本发明涉及突变G蛋白偶联受体(GPCR)和选择那些具有增强稳定性的突变 G蛋白偶联受体的方法。特别的，其涉及突变GPCR的选择和制备，该突变GPCR 与其各自的亲代蛋白相比，在特定的条件下具有增强的稳定性。这样的蛋白更有 可能结晶，因此比亲代蛋白更可能顺应结构测定。其还对药物发现和开发研究是 有用的。

在过去的20年，膜蛋白结构的测定速度已经逐渐地加快，但是大多数成功是 在结晶来自细菌的膜蛋白而不是来自真核生物的膜蛋白[1]。在大肠杆菌 (Escherichia coli)中使用标准技术来过表达细菌膜蛋白比过表达真核生物膜蛋白 较容易[2，3]，并且有时细菌蛋白在去污剂中远更稳定，去污剂稳定性是纯化和结 晶的重要前提。基因组测序计划也允许克隆并表达许多特异转运蛋白或离子通道 的同源物，这也极大地增加了在结晶中的成功机会。但是，迄今在已经解决的120 种不同膜蛋白结构中，  只有哺乳动物完整膜蛋白的七种结构 (http://blanco.biomol.uci.edu/)；这些膜蛋白中的五种是从天然来源纯化的并且在 去污剂溶液中是稳定的。除了在过表达真核生物膜蛋白中的困难，其经常具有在 去污剂溶液中差的稳定性，这严重地限制了无需其立即变性或沉淀的可以探究的 结晶条件范围。理想地，膜蛋白应该在任何特定的去污剂溶液中在多日中是稳定 的，但是最适合生长衍射质量晶体的去污剂倾向是最破坏稳定性的去污剂，即那 些具有短脂肪链和小或带电荷头部基团的去污剂。我们想要解决的还是人类膜蛋 白结构，因为需要它们来通过制药工业帮助开发治疗试剂；通常来自不同哺乳动 物的受体、通道和转运蛋白的药理学有重大不同，同时酵母和细菌基因组可以不 包括任何同源蛋白。因此有极大需要研发允许产生去污剂稳定的真核生物完整膜 蛋白的一般性策略，以用于结晶和结构测定并且潜在地用于其它目的，如药物筛 选、生物鉴定和生物传感器应用。

为了确保细胞存活性，膜蛋白在膜中已经进化到足够稳定，但是其还没有进 化到在去污剂溶液中稳定，暗示膜蛋白可以人工进化并且可以分离对去污剂稳定 的突变体[4]。这随后在两个细菌蛋白，甘油二脂激酶(DGK)(diacylglycerol kinase) [5，6]和细菌视紫质(bacteriorhodopsin)[7]中得到证明。DGK的随机突变鉴定了 增加热稳定性的特异点突变，并且当结合时，效果是加和的，以致相对于天然蛋 白在55℃时6分钟的半衰期，优化稳定突变体在80℃具有35分钟的半衰期[6]。 显示去污剂抗性DGK突变体的三聚体在SDS中变得稳定，因此可能的是低聚物 状态的稳定在热稳定中扮演重要角色。虽然突变的目的是产生适合结晶的膜蛋白， 但是DGK的结构仍需测定并且还没有成功结晶的报道。通过沿着螺旋B的半胱氨 酸扫描突变的细菌视紫质的进一步研究证明不可能预测在突变时哪个氨基酸残基 将导致热稳定性，当研究结构范畴时，也不能弄清为什么热稳定性会发生[7]。

GPCR组成控制许多生理过程并且是许多有效药物靶向的一个极大的蛋白家 族。因此其在药理学上是相当重要的。在Foord等人(2005)Pharmacol Rev.57， 279-288中给出了GPCR的名单，通过引用引入本文。当分离时，GPCR通常是不 稳定的，并且即使用了相当大的努力，还不可能结晶除牛视紫质(bovine rhodopsin) 之外的任何GPCR，牛视紫质是天然格外稳定的。

GPCR是可作为药物的靶向，并且特别引用Overington等人(2006)Nature Rev. Drug Discovery 5，993-996，其指明现有药物的四分之一以上具有作为靶向的 GPCR。

GPCR被认为以多种不同构象存在，该构象与不同药理学配体，如激动剂和拮 抗剂类型相关，并且在这些构象中循环以便其作用(Kenakin T.(1997)Ann N Y Acad Sci 812，116-125)。

可以理解的是本发明的方法不包括D’Antona等人中描述的方法，该方法包括 将[3H]CP55940结合到组成型失活的突变人类大麻素(cannabinoid)受体1(T210A) 中，其中在210位的Thr残基被Ala残基代替。

在本说明书中对显然的在先发表文献的列表或讨论不应该必然地承认该文献 是现有技术的一部分或是公知常识。

我们已经认识到与试图结晶GPCR相关的两个严重问题，即其缺少在去污剂 中的稳定性和其存在多种构象的事实。为了发挥作用，GPCR已经进化到至少是在 激动剂结合形式和拮抗剂结合形式的两种不同构象间循环，并且在这两种构象之 间的变化可以在无配体时自发地发生。因此可能的是任何纯化受体拥有构象的混 合物。在结晶试验中只向GPCR加入配体，没有得到其结构的确定。为了增加结 晶的可能性，因此我们选择了增强GPCR稳定性的突变体，另外优选地将受体锁 在特定生物相关构象中。

我们决定看看在特定的生物相关构象中GPCR的稳定是否是可能的并且效果 是否足够大以致其将显著地增加获得衍射质量结晶的机会。例如在实施例1中， 为了几个原因，在这个研究中选择来自火鸡真核生物的β1-肾上腺素受体(βAR) [8]作为测试主题。βAR是G蛋白偶联受体(GPCR)，该受体已经在药理学上被很 好地开发，有许多商售配体并且是放射性标记的形式。另外，用杆状病毒表达系 统已经特别成功地过表达βAR并且可以将其以有功能的形式以毫克的量纯化[9]。 在实施例2中，使用人类腺苷受体，并且在实施例3中，使用大鼠神经紧张肽受 体。

选择具有增强稳定性的突变GPCR的方法

本发明的第一个方面提供选择具有增强稳定性的突变G-蛋白偶联受体 (GPCR)的方法，该方法包括

(a)提供一个或多个亲代GPCR突变体；

(b)选择配体，该配体是当GPCR位于特异构象中时结合亲代GPCR的配体；

(c)确定相对于亲代GPCR与该选定配体的结合来说，突变的GPCR与该选 定配体的结合是否具有增强的稳定性；和

(d)选择那些相对于亲代GPCR与该选定配体的结合来说，具有增强的稳定 性的突变的GPCR。

本发明人已经理解的是为了增加生物相关形式(其因此是药理学上有用的) GPCR结晶的可能性，需要的不只是增加蛋白的稳定性，还需要在一个特异构象中， 具有这一增加稳定性的蛋白。该构象通过选择的配体测定，并且是在特定药理学 相关构象中的生物相关构象。因此，本发明的方法可以被认为是一种选择GPCR 突变体方法，该突变体具有特定构象的增加稳定性的。例如其可以具有增加的构 象热稳定性。该方法可以通过突变用于创造稳定的、构象锁定的GPCR。选择的突 变GPCR是亲代分子的有效纯化形式，其中非常高比例的它们具有特定的构象状 态。因此，通过使用优选地结合到该构象的一种配体(或多种配体)精细的选择 从其它构象转变的所选受体的构象是本发明的一个重要特征。该方法也可以被认 为是一种选择更易于结晶的突变GPCR的方法。

因此本发明包括一种选择具有增加稳定性的突变G-蛋白偶联受体(GPCR)的 方法，该方法包括：

(a)提供一个或多个亲代GPCR突变体；

(b)选择配体，该配体是当GPCR位于特异构象中时结合亲代GPCR的配体；

(c)确定相对于亲代GPCR在特定构象中与该选定配体的结合来说，突变的 GPCR在特定构象中与该选定配体的结合是否具有增强的稳定性；和

(d)选择那些相对于亲代GPCR与该选定配体的结合来说，具有增强的稳定 性的突变的GPCR。

在Hopkins和Groom(2002)Nature Rev.Drug Discovery 1，727-730关于可药用 基因组的综述中，表1包括其中许多是GPCR的蛋白家族名单。Overington等人 (2006)Nature Rev.Drug Discovery 5，993-996提供更详细的药物靶向，并且图1显 示当前药物的四分之一以上靶向GPCR。在该类别中，在总的186个靶向中，有可 用口服药的52个GPCR靶向。

在本发明实施中适合使用的GPCR包括，但不限于β-肾上腺素受体、腺苷受 体、特别是腺苷A2a受体和神经紧张肽受体(NTR)。其它适合的GPCR是现有技 术中已知的并且包括那些以上Hopkins和Groom列表的GPCR。另外，国际药理 学联盟提出一个GPCR列表(Foord等人(2005)Pharmacol.Rev.57，279-288，通过 引用引入本文，并且该列表定期在网址 http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward上更新)。要注意的是主要 根据其氨基酸序列的相似性，GPCR分为不同种类。通过参考其结合的天然配体， 其也分成家族。所有的GPCR均包含在本发明的范围内。

许多GPCR的氨基酸序列(和编码它们的cDNA的核苷酸序列)是容易获得 的，例如通过参考GenBank。特别地，以上Foord等人从Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)给出人类基因符号和人类、小鼠和大鼠基因 ID。应该注意的还有，因为人类基因型序列基本是完整的，可以从那里推断出人 类GPCR的氨基酸序列。

虽然GPCR可以从任何来源衍生来，如果其是来自真核生物来源，其是特别 优选的。特别优选的是如果其衍生自脊椎动物来源，如哺乳动物或鸟。特别优选 的是如果GPCR衍生自大鼠、小鼠、或狗或非人类灵长类动物或人，或自鸡或火 鸡。为了避免疑问，在“衍生自”的意思中，我们包括cDNA或基因是自该来源使 用遗传物质最初获得的，但是该蛋白可以随后在任何宿主细胞中表达。因此，真 核生物GPCR可以在原核宿主细胞，如大肠杆菌中表达是平常的，但是当情况可 以，可以考虑是源自鸟或哺乳动物。

在某些情况下，GPCR可以由多个不同亚基组成。例如，降钙素(calcitonin) 基因相关肽受体需要结合单一跨膜螺旋蛋白(RAMP1)而获得其生理学配体结合 特征。与GPCR结合形成或调节功能复合体的效应器、附加物(accessory)、辅助 器(auxiliary)或GPCR-相互作用蛋白在本领域中是已知的并且包括，例如，受体 激酶、G-蛋白和抑制蛋白(arrestin)(Bockaert等人(2004)Curr Opinion Drug Discov and Dev 7，649-657)。

亲代GPCR的突变体可以以任何适合的方法产生并且以任何适合的形式提供。 因此，例如，可以制造一系列特异亲代蛋白突变体，其中在所有或部分亲代蛋白 中每个氨基酸残基被单独地换成另一种氨基酸残基。例如，可以方便地在那些被 预测是跨膜的部分蛋白中制造突变体。视紫红质的三维结构是已知的(Li等人 (2004)J Mol Biol 343，1409-1438；Palczewski等人(2000)Science 289，739-745)，并 且用该结构模拟某些GPCR是可能的。因此，方便地，需要突变的部分GPCR可 以基于模拟制造。同样地，根据疏水性模拟GPCR跨膜区的计算机程序是可用的 (Kyle和Dolittle(1982)J.Mol.Biol.157，105-132)，并且当选择需要突变的部分蛋 白时，可以使用这样的模型。可以使用常规定点突变，或可以使用在本领域中已 知的基于聚合酶链式反应的过程。在选择突变蛋白中，可以使用但不是很希望使 用核糖体显示方法。

通常，虽然其可以用任何其它氨基酸代替，每个所选氨基酸被Ala代替(即 Ala-扫描突变)。如果所选氨基酸是Ala，其可以方便地被Leu代替。或者，该氨 基酸可以被Gly代替(即Gly-扫描突变)，这样可以允许较近的折叠相邻螺旋，可 以将蛋白锁在特定构象中。如果所选氨基酸是Gly，其可以方便地被Ala代替。

虽然用于代替在特定位置上的特定氨基酸通常是天然出现的氨基酸，通常是 “可编码的”氨基酸，但是其可以是非天然氨基酸(在这种情况下，蛋白通常是用化 学合成或通过使用非天然氨基酰tRNA制造的)。“可编码的”氨基酸是通过翻译 mRNA引入多肽的。还可能在特定位置通过共价化学修饰，例如通过翻译后处理 蛋白或半合成，创造非天然氨基酸或引入非肽连接。这些翻译后修饰可以是天然 的，如磷酸化、糖基化或棕榈酰化(palmitoylation)，或合成或生物合成。

或者，可以通过随机突变过程产生突变体，其可以是整个蛋白或其所选部分。 随机突变过程在本领域中是已知的。

方便地，突变GPCR与亲代蛋白相比具有一个替换氨基酸(即其在一个氨基 酸位置被突变)。用该方法，可以评估一个氨基酸替换对稳定性的贡献。但是，分 析的突变GPCR与亲代蛋白相比可以具有多个替换氨基酸，如2或3或4或5或6 个替换。

如下面更详细讨论的，根据选择方法的结果，可以制造突变的组合。已经发 现在某些特殊情况中在单一突变蛋白中的突变组合导致进一步增加稳定性。因此 可以理解的是本发明的方法可以用于重复方法通过，例如实现该方法以便鉴定增 加稳定性的单一突变，组合那些在单一突变GPCR中的突变，所述GPCR是在方 法(a)部分中提供的。因此，可以使用方法来选择多重突变的突变蛋白。

亲代GPCR不需要是天然存在的蛋白。方便地，其可以是能够在合适的宿主 有机体如大肠杆菌中表达的工程化版本。例如，如实施例1中描述的，火鸡β-肾上 腺素受体方便的工程化版本是被截短的和缺少氨基酸序列残基1-33的受体(即 βAR34-424)。亲代GPCR可以是截短形式的天然存在蛋白(在任一端或两端截短)， 或者其可以是对天然存在蛋白或是对其片段的融合体。或者或另外，与天然存在 的GPCR相比，可以修饰亲代GPCR以便增加例如可溶性、蛋白水解稳定性(例 如通过截短、删除环，突变糖基化位点或突变反应性氨基酸侧链如半胱氨酸)。在 任何情况下，亲代GPCR是能够结合到所选配体的蛋白，该配体是已知结合天然 存在GPCR的配体。方便地，亲代GPCR是：当加入一个合适的配体时，可以影 响公知的被G-蛋白激活作用影响的任一或多个下游活动。

但是，应理解的是突变体的稳定性需要与亲代比较以便能够评价稳定性的增 加。

选择一种配体，当位于特定构象时，该配体结合到亲代GPCR上。通常，该 配体将结合到亲代GPCR的一种构象上(并且可以造成GPCR采取该构象)，但是 对GPCR能够采取的另一种构象结合不强。因此，可以认为配体的存在是促进 GPCR采取特定的构象。因此，可以考虑该方法是一种选择突变GPCR的方法， 该GPCR被俘获在生物相关构象中(例如配体结合状态)，并且关于该构象是更稳 定的。

优选地，其中在步骤(c)中GPCR残基的特定构象对应在步骤(b)中所选 配体种类。

优选地，所选配体来自配体激动剂种类并且该特定构象是激动剂构象，或者 所选配体来自配体拮抗剂种类并且该特定构象是拮抗剂构象。

优选地所选配体来自配体激动剂种类并且其中在步骤(c)中GPCR的特定构 象是激动剂构象。

优选地，与野生类型受体相比，所选配体对突变受体的结合亲和力应该为相 等或更大；通常淘汰对所选配体显示显著减少结合的突变体。

“配体”中包括结合GPCR并且造成GPCR位于特定构象的任何分子。该配体 优选地是造成GPCR分子的多一半在特定构象的配体。

许多适合的配体是已知的。

通常，配体是完全激动剂并且能够结合GPCR并且能够引起完全(100％)生 物反应，通过例如G-蛋白偶联、下游信号事件或生理学输出如血管舒张测定。因 此，通常生物反应是在G-蛋白中的GDP/GTP交换，随后是对连接效应通路的刺 激。通常测量是GDP/GTP交换或通路终产物水平的变化(例如cAMP、cGMP或 肌醇磷酸盐)。配体还可以是部分激动剂并且能够结合GPCR并且能够引起部分 (＜100％)生物反应。

配体还可以是反向激动剂，其是结合受体并且甚至有时是减低其基础(即未 被激动剂刺激)活性至零的分子。

配体还可以是拮抗剂，其是结合受体并且阻止激动剂结合的分子，所以防止 生物反应。反向激动剂和部分激动剂可以在某些分析条件下是拮抗剂。

上述配体可以是原位的(orthosteric)，其中包括其作为内源激动剂与相同位点 结合；或其可以是异构的(allosteric)或异位的(allotopic)的，包括其与不同于 原位的位点结合的意思。上述配体可以是临接关系的(syntopic)，包括在相同或重 叠位点其与其它配体相互作用的意思。其可以是可逆的或不可逆的。

涉及拮抗剂，其可以是可克服的，包括预处理或用拮抗剂同时处理的刺激而 不降低激动剂最大效果的意思；或其可以是不可克服的，包括预处理或用拮抗剂 同时处理的刺激而降低激动剂最大效果的意思；或其可以是中性的，包括拮抗剂 没有反向激动剂或部分激动剂活性的意思。拮抗剂通常还是反向激动剂。

本发明使用的配体还可以是异构调节剂如正向异构调节剂、增效剂 (potentiator)，负向异构调节剂和抑制剂。其可以独立地具有作为激动剂或反向激 动剂的活性或其可以只在激动剂或反向激动剂存在时具有活性，在该情况下其用 于与这样的分子结合以便结合GPCR。

通过参考在此引入的Neubig等人(2003)Pharmacol.Rev.55，597-606描述了 不同种类的配体。

优选地，上述配体是小的有机或无机半体，但其可以是肽或多肽。通常，当 配体是小有机或无机成分时，其具有50-2000，如100-1000，例如100-500的Mr。

通常配体以mM至pM的Kd结合GPCR，如在μM(微摩尔)至nM的范围。通 常，具有最低Kd的配体是优选的。

小的有机分子配体在本领域中是已知的，例如见下面的实施例。其它小分子 配体包括在5HT1A受体上是完全激动剂的5HT；依托拉嗪(eltoprazine)，其在 5HT1A受体上是部分激动剂(见Newman-Tancredi等人(1997)Neurophamacology 36，451-459)；(+)-丁克吗(butaclamol)和螺环哌啶酮(spiperone)是多巴胺D2 受体反向激动剂(见Roberts和Strange(2005)Br.J.Pharmacol.145，34-42)； WIN55212-3是CB2的中性拮抗剂(Savinainen等人(2005)Br.J.Pharmacol.145， 636-645)。

配体可以是拟肽(peptidomimetic)、核酸、肽核酸(PNA)或适体(aptamer)。 其可以是离子如Na+或Zn2+、脂类如油酸酰胺(oleamide)或碳水化合物如肝素 (heparin)。

配体可以是结合GPCR的多肽。这样的多肽(包括寡肽)通常在Mr500至 Mr50000，但是可以更大。只要其选择性地结合特定构象的GPCR，多肽可以是天 然存在的GPCR相互作用蛋白或与GPCR相互作用的其它蛋白，或衍生物或其片 段。GPCR相互作用蛋白，包括那些具有与信号系统相关并且与运输(trafficking) 相关的蛋白，其经常通过在GPCR的C末端部分的PDZ结构域起作用。

已知结合某种GPCR的多肽包括任何G蛋白、抑制蛋白、RGS蛋白、G蛋白 受体激酶、RAMP、14-3-3蛋白、NSF、periplakin、spinophilin、GPCR激酶、受 体酪氨酸激酶、离子通道或其亚基、锚蛋白(ankyrin)和Shanks或Homer蛋白。 其他多肽包括NMDA受体亚基NR1或NR2a、calcyon或纤维连接蛋白(fibronectin) 结构域骨架。多肽可以是结合GPCR细胞外结构域的多肽，如fibulin-1。多肽可以 另一种与杂合寡聚物中所选GPCR结合的GPCR。在Milligan和White(2001)Trends Pharmacol.Sci.22，513-518，或在Bockaert等人(2004)Curr.Opinion Drug Discov. Dev.7，649-657中有对GPCR的蛋白-蛋白相互作用的综述。上述综述通过参考引 入本文。

多肽配体可以方便地是结合GPCR的抗体。术语“抗体”包括天然发生的抗体、 单克隆抗体和其片段。还包括工程化抗体和在其结合特征中是类抗体的分子，包 括单链Fv(scFv)分子和结构域抗体(dAbs)。还提及的是camelid抗体和工程化 camelid抗体。结合GPCR的这样的分子在本领域中是已知的并且在任何情况下可 以用现有技术制造。适合的抗体包括当前用于对GPCR放射免疫分析(RIA)的抗 体，因为其倾向于识别构象抗原决定簇。

多肽还可以是基于组件骨架(modular framework)的结合蛋白，如锚蛋白重 复蛋白、犰狳(armadillo)重复蛋白、富含亮氨酸蛋白、四三肽(tetratriopeptide) 重复蛋白或设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)或基于lipocalin的蛋白或纤维连接 蛋白结构域或基于人类γ晶状的Affilin生物基材(scaffolds)或人类泛素。

在本发明的一个具体实施方式中，配体是共价加入GPCR的，如作为G-蛋白 或抑制蛋白融合蛋白。某些GPCR(例如凝血酶(thrombin)受体)在N-末端被蛋 白酶切割并且新的N-末端结合到激动剂位点。因此，这样的GPCR是天然GPCR- 配体融合体。

应理解的是抗体或其它“通用”结合多肽(如已知与许多不同GPCR偶联的G- 蛋白)的使用，在使用对于“孤儿”GPCR的方法时，可以是特别有优势的，对于该 GPCR来说，天然配体和小分子配体是未知的。

一旦选择了该配体，然后测定相对于亲代GPCR与该选定配体的结合来说， 突变的GPCR与该选定配体的结合是否具有增强的稳定性。应理解的是这个步骤 (c)是通过所选择的配体来测定定该GPCR或每个GPCR对于特定构象来说，相 对于其亲代是否具有增加的稳定性的步骤。因此通过配体结合或者是当结合所选 配体时测定，关于结合所选配体，突变GPCR具有增加的稳定性。如下面讨论的， 特别优选的是当结合所选配体时，评估增加的稳定性。

通过在可以导致不稳定的强加条件下(如热、严苛去污剂条件、离液试剂等) 可方便地测定增加的稳定性。通常通过测量变性或失去结构来测定在强加条件下 失去稳定性。如下面讨论的，这可以通过失去配体结合能力或失去二级或三级结 构指标自我证明。

如关于下面图12(其描述了特别的、优选的具体实施方式)描述的，有可以 用于测定突变GPCR稳定性的不同分析形式。

在一个具体实施方式中，在测定突变体稳定性过程之前，可以将突变GPCR 与配体接触(在检测期间突变GPCR和配体保持接触)。因此例如，当使用该方法 选择以一种构象结合配体并且具有增加的热稳定性的突变GPCR时，在加热前受 体与配体接触，然后在加热后结合受体的配体的量可以用于表达与亲代受体比的 热稳定性。这提供了测量暴露于变性条件(如热)后，保留了配体结合能力的GPCR 的数量的方法，因此其是稳定性的一个指标。

在另一个(但优选度较低的)具体实施方式中，在突变GPCR其与配体接触 前测定突变体的稳定性。因此，例如当将该方法用于选择以一种构象与配体结合 并且具有增加热稳定性的突变膜受体时，在与配体结合前首先加热受体，然后可 以将结合受体的配体量用于表达热稳定性。此外，这提供了GPCR量的测量方法， 该GPCR在暴露于变性条件下保留配体结合能力。

在在两个具体实施方式中，应理解的是在相同条件下通过参考亲代分子作出 突变体稳定性的比较。

应理解的是在这两个具体实施方式中，与亲代蛋白相比，所选突变体是当位 于特定构象中时具有增加稳定性的突变体。

优选的途径可以根据特定的GPCR，并且将根据在无配体时，蛋白可使用的构 象数量。在图12中描述的具体实施方式中，优选的是如果配体存在于加热步骤中， 因为这增加了所需构象被选择的可能性。

根据上述，应理解的是本发明包括选择具有增加热稳定性的突变GPCR的方 法，该方法包括(a)提供一种或多种亲代GPCR的突变体，(b)选择结合亲代 GPCR的拮抗剂或激动剂，(c)在特定温度下，并且在特定时间后，当存在所述拮 抗剂或激动剂时，通过测定突变GPCR结合所选的所述拮抗剂或激动剂的能力来 测定与亲代GPCR相比，该突变体或每个突变体是否具有增加的热稳定性，并且 (d)在特定温度下并且在特定时间后，选择那些比亲代GPCR在相同条件下结合 更多所选的所述拮抗剂或激动剂的突变GPCR。在步骤(c)中，通常将在特定温 度下的一个固定时间段用于测定突变GPCR结合所选所述拮抗剂或激动剂的能力。 在步骤(c)中，通常选择一个温度和时间，其中在该温度下在固定的时间段，亲 代GPCR对所选所述拮抗剂或激动剂的结合降低50％(其显示50％的受体是失活 的；“类似”Tm)。

方便地，当将配体用于分析GPCR时(即用于测定其是否在非变性状态)，将 配体可检测地标记，例如放射标记或荧光标记。在另一个具体实施方式中，可以 通过用第二检测系统来测定未结合配体的量评估配体结合，所述第二检测系统例 如一个抗体或共价地连接到可检测成分的其它高亲和结合伴侣，例如可以用于色 度法分析的酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。可以使用FRET方法。应理解 的是用于检测其稳定性的分析突变GPCR的配体不需要是与该方法步骤(b)中所 选的相同配体。

虽然通过应用其结合配体的能力(该配体是存在非变性蛋白的指标)来测定 亲代和突变GPCR稳定性是方便的，在本领域中已知有其它方法。例如，荧光光 谱的改变可以是解折叠的敏感指标，或者使用内源色氨酸荧光或使用外源荧光探 针如1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)，例如如在ThermofluorTM方法(Mezzasalma等人， J Biomol Screening，2007，Apr；12(3)：418-428)中应用的。通过质谱、天然蓝胶(blue native gel)、毛细管区带电泳、圆二色谱(CD)光谱和光散射测定的蛋白水解稳定 性、氘/氢交换也可以用于测定通过失去与二级或三级结构相关信号的解折叠。但 是，在其可以使用前，所有这些方法需要以合理的量纯化蛋白(例如高pmol/nmol 量)，而实施例中描述的方法使用pmol量的基本上未纯化的GPCR。

在优选的具体实施方式中，在步骤(b)中选择同样种类的两种或更多配体， 每个的存在造成GPCR位于同样的特点构象中。因此在该具体实施方式中，可以 使用一种或更多同样种类(例如完全激动剂或部分激动剂或拮抗剂或反向激动剂) 的配体(天然或非天然的)。在该过程中包括多种同样种类的配体，不管是顺序还 是平行，将使得未加注意的工程化的理论风险，和选择实质上不同于亲代的多种 突变受体构象(例如在其结合位点上，但由于代偿性改变，还能够结合配体)的 理论风险降到最小。下列步骤可以用于减少该风险：

1.通过例如结合或功能性或分光分析显示，在共同的药理学种类中选择化学上 不同的一套配体(例如n＝2-5)。虽然其不必表达共同的药效团(pharmacophore)， 这些配体应该被认为结合受体的共同立体区，例如使用野生型和/或突变受体，和/ 或通过分子模型通过竞争结合来证明。

2.制造用于增加稳定性的单一或多种受体突变体，并且通过全套配体分析紧 密结合。分析可以是平行的，多种的或以系列进行。

3.通过测定例如对每个配体的结合等温线(isotherm)，以及通过测定结合配 体的稳定性变化(与野生型相比，窗口应该通常变窄)来确定稳定受体突变体的 可靠性。

为了防护由于在突变时干扰结合位点造成的明显亲和力改变，优选使用同样 药理学种类但是不同化学种类的配体来概括该受体。尽管具有不同分子识别性质， 这些应该通常显示相似的亲和力变化(突变对亲代，例如野生型)。结合实验应该 优选地在同样药理学种类中使用标记的配体完成。

虽然如此应该认识到的是：在同样药理学种类中存在化学种类特异性的构象 底物，并且根据所选配体的化学种类，在过程中其可以是特别稳定的。

通常所选配体以其结合亲代GPCR的相似能力结合突变GPCR。通常，对于 特定配体结合突变GPCR和亲代GPCR的Kd值相互是在5-10倍范围中，如在2-3 倍范围中。通常，配体结合突变GPCR相对于结合亲代GPCR应该不弱于5倍并 且不强于10倍。

通常，在所选构象中已经稳定的突变受体应该以约同等亲和力(就是说通常 在2-3倍范围中)或比亲代受体更大亲和力结合所选配体。对于激动剂-构象突变 体，突变体通常以与亲代GPCR比，相同或更高的亲和力结合激动剂并且通常以 与亲代GPCR比，相同或更低的亲和力结合拮抗剂。相似地对于拮抗剂-构象突变 体，突变体通常以与亲代GPCR比，相同或更高的亲和力结合拮抗剂并且通常以 与亲代GPCR比，相同或更低的亲和力结合激动剂。

通常淘汰对所选配体显示显著减少(通常在2-3倍以上)亲和力的突变体。

通常，虽然可以有一或两个顺序反向，或可以有离群的逸出项(out-lier)，相 同种类的一套配体的结合等级顺序是相当的。

在进一步具体实施方式中，可以使用以相同构象同时结合受体的两种或更多 配体，例如异构调节器和原位激动剂。

为了避免疑问，在实施例中明显的是，不必为了该方法有效而使用多种配体。

在进一步具体实施方式中，优选的是选择这样的突变GPCR：其虽然仍然能够 结合所选配体，但是不能结合与第一种配体不同种类的第二种所选配体或比亲代 GPCR结合较弱。因此例如，突变GPCR可以是在其关于结合所选拮抗剂具有增 加稳定性的基础上选择的，但是进一步检测这样选择的突变GPCR以便测定其是 否结合完全激动剂(或比亲代GPCR对完全激动剂结合较弱)。选择那些不结合(或 结合较少)完全激动剂的突变体。用该方法，完成对锁定在一种特定构象中的GPCR 的进一步选择。

应理解的是上述的所选配体(关于方法的(b)部分)和进一步(第二)配体 可以是任何种类的配体对，例如：拮抗剂和完全激动剂、完全激动剂和拮抗剂、 拮抗剂和反向激动剂、反向激动剂和拮抗剂、反向激动剂和完全激动剂、完全激 动剂和反向激动剂等。

优选的是突变受体与进一步(第二)配体结合的亲和力，是亲代受体对相同 的进一步(第二)配体的亲和力的50％以下，更优选地是10％以下，再更优选为 1％或0.1％或0.01％以下。因此第二配体与突变受体相互作用的Kd高于亲代受体。 如实施例1显示，突变β-肾上腺素受体βAR-m23对激动剂的结合比亲代弱3个数 量级以上(即Kd是高于1000倍)。相似地，在实施例2中，突变腺苷A2a受体Rant21 对激动剂的结合比其亲代弱2-4个数量级以上。

这种反向选择类型是有用的，因为其可以用于沿着一个通路，更特异地(因 此更快速并且更有效)朝向被配体限定的纯构象来指导突变过程。

优选提供适合的稳定形式的突变GPCR，在该形式中，其保持结构完整性并且 该GPCR是有功能的形式(例如能够与配体结合)。使用可以被本领域技术人员选 择的而对特定蛋白是有效的适当溶解系统，如合适的去污剂(或其他两亲试剂) 和缓冲液系统。通常可以使用的去污剂包括，例如十二烷基麦芽糖苷(DDM)或 CHAPS或辛基葡萄糖苷(OG)或许多其它去污剂。可以方便的包括其它化合物如 胆固醇半琥珀酸酯或胆固醇本身或1，2，3-庚三醇(heptane-1，2，3-triol)。甘油或吡咯 氨酸(proline)或甜菜碱(betaine)的存在可以是有用的。重要的是GPCR一旦 从其位于的膜中溶解，对于分析必须足够稳定。对某些GPCR，DDM将是足够的， 但是如果需要，可以为了分析的目的加入甘油或其它多元醇增加稳定性。为了分 析目的，可以获得进一步稳定性，例如通过溶于DDM、CHAPS和胆固醇半琥珀 酸酯的混合物中，甘油选择性存在。对于特别不稳定的GPCR，需要用洋地黄皂甙 (digitonin)或amphipol或其它聚合物(所述聚合物可以将GPCR直接从膜上溶 解)将其溶解(而不存在传统去污剂)，并且通常通过允许大量脂质继续与GPCR 结合来维持稳定性。还可以使用毫微级圆盘(Nanodisc)溶解极端不稳定的功能形 式膜蛋白。

通常，在粗提取物中(例如来自表达它的宿主细胞如大肠杆菌的膜组分)提 供突变GPCR。可以提供一种形式的GPCR，其中突变蛋白通常包括至少75％、更 通常至少80％或85％或90％或95％或98％或99％的在样品中存在的蛋白。当然， 将其通常如上所述溶解，所以突变GPCR通常与去污剂分子和/或脂质分子结合。

可以选择具有对任何变性剂或变性条件具有增加的稳定性的突变GPCR，所述 变性条件如加热、去污剂、离液试剂或极端pH中的任一项或多项。

关于对热增加的稳定性(即热稳定性)，通过在特定温度下测量配体结合或通 过使用分光方法如荧光、CD或光散射可以容易地测定。通常，当GPCR结合配体 时，在特定温度下GPCR结合该配体的能力可以用于测定突变体的热稳定性。可 以方便地测定“类似Tm”即在所述条件下，在孵育特定时间段后(如30分钟)50％ 受体被失活的温度。具有较高热稳定性的突变GPCR与其亲代比有增加的类似Tm。

关于对去污剂或离液剂(chaotrope)的稳定性增加，通常在测试去污剂或测 试离液剂存在时，将GPCR，孵育一个限定的时间，并且该稳定性是通过使用例如 上所述的配体结合或分光方法测定的。

关于极端pH，选择通常的测试pH(例如在4.5-2.5范围内(低pH)或在8.5-9.5 范围内(高pH))。

因为在结晶中使用相对严苛的去污剂，优选地在这样的去污剂存在时，突变 GPCR是稳定的。某些去污剂的“严苛”顺序是DDM、C11→C10→C9→C8麦芽糖 苷(maltoside)或葡萄糖苷(glucoside)、十二烷基二甲胺氧化物(lauryldimethylamine oxide(LDAO))和SDS。特别优选的是突变的GPCR对于任何C9麦芽糖苷或葡 萄糖苷、C8麦芽糖苷或葡萄糖苷、LDAO和SDS更稳定，因此优选地是为了稳定 性测试，使用这些去污剂。

由于其测定的容易性，优选地是测定热稳定性，并且选择那些关于所选条件 与亲代蛋白相比具有增加的热稳定性的突变体。应理解的是热是作为变性剂而起 作用的，并且其可以通过冷却样品容易地去除，例如通过放在冰上。据信热稳定 性对其他变性剂或变性条件还可以是稳定性的一个指向。因此增加的热稳定性在 变性去污剂中似乎转变为稳定性，特别是那些比DDM更具变性力的去污剂，例如 那些具有小的头部基团和短烷基链和/或有带电头部基团的去污剂。我们发现热稳 定的GPCR对于严苛去污剂也更稳定。

当作为变性条件使用极端pH时，应理解的是可以通过加入中和试剂将其快速 去除。相似地，当作为变性剂使用离液剂时，通过将样品稀释在离液剂发挥其离 液剂效果的浓度以下，可以去除变性效果。

在本发明的特定具体实施方式中，GPCR是β-肾上腺素受体(例如来自火鸡) 并且配体是一种拮抗剂：双氢心得舒(dihydroalprenolol)(DHA)。

在本发明的进一步优选的具体实施方式中，GPCR是腺苷A2a受体(A2aR)(例 如来自人)并且配体是一种拮抗剂：ZM 241385(4-[2-[[7-氨基-2-(2-呋喃基)[1，2，4]- 三唑[2，3-α][1，3，5]三嗪-5基]氨基]乙基]酚)，或一种激动剂：NECA(5′-N-乙基羧胺 腺苷(ethylcarboxamido adenosine))。

还在进一步优选的具体实施方式中，GPCR是神经紧张肽受体(NTR)(例如， 来自大鼠)并且配体是一种激动剂：神经紧张肽。

本发明的第二方面提供一种制备突变GPCR的方法，该方法包括

(a)实现本发明的第一方面的方法；

(b)鉴定所选的增加稳定性的突变GPCR中突变的氨基酸残基的位置；和

(c)合成在所鉴定的一个或多个位置上含有突变的突变GPCR。

如在实施例中可见的，令人惊讶地，关于蛋白位于特定构象的特定条件，与 亲代蛋白相比，在GPCR中单一氨基酸的变化可以增加蛋白的稳定性。因此在本 发明第二方面方法的具体实施方式中，在突变蛋白中，改变了亲代蛋白的单一氨 基酸残基。通常，将该氨基酸残基变为在本发明的第一方面方法中，在测试的突 变体中发现的氨基酸残基。但是，其可以由任何其它氨基酸残基，如任何天然存 在氨基酸残基(特别地是“可编码”氨基酸残基)或非天然氨基酸代替。一般地，为 了方便，将氨基酸残基用19种其它可编码氨基酸代替。优选地，其是在本发明第 一方面中的所选突变体中存在的替换氨基酸。

在实施例中还可见的是，稳定性的进一步增加可以通过替换亲代蛋白的多个 氨基酸而获得。通常，每个被替换氨基酸是使用本发明第一方面方法鉴定的氨基 酸。通常，虽然如上注释的，其可以被其它氨基酸代替，每个被鉴定氨基酸用在 突变蛋白中存在的氨基酸代替。

通常，与亲代蛋白相比，突变GPCR含有1-10个替换氨基酸，优选地是1-8 个，通常是2-6个，如2、3、4、5或6个替换氨基酸。

应理解的是多种突变体可以适用本发明第一方面方法的选择。换句话说，在 本发明第一方面方法的步骤(a)中可以提供多种突变体。应理解的是通过本发明 第一和/或第二方面，可以产生多种诱变处理的GPCR，选择其构象以创造非常稳 定的多点突变蛋白。

可以通过任何方法制备突变GPCR。方便地，突变蛋白是由合适的核酸分子编 码的并且在合适的宿主细胞中表达。用在本领域中已知标准的克隆技术、定点突 变和PCR可以产生编码突变GPCR的合适的核酸分子。合适的表达系统包括在细 菌或酵母中的组成型或诱导型表达系统、病毒表达系统如杆状病毒、semliki森林 病毒和慢病毒(lentivirus)或在昆虫或哺乳动物细胞中的瞬时转染。合适的宿主细 胞包括大肠杆菌、乳球菌(Lactococcus lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)。合适的动物宿 主细胞包括HEK 293、COS、S2、CHO、NSO、DT40等。已知某些GPCR需要特 定脂质(例如胆固醇)而起作用。在那种情况下，需要选择含有脂质的宿主细胞。 另外或选择性地，在分离和纯化突变蛋白中可以加入脂质。应理解的是这些表达 系统和宿主细胞还可以用于供应在本发明第一方面方法步骤(a)中的突变GPCR。

用于克隆和工程化基因和cDNA、突变DNA和在宿主细胞中从多核苷酸表达 多肽的分子生物学方法在本领域中是已知的，如在“Molecular cloning，a laboratory manual”，third edition，Sambrook，J.和Russell，D.W.(eds)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中举例说明的，通过参考引入本文。

在本发明第一或第二方面的进一步具体实施方式中，需要测定所选或制备的 突变GPCR是否能够偶联G-蛋白。还优选的是测定所选或制备的突变GPCR是否 能够以与亲代GPCR相当的亲和扩展性和/或亲和等级序列，与那些和选择配体属 于同样种类的多种配体结合。

本发明的第三方面提供通过本发明第二方面方法制备的突变GPCR。

本发明包括与其亲代GPCR比，具有增加稳定性的突变GPCR，特别是那些 具有增加热稳定性的GPCR。

突变β-肾上腺素受体

β-肾上腺素受体在本领域是熟知的。它们彼此共有序列同源性并且结合肾上腺 素(adrenalin)。

本发明的第四方面提供突变的β-肾上腺素受体，当与相应的野生型β-肾上腺素 受体比时，具有在对应下列任何一个或多个位置上的不同氨基酸，所述位置根据 火鸡β-肾上腺素受体的编号，如图9中展示的：Ile 55、Gly 67、Arg 68、Val 89、 Met 90、Gly 98、Ile 129、Ser 151、Val 160、Gln 194、Gly 197、Leu 221、Tyr 227、 Arg 229、Val 230、Ala 234、Ala 282、Asp 322、Phe 327、Ala 334、Phe 338。

只要在一个或多个氨基酸位置将其突变，突变的β-肾上腺素受体可以是任何β- 肾上腺素受体突变体。该氨基酸位置是通过参考特定火鸡β-肾上腺素受体氨基酸序 列确定的。

特别优选的是，当与特定火鸡β-肾上腺素受体序列相比时，突变GPCR具有 至少20％氨基酸序列同一性，这用MacVector和CLUSTALW(Thompson等人(1994) Nucl.Acids Res.22，4673-4680)确定。更优选地，突变受体具有至少30％或至少40％ 或至少50％氨基酸序列同一性。在天然配体结合的原位(“活性”)位点周围保留 的通常具有高度氨基酸序列同一性。

如在实施例1和下面图1中描述的，在亲代火鸡β-肾上腺素受体序列(如图9 显示)中下列氨基酸残基的个别替换导致热稳定性的增加：Ile 55、Gly 67、Arg 68、 Val 89、Met 90、Gly 98、Ile 129、Ser 151、Val 160、Gln 194、Gly 197、Leu 221、 Tyr 227、Arg 229、Val 230、Ala 234、Ala 282、Asp 322、Phe 327、Ala 334、Phe 338。

因此，本发明包括突变火鸡β-肾上腺素受体，其中与其亲代相比，一个或多个 这些氨基酸残基已经被另一种氨基酸残基代替。本发明还包括其它来源的突变β- 肾上腺素受体，其中在亲代受体中的一个或多个相应氨基酸被另一种氨基酸残基 代替。为了避免疑问，亲代可以是具有天然存在序列的β-肾上腺素受体，只要其保 持配体结合能力，或可以是截短形式或其可以是天然存在蛋白的融合体或其片段 的融合体，或与天然存在序列相比，其可以含有突变。

“对应氨基酸残基”的意思包括，当用MacVector和CLUSTALW比较火鸡β-肾 上腺素受体和其它β-肾上腺素受体时，与火鸡β-肾上腺素受体中的特定氨基酸残基 匹配(align)的在另一个β-肾上腺素受体中的氨基酸残基。

图9显示火鸡β-肾上腺素受体和人类β1、β2和β3 β-肾上腺素受体之间的匹 配。

可见的是人类β1的Ile 72对应火鸡β-肾上腺素受体的Ile 55，人类β2的Ile 47 对应火鸡β-肾上腺素受体的Ile 55；并且人类β3的Thr51对应火鸡β-肾上腺素受体 的Ile 55。其它在人类β1、β2和β3中的对应氨基酸残基可以通过参考图9容易地 鉴定。

优选地特定的氨基酸是用Ala代替。但是，当特定氨基酸残基是Ala时，优选 地，其是用Leu代替(例如，见图1中火鸡β-肾上腺素能的Ala 234、Ala 282和 Ala 334)。

优选地是如果与其亲代比，在多个氨基酸位置突变β-肾上腺素受体具有不同的 氨基酸，因为这似乎可以产生更大的稳定性。特别优选地人类β1受体突变体是那 些其中一个或更多下列氨基酸残基被另一种氨基酸残基代替的突变体：K85、 M107、Y244、A316、F361和F372。通常，该特定氨基酸残基是被Ala或Val或 Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。

制备了上述具有3或4或5或6个突变组合的突变人类β1受体。

特别优选地，人类β2受体突变体是那些其中一个或更多下列氨基酸残基被另 一种氨基酸残基代替的突变体：K60、M82、Y219、C265、L310和F321。通常， 该特定氨基酸残基被Ala或Val或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。

上述具有3或4或5或6个突变组合的突变人类β2受体是优选的。

图26显示当将β1-m23(R68S、M90V、Y227A、A282L、F327A、F338M)的 六个热稳定突变转移到人类β2受体上(等同突变K60S、M82V、Y219A、C265L、 L310A、F321M)，形成人类β2-m23时，对热稳定性的效果。人类β2和β2-m23 的Tm分别是29℃和41℃。因此举例说明了从一种受体到另一种受体热稳定突变 的可转移性。相应地，特别优选的人类β2受体突变体含有突变K60S、M82V、 Y219A、C265L、L310A、F321M。

特别优选地，人类β3受体突变体是那些其中一个或多个下列氨基酸被另一个 氨基酸残基代替的突变体：W64、M86、Y224、P284、A330和F341。通常，该特 定氨基酸残基被Ala或Val或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。

上述具有3或4或5或6个突变组合的突变人类β3受体是优选的。

特别优选地，突变组合在实施例1中的表1和2中有详细描述，并且本发明 包括突变火鸡β-肾上腺素受体，并且还包括突变β-肾上腺素受体，其中在对应位 置上的氨基酸已经被另一种氨基酸代替，通常所述另一种氨基酸是实施例1表1 和2中指明的同样氨基酸。

特别优选的突变体是那些在与特定氨基酸残基对应的氨基酸上含有突变的突 变体，该特定氨基酸是通过参考火鸡β-肾上腺素受体的氨基酸：(R68S、Y227A、 A282L、A334L)(见下面表2中的m6-10)；(M90V、Y227A、F338M)(见下面表2 中的m7-7)；(R68S、M90V、V230A、F327A、A334L)(见下面表2中的m10-8)；和 (R68S、M90V、Y227A、A282L、F327A、F338M)(见下面表2中的m23)。

突变腺苷受体

腺苷受体在本领域是熟知的。它们彼此共有序列同源性并且结合腺苷。

本发明的第五方面提供突变腺苷受体，当与对应野生型腺苷相比时，其具有 在对应任何一个或多个下列位置的不同氨基酸，如图10所示，所述位置根据人类 腺苷A2a受体编号：Gly 114、Gly 118、Leu 167、Ala 184、Arg 199、Ala 203、Leu 208、Gln 210、Ser 213、Glu 219、Arg 220、Ser 223、Thr 224、Gln 226、Lys 227、 His 230、Leu 241、Pro 260、Ser 263、Leu 267、Leu 272、Thr 279、Asn 284、Gln 311、 Pro 313、Lys 315、Ala 54、Val 57、His 75、Thr 88、Gly 114、Gly 118、Thr 119、 Lys 122、Gly 123、Pro 149、Glu 151、Gly 152、Ala 203、Ala 204、Ala 231、Leu 235、 Val 239。

只要将其在一个或多个氨基酸位置突变，突变腺苷受体可以是任何腺苷受体 的突变体。该氨基酸位置是通过参考特定人类腺苷A2a受体氨基酸序列确定的。

用MacVector和CLUSTALW确定，当与特定人类腺苷A2a受体序列相比时， 特别优选的是突变GPCR具有至少20％氨基酸序列同一性。优选地，突变GPCR 具有至少30％或至少40％或至少50％或至少60％序列同一性。通常，在腺苷结合 位点有高度序列保守性。

如下面实施例2中描述的，人类腺苷A2a受体序列中，当用激动剂5′-N-乙基 羧胺腺苷(ethylcarboxamidoadenosine)(NECA)测定时，下列氨基酸残基的个别 替换(如图10显示)导致热稳定性的增加：Gly 114、Gly 118、Leu 167、Ala 184、 Arg 199、Ala 203、Leu 208、Gln 210、Ser 213、Glu 219、Arg 220、Ser 223、Thr 224、 Gln 226、Lys 227、His 230、Leu 241、Pro 260、Ser 263、Leu 267、Leu 272、Thr 279、 Asn 284、Gln 311、Pro 313、Lys 315。

当用拮抗剂ZM 241385(4-[2-[[7-氨基-2-(2-呋哺基)[1，2，4]-三唑[2，3-α][1，3，5]三 嗪-5-基]氨基]乙基]酚)测定时，在人类A2a受体序列中下列氨基酸残基的替换(如 图10显示)导致热稳定性的增加：Ala 54、Val 57、His 75、Thr 88、Gly 114、Gly 118、Thr 119、Lys 122、Gly 123、Pro 149、Glu 151、Gly 152、Ala 203、Ala 204、 Ala 231、Leu 235、Val 239。

因此本发明包括突变人类A2a腺苷受体，其中当与其亲代比时，一个或多个这 些氨基酸残基已经被另一种氨基酸残基代替。本发明还包括来自其它来源的突变 腺苷受体，其中在亲代受体中的一个或多个对应氨基酸被另一种氨基酸残基代替。 为了避免疑问，亲代可以是具有天然存在序列的腺苷受体，或其可以是截短形式 或其可以是天然存在蛋白融合体或其片段融合体，或只要其维持配体结合能力， 其与天然存在序列比，可以含有突变。

“对应氨基酸残基”的意思包括，当用MacVector和CLUSTALW比较人类腺苷 A2a受体和其它腺苷相关受体时，与人类腺苷A2a受体中特定氨基酸残基匹配的另 一个腺苷受体中的氨基酸残基。

图10显示人类腺苷A2a受体和三种其它人类腺苷受体(A2b、A3和A1)之 间的匹配。

可见的是，例如，A2b受体中的Ser 115(以AA2BR标明)对应A2a受体中的 Gly 114。相似地，其可见的是A3受体中的Ala 60(以AA3R标明)对应在A2a受 体中的Ala 54等。可以通过参考图10容易地鉴定人类腺苷受体A2b、A3和A1中 的其它对应氨基酸残基。

优选的是亲代特定氨基酸用Ala代替。但是，当亲代中的特定氨基酸残基是 Ala时，优选的是其被Leu代替。

优选的是突变腺苷受体与其亲代比，在多个氨基酸位置上具有不同氨基酸。 特别优选的是人类腺苷A2b受体的一个或多个下列氨基酸残基被另一种氨基酸残 基代替：A55、T89、R123、L236和V240。通常该特定氨基酸残基被Ala或Val 或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。

上述具有3或4或5个突变组合的突变人类腺苷A2b受体是优选的。

特别优选的是人类腺苷A3受体的一个或多个下列氨基酸残基被另一种氨基 酸残基代替：A60、T94、W128、L232和L236。通常该特定氨基酸残基被Ala或 Val或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。

上述具有3或4或5个组合突变的突变人类腺苷A3受体是优选的。

特别优选的是人类腺苷A1受体的一个或多个下列残基被代替：A57、T91、 A125、L236和L240。通常该特定氨基酸残基被Ala或Val或Met或Leu或Ile代 替(除非其已经是那种残基)。

特别优选的是在实施例2中详细描述的突变组合。本发明包括那些人类腺苷 A2a受体，还包括其它突变腺苷受体，其中在对应位置上的氨基酸已经被另一种通 常在实施例2中指明的同样氨基酸代替。

特别优选的是腺苷受体突变体含有通过参考人类腺苷A2a受体，对应特定氨 基酸的氨基酸突变：(A54L、K122A、L235A)(Rant 17)；(A54L、T88A、V239A、 A204L)(Rant 19)；和(A54L、T88A、V239A、K122A)(Rant 21)。

突变神经紧张肽受体

神经紧张肽受体在本领域中是熟知的。它们共有序列同一性并且结合神经紧 张肽。

本发明的第六方面提供突变神经紧张肽受体，当与对应野生型神经紧张肽受 体比时，在任何一个或多个下列对应位置，其具有不同氨基酸，如图11展示，所 述位置根据大鼠神经紧张肽受体编号：Ala 69、Leu 72、Ala 73、Ala 86、Ala 90、 Ser 100、His 103、Ser 108、Leu 109、Leu 111、Asp 113、Ile 116、Ala 120、Asp 139、 Phe 147、Ala 155、Val 165、Glu 166、Lys 176、Ala 177、Thr 179、Met 181、Ser 182、 Arg 183、Phe 189、Leu 205、Thr 207、Gly 209、Gly 215、Val 229、Met 250、Ile 253、 Leu 256、Ile 260、Asn 262、Val 268、Asn 270、Thr 279、Met 293、Thr 294、Gly 306、 Leu 308、Val 309、Leu 310、Val 313、Phe 342、Asp 345、Tyr 349、Tyr 351、Ala 356、Phe 358、Val 360、Ser 362、Asn 370、Ser 373、Phe 380、Ala 385、Cys 386、 Pro 389、Gly 390、Trp 391、Arg 392、His 393、Arg 395、Lys 397、Pro 399。

特别优选的是如果用MacVector和CLUSTALW测定，当与特定大鼠神经紧张 肽受体序列相比时，突变GPCR具有至少20％氨基酸序列同一性。优选地，突变 GPCR具有至少30％或至少40％或至少50％氨基酸序列同一性。

只要将其在一个或多个氨基酸位置上突变，突变神经紧张肽受体可以是任何 神经紧张肽受体的突变体，该氨基酸位置是通过参考特定大鼠神经紧张肽受体氨 基酸序列确定的。

如下面实施例3中描述的，当考虑关于无神经紧张肽时，大鼠神经紧张肽受 体序列中下列氨基酸残基的个别替换(如图11和28显示)导致热稳定性的增加： Leu 72、Ala 86、Ala 90、Ser 100、His 103、Ser 108、Leu 109、Leu 111、Asp 113、 Ile 116、Ala 120、Asp 139、Phe 147、Ala 155、Lys 176、Thr 179、Met 181、Ser 182、 Phe 189、Leu 205、Thr 207、Gly 209、Gly 215、Leu 256、Asn 262、Val 268、Met 293、Asp 345、Tyr 349、Tyr 351、Ala 356、Phe 358、Ser 362、Ala 385、Cys 386、 Trp 391、Arg 392、His 393、Lys 397、Pro 399。

如下面实施例3中描述的，当考虑关于存在神经紧张肽时，大鼠神经紧张肽 受体序列中下列氨基酸残基的个别替换(如图11和28显示)导致热稳定性的增 加：Ala 69、Ala 73、Ala 86、Ala 90、His 103、Val 165、Glu 166、Ala 177、Arg 183、 Gly 215、Val 229、Met 250、Ile 253、Ile 260、Thr 279、Thr 294、Gly 306、Leu 308、 Val 309、Leu 310、Val 313、Phe 342、Phe 358、Val 360、Ser 362、Asn 370、Ser 373、 Phe 380、Ala 385、Pro 389、Gly 390、Arg 395。

因此，本发明包括突变大鼠神经紧张肽受体，其中与其亲代相比时，一个或 多个这些氨基酸残基已经被另一种氨基酸残基代替。本发明还包括其它来源的突 变神经紧张肽受体，其中在亲代受体中的一个或多个对应氨基酸被另一种氨基酸 残基代替。为了避免疑问，亲代可以是具有天然存在序列的神经紧张肽受体，或 其可以是截短形式或其可以是天然存在蛋白的融合体或其片段的融合体，或只要 其维持其配体结合能力，与天然存在序列比，其可以含有突变。

“对应氨基酸残基”包括的意思是当用MacVector和CLUSTALW比较大鼠神经 紧张肽受体和其它神经紧张肽受体时，与大鼠神经紧张肽受体中特定氨基酸残基 匹配的另一种神经紧张肽受体中的氨基酸残基。

图11显示大鼠神经紧张肽受体和两种人类神经紧张肽受体1和2之间的匹配。 可见的是，例如，人类神经紧张肽受体1的Ala 85对应大鼠神经紧张肽受体的Ala 86，人类神经紧张肽受体1的Phe 353对应大鼠神经紧张肽受体的Phe 358等。可 以通过参考图11容易地鉴定人类神经紧张肽受体1和2中的其它对应氨基酸残基。

优选的是亲代中的特点氨基酸是用Ala代替。但是，当亲代中的特定氨基酸 是Ala时，优选的是其被Leu代替。

优选的是与其亲代比时，在多个氨基酸位置上，突变神经紧张肽受体具有不 同氨基酸。特别优选的是人类神经紧张肽受体(NTR1)的一个或多个下列氨基酸 残基被另一种氨基酸残基代替：Ala 85、His 102、Ile 259、Phe 337和Phe 353。通 常该特定氨基酸残基被Ala或Val或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残 基)。

上述具有3或4或5个突变组合的突变人类神经紧张肽受体(NTR1)是优选 的。

特别优选的是人类神经紧张肽受体(NTR2)的一个或多个下列氨基酸残基被 另一种氨基酸残基代替：V54、R69、T229、P331和F347。通常该特定氨基酸残 基被Ala或Val或Met或Leu或Ile代替(除非其已经是那种残基)。上述具有3 或4或5个突变组合的人类神经紧张肽受体(NTR2)是优选的。

特别优选的是在实施例3中详述的突变组合。本发明包括那些突变的大鼠神 经紧张肽受体，并且还包括其它突变神经紧张肽受体，其中在对应位置的氨基酸 已经被通常是实施例3中指明的同样氨基酸的另一种氨基酸代替。

特别优选的是通过参考大鼠神经紧张肽受体，神经紧张肽受体突变体含有对 应特定氨基酸残基的氨基酸残基突变：(F358A、A86L、I260A、F342A)(Nag7m)； (F358A、H103A、I260A、F342A)(Nag7n)。

突变草毒碱(muscarinic)受体

草毒碱受体在本领域中是熟知的。它们共有序列同源性并且结合草毒碱 (muscarine)。

本发明的第七方面包括突变草毒碱受体，当与对应野生型草毒碱受体比时， 在对应任何一个或多个下列位置上，其具有不同氨基酸。如图17中展示，所述位 置根据人类草毒碱受体M1编号：Leu 65、Met 145、Leu 399、Ile 383和Met 384。

特别优选的是如果用MacVector和CLUSTALW确定，当与特定人类草毒碱受 体序列相比时，突变GPCR具有至少20％氨基酸序列同一性。优选地，突变GPCR 具有至少30％或至少40％或至少50％氨基酸序列同一性。

只要将其在一个或多个氨基酸位置突变，突变草毒碱受体可以是任何草毒碱 受体的突变，该氨基酸位置是通过参考特定草毒碱受体氨基酸序列确定的。

因此，本发明包括突变人类草毒碱受体，与其亲代相比，其中一个或多个这 些氨基酸残基已经被另一种氨基酸残基代替。本发明还包括其它来源的突变草毒 碱受体，其中亲代受体中一个或多个对应氨基酸被另一种氨基酸残基代替。为了 避免疑问，亲代可以是具有天然存在序列的草毒碱受体，或其可以是截短形式或 其可以是天然存在蛋白的融合体或其片段的融合体，或只要其维持配体结合能力， 与天然存在序列相比，其可以含有突变。

“对应氨基酸残基”包括的意思是当用MacVector和CLUSTALW比较人类草毒 碱受体和其它草毒碱受体时，与人类草毒碱受体中特定氨基酸残基匹配的另一种 草毒碱受体中的氨基酸残基。

优选的是特定氨基酸被Ala代替。但是当特定氨基酸残基是Ala时，优选的是 其被Leu代替。

如在上述实施例1-3中显示的，我们已经鉴定了遍及火鸡β1肾上腺素受体、 人类腺苷受体、大鼠神经紧张肽受体和人类草毒碱受体中广泛分散的热稳定性突 变。图17提供这些序列与人类β-2AR序列的匹配，这样，在总共70个中的11种 情况中，当将热稳定突变定位在该序列上时，两个序列在同样位置含有突变(在 图17中用星指示)。因此应理解的是一旦已经鉴定在一个GPCR中的一个或多个 稳定突变，通过匹配GPCR的氨基酸序列和在对应位置上制造相同的一个或多个 突变，可以产生进一步增加稳定性的GPCR。在图26中清楚地举例说明这一概念， 其中将在火鸡β1-m23中的六个热稳定突变直接转移到人类β2受体。产生的突变 体β2-m23具有比人类β2受体高12℃的Tm值。

相应地，本发明的第八方面提供产生与其亲代GPCR相比，具有增加稳定性 的突变GPCR的方法，该方法包括：

(i)在相对于第一亲代GPCR具有增加稳定性的第一亲代GPCR的一个或多 个突变体的氨基酸序列中，鉴定出一个或多个位置，在所述位置上相对于第一亲 代GPCR来说一个或多个突变体具有至少一个或多个不同氨基酸残基；和

(ii)在相应的一个或多个位置制造在氨基酸序列中的一个或多个突变以限定 第二GPCR，从而提供相对于第二亲代GPCR具有增加稳定性的第二亲代GPCR 的一个或多个突变体。

根据本发明的第一或第二方面的方法，可以选择或制备第一亲代GPCR的一 个或多个突变体。相应地，应理解的是第一亲代GPCR的一个或多个突变体可以 是本发明第三、第四、第五、第六或第七方面的任何突变体。因此，可以使用本 发明的第八方面的方法，通过突变创造稳定、构象锁定的GPCR。例如，在特定构 象的具有增加稳定性的突变GPCR的选择之后，可以见到稳定性突变并且可以鉴 定在第二GPCR中在对应位置上被代替的氨基酸，该氨基酸是用于产生相对于第 二亲代GPCR，在特定构象中具有增加稳定性的突变GPCR。

为了避免疑问，第一亲代GPCR可以是具有天然存在序列的GPCR，或其可 以是截短形式或其可以是天然存在蛋白的融合体或其片段的融合体，或只要其维 持配体结合能力，与天然存在序列相比，其可以含有突变。

通常，鉴定一个或多个位置(与第一亲代GPCR相比，在所述位置上一个或 多个突变体具有至少一个不同氨基酸残基)包括例如使用Clustal W程序 (Thompson等人，1994)，匹配其氨基酸序列和其亲代GPCR氨基酸序列。

当例如通过使用MacVector和Clustal W，通过匹配比较第一和第二GPCR，“对 应位置”包括第二GPCR的氨基酸序列中的位置，其与第一GPCR中的氨基酸序列 的位置匹配。例如，如图17中显示的匹配，在火鸡β1-m23、R68S、M90V、Y227A、 A282L、F327A和F338M中的六个稳定性突变是在人类β2受体中分别对应残基 K60、M82、Y219、C265、L310和F321的位置。

已经鉴定了第二GPCR的氨基酸序列中对应位置，在这些位置上的氨基酸被 另一种氨基酸代替。通常，氨基酸被相同氨基酸代替，后者在第一亲代GPCR突 变体中对应位置上代替氨基酸(除非其已经是那种氨基酸)。例如，在火鸡β1-m23 (R68S)的68位上，一个精氨酸残基被丝氨酸残基代替。所以，在人类β2受体的对 应位置，60位(K60)，赖氨酸残基优选地被丝氨酸残基代替。

可以在氨基酸序列中制造突变，例如，如上所述并且使用本领域中的熟知技 术。

应理解的是第二GPCR可以是任何其它GPCR。例如可以将来自一个物种的 在GPCR中的稳定性突变转移到来自另一个物种的第二GPCR。相似地，可以将 在特定GPCR同型(isoform)中的稳定性突变转移到不同同型的第二GPCR。优 选地，第二亲代GPCR是与第一亲代GPCR比同样GPCR种类或家族的GPCR。 根据蛋白序列的相似性，种系发生(Phylogenetic)分析已经将GPCR分为三个主 要种类，即种类1、2和3，其原型分别是视紫质、促胰液素受体和metabotropic 谷氨酸受体(Foord等人(2005)Pharmacol.Rev.57，279-288)。因此第二GPCR可 以是与第一亲代GPCR比同样GPCR种类的GPCR。相似地，已经通过参考天然 配体，如谷氨酸和GABA，将GPCR分为家族。因此，第二GPCR可以属于第一 亲代GPCR的同样GPCR家族。已经通过国际药理学联盟产生GPCR种类和家族 的名单(Foord等人(2005)Pharmacol.Rev.57，279-288)并且该名单在网址 http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward定期更新。

应理解的是第二亲代GPCR必须能够与第一亲代GPCR匹配，这样，可以在 第二GPCR中确定在第一GCPR中的突变对应位置。因此通常，第二亲代GPCR 具有至少20％对第一亲代GPCR的序列同一性并且更优选的是至少30％、40％、 50％、60％、70％、80％或90％对第一亲代GPCR的序列同一性。但是，某些GPCR 具有低序列同一性(例如家族B和C GPCR)并且在相同时间结构是非常相似的。 因此20％序列同一性的阈值不是绝对的。

本发明人已经论述结构基序的鉴定将在产生具有增加稳定性的进一步突变 GPCR中是有用的，在所述基序中，具有增加稳定性的突变GPCR中的一个或多 个突变。

相应地，本发明的第九方面提供产生相对于其亲代GPCR具有增加稳定性的 突变G-蛋白偶联受体(GPCR)的方法，该方法包括：

(i)提供相对于第一亲代GPCR具有增加稳定性的一个或多个第一亲代GPCR 突变体；

(ii)在结构膜蛋白模型中鉴定结构基序，在该基序中与第一亲代GPCR相比， 一个或多个突变体具有至少一种不同的氨基酸残基；和

(iii)制造一个或多个氨基酸序列中的突变以限定在第二亲代GPCR中的对 应结构基序，从而提供一个或多个相对于第二亲代GPCR来说具有增加稳定性的 第二亲代GPCR突变。

可以通过在一个或多个已知结构模型中比对稳定性突变而鉴定具有这样稳定 性突变的结构基序。我们已经将β1-肾上腺素受体的稳定性突变比对至β2-肾上腺 素受体的结构模型上(Rasmussen等人(2007)Nature 450，383-387；Cherezov等人 (2007)Science 318：1258-65；Rosenbaum等人(2007)Science 318：1266-1273)以便鉴 定这样的基序。例如，表(vi)列出我们已经比对至人类β2-肾上腺素受体上的火 鸡β1-肾上腺素受体突变并且描述其位于的对应结构基序。如实施例4中讨论的， 将Y227A突变(等同于人类β2受体中的Y219)比对于人类β2-肾上腺素受体上揭 示其位置是在螺旋之间的界面上，这样，突变可以增加在螺旋界面上的压缩(见 图15、16和23)。相似地，将M90V(等同于人类β2-受体中的M82)突变比对于 人类β2-肾上腺素受体上揭示其是在螺旋2中的螺旋连接点上(见图15、16和20)。 发现其它突变位于包括跨膜螺旋表面的进一步结构基序中。该跨膜螺旋表面指向 脂双层、疏水-亲水边界区、蛋白结合口袋和环区(见表(vi)和图18-19、21-22 和24-25)。

这样的结构基序，由于其含有稳定性突变，在决定蛋白稳定性中是重要的。 因此，这些基序的靶向突变将有助于产生稳定的突变GPCR。事实上，有将多个突 变比对至同样结构基序上的几种情况。例如，将在火鸡β1肾上腺素受体中的 Y227A、V230A和A234L突变比对至同样螺旋界面上，将V89L和M90V突变比 对至同样螺旋的扭结上，并且将F327A和A334L突变比对至指向脂双层的同样螺 旋表面上(表(vi))。因此，当已经鉴定了一个稳定性突变时，确定该突变定位的 结构基序将能够鉴定进一步的稳定性突变。

在本发明的第九方面的具体实施方式中，根据本发明第一第二或第八方面的 方法选择或制备一个或多个第一亲代GPCR突变体。因此应理解的是，第一亲代 GPCR的一个或多个突变体可以是本发明第三、第四、第五、第六或第七方面任一 个的突变体。因此，本发明的第九方面的方法可以通过突变用于创造稳定的构象 锁定的GPCR。例如，在选择特定构象中具有增加稳定性突变GPCR之后，可以 鉴定这样的稳定性突变位于的结构基序。制造在另一种GPCR中限定对应结构基 序的氨基酸序列中的一个或多个突变然后可以用于产生相对于其亲代GPCR来说 在特定构象中具有增加稳定性的突变GPCR。

我们进行了人类β-2AR、大鼠NTR1、火鸡β-1 AR、人类腺苷A2aR和人类草 毒碱M1受体氨基酸序列的多序列匹配(图17)，其显示当将所鉴定的热稳定性突 变定位在所述序列上(见实施例1-3)，总共70个之中的11种情况中，两个序列 含有同样位置的突变(在图17中用星指示)。不希望被任何理论限制，本发明人 相信这些位置上的热稳定性突变应该对于比对至结构膜蛋白模型上有增加的可转 移性。因此在一个具体实施方式中，第一亲代GCPR的突变体是人类β-2AR、大鼠 NTR1、火鸡β-1 AR、人类腺苷A2aR或人类草毒碱M1受体的突变体，当与其对 应亲代受体相比时，在对应任何一个或多个下列位置的位置上，其具有不同的氨 基酸，所述下列位置是根据如图17中展示的人类β-2AR的编号：Ala 59、Val 81、 Ser 143、Lys 147、Val 152、Glu 180、Val 222、Ala 226、Ala 271、Leu 275和Val 317。

为了鉴定结构基序，将稳定性突变比对至已知膜蛋白结构。

“膜蛋白”意思是附着或连接到细胞膜或细胞器膜的蛋白。优选地，该膜蛋白是 永久地整合到膜中的完整膜蛋白并且只可以使用物理性破坏脂双层的去污剂、非 极性溶剂或变型剂被去除。

膜蛋白的结构模型可以是任何适合的结构模型。例如，该模型可以是已知晶 体结构。GPCR晶体结构的例子包括牛视紫质(Palczewski，K等人，Science 289， 739-745.(2000))和人类β2肾上腺素受体(Rasmussen等人，Nature 450，383-7(2007)； Cherezov等人(2007) Science 318：1258-65；Rosenbaum等人(2007)Science 318：1266-1273)。人类β2肾上腺素受体结构的相配物可以在RCSB蛋白数据库中在 登记编号2rh1，2r4r和2r4s下发现。选择性地，该结构模型可以是根据同源性或使 用de novo结构预测方法(Qian等人Nature(2007)450：259-64)的计算机产生的 模型。

应理解的是可以将特定突变GPCR的稳定性突变比对至具有足够GPCR结构 相似性的任何膜蛋白的结构模型上。特别地，对于需要转移的给定突变，膜蛋白 的结构域必须具有与稳定性突变位于的GPCR结构域足够的结构相似性。

蛋白结构域通常定义为二级结构单元的离散折叠集合，其可以作为单个蛋白 独立存在或可以是与其他结构域组合的大蛋白的部分。其通常是功能进化单元。

本质上GPCR是不含大的N-末端结构域的单一结构域蛋白。因此通常，结构 模型是包括至少具有足够GPCR结构相似性的一个结构域的膜蛋白。

可以通过分析序列同一性间接确定结构相似性，或直接通过结构比较确定结 构相似性。

关于序列同一性，将编码GPCR结构域(在该结构域中突变体与第一亲代 GPCR相比具有至少一个不同氨基酸残基)的氨基酸序列，与编码有可用结构模型 的膜蛋白结构域的氨基酸序列匹配。应理解的是一个或多个这些序列可以含有除 核心保守结构域以外的插入序列或N-末端或C-末端延伸。为了优化匹配，这样的 序列被去除以免歪曲分析。有疑问的结构域中具有足够序列同一性的膜蛋白然后 可以用作为了比对突变的结构模型。对于溶解性蛋白结构域已经显示的是其3D结 构是20％以上序列同一性广泛保守的和30％以上同一性更好保守的，随着序列同 一性增加近100％，结构保守水平增加(Ginalski，K.Curr Op Struc Biol(2006)16， 172-177)。因此优选的是，结构膜蛋白模型含有一个结构域，该结构域与突变GPCR 结构域(突变GPCR结构域与第一亲代GPCR相比，含有至少一个不同氨基酸残 基)具有至少20％序列同一性，并且更优选的是至少30％、40％、50％、60％、70％、 80％或90％序列同一性，  并且还更优选的是至少95％或99％序列同一性。

可以通过使用如BLAST或PSI-BLAST的算法(Altschul等人，NAR(1997)，25， 3389-3402)或根据隐藏的马尔可夫模型(Hidden Markov Models)(Eddy S等人，J Comput Biol(1995)Spring 2(1)9-23.)测定序列同一性。通常，可以使用任何合适 的计算机程序，例如威斯康星大学遗传计算机组的GAP程序确定在两个多肽之间 的百分序列同一性，并且应理解的是百分序列同一性的计算与那些序列已经被优 化匹配的多肽相关。可以选择性地用Clustal W(Thompson等人，1994)进行该匹 配。使用的参数可以如下：快速配对匹配参数：K-元组(字码)大小；1，窗口大 小；5，缺口惩罚；3，顶端对角线数量；5。得分方法：x百分数。多匹配参数： 缺口开放惩罚；10，缺口延伸惩罚；0.05。得分矩阵：BLOSUM。

除了序列同一性，可以直接通过结构模型的比较确定结构相似性。结构模型 可以用于检测从单独序列分析不能显然得出的，并且在序列中可以是不连续的结 构相似性区域。例如，认为家族B和C GPCR具有相似结构；但是其序列同一性 是非常低的。相似地，水转运水通道蛋白菠菜SoPip2、大肠杆菌AqpZ、甲烷球菌 (Methanococcus)AqpM，大鼠Aqp4、人类Aqp1和绵羊Aqp0共有低的序列同 一性但是都具有相似的结构。

为了未知结构的蛋白可以使用标准软件包如MODELLER(SaliA和Blundell T， J Mol Biol(1993)234(3)779-815)构建高保真的结构模型，其中，结构是用同源蛋 白的已知结构模拟的。这样的模拟法随着增加的序列同一性而改善。通常，在未 知结构序列和已知3D结构序列之间的序列同一性在30％以上(Ginalski，K.Curr Op Struc Biol(2006)16，172-177)。另外，只基于序列的结构重新预测方法可以用于模 拟未知结构蛋白(Qian等人，(2007)Nature 450：259-64)。一旦已经实验性地确定或 通过模拟衍生，可以通过直接比较两个或多个3D结构检测结构相似性区域。其可 以，例如含有特定结构和拓扑学的二级结构元素，这可以通过使用软件如DALI 检测(Holm，L和Sander，C(1996)Science 273，595-603)。其可以含有氨基酸侧链 的和多肽骨架的局部排列或在特定空间排列中的特定一套原子或原子组的排列， 这可以例如通过使用图理论图表(graph theoretical representations)而检测 (Artymiuk，P等人，(2005)J Amer Soc Info Sci Tech 56(5)518-528)。在该方法中， 通常图的节点代表需要比较的蛋白或蛋白区中的原子或原子组，图的边缘描述节 点之间的角和距离。这些图中的共同模式显示共同的结构基序。该方法可以延伸 至包括任何原子或原子组的描述符，如氢键供体或受体、疏水性、形状、电荷或 芳香性；例如根据这样的描述符可以用GRID将蛋白空间比对并且该图表可以用 作相似性搜寻的基础(Baroni等人(2007)J Chem Inf Mod 47，279-294)。在上面给 出的参考中描述了方法的描述、软件的可用性和使用者定义的参数选择指南、阈 值和允许误差。

在优选的具体实施方式中，膜蛋白结构模型是GPCR的结构模型。应理解的 是GPCR的结构模型可以是第一亲代的GPCR。例如，可以直接将在具有增加稳 定性的突变GPCR中的稳定性突变，比对于第一亲代GCPR的结构和这样突变所 在的被鉴定的结构基序上。当第一亲代GPCR的结构是未知的，可以使用其它 GPCR的结构模型。例如，来自一个物种的GPCR中的稳定性突变可以比对于来 自另一个物种的同样GPCR的已知结构模型。相似地，在特定GPCR同型中的稳 定性突变可以比对于另一种GPCR同型的已知结构模型上。另外，来自一个GPCR 的稳定性突变可以比对于同种或同家族GPCR上。GPCR种类和家族的名单已经 由国际药理学联盟产生(Foord等人(2005)Pharmacol.Rev.57，279-288)并且该名 单在网址http://www.iuphar-db.org/GPCR/RecentorFamiliesForward上定期更新。

如上所述，应理解的是结构模型可以是任何GPCR，只要其在结构域中具有足 够的结构相似性，在所述结构域中，与第一亲代GPCR相比，突变GPCR具有至 少一个不同氨基酸。因此，优选的是，GPCR与第一亲代GPCR在蛋白结构域(与 第一亲代GPCR比，该结构域含有至少一个不同氨基酸残基)中具有至少20％序 列同一性，并且更优选地是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％序列 同一性，并且还更优选地是至少95％或99％序列同一性。但是，本发明人认识到 20％序列同一性的阈值不是绝对的。与第一亲代GPCR比具有20％以下序列同一 性的GPCR也可以用作转移稳定性突变的结构模型，其中低序列同一性被其他相 似性弥补，所述相似性包括，例如同样序列基序的存在、结合同样的G-蛋白或具 有同样的功能或与亲代GPCR相比具有基本相同的亲水性分析(hydropathy plot)。

使用本领域中已知的任何合适方法，可以进行稳定性突变在结构模型上的比 对。例如通常，将结构模型是可用的GPCR的氨基酸序列与第一亲代GPCR突变 体的氨基酸序列匹配。然后在突变GCPR中相对于第一亲代GPCR的至少一个不 同氨基酸残基的位置可以定位于结构模型是可得的GPCR氨基酸序列中。

“结构基序”包括的意思是热稳定突变的GPCR结构模型中的三维位置描述。 例如，结构基序可以是在GPCR中的任何二级或三级结构基序。“三级结构基序” 包括任何原子或原子组的描述符、例如氢键供体或受体、疏水性、形状、电荷或 芳香性。例如，使用GRID，根据这样的描述符，可以将蛋白空间比对并且该图表 可以作为限定结构基序的基础使用(Baroni等人(2007)J Chem Inf Mod 47， 279-294)。

表(vi)列出了发现火鸡β1肾上腺素受体稳定性突变所在的结构基序。如从 表中可见的突变被定位在一些不同的位置中。三个突变是在预测是水溶剂可以进 入的环区。八个突变是在跨膜α-螺旋中并且指向脂双层；这些突变中的三个接近 该螺旋的末端并且可以认为是在疏水-亲水边界层。发现八个突变是在跨膜α-螺旋 间的界面上，其中三个是在螺旋的结节中或是在螺旋的旋扭区，并且另外两个突 变出现在一个螺旋但是与一个或多个其它螺旋接近，所述一个或多个其它螺旋含 有与突变残基空间上靠近的结节。这些突变的后者可以影响在结节区内的氨基酸 的压缩，其可以导致热稳定性。另一个突变是在底物结合口袋中。

相应地，在一个具体实施方式中，结构基序是任何螺旋界面、螺旋结节、与 螺旋结节对面的螺旋、指向脂双层的螺旋表面、在疏水-亲水边界层的指向脂双层 的螺旋表面、环区或蛋白结合口袋。

对稳定性突变所在的结构基序的鉴定显示那种基序在蛋白稳定性中的重要 性。因此，制造限定在第二亲代GPCR中对应结构基序的氨基酸序列中的一个或 多个突变，应该提供相对于第二亲代GPCR，具有增加稳定性的第二亲代GCPR 的一个或多个突变。

限定结构基序的氨基酸序列是氨基酸残基的一级氨基酸序列，其结合在蛋白 的二级或三级结构中而形成结构基序。应理解的是这样的一级氨基酸序列可以包 括连续的或非连续的氨基酸残基。因此，对限定结构基序的氨基酸序列的鉴定将 包括涉及残基的确定和随后限定该序列。在氨基酸序列中可以制造突变，例如如 上所述并且使用本领域中的现有技术。

“对应结构基序”的意思是在第二亲代GPCR中存在的结构模型中鉴定的相似 结构基序。例如，如果已经鉴定螺旋界面，在第二亲代GPCR中的对应螺旋界面 将是在结构模型中存在的相似螺旋的螺旋间界面。如果鉴定螺旋结节，对应螺旋 结节将是在与结构模型中存在的结节螺旋相似的螺旋中的结节。通过搜索在第二 亲代GPCR中序列中的相似氨基酸序列，可以鉴定在第二亲代GPCR中的相似结 构基序，该第二亲代GPCR序列限定结构模型中的基序，例如通过序列匹配。另 外，基于计算机的算法在本领域中是广泛可用的，根据氨基酸序列，可以用于预 测蛋白基序的存在。因此，根据特定基序在氨基酸序列中的相对位置和其相对于 其它基序的位置，可以容易地鉴定相似结构基序。应理解的是如果第二亲代GPCR 的结构模型是可用的，可以直接将相似结构基序定位在蛋白的结构上。通常，限 定相似结构基序的氨基酸序列与限定结构模型中基序的序列比，具有至少20％序 列同一性，更优选的是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％序列同一 性并且还更优选的是95％和99％序列同一性。

在一个具体实施方式中，第二亲代GPCR是第一亲代GPCR。为了避免疑问， 第二亲代GPCR可以具有第一亲代GPCR的天然存在序列，或其可以是截短的形 式或其可以是天然存在蛋白的融合体或其片段的融合入，或只要其维持配体结合， 与天然存在序列相比，其可以含有突变。

在另一个具体实施方式中第二亲代GPCR不是第一亲代GPCR。例如，可以 鉴定具有增加稳定性的第一亲代GPCR的突变体，但是需要产生具有增加稳定性 的不同GPCR的突变体。优选地，第二亲代GPCR是与上述第一亲代GPCR相同 的GPCR种类或家族的GPCR。但是，应理解的是第二亲代GCPR可以是任何已 知GPCR，只要其与第一亲代GPCR相比具有足够结构相似性，这样，其含有第 一亲代GPCR突变体的稳定性突变所在的对应结构基序。因此，通常与第一亲代 GPCR比，第二亲代GPCR具有至少20％序列同一性并且更优选的是至少30％、 40％、50％、60％、70％、80％或90％序列同一性。但是如上所述，某些GPCR具 有低序列同一性(例如家族B和C GPCR)但是结构是相似的。因此20％序列同 一性阈值不是绝对的。

因为在GPCR中有可以筛选用于增加稳定性的潜在的上千突变体，有利的是 靶向已知对给予稳定性是重要的特定突变。因此，应理解的是本发明第八和第九 方面的方法可以用于选择增加稳定性的突变GPCR的方法。特别地，进行本发明 第八或第九方面的方法可以用于靶向特定氨基酸残基或靶向对于确定稳定性是重 要的限定结构基序的氨基酸序列。

相应地，在一个具体实施方式中，第八或第九方面的方法包括：

(I)选择配体，该配体是当GPCR位于特异构象中时结合第二亲代GPCR的 配体；

(II)确定相对于第二亲代GPCR在特定构象中与选定配体的结合的稳定性来 说，第二亲代GPCR的突变体在特定构象中与该选定配体的结合是否具有增强的 稳定性；和

(III)选择那些相对于第二亲代GPCR与该选定配体的结合来说，具有增强 的稳定性的突变的GPCR。

要注意的是步骤(I)(II)和(III)对应上述本发明第一方面方法的步骤(b) (c)和(d)。相应地，关于本发明第一方面的方法，配体和评估稳定性方法的优 选如上所述。

本发明的第十方面替提供相对于通过本发明第十方面的方法产生的其亲代 GPCR，具有增加稳定性的突变GPCR。

在一个具体实施方式中，本发明第十方面的突变GPCR是与其亲代受体相比， 在对应任一个或多个的下列位置中具有至少一个不同氨基酸的突变GPCR：(i)如 图9展示，根据火鸡β-肾上腺素受体编号：Ile 55、Gly 67、Arg 68、Val 89、Met 90、Gly 67、Ala 184、Arg 199、Ala 203、Leu 208、Gln 210、Ser 213、Glu 219、 Arg 220、Ser 223、Thr 224、Gln 226、Lys 227、His 230、Leu 241、Pro 260、Ser 263、 Leu 267、Leu 272、Thr 279、Asn 284、Gln 311、Pro 313、Lys 315；(iii)如图11 展示，根据大鼠神经紧张肽受体编号：Ala 69、Leu 72、Ala 73、Ala 86、Ala 90、 Ser 100、His 103、Ser 108、Leu 109、Leu 111、Asp 113、Ile 116、Ala 120、Asp 139、 Phe 147、Ala 155、Val 165、Glu 166、Lys 176、Ala 177、Thr 179、Met 181、Ser 182、 Arg 183、Phe 189、Leu 205、Thr 207、Gly 209、Gly 215、Val 229、Met 250、Ile 253、 Leu 256、Ile 260、Asn 262、Val 268、Asn 270、Thr 279、Met 293、Thr 294、Gly 306、 Leu 308、Val 309、Leu 310、Val 313、Phe 342、Asp 345、Tyr 349、Tyr 351、Ala 356、 Phe 358、Val 360、Ser 362、Asn 370、Ser 373、Phe 380、Ala 385、Cys 386、Pro 389、 Gly 390、Trp 391、Arg 392、His 393、Arg 395、Lys 397、Pro 399；和(iv)如图 17展示，根据草毒碱受体编号：Leu 65、Met 145、Leu 399、Ile 383和Met 384。

在图17中的火鸡β1 AR、人类腺苷受体、大鼠神经紧张肽受体和人类草毒碱 受体氨基酸序列的匹配显示在总的70之中的11种情况下，两个序列含有在同样 位置上的突变，即如图17中展示，根据人类β2 AR编号，在下列位置：Ala 59、 Val 81、Ser 143、Lys 147、Val 152、Glu 180、Val 222、Ala 226、Ala 271、Leu 275 和Val 317。因此，在特定具体实施方式中，与其亲代受体相比，在这些位置的任 一个上具有不同氨基酸。

在一个具体实施方式中，本发明的第十方面的突变GPCR是突变β-肾上腺素 受体。例如该突变β-肾上腺素受体在结构基序中，可以具有至少一个不同氨基酸残 基，在该结构基序中，与其亲代受体比，突变受体在对应任何下列位置的位置中， 具有一个不同氨基酸残基，如图9展示，所述位置根据火鸡β-肾上腺素受体编号： Ile 55、Gly 67、Arg 68、Val 89、Met 90、Gly 98、Ile 129、Ser 151、Val 160、Gln 194、Gly 197、Leu 221、Tyr 227、Arg 229、Val 230、Ala 234、Ala 282、Asp 322、 Phe 327、Ala 334、Phe 338。

在一个具体实施方式中，本发明的第十方面的突变GPCR是突变腺苷受体。 例如，该突变腺苷受体可以在结构基序中，具有至少一个不同氨基酸残基。在该 结构基序中，与其亲代受体相比，突变受体在对应任何下列位置的位置上，具有 一个不同氨基酸，如图10展示，所述位置根据人类腺苷A2a编号：Gly 114、Gly 118、 Leu 167、Ala 184、Arg 199、Ala 203、Leu 208、Gln 210、Ser 213、Glu 219、Arg 220、 Ser 223、Thr 224、Gln 226、Iys 227、His 230、Leu 24l、Pro 260、Ser 263、Leu 267、 Leu 272、Thr 279、Asn 284、Gln 311、Pro 313、Lys 315。

在一个具体实施方式中，本发明第十方面的突变GPCR是突变的神经紧张肽 受体。例如，突变神经紧张肽受体可以在结构基序中，具有至少一个不同氨基酸 残基，在该结构基序中，与其亲代受体比，在对应任何下列位置的位置上，突变 受体具有一个不同氨基酸。如图11展示，所述位置根据大鼠神经紧张肽受体编号： Ala 69、Leu 72、Ala 73、Ala 86、Ala 90、Ser 100、His 103、Ser 108、Leu 109、 Leu 111、Asp 113、Ile 116、Ala 120、Asp 139、Phe 147、Ala 155、Val 165、Glu 166、 Lys 176、Ala 177、Thr 179、Met 181、Ser 182、Arg 183、Phe 189、Leu 205、Thr 207、 Gly 209、Gly 215、Val 229、Met 250、Ile 253、Leu 256、Ile 260、Asn 262、Val 268、 Asn 270、Thr 279、Met 293、Thr 294、Gly 306、Leu 308、Val 309、Leu 310、Val 313、 Phe 342、Asp 345、Tyr 349、Tyr 351、Ala 356、Phe 358、Val 360、Ser 362、Asn 370、 Ser 373、Phe 380、Ala 385、Cys 386、Pro 389、Gly 390、Trp 391、Arg 392、His 393、 Arg 395、Lys 397、Pro 399。

在一个具体实施方式中，本发明第十方面的突变GPCR是突变草毒碱受体。 例如，突变草毒碱受体在结构基序中，可以具有至少一种不同氨基酸残基。在该 基序中，与其亲代受体比，在对应任何下列位置的位置上，突变受体具有一个不 同氨基酸，如图17展示，所述位置根据人类草毒碱受体编号：Leu 65、Met 145、 Leu 399、Ile 383和Met 384。

优选地，本发明的突变GPCR对于热、去污剂、离液试剂和极端pH中的任何 一种具有增加稳定性。

优选的是本发明的突变GPCR具有增加的热稳定性。

与其亲代比，当存在或无配体时，优选的是包括突变β-肾上腺素受体、腺苷和 神经紧张肽受体的本发明的突变GPCR具有增加的热稳定性。通常，无论是原位 的或是异构的，配体是拮抗剂、完全激动剂、部分激动剂或反向激动剂。如上所 讨论的，配体可以是多肽，例如抗体。

优选地，本发明的突变GPCR，例如突变β-肾上腺素受体或突变腺苷受体或突 变神经紧张肽受体比其亲代至少是2℃更稳定，优选地至少5℃更稳定，更优选 地至少8℃更稳定并且甚至更优选地比其亲代至少10℃或15℃或20℃更稳定。 通常，亲代和突变受体的热稳定性是在同样条件下测量的。通常，热稳定性是在 GPCR位于特定构象中的条件下分析的。通常，该选择条件是存在结合GPCR的 配体。

优选地，本发明的突变GPCR，当在合适的去污剂中溶解和纯化时，与在十二 烷基麦芽糖苷中纯化的牛视紫质具有相似热稳定性。特别优选的是在40℃加热30 分钟后，突变GPCR保留至少50％其配体结合活性。进一步优选的是在55℃加热 30分钟后，突变GPCR保留至少50％其配体结合活性。

这里揭示的突变GPCR对结晶研究是有用的并且在药物发现程序中时有用的。 其可以用于受体/配体动力学和热动力学参数的生物物理测量，即通过表面细胞基 质共振或基于荧光的技术。其可以用于配体结合筛选，并且可以偶联到固体表面， 用于高通量筛选或作为生物传感器芯片。含有突变GPCR的生物传感器芯片可以 用于检测分子，特别是生物分子。

本发明还包括编码本发明突变GPCR的多核苷酸。特别地，包括的多核苷酸 是本发明的编码突变β-肾上腺素受体或突变腺苷受体或突变神经紧张肽受体的多 核苷酸。该多核苷酸可以是DNA或其可以是RNA。通常，其包含在载体中，如 可以用于表达所述突变GPCR的载体。合适的载体是在细菌或哺乳动物或昆虫细 胞中繁殖和/或允许表达的载体。

本发明还包括宿主细胞，如编码突变GPCR的含有多核苷酸的细菌或真核细 胞。合适的细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

关于下列图和实施例，将更具体地描述本发明，其中：

图1在βAR中导致热稳定性的氨基酸改变。在32℃加热样品30分钟后，稳 定性商(quotient)显示突变体的％剩余结合活性。将所有值标准化到βAR34-424(50％， 以不连续线显示)以去除在分析间的任何实验可变性。条显示每个突变体的稳定 性。在x-轴上的字母显示氨基酸存在于突变体中。在βAR34-424中的原始氨基酸和 其位置在下面显示。在βAR34-424中的对应同样氨基酸的条与指示最佳突变的箭头 是用同样的颜色。从重复测量中计算误差，随后重新分析最佳突变而确定每个单 独突变的Tm并且给出每个突变体稳定性的准确排列顺序(见实施例1)。

图2与βAR34-424中的热稳定突变在同等位置的视紫质中的侧链。根据视紫质、 β1肾上腺素受体、神经紧张肽受体和腺苷A2a受体(未显示数据)的匹配，与 βAR34-424中突变的氨基酸等同的视紫质中的氨基酸残基定位于视紫质结构中。在 同样跨膜螺旋中的侧链作为空间填充模型以同样颜色显示。氨基酸残基的名称和 位置是在视紫质中的名称和位置。

图3在βAR中热稳定性的进化。从βAR-m10-8开始，系统地重新排列突变 的组合而发现优化的突变组合(还见表2)。

图4在apo-state中或含有结合的拮抗剂[3H]-DHA的βAR-m23和βAR34-424的 稳定性。为了确定无配体时的Tm(apo-state，不连续线)，将去污剂稳定的受体在 进行结合分析之前显示的温度孵育30分钟。为了拮抗剂结合形式(连续线)的Tm 确定，将去污剂溶解的受体和[3H]-DHA预孵育，随后是在显示的温度孵育。 βAR-m23(圆圈)；βAR34-424(正方形)。数据点来自在代表性实验中的重复测量。

图5βAR-m23和βAR34-424竞争性结合激动剂。结合分析是在DMM中部分纯 化的受体中进行的；βAR-m23(三角)；βAR34-424(正方形)。以比部分纯化受体的 KD的浓度高三倍的浓度使用[3H]-DHA(见方法)。[3H]-DHA结合与增加浓度的激 动剂、去甲肾上腺素(a)和异丙肾上腺素(b)或激动剂心得舒(alprenolol)(c) 竞争。通过非线性回归，使用GraphPad Prism软件计算不同配体的LogEC50和对 应EC50值，并且logEC50的误差在10％以下。配体结合βAR34-424和βAR-m23的 EC50是：去甲肾上腺素，βAR34-424 1.5μM，βAR-m23 3.7mM；异丙肾上腺素， βAR34-424 330nM，βAR-m23 20μM；心得舒，βAR 78nM，βAR-m23 112nM。

图6βAR-m23和βAR34-424在五种不同去污剂中的稳定性。在Ni-NTA琼脂糖 柱上部分纯化溶解在DDM中的βAR34-424(a)和βAR-m23(b)样品，所述琼脂糖柱 允许在各种不同去污剂中的交换：DDM(正方形)，DM(三角形)，OG(倒三角形)， LDAO(菱形)和NG(圆圈)。βAR在OG、NG和LDAO中太不稳定以致在6℃ 纯化后不能测量任何活性。分析如方法中描述的进行；Tm是在曲线和不连续线之 间的交叉显示的。在代表性实验中重复测量的结果是平行进行的。(c)通过X-射 线衍射显示良好顺序的βAR-m23突变体晶体显微照片。

图7βAR34-424热稳定性曲线(Tm)。如“方法”中描述，结合实验是使用[3H]-双 氢心得舒(DHA)作为放射性配体进行的。在分析前样品在不同温度加热30分钟。 Tm代表结合降至50％的温度，其值作为不连续线显示。数据点来自单一实验的重 复。该实验已经重复了几次，具有相似结果。

图8βAR34-424和βAR-m23膜的饱和结合分析。结合分析是如“方法”中描述， 使用[3H]-双氢心得舒(DHA)作为放射性配体进行的；βAR34-424(a)和βAR-m23(b)。 斯卡查德(scatchard)图和Bmax和KD的对应值一起作为插入物显示。对于每个蛋 白，数据点来自两个独立实验的重复。通过非线性回归使用Prism软件(GraphPad) 分析数据。

图9火鸡β-肾上腺素受体和人类β1、β2和β3受体的匹配。

图10人类腺苷受体的匹配。

图11神经紧张肽受体的匹配。

图12显示用于确定受体热稳定性的配体(+)和配体(-)的两个不同分析形 式流程图。

图13热稳定突变腺苷A2a受体、Rant21的药理学轮廓。(A)拮抗剂和(B) 激动剂与可溶受体的饱和结合。(C-F)通过增加拮抗剂(C)XAC和(D)胆碱茶 (Theophylline)和激动剂(E)NECA和(F)的浓度，抑制[3H]ZM241385结合； 在不存在非标记配体时，将结合[3H]ZM241385(10nM)设定为100％。在冰上在含 有400mM NaCl的结合缓冲液中(50mM Tris pH7.5 and 0.025％DDM)，将每个可 溶性受体与配体孵育1小时(A，C-F)。显示的数据来自两个独立实验，重复三次 测量每个数据点。在表(iii)中给出KD和Ki值。

图14显示与野生型受体相比，热稳定性突变体在加热后减少的对脂质的依赖 (A)和在高浓度DDM中的增加的存活(B)。为了IMAC步骤，将受体溶于1％DDM 中(在50mM Tris pH7.5和400mM NaCl中稀释)并且固定在Ni-NTA琼脂糖上。 在洗涤过程中进行含有适当浓度DDM和/或脂质的缓冲液交换并且从Ni-NTA柱子 上洗脱。

图15将火鸡β1肾上腺素受体中的M90V、Y227A、A282L和F338M m23突 变比对于人类β2肾上腺素受体结构的同源残基(分别是M82、Y219、C265和A321) 上(Rasmussen等人(2007)Nature 15；383-387；pdb accession codes 2R4R and 2R4S) 揭示其位置分别在螺旋界面和螺旋结节上。在火鸡β1肾上腺素受体中，对于热稳 定性突变在等同位置中的氨基酸残基作为标记的空间填充模型显示。

图16将火鸡β1肾上腺素受体中的m23突变比对于人类β2肾上腺素受体结 构的同源残基上(Cherezov等人(2007)Science，318：1258-65；pdb accession code 2RH1)。显示β2AR的Cα示踪是与去除的融合部分(T4溶菌酶)在一起的。在 βAR-m23中的六个突变(R68S、M90V、Y227A、A282L、F327A、F338M)与人类 β2AR中的氨基酸残基K60、M82、Y219、C265、L310、F321是等同的。Lys60 在螺旋1细胞内末端上并且指向脂-水界面。Met82靠近螺旋2的中部并指向配体 结合口袋；底物咔唑心安(carazolol)和Met侧链之间的最近距离是Tyr219 朝向细胞内螺旋5的末端并且在螺旋5-螺旋6的界面上。Cys265在螺旋5和6之 间的环区末端并且背向跨膜区。Leu310和Phe321都在螺旋7中并且都指向脂双层。

图17人类β-2AR、大鼠NTR1、火鸡β-1 AR，人类腺苷A2aR和人类草毒碱 M1受体的多序列匹配。在每个序列中，热稳定性突变用盒标记。存在于两个或多 个序列中的突变用星指示。

图18将火鸡β-1 AR突变I55A(人类β2AR I47)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在三个螺旋间的界面上(H1、H2结节、H7结节)。左： 侧视；右：顶视。

图19将火鸡β-1 AR V89L突变(人类β2AR V81)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在螺旋2中的结节上。编号螺旋并且以空间填充模型显 示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中的热稳定性突变 位置等同的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：顶视。

图20将火鸡β1AR M90V突变(人类β2AR M82)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在指向结合口袋的螺旋2中的结节上。编号螺旋并且以 空间填充模型显示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中 的热稳定性突变在等同位置中的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视； 右：顶视。

图21将火鸡β1AR I129V突变(人类β2AR I121)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在螺旋5中的结节的对面。编号螺旋并且以空间填充模 型显示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中热稳定性突 变在等同位置的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：底视。

图22将火鸡β1AR F338M突变(人类β2AR F321)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在螺旋7中的结节中。编号螺旋并且以空间填充模型显 示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中热稳定性突变在 等同位置的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：顶视。

图23将火鸡β1AR Y227A突变(人类β2AR Y219)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在螺旋-螺旋的界面上。编号螺旋并且以空间填充模型 显示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中热稳定性突变 在等同位置的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：底视。

图24将火鸡β1AR A282L突变(人类β2AR C265)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在环区中。编号螺旋并且以空间填充模型显示结合的拮 抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中热稳定性突变在等同位置的 氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：顶视。

图25将火鸡β1AR R68S突变(人类β2AR K60)比对于人类β2AR结构(pdb 登录号2RH1)上。突变是在脂质-水界面上，指向溶剂。编号螺旋并且以空间填 充模型显示结合的拮抗剂。以空间填充模型显示与火鸡β1肾上腺素受体中热稳定 性突变在等同位置的氨基酸残基并且为了清楚用箭头表示。左：侧视；右：成角 度顶视。

图26三个β肾上腺素受体(火鸡β1(■)，人类β1和人类β2(●))和两个 热稳定性受体(火鸡β1-m23和人类β2-m23(◆))的热稳定性比较。根据图9 中的匹配，在β1-m23中的六个热稳定性突变(R68S、M90V、Y227A、A282L、 F327A、F338M)都被直接转移到人类β2受体(K60S、M82V、Y219A、C265L、 L310A、F321M)上制成β2-m23。将形成的突变体瞬时在哺乳动物细胞中表达、 溶解在0.1％十二烷基麦芽糖苷中并且以负-配体形式为了热稳定性分析该突变体 (加热apo-state，在冰上淬灭，加入3H-DHA)。火鸡β1和β2-m23的显然Tm分 别是23℃和45℃，给出如之前在大肠杆菌表达受体中见到的22℃的ΔTm。人类 β1和β2-m23的Tm分别是29℃和41℃，显示apo受体是用12℃稳定的。这例 证了从一个受体至另一个受体热稳定性突变的可转移性原则，在这个情况下是 59％等同的。人类β1受体(Tm～12℃)比火鸡β1受体更不稳定。

图27火鸡β1肾上腺素受体、人类腺苷受体和大鼠神经紧张肽受体分别与人类 β肾上腺素受体、人类腺苷受体和人类神经紧张肽受体相比的百分比同一性。

图28神经紧张肽受体的匹配。

实施例1：去污剂抗性形式的β-肾上腺素受体的构象稳定

总结

有人类基因组编码的500种以上的非气味(non-odorant)G-蛋白偶联受体 (GPCR)，预测其中的许多是潜在的治疗靶向，但是只有一个结构是可用的，牛 视紫质，其结构代表整个家族。GPCR结构测定缺少进步的原因有许多，但是我们 改善这些受体的去污剂稳定性并且同时将其锁定在特定构象中将极大地增加结晶 的机会。基于丙氨酸扫描诱变，随后是受体稳定性的分析来开发分离去污剂溶解 的热稳定性GPCR突变体(β腺苷受体)的一般对策。318个测试突变体中，15 个显示可测量的稳定性增加。在每个最初突变位点上氨基酸残基的优化后，通过 结合特异突变体构建优化的稳定受体。最稳定的突变受体，βAR-m23含有导致Tm 比天然蛋白高21℃的6个点突变并且，当结合拮抗剂存在时，βARm23与牛视紫 质一样稳定。另外，在对结晶理想的广泛的去污剂中，βAR-m23显著性地更稳定 并且当无配体时，优选地是处于拮抗剂构象中。

结果

选择增加β1肾上腺素受体热稳定性的单一突变

来自火鸡红细胞的βAR是结构研究的理想靶向，因为其被很好地研究了并且 使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中可以高水平表达[10，11]。βAR最好的过表达 是通过使用截短形式的含残基34-424(βAR34-424)的受体而获得的[9]，并且将其用 作本工作的起始点。使用丙氨酸扫描突变来限定βAR34-424中的那些突变时改变受 体热稳定性的氨基酸残基，如果丙氨酸在序列中存在，其被突变成亮氨酸残基。 对氨基酸残37-369总共制造了318个突变，所述氨基酸区域包括所有七个跨膜结 构域和在C末端的23个氨基酸残基；由于在DNA模板中的强二级结构没有获得 15个氨基酸残基的突变。在对每个突变体测序而确保只存在需要的突变，在大肠 杆菌中功能性地表达该受体并且分析稳定性。

通过在32℃加热该受体30分钟，在冰上淬灭反应，然后使用拮抗剂[3H]-双 氢心得舒，进行放射性配体结合分析，在未纯化的去污剂可溶受体上进行热稳定 性的分析，与未加热对照比，而测定剩余的功能性βAR34-424分子数量。在分析前 在32℃加热非突变的βAR34-424 30分钟减少至未加热对照的约50％的结合(图7)； 通过包括作为对照的非突变βAR34-424，在进行的每个分析中，标准化突变的所有 数据。在第一轮筛选中，十八个突变体显示明显的稳定性增加，在加热后维持75％ 以上的拮抗剂结合并且在大肠杆菌中表达至至少50％的天然βAR34-424水平。在进 一步增加这些突变体稳定性的可能性方面，18个氨基酸中的每个被突变成各种大 小或电荷的2-5个可选择氨基酸残基(图1)。在这些18个突变中，12个不被进一 步的改变改善，如果另一个氨基酸存在，5个具有更好的热稳定性，并且来自第一 筛选的一个突变结果是假阳性。另外，当突变成丙氨酸时不稳定的三个残基(V89、 S151、L221)被突变成一系列其它氨基酸残基；突变成丙氨酸时两个位置不影响 热稳定性，也不被其它改变影响。相反，当突变成丙氨酸时，V89显示较小的热 稳定性，但是当其被突变成亮氨酸时，热稳定性增加。因此对于任何特定位置， 最初的丙氨酸扫描成功地给出那些测试的最佳氨基酸残基的三分之二。

给出最佳热稳定性增加的16个氨基酸残基中每个的预测位置和环境是通过匹 配βAR序列和结构是已知的视紫质序列而确定的(图2)。预测这些残基中的十四 个存在于跨膜α-螺旋中，预测其中的五个残基是脂质朝向的，四个是深埋的并且 预测剩余的是在螺旋间的界面上。预期这些残基中的一些将在βAR结构中相互作 用，如保守的氨基酸G67和R68(视紫质中的V63和Q64)，或在螺旋5中在Y227、 R229、V230和A234簇中的氨基酸(在视紫质中的Y223、Q225、L226和V230)。 与βAR相互作用的其它氨基酸残基是在外环2中的Q194A和外环3中的D322A (分别是视紫质中的G182和P285)。

每个单独突变给βAR34-424的稳定性增加是通过测定每个突变体的Tm而确定 的(结果未显示)；在本文中的Tm是在将受体加热30分钟后，给出50％功能性 结合减少的温度。每个突变增加βAR34-424的Tm 1-3℃，例外的是增加Tm 8℃的 M90A和Y227A。

组合突变以制造优化的稳定受体

最初，将βAR一级氨基酸序列中彼此相邻的增加稳定性的突变进行组合。表 达并分析含有突变G67A和R68S，或螺旋5末端的不同突变(Y227A、R229Q、 V230A和A234L)组合的构建体；Tm值(结果未显示)只比βAR34-424的Tm高 1-3℃并且一个突变体实际上是轻微的不稳定，提示在一级氨基酸序列中彼此相邻 的突变组合不极大地增加热稳定性。随后，组合在结构中预测是彼此相距较远的 突变。以随机方式使用各种引物的混合物而组合近5个不同的突变进行PCR反应， 然后检测热稳定性(表1)。与βAR34-424的Tm比，最佳的这些组合增加Tm 10℃ 以上。在某些情况下，相继整合单个突变对Tm有明确的附加效果。这在三个突变 m4-1、m4-7和m4-2系列中可见，将V230A加到m4-1上增加Tm 2℃并且将突变 D332A加到m4-7中进一步增加Tm 3℃。含有Y227A和M90A的突变体都显示增 加Tm 10℃或更多。仅这两个突变一起增加βAR34-424的Tm 13℃(m7-5)，但是， 总共拮抗剂结合是βAR34-424的50％以下，提示该突变体的表达被破坏。将F338M 加到m7-5不增加热稳定性，但是其增加在大肠杆菌中的功能性表达水平。

表1通过PCR组合突变。结合含有所选突变的不同引物对，进行10个PCR。 表中显示成功的PCR反应。如图7中描述的分析这些突变体的稳定性并计算Tm。 以来自重复的平均值±S.E.显示结果。

还在大肠杆菌中高水平表达的获得的最热稳定突变是m6-10、m7-7和m10-8。 这些突变含有总共10个不同突变，8个突变发生在至少两个突变体中。使用m10-8 作为模板并且加入或替换存在于m6-10和m7-7中的突变，进行第二轮突变(图3)； 这些突变中的一些非常靠近βAR一级氨基酸序列并且因此不像上述是附加的，但 是许多突变进一步增加Tm(表2)。例如，在m10-8中交换两个突变而创造m18， 提高Tm至49.6℃并且加入A282L而制造m23进一步增加Tm 3℃至52.8℃。这 产生迄今最热稳定的βAR34-424突变并且将作为βAR-m23被提及。

表2最佳突变组合的改善。通过PCR混合存在于突变m6-10、m7-7和m10-8 中存在的改变，获得这些新突变。图7中描述的分析这些新突变的稳定性。并且 计算Tm。以来自重复的平均值±S.E.显示结果。

通过在无拮抗剂时加热受体进行用于开发βAR34-424突变的热稳定性分析，但 是人们熟知的是：结合的配体稳定受体。因此，在加热步骤中，用结合到受体的 拮抗剂重复对βAR34-424和βAR-m23的稳定性分析(图4)。如期望的，在孵育过 程中，含有结合拮抗剂受体的Tm比无拮抗剂受体的Tm高。对于βAR34-424，有 结合拮抗剂时Tm高6℃并且对于βAR-m23，Tm增加2℃至55℃；当拮抗剂结 合时，观察到的βAR-m23热稳定性的增加较小，提示受体与βAR34-424相比，已经 在一个更稳定的与拮抗剂结合状态相似的构象中(还见下面)。与拮抗剂结合的 βAR-m23的Tm与在十二烷基麦芽糖苷(DDM)中的dark-state的视紫质的Tm相似 [12]，所述视紫质的结构已经由两个独立的实验室解析[13，14]。这提示βAR-m23 对于结晶是足够稳定的。

βAR-m23的鉴定

对βAR-m23和βAR34-424测量的用于鉴定六个突变的效果的三个特性活性是拮 抗剂结合亲和力、拮抗剂结合的相对效力和βAR-m23偶联G蛋白的能力。使用拮 抗剂[3H]-双氢心得舒的饱和结合膜实验(图8)显示结合βAR-m23的亲和力(KD 6.5±0.2nM，n＝2)比βAR34-424(KD 2.8±0.1nM，n＝2)稍微低一些，提示在拮抗剂 结合构象中βARm23的结构没有大的干扰。这与观察是一致的，所述观察是在 βAR-m23中，没有突变对应相信是涉及配体结合的氨基酸。与拮抗剂结合相反， 通过βAR-m23的拮抗剂结合效力比βAR34-424弱三个数量级(图5)。激动剂异丙 肾上腺素的潜力与天然激动剂去甲肾上腺素相比，在βAR-m23和βAR34-424中一 致性的低，揭示两个受体的激动剂结合构象有可能是相似的。但是，与βAR34-424 相比，βAR-m23中的激动剂效力的大幅减少，揭示βAR-m23中的六个突变已经将 受体优选地锁定在拮抗剂结合构象中。从结晶角度，对于热稳定性，这是一个附 加的好处，因为具有构象同质的蛋白总体对于产生衍射质量的结晶是重要的。

用于取得βAR-m23的所有热稳定性分析是在溶于DDM的受体上进行。热稳 定处理的目的是产生对结晶是理想的受体，这意味在各种不同去污剂中并且不只 是DDM中是稳定的。因此我们检测了在各种不同去污剂中βAR-m23和βAR的稳 定性，聚焦于优选的用于完整膜蛋白结晶的较小去污剂。将从表达βAR-m23或 βAR34-424的大肠杆菌中制备的膜溶于DDM，结合到Ni-NTA琼脂糖上，然后用 DDM、葵基麦芽糖苷(decylmaltoside)(DM)、辛基葡萄糖苷(OG)、月桂基二 甲基氧化胺(lauryldimethylamine oxide(LDAO))或壬基葡萄糖苷(NG)洗涤。 在每个不同去污剂中，在受体上进行稳定性分析(图6)。βAR34-424只在DDM中 和DM中是稳定的，没有活性受体从树脂上洗脱下来，该树脂是用OG、NG或LDAO 洗涤的。相反，功能性βAR-m23还存在于所有去污剂中，并且可以测定Tm。如 期望的，认为较小去污剂比DDM(Tm 52℃)或DM(Tm 48℃)更有变性力，具有 Tm 25℃(NG)，23℃(LDAO)和17℃(OG)。在βAR-m23和βAR34-424之间的Tm 差别是约20℃，不管受体是否溶于DDM或DM中；因此不惊讶的是甚至在NG 中不能发现活性的βAR34-424，因为预测的Tm将是约5℃，所以在纯化的条件下造 成受体的快速失活。故意地选择用于产生βAR-m23的选择对策是根据热稳定性， 因为其远比在增加严苛的去污剂中选择稳定性容易实施。但是，清楚的是增加 βAR34-424的热稳定性还造成其对理想的用于结晶完整膜蛋白的较小去污剂增加耐 受性。

突变GPCR的结晶

结晶几个不同火鸡β-肾上腺素受体构建体的早先尝试是失败的。虽然用各种条 件实验、使用天然序列以及结构截短的和删除环的构建体，在多年时间里，没有 获得结晶。

但是，一旦将来自βAR-m23的稳定性突变转移到构建体中，在不同去污剂和 不同条件下获得了几个不同结晶。

迄今研究最多的结晶是使用纯化的β-36构建体(含有下列改变的火鸡β受体氨 基酸残基34-367：点突变C116L和C358A；在m23中的6个热稳定性点突变；用 序列ASKRK替换氨基酸残基244-278；C末端His标签)获得的，该构建体是用 杆状病毒表达系统，在将受体转移到去污剂辛基-葡糖硫苷(octyl-thioglucoside) 中后，在昆虫细胞中表达的。使用的沉淀剂是PEG600或PEG1000并且获得的结 晶是延展的片。

也已经进行实验以确定：一旦用稳定的受体确定结晶条件，使用原始非稳定 的构建体，是否有可能获得结晶。可能的是获得相似或可能极小的结晶，但是， 事实上，“野生型”(即，突变开始的起始结构)从不给出任何结晶。

结晶是片形的，具有空间基团C2并且衍射很好，虽然单元的尺寸根据使用的 冷冻条件而变化。

总的来说，一旦稳定了GPCR，其即可以进行各种已知结构测定的技术。结晶 膜蛋白的最常用的技术是通过蒸气漫射(vapour diffusion)(20，21)，通常使用最 初建立的几千个结晶条件用商业机器人设备(22)。但是，有时通过蒸汽漫射形成 的结晶是小的并且无规则，所以可以使用另外的技术。一项技术包括用抗体对膜 蛋白重结晶(通过蒸汽漫射)，该抗体特异结合蛋白表面上的构象抗原决定簇(23， 24)；这增加蛋白的亲水表面并且可以形成强结晶接触。第二个选择是使用通常被 称为脂质立方相(lipidic cubic phase)或脂质液晶(lipidic mesophase)的不同结晶 矩阵(25，26)，其也已经在机器人平台中被开发(27)。对于产生只具有小亲水 表面的高质量蛋白结晶，例如细菌视紫质，这被证明是非常成功的(28)。通过电 子结晶学，可以确定膜蛋白结构至高分辨率(29)。

通过组合丙氨酸扫描突变和热稳定性突变体的选择，从βAR34-424的βAR-m23 进化已经产生了对结晶学是理想的GPCR。βAR-m23的Tm比βAR34-424的高21℃， 并且，当无拮抗剂时，βAR-m23具有视紫质相似的稳定性。βAR-m23 Tm的增加 已经导致在失活βAR34-424的各种小去污剂中增加稳定性。另外，应用的选择对策 产生优选的在拮抗剂结合构象中的受体，其将增加获得结晶的机会，因为受体构 象的总和将比野生型βAR34-424更同质。因此我们在单一选择过程中，已经获得构 象稳定的过程。

不完全清楚的是为什么我们引入的特定突变导致受体的热稳定性。在视紫质 中的等同位置提示突变的氨基酸残基可以指向脂双层，进入受体的中心或在这两 个环境之间的界面上。考虑到试图理解可溶蛋白热稳定性的复杂性的困难[15]，容 易地理解膜蛋白似乎是不可能的；我们发现在βAR中的氨基酸残基没有那些当突 变时导致热稳定性的特殊的式样。但是，因为产生的近5％的突变比天然受体更稳 定，丙氨酸扫描突变代表快速简单热稳定突变的一个有效对策。

我们用于产生βAR-m23的过程同样适用于任何膜蛋白。该蛋白对于在去污剂 可溶形式中检测活性具有方便的分析法。当我们选择稳定性作为温度的函数，作 为最方便的第一参数，该过程可以容易地延伸至检测稳定性的起始，例如在严苛 的去污剂中，在极端pH或离液序列高的盐存在时。各种人类受体、通道和转运蛋 白的构象稳定将使其远更适于结晶并且还将改进已经结晶的膜蛋白的分辨率。希 望构象稳定将允许膜蛋白结晶成为具有更大的快速成功可能性的，比现在的情况 更易于解决的问题。这将允许在制药工业中常规结晶人类膜蛋白，在药物开发中 形成有价值的结构见识。

方法

材料 来自火鸡的截短的β1肾上腺素受体(βAR34-424)[9]是由Tony Warne博 士(英国，剑桥，MRC分子生物学实验室)提供的。这个编码残基34-424的βAR 构建体含有用于增加表达的突变C116L[11]，和用于纯化的10个组氨酸的C-末端 标签。1-[4，6-丙基-3H]-双氢心得舒([3H]-DHA)是由Amersham Bioscience提供的， (+)L-去甲肾上腺素酒石酸氢盐、(-)异丙肾上腺素、(-)alprenolol酒石酸盐和s-氢氯 化心得安(propranolol hydrochloride)来自Sigma。

βAR的突变 将βAR cDNA连接至pRGIII而允许在大肠杆菌中作为MalE融 合蛋白，功能性表达βAR[16]。通过PCR使用表达质粒作为模板使用QuikChange II的方法学(Stratagene)产生突变。将PCR反应物转化至XL10-Gold超感受态细 胞(Stratagene)中并且将单个克隆完全测序以便检查只有需要的突变是存在的。 通过PCR通过引入下列突变的所有的引物对，随机组合不同的突变：Mut4、G67A、 G068A、V230A、D322A和F327A；Mut6、R068S、Y227A、A234L、A282L和A334L； Mut7、M90V、I129V、Y227A、A282L和F338M；Mut10、R68S、M90V、V230A、 F327A和A334L。转化PCR混合物并且测序克隆以便确切地确定哪个突变是被引 入的。

蛋白表达和膜制备βAR和突变体的表达是在XL10细胞(Stratagene)中进行 的。在37℃震荡培养50ml 2xTY含有氨苄青霉素(100μg/ml)的培养物直到 OD600＝3，然后用0.4mM IPTG诱导。将诱导的培养物在25℃孵育4小时，然后 通过在13,000xg离心1分钟收集细胞(2ml的等份)并且在-20℃储存。为了分 析，通过冻融(5个循环)破碎细胞，重悬于500μl的缓冲液中[20mM Tris pH 8， 0.4M NaCl，1mM EDTA和蛋白酶抑制剂(CompleteTM，Roche)]。在4℃用100μg/ml 溶菌酶和DNase I(Sigma)孵育1小时后，用2％DDM在冰上溶解样品30分钟。 通过离心除去不溶性材料(15,000xg，2分钟，4℃)并且将悬浮液直接用于放射 性配体结合分析。

对于大规模膜制备，分别如上所述生长2L和6L βAR和Mut23的大肠杆菌培 养物。通过5,000xg离心20分钟收集细胞，在液氮中冷冻并且于-80℃储存。在 含有1x蛋白酶抑制剂混合物(CompleteTM无EDTA，Roche)的10ml 20mM Tris pH 7.5中悬浮沉淀，加入1mg DNase I(Sigma)并且调整最终体积至100ml。通过 法式压榨机(French press)(2次通过，20,000psi)并且在4℃ 12,000xg离心45分 钟以去除细胞碎片。将上清(膜)在4℃ 200,000xg离心30分钟，在15ml 20mM Tris pH 7.5中悬浮膜沉淀并且在液氮中急速冷冻后，于-80℃储存1ml的等份。通 过氨基黑方法测定蛋白的浓度[17]。在融化后并且如上溶解于2％DDM后，将这 些样品用于放射性配体结合分析。

为了竞争分析，以及检测不同的去污剂，用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)部分纯 化DDM溶解的βAR。将200μl Ni-NTA琼脂糖加至2ml溶解于20mM Tris pH 8，0.4 M NaCl，20mM咪唑pH 8的样品中(10mg/ml的膜蛋白)并且在4℃孵育1小 时。孵育之后，在13,000xg离心样品30s并且用250μl含有去污剂(0.1％DDM、 0.1％DM、0.1％LDAO、0.3％NG或0.7％OG)的缓冲液(20mM Tris pH 8，0.4M NaCl，20mM咪唑)洗涤两次。

在2x 100μl缓冲液(0.4M NaCl，1mM EDTA，250mM咪唑pH 8，加上相关 去污剂)中洗脱受体。[3H]-DHA结合至半纯化的βAR34-424和βAR-m23的KD分别 是3.7nM and 12.5nM并且用于竞争性分析的[3H]-DHA的最终浓度是KD的3倍， 即对于βAR34-424是12nM并且对于βAR-m23是40nM。

放射性结合和热稳定性分析单一点结合分析含有20mM Tris pH 8，0.4M NaCl，1mM EDTA，0.1％DDM(或对应的去污剂)和在最终体积120μl中的50nM [3H]-DHA和20-100μg膜蛋白，在4℃平衡1小时。在有或没有[3H]-DHA时，在 特定温度，通过孵育30分钟结合分析混合物，评估热稳定性，将反应置于冰上并 且如果需要就加入[3H]-DHA并且进一步平衡1小时。如前面所述，通过凝胶过滤 分离受体结合的和自由的放射性配体[18]。当存在1μM s-心得安时，测定非特异 性结合。使用一系列从0.4nM至100nM浓度的[3H]-DHA获得饱和曲线。对于 βAR34-424使用12nM浓度的[3H]-DHA并且对于βAR-m23使用40nM的[3H]-DHA (即KD的三倍)以及各种浓度的非标记的配体(0-100mM)进行竞争性分析。在 Beckman LS6000液体闪烁计数器计数放射活性并且通过非线性回归，使用Prism 软件(GraphPad)分析数据。

在视紫质结构中定位βAR-m23热稳定性突变从蛋白数据库网址 (www.pdb.org)下载视紫质结构的pdb文件(登录号为1GZM)[14]并且在程序 PyMOLX11Hybrid(DeLano Scientific)中显示。根据四个GPCR间的匹配，将对于 在βAR中的热稳定性突变的在视紫质中等同的氨基酸残基定位在视紫质结构中， 所述的GPCR是我们最熟悉的，即视紫质、β1肾上腺素受体、神经紧张肽受体和 腺苷A2a受体[19]。

实施例2：具有增加热稳定性的腺苷A2a受体(A2aR)的突变

1.在A2aR残基2-316间制造的315位定向突变。

2.在加热步骤后，使用测定激动剂和拮抗剂结合的分析，检测所有这些突变 的热稳定性(如图12中描述的配体(-)形式)。

a.当用3H-NECA(激动剂)检测时，26个突变显示增加的热稳定性：G114A、 G118A、L167A、A184L、R199A、A203L、L208A、Q210A、S213A、 E219A、R220A、S223A、T224A、Q226A、K227A、H230A、L241A、 P260A、S263A、L267A、L272A、T279A、N284A、Q311A、P313A、 K315A。

b.当用3H-ZM241385(拮抗剂)检测时，18个突变显示增加的热稳定性： A54L、V57A、H75A、T88A、G114A、G118A、T119A、K122A、G123A、 P149A、E151A、G152A、A203L、A204L、A231L、L235A、V239A。

3.组合突变以产生具有推定拮抗剂构象的突变。有ZM241385结合时，野生 型A2aR的Tm为31℃。

a.Rant17 A54L+K122A+L235A        Tm 48℃(结合ZM241385)

b.Rant19 A54L，T88A，V239A+A204L Tm 47℃(结合ZM241385)

c.Rant21 A54L，T88A，V239A+K122A Tm 49℃(结合ZM241385)

4.组合来自激动剂筛选的突变，但是只导致Tm+2℃的非常低水平的增加。

表(i)A2aR稳定性突变的列表在大肠杆菌中表达突变体，其溶于2％DDM +10％甘油并且使用激动剂[3H]-NECA(在右侧)和拮抗剂[3H]-ZM241385(左侧) 检测其配体结合。放射性配体的浓度在其野生型受体测定的KD的6-10倍以上。 通过在4℃的配体结合，评估活性受体的表达。通过在其apo-state，在30℃加热 可溶受体30分钟分析稳定性，然后测定残基结合活性。在这些条件下，野生型活 性衰退至50％(S.D.＝15％)。对于表达和稳定性获得的数据被标准化至野生型数值。 包括在随后突变回合的突变是那些与野生型相比，表达≥30-40％和稳定性≥ 130-140％的突变。粗线指示突变群(cluster of mutation)。

表(ii)最佳组合的稳定性将受体溶于1％DDM(无甘油)。当无(apo-state) 或有配体(配体占有状态)时，通过在不同温度加热溶解的受体获得溶解轮廓。 显示的数据是至少三个独立实验的代表。S.D.＜1℃。

表(iii)去污剂溶解的野生型A2aR和热稳定突变体Rant 21的竞争性分析结 果的总结数值是两个独立实验的代表。将每个数据点重复三次分析并且以平均值 ±SD绘图。在冰上在含有400mM NaCl的结合缓冲液中(50mM Tris pH 7.5和 0.025％DDM)将每个溶解的受体与配体孵育1小时。将没有未标记配体时， [3H]ZM241385(10nM)的结合设定为100％。显示的数据来自两个独立实验，每 个数据点重复测量三次。在冰上，用配体孵育样品1h，[3H]ZM241385的浓度是 10nM。根据Cheng和Prusoff等式，使用软件Prism非线性回归方程计算Ki值， 应用[3H]ZM241385的KD为：对野生型是12nM，对Rant 21是15nM。Rant 21 不能充分结合NECA而准确地测定Ki(因此指示为1×10-1)。对于R-PIA，Rant21 的激动剂结合亲和力减弱232倍，并且对于NECA至少是1900倍。

表(iv)去污剂溶解的野生型A2aR和热稳定突变体的饱和分析结果的总结数 值是三个独立实验的代表。以三次重复分析每个数据点并且以平均值±SD绘图。 使用软件Prism的非线性回归方程式，将数据适用于Michaelis-Menten方程式。

表(v)在不同去污剂中野生型和突变受体稳定性的总结在IMAC步骤中进 行受体的溶解和去污剂的交换。S.D.为＜1℃。不能测定某些受体-去污剂组合的 Tm，因为受体太不稳定

实施例3：具有增加热稳定性的神经紧张肽受体(NTR)的突变

1.已经在NTR的残基61-400之间制造340位定向突变。

2.开始，在加热步骤后，使用检测3H-神经紧张肽(激动剂)结合的分析，分 析所有这些突变体的热稳定性。24个突变导致小的但是显著的热稳定性增加： A356L、H103A、D345A、A86L、A385L、Y349A、C386A、K397A、H393A、I116A、 F358A、S108A、M181A、R392A、D113A、G209A、L205A、L72A、A120L、P399A、 Y351A、V268A、T207A、A155L、S362A、F189A、N262A、L109A、W391A、 T179A、S182A、M293A、L256A、F147A、D139A、S100A、K176A、L111A、 A90L、N270A。

3.在无激动剂时，使用稍微不同的分析(其中在3H-神经紧张肽(在图12中 的配体(+)形式)存在时，将突变体加热)重新检测用于热稳定性检测的突变体。 具有增加稳定性的突变是：A69L、A73L、A86L、A90L、H103A、V165A、E166A、 G215A、V229A、M250A、I253A、A177L、R183A、I260A、T279A、T294A、G306A、 L308A、V309A、L310A、V313A、F342A、F358A、V360A、S362A、N370A、S373A、 F380A、A385L、P389A、G390A、R395A。

4.还有一些突变，其与野生型受体相比，具有显著增强表达水平的突变并且 可以用与提高结晶的受体产生水平：A86L、H103A、F358A、S362A、N370A、 A385L、G390A。所有这些都具有增加的热稳定性。

5.优选的组合是

a.Nag7m  F358A+A86L+I260A+F342A   Tm 51℃(结合神经紧张肽)

b.Nag7n  F358A+H103A+I260A+F342A  Tm 51℃(结合神经紧张肽)

有神经紧张肽结合时，野生型NTR具有Tm 35℃。

实施例4：鉴定稳定性GPCR突变位于的结构基序。

已经确定β2肾上腺素受体的结构(20，21)，其与火鸡β1受体是59％等同的， 但是具有明显不同的药理学轮廓(22，23)。为了测定火鸡β1受体稳定性突变位于 的将结构基序，我们将突变定位在人类β2结构上(21)。

首先用在MacVector包中的ClustalW匹配β肾上腺素受体；突出显示与人类β2 序列中的对应残基一起的火鸡β1中的热稳定性突变。在Pymol中观看人类β2模 型(pdb登录号2RH1)并且通过本领域中已知的标准过程，以空间填充模型显示 需要的氨基酸。通过视觉检查，测定稳定性突变位于的结构基序。

表(vi)列出在β2受体中的等同位置，其对应βAR-m23中的热稳定性突变和 其位于的结构基序。

从表(vi)中所见，突变位于一些不同的位置。三个突变在预测水溶剂可以进 入的环区中(环)。八个突变是在跨膜α-螺旋中并且指向脂双层(脂质)；这些突 变中的三个接近螺旋的末端并且可以认为是在亲水界面层上(脂质界面)。发现八 个突变在跨膜α-螺旋间的界面上(螺旋-螺旋界面)，其中的三个在螺旋的结节或 扭转区(结节)并且另外两个突变发生在一个螺旋中，但是接近一个或多个其它 螺旋，后面的螺旋含有空间上接近突变残基的结节(对面的结节)。这些后来的突 变可以影响在结节区中氨基酸的组装，其造成热稳定。另一个突变是在底物结合 口袋中(口袋)。

   火鸡β1   人类β2     描述 螺旋1     I55A     I47     3-螺旋结节界面 图18 螺旋1     G67A     A59     脂质边界 螺旋1     R68S     K60     脂质边界 图25 螺旋2     V89L     V81     结节 图19 螺旋2     M90V     M82     结节 图20

螺旋2   G98A   G90     口袋 螺旋3   I129V   S151E   I121   S143     对面结节     环 图21 螺旋4   V160A   Q194A   V152   A186     脂质     环 螺旋5   L221V   V213     脂质 螺旋5   Y227A   Y219     螺旋-螺旋界面 图23 螺旋5   R229Q   R221     脂质 螺旋5   V230A   V222     螺旋-螺旋界面 螺旋5   A234L   A226     螺旋-螺旋界面 螺旋6   A282L   D322A   C265   K305     环     脂质边界 图24 螺旋7   F327A   L310     脂质 螺旋7   A334L   V317     脂质 螺旋7   F338M   F321     结节 图22

表(vi)与在火鸡β1受体中发现的热稳定性突变等同的氨基酸残基的人类β2 结构的位置及其所在的基序。

因为其含有稳定性突变，这样的结构基序在测定蛋白稳定性中是重要的。因 此，靶向这些基序的突变，将有助于产生稳定的突变GPCR。事实上，有将多个突 变比对于同样的结构基序上的几种情况。例如，在火鸡β1肾上腺素受体中的 Y227A、V230A和A234L突变都被比对于同样的螺旋界面上，V89L和M90V突 变比对于相同的螺旋节上，并且F327A和A334L突变比对于指向脂双层的同样螺 旋表面上(表(vi))。因此，当已经鉴定了一种稳定性突变，突变所在的结构基序 的测定将能够进一步鉴定稳定性突变。

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