生物传感器
阅读：624发布：2020-05-13
专利汇可以提供生物传感器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于测定在测试样品中存在分析物的 传感器 ，所述传感器包含纳米颗粒膜，所述纳米颗粒膜含有选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机 氧 化物纳米颗粒，其中氧化还原酶和电化学活化剂扩散分布于所述纳米颗粒膜中。，下面是生物传感器专利的具体信息内容。
1.一种用于测定分析物在测试样品中存在与否的传感器，所述传感器包括：
纳米颗粒膜，其含有选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、 VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒，其中氧化还原酶 和电化学活化剂扩散分布于所述纳米颗粒膜中。
2.权利要求1的传感器，其中所述氧化还原酶选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣 根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、氢氢化酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖脱 氢酶、NADH脱氢酶、肌氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、醇脱氢酶、羟基丁酸脱氢酶、甘 油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、苹果酸氧化酶、半乳糖 氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆碱脱氢酶、丙 酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、胆红素氧化酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸 氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、细胞色素C氧化酶和儿茶酚氧化 酶。
3.权利要求1的传感器，其中所述的电化学活化剂是能够在分析物和存在于传感器 中的电极之间传递电子的聚合物氧化还原介体。
4.权利要求3的传感器，其中所述的氧化还原酶通过交联键与聚合物氧化还原介体 共价连接。
5.权利要求1的传感器，其中所述选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、 IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素选自铝、硅、镁和锌。
6.权利要求1的传感器，其中所述膜的厚度为250-500μm。
7.权利要求6的传感器，其中所述纳米颗粒的尺寸为10nm-1μm。
8.权利要求1的传感器，其中所述膜还包含聚合物粘合剂。
9.权利要求8的传感器，其中所述聚合物粘合剂是含有选自乙烯基吡啶、乙烯基咪 唑、丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼以及丙烯酸的单体单元的聚合物或共聚物。
10.权利要求1的传感器，还包括：
用于容纳测试样品的腔，所述腔至少结合在工作电极上的工作区域与参比电极 上的工作区域之间，
其中氧化还原酶和电化学活化剂涂布在工作电极的工作区域上。
11.权利要求10的传感器，其中所述工作电极包含选自金、碳、铂、二氧化钌、钯和 导电环氧树脂的材料。
12.一种非导电纳米颗粒膜，其包含选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、 IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒， 其中氧化还原酶和电化学活化剂扩散分布于所述纳米颗粒膜中。
13.权利要求12的膜，其中所述电化学活化剂是能够传递电子的聚合物氧化还原介 体。
14.权利要求12的膜，其中所述选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素选自铝、硅、镁和锌。
15.权利要求12的膜，其中所述膜的厚度为250-500μm。
16.权利要求12的膜，其中所述纳米颗粒的尺寸为10nm-1μm。
17.权利要求12的膜，其中所述膜还包含聚合物粘合剂。
18.权利要求17的膜，其中所述聚合物粘合剂是含有选自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、 丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼以及丙烯酸的单体单元的聚合物或共聚物。
19.一种生产非导电纳米颗粒膜的方法，所述方法包括：
将电化学氧化还原介体与氧化还原酶和来自周期表的IA、IIA、IIIA、IVA、IB、 IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族元素的无机氧化物的纳米颗粒混合， 以形成纳米复合材料墨；和
将所述纳米复合材料墨涂布至衬底上。
20.权利要求19的方法，其中所述纳米复合材料墨根据预定图案涂布。
21.权利要求20的方法，其中所述纳米复合材料墨通过丝网印刷涂布。
22.权利要求19的方法，其中所述混合还包括将聚合物粘合剂混入所述纳米复合材 料墨中。
23.权利要求19的方法，其中纳米复合材料墨中的电化学活化剂的浓度为约15mg/ml。
24.权利要求19的方法，其中纳米复合材料墨中的酶浓度为约0.2mg/ml。
25.一种水溶性氧化还原聚合物，包含：
第一单体单元，包含可聚合的二茂铁衍生物；和
第二单体单元，包含具有能够能够获得净电荷的伯酸或碱官能团的丙烯酸衍生 物。
26.权利要求25的氧化还原聚合物，其中第二单体单元包含具有能够获得净电荷的 末端伯酸或碱官能团的丙烯酸衍生物。
27.权利要求25的氧化还原聚合物，其中所述丙烯酸衍生物由通式(I)表示
其中，R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中 烷基链可以是任选取代的，其中n是0-12的整数。
28.权利要求25的氧化还原聚合物，其中所述可聚合二茂铁衍生物选自乙烯基-二茂 铁、乙炔基-二茂铁、苯乙烯基-二茂铁和氧化乙烯-二茂铁。
29.权利要求28的氧化还原聚合物，其中所述二茂铁衍生物是乙烯基二茂铁。
30.权利要求25的氧化还原聚合物，其中氧化还原聚合物的分子量是约1000-5000道 尔顿。
31.权利要求25的氧化还原聚合物，其中存在于氧化还原聚合物中的二茂铁为约 3％-14％。
32.一种制备水溶性氧化还原聚合物的方法，所述方法包括：
将第一单体单元与第二单体单元聚合，所述第一单体单元包含可聚合的二茂铁 衍生物，所述第二单体单元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能够获得净 电荷的酸或碱官能团，其中所述聚合在水醇介质中进行。
33.权利要求32的方法，其中所述水醇介质包含体积比为2∶1-3∶1的乙醇和水。
34.权利要求32的方法，其中所述聚合通过加入自由基引发剂而引发。
35.权利要求34的方法，其中所述自由基引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸 钠。
36.权利要求34的方法，其中所加入的自由基引发剂的重量比为约20mg-40mg/1g 单体。
37.权利要求32的方法，其中所述聚合在约60℃-80℃的温度下回流进行。
38.权利要求33的方法，其中所述聚合在惰性气氛中进行。
39.权利要求32的方法，其中所述聚合进行约24小时。
40.权利要求32的方法，还包括：在将所述第一和第二单体聚合之前形成反应前混 合物，包括：
将丙烯酸衍生物单体单元溶解在水醇介质中，然后
加入自由基引发剂，然后
加入可聚合的二茂铁衍生物单体单元，以形成反应前混合物。
41.权利要求40的方法，其中反应前混合物中的丙烯酸衍生物和可聚合二茂铁衍生 物的进料比为所加入单体重量的约5％-15％。
42.权利要求40的方法，其中所述可聚合二茂铁衍生物单体单元在加入之前溶解于 水醇介质。
43.权利要求40的方法，还包括将氧化还原介体沉淀在有机溶剂中。
44.权利要求40的方法，其中所述有机溶剂选自醚和酮。
45.权利要求1的传感器，其中所述传感器用于测定葡萄糖浓度。
技术领域
本发明涉及传感器，具体涉及用于测定测试样品中存在分析物的传感器。本发 明还涉及纳米颗粒膜。本发明进一步涉及水溶性氧化还原聚合物及制备聚合物的方 法。
背景技术
近年来，聚合物材料在许多领域得到广泛的理论关注和实际使用[G.Harsanyi. Materials Chemistry anf Physics Vol.43，Issue 3，1996，199]。具体而言，已经发现导电 聚合物逐渐用于生物传感领域，其中导电聚合物提供作为智能传感器与智能分子接 收器之间的界面的独特功能。在所有已知的导电聚合物中，例如离子导电聚合物、 电荷转移聚合物和共轭导电聚合物，迄今为止，氧化还原聚合物被最广泛地用于生 物传感领域。
葡萄糖传感，作为生物传感的一个方面已经在最近进行了重大研究，其基于葡 萄糖氧化酶将葡萄糖酶氧化成葡萄糖酸所需的电子介导。氧化还原聚合物的电子介 导功能已被广泛研究并应用于许多电流测量的葡萄糖生物传感器。
在其天然酶反应中，辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是存在于葡萄糖氧化酶 中的电子载体，其被还原成FADH2(从FAD还原)并由分子氧氧化恢复为FAD。 O2随后被还原为H2O2。该氧化和还原循环使FAD能够作为电子受体。由于葡萄糖 和葡萄糖酸在-0.5-1.0V的工作电位窗口内均没有电活性，因此增加H2O2浓度或降 低O2浓度成为定量葡萄糖浓度的测量手段。
然而，基于测量H2O2和O2的测量精确性有损害，这是由于首先空气中的O2 分压影响电流计的响应，其次因为当进行传感时O2用量上升，因而在高葡萄糖浓度 下定量测量O2很困难。利用H2O2在铂电极上氧化而检测H2O2需要0.5-0.6V的工作 电位(相对于Ag/AgCl)，因而受到血液中电活性物质的干扰，例如在该电位处具有 电化学活性的抗坏血酸和尿酸。
为了解决与涉及O2或H2O2的葡萄糖检测有关的上述问题，已经提出将氧化还 原介体作为人工电子受体以替代用于FADH2的氧分子。
原则上，成功的介体应该满足三个条件：1)与酶和电极的快速电子交换速率， 2)稳定附着于电极上，和3)可在水性介质中加工。
为此，广泛研究了两类介体，即过渡金属配合物和二茂铁基材料。近年来，许 多研究小组关注单聚和多聚的二茂铁基材料的合成和生物传感器应用。例如，聚二 茂铁基化合物已经用作分子识别中的氧化还原指示剂[J.E.Kinston，et al，J.Chem. Soc.，Dalton.Trans(1999)251.]、生物传感器中的介体[S.Koide，et al，J.Electroanal. Chem.，468(1999)193.]和改性电极表面的涂层[S.Nlate，et al，Chem.Commun.，(2000) 417]。然而，大多数已知的二茂铁基材料仅可溶于非极性介质中，仅有少数二茂铁基 和聚二茂铁基材料是水溶性的[O.Hatozaki，et al，J.Phys.Chem.，199(1996)8448.]。 人们对水溶性二茂铁基材料作为生物传感器中的氧化还原介体特别关注。通过将烯 烃取代的二茂铁如乙烯基二茂铁与适当的水溶性聚合物共聚，可以制备易溶于水的 二茂铁基材料。但是，已经表明自由基引发的乙烯基二茂铁聚合是不常见的[A.J. Tinker，et al，J.Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，13(1975)2133；M.H.George，et al，J. Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，14(1975)475.]。已知乙烯基二茂铁的共聚是困难的， 这是因为在聚合体系中茂铁离子是自由基清除剂，导致反应不遵守正常的自由基 聚合动力学。聚合反应的终止通过从二茂铁核至增长链自由基的电子传递而发生。 这导致聚合物链失活和含有高自旋铁(III)物质的聚合物。
聚丙烯酰胺已经广泛用作酶固定化和生物传感中的载体基质，这是因为其良好 的化学和机械稳定性及其对微生物降解的惰性[I，Willner，et al，J.Am.Chem.Soc. 112(1990)6438]。然而，乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的共聚尝试并不成功[H. Bu，et al，Anal.Chem.，67(1995)4071及其中的参考文献]。相反，为了避免低效的乙 烯基二茂铁的共聚，提出了制备二茂铁基材料中的化学接枝程序[S.Koide，et al，J. Electroanal.Chem.，468(1999)193；J.Hodak，et al，Langmuir，13(1997)2708；A. Salmon，et al，J.Organomet.Chem.，637-639(2001)595]。在最近的两篇报导中[N. Kuramoto，et al，Polymer 39(1998)669；H.Ahmad，et al，Colloids and Surfaces，186 (2001)221]，合成了乙烯基二茂铁共聚物，但是在这些聚合物中二茂铁负载量小且缺 少可交联基团，这限制其在生物传感器中的应用。
商业可得的生物传感器包括Therasense Inc.(参见例如US专利6,338,790)、 Inverness Medical Technology(参见例如US专利6,241,862)和Matsushita Electric (参见例如US专利6,547,954)制造的生物传感器。
因此，仍然需要具有优异性能特征的二茂铁基聚合物介体。结果，本发明的目 的在于开发合成新型二茂铁基聚合物介体的新方法。本发明的另一目的是提供具有 增强性能的生物传感器，并且该生物传感器将使生物传感器终端用户的不便尽可能 小。
这些目的通过本发明的各个方面得到解决，所述各个方面亦即在各独立权利要 求中限定的传感器、膜、聚合物和方法。
葡萄糖传感，作为生物传感的一个方面已经在最近进行了重大研究，其基于葡 萄糖氧化酶将葡萄糖酶氧化成葡萄糖酸所需的电子介导。氧化还原聚合物的电子介 导功能已被广泛研究并应用于许多电流测量的葡萄糖生物传感器。
在其天然酶反应中，辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是存在于葡萄糖氧化酶 中的电子载体，其被还原成FADH2(从FAD还原)并由分子氧氧化恢复为FAD。 O2随后被还原为H2O2。该氧化和还原循环使FAD能够作为电子受体。由于葡萄糖 和葡萄糖酸在-0.5-1.0V的工作电位窗口内均没有电活性，因此增加H2O2浓度或降 低O2浓度成为定量葡萄糖浓度的测量手段。
然而，基于测量H2O2和O2的测量精确性有损害，这是由于首先空气中的O2 分压影响电流计的响应，其次因为当进行传感时O2用量上升，因而在高葡萄糖浓度 下定量测量O2很困难。利用H2O2在铂电极上氧化而检测H2O2需要0.5-0.6V的工作 电位(相对于Ag/AgCl)，因而受到血液中电活性物质的干扰，例如在该电位处具有 电化学活性的抗坏血酸和尿酸。
为了解决与涉及O2或H2O2的葡萄糖检测有关的上述问题，已经提出将氧化还 原介体作为人工电子受体以替代用于FADH2的氧分子。
原则上，成功的介体应该满足三个条件：1)与酶和电极的快速电子交换速率， 2)稳定附着于电极上，和3)可在水性介质中加工。
为此，广泛研究了两类介体，即过渡金属配合物和二茂铁基材料。近年来，许 多研究小组关注单聚和多聚的二茂铁基材料的合成和生物传感器应用。例如，聚二 茂铁基化合物已经用作分子识别中的氧化还原指示剂[J.E.Kinston，et al，J.Chem. Soc.，Dalton.Trans(1999)251.]、生物传感器中的介体[S.Koide，et al，J.Electroanal. Chem.，468(1999)193.]和改性电极表面的涂层[S.Nlate，et al，Chem.Commun.，(2000) 417]。然而，大多数已知的二茂铁基材料仅可溶于非极性介质中，仅有少数二茂铁基 和聚二茂铁基材料是水溶性的[O.Hatozaki，et al，J.Phys.Chem.，199(1996)8448.]。 人们对水溶性二茂铁基材料作为生物传感器中的氧化还原介体特别关注。通过将烯 烃取代的二茂铁如乙烯基二茂铁与适当的水溶性聚合物共聚，可以制备易溶于水的 二茂铁基材料。但是，已经表明自由基引发的乙烯基二茂铁聚合是不常见的[A.J. Tinker，et al，J.Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，13(1975)2133；M.H.George，et al，J. Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，14(1975)475.]。已知乙烯基二茂铁的共聚是困难的， 这是因为在聚合体系中茂铁离子是自由基清除剂，导致反应不遵守正常的自由基 聚合动力学。聚合反应的终止通过从二茂铁核至增长链自由基的电子传递而发生。 这导致聚合物链失活和含有高自旋铁(III)物质的聚合物。
聚丙烯酰胺已经广泛用作酶固定化和生物传感中的载体基质，这是因为其良好 的化学和机械稳定性及其对微生物降解的惰性[I，Willner，et al，J.Am.Chem.Soc. 112(1990)6438]。然而，乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的共聚尝试并不成功[H. Bu，et al，Anal.Chem.，67(1995)4071及其中的参考文献]。相反，为了避免低效的乙 烯基二茂铁的共聚，提出了制备二茂铁基材料中的化学接枝程序[S.Koide，et al，J. Electroanal.Chem.，468(1999)193；J.Hodak，et al，Langmuir，13(1997)2708；A. Salmon，et al，J.Organomet.Chem.，637-639(2001)595]。在最近的两篇报导中[N. Kuramoto，et al，Polymer 39(1998)669；H.Ahmad，et al，Colloids and Surfaces，186 (2001)221]，合成了乙烯基二茂铁共聚物，但是在这些聚合物中二茂铁负载量小且缺 少可交联基团，这限制其在生物传感器中的应用。
商业可得的生物传感器包括Therasense Inc.(参见例如US专利6,338,790)、 Inverness Medical Technology(参见例如US专利6,241,862)和Matsushita Electric (参见例如US专利6,547,954)制造的生物传感器。
因此，仍然需要具有优异性能特征的二茂铁基聚合物介体。结果，本发明的目 的在于开发合成新型二茂铁基聚合物介体的新方法。本发明的另一目的是提供具有 增强性能的生物传感器，并且该生物传感器将使生物传感器终端用户的不便尽可能 小。
这些目的通过本发明的各个方面得到解决，所述各个方面亦即在各独立权利要 求中限定的传感器、膜、聚合物和方法。
发明内容
在一个方面中，本发明提供用于确定分析物存在于测试样品中的传感器，所述 传感器包含纳米颗粒膜，其含有选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒，其中 氧化还原酶和电化学活化剂扩散分布于所述纳米颗粒膜中。
在另一方面中，本发明提供非导电纳米颗粒膜，所述纳米颗粒膜含有选自周期 表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的 元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒，其中氧化还原酶和电化学活化剂扩散分布于 所述纳米颗粒膜中。
在又一方面中，本发明提供一种用于生产非导电纳米颗粒膜的方法，包括将电 化学氧化还原介体与氧化还原酶和来自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族元素的氧化物纳米颗粒混合，以形成纳米复合材 料墨；和将所述纳米复合材料墨涂布至基材上。
在再一方面中，本发明提供水溶性氧化还原聚合物，其包含：
第一单体单元，包含可聚合的二茂铁衍生物；和
第二单体单元，包含具有能够获得净电荷的(末端)伯酸或碱官能团的丙烯酸 衍生物。
在一个实施方案中，该新水溶性氧化还原聚合物中的丙烯酸衍生物由以下通式 (I)示出：
其中，R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其 中烷基链可以是任选取代的，其中n是0-12的整数。
在再一方面中，本发明提供一种制备水溶性氧化还原聚合物的方法，所述方法 包括：
将第一单体单元与第二单体单元聚合，所述第一单体单元包含可聚合的二茂铁 衍生物，所述第二单体单元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能够获得净 电荷的酸或碱官能团，其中所述聚合在含水的醇介质中进行。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，通过以下详细说明将更好地理解本发明， 其中：
图1是根据本发明一个实施方案的生物传感器的等比例分解图。
图2A是示出图1的生物传感器沿图1箭头A方向观察的端视图。
图2B是示出图1的生物传感器沿图1箭头B方向观察的端视图。
图3是根据本发明另一实施方案的生物传感器的等比例分解图。
图4示出发生在氧化还原聚合物介导的生物传感器中的氧化还原偶联反应的示 意图。
图5示出本发明的水溶性且可交联聚合物的基本单元的结构。该图示出在乙烯 基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚物中发现的重复单元。
图6说明在乙烯基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚反应中的通用反应方程式。
图7示出根据本发明方法生产的氧化还原聚合物PAA-VFc和PAAS-VFc的傅立 叶变换红外(FT-IR)光谱。
图8示出Fc、PAA、PAAS和由同VFc共聚得到的共聚物的紫外(UV)-可见 光谱。
图9示出各种系统中氧化还原聚合物的循环伏安图。使用磷酸盐缓冲盐水，用 于获得伏安图的电位扫描率为100mV/s。
图10示出与金电极上的葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)膜交联的氧 化还原聚合物PAA-VFc的另一循环伏安图。使用磷酸盐缓冲盐水，用于获得伏安图 中的电位扫描率为50mV/s。
图11示出用于本工作中可一次性葡萄糖生物传感器的分解图。
图12示出纳米颗粒印刷墨加入(a)和不加入(b)100mg/dl葡萄糖的循环伏安 图。应用的电位扫描率为100mV/s。
图13示出生物传感器在含有(a)200和(b)0.0mg/dl葡萄糖的PBS中的电流 计响应。所施加的平衡电位为0.30V。
图14示出300mg/dl葡萄糖的电流计峰值电流对(a)PVFcAA浓度、(b)GOX 浓度、(c)平衡电位和(d)纳米颗粒膜厚度的依赖性。
图15示出(a)不存在和(b)存在溶解氧时，PBS中的200mg/dl葡萄糖的电 流计响应。所施加的平衡电位为0.30V。
图16示出(a)对PBS中顺序增加的100mg/dl葡萄糖的电流计响应和(b)在 不同取样时间下的标定曲线。所施加的平衡电位为0.30V。
在另一方面中，本发明提供非导电纳米颗粒膜，所述纳米颗粒膜含有选自周期 表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的 元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒，其中氧化还原酶和电化学活化剂扩散分布于 所述纳米颗粒膜中。
在又一方面中，本发明提供一种用于生产非导电纳米颗粒膜的方法，包括将电 化学氧化还原介体与氧化还原酶和来自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族元素的氧化物纳米颗粒混合，以形成纳米复合材 料墨；和将所述纳米复合材料墨涂布至基材上。
在再一方面中，本发明提供水溶性氧化还原聚合物，其包含：
第一单体单元，包含可聚合的二茂铁衍生物；和
第二单体单元，包含具有能够获得净电荷的(末端)伯酸或碱官能团的丙烯酸 衍生物。
在一个实施方案中，该新水溶性氧化还原聚合物中的丙烯酸衍生物由以下通式 (I)示出：
其中，R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其 中烷基链可以是任选取代的，其中n是0-12的整数。
在再一方面中，本发明提供一种制备水溶性氧化还原聚合物的方法，所述方法 包括：
将第一单体单元与第二单体单元聚合，所述第一单体单元包含可聚合的二茂铁 衍生物，所述第二单体单元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能够获得净 电荷的酸或碱官能团，其中所述聚合在含水的醇介质中进行。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，通过以下详细说明将更好地理解本发明， 其中：
图1是根据本发明一个实施方案的生物传感器的等比例分解图。
图2A是示出图1的生物传感器沿图1箭头A方向观察的端视图。
图2B是示出图1的生物传感器沿图1箭头B方向观察的端视图。
图3是根据本发明另一实施方案的生物传感器的等比例分解图。
图4示出发生在氧化还原聚合物介导的生物传感器中的氧化还原偶联反应的示 意图。
图5示出本发明的水溶性且可交联聚合物的基本单元的结构。该图示出在乙烯 基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚物中发现的重复单元。
图6说明在乙烯基二茂铁和丙烯酸衍生物的共聚反应中的通用反应方程式。
图7示出根据本发明方法生产的氧化还原聚合物PAA-VFc和PAAS-VFc的傅立 叶变换红外(FT-IR)光谱。
图8示出Fc、PAA、PAAS和由同VFc共聚得到的共聚物的紫外(UV)-可见 光谱。
图9示出各种系统中氧化还原聚合物的循环伏安图。使用磷酸盐缓冲盐水，用 于获得伏安图的电位扫描率为100mV/s。
图10示出与金电极上的葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)膜交联的氧 化还原聚合物PAA-VFc的另一循环伏安图。使用磷酸盐缓冲盐水，用于获得伏安图 中的电位扫描率为50mV/s。
图11示出用于本工作中可一次性葡萄糖生物传感器的分解图。
图12示出纳米颗粒印刷墨加入(a)和不加入(b)100mg/dl葡萄糖的循环伏安 图。应用的电位扫描率为100mV/s。
图13示出生物传感器在含有(a)200和(b)0.0mg/dl葡萄糖的PBS中的电流 计响应。所施加的平衡电位为0.30V。
图14示出300mg/dl葡萄糖的电流计峰值电流对(a)PVFcAA浓度、(b)GOX 浓度、(c)平衡电位和(d)纳米颗粒膜厚度的依赖性。
图15示出(a)不存在和(b)存在溶解氧时，PBS中的200mg/dl葡萄糖的电 流计响应。所施加的平衡电位为0.30V。
图16示出(a)对PBS中顺序增加的100mg/dl葡萄糖的电流计响应和(b)在 不同取样时间下的标定曲线。所施加的平衡电位为0.30V。
具体实施方式
一方面，本发明是基于以下发现，即水溶性且可交联的氧化还原聚合物可很容 易地在含有过硫酸盐作为引发剂的乙醇与水的化合物中制备。该制备方法允许更早 面对所要克服的问题，如涉及二茂铁分子的共聚反应的不利动力学。试验表明得自 本方法的乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺共聚物的分子量为2000-4000道尔顿，对应于 约400个单体单元，二茂铁负载为3-14％。该水平的二茂铁负载在之前使用自由基 聚合技术已经可以得到(参见例如N.Kuramoto et al.)。通过克服该限制，本发明已 经给出用于生物传感应用的具有有用性能的新型聚合物和电化学检测分析物的其它 方法。
本发明氧化还原聚合物中的二茂铁中心能够提供局部电活性，因而能够用于氧 化还原反应而不带来聚合物中分子内键的重组。此外，本发明的氧化还原聚合物包 含具有功能基团的侧链，其有利于与其它具有合适官能团的分子交联。这还允许该 聚合物连接至大量的分子。组合这两个特征，这些聚合物很好地适用于需要电子介 导的应用，如用于生物传感器和生物燃料电池中的酶电极，以及在电子酶反应器中 进行的酶合成。
在另一方面中，根据本发明的葡萄糖传感器引入能够精确测量以极小量存在的 流体中的葡萄糖浓度的传感元件，因而只需要小于1μL或优选约0.2μL-0.3μL的测 试样品。测试样品通常包括动物生物样本如生物流体(例如血液样本、汗液样本、 尿液样本)；排泄物样本和含有脂肪组织或皮下脂肪的新鲜样本。可以利用本传感器 分析的其它样品包括用于科学实验的试剂或含有葡萄糖的食物和用于葡萄酒或啤酒 生产工业中的发酵液体培养基。试验样品也可包括微生物培养基(例如用于大肠杆 菌、酵母或其它宿主生物高密度发酵的生长培养基，通常用于多肽的重组生产)。
由于进行诊断测试需要的是小量测试样品，因此使得对终端用户带来的不便最 小。例如，对于需要连续葡萄糖评估的糖尿病人来说，抽取次微升水平的血液样本 将给患者带来最小的疼痛和不便。
一般来说，本发明的传感器利用本文中所详述的纳米颗粒膜。除了适合以亚微 升水平测试血液样本之外，该膜还具有可低成本制造和甚至在保存期延长的条件下 稳定的优点。
该膜可引入电化学活化剂和底物特异酶，二者均扩散分布在沉积于氧化葡萄糖 的传感器电极上的膜中。此处使用的术语“电化学活化剂”是指能够使葡萄糖和传 感器的工作(检测)电极之间传递电子的酶活化的任意化合物。电化学活化剂可以 是聚合物氧化还原介体。作为替代方案，也可以使用单体的电化学活化剂，如水溶 性二茂铁衍生物、锇-二吡啶配位化合物、钌配位化合物(例如五胺吡啶钌和 Ru(NH3)6 3+)以及六氰合铁酸盐和六氰合钌酸盐。在本发明的一些实施方案中，电化 学活化剂含具有氧化还原活性的金属离子。该金属离子的例子是银、金、铜、镍、 铁、钴、锇或钌离子或其混合物。
一般来说，引入本发明纳米颗粒膜中的合适氧化还原介体应该具有防止或实质 性减少氧化还原物质在样品被分析期间的扩散损失的化学结构。氧化还原介体的扩 散损失可以通过使聚合物氧化还原介体不可从传感器的工作电极上释放来减少。这 可以通过结合或固定氧化还原介体例如将氧化还原介体通过共价结合或双共轭结合 至电极上的聚合物而实现。作为替代方案，氧化还原介体可以通过提供具有反电荷 物质或对氧化还原介体具有高亲和力的物质的粘合剂来固定。在本发明的一个实施 方案中，一种非可释放的聚合物氧化还原介体包含共价连接至聚合物的氧化还原物 质。该氧化还原聚合物通常是过渡金属化合物，其中具有氧化还原活性的过渡金属 基侧基共价结合至合适的聚合物骨架上，所述骨架自身可以具有或不具有电活性。 该类实例是聚(乙烯基二茂铁)和聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)。作为替代方 案，聚合物氧化还原介体可包含离子结合的氧化还原物质。通常，这些介体包括偶 联至带有相反电荷的氧化还原物质上的带电聚合物。此类实例包括带负电荷的聚合 物如Nafion(Dupont)，其偶联至带正电荷的氧化还原物质如锇或钌聚吡啶阳离子； 或者相反，带正电荷的聚合物如聚(1-乙烯基咪唑)偶联至带负电荷的氧化还原物质 如铁氰化物或亚铁氰化物。此外，氧化还原物质还可以配位结合至聚合物。例如， 氧化还原介体可以通过锇或钴2，2’-二吡啶基配位化合物与聚(1-乙烯基咪唑)或聚 (4-乙烯基吡啶)的配位结合而形成。另一实例是聚(4-乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺) 与锇4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶基配位化合物配位。有用的氧化还原介体及其合成方法 描述于美国专利No.5,264,104；5,356,786；5,262,035；5,320,725；6,336,790；6,551,494 和6,576,101。
在本发明另一实施方案中，电化学活化剂选自下文中详细描述的新一类氧化还 原聚合物。简而言之，该新一类氧化还原聚合物包括聚(乙烯基二茂铁)、聚(乙烯 基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂铁) -共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸以及聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸， 其中n为0-12的整数，优选0-8。
本发明的膜也可引入氧化还原聚合物，该聚合物与蛋白质如酶或抗原交联，并 固定在电极表面。
传感器的一个实施方案包含容纳测试样品的腔，由此该腔至少结合在工作电极 的工作区域与参比电极的工作区域之间。同样在该实施方案中，氧化还原酶和水溶 性氧化还原聚合物涂布在工作电极的工作区域上。
参考附图，本发明的传感器描述如下。图1示出根据本发明一个实施方案的顶 部填充的生物传感器2的等比例分解图。生物传感器2包括由几层构成的堆叠体。 根据图1和2从下往上，该堆叠体包括衬底层4、工作电极6、隔离物8、反电极10 和顶层12。隔离物8隔离工作电极6和反电极10，从而使它们电绝缘。形成在隔离 物8的分叉末端的两腿之间的凹槽14限定工作电极6和反电极10之间的样品腔14 (参见图2A)。由此方式，样品腔14通过反电极10和工作电极6各自相对面对面的 表面而结合或限定在顶部和底部，以及通过隔离物8的侧壁结合或限定在两侧。样 品腔14一侧暴露，如图2所示。工作电极6的该表面称作工作表面。传感化学材料 载体，如纳米复合材料膜18设置在样品腔14中。该膜18与工作电极6物理接触。 传感化学材料优选包括电子转移剂、如可扩散氧化还原介体(未能示出)。氧化还原 介体和其它传感化学材料将在以下详述。空洞16形成在顶层12中，并穿过反电极 到达样品腔14。衬底4和顶层12凹陷，使得工作电极6和反电极10的部位20和 22(图2B)依然暴露，从而其可相互连接以形成电路。
样品腔14的配置或成形使得当样品或分析物提供在腔14中时，分析物与工作 电极6和反电极10电解接触。这种电解接触允许氧化还原介体介导的电流在电极6、 10之间流动，以实现分析物的电解作用(电致氧化或电致还原)。氧化还原介体使可 能不适合在工作电极6上直接进行电化学反应的分析物分子的电化学分析成为可能。 样品腔14的容积可以是0.1-1μl，但是其它容积也是可以的。称为测量区的样品腔14 的区域仅含有在分析物分析期间被探询的部分分析物。在图1的生物传感器2中， 测量区容积近似等于样品腔14的容积。然而，应该注意更小的测量区例如样品腔14 的尺寸的80％或90％也是可以的。
由隔离物8的厚度所限定的样品腔14的高度优选小，以促进分析物的快速电解， 这是因为对于给定分析物体积将有更多的分析物与电极6和10的表面接触。此外， 高度小的样品腔14有助于减少分析物分析期间分析物从样品腔14的其它部分扩散 到更小测量区而带来的误差，因为扩散时间比测量时间要长。通常，样品腔的厚度 不大于约0.2mm。优选样品腔的厚度不大于约0.1mm，更优选样品腔的厚度为约 0.05mm或更小。
衬底4和顶层12可由惰性非导电材料如聚酯形成。作为替代方案，衬底4和顶 层12可由模制碳纤维复合材料形成。工作电极6优选具有较低电阻，并且通常在运 行期间在生物传感器电位范围内是电解惰性的。用于形成工作电极6的合适材料包 括金、碳、铂、二氧化钌、钯和导电环氧树脂，例如ECCOCOAT CT5079-3碳填充 导电环氧树脂涂料(可得自W.R.Grace Company，Woburn，Mass.)，以及本领域技 术人员已知的其它非腐蚀材料。反电极10也可使用适合形成工作电极6的上述任意 材料来形成。工作电极6和反电极10可通过任意合适的方例如通过气相沉积或印刷 而沉积在衬底4和顶层12的表面。
隔离物8通常由惰性非导电材料如压敏胶粘剂、聚酯、Mylar、kevlar或任意 其它强力聚合物薄膜构成，或者作为替代方案，由根据其化学惰性而选择的聚合物 薄膜如Teflon膜构成。其它隔离物包括胶粘剂层或双面胶粘带(例如在膜反面具有 胶粘剂的载体膜)。
在一个具体的实施方案中，衬底4和顶层12是聚酯膜，工作电极6是丝网印刷 的碳层，反电极10是丝网印刷的Ag/AgCl层，隔离物8是双面胶粘带。
生物传感器2使用期间，样品腔14的暴露侧用于接触分析物如血液或血清。其 中具有纳米复合材料膜18的样品腔14通过芯吸或毛细作用接收用于分析的分析物。 根据氧化还原介体的类型，可扩散的氧化还原介体可快速扩散入分析物，或扩散发 生在一段时间内。类似地，膜18中的可扩散氧化还原介体可首先溶解，随后扩散进 入分析物，或快速或经过一段时间。如果氧化还原介体扩散经过一段时间，则可指 示用户在测量分析物浓度前等待一段时间，以允许氧化还原介体扩散。
不应认为生物传感器的结构和构造受上述限制；具有其它结构和使用其它方法 构成的生物传感器也是可以的。图2示出根据本发明另一实施方案的一个这样的生 物传感器24。该生物传感器24是图1中的生物传感器2的变体，其包括生物传感器 2的层4、6、10、12和膜18。然而，该实施方案中的隔离物8包括由其间的沟槽26 所分隔的第一隔离物部分8A和第二隔离物部分8B。当隔离物8夹在工作电极6和 反电极10之间时，该沟槽26限定样品腔14。样品腔14的两个相对侧均暴露。由此， 在生物传感器20中不需要空洞。
某些其它的生物传感器公开在Feldman等的题目为“Small Volume in vitro analyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator”的美国专利6,338,790 中。这些生物传感器中的一些包含多于一个的反电极6。
大量氧化还原酶可用于本发明的传感器。酶在传感器中的一个功能是通过移除 或加入电子来催化酶底物的氧化和还原反应。例如，当带检测的底物或分析物是葡 萄糖时，可利用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸。虽然在酶不存在时葡萄糖 氧化反应是热力学可行的，但是适当的氧化还原酶的存在有助于加速氧化反应，由 此允许更方便地研究酶活性和底物分析。此外，该酶可廉价而方便地得到。
在本发明的一些实施方案中，氧化还原酶选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣 根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、氢氢化酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖脱 氢酶、NADH脱氢酶、肌氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、醇脱氢酶、羟基丁酸脱氢酶、 甘油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、苹果酸氧化酶、半乳 糖氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆碱脱氢酶、 丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、胆红素氧化酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、细胞色素C氧化酶、儿茶酚 氧化酶及其混合物。
标记周期表族的三种常用约定是新IUPAC约定、旧IUPAC约定(也称为欧洲 约定)以及CAS族标记约定(也称为美国约定)。本发明采用CAS约定。在CAS 约定中，IA、IIA、IIIA和IVA族分别指第1族(Li、Na、K等)、第2族(Be、 Mg、Ca等)、第3族(B、Al、Ga等)和第4族(C、Si、Ge等)的主族元素，而 IB、IIb、IIIb、IVAB、VB、VIB、VIIB和VIIIB族指过渡元素。CAS约定下的IA、 IIA、IIIA和IVA族分别等同于旧IUPAC约定下的IA、IIA、IIIB和IVB族，分别 等同于新IUPAC约定下的1、2、13和14族。CAS约定下的IB、IIb、IIIB、IVAB、 VB、VIB、VIIB和VIIIB族分别等同于旧IUPAC约定下的IA、IIA、IIIA、IVA、 VA、VIA、VIIA和VIIIA族，也分别等同于新IUPAC约定下的3、4、5、6、7、 8-10、11和12族。
可使用的纳米颗粒可以是选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的任意无机氧化物。纳米颗粒可具有任 意合适的尺寸和形状，只要其能够提供足够的扩散通道使葡萄糖分子转运至位于氧 化电极表面附近的膜中。此外，用于本发明的纳米颗粒可以是多孔的或无孔的。用 于本发明膜中的无机纳米颗粒的平均尺寸通常为约5nm-约1μm，或约100-约 1000nm，包括约100-约500nm，或约200-约300nm。纳米颗粒的尺寸可根据所需应 用来选择(例如影响上述扩散通道的长度)，或改变用于制备本发明膜的浆墨的粘度 或密度。
适合用于本发明膜的氧化物的实例包括但不限于氧化锂锰、氧化镁、氧化锌、 氧化钴、氧化钇、氧化铌、氧化钙、氧化镧、氧化铈、氧化铝、二氧化硅及其混合 物。
在一些实施方案中，所述膜引入铝、硅、镁或锌的氧化物。本发明人发现将这 种氧化物例如氧化铝或二氧化硅引入所述膜中有利于制备所述膜，并赋予所述膜良 好的机械强度，使得其甚至在长期使用之后也不开裂。
至于二氧化硅颗粒，任意合适种类的二氧化硅颗粒(例如气相二氧化硅或胶体 二氧化硅)可用于本发明。如本文所限定的每一种其它无机氧化物的颗粒一样，二 氧化硅颗粒可基于多种因素如其直径、长径比、平均孔径或形状来选择。这些参数 可选择用来获得纳米颗粒膜中所期望的转移特性。合适颗粒的选择也可取决于沉积 技术的选择。二氧化硅颗粒的尺寸可为约5-约1000nm，或约100-约1000nm，包括 约100-约500nm，或约200-300nm。二氧化硅颗粒可在实验室中合成或得自商品供 应商。例如，胶体二氧化硅(Chemical Abstracts Number 7631-86-9)可商业购自许 多供应商。例如其由Nissan Chemicals以商品名Snowtex出售或由Nyacol Nanotechnologies，Inc.以商品名NYACOL出售。
本发明的纳米膜的厚度为50-1000微米，或100-700微米，或优选250-500微米。 膜厚度可取决于几个因素，例如所需电极尺寸或膜的构成。可以通过选择沉积技术 (仅举几个例子，如丝网印刷、浸涂或旋涂)来控制纳米颗粒材料的含量或墨浆的 浓度。当使用丝网印刷来沉积制备所述膜的墨浆时，可以通过丝网的网目尺寸来控 制膜厚度。
在传感器的又一实施方案中，本发明的纳米颗粒膜还可包含聚合物粘合剂。任 意适合的聚合物粘合剂可用于所述膜中，包括静电惰性聚合物、离聚物、能够获得 净电荷的聚合物、能够提供双连接的聚合物和蛋白质。聚氨酯、纤维素或弹性体聚 合物是静电惰性聚合物的例子。能够获得净电荷从而变成带正电荷或负电荷的聚合 物的例子是含氮杂环如吡啶或咪唑。糖蛋白是一类可用于本发明的蛋白质。具体实 例包括抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白链菌素，其可以与存在于所述膜中的 电化学活化剂结合以形成用于本发明的合适的聚合物粘合剂。有用的粘合剂及其合 成方法例如公开在美国专利No.6,592,745中。
在一个实施方案中，聚合物粘合剂是包含选自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、丙烯 酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼的单体单元和丙烯酸单体单元的聚合物或共聚物。具有选 自上述单体的聚合物粘合剂的具体实例是乙烯基吡啶。衍生自这些单体单元的粘合 剂适合涉及血液样本的葡萄糖传感应用，例如这是因为所述粘合剂的膜内粘合和分 析物调节的双重功能。通过引入粘合剂如乙烯基吡啶至膜中，所述膜在水合时不破 裂，但溶胀形成在丝网印刷的碳表面上容纳各种膜组分的凝胶层。随后，介体、酶 和分析物如葡萄糖可在该层内自由移动，从而使含氧合血红蛋白的红细胞由于静电 排斥不能进入所述膜。阴离子抗坏血酸和尿酸用阴离子粘合剂排除，溶解进入纳米 颗粒膜的溶解氧部分由于该层的亲水特性而被最小化。
本发明还涉及生产非导电纳米颗粒膜的方法。纳米复合材料即包含电化学活化 剂如氧化还原聚合物、酶和纳米颗粒的浆墨可以在商业购得的混合器、混料机和搅 拌机中根据浆料的量、粘度和均匀度来制备。可在能够有利于加工纳米颗粒膜的任 意合适的液体或分散介质例如极性溶剂、水溶液、PBS缓冲液和有机化合物或溶剂 (例如醇)中制备所述浆料。
用于形成浆墨的组分的适当比例可变。例如，所述复合材料可根据应用或所用 的酶或用来沉积浆墨的沉积技术而变化，并且每一组分的用量可凭经验确定。例如， 用于制备葡萄糖传感器膜的浆墨的合适组成包括以下组成范围的组分—葡萄糖氧化 酶：0.10-1.0mg/ml；氧化还原介体：5-50mg/ml；纳米颗粒：10-200mg/ml；粘合剂： 10-300mg/ml。在该实施例中，不需要静置期，而是浆墨可立即使用。然而，对于其 它制剂来说，浆墨可能必须在应用于合适的底物之前静置适当的时间。在另一具体 实施方案中，浆墨可包含葡萄糖氧化酶、聚(VFc-co-AA)、氧化铝纳米颗粒和PVPAC 粘合剂，其以1∶50∶150∶200-1∶40∶200∶300重量份的混合比例来混合。本发明的氧化还 原聚合物加入该混合物中，其中酶、纳米颗粒和水得到均化。之后，将该均匀混合 物应用至任意合适的底物上。可以采用各种沉积技术以在表面上沉积膜，所述沉积 技术包括但不限于喷涂、刷涂、浸涂、旋涂、喷墨印刷和丝网印刷。
如上所提及，浆墨中的氧化还原介体的浓度可以变化，例如从5至50mg/ml。 在采用乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺氧化还原介体的下述一个实施方案中，可将 10-20mg/ml的介体加入浆墨中。在一个实施方案中，纳米复合材料墨中的氧化还原 介体浓度为约15mg/ml。
浆墨中的酶浓度也可变化。典型范围是0.1-1mg/ml。在一个实施方案中，纳米 复合材料墨中的酶浓度为约0.2mg/ml。
纳米复合材料墨的配方可如下变化。由于催化反应发生在介体和酶之间，介体 浓度必须足够高以具有高灵敏度并且使催化氧化电流和葡萄糖浓度之间的关系为线 性。如果限制介体用量，即使样本中的葡萄糖浓度上升，传感器的测量电流响应也 会出现平台。此事发生时，介体量成为瓶颈，并且传感器读数改为依赖于膜中的介 体量，而不是样本中的葡萄糖浓度。对于后述具体实施例来说，发现最优介体浓度 为约15mg/ml，GOX最优浓度为约0.20mg/ml。
本发明还涉及新型二茂铁基氧化还原聚合物，其在其它应用中非常适合用作本 发明葡萄糖传感器中的电化学活化剂并且用于任意以及例如任意其它已知的分析物 电化学检测中。虽然含二茂铁的单体通常很难进行自由基聚合，但是本发明人发现 含二茂铁的氧化还原聚合物可以使用由例如乙醇和水的混合物制备的醇介质与作为 自由基引发剂的过硫酸盐一起来极好且容易地制备。
当任意有机金属氧化还原物质可用作氧化还原介体(例如二茂镍和二茂钴)时， 优选二茂铁基氧化还原介体，例如这是因为来自将二茂铁氧化成二茂铁离子的合 适氧化还原电位。
二茂铁衍生物可被用作均一体系中的扩散电子传递介体。应该注意的是扩散介 体通常分子量低并且可以漏出电极而损失在所测量的样品中。由于该原因，基于扩 散介体的传感器适合作为使用一次而随即丢弃的一次性传感器。
二茂铁衍生物也可用作固定在电极表面上的介体，其随后与蛋白质分子如酶或 抗原结合，所述结合是通过酶和氧化还原聚合物侧链中发现的可交联官能团之间的 交联。
可用作第一单体以形成氧化还原聚合物的合适可聚合二茂铁衍生物应该具有含 不饱和键如C-C双键或三键、或N-N双键或S-S双键的侧链单元。该侧链单元的实 例包括通式R1—C＝C—所示的烯基。双键可位于沿碳链的任意位置处。也可以使用 芳香族基团如苯基、甲苯酰基和萘基。此外，所述可聚合基团还可包含取代的C原 子，其中例如卤素(例如氟、氯、溴或碘)、氧或羟基取代基团碳原子上的一个或多 个氢原子。其它实例包括炔基和二硫基团。
在优选实施方案中，可聚合二茂铁衍生物选自乙烯基-二茂铁、乙炔基-二茂铁、 苯乙烯基-二茂铁和氧化乙烯-二茂铁。
这些衍生物中不饱和键的存在将使二茂铁分子通过与其它也具有至少一个不饱 和C-C双或三键、或N-N双键或S-S双键的物质共聚而连接至聚合物主链。
对于用于与可聚合二茂铁衍生物共聚的第二单体单元来说，可以采用能够获得 净电荷的具有伯酸或伯碱官能团的任意合适的丙烯酸衍生物。这意味着本发明提供 带正电荷和负电荷的聚合物，并因而确保可以形成上述导电双层，而与形成在捕获 分子和分析物分子之间的配位化合物的净电荷无关。一般来说，对于用作单体的合 适丙烯酸衍生物的选择有两个要求。为了使其与二茂铁衍生物共聚，其应该具有至 少一个不饱和键，该不饱和双键例如可通过C-C双或三键、或N-N双键或S-S双键 来提供。第二，该丙烯酸衍生物应该能够通过生成H+离子或接受H+离子而分别执行 bronsted-Lowry酸或碱的功能。可以提供bronsted-Lowry酸或碱功能的官能团实例 包括可以接受H+离子形成带电胺基的伯胺基团，或羧基，或当酸官能团解离释放H+ 离子时可贡献H+离子的硫酸盐。在此，注意到虽然在本发明中优选使用伯胺基团， 但是对于本领域技术人员而言很明显也可使用存在于丙烯酸衍生物中的仲或叔胺基 团，以产生带正电荷的氧化还原聚合物。在此，也应注意尽管酸或碱官能团是一元 的，但是并不需要成为端基，除了在支化侧链可存在于更短的一个侧链“内”的情 况下。
虽然可以使用具有酸或碱官能团的任意合适的丙烯酸衍生物，用作本发明的氧 化还原聚合物中的第二单体的优选单体是通式(I)所示的丙烯酸衍生物：
其中，R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-SO3H和NH-CnH2n-PO3H，其 中烷基链可以是任选取代的，其中n是0-12的整数，优选0-8。因而，烷基可以是直 链或支链烷基，还可包含双或三键、或环状结构如环己基。仅举几个例子，取代基R 之内的合适脂肪族基团有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊 基、己基、环己基或辛基等。脂肪族基团可进一步例如被芳香族基团如苯基、卤素 原子、其它碱基或酸基或O-烷基所取代。可作为取代基而存在的示例性芳香族基团 是苯基、甲苯酰基或萘基。卤素原子可选自氟、氯或溴。合适的O-烷基的例子是甲 氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，而N-烷基选自-NHMe、-N(Me)2、-N(Ethyl)2或 -N(Propyl)2。
如果丙烯酸衍生物单体不可商业购得，则可从丙烯酰胺开始通过亲核取代而制 备，例如通过其末端NH2-基团与具有上述烷基链的酸或碱化合物的适当活化的衍生 物反应而制备。例如，丙烯酰胺可与4-溴丁酸或其酯衍生物反应，得到各种丙烯酰 胺单体。类似过程可用于磺酸或磷酸衍生物。
通常，对于生物样品，pH可以是约6.5-7.5。在该pH范围内，氧化还原聚合物 中的丙烯酰胺单元可获得正电荷，即成为阳离子。该正电荷使聚合物中的二茂铁基 团通过静电作用更为靠近葡萄糖氧化酶的氧化还原中心(此处葡萄糖氧化酶是所选 择的氧化还原酶)，因为葡萄糖氧化酶在该pH范围内是带负电荷的，即阴离子。
在本发明的一个传感器中，氧化还原酶通过交联键共价结合至氧化还原聚合物。 本发明的氧化还原聚合物可与电极表面上的氧化还原酶共固定，使所述酶成为电极 的集成(功能)部分。酶和介体的共固定化可通过用氧化还原介体标记所述酶并随 后将酶固定至电极表面来完成。作为替代方案，氧化还原聚合物可先固定在电极表 面上，接着将所述酶固定至氧化还原聚合物中。也可以将酶和氧化还原聚合一起固 定在由导电聚合物形成的基质中。
在本发明的另一传感器中，氧化还原酶和氧化还原聚合物均可扩散分布在纳米 颗粒膜中，所述纳米颗粒膜包含选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒。
在该传感器中，氧化还原聚合物用作在电极表面和测试样品之间穿梭的扩散介 体。引入氧化还原聚合物的纳米颗粒膜不仅提供电子介导功能，而且提供分析物过 滤功能，以防止电极接触样品中的其它电化学活性材料。膜中的纳米颗粒提供分析 物分子可以扩散进入以到达传感器中氧化电极的微通道。
在本发明传感器的一个实施方案中，式(I)的氧化还原聚合物具有约1000-5000 道尔顿或优选约2000-4000道尔顿的分子量。
在本发明的另一实施方案中，式(I)的氧化还原聚合物的二茂铁负载率为约 2％-17％，或3％-14％。希望具有高二茂铁负载水平，优选至少在3％以上。通常， 低水平的二茂铁负载将限制可测量的葡萄糖浓度。例如，当葡萄糖浓度大大高于存 在的二茂铁分子介导能力时，产生的测量电流响应可受到小量介导二茂铁分子的限 制，导致测量不精确。因此，通过采用具有高二茂铁负载水平的式(I)的氧化还原 聚合物，可用传感器检测的葡萄糖浓度的上限提高，由此只需要更小体积的样品。
本发明还涉及制备水溶性氧化还原聚合物的方法。该方法主要涉及将可聚合二 茂铁衍生物的第一单体单元与包含丙烯酸衍生物如一元、二元或三元丙烯酰胺的第 二单体单元聚合，以产生共聚物。丙烯酸衍生物具有能够获得净电荷的酸或碱官能 团。重要的是，聚合反应在引发剂存在下在醇水溶液介质中进行。
单体和引发剂的加入次序可以改变。例如，可以在醇介质中混合第一和第二单 体，接着加入引发剂引发反应。也可以先将单体之一溶解在醇水溶液介质中，接着 加入引发剂，再将另一单体加入混合物中。
可采用任意有机醇例如脂肪族醇如乙醇、或芳香族醇如苯酚来制备醇介质。常 用体积比为ca 5∶1-1∶1(醇/水)。在一些实施方案中为约3∶1。
在根据本发明的方法的实施方案中，利用含体积比为约2∶1-3∶1的乙醇和水的水 醇溶剂来进行聚合。
虽然可在不加入引发剂的条件下进行聚合，但是希望加入攻击单体中不饱和键 的富电子中心的自由基引发剂。由此，在本发明的另一实施方案中，通过加入自由 基引发剂来引发聚合。
可以使用任意自由基引发剂。实例包括无机盐如过硫酸盐，以及有机化合物如 过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈(AIBN)，其可以产生称作引发剂碎片的自由基碎片， 每个碎片具有一个能够起到自由基作用的未成对电子，其攻击单体单元中的不饱和 键。
在一些实施各方案中，自由基引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸钠。
在本发明的一个实施方案中，所加入的自由基引发剂的重量比为约 20mg-40mg/g单体。本发明人发现自由基引发剂量影响聚合度。高用量的自由基引 发剂明显降低聚合效率，导致氧化还原聚合物具有低分子量。这也意味着与正常的 自由基结合反应相比，在所述聚合过程中需要较少的自由基引发剂。除了所用的自 由基引发剂的用量之外，反应物的加入次序(参见与本发明方法相关的下文)也影 响聚合效率。
可在室温和常压的标准条件下实施根据本发明的方法。然而，为了加速反应， 通常优选使反应混合物回流。还必须注意不要使用过高温度，这会导致聚合物或反 应物分解。由此，适合的上限一般低于100℃。在本方法的优选实施方案中，在约 60-80℃温度下回流进行聚合。
在另一实施方案中，在惰性气氛中回流进行聚合。惰性气氛可以由例如氮气或 氦气或氩气提供。
聚合所需时间长度可取决于所要温度和加入反应混合物中的引发剂的量。通常， 聚合时间为10-40小时，优选约24小时。
本发明方法的一个实施方案还包括在聚合所述第一和第二单体之前产生预反应 混合物，包括：
将丙烯酸衍生物单体单元溶解于水醇介质中；然后
加入自由基引发剂；然后
将可聚合二茂铁衍生物单体单元加入所述混合物中。
在上述方法的另一实施方案中，预反应混合物中的丙烯酸衍生物与可聚合二茂 铁衍生物的进料比优选占所加入单体重量的约5％-15％，以便得到具有合适分子量 和粘度的氧化还原聚合物。
在又一实施方案中，可聚合二茂铁衍生物单体单元在加入反应混合物之前溶解 于水醇介质中。
在本发明方法的实施方案中，氧化还原聚合物沉淀在有机溶剂中。可用来溶解 参与聚合的单体的有机溶剂例如包括醚、酮和醇。
实施例
实施例1：扩散介体生物传感器的构造
图1示出根据本发明一个实施方案的顶端填充生物传感器2的等比例分解图。 根据具体实施方案的生物传感器2的制造方法如下所述。首先，将碳电极阵列如可 得自Acheson Colloids Co.，Ontario，California，U.S.A.的Electrodag 423SS利用合 适的模具印制在聚酯膜衬底上。随后在约70℃的温度下持续干燥所印制衬底一段时 间，例如24小时。之后，将具有适当形成在其中的孔的双面带至于所述印制衬底上。 这些孔将最终限定凹陷14和暴露电极部分20、22的开口。随后利用合适的模具将 相同的纳米颗粒膜丝网印刷在具有PVFcAA(如实施例2所述制备，见下)、GOX、 聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合剂和氧化铝纳米颗粒的水浆“墨”的 碳电极的工作表面上。随后在约37℃于受控环境中干燥所得结构。纳米颗粒膜的厚 度一般可通过调整墨含量、同时保持涂覆在工作区域上的体积恒定而得到控制，例 如通过调节丝网印刷机中丝网的目径或调节纳米颗粒材料的含量或印刷浆料的“浓 度”来操作。
当上述结构形成时，利用合适的模具将Ag/AgCl或碳反电极阵列类似地丝网印 刷在第二聚酯膜上并干燥。接着，将该第二聚酯膜置于胶粘带上，使得反电极与其 对应的工作电极对准。之后，使结构单一化以生产多个生物传感器2，其中之一示于 图1。
实施例2：合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)、聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸) 和聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺-磺酸)共聚物
葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，来自Aspergillus niger，191单位/mg)购自 Fluka(CH-9470Buchs，瑞士)。二茂铁(Fc)、乙烯基二茂铁(VFc)、丙烯酰胺(AA)、 丙烯酸(AC)、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷-磺酸(cat.no.28，273，“丙烯酰胺-磺酸“或 AAS)和过硫酸盐均购自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。所有其它所用的化 学品如丙酮、乙醇和磷酸盐缓冲盐水具有检定的分析级。所用的所有溶液均用去离 子水制备。
实验中生成的聚合物的UV光谱在Agilent 8453UV-可见光谱测光仪上进行和记 录。分子量采用Toyo Soda高效凝胶渗透色谱在水中测定，使用标准聚氧化乙烯和聚 乙二醇来校准。
i)合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酰胺的三个样品。 脱氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用 量为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二 茂铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15 的丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰 胺-引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将 反应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉 淀的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空 干燥纯化产物。
ii)合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三个样品。脱 氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用量 为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二茂 铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15的 丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰胺 -引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将反 应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉淀 的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空干 燥纯化产物。
iii)制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺-磺酸)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三个样品。脱 氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用量 为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二茂 铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15的 丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰胺 -引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将反 应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉淀 的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空干 燥纯化产物。
结果和讨论
乙烯基二茂铁与丙烯酰胺及其衍生物的共聚合反应基于传统自由基聚合反应进 行。一般反应方程式示于图6中。
然而，为了成功共聚所述单体，极为关注体系中乙烯基二茂铁的末端效应。如 在引言部分所述，乙烯基二茂铁通常在共聚合体系中用作自由基清除剂。发现自由 基引发剂的量明显少于正常聚合反应中所需要的量。较高用量的自由基引发剂明显 降低聚合效率和产物的分子量。此外，加入次序也影响聚合效率。
当在乙烯基二茂铁和丙烯酰胺中加入过硫酸盐自由基引发剂时，观察到聚合低 于20％。这可能是因为在反应混合物中形成了二茂铁，其导致阻滞聚合速率并过 早地使聚合物链生长过程终止。如表1所示，在最优条件下，得到较高的产率。
表1乙烯基二茂铁、丙烯酰胺及其衍生物的共聚 进料比(W/W) 产率(％) VFc含量(％) 分子量 AA/VFc 95∶5 80 4％ 3600 AA/VFc 90∶10 72 9％ 3100 AA/VFc 85∶15 56 11％ 2400 AC/VFc 95∶5 75 3％ 2800 AC/VFc 90∶10 55 7％ 2500 AC/VFc 85∶15 45 6％ 2000 AAS/VFc 95∶5 85 6％ 4000 AAS/VFc 90∶10 75 9％ 3500 AAS/VFc 85∶15 62 14％ 3000
然而，聚合物产率随乙烯基二茂铁进料比的增加而下降，这表明自由基聚合中 的末端效应依然存在，即使在聚合过程中已经极为注意也是如此。发现当反应混合 物变蓝时获得微小的产率，这是由于聚合溶液中形成相当大量的二茂铁。二茂铁 负载量在3-14％之间变动，总是小于单体进料中的二茂铁含量。
氧化还原聚合物中二茂铁的负载量由元素分析确定。能量色散X射线分析 (Energy Dispersive X-ray Analysis，EDX)用于该目的。用在所得氧化还原聚合物 样品上的电子束能量为120keV。用锂漂移硅检测器对样品产生的X射线进行分析。
通过凝胶渗透色谱测定氧化还原聚合物的分子量。通常，用较高二茂铁进料比 制备的氧化还原聚合物具有较低的分子量和较宽的分子量分布。
合成的氧化还原聚合物的特征
合成的共聚物为淡黄色的粉末状物质。共聚物的分子量为2000-4000道尔顿。 FT-IR实验(参见图7)清楚示出1650处的乙烯基的吸收完全消失，说明丙烯酰胺和 乙烯基二茂铁成功聚合，所得的氧化还原聚合物具有高纯度，没有单体。其他证据存 在于1000-1300cm-1区域。1126cm-1处伴随一个弱峰的极强吸收说明氧化还原聚合物 中存在二茂铁单元，1218em-1处的强吸收说明聚合物中存在酰胺基团。UV实验也证 实了乙烯基二茂铁和丙烯酰胺之间的成功共聚。300nm处的微小肩峰清楚指示为共 聚物中的二茂铁基团(参见图8)。氧化还原聚合物中具有二茂铁和胺基或羧酸基团 使它们具有双功能：介导电子的氧化还原活性和与蛋白质交联的化学活性。
增加乙烯基二茂铁的进料比倾向于增加氧化还原聚合物中二茂铁基团的比例。 但是，改变乙烯基二茂铁的量也影响聚合物产率。当乙烯基二茂铁进料比最低时获 得最高产率，这和自由基聚合中二茂铁化合物的不寻常行为非常一致。如表1所示， 虽然聚合物中二茂铁基团的含量随乙烯基二茂铁进料比增加而增加，但是远不是线 性的。发现对于生物传感目的来说，10％的乙烯基二茂铁进料比是足够的，其具有 良好的介导功能和良好的经济性。用于聚合的引发剂的量也影响氧化还原聚合物的 组成和产率。发现当引发剂为20-40mg/g单体时获得良好的氧化还原聚合物。
实施例3：得到氧化还原聚合物的循环伏安图
氧化还原聚合物制备在存在0.0μg、10μg GOx和10μg GOx以及10μM葡萄糖 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。
在4.9版general purpose electrochemical system(GPES)管理器的AutoLab potentiostat/galvanostat运行下进行电化学测试。将3-电极系统电池装在法拉第笼中。 所述电极是(Ag/AgCl)参比电极、铂线反电极和Au工作电极(表面面积为7.94mm2)。
与乙烯基二茂铁相比，合成的氧化还原聚合物在水中具有高溶解度，但是不溶 于多数有机溶剂。该特征使得氧化还原聚合物理想地用作生物传感、尤其是酶联生 物传感中的介体，因为多数酶仅在含水介质中有活性。
图9示出在仅含有氧化还原聚合物的PBS中的典型循环伏安图，伏安图表现出 高度可逆的溶液电化学：氧化还原波动中心在～0.18V(与Ag/AgCl相比)，伏安图具 有扩散受限的形状，阴离子和阳离子的峰值电流的幅度相同，峰间电位差为60mV， 与25℃下理论值59mV非常接近。这些氧化还原波动可以归为氧化还原聚合物中二 茂铁基团的氧化和还原，指示聚合物的优异氧化还原活性。伏安分析实验再一次验 证了乙烯基二茂铁成功地与丙烯酰胺及其衍生物共聚，并且聚合物中的二茂铁基团 保留其电活性。氧化还原聚合物的PBS溶液是具有自由扩散行为的真溶液形式。向 该溶液中掺加不同量的葡萄糖并不改变伏安图，说明单独通过氧化还原聚合物不催 化氧化葡萄糖。另外，当在氧化还原聚合物溶液中加入少量的GOx时未观察到明显 变化。所得溶液的电化学实际上与单独的氧化还原聚合物溶液的电化学相同。但是， 当向该溶液中加入10mM葡萄糖时，溶液中进行GOx对葡萄糖的酶促氧化。GOx 中的氧化还原中心FAD转化成FADH2。当电极电位扫描过氧化还原聚合物的氧化还 原电位时，在电极表面附近，氧化还原聚合物中大量的二茂铁基团氧化成二茂铁。 GOx中FAD/FADH2的氧化还原电位是-0.36V(与Ag/AgCl相比)，远低于二茂铁/ 二茂铁电对的氧化还原电位，FADH2附近的二茂铁基团将它氧化回FAD，氧化 还原聚合物中的二茂铁基团还原成原来的二茂铁基团。这两个反应形成催化循环， 如图4所示，或者换句话说，GOx的葡萄糖氧化由氧化还原聚合物介导。
因此，氧化还原聚合物引起的催化反应大大增加含葡萄糖的溶液中的氧化电流， 见图9(浅灰色迹线)。如果FADH2、氧化还原聚合物和电极之间的电子交换都非常 快，则在电化学氧化期间产生大量的二茂铁基团，所述二茂铁基团又快速被 FADH2所消耗。这是与无葡萄糖的溶液中获得的还原电流相比二茂铁基团的还原 电流更低的原因。这些数据表明氧化还原聚合物在酶促反应中有效地作为氧化还原 介体起作用，使电子在酶的氧化还原中心和电极表面之间穿梭。
实施例4：包含与葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)交联的乙烯基二茂铁- 共聚-丙烯酰胺的膜的合成
进行氧化还原聚合物与蛋白质的交联反应，以研究所得膜的电化学特性。在本 实施例中使用酶GOx。选择戊二醛和聚乙二醇二缩水甘油醚(PEG)作为交联剂。 生物级的戊二醛(50％水溶液，产品编号00867-1EA)和聚乙二醇二缩水甘油基醚 (PEGDE)(产品编号03800)得自Sigma-Aldrich。
首先，将从实施例1得到的聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)沉积到金电极上。 用交联剂修饰GOx-BSA，以提供具有脂肪碳链的GOx-BSA，所述脂肪碳链具有末 端醛官能团，其能够提供与固定介体上合适官能团的交联。随后，使修饰的GOx-BSA 沉积，并与固定的引发剂反应。修饰的GOx-BSA上的醛基团与PAA-VFc上的胺基 反应，形成共价交联键。反应进行后，使PAA-VFc-GOx-BSA膜干燥。
将金电极上交联的PAA-VFc-GOx-BSA膜进行伏安分析。使用空白PBS，施加 的电位扫描速率为50mV/s。
图10示出空白PBS中PEG交联的PAA-VFc与金电极上的GOx及BSA的循环 伏安图。如图10所示，正如所期望的，交联膜表现出固定氧化还原电对的高度可逆 的表面(A.J.Bard，L.R.Faulkner，Electrochemical Methods，John Wiley & Sons： New York，2001.)，其用水和PBS彻底洗涤后和在-0.2V至+0.8V之间多次重复电位循 环后几乎没有变化，显示出在金电极上固定有二茂铁膜的高度稳定表面。在＜100mV/s 的低扫描速率下，如预期那样对表现出理想Nernstian行为的表面限定的单电子氧化 还原体系记录明显对称的信号：峰电流与电位扫描速率成比例，峰间电位差远低于 59mV，如在溶液中扩散行为的情况下观察到的(见图9)，半峰高度处电流的宽度为 约90mV。该结果证实：所有的二茂铁氧化还原中心都允许到达电极表面，进行可逆 的异质电子传递。向PBS溶液中加入10mM葡萄糖时，获得典型的催化电化学曲线。 但是，氧化还原聚合物的还原峰消失(图10，灰色迹线)。这意味着传感层通过电子 从还原态GOx向二茂铁基团的传递均匀地维持在还原状态。检测到的快速应答和电 流表明氧化还原聚合物的优异介导功能，生物传感器的高电流灵敏性(750nA/mM 葡萄糖)。
实施例5：制备引入共分散扩散的聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)和葡萄糖氧化 酶的纳米颗粒膜
i)制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)氧化还原聚合物
D-(+)-葡萄糖和葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，来自Aspergillus niger，191单 位/mg)购自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。粒径为10-1000nm的氧化铝纳 米颗粒在室内合成如下。将硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O，88.30g)溶于471ml水中，随 后逐滴加入到由205.9ml浓氢氧化铵溶于411.93ml水中制备的碱溶液中。将所得沉 淀物搅拌并在25℃下陈化过夜，随后离心除去上清液。洗涤之后，将沉淀物洗涤、 干燥并研磨，并在空气中于700℃下煅烧3小时。得到的γ-氧化铝纳米晶体具有从几 十到几百纳米的可控尺寸。
磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(pH7.4)由磷酸盐(0.020M)和氯化钠(0.15M) 制备。聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)、葡萄糖和GOX用PBS缓冲液制备。葡 萄糖贮液允许在使用前进行旋光改变至少24小时。所有溶液均用从Millipor得到的 去离子水制备。用于本实验中的所有其它化学品均具有检定的分析级。
根据以下程序制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)(PVFcAA)氧化还原聚 合物：将0.15g乙烯基二茂铁和1.0g丙烯酰胺溶于10ml水醇(2份乙醇：1份水) 中。为了引发聚合，将0.50ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸铵溶液在脱气之后加入反 应混合物中。冷却后，将氧化还原聚合物在丙酮中沉淀。通过在水中溶解粗产物并在 丙酮/水混合物中沉淀来进行纯化。
ii)合成纳米复合材料膜
利用PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合剂和氧化 铝纳米颗粒的水浆“墨”，将纳米复合材料膜丝网印刷至碳条上。该水浆墨通过将以 上制备的PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)或聚(乙烯基 吡啶-共聚-丙烯酰胺-磺酸)(PVPPAS)粘合剂和氧化铝纳米颗粒根据以下浓度范围 混入水中而制备所述水浆墨：葡萄糖氧化酶：0.20-0.50mg/ml，介体：10-20mg/ml， 纳米颗粒：30-100mg/ml，PVPPAC或PVPPAS粘合剂：40-150mg/ml。所述浆墨可 储存或立即使用。当希望以膜层涂覆传感器电极时，将所述浆墨装入沉积装置如丝网 印刷机中，并且沉积在电极上以形成膜。在组装成传感器之前，首先使所述膜干燥。
实施例6：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介体和 葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的循环伏安法分析
在本实施例中，利用实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电极 和Ag/AgCl参比电极组装。所述传感器性能利用循环伏安法来分析。使用CHI 660A 型电化学工作站(CH Instruments，Austin，USA)在室温下进行所有电化学测量。使 用传统三电极系统进行循环伏安测量，所述三电极系统由丝网印刷碳工作电极、微 型Ag/AgCl参比电极(Cypress Systems，Lawrence，KS，USA)和铂线反电极组成。 为了避免印刷墨扩散分布至2mm直径工作区域之外，将图案化的憎水膜涂覆至碳电 极。为了避免电极结垢和墨中可能的浓度改变，对每次伏安测量试验使用新鲜的电 极和墨。所有葡萄糖测量均在PBS溶液中进行。在pH变化的实验中，使用1.0M HCL和1.0M NaOH溶液来调节PBS缓冲液的pH。在电流分析实验中，工作电极平衡在 0.30V处(与Ag/AgCl相比)。
结果和讨论
平面纳米复合材料墨中的PVFcAA介体的典型循环伏安图示于图12中。电极表 现出扩散受控动力学的快速氧化还原电对的典型特征。峰值电流随电位扫描速率的 平方根而线性增加，对于最大200mV/s的扫描速率，还原和氧化峰值电位差保持为 59mV不变，这表明从介体至电极的电荷转移迅速。用葡萄糖强化该墨并未改变伏安 图，这提示不存在单独通过介体的葡萄糖催化氧化。此外，在存在0.10-20mg/ml的 不同GOX量时得到实际相同的伏安图，如图12a所示，这表明酶并不显著影响墨中 的Fc+/Fc氧化还原对的电化学。然而，向该墨中加入极少量的葡萄糖，导致阴极电 流增强和阳极电流减小(图12b)。此外，如图12b中所可见，伏安图在介体的氧化 还原电位附近，朝阴极侧上升。该变化暗示典型的化学偶联电极过程(电催化)。该 电催化可通过以下反应方程式描述：
葡萄糖+GOX-FAD+2H+→葡萄糖内酯+GOX-FADH2 (1)
GOX-FADH2+2Fc+→GOX-FAD+2Fc+2H+ (2)
Fc→Fc++e- (3)
由此，GOX-FAD通过渗入膜的葡萄糖还原成GOX-FADH2(方程式1)，电子 从GOX-FADH2传递至Fc+位置(方程式2)，随后电子经过聚合物介体的Fc+/Fc位 置传递至电极表面(方程式3)。电极下方处二茂铁的氧化是图12b所示阴极电流增 强的原因。
Fc和GOX之间的催化反应速率常数k可从存在大大过量的葡萄糖以确保酶被 完全还原时得到的伏安测量数据来估计。该条件下，GOX和Fc之间的反应(方程 式2)实际上是拟一级的。如Nicholson和Shain以及Liaudet与其同事们所显示的， 由于Fc和GOX之间的介导氧化还原过程引起的限制电流IL可描述如下：
IL＝nFACFc(2DFckCGOX)1/2 (4)
其中CFc和CGOX分别是Fc和GOX的浓度。DFc是Fc的扩散系数，其它符号 具有其常用意义。如方程式4所预期的，在足够低的电位扫描速率下，限制电流与 电位扫描速率无关，并且与Fc浓度和GOX浓度的平方根成比例。这些观察结果证 明使用方程式4确定介导葡萄糖氧化的速率常数的正当性。结合方程式4和以线性 扫描伏安测量表达的峰值电流ip，得到iL/ip关系如下：
IL/iP＝(2kCGOD)1/2/[0.4463(nFv/RT)1/2] (5)
该方程式包含任意确定的经验参数并很好地适用于确定速率常数的目的，这是因为 Fc/Fc+对的电极过程仅由扩散控制。根据在慢扫描速率＜5.0mV/s下，在含有0.50mM 的Fc、60mM葡萄糖和0-30μM的GOX的溶液中得到数据估计速率常数为约3.8× 103l/s mol。该速率常数表明PVFcAA有效介导GOX的氧化，是连接葡萄糖酶氧化 与电极表面的优异介体。本工作得到的速率常数明显大于之前报导的其它二茂铁衍 生物-GOX体系的速率常数。可能的原因是pH7.4下在氧化还原聚合物中存在阳离 子丙烯酰胺单元，由于GOX在该pH下是阴离子，因此其使Fc基团通过静电相互 作用而更加接近GOX的氧化还原中心。
实施例7：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介体和 葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的电流测量响应
在本实施例中，利用如实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电 极和Ag/AgCl参比电极组装。葡萄糖在生物传感器的空气饱和PBS缓冲液中的典型 电流测量响应如图13a所示。电流测量测试示出生物传感器具有对葡萄糖的快速响 应时间和高灵敏度。在0.30V处，在强化葡萄糖浓度之后，氧化电流增大并在5秒内 非常快速地达到最大值，之后是保持60％以上的峰值电流持续20s的逐步瞬态。在 相同实验条件下，在空白PBS缓冲液中没有观察到催化氧化电流(图13b)，但是纳 米颗粒膜的存在增大背景电流并经过相当长时间才下降至微小水平。
为了获得满意性能的生物传感器，优化纳米复合材料墨的配方。因为催化反应 发生在介体和GOX之间，由此介体浓度必须足够高以具有高灵敏度和催化氧化电流 与葡萄糖浓度之间的线性关系。否则，介导葡萄糖氧化的部分将非常小并取决于膜 中的介体量，而不是葡萄糖浓度。既考虑灵敏度又考虑生物传感器的经济性，发现 为此目的的最佳介体浓度为15mg/ml，并且最优GOX浓度发现是0.20mg/ml(图14a 和14b)。希望平衡电位影响生物传感器的电流测量响应；因此平衡电位检测处于 0.0-0.70V。如图13c所示，随着平衡电位上升并到达0.30V的平台，电流灵敏度增加。 当平衡电位变得大于0.50V时，观察到微小的灵敏度下降，可能是由于背景电流增大 所致。此外，过高的平衡电位消弱葡萄糖测量的精确性，这是因为来自大大增加的 背景电流和电极下大量电活性物质可能直接氧化的复杂性。因此，对于葡萄糖的电 流分析测量，生物传感器的电位平衡在0.30V。
也研究了葡萄糖的催化氧化电流对纳米颗粒膜厚度的依赖性(图14d)。如图14d 所示，对于厚度为250-500μm的纳米颗粒膜，催化氧化电流达到最大值。更薄的膜 中材料不足导致较低的灵敏度和电流峰值的消失。相反，纳米颗粒膜膜厚进一步增 加超过500μm将不利地影响膜对葡萄糖和GOX催化反应产物的通透性。而且，注 意到膜越厚则响应时间越长。
与使用表面固定传感膜不同，使用非导电纳米颗粒传感膜在灵敏度方面提供优 于已知一次性葡萄糖生物传感器的优点。在前者的系统中，传感膜是电极的一部分 并且直接接触血液样本。血液中的某些成分例如血细胞包括红细胞和白细胞、蛋白 质和抗坏血酸可与传感膜相互反应，抵消血糖测量的精确性。本工作中，纳米颗粒 膜是非导电性的，因此在结构和功能上都不是电极的一部分。葡萄糖的催化氧化仅 仅发生在电极/纳米颗粒膜的界面上。换言之，电活性物质只有穿过纳米颗粒膜到达 该界面时才与电极交换电子。因此，纳米颗粒膜提供阻断血液中的大量物质如细胞 和蛋白质可能干扰的屏障。当该配方用于印制纳米颗粒膜时，PVPAC粘合剂在传感 膜中发挥双重作用：粘合和分析物调节。当再水合时，膜不破裂，但是溶胀在丝网 印刷碳表面上形成凝胶层。反应物，如葡萄糖和介体在该层内自由移动，而干扰物 质如含有氧合血红蛋白的红细胞被排除在外。阴离子抗坏血酸和尿酸被阴离子PVAC 聚合物排斥，并且部分溶解在纳米颗粒膜中的氧由于该层的高亲水特征而大大减少。 这得到传感膜，由此响应给定葡萄糖浓度而产生的电流量在40-60％血球比率以上和 存在0.20mM抗坏血酸和0.10mM尿酸的情况下变化小于5.0％。这种对血液中干扰 成分的所期望不敏感性在全血样本中观察到。此外，纳米颗粒膜还存在葡萄糖分析 物调节层，明显减缓葡萄糖的运输，使得体系不再动力学可控，由此使线性区域延 伸遍布整个生理相关葡萄糖浓度范围40-540mg/dl。
如前所述，氧影响葡萄糖生物传感器的灵敏度，因为溶解氧氧化葡萄糖作为副 反应同时发生。对采用憎水的聚乙烯基吡啶(PVP)粘合剂的薄纳米颗粒薄膜的初始 电流分析测试表明不存在氧时的响应高于具有溶解氧时的响应。在低葡萄糖浓度例 如50mg/dl下，与氧的竞争引起峰值电流的显著下降(～20％)。因此，需要抑制系 统中的氧干扰，以获得高选择性和精确的生物传感器。在憎水的PVP中引入丙烯酸 单元导致生物传感器性能明显改进。所得纳米颗粒膜高度亲水，这改善葡萄糖/氧的 渗透比并优化生物传感器响应的精确性和线性。对于以氮气(图15a)和氧气(15b) 鼓泡的200mg/dl葡萄糖溶液的两张电流分析图重叠良好，峰值电流差小于5％，表 明生物传感器对样本中的氧含量非常不敏感。
实施例8：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺) 介体和葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的特征分析
在本实施例中，利用如实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电 极和Ag/AgCl参比电极组装。对≤600mg/dl的葡萄糖浓度，峰值电流的灵敏度为～ 76nA/mg/dl。如图16所示，催化氧化电流直接与最高600mg/dl的葡萄糖浓度成比例， 覆盖整个生理相关的血糖水平。有趣的是，峰值电流之后的任意时间点所得电流也 与葡萄糖浓度成线性关系(见图16b)，提供在电流分析测试的前20秒内作为替代方 案的取样可能性。从40和300mg/dl的葡萄糖溶液的两组20次反复测量来估计准确 性。相对标准偏差分别为4.0％和8.6％。在最优条件下对5.0mg/dl葡萄糖反复测量 的标准偏差的3倍估计得到的检测极限发现为1.8mg/dl，其受生物传感器的充电电流 限制。更重要的是单次测试所需血液样本体积为约0.20-0.30μl，是市场上所有一次性 葡萄糖生物传感器中的最小样本体积。在不同温度下进行稳定性测试。结果表明生 物传感器在室温下储存的前180天保持了100％的最初灵敏度，暴露在50℃下60分 钟后损失其最初灵敏度的10％，60℃下60分钟后损失最初灵敏度的约50％。这可 能是由于生物传感器中酶活性损失所造成的。所提出的方法成功应用于全血中的葡 萄糖测定。
表2.血糖分析结果(10次测试的平均值) 样品 葡萄糖 参考值 收回率(％) (+50mg/dl葡萄糖) 全血1 (健康人) 80 84 96.3 全血2 (健康人) 110 115 99.2 全血3 105 105 104
(健康人) 全血4 (糖尿病患者) 185 179 98.5 全血5 (糖尿病患者) 155 158 97.1
*得自YSI血糖分析仪。
得到的结果与使用yellow springs血糖仪(YSI 2300型)得到的参考值一致性良 好。所得收回率足够进行实际应用。
已经通过乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的传统自由基聚合制备一系列水 溶性和可交联二茂铁基氧化还原聚合物。所得氧化还原聚合物在GOX存在时产生对 于葡萄糖的典型催化氧化电流。本实验结果表明在氧化还原聚合物和GOx引入PBS 中之后，氧化还原聚合物保留快速电子传递特性并且GOx保留其催化活性。具有作 为侧链之一的胺或羧酸基团的氧化还原聚合物允许其方便地与蛋白质交联，所述蛋 白质例如是酶和抗体和抗原。交联氧化还原聚合物膜的电化学测试表明对氧化溶液 中底物的优异催化活性、高灵敏度、良好的再现性和稳定性，因此指示其适合用作 生物传感器中的传感膜。
在单独实验中，还表明葡萄糖氧化酶和PVFcAA可与憎水PVPAA粘合剂一起 容易而均匀地分散在纳米颗粒氧化铝中，并且所得膜产生对于葡萄糖的典型催化氧 化电流。实验结果表明在将介体和GOX丝网印刷在碳电极上之后，介体保留其快速 电子传递性质，GOX保留其催化活性。其还表明生物传感器对利用少至0.20μl的血 液样本体积进行血糖监测具有良好的灵敏度和稳定性。丝网印刷技术在制造生物传 感器中的用途使得可以容易和低成本地大量生产。这些生物传感器特征对于开发高 市场价值的微型葡萄糖生物传感器是有前途的。
本发明氧化还原聚合物中的二茂铁中心能够提供局部电活性，因而能够用于氧 化还原反应而不带来聚合物中分子内键的重组。此外，本发明的氧化还原聚合物包 含具有功能基团的侧链，其有利于与其它具有合适官能团的分子交联。这还允许该 聚合物连接至大量的分子。组合这两个特征，这些聚合物很好地适用于需要电子介 导的应用，如用于生物传感器和生物燃料电池中的酶电极，以及在电子酶反应器中 进行的酶合成。
在另一方面中，根据本发明的葡萄糖传感器引入能够精确测量以极小量存在的 流体中的葡萄糖浓度的传感元件，因而只需要小于1μL或优选约0.2μL-0.3μL的测 试样品。测试样品通常包括动物生物样本如生物流体(例如血液样本、汗液样本、 尿液样本)；排泄物样本和含有脂肪组织或皮下脂肪的新鲜样本。可以利用本传感器 分析的其它样品包括用于科学实验的试剂或含有葡萄糖的食物和用于葡萄酒或啤酒 生产工业中的发酵液体培养基。试验样品也可包括微生物培养基(例如用于大肠杆 菌、酵母或其它宿主生物高密度发酵的生长培养基，通常用于多肽的重组生产)。
由于进行诊断测试需要的是小量测试样品，因此使得对终端用户带来的不便最 小。例如，对于需要连续葡萄糖评估的糖尿病人来说，抽取次微升水平的血液样本 将给患者带来最小的疼痛和不便。
一般来说，本发明的传感器利用本文中所详述的纳米颗粒膜。除了适合以亚微 升水平测试血液样本之外，该膜还具有可低成本制造和甚至在保存期延长的条件下 稳定的优点。
该膜可引入电化学活化剂和底物特异酶，二者均扩散分布在沉积于氧化葡萄糖 的传感器电极上的膜中。此处使用的术语“电化学活化剂”是指能够使葡萄糖和传 感器的工作(检测)电极之间传递电子的酶活化的任意化合物。电化学活化剂可以 是聚合物氧化还原介体。作为替代方案，也可以使用单体的电化学活化剂，如水溶 性二茂铁衍生物、锇-二吡啶配位化合物、钌配位化合物(例如五胺吡啶钌和 Ru(NH3)6 3+)以及六氰合铁酸盐和六氰合钌酸盐。在本发明的一些实施方案中，电化 学活化剂含具有氧化还原活性的金属离子。该金属离子的例子是银、金、铜、镍、 铁、钴、锇或钌离子或其混合物。
一般来说，引入本发明纳米颗粒膜中的合适氧化还原介体应该具有防止或实质 性减少氧化还原物质在样品被分析期间的扩散损失的化学结构。氧化还原介体的扩 散损失可以通过使聚合物氧化还原介体不可从传感器的工作电极上释放来减少。这 可以通过结合或固定氧化还原介体例如将氧化还原介体通过共价结合或双共轭结合 至电极上的聚合物而实现。作为替代方案，氧化还原介体可以通过提供具有反电荷 物质或对氧化还原介体具有高亲和力的物质的粘合剂来固定。在本发明的一个实施 方案中，一种非可释放的聚合物氧化还原介体包含共价连接至聚合物的氧化还原物 质。该氧化还原聚合物通常是过渡金属化合物，其中具有氧化还原活性的过渡金属 基侧基共价结合至合适的聚合物骨架上，所述骨架自身可以具有或不具有电活性。 该类实例是聚(乙烯基二茂铁)和聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)。作为替代方 案，聚合物氧化还原介体可包含离子结合的氧化还原物质。通常，这些介体包括偶 联至带有相反电荷的氧化还原物质上的带电聚合物。此类实例包括带负电荷的聚合 物如Nafion(Dupont)，其偶联至带正电荷的氧化还原物质如锇或钌聚吡啶阳离子； 或者相反，带正电荷的聚合物如聚(1-乙烯基咪唑)偶联至带负电荷的氧化还原物质 如铁氰化物或亚铁氰化物。此外，氧化还原物质还可以配位结合至聚合物。例如， 氧化还原介体可以通过锇或钴2，2’-二吡啶基配位化合物与聚(1-乙烯基咪唑)或聚 (4-乙烯基吡啶)的配位结合而形成。另一实例是聚(4-乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺) 与锇4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶基配位化合物配位。有用的氧化还原介体及其合成方法 描述于美国专利No.5,264,104；5,356,786；5,262,035；5,320,725；6,336,790；6,551,494 和6,576,101。
在本发明另一实施方案中，电化学活化剂选自下文中详细描述的新一类氧化还 原聚合物。简而言之，该新一类氧化还原聚合物包括聚(乙烯基二茂铁)、聚(乙烯 基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂铁) -共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸以及聚(乙烯基二茂铁)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸， 其中n为0-12的整数，优选0-8。
本发明的膜也可引入氧化还原聚合物，该聚合物与蛋白质如酶或抗原交联，并 固定在电极表面。
传感器的一个实施方案包含容纳测试样品的腔，由此该腔至少结合在工作电极 的工作区域与参比电极的工作区域之间。同样在该实施方案中，氧化还原酶和水溶 性氧化还原聚合物涂布在工作电极的工作区域上。
参考附图，本发明的传感器描述如下。图1示出根据本发明一个实施方案的顶 部填充的生物传感器2的等比例分解图。生物传感器2包括由几层构成的堆叠体。 根据图1和2从下往上，该堆叠体包括衬底层4、工作电极6、隔离物8、反电极10 和顶层12。隔离物8隔离工作电极6和反电极10，从而使它们电绝缘。形成在隔离 物8的分叉末端的两腿之间的凹槽14限定工作电极6和反电极10之间的样品腔14 (参见图2A)。由此方式，样品腔14通过反电极10和工作电极6各自相对面对面的 表面而结合或限定在顶部和底部，以及通过隔离物8的侧壁结合或限定在两侧。样 品腔14一侧暴露，如图2所示。工作电极6的该表面称作工作表面。传感化学材料 载体，如纳米复合材料膜18设置在样品腔14中。该膜18与工作电极6物理接触。 传感化学材料优选包括电子转移剂、如可扩散氧化还原介体(未能示出)。氧化还原 介体和其它传感化学材料将在以下详述。空洞16形成在顶层12中，并穿过反电极 到达样品腔14。衬底4和顶层12凹陷，使得工作电极6和反电极10的部位20和 22(图2B)依然暴露，从而其可相互连接以形成电路。
样品腔14的配置或成形使得当样品或分析物提供在腔14中时，分析物与工作 电极6和反电极10电解接触。这种电解接触允许氧化还原介体介导的电流在电极6、 10之间流动，以实现分析物的电解作用(电致氧化或电致还原)。氧化还原介体使可 能不适合在工作电极6上直接进行电化学反应的分析物分子的电化学分析成为可能。 样品腔14的容积可以是0.1-1μl，但是其它容积也是可以的。称为测量区的样品腔14 的区域仅含有在分析物分析期间被探询的部分分析物。在图1的生物传感器2中， 测量区容积近似等于样品腔14的容积。然而，应该注意更小的测量区例如样品腔14 的尺寸的80％或90％也是可以的。
由隔离物8的厚度所限定的样品腔14的高度优选小，以促进分析物的快速电解， 这是因为对于给定分析物体积将有更多的分析物与电极6和10的表面接触。此外， 高度小的样品腔14有助于减少分析物分析期间分析物从样品腔14的其它部分扩散 到更小测量区而带来的误差，因为扩散时间比测量时间要长。通常，样品腔的厚度 不大于约0.2mm。优选样品腔的厚度不大于约0.1mm，更优选样品腔的厚度为约 0.05mm或更小。
衬底4和顶层12可由惰性非导电材料如聚酯形成。作为替代方案，衬底4和顶 层12可由模制碳纤维复合材料形成。工作电极6优选具有较低电阻，并且通常在运 行期间在生物传感器电位范围内是电解惰性的。用于形成工作电极6的合适材料包 括金、碳、铂、二氧化钌、钯和导电环氧树脂，例如ECCOCOAT CT5079-3碳填充 导电环氧树脂涂料(可得自W.R.Grace Company，Woburn，Mass.)，以及本领域技 术人员已知的其它非腐蚀材料。反电极10也可使用适合形成工作电极6的上述任意 材料来形成。工作电极6和反电极10可通过任意合适的方例如通过气相沉积或印刷 而沉积在衬底4和顶层12的表面。
隔离物8通常由惰性非导电材料如压敏胶粘剂、聚酯、Mylar、kevlar或任意 其它强力聚合物薄膜构成，或者作为替代方案，由根据其化学惰性而选择的聚合物 薄膜如Teflon膜构成。其它隔离物包括胶粘剂层或双面胶粘带(例如在膜反面具有 胶粘剂的载体膜)。
在一个具体的实施方案中，衬底4和顶层12是聚酯膜，工作电极6是丝网印刷 的碳层，反电极10是丝网印刷的Ag/AgCl层，隔离物8是双面胶粘带。
生物传感器2使用期间，样品腔14的暴露侧用于接触分析物如血液或血清。其 中具有纳米复合材料膜18的样品腔14通过芯吸或毛细作用接收用于分析的分析物。 根据氧化还原介体的类型，可扩散的氧化还原介体可快速扩散入分析物，或扩散发 生在一段时间内。类似地，膜18中的可扩散氧化还原介体可首先溶解，随后扩散进 入分析物，或快速或经过一段时间。如果氧化还原介体扩散经过一段时间，则可指 示用户在测量分析物浓度前等待一段时间，以允许氧化还原介体扩散。
不应认为生物传感器的结构和构造受上述限制；具有其它结构和使用其它方法 构成的生物传感器也是可以的。图2示出根据本发明另一实施方案的一个这样的生 物传感器24。该生物传感器24是图1中的生物传感器2的变体，其包括生物传感器 2的层4、6、10、12和膜18。然而，该实施方案中的隔离物8包括由其间的沟槽26 所分隔的第一隔离物部分8A和第二隔离物部分8B。当隔离物8夹在工作电极6和 反电极10之间时，该沟槽26限定样品腔14。样品腔14的两个相对侧均暴露。由此， 在生物传感器20中不需要空洞。
某些其它的生物传感器公开在Feldman等的题目为“Small Volume in vitro analyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator”的美国专利6,338,790 中。这些生物传感器中的一些包含多于一个的反电极6。
大量氧化还原酶可用于本发明的传感器。酶在传感器中的一个功能是通过移除 或加入电子来催化酶底物的氧化和还原反应。例如，当带检测的底物或分析物是葡 萄糖时，可利用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸。虽然在酶不存在时葡萄糖 氧化反应是热力学可行的，但是适当的氧化还原酶的存在有助于加速氧化反应，由 此允许更方便地研究酶活性和底物分析。此外，该酶可廉价而方便地得到。
在本发明的一些实施方案中，氧化还原酶选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣 根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、氢氢化酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖脱 氢酶、NADH脱氢酶、肌氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、醇脱氢酶、羟基丁酸脱氢酶、 甘油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、半乳糖脱氢酶、苹果酸氧化酶、半乳 糖氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆碱脱氢酶、 丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、胆红素氧化酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、细胞色素C氧化酶、儿茶酚 氧化酶及其混合物。
标记周期表族的三种常用约定是新IUPAC约定、旧IUPAC约定(也称为欧洲 约定)以及CAS族标记约定(也称为美国约定)。本发明采用CAS约定。在CAS 约定中，IA、IIA、IIIA和IVA族分别指第1族(Li、Na、K等)、第2族(Be、 Mg、Ca等)、第3族(B、Al、Ga等)和第4族(C、Si、Ge等)的主族元素，而 IB、IIb、IIIb、IVAB、VB、VIB、VIIB和VIIIB族指过渡元素。CAS约定下的IA、 IIA、IIIA和IVA族分别等同于旧IUPAC约定下的IA、IIA、IIIB和IVB族，分别 等同于新IUPAC约定下的1、2、13和14族。CAS约定下的IB、IIb、IIIB、IVAB、 VB、VIB、VIIB和VIIIB族分别等同于旧IUPAC约定下的IA、IIA、IIIA、IVA、 VA、VIA、VIIA和VIIIA族，也分别等同于新IUPAC约定下的3、4、5、6、7、 8-10、11和12族。
可使用的纳米颗粒可以是选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的任意无机氧化物。纳米颗粒可具有任 意合适的尺寸和形状，只要其能够提供足够的扩散通道使葡萄糖分子转运至位于氧 化电极表面附近的膜中。此外，用于本发明的纳米颗粒可以是多孔的或无孔的。用 于本发明膜中的无机纳米颗粒的平均尺寸通常为约5nm-约1μm，或约100-约 1000nm，包括约100-约500nm，或约200-约300nm。纳米颗粒的尺寸可根据所需应 用来选择(例如影响上述扩散通道的长度)，或改变用于制备本发明膜的浆墨的粘度 或密度。
适合用于本发明膜的氧化物的实例包括但不限于氧化锂锰、氧化镁、氧化锌、 氧化钴、氧化钇、氧化铌、氧化钙、氧化镧、氧化铈、氧化铝、二氧化硅及其混合 物。
在一些实施方案中，所述膜引入铝、硅、镁或锌的氧化物。本发明人发现将这 种氧化物例如氧化铝或二氧化硅引入所述膜中有利于制备所述膜，并赋予所述膜良 好的机械强度，使得其甚至在长期使用之后也不开裂。
至于二氧化硅颗粒，任意合适种类的二氧化硅颗粒(例如气相二氧化硅或胶体 二氧化硅)可用于本发明。如本文所限定的每一种其它无机氧化物的颗粒一样，二 氧化硅颗粒可基于多种因素如其直径、长径比、平均孔径或形状来选择。这些参数 可选择用来获得纳米颗粒膜中所期望的转移特性。合适颗粒的选择也可取决于沉积 技术的选择。二氧化硅颗粒的尺寸可为约5-约1000nm，或约100-约1000nm，包括 约100-约500nm，或约200-300nm。二氧化硅颗粒可在实验室中合成或得自商品供 应商。例如，胶体二氧化硅(Chemical Abstracts Number 7631-86-9)可商业购自许 多供应商。例如其由Nissan Chemicals以商品名Snowtex出售或由Nyacol Nanotechnologies，Inc.以商品名NYACOL出售。
本发明的纳米膜的厚度为50-1000微米，或100-700微米，或优选250-500微米。 膜厚度可取决于几个因素，例如所需电极尺寸或膜的构成。可以通过选择沉积技术 (仅举几个例子，如丝网印刷、浸涂或旋涂)来控制纳米颗粒材料的含量或墨浆的 浓度。当使用丝网印刷来沉积制备所述膜的墨浆时，可以通过丝网的网目尺寸来控 制膜厚度。
在传感器的又一实施方案中，本发明的纳米颗粒膜还可包含聚合物粘合剂。任 意适合的聚合物粘合剂可用于所述膜中，包括静电惰性聚合物、离聚物、能够获得 净电荷的聚合物、能够提供双连接的聚合物和蛋白质。聚氨酯、纤维素或弹性体聚 合物是静电惰性聚合物的例子。能够获得净电荷从而变成带正电荷或负电荷的聚合 物的例子是含氮杂环如吡啶或咪唑。糖蛋白是一类可用于本发明的蛋白质。具体实 例包括抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白链菌素，其可以与存在于所述膜中的 电化学活化剂结合以形成用于本发明的合适的聚合物粘合剂。有用的粘合剂及其合 成方法例如公开在美国专利No.6,592,745中。
在一个实施方案中，聚合物粘合剂是包含选自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、丙烯 酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼的单体单元和丙烯酸单体单元的聚合物或共聚物。具有选 自上述单体的聚合物粘合剂的具体实例是乙烯基吡啶。衍生自这些单体单元的粘合 剂适合涉及血液样本的葡萄糖传感应用，例如这是因为所述粘合剂的膜内粘合和分 析物调节的双重功能。通过引入粘合剂如乙烯基吡啶至膜中，所述膜在水合时不破 裂，但溶胀形成在丝网印刷的碳表面上容纳各种膜组分的凝胶层。随后，介体、酶 和分析物如葡萄糖可在该层内自由移动，从而使含氧合血红蛋白的红细胞由于静电 排斥不能进入所述膜。阴离子抗坏血酸和尿酸用阴离子粘合剂排除，溶解进入纳米 颗粒膜的溶解氧部分由于该层的亲水特性而被最小化。
本发明还涉及生产非导电纳米颗粒膜的方法。纳米复合材料即包含电化学活化 剂如氧化还原聚合物、酶和纳米颗粒的浆墨可以在商业购得的混合器、混料机和搅 拌机中根据浆料的量、粘度和均匀度来制备。可在能够有利于加工纳米颗粒膜的任 意合适的液体或分散介质例如极性溶剂、水溶液、PBS缓冲液和有机化合物或溶剂 (例如醇)中制备所述浆料。
用于形成浆墨的组分的适当比例可变。例如，所述复合材料可根据应用或所用 的酶或用来沉积浆墨的沉积技术而变化，并且每一组分的用量可凭经验确定。例如， 用于制备葡萄糖传感器膜的浆墨的合适组成包括以下组成范围的组分—葡萄糖氧化 酶：0.10-1.0mg/ml；氧化还原介体：5-50mg/ml；纳米颗粒：10-200mg/ml；粘合剂： 10-300mg/ml。在该实施例中，不需要静置期，而是浆墨可立即使用。然而，对于其 它制剂来说，浆墨可能必须在应用于合适的底物之前静置适当的时间。在另一具体 实施方案中，浆墨可包含葡萄糖氧化酶、聚(VFc-co-AA)、氧化铝纳米颗粒和PVPAC 粘合剂，其以1∶50∶150∶200-1∶40∶200∶300重量份的混合比例来混合。本发明的氧化还 原聚合物加入该混合物中，其中酶、纳米颗粒和水得到均化。之后，将该均匀混合 物应用至任意合适的底物上。可以采用各种沉积技术以在表面上沉积膜，所述沉积 技术包括但不限于喷涂、刷涂、浸涂、旋涂、喷墨印刷和丝网印刷。
如上所提及，浆墨中的氧化还原介体的浓度可以变化，例如从5至50mg/ml。 在采用乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺氧化还原介体的下述一个实施方案中，可将 10-20mg/ml的介体加入浆墨中。在一个实施方案中，纳米复合材料墨中的氧化还原 介体浓度为约15mg/ml。
浆墨中的酶浓度也可变化。典型范围是0.1-1mg/ml。在一个实施方案中，纳米 复合材料墨中的酶浓度为约0.2mg/ml。
纳米复合材料墨的配方可如下变化。由于催化反应发生在介体和酶之间，介体 浓度必须足够高以具有高灵敏度并且使催化氧化电流和葡萄糖浓度之间的关系为线 性。如果限制介体用量，即使样本中的葡萄糖浓度上升，传感器的测量电流响应也 会出现平台。此事发生时，介体量成为瓶颈，并且传感器读数改为依赖于膜中的介 体量，而不是样本中的葡萄糖浓度。对于后述具体实施例来说，发现最优介体浓度 为约15mg/ml，GOX最优浓度为约0.20mg/ml。
本发明还涉及新型二茂铁基氧化还原聚合物，其在其它应用中非常适合用作本 发明葡萄糖传感器中的电化学活化剂并且用于任意以及例如任意其它已知的分析物 电化学检测中。虽然含二茂铁的单体通常很难进行自由基聚合，但是本发明人发现 含二茂铁的氧化还原聚合物可以使用由例如乙醇和水的混合物制备的醇介质与作为 自由基引发剂的过硫酸盐一起来极好且容易地制备。
当任意有机金属氧化还原物质可用作氧化还原介体(例如二茂镍和二茂钴)时， 优选二茂铁基氧化还原介体，例如这是因为来自将二茂铁氧化成二茂铁离子的合 适氧化还原电位。
二茂铁衍生物可被用作均一体系中的扩散电子传递介体。应该注意的是扩散介 体通常分子量低并且可以漏出电极而损失在所测量的样品中。由于该原因，基于扩 散介体的传感器适合作为使用一次而随即丢弃的一次性传感器。
二茂铁衍生物也可用作固定在电极表面上的介体，其随后与蛋白质分子如酶或 抗原结合，所述结合是通过酶和氧化还原聚合物侧链中发现的可交联官能团之间的 交联。
可用作第一单体以形成氧化还原聚合物的合适可聚合二茂铁衍生物应该具有含 不饱和键如C-C双键或三键、或N-N双键或S-S双键的侧链单元。该侧链单元的实 例包括通式R1—C＝C—所示的烯基。双键可位于沿碳链的任意位置处。也可以使用 芳香族基团如苯基、甲苯酰基和萘基。此外，所述可聚合基团还可包含取代的C原 子，其中例如卤素(例如氟、氯、溴或碘)、氧或羟基取代基团碳原子上的一个或多 个氢原子。其它实例包括炔基和二硫基团。
在优选实施方案中，可聚合二茂铁衍生物选自乙烯基-二茂铁、乙炔基-二茂铁、 苯乙烯基-二茂铁和氧化乙烯-二茂铁。
这些衍生物中不饱和键的存在将使二茂铁分子通过与其它也具有至少一个不饱 和C-C双或三键、或N-N双键或S-S双键的物质共聚而连接至聚合物主链。
对于用于与可聚合二茂铁衍生物共聚的第二单体单元来说，可以采用能够获得 净电荷的具有伯酸或伯碱官能团的任意合适的丙烯酸衍生物。这意味着本发明提供 带正电荷和负电荷的聚合物，并因而确保可以形成上述导电双层，而与形成在捕获 分子和分析物分子之间的配位化合物的净电荷无关。一般来说，对于用作单体的合 适丙烯酸衍生物的选择有两个要求。为了使其与二茂铁衍生物共聚，其应该具有至 少一个不饱和键，该不饱和双键例如可通过C-C双或三键、或N-N双键或S-S双键 来提供。第二，该丙烯酸衍生物应该能够通过生成H+离子或接受H+离子而分别执行 bronsted-Lowry酸或碱的功能。可以提供bronsted-Lowry酸或碱功能的官能团实例 包括可以接受H+离子形成带电胺基的伯胺基团，或羧基，或当酸官能团解离释放H+ 离子时可贡献H+离子的硫酸盐。在此，注意到虽然在本发明中优选使用伯胺基团， 但是对于本领域技术人员而言很明显也可使用存在于丙烯酸衍生物中的仲或叔胺基 团，以产生带正电荷的氧化还原聚合物。在此，也应注意尽管酸或碱官能团是一元 的，但是并不需要成为端基，除了在支化侧链可存在于更短的一个侧链“内”的情 况下。
虽然可以使用具有酸或碱官能团的任意合适的丙烯酸衍生物，用作本发明的氧 化还原聚合物中的第二单体的优选单体是通式(I)所示的丙烯酸衍生物：
其中，R选自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-SO3H和NH-CnH2n-PO3H，其 中烷基链可以是任选取代的，其中n是0-12的整数，优选0-8。因而，烷基可以是直 链或支链烷基，还可包含双或三键、或环状结构如环己基。仅举几个例子，取代基R 之内的合适脂肪族基团有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊 基、己基、环己基或辛基等。脂肪族基团可进一步例如被芳香族基团如苯基、卤素 原子、其它碱基或酸基或O-烷基所取代。可作为取代基而存在的示例性芳香族基团 是苯基、甲苯酰基或萘基。卤素原子可选自氟、氯或溴。合适的O-烷基的例子是甲 氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，而N-烷基选自-NHMe、-N(Me)2、-N(Ethyl)2或 -N(Propyl)2。
如果丙烯酸衍生物单体不可商业购得，则可从丙烯酰胺开始通过亲核取代而制 备，例如通过其末端NH2-基团与具有上述烷基链的酸或碱化合物的适当活化的衍生 物反应而制备。例如，丙烯酰胺可与4-溴丁酸或其酯衍生物反应，得到各种丙烯酰 胺单体。类似过程可用于磺酸或磷酸衍生物。
通常，对于生物样品，pH可以是约6.5-7.5。在该pH范围内，氧化还原聚合物 中的丙烯酰胺单元可获得正电荷，即成为阳离子。该正电荷使聚合物中的二茂铁基 团通过静电作用更为靠近葡萄糖氧化酶的氧化还原中心(此处葡萄糖氧化酶是所选 择的氧化还原酶)，因为葡萄糖氧化酶在该pH范围内是带负电荷的，即阴离子。
在本发明的一个传感器中，氧化还原酶通过交联键共价结合至氧化还原聚合物。 本发明的氧化还原聚合物可与电极表面上的氧化还原酶共固定，使所述酶成为电极 的集成(功能)部分。酶和介体的共固定化可通过用氧化还原介体标记所述酶并随 后将酶固定至电极表面来完成。作为替代方案，氧化还原聚合物可先固定在电极表 面上，接着将所述酶固定至氧化还原聚合物中。也可以将酶和氧化还原聚合一起固 定在由导电聚合物形成的基质中。
在本发明的另一传感器中，氧化还原酶和氧化还原聚合物均可扩散分布在纳米 颗粒膜中，所述纳米颗粒膜包含选自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、 IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一种无机氧化物纳米颗粒。
在该传感器中，氧化还原聚合物用作在电极表面和测试样品之间穿梭的扩散介 体。引入氧化还原聚合物的纳米颗粒膜不仅提供电子介导功能，而且提供分析物过 滤功能，以防止电极接触样品中的其它电化学活性材料。膜中的纳米颗粒提供分析 物分子可以扩散进入以到达传感器中氧化电极的微通道。
在本发明传感器的一个实施方案中，式(I)的氧化还原聚合物具有约1000-5000 道尔顿或优选约2000-4000道尔顿的分子量。
在本发明的另一实施方案中，式(I)的氧化还原聚合物的二茂铁负载率为约 2％-17％，或3％-14％。希望具有高二茂铁负载水平，优选至少在3％以上。通常， 低水平的二茂铁负载将限制可测量的葡萄糖浓度。例如，当葡萄糖浓度大大高于存 在的二茂铁分子介导能力时，产生的测量电流响应可受到小量介导二茂铁分子的限 制，导致测量不精确。因此，通过采用具有高二茂铁负载水平的式(I)的氧化还原 聚合物，可用传感器检测的葡萄糖浓度的上限提高，由此只需要更小体积的样品。
本发明还涉及制备水溶性氧化还原聚合物的方法。该方法主要涉及将可聚合二 茂铁衍生物的第一单体单元与包含丙烯酸衍生物如一元、二元或三元丙烯酰胺的第 二单体单元聚合，以产生共聚物。丙烯酸衍生物具有能够获得净电荷的酸或碱官能 团。重要的是，聚合反应在引发剂存在下在醇水溶液介质中进行。
单体和引发剂的加入次序可以改变。例如，可以在醇介质中混合第一和第二单 体，接着加入引发剂引发反应。也可以先将单体之一溶解在醇水溶液介质中，接着 加入引发剂，再将另一单体加入混合物中。
可采用任意有机醇例如脂肪族醇如乙醇、或芳香族醇如苯酚来制备醇介质。常 用体积比为ca 5∶1-1∶1(醇/水)。在一些实施方案中为约3∶1。
在根据本发明的方法的实施方案中，利用含体积比为约2∶1-3∶1的乙醇和水的水 醇溶剂来进行聚合。
虽然可在不加入引发剂的条件下进行聚合，但是希望加入攻击单体中不饱和键 的富电子中心的自由基引发剂。由此，在本发明的另一实施方案中，通过加入自由 基引发剂来引发聚合。
可以使用任意自由基引发剂。实例包括无机盐如过硫酸盐，以及有机化合物如 过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈(AIBN)，其可以产生称作引发剂碎片的自由基碎片， 每个碎片具有一个能够起到自由基作用的未成对电子，其攻击单体单元中的不饱和 键。
在一些实施各方案中，自由基引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾和过硫酸钠。
在本发明的一个实施方案中，所加入的自由基引发剂的重量比为约 20mg-40mg/g单体。本发明人发现自由基引发剂量影响聚合度。高用量的自由基引 发剂明显降低聚合效率，导致氧化还原聚合物具有低分子量。这也意味着与正常的 自由基结合反应相比，在所述聚合过程中需要较少的自由基引发剂。除了所用的自 由基引发剂的用量之外，反应物的加入次序(参见与本发明方法相关的下文)也影 响聚合效率。
可在室温和常压的标准条件下实施根据本发明的方法。然而，为了加速反应， 通常优选使反应混合物回流。还必须注意不要使用过高温度，这会导致聚合物或反 应物分解。由此，适合的上限一般低于100℃。在本方法的优选实施方案中，在约 60-80℃温度下回流进行聚合。
在另一实施方案中，在惰性气氛中回流进行聚合。惰性气氛可以由例如氮气或 氦气或氩气提供。
聚合所需时间长度可取决于所要温度和加入反应混合物中的引发剂的量。通常， 聚合时间为10-40小时，优选约24小时。
本发明方法的一个实施方案还包括在聚合所述第一和第二单体之前产生预反应 混合物，包括：
将丙烯酸衍生物单体单元溶解于水醇介质中；然后
加入自由基引发剂；然后
将可聚合二茂铁衍生物单体单元加入所述混合物中。
在上述方法的另一实施方案中，预反应混合物中的丙烯酸衍生物与可聚合二茂 铁衍生物的进料比优选占所加入单体重量的约5％-15％，以便得到具有合适分子量 和粘度的氧化还原聚合物。
在又一实施方案中，可聚合二茂铁衍生物单体单元在加入反应混合物之前溶解 于水醇介质中。
在本发明方法的实施方案中，氧化还原聚合物沉淀在有机溶剂中。可用来溶解 参与聚合的单体的有机溶剂例如包括醚、酮和醇。
实施例
实施例1：扩散介体生物传感器的构造
图1示出根据本发明一个实施方案的顶端填充生物传感器2的等比例分解图。 根据具体实施方案的生物传感器2的制造方法如下所述。首先，将碳电极阵列如可 得自Acheson Colloids Co.，Ontario，California，U.S.A.的Electrodag 423SS利用合 适的模具印制在聚酯膜衬底上。随后在约70℃的温度下持续干燥所印制衬底一段时 间，例如24小时。之后，将具有适当形成在其中的孔的双面带至于所述印制衬底上。 这些孔将最终限定凹陷14和暴露电极部分20、22的开口。随后利用合适的模具将 相同的纳米颗粒膜丝网印刷在具有PVFcAA(如实施例2所述制备，见下)、GOX、 聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合剂和氧化铝纳米颗粒的水浆“墨”的 碳电极的工作表面上。随后在约37℃于受控环境中干燥所得结构。纳米颗粒膜的厚 度一般可通过调整墨含量、同时保持涂覆在工作区域上的体积恒定而得到控制，例 如通过调节丝网印刷机中丝网的目径或调节纳米颗粒材料的含量或印刷浆料的“浓 度”来操作。
当上述结构形成时，利用合适的模具将Ag/AgCl或碳反电极阵列类似地丝网印 刷在第二聚酯膜上并干燥。接着，将该第二聚酯膜置于胶粘带上，使得反电极与其 对应的工作电极对准。之后，使结构单一化以生产多个生物传感器2，其中之一示于 图1。
实施例2：合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)、聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸) 和聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺-磺酸)共聚物
葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，来自Aspergillus niger，191单位/mg)购自 Fluka(CH-9470Buchs，瑞士)。二茂铁(Fc)、乙烯基二茂铁(VFc)、丙烯酰胺(AA)、 丙烯酸(AC)、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷-磺酸(cat.no.28，273，“丙烯酰胺-磺酸“或 AAS)和过硫酸盐均购自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。所有其它所用的化 学品如丙酮、乙醇和磷酸盐缓冲盐水具有检定的分析级。所用的所有溶液均用去离 子水制备。
实验中生成的聚合物的UV光谱在Agilent 8453UV-可见光谱测光仪上进行和记 录。分子量采用Toyo Soda高效凝胶渗透色谱在水中测定，使用标准聚氧化乙烯和聚 乙二醇来校准。
i)合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酰胺的三个样品。 脱氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用 量为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二 茂铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15 的丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰 胺-引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将 反应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉 淀的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空 干燥纯化产物。
ii)合成聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酸)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三个样品。脱 氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用量 为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二茂 铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15的 丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰胺 -引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将反 应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉淀 的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空干 燥纯化产物。
iii)制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺-磺酸)聚合物
制备含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三个样品。脱 氧10分钟后在每个样品中加入0.30ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸盐溶液。将用量 为0.05-0.16g的三种用量的乙烯基二茂铁溶于脱气的乙醇中以形成三种乙烯基二茂 铁溶液样品，计算加入每个样品中的二茂铁的量以分别得到95∶5、90∶10和85∶15的 丙烯酰胺/乙烯基二茂铁进料比(w/w)。接着，将各乙烯基二茂铁样品加入丙烯酰胺 -引发剂混合物中。反应混合物在氮气气氛中于70℃下回流24小时。冷却后，将反 应混合物分别逐滴加入快速搅拌的丙酮中以沉淀氧化还原聚合物。用丙酮洗涤沉淀 的氧化还原聚合物并通过多次水溶解-丙酮沉淀循环进行纯化。随后在50℃下真空干 燥纯化产物。
结果和讨论
乙烯基二茂铁与丙烯酰胺及其衍生物的共聚合反应基于传统自由基聚合反应进 行。一般反应方程式示于图6中。
然而，为了成功共聚所述单体，极为关注体系中乙烯基二茂铁的末端效应。如 在引言部分所述，乙烯基二茂铁通常在共聚合体系中用作自由基清除剂。发现自由 基引发剂的量明显少于正常聚合反应中所需要的量。较高用量的自由基引发剂明显 降低聚合效率和产物的分子量。此外，加入次序也影响聚合效率。
当在乙烯基二茂铁和丙烯酰胺中加入过硫酸盐自由基引发剂时，观察到聚合低 于20％。这可能是因为在反应混合物中形成了二茂铁，其导致阻滞聚合速率并过 早地使聚合物链生长过程终止。如表1所示，在最优条件下，得到较高的产率。
表1乙烯基二茂铁、丙烯酰胺及其衍生物的共聚 进料比(W/W) 产率(％) VFc含量(％) 分子量 AA/VFc 95∶5 80 4％ 3600 AA/VFc 90∶10 72 9％ 3100 AA/VFc 85∶15 56 11％ 2400 AC/VFc 95∶5 75 3％ 2800 AC/VFc 90∶10 55 7％ 2500 AC/VFc 85∶15 45 6％ 2000 AAS/VFc 95∶5 85 6％ 4000 AAS/VFc 90∶10 75 9％ 3500 AAS/VFc 85∶15 62 14％ 3000
然而，聚合物产率随乙烯基二茂铁进料比的增加而下降，这表明自由基聚合中 的末端效应依然存在，即使在聚合过程中已经极为注意也是如此。发现当反应混合 物变蓝时获得微小的产率，这是由于聚合溶液中形成相当大量的二茂铁。二茂铁 负载量在3-14％之间变动，总是小于单体进料中的二茂铁含量。
氧化还原聚合物中二茂铁的负载量由元素分析确定。能量色散X射线分析 (Energy Dispersive X-ray Analysis，EDX)用于该目的。用在所得氧化还原聚合物 样品上的电子束能量为120keV。用锂漂移硅检测器对样品产生的X射线进行分析。
通过凝胶渗透色谱测定氧化还原聚合物的分子量。通常，用较高二茂铁进料比 制备的氧化还原聚合物具有较低的分子量和较宽的分子量分布。
合成的氧化还原聚合物的特征
合成的共聚物为淡黄色的粉末状物质。共聚物的分子量为2000-4000道尔顿。 FT-IR实验(参见图7)清楚示出1650处的乙烯基的吸收完全消失，说明丙烯酰胺和 乙烯基二茂铁成功聚合，所得的氧化还原聚合物具有高纯度，没有单体。其他证据存 在于1000-1300cm-1区域。1126cm-1处伴随一个弱峰的极强吸收说明氧化还原聚合物 中存在二茂铁单元，1218em-1处的强吸收说明聚合物中存在酰胺基团。UV实验也证 实了乙烯基二茂铁和丙烯酰胺之间的成功共聚。300nm处的微小肩峰清楚指示为共 聚物中的二茂铁基团(参见图8)。氧化还原聚合物中具有二茂铁和胺基或羧酸基团 使它们具有双功能：介导电子的氧化还原活性和与蛋白质交联的化学活性。
增加乙烯基二茂铁的进料比倾向于增加氧化还原聚合物中二茂铁基团的比例。 但是，改变乙烯基二茂铁的量也影响聚合物产率。当乙烯基二茂铁进料比最低时获 得最高产率，这和自由基聚合中二茂铁化合物的不寻常行为非常一致。如表1所示， 虽然聚合物中二茂铁基团的含量随乙烯基二茂铁进料比增加而增加，但是远不是线 性的。发现对于生物传感目的来说，10％的乙烯基二茂铁进料比是足够的，其具有 良好的介导功能和良好的经济性。用于聚合的引发剂的量也影响氧化还原聚合物的 组成和产率。发现当引发剂为20-40mg/g单体时获得良好的氧化还原聚合物。
实施例3：得到氧化还原聚合物的循环伏安图
氧化还原聚合物制备在存在0.0μg、10μg GOx和10μg GOx以及10μM葡萄糖 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。
在4.9版general purpose electrochemical system(GPES)管理器的AutoLab potentiostat/galvanostat运行下进行电化学测试。将3-电极系统电池装在法拉第笼中。 所述电极是(Ag/AgCl)参比电极、铂线反电极和Au工作电极(表面面积为7.94mm2)。
与乙烯基二茂铁相比，合成的氧化还原聚合物在水中具有高溶解度，但是不溶 于多数有机溶剂。该特征使得氧化还原聚合物理想地用作生物传感、尤其是酶联生 物传感中的介体，因为多数酶仅在含水介质中有活性。
图9示出在仅含有氧化还原聚合物的PBS中的典型循环伏安图，伏安图表现出 高度可逆的溶液电化学：氧化还原波动中心在～0.18V(与Ag/AgCl相比)，伏安图具 有扩散受限的形状，阴离子和阳离子的峰值电流的幅度相同，峰间电位差为60mV， 与25℃下理论值59mV非常接近。这些氧化还原波动可以归为氧化还原聚合物中二 茂铁基团的氧化和还原，指示聚合物的优异氧化还原活性。伏安分析实验再一次验 证了乙烯基二茂铁成功地与丙烯酰胺及其衍生物共聚，并且聚合物中的二茂铁基团 保留其电活性。氧化还原聚合物的PBS溶液是具有自由扩散行为的真溶液形式。向 该溶液中掺加不同量的葡萄糖并不改变伏安图，说明单独通过氧化还原聚合物不催 化氧化葡萄糖。另外，当在氧化还原聚合物溶液中加入少量的GOx时未观察到明显 变化。所得溶液的电化学实际上与单独的氧化还原聚合物溶液的电化学相同。但是， 当向该溶液中加入10mM葡萄糖时，溶液中进行GOx对葡萄糖的酶促氧化。GOx 中的氧化还原中心FAD转化成FADH2。当电极电位扫描过氧化还原聚合物的氧化还 原电位时，在电极表面附近，氧化还原聚合物中大量的二茂铁基团氧化成二茂铁。 GOx中FAD/FADH2的氧化还原电位是-0.36V(与Ag/AgCl相比)，远低于二茂铁/ 二茂铁电对的氧化还原电位，FADH2附近的二茂铁基团将它氧化回FAD，氧化 还原聚合物中的二茂铁基团还原成原来的二茂铁基团。这两个反应形成催化循环， 如图4所示，或者换句话说，GOx的葡萄糖氧化由氧化还原聚合物介导。
因此，氧化还原聚合物引起的催化反应大大增加含葡萄糖的溶液中的氧化电流， 见图9(浅灰色迹线)。如果FADH2、氧化还原聚合物和电极之间的电子交换都非常 快，则在电化学氧化期间产生大量的二茂铁基团，所述二茂铁基团又快速被 FADH2所消耗。这是与无葡萄糖的溶液中获得的还原电流相比二茂铁基团的还原 电流更低的原因。这些数据表明氧化还原聚合物在酶促反应中有效地作为氧化还原 介体起作用，使电子在酶的氧化还原中心和电极表面之间穿梭。
实施例4：包含与葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)交联的乙烯基二茂铁- 共聚-丙烯酰胺的膜的合成
进行氧化还原聚合物与蛋白质的交联反应，以研究所得膜的电化学特性。在本 实施例中使用酶GOx。选择戊二醛和聚乙二醇二缩水甘油醚(PEG)作为交联剂。 生物级的戊二醛(50％水溶液，产品编号00867-1EA)和聚乙二醇二缩水甘油基醚 (PEGDE)(产品编号03800)得自Sigma-Aldrich。
首先，将从实施例1得到的聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)沉积到金电极上。 用交联剂修饰GOx-BSA，以提供具有脂肪碳链的GOx-BSA，所述脂肪碳链具有末 端醛官能团，其能够提供与固定介体上合适官能团的交联。随后，使修饰的GOx-BSA 沉积，并与固定的引发剂反应。修饰的GOx-BSA上的醛基团与PAA-VFc上的胺基 反应，形成共价交联键。反应进行后，使PAA-VFc-GOx-BSA膜干燥。
将金电极上交联的PAA-VFc-GOx-BSA膜进行伏安分析。使用空白PBS，施加 的电位扫描速率为50mV/s。
图10示出空白PBS中PEG交联的PAA-VFc与金电极上的GOx及BSA的循环 伏安图。如图10所示，正如所期望的，交联膜表现出固定氧化还原电对的高度可逆 的表面(A.J.Bard，L.R.Faulkner，Electrochemical Methods，John Wiley & Sons： New York，2001.)，其用水和PBS彻底洗涤后和在-0.2V至+0.8V之间多次重复电位循 环后几乎没有变化，显示出在金电极上固定有二茂铁膜的高度稳定表面。在＜100mV/s 的低扫描速率下，如预期那样对表现出理想Nernstian行为的表面限定的单电子氧化 还原体系记录明显对称的信号：峰电流与电位扫描速率成比例，峰间电位差远低于 59mV，如在溶液中扩散行为的情况下观察到的(见图9)，半峰高度处电流的宽度为 约90mV。该结果证实：所有的二茂铁氧化还原中心都允许到达电极表面，进行可逆 的异质电子传递。向PBS溶液中加入10mM葡萄糖时，获得典型的催化电化学曲线。 但是，氧化还原聚合物的还原峰消失(图10，灰色迹线)。这意味着传感层通过电子 从还原态GOx向二茂铁基团的传递均匀地维持在还原状态。检测到的快速应答和电 流表明氧化还原聚合物的优异介导功能，生物传感器的高电流灵敏性(750nA/mM 葡萄糖)。
实施例5：制备引入共分散扩散的聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)和葡萄糖氧化 酶的纳米颗粒膜
i)制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)氧化还原聚合物
D-(+)-葡萄糖和葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，来自Aspergillus niger，191单 位/mg)购自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。粒径为10-1000nm的氧化铝纳 米颗粒在室内合成如下。将硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O，88.30g)溶于471ml水中，随 后逐滴加入到由205.9ml浓氢氧化铵溶于411.93ml水中制备的碱溶液中。将所得沉 淀物搅拌并在25℃下陈化过夜，随后离心除去上清液。洗涤之后，将沉淀物洗涤、 干燥并研磨，并在空气中于700℃下煅烧3小时。得到的γ-氧化铝纳米晶体具有从几 十到几百纳米的可控尺寸。
磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(pH7.4)由磷酸盐(0.020M)和氯化钠(0.15M) 制备。聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)、葡萄糖和GOX用PBS缓冲液制备。葡 萄糖贮液允许在使用前进行旋光改变至少24小时。所有溶液均用从Millipor得到的 去离子水制备。用于本实验中的所有其它化学品均具有检定的分析级。
根据以下程序制备聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺)(PVFcAA)氧化还原聚 合物：将0.15g乙烯基二茂铁和1.0g丙烯酰胺溶于10ml水醇(2份乙醇：1份水) 中。为了引发聚合，将0.50ml等分的0.10g/ml无氧过硫酸铵溶液在脱气之后加入反 应混合物中。冷却后，将氧化还原聚合物在丙酮中沉淀。通过在水中溶解粗产物并在 丙酮/水混合物中沉淀来进行纯化。
ii)合成纳米复合材料膜
利用PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合剂和氧化 铝纳米颗粒的水浆“墨”，将纳米复合材料膜丝网印刷至碳条上。该水浆墨通过将以 上制备的PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)或聚(乙烯基 吡啶-共聚-丙烯酰胺-磺酸)(PVPPAS)粘合剂和氧化铝纳米颗粒根据以下浓度范围 混入水中而制备所述水浆墨：葡萄糖氧化酶：0.20-0.50mg/ml，介体：10-20mg/ml， 纳米颗粒：30-100mg/ml，PVPPAC或PVPPAS粘合剂：40-150mg/ml。所述浆墨可 储存或立即使用。当希望以膜层涂覆传感器电极时，将所述浆墨装入沉积装置如丝网 印刷机中，并且沉积在电极上以形成膜。在组装成传感器之前，首先使所述膜干燥。
实施例6：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介体和 葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的循环伏安法分析
在本实施例中，利用实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电极 和Ag/AgCl参比电极组装。所述传感器性能利用循环伏安法来分析。使用CHI 660A 型电化学工作站(CH Instruments，Austin，USA)在室温下进行所有电化学测量。使 用传统三电极系统进行循环伏安测量，所述三电极系统由丝网印刷碳工作电极、微 型Ag/AgCl参比电极(Cypress Systems，Lawrence，KS，USA)和铂线反电极组成。 为了避免印刷墨扩散分布至2mm直径工作区域之外，将图案化的憎水膜涂覆至碳电 极。为了避免电极结垢和墨中可能的浓度改变，对每次伏安测量试验使用新鲜的电 极和墨。所有葡萄糖测量均在PBS溶液中进行。在pH变化的实验中，使用1.0M HCL和1.0M NaOH溶液来调节PBS缓冲液的pH。在电流分析实验中，工作电极平衡在 0.30V处(与Ag/AgCl相比)。
结果和讨论
平面纳米复合材料墨中的PVFcAA介体的典型循环伏安图示于图12中。电极表 现出扩散受控动力学的快速氧化还原电对的典型特征。峰值电流随电位扫描速率的 平方根而线性增加，对于最大200mV/s的扫描速率，还原和氧化峰值电位差保持为 59mV不变，这表明从介体至电极的电荷转移迅速。用葡萄糖强化该墨并未改变伏安 图，这提示不存在单独通过介体的葡萄糖催化氧化。此外，在存在0.10-20mg/ml的 不同GOX量时得到实际相同的伏安图，如图12a所示，这表明酶并不显著影响墨中 的Fc+/Fc氧化还原对的电化学。然而，向该墨中加入极少量的葡萄糖，导致阴极电 流增强和阳极电流减小(图12b)。此外，如图12b中所可见，伏安图在介体的氧化 还原电位附近，朝阴极侧上升。该变化暗示典型的化学偶联电极过程(电催化)。该 电催化可通过以下反应方程式描述：
葡萄糖+GOX-FAD+2H+→葡萄糖内酯+GOX-FADH2 (1)
GOX-FADH2+2Fc+→GOX-FAD+2Fc+2H+ (2)
Fc→Fc++e- (3)
由此，GOX-FAD通过渗入膜的葡萄糖还原成GOX-FADH2(方程式1)，电子 从GOX-FADH2传递至Fc+位置(方程式2)，随后电子经过聚合物介体的Fc+/Fc位 置传递至电极表面(方程式3)。电极下方处二茂铁的氧化是图12b所示阴极电流增 强的原因。
Fc和GOX之间的催化反应速率常数k可从存在大大过量的葡萄糖以确保酶被 完全还原时得到的伏安测量数据来估计。该条件下，GOX和Fc之间的反应(方程 式2)实际上是拟一级的。如Nicholson和Shain以及Liaudet与其同事们所显示的， 由于Fc和GOX之间的介导氧化还原过程引起的限制电流IL可描述如下：
IL＝nFACFc(2DFckCGOX)1/2 (4)
其中CFc和CGOX分别是Fc和GOX的浓度。DFc是Fc的扩散系数，其它符号 具有其常用意义。如方程式4所预期的，在足够低的电位扫描速率下，限制电流与 电位扫描速率无关，并且与Fc浓度和GOX浓度的平方根成比例。这些观察结果证 明使用方程式4确定介导葡萄糖氧化的速率常数的正当性。结合方程式4和以线性 扫描伏安测量表达的峰值电流ip，得到iL/ip关系如下：
IL/iP＝(2kCGOD)1/2/[0.4463(nFv/RT)1/2] (5)
该方程式包含任意确定的经验参数并很好地适用于确定速率常数的目的，这是因为 Fc/Fc+对的电极过程仅由扩散控制。根据在慢扫描速率＜5.0mV/s下，在含有0.50mM 的Fc、60mM葡萄糖和0-30μM的GOX的溶液中得到数据估计速率常数为约3.8× 103l/s mol。该速率常数表明PVFcAA有效介导GOX的氧化，是连接葡萄糖酶氧化 与电极表面的优异介体。本工作得到的速率常数明显大于之前报导的其它二茂铁衍 生物-GOX体系的速率常数。可能的原因是pH7.4下在氧化还原聚合物中存在阳离 子丙烯酰胺单元，由于GOX在该pH下是阴离子，因此其使Fc基团通过静电相互 作用而更加接近GOX的氧化还原中心。
实施例7：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介体和 葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的电流测量响应
在本实施例中，利用如实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电 极和Ag/AgCl参比电极组装。葡萄糖在生物传感器的空气饱和PBS缓冲液中的典型 电流测量响应如图13a所示。电流测量测试示出生物传感器具有对葡萄糖的快速响 应时间和高灵敏度。在0.30V处，在强化葡萄糖浓度之后，氧化电流增大并在5秒内 非常快速地达到最大值，之后是保持60％以上的峰值电流持续20s的逐步瞬态。在 相同实验条件下，在空白PBS缓冲液中没有观察到催化氧化电流(图13b)，但是纳 米颗粒膜的存在增大背景电流并经过相当长时间才下降至微小水平。
为了获得满意性能的生物传感器，优化纳米复合材料墨的配方。因为催化反应 发生在介体和GOX之间，由此介体浓度必须足够高以具有高灵敏度和催化氧化电流 与葡萄糖浓度之间的线性关系。否则，介导葡萄糖氧化的部分将非常小并取决于膜 中的介体量，而不是葡萄糖浓度。既考虑灵敏度又考虑生物传感器的经济性，发现 为此目的的最佳介体浓度为15mg/ml，并且最优GOX浓度发现是0.20mg/ml(图14a 和14b)。希望平衡电位影响生物传感器的电流测量响应；因此平衡电位检测处于 0.0-0.70V。如图13c所示，随着平衡电位上升并到达0.30V的平台，电流灵敏度增加。 当平衡电位变得大于0.50V时，观察到微小的灵敏度下降，可能是由于背景电流增大 所致。此外，过高的平衡电位消弱葡萄糖测量的精确性，这是因为来自大大增加的 背景电流和电极下大量电活性物质可能直接氧化的复杂性。因此，对于葡萄糖的电 流分析测量，生物传感器的电位平衡在0.30V。
也研究了葡萄糖的催化氧化电流对纳米颗粒膜厚度的依赖性(图14d)。如图14d 所示，对于厚度为250-500μm的纳米颗粒膜，催化氧化电流达到最大值。更薄的膜 中材料不足导致较低的灵敏度和电流峰值的消失。相反，纳米颗粒膜膜厚进一步增 加超过500μm将不利地影响膜对葡萄糖和GOX催化反应产物的通透性。而且，注 意到膜越厚则响应时间越长。
与使用表面固定传感膜不同，使用非导电纳米颗粒传感膜在灵敏度方面提供优 于已知一次性葡萄糖生物传感器的优点。在前者的系统中，传感膜是电极的一部分 并且直接接触血液样本。血液中的某些成分例如血细胞包括红细胞和白细胞、蛋白 质和抗坏血酸可与传感膜相互反应，抵消血糖测量的精确性。本工作中，纳米颗粒 膜是非导电性的，因此在结构和功能上都不是电极的一部分。葡萄糖的催化氧化仅 仅发生在电极/纳米颗粒膜的界面上。换言之，电活性物质只有穿过纳米颗粒膜到达 该界面时才与电极交换电子。因此，纳米颗粒膜提供阻断血液中的大量物质如细胞 和蛋白质可能干扰的屏障。当该配方用于印制纳米颗粒膜时，PVPAC粘合剂在传感 膜中发挥双重作用：粘合和分析物调节。当再水合时，膜不破裂，但是溶胀在丝网 印刷碳表面上形成凝胶层。反应物，如葡萄糖和介体在该层内自由移动，而干扰物 质如含有氧合血红蛋白的红细胞被排除在外。阴离子抗坏血酸和尿酸被阴离子PVAC 聚合物排斥，并且部分溶解在纳米颗粒膜中的氧由于该层的高亲水特征而大大减少。 这得到传感膜，由此响应给定葡萄糖浓度而产生的电流量在40-60％血球比率以上和 存在0.20mM抗坏血酸和0.10mM尿酸的情况下变化小于5.0％。这种对血液中干扰 成分的所期望不敏感性在全血样本中观察到。此外，纳米颗粒膜还存在葡萄糖分析 物调节层，明显减缓葡萄糖的运输，使得体系不再动力学可控，由此使线性区域延 伸遍布整个生理相关葡萄糖浓度范围40-540mg/dl。
如前所述，氧影响葡萄糖生物传感器的灵敏度，因为溶解氧氧化葡萄糖作为副 反应同时发生。对采用憎水的聚乙烯基吡啶(PVP)粘合剂的薄纳米颗粒薄膜的初始 电流分析测试表明不存在氧时的响应高于具有溶解氧时的响应。在低葡萄糖浓度例 如50mg/dl下，与氧的竞争引起峰值电流的显著下降(～20％)。因此，需要抑制系 统中的氧干扰，以获得高选择性和精确的生物传感器。在憎水的PVP中引入丙烯酸 单元导致生物传感器性能明显改进。所得纳米颗粒膜高度亲水，这改善葡萄糖/氧的 渗透比并优化生物传感器响应的精确性和线性。对于以氮气(图15a)和氧气(15b) 鼓泡的200mg/dl葡萄糖溶液的两张电流分析图重叠良好，峰值电流差小于5％，表 明生物传感器对样本中的氧含量非常不敏感。
实施例8：使用共分散在纳米颗粒膜中的扩散性聚(乙烯基二茂铁-共聚-丙烯酰胺) 介体和葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器的特征分析
在本实施例中，利用如实施例5中制备的浆墨，将传感器与丝网印刷碳工作电 极和Ag/AgCl参比电极组装。对≤600mg/dl的葡萄糖浓度，峰值电流的灵敏度为～ 76nA/mg/dl。如图16所示，催化氧化电流直接与最高600mg/dl的葡萄糖浓度成比例， 覆盖整个生理相关的血糖水平。有趣的是，峰值电流之后的任意时间点所得电流也 与葡萄糖浓度成线性关系(见图16b)，提供在电流分析测试的前20秒内作为替代方 案的取样可能性。从40和300mg/dl的葡萄糖溶液的两组20次反复测量来估计准确 性。相对标准偏差分别为4.0％和8.6％。在最优条件下对5.0mg/dl葡萄糖反复测量 的标准偏差的3倍估计得到的检测极限发现为1.8mg/dl，其受生物传感器的充电电流 限制。更重要的是单次测试所需血液样本体积为约0.20-0.30μl，是市场上所有一次性 葡萄糖生物传感器中的最小样本体积。在不同温度下进行稳定性测试。结果表明生 物传感器在室温下储存的前180天保持了100％的最初灵敏度，暴露在50℃下60分 钟后损失其最初灵敏度的10％，60℃下60分钟后损失最初灵敏度的约50％。这可 能是由于生物传感器中酶活性损失所造成的。所提出的方法成功应用于全血中的葡 萄糖测定。
表2.血糖分析结果(10次测试的平均值) 样品 葡萄糖 参考值 收回率(％) (+50mg/dl葡萄糖) 全血1 (健康人) 80 84 96.3 全血2 (健康人) 110 115 99.2 全血3 105 105 104
(健康人) 全血4 (糖尿病患者) 185 179 98.5 全血5 (糖尿病患者) 155 158 97.1
*得自YSI血糖分析仪。
得到的结果与使用yellow springs血糖仪(YSI 2300型)得到的参考值一致性良 好。所得收回率足够进行实际应用。
已经通过乙烯基二茂铁和丙烯酰胺及其衍生物的传统自由基聚合制备一系列水 溶性和可交联二茂铁基氧化还原聚合物。所得氧化还原聚合物在GOX存在时产生对 于葡萄糖的典型催化氧化电流。本实验结果表明在氧化还原聚合物和GOx引入PBS 中之后，氧化还原聚合物保留快速电子传递特性并且GOx保留其催化活性。具有作 为侧链之一的胺或羧酸基团的氧化还原聚合物允许其方便地与蛋白质交联，所述蛋 白质例如是酶和抗体和抗原。交联氧化还原聚合物膜的电化学测试表明对氧化溶液 中底物的优异催化活性、高灵敏度、良好的再现性和稳定性，因此指示其适合用作 生物传感器中的传感膜。
在单独实验中，还表明葡萄糖氧化酶和PVFcAA可与憎水PVPAA粘合剂一起 容易而均匀地分散在纳米颗粒氧化铝中，并且所得膜产生对于葡萄糖的典型催化氧 化电流。实验结果表明在将介体和GOX丝网印刷在碳电极上之后，介体保留其快速 电子传递性质，GOX保留其催化活性。其还表明生物传感器对利用少至0.20μl的血 液样本体积进行血糖监测具有良好的灵敏度和稳定性。丝网印刷技术在制造生物传 感器中的用途使得可以容易和低成本地大量生产。这些生物传感器特征对于开发高 市场价值的微型葡萄糖生物传感器是有前途的。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物传感器热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈