM)的核酸序列，SEQ ID NO:265
[0566]
[0567] lxix.4-1BB共刺激结构域BBCYP 266 4-1BB共刺激结构域(BBCYP)的核酸序列，SEQ ID NO:266
[0568]
[0569] lxx.CD28共刺激结构域CD28CYP 267 CD28共刺激结构域(CD28CYP)的核酸序列，SEQ ID NO:267
[0570]
[0571] lxxi.DAP10共刺激结构域DAP10CYP 268 DAP10共刺激结构域(DAP10CYP)的核酸序列，SEQ ID NO:268
[0572]
[0573] lxxii.CD3ζ细胞内结构域CD3ζCYP 269 CD3ζ细胞内结构域(CD3ζCYP)的核酸序列，SEQ ID NO:269
[0574]
[0575] lxxiii.129H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)129H-CD28 270 129H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYPCAR(包括前导序列)(129H-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:270
[0576]
[0577] lxxiv.129L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)129L-CD28 271 129L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(129L-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:271
[0578]
[0579] lxxv.272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-BB 272 272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-BB)的核酸序列，SEQ ID NO:272
[0580]
[0581] lxxvi.272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-CD28 273 272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:273
[0582]
[0583] lxxvii.272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272H-DAP10 274 272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272H-DAP10)的核酸序列，SEQ ID NO:274
[0584]
[0585] lxxviii.272L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)272L-CD28 275 272L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(272L-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:275
[0586]
[0587] lxxix.2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-BB 276 2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-BB)的核酸序列，SEQ ID NO:276
[0588]
[0589] lxxx.2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-CD28 277 2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:277
[0590]
[0591] lxxxi.2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592H-DAP10 278 2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592H-DAP10)的核酸序列，SEQ ID NO:278
[0592]
[0593] lxxxii.2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)2592L-CD28 279 2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP CAR(包括前导序列)(2592L-CD28)的核酸序列，SEQ ID NO:279
[0594]
[0595] lxxxiii.信号肽信号280信号肽(信号)的核酸序列，SEQ ID NO:280
[0596]
[0597] lxxxiv.T2A核糖体跳跃序列T2A 281 T2A核糖体跳跃序列(T2A)的核酸序列，SEQ ID NO:281
[0598]
[0599] lxxxv.截短的CD19 tCD19 282截短的CD19(tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:282[0600]
[0601] lxxxvi.Ab 129 CDR H1 Ab129 CDR 1 283 Ab 129 CDR H1(Ab129 CDR 1)的核酸序列，SEQ ID NO:283 GGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGGTTACTAC
[0602] lxxxvii.Ab 129 CDR H2 Ab129 CDR 2 284 Ab 129 CDR H2(Ab129 CDR 2)的核酸序列，SEQ ID NO:284 ATCTATTACACTGGGAGCACC
[0603] lxxxviii.Ab 129 CDR H3 Ab129 CDR 3 285 Ab 129 CDR H3(Ab129 CDR 3)的核酸序列，SEQ ID NO:285 GATTATGACTGGAGCTTCCACTTTGACTAC
[0604] lxxxix.Ab 129 CDR L1 Ab129 CDR 4 286 Ab 129 CDR L1(Ab129 CDR 4)的核酸序列，SEQ ID NO:286CAGGGCATTAGAAATGAT
[0605] xc.Ab 129 CDR L2 Ab129 CDR 5 287 Ab 129 CDR L2(Ab129 CDR 5)的核酸序列，SEQ ID NO:287GCTGCATCC
[0606] xci.Ab 129 CDR L3 Ab129 CDR 6 288 Ab 129 CDR L3(Ab129 CDR 6)的核酸序列，SEQ ID NO:288CTACAGCATAATAGTTACCCT
[0607] xcii.Ab 272 CDR H1 Ab272 CDR 1 289 Ab 272 CDR H1(Ab272 CDR 1)的核酸序列，SEQ ID NO:289GGATTCATCTTCAGTCGCTATGGC
[0608] xciii.Ab 272 CDR H2 Ab272 CDR 2 290 Ab 272 CDR H2(Ab272 CDR 2)的核酸序列，SEQ ID NO:290 ATATGGTATGATGGAAGTAATAAA
[0609] xciv.Ab 272 CDR H3 Ab272 CDR 3 291 Ab 272 CDR H3(Ab272 CDR 3)的核酸序列，SEQ ID NO:291 GATTACTATGATAATAGTAGACATCACTGGGGGTTTGACTAC
[0610] xcv.Ab 272 CDR L1 Ab272 CDR 4 292 Ab 272 CDR L1(Ab272 CDR 4)的核酸序列，SEQ ID NO:292
[0611]
[0612] xcvi.Ab 272 CDR L2 Ab272 CDR 5 293 Ab 272 CDR L2(Ab272 CDR 5)的核酸序列，SEQ ID NO:293ACGCTTTCCTATCGGGCCTCT
[0613] xcvii.Ab 272 CDR L3 Ab272 CDR 6 294 Ab 272 CDR L3(Ab272 CDR 6)的核酸序列，SEQ ID NO:294 ATGCAACGTGTAGAGTTTCCTATCACC
[0614] xcviii.Ab 2592 CDR H1 Ab2592 CDR 1 295 Ab 2592 CDR H1(Ab2592 CDR 1)的核酸序列，SEQ ID NO:295GGTGGCTCCATCAGTAGTGATGGTTAC
[0615] xcix.Ab 2592 CDR H2 Ab2592 CDR 2 296 Ab 2592 CDR H2(Ab2592 CDR 2)的核酸序列，SEQ ID NO:296 ATCTATTACAGTGGGAGCACC
[0616] c.Ab 2592 CDR H3 Ab2592 CDR 3 297 Ab 2592 CDR H3(Ab2592 CDR 3)的核酸序列，SEQ ID NO:297 GAATCCCCTCATAGCAGCAACTGGTACTCGGGCTTTGACTGC
[0617] ci.Ab 2592 CDR L1 Ab2592 CDR 4 298 Ab 2592 CDR L1(Ab2592 CDR 4)的核酸序列，SEQ ID NO:298CAGAGCATTGGTAGTAGG
[0618] cii.Ab 2592 CDR L2 Ab2592 CDR 5 299 Ab 2592 CDR L2(Ab2592 CDR 5)的核酸序列，SEQ ID NO:299 TATGCTTCC
[0619] ciii.Ab 2592 CDR L3 Ab2592 CDR 6 300 Ab 2592 CDR L3(Ab2592 CDR 6)的核酸序列，SEQ ID NO:300 CATCAGAGTAGTAATTTACCATTCACT
[0620] civ.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-BB_tCD19 301前导序列_272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-BB_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:301
[0621]
[0622] cv.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-BB_tCD19 302前导序列_272H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-BB_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:302
[0623]
[0624]
[0625] cvi.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-CD28_tCD19 303前导序列_272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-CD28_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:303
[0626]
[0627] cvii.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-CD28_tCD19 304前导序列_272H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-CD28_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:304
[0628]
[0629]
[0630] cviii.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-DAP10_tCD19 305前导序列_272H-CD28H-CD28 TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-DAP10_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:305
[0631]
[0632] cix.前导序列_272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 272H-DAP10_tCD19 306前导序列_272H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(272H-DAP10_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:306
[0633]
[0634]
[0635]
[0636] cx.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-BB_tCD19 307前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-BB_tCD19的氨基酸序列，SEQ ID NO:307
[0637]
[0638] cxi.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-BB_tCD19 308前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-BBCYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592H-BB_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:308
[0639]
[0640]
[0641]
[0642] cxii.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-CD28_tCD19 309前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592H-CD28_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:309
[0643]
[0644] cxiii.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-CD28_tCD19 310前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592H-CD28_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:310
[0645]
[0646]
[0647]
[0648] cxiv.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-DAP10_tCD19 311前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592H-DAP10_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:311
[0649]
[0650]
[0651] cxv.前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592H-DAP10_tCD19 312前导序列_2592H-CD28H-CD28TM-DAP10CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592H-DAP10_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:312
[0652]
[0653]
[0654] cxvi.前导序列_2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592L-CD28_tCD19 313前导序列_2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592L-CD28_tCD19)的氨基酸序列，SEQ ID NO:313
[0655]
[0656] cxvii.前导序列_2592L-CD28H-CD28TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19 2592L-CD28_tCD19 314前导序列_2592L-CD28H-CD28 TM-CD28CYP-CD3ζCYP_T2A-tCD19(2592L-CD28_tCD19)的核酸序列，SEQ ID NO:314
[0657]
[0658]
[0659] cxviii.人TIM-1 TIM-1 315人TIM-1(TIM-1)的氨基酸序列，SEQ ID NO:315
[0660]
[0661]
[0662] 参考文献
[0663] 该列表中的参考文献按照上面的数字引用，并且全文以引用方式并入本文。
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