本发明涉及磷虾来源的多功能酶以及甲壳动物和鱼类来源的酶家 族，该酶家族结构上与南极磷虾来源的多功能酶基本相似。本发明还涉 及多功能酶、纯化多功能酶的方法、纯化的多功能酶和本发明的多功能 酶在制药、化妆品和其它方面的应用。

这些结构上与磷虾来源的多功能酶基本相似的酶与磷虾酶有相同的 用途。尤其是，这些多功能酶可用来治疗疱疹发作等病毒感染、真菌、 细菌或寄生虫感染，包括麻风的原发性和继发性感染、结肠炎、溃疡、 痔疮、角膜疤痕、牙斑、痤疮、囊性纤维变、血块、创伤、包括红斑狼 疮和多发性硬化等自身免疫病在内的免疫紊乱以及癌症。

美国专利第4,801,451和4,963,491号公开了一种由南极磷虾 (Euphasia superba)中分离的内肽酶和外肽酶的混合物和该混合物作 为清洗液的应用。美国专利第4,801,451号公开了这些酶由伤口处清除 外来异物和坏死组织的应用。专利申请WO 85/04809公开了磷虾酶作为 消化促进剂的应用。欧洲申请EP-A1-0170115公开了磷虾酶溶解血 块的应用。所有这些参考文献均使用未纯化或粗略鉴定的材料。纯化的 多功能酶用来提供制药上有用的产品是理想的。

发明概述

本发明提供了一种多功能酶，人们发现该酶在医学和化妆品方面有 广泛的用途。尤其是，本发明涉及具有多种活性的酶，这些活性包括以 下活性中至少一种：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或 外肽酶活性。该酶分子量以SDS PAGE测定为大约20到40kd，它与 磷虾来源的多功能水解酶具有基本的同源性。优选该酶分子量以SDS(十 二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳(“PAGE”)测定为大约26到32 kd，更优选大约29kd。优选该酶选择性与蛋白质或糖脂等细胞表面受 体反应。还优选该酶基本上是纯化的。优选该酶的大分子的纯度为至少 大约90％，更优选至少大约95％，更优选大约97％，更加优选大约99％， 最优选99.7％。优选该酶的N-末端序列包括：I-V-G-G-X-E/D- B-X-X-X-X-Z/B′-P-Z/H-Q-B-X-B′/Z，其中X为任何氨基 酸，Z为芳香族氨基酸，B为具有C2到C6烷基侧链的氨基酸，B′为亮 氨酸或异亮氨酸。更优选X、Z或B代表的所有氨基酸均为天然氨基酸。 优选该酶的N-末端序列包括：I-V-G-G-X-E/D-B，其中X为 任何氨基酸，B为具有C2到C6烷基侧链的氨基酸。优选该酶为磷虾来 源的多功能水解酶。优选该酶的N-末端序列为：I-V-G-G-N/M-E -V-T-P-H-A-Y-P-W-Q-V-(G-L-F-I-D-D-M-Y-F(SEQ ID NO.1)。对本申请来说，“基本上纯化的”是指大约60％的纯度。

在另一优选实施方案中，该多功能酶应与磷虾来源的多功能水解酶 有至少大约70％的同源性，更优选至少大约80％的同源性，更加优选 至少大约90％的同源性，最优选至少大约95％的同源性。测定同源性 时以保守置换作为同源。磷虾来源的多功能水解酶可作为多功能酶。磷 虾来源的多功能水解酶与其自身的同源性为100％。

本发明也提供了包括权利要求1的多功能酶和可药用的稀释剂或载 体的药用组合物。

本发明还提供了(a)某些条件下使用有效用量的上述酶的方法， (b)用于这些方法的组合物，(c)含有效用量的酶、用于这些方法 的药用组合物，和(d)该酶组合物在生产用于这些方法的药物中的应 用。这些方法用于：

(1)治疗或预防微生物感染，如病毒感染：疱疹(如HSV-1、 HSV-2、带状疱疹或生殖器疱疹感染)，HIV、肝炎、流感冠状病毒、 巨细胞病毒、鼻病毒或乳头瘤病毒感染；引起溃疡或腹泻等胃肠疾病的 感染；全身性、皮肤、口部、阴道或食管等真菌感染，包括诸如酵母感 染等，其中又包括真菌性指甲感染和念珠菌属感染；眼部微生物感染， 优选眼部用药进行治疗；细菌感染，包括葡萄球菌、链球菌、克雷伯氏 菌、假单胞菌、淋病、嗜血杆菌、衣原体、梅毒和大肠杆菌感染以及引 起软下疳的细菌感染；免疫力低下的患者中的机会性微生物感染，优选 后述多功能酶的用量为治疗或防止微生物感染的有效量或对细胞-细胞 或细胞-病毒粘附有抑制活性的量。

(2)治疗或预防皮肤病，如痤疮、牛皮癣或湿疹(包括脸部皮脂 溢性湿疹或手、脸或颈部湿疹)，痔疮等，此处优选该多功能酶的用量 为治疗或预防皮肤病的有效用量。

(3)治疗或预防囊性纤维变、COPD、癌症(例如，可使用治疗 肿瘤的有效用量或防止或抑制肿瘤转移的量)、动脉粥样硬化、哮喘、 败血症性休克、中毒性休克综合症、组织粘连(如腱-鞘、腹部手术后 或关节粘连)、再灌注损伤、疟疾、自身免疫病等免疫紊乱、细胞凋亡、 结肠炎和肠炎(如局限性回肠炎)，此处优选多功能酶的用量对治疗或 预防是有效的；

(4)治疗或预防伤口感染(向伤口处使用防止伤口微生物感染的 有效量的酶或通过使用抑制微生物的有效用量的酶促进伤口的愈合)， 这样进行治疗时，伤口处可以基本上没有坏死组织；

(5)治疗或预防急性或慢性炎症，此处优选多功能酶的用量为治 疗或预防急性或慢性炎症的有效用量；

(6)治疗或预防以下适应症：疼痛、支气管炎、流感嗜血杆菌感 染、肺部支原体感染、包皮感染、足癣、瘘管感染、感染性浅表性溃疡、 胃溃疡、新生儿脐部感染、皱纹、息肉、疤痕和Kelloids、扁平苔癣、 疖、疣和过敏性瘙痒、前列腺炎、乳腺炎、牙龈炎、鼻窦炎、关节炎和 关节红肿、腹泻、眼疾(如青光眼或白内障)和脱发，此处优选多功能 酶的用量为进行治疗或预防的有效用量；

(7)由健康的皮肤上除去死掉或脱落的皮肤以改善皮肤的外观， 此处优选多功能酶的用量为除去死皮的有效用量；

(8)溶解血块，此处优选多功能酶的用量为溶解血块的有效用量； 和

(9)去除牙斑，此处优选多功能酶的用量为除去牙斑的有效用量。 该方法包括使用包含上述多功能酶的组合物。本发明的组合物也可用于 防止分散性细胞死亡。

本发明提供了包括上述多功能酶的化妆品组合物；和霜剂、凝胶或 栓剂组合物。

本发明也提供了纯化上述多功能酶的方法，以获得除了该多功能酶 之外基本不含其它结合选定蛋白酶抑制物的蛋白质的组合物，该方法包 括以下步骤：

(a)将含有多功能酶的组合物上样到离子交换柱上；

(b)以离子强度为I1的第一种水溶液将第一种吸附物质由柱上洗 脱下来；

(c)以离子强度为I2的第二种水溶液将多功能酶由柱上洗脱下来；

(d)将步骤(c)洗脱下来的多功能酶转移到包括蛋白酶抑制物 的亲和基质上；和

(e)以使多功能酶和蛋白酶抑制物间相互作用不稳定的第三种水 溶液对亲和基质进行洗脱，

其中选择I1使得第一种水溶液(i)将含有能结合蛋白酶抑制物的 蛋白质的第一种吸附物质洗脱下来，但该蛋白质结合于阴离子交换柱的 能力弱于多功能酶，(ii)不将多功能酶洗脱下来；其中I2大于I1，选 择I2使得第二种水溶液将多功能酶洗脱下来，而基本上没有与选定的蛋 白酶抑制物结合的其它蛋白质被洗脱下来。优选亲和基质中使用的选定 蛋白酶抑制物抗多功能酶的消化，蛋白酶抑制物可为哺乳动物胰蛋白酶 抑制物，如牛胰蛋白酶抑制物。

本发明还提供(a)某些条件下使用有效用量的上述酶的方法， (b)用于这些方法的组合物或物质，(c)用于这些方法的含有效用 量的酶的药用组合物，和(d)该酶在生产用于这些方法的药物中的应 用。这些方法用于：

(10)预防性传播微生物感染，如念珠菌(口部或阴道念珠菌)感 染、淋病、衣原体、梅毒、毛滴虫、软下疳、HIV、疱疹、乳头瘤或肝 炎感染，其中后述酶可在性行为前后或在性行为期间使用，优选用量为 预防感染的有效量；

(11)预防感冒或流感病毒感染，此处优选该酶使用于有感染危险 的动物的肺、鼻腔或窦道，用量为防止微生物感染的有效量。

(12)治疗或预防麻风患者的原发性或继发性微生物感染，优选用 量为治疗或预防原发性或继发性感染的有效量。

(13)处理组织、体液或细胞组分以除去或灭活包含的细胞粘附成 分，其中该酶用于组织、体液或细胞组分，优选酶的用量为除去或灭活 细胞粘附成分的有效量或抑制免疫排斥反应的量，优选组织、体液或细 胞组分在体外进行处理，但它们也可在动物体内原位处理；

(14)清洁隐形眼镜，优选向镜片上使用的酶的用量为清洁镜片的 有效量，此处当镜片在眼内时也可使用；

(15)治疗或预防冠状病毒(如引起猫科动物传染性腹膜炎的冠状 病毒)、巨细胞病毒、鼻病毒或乳头瘤病毒(如人乳头瘤病毒)感染， 此处优选酶的用量为治疗或预防病毒感染的有效量；

(16)治疗或预防HIV感染，优选酶的用量为治疗或预防HIV感 染的有效量；

(17)治疗或预防口部或食管真菌(如包括酵母菌感染)，优选酶 的用量为治疗或预防微生物感染的有效量；

(18)治疗或预防假单胞菌、扁平苔癣、念珠菌(如阴道或口部念 珠菌感染)、淋病、衣原体、梅毒、毛滴虫或软下疳感染，优选酶的用 量为治疗或预防微生物感染的有效量；

(19)预防、减轻或去除角膜疤痕，优选酶的用量为预防、减轻或 去除角膜疤痕的有效量，还优选该酶在进行眼部手术时使用以防止角膜 疤痕的形成；

(20)治疗或预防结膜炎(如病毒性、细菌性或过敏性结膜炎)， 优选酶的用量为治疗或预防结膜炎的有效量；

(21)治疗或预防以下疾病或细胞过程：囊性纤维变、COPD、动 脉粥样硬化、哮喘、中毒性休克综合症、再灌注损伤、结肠炎、肠炎和 伴有疼痛的疟疾感染，优选酶的用量为进行治疗或预防的有效量；

(22)预防或减轻再灌注损伤，优选酶的用量为预防或减轻再灌注 损伤的有效量；

(23)治疗或预防有凋亡危险的细胞(如HIV患者的T细胞)的 凋亡过程，优选酶的用量为治疗或预防凋亡的有效量；

(24)治疗或预防自身免疫病，如多发性硬化、类风湿性关节炎、 红斑狼疮、脉管炎、颞动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、活动性慢性肝炎、 溃疡性结肠炎或硬皮病，优选酶的用量为治疗或预防自身免疫病的有效 量；以及

(25)治疗痔疮(如产后痔疮)，优选酶的用量为治疗痔疮的有效 量。 该方法包括使用含有上述多功能酶的组合物。

本发明还提供了(a)治疗或预防细胞-细胞或细胞-病毒粘附综 合症的方法，包括使用抗粘附的有效量的水解酶，有效除去或灭活参与 细胞-细胞或细胞-病毒粘附的细胞或病毒受体粘附成分，(b)用于 这些方法的组合物或物质，(c)用于这些方法的包含有效量的酶的药 用组合物，和(d)该酶组合物在生产用于这些方法的药物中的应用。 优选该综合症包括发炎、休克、肿瘤转移、自身免疫病、移植排斥反应 或微生物感染。优选(a)该综合症选自微生物感染、免疫紊乱、囊性 纤维变、COPD、动脉粥样硬化、癌症、哮喘、败血症性休克、中毒性 休克综合症、结膜炎、再灌注损伤和疼痛，和(b)与细胞-细胞或细 胞-病毒粘附综合症有关的细胞表面受体选自ICAM-1、ICAM-2、 VCAM-1、CD4、CD8、CD11、CD18、CD28、CD29D、CD31、 CD44、CD49、CD62L、CD102和无唾液酸GM1神经酰胺，这些受 体可通过使用水解酶而除去或灭活。优选微生物感染得到治疗或预防， 微生物感染为疱疹、HIV、肝炎或乳头瘤病毒感染；引起结肠炎、溃疡 或腹泻的感染；口部、阴道或食管念珠菌感染等念珠菌感染；感冒或流 感；假单胞菌、嗜血杆菌、葡萄球菌、链球菌、克雷伯氏菌或大肠杆菌 感染；麻风的原发性或继发性感染；或引起结膜炎的感染。

本发明还提供了(a)治疗或预防抗药性微生物感染的方法，即使 用治疗或预防有效量的上述多功能酶，(b)用于这些方法的组合物或 物质，(c)用于这些方法的含有效量的酶的药用组合物，和(d)该 酶组合物在生产用于这些方法的药物中的应用。优选的微生物为抗甲氧 西林或quinilone的细菌。在另一优选实施方案中，微生物为真菌，如抗 吡咯型药物(如fluconazole)的真菌(如念珠菌)。

本发明还提供了用来除去或灭活细胞表面粘附分子的药用组合物， 它包括除去或灭活细胞表面粘附分子的有效量的多功能酶，该酶至少具 有以下一种活性：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或外 肽酶活性；其分子量以SDS PAGE测定为大约20到40kd；它与磷虾 来源的多功能水解酶有基本的同源性，该组合物还包括可药用的稀释剂 或载体。

本发明还提供了用来治疗或预防细胞-细胞或细胞-病毒粘附 综合症的药用组合物，它包括治疗或预防细胞-细胞或细胞-病毒粘附 综合症的有效量的组合物，该组合物包括多功能酶，该多功能酶至少具 有以下一种活性：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或外 肽酶活性；其分子量以SDS PAGE测定为大约20到40kd；它与磷虾 来源的多功能水解酶有基本的同源性，上述组合物还包括可药用的稀释 剂或载体。

优选本发明的多功能酶至少具有列出的两种蛋白水解酶活性，更优 选至少三种，更加优选至少四种。最优选该酶具有所有列出的蛋白水解 酶活性。优选多功能酶具有基本的抗细胞-细胞和细胞-病毒粘附活 性。优选多功能酶与磷虾来源的多功能水解酶有基本的同源性。

在一个优选实施方案中，对HIV感染的患者进行治疗以减缓有关疾 病的进程，治疗过程包括：(1)由患者体内分离T细胞，(2)以水 解酶处理T细胞以有效除去CD4，和(3)将T细胞注入患者体内。

治疗肿瘤的方法如下：口服或非肠道用药，包括但不限于静脉内、 动脉内、腹膜内、皮下、肌内或瘤内用药。作为该实施方案的一部分， 本发明提供了预防或限制肿瘤转移过程的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了使用多功能酶抑制或预防病原微 生物传播的方法。优选多功能酶用于包括该微生物主要传播途径的身体 部位。例如，在一个优选实施方案中，在参与性行为的体孔处使用喷雾 剂、软膏或洗剂，以预防HIV或肝炎传播。又如，在另一优选实施方案 中，通过气雾剂将多功能酶用于上呼吸道，以阻止或预防鼻病毒或冠状 病毒等感冒病毒的传播。

一方面，体外处理组织、体液或细胞组分以除去细胞粘附成分的方 法减弱了由一个个体移植到另一个体的组织、体液或细胞组分的免疫排 斥反应。另一方面，这样的处理除去或灭活处理的组织、体液或细胞组 分中发现的参与微生物感染的细胞粘附成分。

使用多功能酶治疗或预防败血症休克或中毒性休克综合症时，合适 的给药途径包括但不限于全身用药。与休克有关的阴道感染，优选的用 药方法可以是阴道冲洗、乳膏、凝胶或栓剂。

本发明还涉及预防性传播疾病的方法，即在节育装置中使用预防微 生物感染的有效量的多功能酶。并且，本发明还提供了包括多功能酶的 节育装置。

在抑制或预防细胞凋亡或程序性细胞死亡过程时，该酶可在体内或 体外使用。

在本发明的一个优选实施方案中，分离的多功能酶为基本上不含任 何胰蛋白酶抑制物的形式。“基本上不含”指以SDS-PAGE分析15μg 分离的多功能酶时，考马斯蓝染色测不出这种胰蛋白酶抑制物。优选以 SDS-PAGE分析1μg分离的多功能酶时，银染色测不出胰蛋白酶抑制 物。

附图简述

图1A和1B显示在不同温度下温育数小时或数天时实施例1A中的 酶制品的温度稳定性。

图2显示实施例1A中的多酶制品的最适温度。

图3显示实施例1A中的多酶制品的pH稳定性。

图4显示荷柔软的卵巢来源肿瘤的小鼠分别以如实施例1C所述纯化 的多功能酶治疗或不治疗时的体重增加情况。

图5显示荷卵巢肿瘤的小鼠以酶治疗或不治疗时的存活情况。

图6显示以实施例1A的多酶制品对膀胱感染患者进行治疗后排尿间 隔时间的增加。

图7显示肺部病毒感染的患者以如实施例1B所述纯化的多功能酶进 行治疗后红斑/肿胀减轻的情况。

图8显示如实施例1C所述纯化的多功能酶对抗HIV的保护效果。

图9显示以不同底物进行测定时，如实施例1C所述纯化的多功能酶 的pH依赖性。

图10显示以2个不同的蛋白酶抑制物对如实施例1C所述纯化的多 功能酶进行滴定时的活性。

图11显示以实施例1A的多功能酶制品进行治疗时，跛种马的疼痛 缓解情况。

图12显示以如实施例1B所述纯化的多功能酶对坏死伤口进行治疗 时的某些愈合指标。

发明详述

现已发现，本发明的多功能酶能有效除去或灭活某些细胞表面粘附 分子，如ICAM-1(即CD54)、ICAM-2、VCAM-1、CD4、 CD8、CD28、CD31、CD44和无唾液酸GM1神经酰胺，而不会影响 细胞生存能力。人们相信，这种粘附位点去除或灭活现象至少部分解释 了酶对多种但可能不是全部适应症(该多功能酶对这些适应症都是有效 的)的效果。已发现其它细胞表面受体基本上不被多功能酶去除或灭活， 这样的受体如T细胞受体、I类主要组织相容性复合体或整合素CD11 和CD18。

虽然不想受任何特定理论的限制，但可以相信多功能酶预防或治疗 感冒病毒感染的活性与酶的抗粘附活性有关。例如，引起大部分感冒的 鼻病毒利用病毒和ICAM-1细胞表面粘附分子的相互作用作为感染途 径。参见Lineberger等，《病毒学杂志》(J.Virol.)64卷2582-2587 页(1990)；Stauton等，《细胞》(Cell)61卷243-254页(1990)。 多功能酶由哺乳动物细胞表面除去或灭活ICAM-1。同理，引起大部 分非鼻病毒导致的感冒的冠状病毒利用CD13细胞表面分子作为感染途 径。参见Delmen等，《自然》(Nature)357卷417-420页 (1992)；Yeager等，《自然》(Nature)357卷420-422页(1992)。 人们相信，多功能酶除去或灭活参与冠状病毒感染途径的细胞表面粘附 分子。由于多功能酶的稳定性和较宽的pH范围(在该范围内有效)，该 酶可在多种环境下起作用，如肺、窦道、嘴、肠和阴道，在这些部位该 酶均可使用。

虽然不想受任何特定理论的限制，但可以相信，多功能酶减轻疟疾 疼痛的活性至少部分是由于该酶的抗ICAM-1细胞表面粘附分子的活 性。ICAM-1参与吸附感染红细胞(RBCs)至内皮细胞或未感染RBCs 上，引起患者毛细管和小静脉的堵塞以及疟疾感染危象引起的疼痛。参 见Ockenhouse，《宿主寄生物相互作用中的细胞粘附分子》(Cell Adhesion Molecules in Host Parasite Interactors)，刊登于《粘附 分子》(Adhesion Molecules)277-291页，Craig Wegner编著， Academic Press，San Diego，1994。多功能酶由细胞表面除去或灭 活ICAM-1。

多种细胞表面粘附分子，包括ICAM-1分子，与再灌注损伤有关。 参见Korthius和Granger，《局部缺血/重灌注的发病机制》(Pathogenesis of Ischemial/Reperfusion)，刊登于《粘附分子》(Adhesion Molecules)163-190页，Wegner编著，Academic Press，1994。 ICAM-1特异性抗体干扰嗜中性粒细胞吸附、迁移到缺血组织(同前)， 因而限制了嗜中性粒细胞在再灌注损伤中的作用。这些抗体也限制了心 肌梗死的面积(同前，见177页图8.17)。多功能酶通过将ICAM-1 由细胞表面除去或使其灭活而干扰其作用。

同样，虽然不想受任何特定理论的限制，但可以相信多功能酶抑制 HIV传播的活性至少部分与该酶的抗CD4细胞表面粘附分子活性有关。 HIV感染途径利用了CD4细胞表面分子。参见Lentz，《病毒与宿主细 胞受体的分子相互作用》(Molecular Interaction of Viruses With Host-Cell Receptors)229页，刊登于《粘附分子》(Adhesion Molecules)223-251页，Wegner编著，Academic Press，1994。

念珠菌感染时，菌丝体阶段被认为更具感染性。念珠菌上的配体可 能能够识别感染宿主的无唾液酸GM1神经酰胺上的GalNAcβ(1-4)Gal碳 水化合物结构，它们被认为参与念珠菌感染过程。这些配体分子可能也 与酵母型念珠菌转变为丝状体阶段的过程有关。在肺部假单胞菌感染 时，一种细菌细胞表面配体能够识别GalNAcβ(1-4)Gal碳水化合物结构， 它被认为在肺部感染途径中起一定作用。参见Abraham，《细菌粘附》 (Bacterial Adhesions)，刊登于《粘附分子》(Adhesiorn Molecules) 253-276页，Wagner编著，Academic Press，1994。同样或类似的 糖脂结构被认为与几种病原微生物粘附到肺部有关，这些病原微生物包 括铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎 克雷伯氏菌和大肠杆菌的某些分离株。参见Krivan等，《美国国家科学 院院于》(Proc，Natl.Acad Sci.U S.A.)85卷6157-6161页，1988。

皮肤起皱很大程度上是由于自由基交联胶原蛋白引起的。自由基的 形成被认为是由于死的或将死去的细胞与细菌相互作用引起的，死去的 或将死的细胞是细菌生长的良好培养基。虽然不想受特定理论的限制， 但可以相信，多功能酶的抗粘附特性会减弱与自由基形成有关的细胞对 皮肤的粘附。

细菌在死的、将死的或散开的细胞中的快速生长被认为会产生引起 脱发的毒素。这种毒素刺激皮肤细胞产生肿瘤坏死因子等因子，这又会 对头发生长有不利影响。虽然不想受特定理论的限制，但可以相信，多 功能酶的抗粘附特性有助于稳定或逆转脱发的过程。

CD4和ICAM-1被认为与T细胞凋亡有关。参见Okazaki等，《细 胞免疫学》(Cell.Immunol，)156卷，135-45页(1994)。同样， 虽然不想受特定理论的局限，但可以相信，多功能酶的抗粘附活性在抑 制细胞凋亡中起一定作用。

胃溃疡通常与幽门螺杆菌感染有关。虽然不想受特定理论的限制， 但可以相信本发明的多功能酶对溃疡有作用，因为它能抑制细菌对胃肠 粘膜的粘附。

37℃时T细胞与浓度低至10μg/ml的磷虾水解酶温育4小时，酶对 细胞表面分子的破坏或灭活程度经测定有如下结果：CD3和CD90基本 上不受影响；CD28、CD49、CD29D、CD18和CD11被明显破坏或 灭活，可测定的抗原降低了大约25％到40％；CD54、CD102、 CD44、CD31、CD62L、CD4和CD8基本上被破坏或灭活，可测定的 抗原普遍降低了大约70％到100％。另外，与本发明的多功能酶温育后， 以抗无唾液酸GM-1的抗体测定表明肺上皮细胞膜上免疫法可测定的 该神经酰胺的量减少了。而且，对肺上皮细胞的这种处理降低了假单胞 菌对肺上皮细胞的粘附水平。

可以相信上述及其它粘附分子在多种其它疾病中起一定作用将会得 到证实。对这些疾病，多功能酶是有效的治疗和预防剂。

对本申请来说，下列术语含义如下：   ·有感染危险    若动物环境或病史的某些特征符合一种或多种

              感染的危险增加的趋势，则该动物有感染危险。   ·细胞-细胞     一种疾病，其中受体细胞粘附成分在疾病的病

或细胞-病毒   原学上起作用，例如在疾病的形成、传播、发

间粘附综合症  展或进程中起作用。   ·与微生物感染  细胞粘附成分被微生物用来促进对有感染危险

有关的细胞粘  的组织或细胞的粘附。

附成分   ·皮肤病        与动物的表面损伤有关的疾病，包括但不限于

              皮肤、阴道和眼睛表面。   ·鱼类或甲壳动  指一种酶，与自鱼类或甲壳动物分离的酶有相

物来源的      同的序列。   ·抗药的        一种类型的微生物对或曾经对给定剂量的一种

              或多种抗微生物药剂敏感，但现在只对剂量明

              显增加的该药剂敏感或对该药剂不再敏感。   ·水解酶        通过水解反应降解酰胺、酯或醚键等键的酶，

              该术语包括但不限于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶

              等蛋白酶。   ·免疫紊乱      由对外来物质、组织或细胞或者对自体或移植

              组织的免疫反应引起的各种紊乱。该术语包括

              自身免疫病。   ·磷虾来源的多  与由磷虾中分离的酶有同样序列的多功能酶，

功能水解酶    它具有实施例1B、1C和1D中所述蛋白质的

              特性。该酶也被称为“磷虾多功能水解酶”或

              “磷虾多功能酶”或“磷虾来源的多功能酶”。   ·大分子        对纯度鉴定来说，该术语指分子量大于1000左

              右的蛋白质、核酸或碳水化合物等生物聚合体。   ·微生物        细菌、支原体、酵母、真菌、病毒、原生动物、

              寄生虫(如疟疾寄生虫)等。   ·多功能酶      至少具有以下一种活性的酶：胰凝乳蛋白酶、胰

              蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或外肽酶活性，其

              分子量为大约20到40kd，与磷虾来源的多功能

              水解酶有基本的同源性。   ·坏死细胞      由死的或不可逆损伤的细胞组成的组织部分。   ·蛋白质        为鉴定纯度的目的，该术语指分子量大于1000

              左右的多肽。   ·与细胞表面蛋  指通过任何方式除去、破坏、灭活或钝化可测定

白或糖脂反应  的细胞表面分子。   ·与细胞或病毒  指不论以何种方式除去、破坏、灭活或钝化细胞

受体粘附成分  或病毒与细胞、病毒、配体基团或分子反应的能

反应          力。   ·SDS-PAGE      指在十二烷基硫酸钠存在时对蛋白质进行聚丙

              烯酰胺凝胶电泳。   ·与细胞表面蛋  指除去、破坏、灭活或钝化某些位于细胞表面

白的选择性反  的细胞表面蛋白，而不影响其它分子。

应   ·性传播微生物    任何通过性接触传播的疾病。

感染   ·基本的同源性    至少大约60％的序列同源性。   ·基本不含其它    组合物基本不含其它结合于选定蛋白酶抑制物

结合于选定蛋    的蛋白质是指这类蛋白质占组合物中总蛋白的

白酶抑制物的    重量百分比小于5％。

蛋白质   ·全身用药        多功能酶等生物制剂的用药，使该制剂到达动物

的血液或其它循环系统(如淋巴系统)。

甲壳动物，包括南极磷虾，为本发明的多功能酶的有用来源。例如， 冰冻磷虾可以在水或缓冲液中制成匀浆，优选其中含有抗微生物剂。所 得上清中(若合适的话，进行稀释)可以通过离子交换层析(优选阴离 子交换层析)、凝胶过滤、层析聚焦层析或其它常规分离过程进行分离。 然而，优选分离过程的某些部分包括亲和层析，所用基质已附有大豆胰 蛋白酶抑制物等胰蛋白酶抑制物。本发明所用的磷虾来源的多功能水解 酶可由这种基质上解吸附，使用的条件会使水解酶和抑制物之间相互作 用去稳定。这些条件包括高盐、低pH或存在尿素等变性剂。为增加其它 选择性过程，去稳定条件可以递增(如以梯度)施用于基质上。当使用 亲和层析时，优选后续的层析使用已附有本发明所用的多功能酶的基 质。该酶亲和步骤有助于除去由第一种亲和基质中洗出的胰蛋白酶抑制 物。通过这些方法，可以分离出纯度超过95％左右的(如纯度为大约 99.7％或更高)的多功能酶。

非磷虾材料中分离出的多功能酶在分子量、序列、温度或pH稳定 性、最适pH或温度和蛋白水解特异性或实施例中列出的磷虾来源的多功 能酶的其它特性方面均与分离的磷虾多功能水解酶相当。

蛋白酶活性的测定方法如下：将酶制品与酪蛋白(浓度：1％w/v) 在30℃下温育20小时，测定释放的氨基酸或肽(可通过比色法可测定 的氨基基团的增加进行测定)。分离的纯度为95％的多功能酶一般具有 至少大约每毫克25个酪蛋白单位的特异活性。酪蛋白单位的定义见《生 物化学杂志》(Biochem.J.)173卷291-298页，1978(使用偶氮酪 蛋白(azocasein)作为底物)

或者，胰蛋白酶活性可以酪氨酸-精氨酸甲基酯(TAME)为底物 进行测定。优选多功能酶(纯度为大约95％或更高)具有至少大约每毫 克60个TAME单位的特异活性。或，胰蛋白酶活性可以苯甲酰-基缬 氨酸-甘氨酸-精氨酸-对亚硝基-酰基苯胺为底物进行测定。使用该 底物和相应方法(见《生物化学杂志》(Biochemical.J)185卷423- 433页，1980)测定时，优选多功能酶具有至少大约每毫克210个单位 的特异活性。胰凝乳蛋白酶活性可以丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸 -苯丙氨酸-对亚硝基-酰基苯胺为底物进行测定。使用该底物和相应 方法(见《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem)269卷19565-19572 页，1994)测定时，优选多功能酶具有至少大约每毫克260个单位的特 异活性。弹性蛋白酶活性可以使用BOC-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙 氨酸-对亚硝基酰基苯胺为底物进行测定。使用该底物和相应方法(见 《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)269卷19565-19572页，1994) 测定时，优选多功能酶具有至少大约每毫克270个单位的特异活性。

蛋白质纯度通常以SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行鉴定。所需各 带的染色百分比反映了纯度。蛋白质浓度通常以氨基酸分析或280nm处 吸收值进行测定。

通常，本发明的多功能酶足够稳定，浓度为5mg/ml，pH7.0时50 ℃温育24小时后，至少保留有大约50％的水解酶活性。优选浓度为 5mg/ml，pH7.0时60℃温育5小时后，至少保留有大约50％的水解酶 活性。

优选多功能酶的最适pH与底物有关。底物为偶氮酪蛋白时，最适 pH优选为大约3.5到6.5，更优选为大约4.0到6.0。底物为苯甲酰基 缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-对亚硝基酰基苯胺时，最适pH优选大于8.0 左右，更优选大于9.0左右。底物为BOC-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸- 丙氨酸-对亚硝基酰基苯胺时，最适pH优选为大约6.0到7.0，更优选 为大约7.0。

以苯甲酰基-缬氨酸甘氨酸精氨酸-对亚硝基酰基苯胺为底物 时，在2mM Ca++存在下pH大约9.5时Km优选为大约200到240μM。 以丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸苯丙氨酸对亚硝基酰基苯胺为 底物时，在2mM Ca++存在下pH9.5时Km优选为大约250-290μM。

优选多功能酶降解酪蛋白活性的最适温度为大约45℃到60℃。通 常，该酶在浓度为5mg/m1、pH范围为大约5.0到9.5时于25℃温育18 小时后，保留有至少50％的活性。

当HL60细胞以磷虾多功能水解酶预处理时，它们与TNFα刺激的18 内皮细胞的结合被抑制达60％以上。优选以本发明的多功能酶处理HL 60或内皮细胞时，对HL 60细胞与TNFα刺激的内皮细胞结合的抑制达 大约20％以上，更优选大约40％以上，更加优选大约60％以上，最优 选大约80％以上。或者，优选多功能酶具有大约30％以上的磷虾来源 的多功能水解酶的粘附抑制活性。更优选多功能酶具有大约60％以上的 磷虾来源的多功能水解酶的粘附抑制活性，更加优选大约80％以上，最 优选大约100％以上。

本发明的多功能酶可以口服、局部用药、直肠给药、阴道给药，采 用滴注法(如注入尿道或瘘管)、利用气雾剂经肺给药、滴眼或全身用 药，如肠道外给药，包括肌内、皮下、腹膜内、动脉内或静脉内给药等。 多功能酶可单独使用，或根据标准制药方法与可药用的载体或赋形剂组 合使用。采用口服方式用药时，多功能酶以片剂、胶囊、糖锭、咀嚼胶、 锭剂、粉剂、糖浆、酏剂、水溶液和悬液等形式使用。使用片剂时，所 用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。片剂通常使用淀粉等各种崩解 剂以及硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。以胶囊形式口服时，有用的稀释剂 为乳糖和高分子量的聚乙二醇。如果需要，可加入某些甜味剂和/或调味 剂。肠道外给药时，通常制备多功能酶的无菌溶液，调好溶液的pH并加 以适当的缓冲剂。静脉内使用时，应控制溶质的总浓度使制品等渗。眼 部用药时，软膏或滴眼液可以通过涂药器或眼滴管等本领域已知的眼部 用药装置来使用。这些组合物可以包括透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基 甲基纤维素或聚乙烯醇等粘液模拟物(mucomimetics)，山梨酸、EDTA 或benzylchronium chloride等防腐剂，和常量的稀释剂和/或载体。肺部 给药时，应选择合适的稀释剂和/或载体以使气雾剂能够形成。局部用药 时，多功能酶通常以水溶液或水凝胶形式使用。优选水凝胶包括大约1 ％到10％(w/v)的低分子量水解淀粉的含水悬液。

多功能酶的栓剂形式可用于阴道、尿道和直肠给药。这些栓剂通常 由一种混合物组成，该混合物在室温下为固体但在体温下熔化。通常用 来制造这些赋形剂的物质有可可油、含甘油的明胶、还原的植物油、各 种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇脂肪酸酯的混合物。对栓剂形式的进一 步讨论参见《雷明顿制药科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，16版，Mack Publishing，Easton，PA，1980，第1530 -1533页。类似的凝胶或乳膏可用于阴道、尿道和直肠给药。

本领域的普通技术人员很容易想到有多种给药赋形剂均可使用，包 括但不限于缓释剂、脂质体和聚合基质。

局部治疗时，每次应用的多功能酶的合适剂量为大约0.1μg/cm2到 1mg/cm2，优选大约1μg/cm2(如使用浓度大约为10μg/ml)到1mg/cm2 (如使用浓度大约为10mg/ml)，更优选大约5μg/cm2(如使用浓度大 约为50μg/ml)到100μg/cm2(如使用浓度大约为1mg/ml)，更加优选 大约10μg/cm2到250μg/cm2，最优选大约10μg/cm2(如使用浓度大约为 100μg/ml)到50μg/cm2(如大约500μg/ml)。全身治疗时，剂量的选 择通常使血清中多功能酶的水平维持在大约0.1μg/100cc到5μg/100cc， 优选大约0.5μg/100cc到2.0μg/100cc。优选的全身用药量的另一种表示 方法为：优选剂量为大约0.1mg/kg到10mg/kg，更优选剂量为大约1mg/kg (尽管动物模型的毒理实验表明超过25mg/kg是可以接受的)。眼部治 疗时，每次应用的多功能酶的合适剂量为每只眼大约0.01mg到5mg，优 选每只眼大约0.1mg到2.0mg。阴道和尿道治疗时，合适的多功能酶的 冲洗/滴注液的浓度通常为大约1μg/ml到15mg/ml，优选大约100μg/ml 到3mg/ml。口服治疗时，合适的漱口液含多功能酶的浓度为大约1mg/ml 到15mg/ml，优选大约2mg/ml到10mg/ml。锭剂通常含大约100μg到 10mg多功能酶。气雾剂通常由含酶浓度为大约0.1mg/ml到15mg/ml的 溶液制成，优选浓度为大约1mg/ml到10mg/ml。通常向患者的呼吸道使 用大约0.1ml到2ml气雾剂，优选大约0.5ml到1.0ml。治疗疤痕和瘢痕 瘤时，通常每cm2伤处注射大约0.1mg到5mg多功能酶，优选大约0.5mg 到3mg。治疗结缔组织或关节粘连，通常向粘连间隙注入大约0.5mg到 10mg多功能酶，优选大约1mg到5mg。无论何种治疗，酶组合物通常 每天使用大约1到10次，优选大约2到5次。当然，这些值会随多种因 素的变化而变化，这些因素包括疾病的类型和严重程度、患者的年龄、 体重和医疗状况，这都在医学领域的普通技术人员的知识范围之内。人 们相信，可以使用显著增加的剂量而不会有明显的副作用。

治疗或预防感染时，多功能酶可以全身使用或以导向于感染组织的 方式使用。预防感冒或流感传播时，优选组合物使用于肺部或呼吸道。 治疗免疫紊乱时，组合物可以全身使用或以导向于感染组织的方式使 用。治疗麻风的原发性和继发性感染时，主要的用药途径通常是局部用 药。治疗疤痕或瘢痕瘤组织时，组合物通常注到疤痕或瘢痕瘤中，但治 疗角膜疤痕时，组合物通常以非注射方式使用于眼部。治疗癌症时，组 合物通常以一种途径全身用药或以导向于感染组织的方式使用。治疗动 脉粥样硬化时，虽然可以选择用药部位，以使循环系统中最危险的部分 获得最高剂量，但组合物通常全身使用。治疗哮喘时，通常的给药途径 为肺部。治疗假单胞菌感染时，典型感染通常发生于肺部，用药途径也 通常是肺部。治疗再灌注损伤时，虽然用药部位可以选择，以使身体遭 受局部缺血的部分获得最高剂量，但组合物通常全身用药。治疗疟疾的 疼痛症状时，用药方式通常为全身用药。

伤口愈合时，优选多功能酶比初次包扎伤口时的简单应用更经常地 使用。优选至少每次更换敷料时均使用多功能酶。也可至少每隔一天使 用多功能酶，更优选每天使用。在一个实施方案中，多功能酶使用于基 本没有坏死组织的伤口。“基本没有坏死组织”指坏死组织极少，因而 普通的病理学家将会认为任何残余的坏死组织与确定伤愈预后无关。

器官移植时，优选移植器官浸泡于多功能酶溶液中大约10分钟到5 小时。优选酶溶液含有大约0.01mg/ml到25mg/ml多功能酶，更优选大 约0 5mg/ml到5mg/ml。移植完成后，优选多功能酶按照上述条件全身 使用。

眼内清洁隐形眼镜时，优选上述眼部治疗的溶液；体外处理时，通 常使用更高浓度的酶。清洁温育优选在大约20℃到50℃时处理大约5 到30分钟。体外处理时，优选温度范围的上限值更高。

治疗麻风时，多种相关感染可以通过多功能酶的局部使用得以妥善 治疗。治疗CF或COPD时，多功能酶可用来治疗(a)肺部粘液的形成 和(b)相关的肺部感染。优选对CF和COPD患者的治疗包括以多功 能酶的气雾剂进行肺部治疗，但也可包括全身用药以及其它用药途径。

与本发明的传播抑制实施方案有关的疾病中特别重要的是性传播疾 病，如念珠菌、淋病、衣原体、梅毒、毛滴虫、软下疳、HIV、疱疹或 肝炎感染。在这些疾病中，病毒性疾病为特别优选的预防传播的目标； HIV为更优选的目标。为此用途，参与性活动的体孔通常以含有多功能 酶的组合物冲洗，或以乳膏、凝胶或栓剂使组合物局限于体孔部位。组 合物可以在性活动之前或之后立即使用，也可在性活动期间使用，但优 选在性活动之前或在性活动期间使用。

对疱疹感染来说，靶病毒包括HSV-1，它主要表现为口部疱疹， HSV-2，它主要表现为生殖器疱疹和带状疱疹。

对自身免疫病或与自身免疫成分有关的疾病来说，治疗对象包括但 不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬变、活动性慢 性肝炎、溃疡性结肠炎、风湿性关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、淋 巴瘤性甲状腺肿、原发性粘液水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、阿狄森病、 早发性绝经(premature onset of menopause)、自身免疫性男性不 育、胰岛素依赖性糖尿病、抗胰岛素黑棘皮症(type B insulin resistance of acanthosis nigricans)、alopic过敏、重症肌无力、 Lambert-Eaton综合症、古德帕斯彻综合症、寻常天疱疮、类天疱疮、 晶状体眼色色素层炎(phacogenic uveitis)、交感性眼炎、自身免疫 性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、斯耶格伦综合症、盘状红斑 狼疮、皮肤肌炎和混和性结缔组织病。

粘附紊乱时，涉及的细胞或病毒可以包括但不限于内皮细胞、T细 胞等淋巴细胞、肿瘤细胞、微生物细胞、HIV和疱疹等病毒。粘附过程 被认为与免疫细胞、微生物和肿瘤细胞等对组织的侵袭有关。

从以下多个临床病例中可见，本发明的多功能酶可有效地治疗或预 防炎症。典型情况下，在开始治疗后3到4天内，炎症减轻到可接受的 水平。这些病例也说明该酶可有效缓解疼痛。一般报道在开始治疗后20 分钟到2小时内疼痛减轻。疼痛减轻并不伴随有接受治疗的组织的感觉 麻木。更完全的减痛效果(使患者只感到轻微的疼痛或仅有触痛)通常 在开始治疗后2天内达到。尽管这些参数的测定通常是主观的，但实施 例中还包括有对发炎的马关节进行治疗的情况，这种情况下减痛效果可 通过观察受治疗马的跨步更客观地衡量。

对多种疾病来说，长发明的多功能酶可以有效地进行预防性治疗， 这些疾病包括不是由微生物引起的疾病，患者的病史、生活方式或遗传 背景通常有助于找到致病因素。例如，对动脉粥样硬化来说情况就确实 如此。

优选水解酶为蛋白酶。特别优选为本发明的多功能酶。

通常，多功能酶以有效量使用。有效量为有效达到以下要求的用量 (1)减轻待治疗疾病的症状，(2)诱导与治疗待治疗疾病有关的药 理学变化，(3)抑制或预防由感染因素引起的感染或再感染，或(4) 预防非传染性疾病(例如可通过阻断细胞粘附现象进行治疗的疾病)的 发生。对癌症来说，有效量还包括有效达到以下要求的用量：防止或限 制转移(如降低转移程度)；减小肿瘤大小；减缓肿瘤的生长；以及增 加疾病侵袭动物的预期寿命。治疗创伤时，有效量一方面包括若有规律 地使用时可预防感染发生的用量，另一方面还包括有效地缩短伤口愈合 时间的用量。

人为优选的治疗对象。但多功能酶可有多种兽医上的用途，可用来 对动物进行治疗，优选对哺乳动物进行治疗，本领域的普通技术人员参 考本发明公开的内容就能认识到这些。

测定同源性百分数的多种方法在本领域是已知的。一种优选的方法 是使用6.0版GAP计算机程序进行序列比较。该程序可由威斯康星大学 遗传学计算机小组(University of Wisconsin Genetics Computer Group)处获得，它使用Smith和Waterman(见《应用数学进展》(Adv Appl.Math)，第2卷482页，1981)改进的Needleman和Wunsch排 列法(见《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)48卷443页，1970)。 另有一种方法使用FASTA计算机程序。

多功能酶已被证实可治疗感染。但是，它在体外对微生物生长的直 接作用很小。虽然不想受任何特定理论的局限，但可以相信，该酶干扰 微生物和肿瘤侵袭组织的机制。这些机制包括细胞-细胞或细胞-病毒 粘附机制，肿瘤或微生物利用该机制使其在组织上立足。关于细胞表面 粘附分子和粘附过程在肿瘤转移过程中的重要性，在Albelda举行的讨论 中有论述，见《细胞粘附分子在肿瘤发展和转移中的作用》，刊登于《粘 附分子》，Craig Wegner编著，Academic Press，san Diego， 1994，第71-88页。

多功能酶破坏其它细胞-细胞或细胞-病毒的粘附反应被认为与其 它可以用多功能酶进行治疗的疾病有关，这些疾病包括牙斑和免疫紊 乱。

HL 60细胞(人淋巴细胞系)对内皮细胞的粘附被认为更一般地模 仿了肿瘤细胞侵袭和感染的机制。这种粘附受肿瘤坏死因子α(TNFα) 的刺激，而为抗HL 60细胞上的E-选择素抗原的抗体所抑制。E-选 择素为细胞表面的粘附蛋白，它似乎与唾液酸化的碳水化合物结合。参 见Bevilacqua等，《科学》(Science)(1989)243卷1160页。

多功能酶制品即使未纯化至均一状态也有活性。在以下实施例1A中 提及的说明性的纯化过程中，制备了一种含至少六种蛋白质的“多酶” 组合物。该制品被发现在多种条件下部有活性，这在多个实施例中述及。

多酶制品中至少含有磷虾多功能水解酶，它至少具有以下一种活 性：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶或外肽酶活性。这 种水解酶可以用常规方法进行基本纯化，达到表观纯度为至少大约 90％。磷虾来源的多功能水解酶的表观分子量为大约29kd。

有用的多酶制品就蛋白质来讲通常包括至少大约10％的多功能 酶。优选的多酶制品包括至少30％的多功能酶。

图1A和B示出了磷虾多酶制品的温度稳定性。酶制品(5mg/ml， 溶于pH7.0的缓冲体系)在10、20、30、40、50、60或70℃温育 不同时间，随后在pH7.0)时温育20小时检测其由牛酪蛋白(来自Bio Rad Laboratories，Inc，Hercules，California)中释放氨基酸和肽的 能力。60℃时，该制品的半衰期超过6小时；50℃时，半衰期远远超 过24小时；40℃时，半衰期为大约6天。图2示出多酶制品在不同温 度下的活性。最适温度为55℃。图3示出多酶制品在室温下于不同pH 温育时的活性。温育后，pH调整为大约pH7.0，剩余活性的测定同上 所述。最大稳定性在大约pH7.0时达到。但是在pH为大约5.0到9.5的 溶液中温育18小时后，至少保留有50％的初始活性。

多功能酶可由鱼类或甲壳动物的组织匀浆中纯化，或由产生多功能 酶的转化或正常原核或真核细胞的细胞培养物的上清或匀浆中纯化。优 选纯化过程中包括使用亲和柱，该亲和柱包含与多功能酶反应的抑制 物。多功能酶由亲和柱中洗脱出来之后，制品中残留的酶抑制物被除去。 去除的一种方法是将该制品通过亲和基质，该基质含有与抑制物牢固结 合(如亲和常数至少为大约106M，优选至少为大约107M)的分子(通 常为蛋白酶)。更优选亲和配体为原来分离的欲纯化的多功能酶制品。

优选亲和纯化步骤之前使用一些常规蛋白纯化过程进行纯化。这可 包括不同的沉淀法、凝胶过滤层析、离子交换层析、在染料基质等弱疏 水基质上的层析、层析聚焦和反相液相层析。优选这当中的一个或多个 步骤可充分地除去与亲和配体结合的所有蛋白质，而多功能酶被保留下 来。作为可选择的或补充的步骤，亲和层析之后可使用一个或多个常规 蛋白纯化过程进行纯化。

优选纯化流程包括以下步骤：

(a)将含多功能酶的组合物上样于离子交换柱上；

(b)以具有选定离子强度I1的第一种水溶液将第一种吸附物质由

   柱中洗脱下来；

(c)具有选定离子强度I2的第二种水溶液将多功能酶由柱中洗脱

   下来； 其中选择I1使得第一种水溶液(i)洗脱出含蛋白质的第一种吸附物质， 该蛋白质可结合到水解酶抑制物上，但它与阴离子交换柱结合的能力较 多功能酶弱；(ii)不洗脱出多功能酶，其中I2高于I1，选择I2使得第 二种水溶液洗脱出多功能酶，而基本没有其它与选定蛋白酶抑制物结合 的蛋白质被洗脱下来。

该方法在步骤(c)之后还包括以下步骤：

(d)将步骤(c)中洗脱下来的多功能酶转移到含蛋白酶抑制物

   的亲和基质上；

(e)以使蛋白酶抑制物和多功能酶的相互作用不稳定的第三种水

   溶液洗脱亲和基质；和

(f)收集洗脱的多功能酶。 经过一些步骤后，用这些优选的方法出乎意料地获得了多功能酶的均一 制品。

步骤(f)之后，该方法可任选地包括以下步骤：

(g)将第二种洗脱下来的溶液转移到亲和基质上，该基质上含有

   原来的多功能酶制品；

(h)收集含酶基质中的流出液，该流出液包括纯化的多功能酶。

优选I1为大约0.4M NaCl的离子强度，I2为大约0.6M NaCl的离 子强度。优选阴离子交换层析在pH大约为5.5到7.5之间进行，更优选 大约6.0到7.0，更加优选大约6.2。优选阴离子交换基质包括基于多糖 的基质，该基质在膨胀状态下每ml包括大约0.05mmol到0.6mmol阴离 子交换位点。优选该基质为商品名为Sepharose的交联葡聚糖。优选阴离 子交换基团包括二乙氨乙基(DEAE)或四氨乙基(QAE)，更优选 DEAE。

步骤(d)-(f)的亲和层析优选在步骤(d)到(e)之间还包 括以离子强度至少为大约0.5M NaCl的溶液洗含抑制物的层析柱，更优 选大约0.8M NaCl，更加优选大约1M NaCl。这一步及前一洗脱步骤 优选在pH大约5.5到7.5时进行，更优选pH为大约6.0到7.0。洗脱步 骤(e)优选包括使用pH为大约2到4的缓冲液，优选pH大约为3。 或者，也可优选包括使用pH至少为大约8的缓冲液。洗脱缓冲液优选具 有足够的离子强度，以抑制同亲和基质的较弱的离子相互作用。

该方法中的步骤(g)和(h)优选在pH为大约5.5到7.5时进行， 更优选大约6.0到7.0。这些步骤中所用的缓冲液优选具有足够的离子强 度，以抑制与亲和基质的较弱的离子相互作用。    

用来产生亲和基质的基质优选包含碳水化合物基质，如交联葡聚糖 (如商品名为Sepharose者)或琼脂糖(如瑞典Pharmacia名为Sephacryl 者)。基质孔径应足以容纳连接于亲和基质上的亲和配体和本发明的多 功能酶。合成合适的亲和柱的方法是众所周知的。例如，可参见Axén 等，《自然》(Nature)214卷1302-1304页(1967)。

优选的亲和配体在步骤(d)和(e)的条件下抗多功能酶的消化。 这类亲和配体包括牛胰蛋白酶抑制物。使用这类抑制物，选择性步骤 (g)和(h)通常就变得较不重要。

一些鱼类或甲壳动物水解酶的分离物和部分序列已有报道。以下的 表l中列出了多个报道的结果。

                                表l-序列报道 Penaeus vanamelii 1 已报道的序列： Van Wormoudt等，Comp Biochem. Physiol.，103B：675-680，1992和Sellos 和Wormhoudt，FEBS，39：219-224，1992. 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶 表观分子量： 25kd  Panaeus  vanamelii 2 已报道的序列： Van Wormoudt等，Comp Biochem. Physiol.，103B：675-680，1992. 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶(胰蛋白酶) 表观分子量： 25kd 斑节对虾胰蛋白酶(虾) 已报道的序列： Lu等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，371： 851-859.1990. 报道的活性： 胰蛋白酶 表观分子量： 27kd 最适pH： 7.4-8.0  Pi： ≤2.4 斑节对虾胰凝乳蛋白酶-1(虾) 已报道的序列： Tsai等，Biochem et Biophys，Acta， 1080：59-67，1991 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶 胶原酶 表观分子量： 27-28kd 斑节对虾胰凝乳蛋白酶-2 已报道的序列： Tsai等，Biochem.et Biophys.Acta， 1080：59-67，1991 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶 胶原酶 表观分子量： 25-26kd  Uca pubilator(招潮蟹)l 已报道的序列： Tsai等，Biochem.et Biophys.Acta， 1080：59-67，1991 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶 表观分子量： 最适pH  25kd  8.0-8.5  Uca pugliator II 已报道的序列： Grant等，Biochemistry，19：4653-4659， 1980 报道的活性： 胰凝乳蛋白酶 胶原酶 胰蛋白酶 弹性蛋白酶 表观分子量： 25kd  pl： 8.0-8.5 堪察加蟹(至少4种蛋白酶) 已报道的序列： Grant等，Biochemistry，22：354-358，1983 报道的活性： 胰蛋白酶 胶原酶 表观分子量： 23-26kd 螯虾蛋白酶 已报道的序列： Titani等，Biochemistry，22：1459-1465，

磷虾来源的多功能酶的前25个氨基酸序列为I-V-G-G-N/M-E -V-T-P-H-A-Y-P-(W)-Q-V-G-L-F-I-D-D-M-Y-F (SEQ ID NO.1)。括号表示第14个氨基酸回收较少，“N/M” 表示第5位氨基酸的异质性。各种丝氨酸水解酶的N-未端20到25个 氨基酸序列的比较见以下的表2。

                               表2 N-末端序列     种类   SεQ    ID    NO                           序列   Penaeus   vanameii 1   (虾)      3     I V G G V E A T P H S W P H Q A A L F I D D M Y F   Penaeus   vanameii 2      4     I V G G V E A T P H S X P H Q A A L F I   P.monodon，   trypt.   (虾)      5     I V G G T A V T P G E F P Y Q L S F Q D S I E G V   P.monodon，   chym.1      6     I V G G V E A V P G V W P Y Q A A L F I I D M Y F   P.monodon，   chym.2      7     I V G G V E A V P H S W P Y Q A A L F I I D M Y F   Uca   pugilator I     (蟹)      8     I V G G V E A V P N S W P H Q A A L F I D D M Y F   Uca   pugilator   II      9     I V G G Q D A T P G Q F P Y Q L S F Q D   王蟹     10     I V G G Q E A S P G S W P ? Q V G L F 堪察加蟹     11     12     13     14     I V G G Q E A S P G S W P X Q V G L F F     I V G G T E V T P G E I P Y Q L S L Q D     I V G G T E V T P G E I P Y Q L S F Q D     I V G G S E A T S G Q F P Y Q X S F Q D   螯虾     15     I V G G T D A T L G E F P Y Q L S F Q N 磷虾酶      1      2     I V G G N E V T P H A Y P W Q V G L F I D D M Y F     I V G G M E VT P H A Y P W Q V G L F I D D M Y F 牛胰凝乳蛋白酶     16     I V N G E D A V P G S W P W Q V S L Q D 鲑 大西洋鳕鱼 大西洋鳕鱼     18     19     20     I V G G Y E C K A Y S Q A Y Q V S L N S G Y H Y C     I V G G Y E C T K H S Q A H Q V S L N S G Y H Y C     I V G G Y E C T R H S Q A H Q V S L N S G Y H Y C ×＝未知或未定义

该酶可以用重组方法生产，这对普通技术人员来说是显而易见的。 例如，此处所引的序列可以作为筛选表达或基因组文库的寡核苷酸探针 的基础，以分离完整的结构基因。例如可参见Suggs等，《美国国家科 学院院刊》78卷6613页，1981或Berent等，《生物技术》(Bio Techniques)3卷208页，1985。或者，已知的蛋白序列可用来设计引 物，采用基于PCR的方法扩增编码多功能酶的核酸。通常参见《分子克 隆实验指南》(第二版)，Cold Spring Harbor，1989和《PCR方 法与应用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Michael等编，Academic Press，1990。一旦完全鉴 定后，这些结构基因可以用本领域的已知方法进行剪辑，并恰当地插入 表达载体。

这些结构基因可以用诱变方法改变，诱变方法可参见Adelman等， 《DNA》第2卷183页，1983，或使用合成核酸链使结构基因改变。 突变基因产物可以用来方便地测定多功能酶活性。优选保守突变。这些 保守突变包括以下各组中以一个氨基酸替换另一个氨基酸的突变：

1.小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、

  Gly；

2.极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；

3.极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；

4.大的脂肪族、非极性残基：Met、Ieu、Ile、Val和Cys；

  和

5.芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。 优选的保守替换于以下列出： 原残基 替换残基  Ala  Gly，Ser  Arg  Lys  Asn  Gln，His  Asp  Glu  Cys  Ser  Gln  Asn  Glu  Asp  Gly  Ala，Pro  His  Asn，Gln  Ile  Leu，Val  Leu  11e，Val  Lys  Arg，Gln，Glu  Met  Leu，Tyr，Ile  Phe  Met，Leu，Tyr  Ser  Thr Thr  Ser  Trp  Tyr Tyr  Trp，Phe  Val  Ile，Leu 替换类型可以根据不同物种的同源蛋白之间氨基酸替换的频率分析进行 选择，该频率分析由Schulz等在《蛋白质结构原理》(Principles of Protem Structure)，Sprmger-Verlag，1978，14-16页中提出； 也可以根据结构形成趋势的分析或其它类似方法进行选择，该分析由 Chou和Fasman在《生物化学》《Biochemistry)13卷211页(1974) 中提出，其它类似方法见Schulz等的综述，刊登于《蛋白质结构原理》 Springer-Verlag，1978，108-130页；还可以根据蛋白质疏水特征 分析进行选择，该分析由Kyte和Doolittle在《分子生物学杂志》(J.Mo1. Biol.)157卷105-132页(1982)中提出。

患有产后痔疮的患者的临床试验表明含500μg/ml实施例1C中的磷 虾来源的水解酶的1ml水凝胶(实施例1F)在痔疮部位使用，每日三次， 两天内(通常在一天内)可有效地治愈痔疮发作。

患生殖器疱疹的患者的双盲、安慰剂对照试验表明，含500μg/ml实 施例1C中的磷虾来源的水解酶的1ml水凝胶(实施例1F)每日使用三 次，平均5天之内可有效地治愈疱疹发作时的疼痛。以安慰剂治疗的患 者，发作平均持续12天。以水解酶治疗的患者，疼痛和发痒在36小时 之内消失，而这些症状在安慰剂对照组中3到4天达到高峰。

患有口部念珠菌感染的HIV患者的临床试验表明，含3mg实施例1C 中的磷虾来源的水解酶的糖锭(实施例1H)每日使用3次，可在7到9 天之内有效地清除感染。

抗常规抗真菌药的复发性阴道念珠菌病患者的临床试验表明，含有 100μg/ml或250μg/ml实施例1C中的磷虾来源的水解酶的1ml水凝胶(实 施例1F)每日使用3次，平均在4天之内可有效地清除念珠菌感染并能 降低复发率。

抗甲氧西林的局部金黄色葡萄球菌(“MRSA”)感染的特征在于： 组织坏死、红斑和基底组织肿胀、水肿、并且感染影响了大约100cm2表 面积，使用3ml含500μg/ml实施例1C中的磷虾来源的水解酶的水凝胶 (实施例1F)，每日三次，可有效地对感染进行治疗。使用后，感染处 以敷料覆盖。第2天第3次用药时，所有坏死组织都消失了，红斑有显 著改善，有渗出液自感染组织流出。第5天水肿消失。第7天伤口40％ 愈合，MRSA培养阴性。第9天伤口25％愈合。

磷虾，包括但不限于磷虾属(如华丽磷虾、晶顶磷虾、冷水磷虾、 三棘磷虾、瓦氏磷虾、lougirostris磷虾、发光磷虾、拟磷虾、多刺磷虾、 后弯磷虾等)、大夜明磷虾属(如挪威大夜明磷虾等)和小缨足磷虾属 (如大尾小缨足磷虾、近亲小缨足磷虾、簇状小缨足磷虾)的磷虾为优 选的多功能酶的来源。

本发明以下述非限定性实施例为例进行说明。尽管所有的实施例中 均使用来源于磷虾的多功能酶(即磷虾多功能水解酶)，但也可使用其 它多功能酶。 实施例1A：多酶制品

冰冻的磷虾解冻后制成匀浆，加入等体积含0.02％(w/v)叠氮化 钠的蒸馏水，所得混和物在4℃左右搅拌大约6小时。然后离心收集上 清液。加入乙酸乙酯并在4℃下搅动过夜使上清脱脂。含脂的乙酸乙酯 层随后弃去，水相抽提物充分蒸发，以除去乙酸乙酯。4℃左右加入硫 酸铵至抽提物中达到60％饱和度，混合物搅动过夜。盐析沉淀通过离心 分离。沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(“PBS”，0.05M磷酸钠，pH7.4， 0.05M NaCl)中并对PBS透析(使用阻截10kd分子量的透析膜)。

重新溶解的沉淀上样于交联琼脂糖凝胶过滤柱(Sephacryl 200， Pharmacia，Sweden)上，在280nm附近有吸收的组分进行蛋白水解酶 活性分析。收集有蛋白水解酶活性的混合组分并冻干。用这种方法从南 极磷虾中分离出含6个带左右的“多酶”制品，其表观分子量(SDS PAGE)介于24到34kd之间。保存时，该制品的冻干粉分装于安瓿中， 每一安瓿25个酪蛋白单位。 实施例1B：磷虾来源的多功能酶的制备

如实施例1A所述制备的多酶制品再上样于Sephacryl 200柱上。分 离出基本均一、表观分子量为29kd的组分。用下述的蛋白水解分析发现 该组分具有多功能酶活性。该磷虾来源的多功能酶制品盛放于安瓿中无 菌保存，每一安瓿15个酪蛋白单位，不添加防腐剂或抗微生物添加剂。 实施例1C：多功能酶的纯化

100kg冰冻的南极磷虾解冻后与100kg蒸馏水混合，并搅动30分 钟。所用磷虾于一月份到三月份之间捕获。在此期间，磷虾大部分不含 色素，称为“白”磷虾。(由于食物的改变，其后的月份捕获的磷虾为 “红”磷虾。红磷虾产生的多功能水解酶要较白磷虾少30％到40％。 再以后的月份(六月份到八月份)捕获的磷虾为“黑”磷虾，黑磷虾产 生的酶更少。)1000rpm离心收集上清，离心使用配备125微米旋转锥 体(spinning cone)的GL筛淀粉(starch)离心机(220型，购自G. Larssons Mekaniska Verkstad，Fjlkinge，瑞典)。上清pH调整至 6.2。上清的浊度低于4％，脂肪含量低于2％。

100ml上清以17,000g离心使其进一步澄清，随后与5kg DEAE -sepharose凝胶(Pharmacia，Sweden)混合，凝胶预先平衡至pH6.2。 混合物缓慢搅动1小时。凝胶收集于过滤床上，以5倍体积的0.4M NaCl清洗。凝胶随后以0.4M NaCl填充于合适的柱中。再以15倍床体积的 0.4M NaCl洗柱过夜。

以0.6M NaCl将含蛋白的组分(收集了大约1.5升)由凝胶中洗脱 下来。该组分含有多种蛋白质，以SDS-PAGE测定其分子量由10kd 到90kd以上。以280nm处光吸收测定其中蛋白含量为20g/l。蛋白质组 分通过0.20微米滤膜过滤除菌，随后上样于亲和柱上，该柱中含有偶联 于琼脂糖上的大豆胰蛋白酶抑制物(200ml凝胶，置换率3∶1，凝胶； 抑制物)。亲和凝胶以4倍床体积的1M NaCl清洗。多功能酶以0.2M 柠檬酸钠，pH3.0由凝胶中洗脱下来(在平行程序中，多功能酶的同等 制品的制备过程中使用0.5M Tris-HCl，pH8.0或0.1M铵盐溶液， pH11洗脱多功能水解酶)。产生的多功能酶为100mg。

多功能水解酶制品pH调整至7.4，上样至200ml琼脂糖亲和凝胶 上，该凝胶上偶联有原来的多功能酶制品(凝胶：酶置换率为6∶1)。

纯化的多功能水解酶制品以SDS-PAGE均一化。纯化的制品过滤 除菌，分装于注射小瓶中。注射小瓶冰冻干燥，冻干的粉末在4℃下稳 定保存。 实施例1D：蛋白质鉴定

磷虾来源的多功能水解酶以前述实施例1C中的方法纯化。制备了三 种磷虾来源的多功能水解酶。三种制品的区别仅在于磷虾多功能水解酶 分别以pH3、pH8.pH11的缓冲液由胰蛋白酶抑制物凝胶中洗脱下 来。这些制品被称为“制品-3”、“制品-8”和“制品-11”。这 些制品溶解于水中至浓度为6mg/ml。

各种制品的样品以SDS-PAGE分析，各种制品均发现含有表观分 子量为29kd的单一蛋白带。SDS电印迹转移至PVDF膜上，通过25个 循环的Edman降解测序。参见Matsudaira，《生物与化学杂志》(J.Biol. Chem)262卷10035-10038页，(1987)。各种制品产生相同的序 列：I V G G M/N E V T P H A Y P W Q V G L F P I D D M Y F。因而， 虽然每一种在位置5都表现出小的不均一性，但很明显这三种制品都是 均一的。三种制品的蛋白水解活性均以苯甲酰基-缬氨酸-甘氨酸-精 氨酸-对亚硝基酰基苯胺为底物进行测定。该底物的水解可以在210nm 处进行监测，这反映了对亚硝基酰基苯胺的释放。三种制品在离子强度 为0.1M时的pH依赖性示于图9。制品-3(以实心方块表示)、制品 -8(以空心菱形表示)和制品11(以实心菱形表示)的曲线相同。三 种制品对该底物的最适pH均为9.5。

对弹性蛋白酶底物丁二酰-p-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-对亚硝 基酰基苯胺和boc-丙氨酸-丙氨酸脯氨酸-丙氨酸-对亚硝基酰基 苯胺来说，制品-8的最适pH为7.0。见图9中以×表示的曲线。类似 的典型底物的研究表明磷虾多功能水解酶的水解效率依次为胰凝乳蛋白 酶≥胰蛋白酶≥弹性蛋白酶。

以偶氮酪蛋白为底物时，pH依赖性的曲线较宽并且分布于酸性pH 区域。见图9中以空心三角形表示的曲线。

Km值使用0.1M苯甲酰基-pal-甘氨酸-精氨酸-对亚硝基酰基苯 胺在含2mM Ca++pH为9.5的CAPS缓冲液中测定。制品-3、制品 -8和制品-11的Km值分别为210±8、210±8和230±13μM。相同 条件下使用丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对亚硝基酰 基苯胺为底物，Km值分别为260±50、270±50和270±40μM。

三种蛋白酶抑制物对三种水解酶制品的效果在pH9.5时进行测定， 结果如下： 蛋白酶抑制物  制品-3  制品-8  制品-11     (剩余活性，％) 抗蛋白酶(1μM)     2     5     5 胰凝乳蛋白酶抑制物(1μM)     0     0     0 牛胰腺胰蛋白酶抑制物(1μM)     2     1     1

其它蛋白酶抑制物对制品-8的效果在pH为7.5的0.1M  Tris-HCl缓冲液中测定。苯甲酰基-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-对亚硝基酰 基苯胺(“ARG-p-NA”)和丁二酰-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸 -对亚硝基酰基苯胺(Phe-pNA)被用作底物。结果如下：     底物： 抑制物：   Phe-pNA   Arg-pNA     (剩余活性，％) 膦酰二肽(10μM)     94     87 弹性蛋白酶抑制物(10μM)    100    100 水蛭蛋白酶抑制物C片段(8.4μM)    100    未测 抗凝血酶III(0.2μM)     2     4 α-抗胰凝乳蛋白酶(0.2μM)     1     7  α-蛋白酶抑制物(0.2μM)     0     0

标定浓度为6mg/ml的制品-8溶液小份对牛胰腺胰蛋白酶抑制物、 α1-抗胰凝乳蛋白酶、α-蛋白酶抑制物和大豆胰蛋白酶抑制物进行滴 定。结果示于图10。曲线1为pH9.5时以苯甲酰基-缬氨酸-甘氨酸- 精氨酸-对亚硝基酰基苯胺为底物对牛胰腺胰蛋白酶抑制物滴定的结 果。曲线2中，pH为7.0)，所用底物为丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨 酸-苯丙氨酸-对亚硝基酰基苯胺。以α-抗胰凝乳蛋白酶、α-蛋白酶 抑制物和大豆胰蛋白酶抑制物也获得了类似的曲线。这些曲线可用来估 计抑制物的Ki值和多功能水解酶的有效浓度。 实施例1E：水凝胶的制备

多功能酶与水凝胶以本领域的已知方法混和，以获得该酶的水凝胶 制剂，前述水凝胶由低分子量水解淀粉组成，其中含90％水。 实施例1F：水凝胺的制备

根据实施例1B的多功能水解酶临用前与水蚀体凝胶混合，该水蚀体 凝胶包括含0.8％(w/v)CarbopolTM(Dow Cornmg，Midland， Michigan)和23.5％(w/v)甘油的含水凝胶。(CarbopolTM为具有活 化羧基的乙烯聚合物，参见《化学工程通讯》(Chem.Eng.News)36 卷64页(1958)。) 实施例1G：水凝胶的制备

根据实施例1C的多功能酶临用前与水蚀体凝胶混和，该水蚀体凝胶 包括含0.8％(w/v)CarbopolTM(Dow Corning，Michigan)、23.5％ (w/v)甘油和10％(w/v)Pluronic P85(BASF，Wyandotte， Michigan)的含水凝胶。(CarbopolTM为具有活化羧基的乙烯聚合物。 见《化学工程通讯》(Chem.Eng.News)36卷64页(1958)。) 实施例1H：糖锭的制备

含3或6mg根据实施例1C的多功能酶的糖锭由50％乳糖、20％ Avicel(微晶纤维素)、29％蔗糖和1％硬脂酸镁组成。 实施例2：蛋白酶活性

多功能酶就分子量、序列、温度或pH稳定性、最适温度或pH和蛋 白水解特异性与分离自磷虾的多功能蛋白酶进行比较。 实施例2A：特异性

为研究蛋白水解特异性，使用了下列底物：

         底物                       活性类型 丁二酰-Ala-Ala-Pro-Phe-pNO2酰基苯胺    胰凝乳蛋白酶 Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNO2酰基苯胺       弹性蛋白酶 苯甲酰基-Val-Gly-Arg-pNO2酰基苯胺      胰蛋白酶 这些底物被用来测量根据实施例1D的多功能酶的蛋白水解活性。参见 《生物化学杂志》(Biochemical J.)185卷423-33页，1980；《生 物与化学杂志》(J.Biol.Chem)269卷19565-19572页，1994。这 些研究包括对Km和Kcal的测定。 实施例2B：外肽酶活性

如实施例1B所述纯化的磷虾多功能水解酶(1mg)溶解于5ml含 1％(w/v)牛酪蛋白的缓冲液中，20℃温育24小时。缓冲液为pH7.5 的0.1M磷酸钠。24小时后，加入10％的三氯乙酸沉淀溶液中存在的蛋 白质。收集上清并与茚三酮反应。所用茚三酮为溶于3∶1的DMSO：4M 乙酸锂的2％的溶液，pH5.2，按照供应商Sigma Chemical，Co(St. Louis)的说明使用。反应后的上清上样于交联丙烯酰胺柱(Biorad P -2，Bio-Rad，Hercules，CA)上，将已反应的氨基酸由已反应 的肽中分离出来。氨基酸组分中的氨基酸浓度根据820nm吸收值确定。 1％的未消化的酪蛋白溶液以同样方式处理作为对照。对照的吸收值小于 0.01，而消化的氨基酸组分的吸收值为0.28(稀释度相同)。 实施例2C：最适pH

多功能酶对不同底物的蛋白水解活性在pH为4到10的不同溶液中 进行测定，以确定对某一给定底物的最适pH，所用的缓冲条件在本领域 中是众所周知的。这些最适值可以与磷虾多功能水解酶的相应最适值进 行比较。 实施例2D：蛋白酶抑制物

不同蛋白酶抑制物的效果被用来确定不同的候选多功能酶的相关 性。这些抑制物为α1-蛋白酶抑制物、α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶 III、α2-巨珠蛋白、牛胰蛋白质抑制物和大豆蛋白质抑制物。进行这些 测定的条件如实施例1D中所述。这些抑制物可购自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。Ki值在不同pH的溶液中进行测定，所用的蛋 白酶底物如下：TAME、苯甲酰基-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-对亚硝 基酰基苯胺、丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对亚硝基 酰基苯胺、Boc-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-对亚硝基酰基苯 胺和偶氮酪蛋白。 实施例3A：HL60细胞在体外对内皮细胞的结合

内皮细胞首先以给定浓度在96孔板上传代。实验中所用的内皮细胞 参见Edgell等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A) (1983)80卷3734页。细胞在37℃温育。使用含10％胎牛血清的 DMEM细胞培养基，空气中含5％的CO2。随后弃去培养基，代之以100μl 悬浮于含10％胎牛血清的RPMI培养基中的200,000个HL 60细胞(一 种人淋巴细胞系，来自欧洲细胞培养库，ECACC登记号85011431)的 悬液。细胞温育30分钟。随后，弃去培养基，粘附的细胞以DMEM培 养基洗两次。HL60细胞的相对粘附通过测定两种板450nm处的光密度 差别来确定，一种板上有两种细胞共同温育，而另一种板上只有内皮细 胞。

在与HL60细胞一起温育之前4小时，向内皮细胞中加入TNFα至 1500单位/ml，以测定TNFα的效果。抗E-选择素抗体的效果通过加 入25μg/ml单克隆抗体BBAZ(R&D Systems Europe，Oxford， England)至HL60细胞中进行测定。实验结果如下：   试验序号     HL60细胞     内皮细胞   吸收值*     1     未处理     未处理     0.324     2     未处理   以TNFα预处理     0.444     3 在抗E-选择素的单克   隆抗体存在时加入   以TNFα预处理     0.357 *吸收值较只有内皮细胞时的增加值

该系统中磷虾多功能水解酶的效果按以下方法测量：

(1)测定向内皮细胞中加入92.3μg/ml磷虾多功能水解酶(按实施 例1C制备)和HL60细胞的效果；

(2)以TNFα将内皮细胞预处理2小时后，加入92.3μg/ml磷虾多 功能水解酶，在加入HL60细胞之前再温育2小时；或

(3)将HL60细胞加入内皮细胞培养板之前，以92.3μ/ml磷虾多 功能水解酶预处理HL60细胞。

这些实验的结果如下： 试验序号     HL60细胞     内皮细胞 吸收值*     4 多功能酶与细胞同时加入 以TNFα预处理     0.425     5 未处理 预处理4小时： 0-4h TNFα 2-4h 多功能酶     0.247     6 以多功能酶预处理2小时 以TNFα预处理     0.160     7 以多功能酶预处理2小时 预处理4小时： 0-4h TNFα 2-4h 多功能酶     0.059 *吸收值较只有内皮细胞时的增加值。

为证实这些结果，粘附HL60细胞的数目通过将它们由培养板上移 去并进行细胞计数来确定。HL60细胞的数目要减去只有内皮细胞的对 照板上的细胞数目。这些计数结果反映了光密度的结果，见下表：     试验     HL60细胞数目     1     32,590     2     43,990     3     35,730     4     42,190     5     25,280     6     17,010

这些粘附研究表明磷虾水解酶破坏了促进细胞粘附的细胞表面配体 和受体分子。 实施例3B：对一些细胞表面粘附分子的活性

由C57BL/6小鼠(由lnstitut Armaud Frappier繁育)胸腺新分离 的T细胞以无血清培养基洗三次。含5-10×106个细胞的1ml细胞小 份以根据实施例1B制备的磷虾来源的多功能水解酶在37℃处理4小 时，水解酶溶于无血清的培养基，处理浓度分别为0、100或500μg/ml。 所得细胞以下面列出的一种荧光抗体进行标记：   抗体  来源   CD4-PE  Boehringer Mannheim，LaVal，  Quebec   CD8-Red613  GIBCO，Long Island，New York   ICAM-1  PharMingen，San Diego，CA   ICAM-2  PharMingen，San Diego，CA   CD44  PharMingen，San Diego，CA   H-2K  PharMingen，San Diego，CA

结合的抗体量使用流式细胞仪确定。根据这些结果，可以确定水解 酶去除或灭活敏感性的顺序为CD4、CD8＜ICAM-2＜CD44＜ICAM -1＜H-2K。使用同样的方法和合适的细胞，证实VCAM-1、 CD28、CD31和无唾液酸GM1神经酰胺对水解酶敏感，上述合适的细 胞包括内皮细胞(如s-end-1内皮细胞系，Kinashi等，J.Beukocyte Biol.57卷168页，1995)和由C57BL/6小鼠胸腺中分离的T细胞。用 来进行这些测定的抗体为：   抗体特异性   来源  VCAM-1  PharMingen，San Diego，CA  CD28  PharMingen，San Diego，CA  CD31  PharMingen，San Diego，CA 无唾液酸GM1  Wako Bioproducts，Richmond，VA 在某些情况下，结合以标记的第二抗体测定，如无唾液酸GM1抗体的结 合以FITC标记的Fab片段测定，该片段对兔IgG(重链和轻链)有特异 性，IgG来自Caltag Laboratories，San Francisco，CA。 实施例3C：粘附分子在细胞表面恢复的时间进程

DO-11.10杂合T细胞(该细胞系见Shimonkevitz等《实验医学杂 志》(J.Experimental Med.)158卷303页，1983)以500μg/ml根据 实施例1B制备的磷虾来源的多功能水解酶进行处理，并按实施例3B所 述检测CD4分子。刚处理之后，水解酶处理细胞上发现的CD4量远远少 于对照上CD4量的1％。48小时后，处理细胞的CD4水平与未处理细 胞的CD4水平相同。 实施例4：细胞结合比较

多功能酶家族不同成员的效果使用实施例3A的HL60结合试验与来 源于磷虾的酶进行了比较，多功能家族即与磷虾来源的水解酶的同源性 至少在60％左右的非磷虾多功能酶。 实施例5：小鼠卵巢肿瘤的治疗

25000个小鼠卵巢肿瘤细胞注入12只C3H/hsd小鼠的腹腔。在第1、 2、5、6、7、8、9天，1ml盐水或200μg溶于盐水的磷虾多功能 水解酶(按实施例1C所述制备)注入腹水中。图4示出了盐水处理(实 心圆)和多功能酶处理(空心圆)小鼠的体重增加情况(肿瘤生长的指 标)。图5示出了盐水(曲线A)和水解酶(曲线B)处理的小鼠的时 间-存活百分率。在对照小鼠中有实体肿瘤形成，但酶处理的小鼠中没 有。

肿瘤细胞可由受治疗小鼠的腹水中回收。25000个这样回收的肿瘤 细胞分别注入6只C3H/hsd小鼠。在对照实验中，同样数目未经治疗小 鼠的卵巢肿瘤细胞被注入C3H/hsd小鼠中。在对照小鼠中形成了肿瘤， 但在注射回收细胞的小鼠体内没有形成肿瘤。 实施例6A：毒理学

给不同组别的雄性和雌性(Crl：CD(SD)BR品系，Charles Rivet Ltd，Margate，UK；每组5只)大鼠静脉注射根据实施例1C制备的磷 虾来源的多功能水解酶，每日用量分别为0、0.5、5和50mg/kg，使用 7天。7天之后，这些剂量导致血红蛋白(“Hb”)、红细胞计数 (“RBC”)和血细胞压积(“PCV”)略有下降，结果见下表： 组别 剂量 性别     HB    RBC   PCV   MCV*   MCH*   MCHC*   1    0   M   14.8    6.79   44.3   65.4   21.8   33.4   F   14.7    6.76   43.7   64.6   21.7   33.6   2   0.5   M   14.0    6.35   41.8   65.9   22.2   33.6   F   13.8    6.12   40.5   66.3   22.5   33.9   3    5   M   13.8    6.25   41.1   65.8   22.1   33.6   F   13.4    5.94   39.9   67.2   22.6   33.6   4    50   M   13.1    6.19   39.1   63.3   21.3   33.6   F   13.0    6.01   38.8   64.6   21.7   33.6

* MCV＝平均细胞体积

   MCH＝平均细胞血红蛋白

   MCHC＝平均细胞血红蛋白浓度 上述处理的动物未表现出任何可见的疾病症状或副反应。 实施例7：对小鼠的毒性

关于酶制品的毒性，对皮下接种了P388鼠白血病(化学诱发的癌 症)细胞的小鼠进行了检测，并与一种有名的抗癌药物阿霉素(缩写 DOX)进行了比较。结果在下表中进行了总结。以实施例1A中的多酶 制品处理的小鼠或对照组的小鼠没有死亡和体重减轻的现象，而阿霉素 组的所有小鼠除接受最低剂量的之外均有体重减轻和死亡的现象。多酶 制品的最高剂量(20mg/kg)大大高于下述临床实施例中所用的剂量。

多酶制品和DOX对有P388鼠白血病的小鼠的毒性，

多酶制品和DOX腹膜内使用，连续9天每天使用 药物    剂量    中毒性   体重变化

   (mg/kg)   死亡      (g) 对照      0       0/6      +2.3 磷虾多酶  20      0/6      +3.3 制品      10      0/6      +3.3

      5       0/6      +3.3 DOX       5       6/6      -2.3

      2.5     6/6      -0.6

      1.25    0/6      +0.5 实施例8A：术后外科创伤的感染

本研究包括四十名患者，分成两组，每组20名患者，代表着41例 术后腹部(34)和胸部(7)创伤。根据实施例1B制备的磷虾多功能 水解酶制品(3个酪蛋白单位/ml)和实施例1A的磷虾多酶制品(5个 酪蛋白单位/ml)在各组中进行试用。酶溶液以实施例1A和1B所述的 安瓿保存的冻干制品制得，冻干制品在使用前重新溶解于盐水中。

患者平均年龄为52±16岁，包括28名男性和12名女性。向伤口上 每日2次使用酶制品，每次25mg。5天之内，所有感染均转为亚临床水 平，临床感染的所有明显指征均消失了。两种制品之间未见明显的差别。 没有明显的副反应。 实施例8B：感染的伤口

一名3个月的男童曾因为阴囊疝(hydro cele och scrotal hernia)进 行手术，术后10天在切口部位有严重的感染。由感染的切口渗出脓液。 拆线后部分切口有裂口的危险。该男童用浸有实施例1A的多酶制品的敷 料进行治疗，每日两次，连用3天(每次治疗4mg)。治疗后3天，感 染消失，伤口也愈合了。 实施例8C：坏死的术后创伤

15名有坏死创伤的患者以3个酪蛋白单位/ml的根据实施例1B的磷 虾多功能水解酶溶液进行治疗。伤口在使用水解酶之前冲洗干净。1个 安瓿的实施例1B所述的多功能酶的干粉以5ml盐水稀释，每日两次浇注 包扎伤口的纱布敷料并将其完全覆盖伤口。引流的纱布通过自粘性半闭 合纱布固定于伤口。每次更换敷料，均察看伤口处的红斑、水肿、流血、 肿胀、发热、渗液、脓液、坏死组织、疼痛、气味、可能的副反应和患 者的总体状况。当所有的坏死、纤维蛋白、脓液和血块均被降解后终止 治疗，但治疗不得超过7天。

患者创伤的情况有几种，即安排的手术、外伤、烧伤、枪伤和糖尿 病。所有患者作为门诊病人每日治疗两次。试用的制品未见有副反应。 结果总结于图12中。“Y”符号表示的点代表黄色纤维蛋白和化脓性组 织的结果。“B”符号表示的点代表黑色坏死组织。“R”符号表示的 点代表肉芽组织和上皮。在一周之内，坏死、纤维蛋白、脓液、血块和 斑痕都被有效地分解，某些创伤愈合了。烧伤、枪伤和糖尿病患者术后 创伤一开始效果很不明显，但研究结束时(即第7天)基底部的坏死完 全消失了，只有上表面有坏死，象盖子一样，在一个星期之内，伤口也 部分愈合了。 实施例9：小牛脓肿

通过注射氯化钙溶液在两只小牛的颈部形成了体积为大约25到 40ml的脓肿。脓肿通过每日1次使用引流管滴注10ml实施例1A的多 酶制品(5mg/ml)进行治疗。治疗时，引流管密封使酶溶液在局部至 少保持4小时。然后打开管口，对脓肿引流。第三次治疗后引流液变澄 清了，第六次治疗后，除去引流管。“囊”分别在9和12天后愈合。 实施例10：硬皮病

患者右手指尖皮肤慢慢变厚、变硬，即患有硬皮病。该患者每日两 次使用0.5ml含0.5mlg/ml根据实施例1B的磷虾多功能水解酶的水凝 胶(如实施例1F所述)进行治疗。该病伴随的疼痛在48小时内明显减 轻，三个星期后所有裂口均已愈合。三个星期后治疗停止。随访的六个 星期没有复发。 实施例11：外科手术后创伤的预防性治疗

根据实施例1B的磷虾多功能水解酶(1)和实施例1A的磷虾多酶 制品(2)在手术后创伤中作为预防性抗微生物冲洗液进行了试用，以 无菌的0.9％NaCl(3)作为对照。每一治疗组中包括20名患者。

无出血的术后伤口每日两次以盐水、多功能水解酶(3个酪蛋白单 位/ml)或多酶制品(5个酪蛋白单位/ml)进行治疗。伤口以相应溶 液充分地冲洗并以无菌纱布覆盖。其上有半闭合的敷料。每次更换敷料 时，检查伤口的感染、炎症、红斑、肿胀、发热、坏死组织、纤维蛋白、 脓液、流血、疼痛和可能的副反应。

以多功能水解酶或多酶制品治疗的组别没有发生术后临床感染，这 两组患者中也未见有急性炎症或红斑。以任一酶组合物治疗的两组中， 治疗10天内有18例伤口愈合(＞90％上皮形成)。未见有副反应。在 对照组中，4例发展为严重的侵袭性感染，另有2例发生了急性炎症。 红斑、肿胀和疼痛在该组中很常见。对照组中，14例在治疗10天内伤 口愈合。 实施例12：小面积烧伤

本研究包括11名小面积、深度烧伤的患者，他们被金黄色葡萄球菌 和铜绿假单胞菌所感染，对抗生素和磺胺嘧啶银乳膏不敏感。5名患者 以实施例1F所述的磷虾多功能水解酶水蚀体乳膏(3个酪蛋白单位 /ml)进行治疗，6名患者以溶于等渗盐溶液的实施例1A的磷虾多酶制 品(5个酪蛋白单位/ml)进行治疗。

伤口以每次25mg多功能水解酶的用量每日处理两次。治疗后5天 内，所有伤口均无感染迹象。微生物(MO)培养也证实未发生感染。 两种制品均能有效地分解肉芽组织中的坏死组织、脓液和纤维蛋白丝， 两种制品间没有明显可见的差别。也未见到副反应。试用结果如下： 创伤编 号/ 面积(cm2)      菌株 治疗前 微生物量   (103)                    可见百分比 坏死       化脓       纤维蛋 肉芽上皮    制品                       白纤丝   终止   时间 治疗后 微生物 量(103)          可见百分比 坏死化脓 纤维蛋     肉芽       上皮          白纤丝 治疗后 愈合时 间(天)     I     1.5   Pacrig     16     20    60     20   溶液    3.5     ＜1     30     70     3     II     4.0   Pacrig     18     50    10     40   凝胶    5.0     ＜1     10     60     30     11     III     36   Saurcus     22     10    90   凝胶    3.0     ＜1     10     40     50     6     IV     2.4   Pacrig     14     40    10     50   凝胶    3.0     ＜1     50     50     V     2.8   Saurcus     17   100   溶液    4.0     ＜1     30     70     7     VI     1.9   Saurcus     16   100   溶液    2.5     ＜1     20     80     4     VII     45   Saurcus     15     10   80     10   凝胶    5.0     ＜1     10     60     30     15     VIII     3.2   Pacrig     12     40   40     20   容液    3.0     ＜1     60     40     6     IX     1.8   Saurcus     16     10   90   溶液    2.5     ＜1     20     80     X     1.3   Pairig     17     30   30     40   凝胶    3.5     ＜1     40     60     8     XI     3.1   Pacrig     20     30   30     40   溶液    5.0     ＜1     10     80     10     18 实施例13：感染性褥疮溃疡

本研究包括14名老年患者，他们在足跟或腰背共长有18处褥疮溃 疡。溃疡以盐水充分冲洗后尽量排干，再以5ml溶于盐水中的实施例1A 的多酶制品(5个酪蛋白单位/ml)冲洗。随后溃疡以半闭合性敷料覆 盖。上述过程每天重复两次，连续7天，检查溃疡处炎症、红斑、发热、 肿胀、坏死组织、化脓、疼痛和可能的副反应。治疗4天内感染消失了。 7天内6处伤口完全愈合，14天内共有11处伤口愈合。7处伤口未愈合 可能由于患者的整体状况，但伤口表现出了某些好转。未见有副反应。 实施例14：瘘管感染

根据实施例1B的磷虾多功能水解酶和实施例1A的多酶制品被用来 治疗肛门瘘管。临用前，1安瓿多功能水解酶制成5ml水凝胶，使其终 浓度为3个酪蛋白单位/ml。多酶制品制成水凝胶，终浓度为5个酪蛋 白单位/ml。瘘管以无菌溶液冲洗并尽量排空，随后以含多功能水解酶 或多酶制品的水凝胶冲洗。该过程每天重复一次，检查患者有无红斑、 发热、肿胀、化脓、疼痛和副反应。治疗持续至所有感染迹象和炎症消 失，但不超过10天。两名有肛门瘘管但没有肛门直肠瘘的患者分别使用 多功能水解酶和多酶的凝胶制品进行了治疗。两组患者中，48小时内全 部有疼痛缓解的报告，4天后所有感染和炎症的体征均消失。所有瘘管 在6到9天愈合，随访六个月未见复发。也未见有副反应。 实施例15：足癣(表皮霉菌病)

该实施例目的在于研究磷虾多酶制品治疗足部表皮霉菌病的效果。 本研究包括有真菌感染的41名患者。患者足部浸泡于含5个酪蛋白单位 /ml实施例1A的多酶制品的水溶液30分钟，每日一次，连续治疗3天。 再者每晚临睡前，含5个酪蛋白单位/ml磷虾多酶制品的水凝胶使用于 感染区域，连用7次。多名患者使用后马上就有疼痛减轻的效果，2天 内其余患者的疼痛也完全消失了。在暴露的表面、裂缝和指甲下的癣斑 很容易被多酶制品除去，癣斑、气味和感染的所有体征在3天后均消失。 实施例16A：包皮感染

对两名分别为4周和6周的婴儿的包皮感染每日两次使用含1个酪 蛋白单位/ml实施例1A的多酶制品溶液进行治疗。每日早晚用10ml溶 液对包皮下进行冲洗，冲洗使用带有软管的标准注射器。3天后两名婴 儿的症状都消失了，随访两个月感染未再复发。 实施例16B：狗的包皮感染

每日一次使用含1个酪蛋白单位/ml实施例1A的多酶制品的溶液对 6只有包皮感染的狗的包皮下进行冲洗。注射器上连接的软硅导管插入包 皮下，用10ml多酶溶液慢慢冲洗感染区域。大约1ml溶液保留在皮下最 少2分钟，让狗30分钟之内不舔感染区域。各例的脓性渗出在2天内均 停止，4天之内所有感染的炎症体征均消失。 实施例17A：机会性感染

两名第IV期子宫癌患者的未愈合术后伤口发生了机会性感染，一名 患者的辐射创伤也发生了机会性感染。每日两次用含5mg/ml实施例1A 的多酶制品的溶液饱和的敷料对上述患者的伤口进行治疗。感染被认为 是细菌性感染，分别在12、14和17天后伤口愈合。 实施例17B：支原体感染

一名55岁男性3年前染上急性支原性感染，以不同抗生素进行过治 疗。但是这些治疗在抗药性形成之后不再有效。感染后数周，患者发生 高热并伴有严重的咳嗽，X-射线检查发其胸腔有积水。患者自诉呼吸 困难、行走不过100米即要休息、严重疲劳及难受的干咳。

患者以2ml 2m/ml(共4mg)根据实施例1B的磷虾多功能水解 酶溶液进行治疗。漱洗液在嘴里含大约4分钟，然后慢慢吞下。最初两 周每两天重复治疗一次。在此期间，每日吸入0.5ml漱洗液的气雾剂。 最初两周未见有疗效，治疗两周后，颈部左侧淋巴腺肿大、疼痛。此时 再治疗3次(每两天一次)。1.5周后与淋巴节有关的问题都消失了， 支气管炎也减轻了。再以漱洗液治疗3周，每4天1次，支气管炎完全 消失了。持续6.5周的治疗后患者完全恢复了，很短时间之后就可步行5 公里而没有任何问题。 实施例18：狗的疖子

3只柏塞狗在脚趾间长有十分疼痛的、感染性和渗出性/出血性疖 子，每日两次用多酶溶液治疗。一块纱布以2ml实施例1A的多酶制品溶 液(5个酪蛋白单位/ml)浸泡后使用于疖子处。将脚爪包扎起来使纱 布固定，用橡胶护套保护敷料。治疗后1天可见疼痛明显减轻。渗液和 流血在2天内停止。治疗后5-7天，炎症明显减轻，11-15天后疖 子的所有体征都消失了。 实施例19：膀胱和尿道感染

本研究包括12名患有十分疼痛的泌尿系统感染的患者。临用前，6 个安瓿实施例1A所述的磷虾多酶制品以50ml盐水重新溶解，使终浓度 为3个酪蛋白单位/ml。刚开始治疗时，所有患者第一次排出的尿液都 非常浑浊，第二次排出的尿液澄清或略浑浊。以50ml盐溶液每日滴注2 次对患者进行治疗。疼痛立即减轻，治疗两天后储尿能力明显提高。治 疗4天后微生物(MO)样品证实没有细菌，4天后停止所有的治疗。 未见有副反应。结果总结于图6中。平均MO量示如下表中。     治疗前     第2天   第4天 MO量：  (平均)     1.4×104     4.3×103 ＜1.0×102 相对MO量：占起始量的百分比     100％     31％     1％ 实施例20：眼部感染

15名患有化脓性眼部感染的患者每日两次用磷虾多酶制品滴眼。使 用前1个安瓿实施例1A所述的多酶制品溶解于25ml水中，使其终浓度 为1个酪蛋白单位/ml。患眼早晚各用两滴(0.4ml)溶液滴眼。每次使 用时，检查病眼红斑、肿胀、脓液、眼泪分泌和可能的副反应。对患者 的治疗持续至各种体征消失为止，但不应超过10天。所有患者在3天内 感染均消失了。眼周围的红斑和肿胀在2天内消退，过多的眼泪分泌在2 天内停止。首次治疗后，所有患者均感到疾病减轻，眼周围的刺激感和 触痛几分钟就消失了。未见有副反应。 实施例21：牙龈感染

本研究包括22名患有急性或慢性牙龈感染/炎症的患者。每日3次 (早、中、晚)，将1个安瓿实施例1A所述的多酶制品重新溶解在5ml 自来水中(使浓度为5个酪蛋白单位/ml)，用该溶液冲洗患者的口腔5 分钟。治疗后2小时之内不能饮水和进食。无论结果如何，治疗持续7 天。治疗20分钟后到12小时患者报告疼痛减轻。感染和炎症在4天内 消失，随访3周内没有复发。没有发生副反应的报道。 实施例22A：上呼吸道病毒感染

本研究包括11名有上呼吸道流感病毒和继发性细菌感染(如鼻窦 炎)的患者。肺部病毒感染对肺部纤毛造成损害并引起炎症反应，后者 又可导致红斑、肿胀并增加粘液分泌。受损的纤毛不再排出吸入的细菌， 这常常引起继发性细菌感染。病毒的生存和增殖依赖于宿主细胞，很难 杀死病毒而不损伤或杀死宿主细胞。治疗前，1个安瓿实施例1B所述的 磷虾多功能水解酶重新溶解于5ml盐水中，使终浓度为5个酪蛋白单位 /ml。两侧鼻腔各以0.25ml该溶液喷雾，口腔用4.5ml溶液冲洗5分钟。 该治疗每日重复3次，每日1次记录红斑、肿胀、粘液分泌、疼痛和副 反应的情况。

治疗持续至所有感染体症消失，但不应超过10天。8名患者在治疗 6天后症状消失，剩下的3名患者在治疗9天后症状消失。所有患者在治 疗2小时后到2天内均感到疼痛减轻。患者的脓痰在3天内变清亮。红 斑和肿胀在4天内消失。结果总结于表7中。未见有副反应。 实施例22B：普通感冒

本研究包括5名30到63岁的患者。当他们出现最初的感冒症状后 数小时，即以根据实施例1B的磷虾多功能水解酶治疗。治疗时，每4小 时用0.5mg/ml的水解酶水溶液对鼻腔喷雾(两侧鼻腔各吸入0.1mg)， 每6小时用0.5mg/ml的漱洗液漱口(每次1.5mg)，漱洗液在口腔内保 持2到4分钟，再吞下。12小时后感冒症状消失了，患者再无患病感。 实施例23：流感嗜血杆菌感染

一名34岁的妇女患有流感嗜血杆菌感染引起的鼻窦炎。在患者鼻窦 出现压迫感和疼痛症状数小时后，用4.5ml 5mg/ml的根据实施例1B的 磷虾多功能水解酶溶液漱洗口腔3分钟，用0.5ml水解酶溶液对两侧鼻 腔喷雾。每2小时重复上述治疗过程，共3次。随后3天内，每3小时 进行一次喷雾治疗。首次治疗后数小时，鼻窦感染引起的压迫感消失了， 鼻腔分泌物大大增加了。治疗后3天，该妇女患病感消失了。 实施例24：支气管炎

本实施例中对一名患有严重的支气管炎的55岁男性进行了治疗。该 男性自诉呼吸困难、难以步行超过100米距离、浑身无力、慢性干咳。 其医师认为他的支气管炎由支原体引起，早于3年前，该男性首次感染 支原体，随后支原体对抗生素产生了抗性。感染引起胸腔积水，这被X -射线检查所证实。对患者的治疗是以含4mg/ml根据实施例1B的磷虾 多功能水解酶的盐水漱口。水解酶溶液在口腔内保持4分钟，然后慢慢 吞下。最初两周，每两天治疗一次，在此期间，吸入少量(0.5m1)水 解酶溶液的气雾剂。

在最初两周内，未见有效果。治疗两周后，患者颈部左侧淋巴腺肿 大、疼痛。随后再治疗3次。此后大约1.5周，淋巴腺肿大消失了，患 者的支气管炎症状开始减轻。治疗再持续3周，每4天漱一次口，支气 管炎症状消失了。在持续6.5周的治疗后，患者完全恢复了，随后很短 时间他就可以毫无问题地步行相当长的距离。 实施例25A：胃溃疡

本实施包括一名患有再发性轻度胃溃疡的40岁男性。对该男性用含 实施例1A的磷虾多酶制品的抗酸性明胶胶囊(5mg/胶囊)进行治疗。胶 囊化制品中未添加任何填充料。患者每天用一杯水吞服一粒胶囊，持续 两周。大约4天后，胃部不适消失了，患者的肠道功能正常了。

一名55岁的男性患再发性胃溃疡超过20年，按上述方法对其进行 治疗。治疗后数天，不适感消失，肠道功能恢复正常。 实施例25B：溃疡性结肠炎

患者溃疡性结肠炎的病史有15年，曾以消炎药水杨酸偶氮磺胺吡啶 (Salazopyrine，Pharmacia，Sweden)治疗过。患者每日1次吞服1 粒抗酸性胶囊，胶囊中含lmg根据实施例1B的冻干多功能水解酶，这样 持续6周。同时患者还以水杨酸偶氮磺胺吡啶进行治疗。首次以多功能 水解酶治疗后2小时，患者出现胃痛、排气和腹泻，这些症状持续大约6 小时。第二次治疗后，患者感到轻微疼痛，持续30分钟。随后，患者再 未有副反应。在第16和29天，患者出现胃痛、腹泻，这与异常食物有 关。但是与以前的发作比起来，这些发作为时既短、程度也轻。治疗过 程中，患者感到较以前舒服。治疗后3到4个月，患者的症状慢慢恢复 到治疗前的严重程度。 实施例26：生殖器疱疹

本实施例中对一名长期生殖器疱疹的62岁男性患者进行了治疗。该 病每4个月复发一次，在急性发作期间，该男性被禁止性交。急性发作 期间，感染区域以浸有根据实施例1B的磷虾多功能水解酶溶液的绷带包 扎，绷带中含3mg水解酶。每日两次用绷带进行治疗。持续两天。第二 次治疗后，患者的不适感消失了。治疗后10个月，该男性未再见复发。 实施例27：口腔单纯疱疹感染

8名有口腔复发性单纯疱疹水疱的患者每日两次漱口治疗。临用前， 1个安瓿的磷虾多酶制品(实施例1A所述)重新溶解在5ml盐水中，其 终浓度为5个酪蛋白单位/ml。患者用该溶液漱口5分钟。每次治疗后两 小时内不能进食、饮水。每日两次进行治疗，每天记录临床参数、红斑、 肿胀、疼痛和副反应。治疗持续至所有感染体征消失，但不应超过10天。

首次治疗后2小时患者感到疼痛减轻。某些患者中，最初两天在两 次治疗中间疼痛复发，但此后就再不复发。5天后，患者的所有症状均 消失了，所有水疱都愈合了。未见有副反应。 实施例28：带状疱疹

一名70岁的男性的面部有十分疼痛的带状疱疹，症状持续了10个 月。三天一次用浸有实施例1A的磷虾多酶制品溶液的纱布绷带(含1 2mg)进行局部治疗。首次治疗后发痒和疼痛减轻了。12天后疼痛完全 消失了。由于感染引起的疼痛，该男性咀嚼困难，但12天后，他就可以 毫无问题地咀嚼食物了。 实施例29：痤疮

本实施例对两名分别为29和30岁的妇女的面部痤疮进行了治疗。 29岁的妇女有严重的痤疮，而30岁的妇女有中等程度的痤疮。患者每日 数次用0.1mg根据实施例1B的磷虾多功能水解酶进行治疗，持续4～6 天，治疗时选用含5mg/ml的磷虾多功能水解的水凝胶(实施例1F所述)， 用量为0.5g/cm2到2g/cm2。首次治疗后即有明显疗效，治疗一周后，只 可见到痤疮色素沉着。 实施例30：牛皮癣和干性湿疹

牛皮癣斑和干性湿疹斑用根据实施例1B的磷虾多功能水解酶的水 凝胶制品(实施例1F所述)很容易除去。含5个酪蛋白单位/ml水解酶 的水凝胶(实施例1F所述)在需要治疗的部位使用，用量为0.5g/cm2， 使用后，该部位覆以半闭合的敷料。每日两次重复治疗。24小时之内， 斑完全消失了，敏感性皮肤(尤其是牛皮癣患者)的炎症减轻了。治疗 后，感染区域对类固醇乳膏有反应。 实施例31A：湿疹感染

40名患有脂溢性湿疹和牛皮癣感染的患者每日一次到两次用含2.5 个酪蛋白单位/ml实施例1A的多酶制品的多酶水凝胶(实施例1F所述) 进行治疗。治疗2-4次后，干性湿疹/斑患者的炎症或感染体征消失了。 脂肪型皮脂溢斑6-9天后消失了，但相关的炎症/感染在开始治疗的2 -4天内消失了。有牛皮癣斑的患者对类固醇乳膏的反应性提高了，这 可能是由于多酶制品除去了癣斑，使患区的渗透性更好了。 实施例31B：扁平苔癣伴相关感染

本例中患者下牙龈患有扁平苔癣。感染区域有丘疹和损害，并为真 菌斑所覆盖。每日一次，用1g含0.5mg/ml根据实施例1B的磷虾多功能 水解酶的水凝胶(实施例1F所述)涂敷感染区域。3天后，斑块和丘疹 消失了。第7天损害愈合，此时停止治疗。 实施例32：溶血栓/抗栓塞特性

血栓的形成是通过在兔子的主要耳静脉人为造成栓塞，直至合适的 血栓形成。距局部缺血区2cm处，顺血栓方向向耳静脉注入根据实施例 1B的磷虾多功能水解酶(0.5mg溶解于0.2ml等渗溶液)。30分钟之 内，血栓完全溶解，血流通畅了。在治疗区域形成了小面积坏死，但坏 死在7天内被重新吸收。在对照动物中，局部缺血区4-5天内形成坏 死。 实施例33：狗的牙斑

磷虾多酶制品被用来除去小猎兔犬的牙斑。临用前，安瓿盛装的多 酶制品(实施例1A所述)重新溶解于5ml盐水，使其终浓度为5个酪蛋 白单位/ml。新制备的溶液仔细地涂在牙齿和牙龈上。将舌头固定2分 钟，治疗后2小时不能进食和饮水。每日两次进行治疗，直至所有斑块 完全消失。每天一次检查狗的斑块情况、唾液分泌和副反应。本研究包 括8只由于特殊的饲喂和圈养而形成不正常斑块的小猎兔犬。4天后所 有斑块的迹象消失了，此时终止本研究。未见有副反应。 实施例34：人的牙斑

磷虾多功能酶被用来除去人的牙斑。每次治疗前，1个安瓿实施例 1A的多酶制品重新溶解于5ml盐水中，其终浓度为5个酪蛋白单位/ml， 患者用该溶液漱口5分钟。治疗后2小时不能进食、饮水。每日两次进 行治疗，每日一次检查患者的斑块、唾液分泌、干燥及副反应。研究期 间，患者不要刷牙。治疗持续至所有斑块的迹象消失，但不应超过7天。 首次治疗后2小时，所有患者的牙均有柔滑感，但用眼检查可见斑块残 迹。第三次治疗后2小时，所有斑块的迹象均已消失，此时停止治疗。 未见有副反应。 实施例35：癌症

实施例1A的磷虾多酶制品被用来治疗幼鼠Yoshida肉瘤。Yoshida 肉瘤细胞参见Micotina等《肿瘤生物学》(Tumour Biology)12卷 225页，1991和Goseki等《癌症》(Cancer)69卷1865页，1992。 多酶制品采用3种途径(腹腔内)(i.p.)、肿瘤内(i.t.)和皮下 (s.c.))用药，治疗对象为已接种Yoshida肉瘤细胞的Wistar大鼠。 治疗组别如下：

A.单一i.p.用药，5mg/kg。

B.单一i.t.用药，5mg/kg。

C.单一s.c.用药，5mg/kg。

D.每日两次s.c.用药，1.25mg/kg，持续7天。

E.每4天一次s.c.用药，5mg/kg。

F.每4天一次s.c.用药，12.5mg/kg。 临用前，安瓿盛装的多酶制品粉末重新溶解于等渗盐水中，使其浓度为 5mg/ml。1×104个Yoshida肉瘤细胞被接种至白Wistar大鼠背部皮 下。当接种细胞形成了10mm×10mm大的肿瘤时，这些大鼠或以多酶制 品进行治疗或用作不治疗的对照。最后一次治疗后7天将大鼠处死。测 量肿瘤的大小并与未治疗的对照大鼠的肿瘤进行比较。

A组的肿瘤相对缩小为46％，B组为56％，C组为49％。连续7 天每日两次以1.25mg/kg的剂量进行治疗的组别(D组)中，相对缩小 为72％。每两天以s.c.方式分别使用5mg/kg和12.5mg/kg的组别中， 肿瘤缩小分别为53％和69％。在所有治疗的鼠中，肿瘤坏死部分大大 多于未治疗鼠中的肿瘤。并且，治疗鼠体重增加较未治疗鼠快。

在每两天使用12.5mg/kg的组别中有一只鼠肿瘤完全消失了(而不 是相对减小)。与对照鼠相比，治疗组中转移程度非常小。治疗鼠饮食 均表现正常，与此相对照的是，对照鼠饮食均受抑制，表现出没有食欲。 此试验中未见有副反应。 实施例36：体外对HIV-感染细胞系的抗病毒作用

磷虾多功能水解酶的抗HIV活性采用国立癌症研究所(Natiornal Cancer Institute)的标准分析方法进行了测试。参见Weislow等，《国 立癌症研究所学报》(J.Nat1.Cancer.Inst.)81卷577-586页， 1989。其步骤包括：

(1)根据实施例1C的多功能水解酶溶解于二甲亚砜中，以细胞培 养基1∶100稀释，随后进行梯度稀释。病毒感染的T4淋巴细胞(CEM 细胞系)被加入不同稀释液中。相应的对照包括使用对HIV感染细胞进 行平行治疗的水解酶对未感染细胞进行治疗，但上述水解酶中没有多功 能水解酶。

(2)细胞在含5％CO2的空气中于37℃培养6天。

(3)四唑氮盐XTT被加入培养孔中，将细胞温育进行活细胞染色。 4种培养物采用分光光度法和显微镜法对存活细胞进行定量。图8示出实 验结果。曲线A为以多功能水解酶进行治疗的细胞，而曲线B为未感染 的对照。浓度低于10μg/ml未见有活性，在该点出现了活性剧变，水解 酶表现出明显保护活性的浓度至少较已知血清安全浓度要低10倍。 实施例37：狗的灰色内障

一只狗的右眼患有灰色内障，用2滴5个酪蛋白单位/ml实施例1A 的多酶制品溶液进行治疗。左眼同样进行治疗，只是滴眼液使用3个酪 蛋白单位/ml根据实施例1B的多功能水解酶溶液。上述过程每日重复一 次，观察混浊度变化和副反应。5天后可见双眼混浊度明显下降，10天 后双眼看起来都非常清亮，此时停止治疗。未见有副反应。 实施例38：人的内障

一名80多岁的妇女一只眼由于灰色内障造成昼间/夜间视觉，每3 天一次用0.4ml 0.1mg/ml的实施例1A的多酶制品溶液进行治疗。5次 治疗后，由于其它医学上的原因中止了本研究。但可观察到混浊度明显 下降，该女性反映患眼视力有所提高。治疗期间或治疗后1个月未见有 任何刺激、疼痛或其它不适。 实施例39：青光眼

一名74岁的男性右眼感到轻微的疼痛/不适，检查发现其眼内压增 高，并且这是持久的而非急性原因引起。每4天一次用含0.1mg实施例 1A的多酶制品滴入患眼，共滴3次。治疗后两周眼内压恢复正常，治疗 后4个月保持正常。首次治疗后20分钟之内，患者感到疼痛迅速缓解。 未见有副反应。 实施例40：常规滴眼

本研究包括12名没有眼部疾病、对空气污染的过敏反应或眼部感染 /炎症记录的患者，对他们的眼睛疲劳和刺痛进行治疗。必要时用2滴0.1 个酪蛋白单位/ml实施例1A的多酶制品溶液滴眼。30分钟之内所有患者 均感到眼部紧张和疼痛缓解。没有人反映瞳孔的光敏感性、对焦有变化， 也没有任何瞳孔扩张的变化。有时会感到短时的眼部发干。未见有任何 刺激、眼泪分泌增多或其它副反应。 实施例41：腱-鞘粘连

两只兔子的左侧跟腱裂开，立即以分离/重叠技术缝合。术后5天， 腱和腱鞘间有明显的粘连。术后第5、7、9天分别将溶解成0.25ml的 1mg多酶制品(实施例1A)注入鞘中。首次注射后1天(24小时)，腱 和鞘之间没有了明显的粘连。术后6周再未发生粘连。术后8个月，将 动物处死，在显微镜下检查腱的粘连、纤维蛋白和胶原蛋白增生。腱和 鞘分别愈合，未见有粘连的迹象。进行过手术的左腿跟腱的张力与未进 行手术的右腿跟腱进行了比较，未见有差别。可以认为该制品特异降解 多余的纤维蛋白，但并不影响腱和鞘的正确愈合所需的纤维蛋白。 实施例42：分离粘连的手腕

一名40岁的妇女由于手腕长期固定于硬石膏模型中而变得僵直。她 只有大约25％的正常运动性。虽然进行过训练但受影响关节的运动性没 有多少改善，诊断结论是僵直是由于关节内有纤维蛋白包被。每3天一 次以实施例1A的多酶制品溶液注入关节内(2mg/0.5ml)，总共注射4 次。14天后，关节运动性逐步提高到50-60％的运动性。4个月的康 复训练之后该妇女的运动性恢复至70-80％。未见有副反应。 实施例43：疤痕和瘢痕瘤的降解

实施例1A的多酶制品溶液每日一次注入5处脸部疤痕和3处手上和 前臂上的瘢痕瘤。每厘米疤痕/瘢痕瘤注入0.2ml溶液(含5个酪蛋白单 位/ml)，每天一处疤痕或瘢痕瘤的注入量不要超过1ml。每日重复一次 上述过程，检查疤痕/瘢痕瘤有无红斑、肿胀、发热、流血、坏死和副反 应。有80％的疤痕/瘢痕瘤降解即停止治疗，但治疗不应超过7天。治 疗7天后纤维蛋白疤痕缩小至原来体积的25％，胶原蛋白瘢痕瘤缩小至 70％。试用期间未见有副反应。 实施例44：减少皱纹

一名33岁的妇女连续60天每晚进行治疗，每次用浸有根据实施例 1B的多功能水解酶溶液的纱布绷带敷用30分钟。每次所用的多功能水解 酶的总量为0.15mg。患者一只眼以下的区域进行治疗，而另一边作为对 照。治疗15天后，可见皮肤的弹性有差别，治疗60天后，肉眼可见皱 纹有明显的差别。治疗区域的皮肤非常柔软有弹性，与未治疗区域皮肤 相比，皱纹的数量和深度都大大减少了。 实施例45A：息肉

本例中对一名有肛门息肉的62岁男性进行了治疗。该男性患息肉已 经3年，曾有一名医师进行过治疗。他接受过各种药物的治疗，但未见 有改善。用含有大约5mg溶解于5ml盐水中的根据实施例1B的多功能水 解酶的纱布绷带进行治疗。治疗持续总共5次。所有不适都消失了，在 下次去原来那名医师处检查时发现息肉已经消失了。治疗后8个月，该 男性仍未出现症状。 实施例45B：疣

一名颈部长有疣的35岁男性以含有根据实施例1B的多功能水解酶 溶液的膏药(“Hansaplast”每个膏药0.1mg)进行治疗。一周内每天 重复进行治疗。治疗一周后，疣完全消失了。 实施例45C：痔疮

本例对两名患者的痔疮进行了治疗，一名为55岁的男性，一名为30 岁的女性。该女性大约3年有疼痛和轻度流血症状。该女性用根据实施 例1B的多功能水解酶干粉进行治疗，将干粉撒在纱布绷带上，绷带敷用 于患处。每次使用量为5mg。5次治疗后，患者的症状消失了。治疗后1 年没有复发。

该男性多年以来为痔疮不时发作所苦恼。当急性症状(包括流血和 强烈的疼痛)出现时，用浸有大约4mg根据实施例1B的多功能水解酶干 粉的纱布绷带治疗1次。疼痛在20分钟内消失，这一次治疗以后，所有 症状都消失了，此后也没有复发。 实施例46：婴儿脐部感染的治疗

一名4日龄的男婴用多功能水解酶进行治疗，以除去坏死组织并避 免进一步感染。用根据实施例1B的多功能水解酶溶液饱和的纱布(2mg/ 纱布)缠绕脐系带，使其覆盖于健康的、感染的和坏死的脐系带组织。 每12小时更换4次纱布。大约12小时后，坏死和感染部分的组织经治 疗后被除去，而脐系带组织的健康部分完全未受影响。脐系带的健康皮 肤未见降解；也没有见到任何感染或皮肤刺激或炎症。健康的脐治疗4 次以上。出生后6天，在医院对婴儿进行检查，发现该婴儿脐没有任何 感染，与大多数同时检查的婴儿对比鲜明。 实施例47：过敏性瘙痒

一名28岁的女性有过敏问题，在她的一侧膝部和下巴及下巴以下有 荨麻疹，造成强烈的瘙痒。膝部荨麻疹呈现白色略有蔓延的隆肿，而在 下巴处则布满了与皮肤颜色相同的小疹。将纱布绷带以含2mg根据实施 例1B的多功能水解酶溶液浸湿。纱布在膝部的荨麻疹上敷用。10分钟 后除去纱布绷带。45分钟后瘙痒减轻，1.5小时后完全消失。白色隆肿 也消失了，荨麻疹完全消退。

1天后对下巴及下巴以下部位进行治疗。这一部位此时痒得非常厉 害，由于抓挠刺激感较以前更强烈。刚使用浸有磷虾多功能水解酶溶液 的纱布绷带，瘙痒加剧了，7分钟后由于强烈的瘙痒除去纱布绷带。此 后1.5小时，瘙痒渐渐减轻，2.95小时后完全消失了。对膝部开始治疗 后两天，治疗部位未见有副反应。 实施例48：前列腺炎

一名52岁的男性，在20岁以后每年冬天都受前列腺炎困扰。最近4 年以来，症状加剧，引起腹部剧痛。在每次急性发作期间，该男性接受 了多种抗生素的治疗，但抗生素治疗一结束，症状在一周内又复发。在 一次发作期间，该男性接受抗酸性胶囊的治疗，每一胶囊含有5mg根据 实施例1B的多功能水解酶干粉。一周内每天吞服2粒胶囊。所有症状很 快消失了，此后12个月没有复发。 实施例49：人乳腺炎(乳房炎症)

一名28岁的新生儿母亲在分娩后3天出现严重的乳液积滞，病症表 现为乳腺变硬、剧痛。这些症状在喂乳后半小时出现。该妇女被送进医 院，用常规方法进行治疗，但无济于事。当剧痛开始时，用含0.1mg根 据实施例1B的磷虾多功能水解酶溶液滴在该妇女的乳头上。在大约15 分钟之内，所有疼痛均消失了。大约45分钟之后，发硬的乳腺变软了。 每次喂乳后重复上述治疗，如此持续3个月以上。为检查治疗有无必要 继续，偶尔在该妇女喂乳后不进行治疗。每次检查，乳腺变硬和剧痛都 会复发。 实施例50：马的关节炎症

本研究包括16只瘸马，它们的前腿膝部发炎。安瓿盛装的实施例1A 的多酶制品重新溶解于10ml水中供注射之用，其终浓度为2.5个酪蛋白 单位/ml。在第1、2、4和7天，分别向马的疼痛关节注入2ml该溶液。 注射后，观察马有无任何副反应或总体状况的恶化。每天一次观察临床 参数。九例中在首次治疗后30分钟到2小时之内有疼痛减轻的反应，另 有4例在6小时内有反应，另2例在第二次治疗后2小时之内有反应。1 例在第三次注射后疼痛减轻，该例中膝部有严重的肿胀。15例中发热和 肿胀迅速消退，2天后炎症消失了。未见有副反应。平均结果总结于图 11中。治疗后1周，病马简单训练后都恢复了。 实施例51：旅游者腹泻

一名41岁的男性发生急性食物中毒(可能由于葡萄球菌)，出现腹 泻和呕吐。发病后l小时，该男性用含5mg根据实施例1B的磷虾多功能 水解酶溶液进行治疗，让他将该溶液含在口里大约3分钟，随后慢慢吞 下。上述过程每两小时重复3次。第4次治疗后，胃疼消失了，呕吐和 腹泻也停止了。 实施例52：脱发

本例中对两名年龄分别为55岁和62岁的男性进行了治疗。他们在 近十年都出现脱发现象。治疗是用含5mg根据实施例1B的磷虾多功能水 解酶溶液将整个头皮浸湿。为保持头皮的湿润，用淋浴帽覆盖30分钟。 治疗每周重复一次，大约持续3个月。经过这段时间的治疗后开始有新 的头发长出。 实施例53：用非磷虾酶治疗

将实施例8-52中的磷虾来源的多功能水解酶均用其它来源的多功 能酶代替，结果同样有效。