过去，对含特定的测定对象物的试料，例如，广泛使用不进行试 料的稀释和搅拌等而可简便且迅速地定量前述测定对象物的生物传感 器。这样的生物传感器，例如如专利第2517153号公报等所公开的那 样，通常可采用网版印刷等方法，在电绝缘性的基板上形成具有作用 极(也称测定电极)和对电极(反电极；counter electrode)的电极系， 通过在其上形成含有与前述测定对象物反应的氧化还原酶和电子接受 物等的反应层而可制作。使含有前述测定对象物的试料与该反应层接 触时，通过前述氧化还原酶的催化作用，前述测定对象物被氧化，同 时前述电子接受物被还原。用电化学的方法将前述被还原的电子接受 物再氧化，可从由此获得的氧化电流值算出前述试料中的测定对象物 的浓度。
然而，采用这样的生物传感器，有时因试料的物性等产生测定误 差。例如，试料是全血时，由于血液中所含的血球等的固体成分、脂、 蛋白质、糖等的可溶成分和不溶成分等吸附在生物传感器的电极表 面，所以很难进行准确的测定。另外，红血球与全血的容积比，即血 球比率(Hct)值，个人差别大，故根据检体不同前述的对传感器的影 响也可看到差别。这类不纯物(杂质)所致的影响，例如通过稀释前 述试料后供于生物传感器等可以缓和，但这种方法费工夫操作繁杂。
因此，为了回避前述不纯物的影响，提出了以下所示的方法。例 如，有在电极上形成吸水性高分子层的方法(特公平6-54304号公 报)、在反应层上形成含有非水溶性高分子和水溶性高分子的层的方 法(特开平6-213858号公报)、在电极上形成由脂溶性高分子与两亲 液性高分子的混合物组成的高分子膜的方法(特开平9-318588号公 报)、在反应层上形成抑制固体成分透过的阴离子性过滤膜的方法(特 开平10-221293号公报)、把封入了柠檬酸钠水溶液的微胶囊固定在 固定葡萄糖氧化酶的电极上，以此作为作用极的方法(特开平5-133929 号公报)等。
发明的公开
然而，使用前述阴离子性过滤膜的方法，只对固体成分有效，例 如，存在对蛋白质等试料中的可溶成分看不到效果的问题。另外，前 述其他的方法，由于使用水溶性高分子等，所以存在吸水性高、容易 受湿度的影响、酶反应变慢等问题。
因此，本发明的目的是提供不受试料中的不纯物和湿度的影响， 可高精度地测定前述试料中的测定对象物的生物传感器。
为了解决前述课题，本发明的生物传感器其特征在于，它是备有 基板、含有试剂的试剂层、及包含作用极和对电极的电极系，在前述 基板上配置电极系，在前述电极系上形成前述试剂层的生物传感器， 前述试剂层还含有微粒子。
本发明的生物传感器，通过这样地在前述电极系上形成的试剂层 含有前述微粒子，可防止试料中的不纯物附着在前述电极表面。另外， 由于不需要使用如前述的水溶性高分子等，所以也不受湿度的影响。 因此，与如前述的试料的物性无关，可防止灵敏度的降低，可高精度 地测定测定对象物。再者，采用前述微粒子可防止不纯物向电极表面 附着的理由不清楚，但认为是由于前述不纯物对前述微粒子的物理吸 附等所致。
在本发明的生物传感器中，前述试剂层可以是单层。也可以是包 括含有前述试剂的试剂含有层和含有前述微粒子的微粒子含有层的叠 层体。
前述试剂层为前述叠层体时，可以在前述电极上通过前述微粒子 含有层形成前述试剂含有层，但，例如从更可以排除不纯物对电极的 吸附、前述试料中的测定对象物和试剂容易反应的观点考虑，优选在 前述电极上通过前述试剂含有层形成前述微粒子含有层。
在本发明的生物传感器中，前述微粒子的平均粒径，例如是0.1～ 45μm的范围，优选是0.5～30μm的范围，更优选是1～20μm的范 围、最优选是3～15μm的范围。前述平均粒子粒径若是0.1μm以上， 则试料向前述试剂层容易充分浸透，可提高生物传感器的灵敏度。另 外，平均粒子粒径若是45μm以下，则可充分排除前述试料中的不纯 物的影响。
前述平均粒径，例如可用电子显微镜直接观察前述微粒子，测定 其粒径后算出平均值来求出。此时，前述微粒子的测定个数没有特殊 限制，例如是100个以上，优选是100～300个的范围。
另外，前述微粒子的粒度分布没有特殊限制，但优选是0.01～100 μm的范围，更优选是0.05～60μm的范围、最优选是平均粒径0.1～ 40μm的范围。
前述微粒子的形态，例如可以是球状、扁球状，也可以使用微粒 子凝结而变成球状的形态等，但含前述微粒子的层，从可保持均匀且 适度的疏密性的观点考虑优选是球状。
另外，前述微粒子由高分子化合物形成为好，更理想的情况是不 含引起电解的不纯物、在电化学上是惰性的高分子化合物。另外，前 述高分子化合物优选是非水溶性。作为前述高分子化合物的具体例， 例如可列举含有丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸、丙烯酸酯、甲基丙烯 酸酯、马来酸酯和苯乙烯衍生物单体之中至少一种的聚合物或共聚物 等。作为前述苯乙烯衍生物单体，例如可列举苯乙烯、烷基苯乙烯等。 另外，也可以使用例如聚氨酯、聚脲等的氨基甲酸酯化合物，聚乙烯、 聚丙烯等的聚烯烃系高分子化合物，聚氯乙烯等的聚烯烃衍生物、及 聚酰胺化合物等。另外，除高分子化合物以外，例如，也可以由以硅 胶、氧化铝、沸石、磷灰石、玻璃和硅酸三钙石等为代表的陶瓷等的 无机化合物形成。这些之中，从电化学上是惰性的观点考虑，更优选 是含丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、马来 酸酯和苯乙烯衍生物单体之中至少一种的聚合物或共聚物、或者聚酰 胺系高分子化合物。具体地讲，最优选聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚 苯乙烯(PS)、聚酰胺(PA)等。
作为这样的微粒子，例如、可以使用市售的商品名テツクポリマ一 bmx-5(积水化成品工业公司制、PMMA、球状、粒径5μm)、商品名 ガンツパ一ルGM-0600(ガンツ化成公司制、PMMA、球状、粒径6μm)、 商品名ガンツパ一ルGS-0805(ガンツ化成公司制、交联PS、球状、粒径 8μm)、商品名ガンツパ一ルPS-8F(ガンツ化成公司制、PMMA、球状、 粒径0.4μm)、商品名オ一ガゾル2002EXD NAT COS Types(エルフアトケム 公司制、尼龙、扁球状、尺寸10μm)、商品名トレフイルE-506C(东 丽道康宁有机硅公司制、交联聚硅氧烷粉末、球状、粒径10μm)、 商品名サラミツクス粉末SN-E-02(宇部兴产公司制、氮化硅、球状、 粒径1μm)、商品名ゴツトボ一ル(铃木油脂公司制、氧化硅、球状、 粒径10μm)、商品名ガラスビ一ズ(ポリサイエンス公司制、石灰玻璃、 球状、粒径3～10μm)等。
另外，前述微粒子希望是电学上惰性，与试料中要除去的不纯物 相应地改变粒径、同时改变微粒子表面的特性。例如，要设定微粒子 表面的特性为疏水性时，由PS形成的微粒子为好，要设定成比PS具 有亲水性时，由PMMA和PA等形成的微粒子为好。而，要把前述特性 设定为带负电荷时，优选由导入了羧基的PS等形成的微粒子，要设定 为带正电荷时，优选由导入了氨基的PS等形成的微粒子。
另外，具体地讲，以除去全血中的血球为目的时，占血球成分的 大部分的红血球由于平均直径是大约7μm，所以例如若选择平均粒径约 7μm以下大小的微粒子，则可高效地进行红血球的分离。另外，以除去 全血中多数的蛋白质为目的时，例如，通过将PS、导入了羧基的PS 和导入了氨基的PS等适当混合来使用，可吸附除去不特定多数的蛋白 质。再者，并不限于这些的方法。
在本发明的生物传感器中，前述试剂层还含有无机凝胶为好。通 过含有前述无机凝胶，可进一步防止不纯物对电极的吸附，而且从可 防止试料扩散的观点考虑，由于在窄的范围引起酶反应，所以试剂与 测定对象物可迅速地反应。
另外，由于同样的理由，也可以在前述电极与前述试剂层之间另 行形成含有无机凝胶的无机凝胶含有层。
作为前述无机凝胶，优选粘土矿物，例如，可列举膨润性层状硅 酸盐等。作为前述膨润性层状硅酸盐，例如，优选绿土(smectite)、 膨润性云母等。作为前述绿土，例如，优选锂蒙脱石、皂石、蒙脱石 等。作为前述膨润性云母，例如，优选氟化四硅钠云母、带云母等。 这些可以用任何一种，也可以并用二种以上。
作为绿土，例如，可以使用市售的合成锂蒙脱石、即商品名 ラボナイトXLG和商品名ラボナイトXLS(分别为ラボ一トインダストリ一公 司制)、商品名ル一センタイトSWN和商品名ル一センタイトSWF (コ一プケミカル公司制)及商品名チキソピ一W(协和化学工业公司制) 等；市售的合成皂石、即商品名スメクトンSA(クニミネ工业公司制)； 市售的天然蒙脱石精制物、即商品名クニピアF(クニミネ工业公司制) 等。
另外，作为膨润性云母，例如，可列举市售的氟化四硅钠云母、 即商品名Na-TS(トピ一工业公司制)；市售的带云母、即商品名Li- TN(トピ一工业公司制)等。
在本发明的生物传感器中，还在前述试剂层的上面形成含表面活 性剂的表面活性剂含有层为好。若这样地设前述表面活性剂含有层， 则由于在前述试剂层表面形成亲水化膜，所以试料与试剂迅速且均匀 地混合。因此，反应迅速地进行，再现性也提高。
另外，前述的叠层体的场合，优选在前述微粒子含有层上形成含 表面活性剂的表面活性剂含有层。
作为前述表面活性剂，例如，可列举阳离子性表面活性剂、阴离 子性表面活性剂、两离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂，天然 型表面活性剂等，其中，优选是阳离子性表面活性剂、非离子性表面 活性剂、天然型表面活性剂，更优选是非离子性表面活性剂、天然型 表面活性剂。作为前述天然型表面活性剂，例如，可列举磷脂，可优 选使用蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、加氢卵磷脂、高纯度卵磷脂等的卵 磷脂等。另外，作为非离子性表面活性剂，例如，可列举商品名Tween 20等的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、商品名Triron X-100等的聚 氧乙烯烷基醚、商品名Triton X-405等的聚氧乙烯苯基烷基醚等。这 些之中特别优选的是磷脂，最优选的是高纯度卵磷脂等的卵磷脂。
本发明的生物传感器中，作为前述电极，若能用于电化学检测测 定对象物与试料的反应即可，例如，可列举金电极、碳电极、银电极 等。其中，从导电性和化学稳定性优异的观点考虑，优选金电极、碳 电极，更优选碳电极。
本发明的生物传感器中，前述试剂如果是与测定对象物反应，并 能电化学检测其反应的试剂就没有特殊限制，例如，含酶为好。作为 前述酶，例如，可列举氧化还原酶等。
前述氧化还原酶，例如，可根据前述测定对象物的种类适当地决 定，具体地，可列举葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳 酸脱氢酶、果糖脱氢酶、半乳糖氧化酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢 酶、醇氧化酶、醇脱氢酶、胆红酸氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、氨 基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、脂酰辅酶A氧化酶、胆碱氧 化酶、4-羟基苯甲酸羟化酶、马来酸脱氢酶、肌氨酸氧化酶、尿酸酶 等。
另外，前述酶为氧化还原酶时，还含有前述酶的反应中的电子受 体。
作为前述电子受体，例如，可以使用铁氰化钾、对-苯醌，吩嗪甲 硫酸酯(フェナジンメトサルフェ-ト)、靛酚及其衍生物、β-萘醌-4- 磺酸钾、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、锇配位化合物、钌配位化合 物、NAD+、NADP+、吡咯喹啉醌(PQQ)等。其中优选是铁氰化钾、二茂 铁、锇配位化合物、NAD+、NADP+等。
本发明的生物传感器中，前述测定试料没有特殊限制，但例如对 于含前述可溶性成分、不溶性成分、固体成分等不纯物的试料有用。 作为前述不纯物，例如、可列举蛋白质、脂、糖、血球等。作为具体 的测定试料，例如，可以使用全血、血浆、血清、唾液、尿、髓液等 的有机体试料、和果汁等的饮料水，酱油、酱汁等的食品类等，排水、 雨水、游泳池用水等，其中优选是全血、血浆、血清、唾液、髓液等， 更优选是全血。
附图的简单说明
图1是表示本发明生物传感器一个例子的图，(A)是其平面图、 (B)和(C)是其截面图。
图2是表示本发明生物传感器另一个例子的图、(A)是其平面图、 (B)与(C)是其截面图。
图3是表示本发明生物传感器的又一个例子的截面图。
图4是表示本发明的一个实施例中的电流值与开路时间的相关关 系的曲线图。
实施发明的最佳方案
以下，对本发明的实施方案更详细地进行说明。
(实施方案1)
图1表示本发明的生物传感器的一个例子。该图的(A)是前述生 物传感器的平面图，该图的(B)是前述图(A)的I-I方向截面图， 该图的(C)是前述图(A)的II-II方向截面图。如图所示，该生物 传感器1，在基板11上配置由作用极12和对电极13构成的电极系， 在该一方的端部上(图1(A)中右侧、图1(B)中右上)形成含试剂 和微粒子的单层的试剂层16。2个对电极13分别配置在基板11的横 向(箭头b方向)两端，作用极12配置在基板11的横向中央，这些 电极12、13沿基板11的纵向(箭头a方向)延伸。另外，在作用极 12和对电极13之间形成绝缘部分14。在该电极系的一端上配置垫片 (spacer)15a、15b，使之与前述电极系垂直，在该垫片15a、15b之 间配置试剂层16。而且，在垫片15a、15b上配置盖17使之覆盖试剂 层16的上部，在盖17与试剂层16之间形成在横向贯通的孔、该孔成 为供给试料用孔18。
该生物传感器1的大小没有特殊限制，可按照所供给试料的量等 适当地设定，例如，为总体长50～10mm、总体宽20～2mm、最大厚 度1500～500μm、最小厚度500～300μm，优选总体长30～10mm的 范围、总体宽10～2mm、最大厚度1000～500μm、最小厚度400～300 μm。
试剂层16的大小，例如是长10～0.2mm、宽20～2mm、厚度 400～5μm，优选是长5～0.2mm、宽10～2mm、厚度200～10μm。 基板11的大小，例如是长50～10mm、宽20～2mm、厚度1000～50μm， 优选是长30～10mm、宽10～2mm、厚度500～50μm。垫片15a、15b 的大小，例如是长20～1mm、宽20～2mm、厚度500～10μm，优选 是长10～2mm、宽10～2mm、厚度300～20μm。盖17的大小，例如 是长50～10mm、宽20～2mm、厚度1000～50μm，优选是长30～10 mm、宽10～2mm、厚度500～50μm。孔18的大小，例如是长10～0.2 mm、宽20～0.2mm、高500～5μm，优选是长5～0.2mm、宽10～2mm、 高度300～10μm。再者，所谓各部位的「长度」是指生物传感器的纵 向的长度、所谓「宽」是指横向的长度。
具体地，供给料约2μL时，试剂层16的大小，例如是长2～0.2 mm、宽20～2mm、厚度400～5μm，优选是长1～0.4mm、宽10～2mm、 厚度200～10μm。孔18的大小，例如是长2～0.2mm、宽20～2mm、 高500～50μm，优选是长1～0.4mm、宽10～2mm、高300～100μm。
前述试剂层16中微粒子的含有量，可根据供给试料的种类和其量 等适当地确定，但相对于试料约2μL，例如是1～0.01mg的范围， 优选是0.5～0.05mg的范围。
另外，前述试剂层16中试剂的含有量没有特殊限制，可根据试剂 的种类、试料的种类和其量等适当地确定。例如作为试剂使用酶时， 其含有量相对于试料约2μL，优选是50～0.05U、更优选是20～0.1 U。又，使用电子受体时，其含有量相对于试料约2μL，优选是100～ 0.01μmol，更优选是50～0.05μmol。具体地讲，作为酶使用GOD、 作为电子受体使用铁氰化钾时，相对于试料约2μL，优选GOD是20～ 0.1U、铁氰化钾是50～0.05μmol，更优选GOD是10～0.2U、铁氰 化钾是10～0.1μmol。
这样的生物传感器，例如可如以下所示那样地制造。首先，准备 用于形成前述电极等的基板11。作为基板11的材料，优选是电绝缘 性，例如可列举塑料、玻璃、纸、陶瓷等。作为前述塑料，例如，可 列举聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、PS、PMMA、聚丙烯(PP)等。
其次，在前述基板11上形成由作用极12与对电极13构成的电极 系。作为前述电极，如前述那样，优选金电极和碳电极等，可采用与 其种类相应的公知的方法形成。
前述金电极，例如，可采用蒸镀法、镀敷法、金箔粘着法等形成。 前述蒸镀法，例如可在真空度1.33×10-4Pa、输入功率300W、速率 5/秒、时间2分钟的条件下采用离子镀法进行。这是，例如在PET 等的塑料片上蒸镀金，再用触刻装置，在蒸镀在前述片上的金箔层上 加工出缝隙(断开处；きれめ)的方法。由此，缝隙部分成为绝缘部 分，可形成作用极和对电极。
另外，碳电极的场合，例如，可采用在前述基板11上进行网板印 刷碳墨的手段、进行涂布的手段、镀敷手段等形成。
在前述电极上形成后述的试剂层16之前，将前述电极表面进行亲 水化处理为好。由此，电极表面即使是疏水性，通过前述处理也被亲 水化，所以如后述那样，使用试剂溶液形成试剂层时，容易均匀地形 成前述试剂层。
前述亲水化处理，可根据电极的种类适当地确定。前述电极是金 电极时，例如，将前述电极在巯基乙醇溶液、巯基乙醇胺溶液等亲水 化溶液中浸渍后，进行洗涤和干燥即可。
作为前述亲水化溶液的溶剂，例如，可列举乙醇、丁醇、丙酮、 四氢呋喃等有机溶剂等。另外，前述亲水化溶液的浓度，例如，是100～ 0.01mmol/L的范围，优选是50～0.05mmol/L的范围。另外，对于 洗涤，例如，可以使用乙醇、甲醇、丁醇、丙酮、四氢呋喃等有机溶 剂、纯水等洗涤液。
另外，电极是碳电极时，例如，可采用在表面活性剂中浸渍后用 纯水洗涤的方法来亲水化处理。
然后，在形成前述电极系的基板11上配置垫片15a、15b。如图 示，把两个垫片15a、15b隔一定间隔横向平行地配置，这样可确保后 述的试剂层16的形成部分。作为前述垫片15的材料，例如，可以使 用树脂制的薄膜或胶带等。另外，若是两面胶带，则可容易粘接后述 的盖。除此之外，例如，可用抗蚀印刷(レジストいんさつ)等手段 形成垫片。
然后，在前述垫片15a、15b的间隙部分，形成含试剂和微粒子的 单层的试剂层16。
作为前述微粒子和前述试剂，可使用前述那样的微粒子和试剂。 该试剂层可通过调制含有前述微粒子和各种试剂的溶液，将该溶液注 入到前述垫片15的间隙中来形成。
前述溶液，例如，使试剂充分溶解后，再分散前述微粒子进行调 制为好。作为前述溶剂，没有特殊限制，例如，可以使用水、缓冲液、 乙醇、甲醇、丁醇、二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃等有机溶剂等。 作为前述缓冲液，例如，可列举磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓 冲液、三盐酸缓冲液、良缓冲液等。其pH优选是4～9的范围、更优 选是5～8的范围。另外，作为水，例如，可列举纯水、蒸馏水、超纯 水等，其中从可制作不纯物极少、高精度的生物传感器的观点考虑， 优选超纯水。
前述溶液中微粒子的浓度没有特殊限制，优选是1000～10g/L的 范围，更优选是500～50g/L的范围。
前述溶液中试剂的浓度没有特殊限制，例如，酶的场合，优选是 10,000～10KU/L的范围，更优选是5000～50KU/L的范围。又，含 有电子受体时，优选是10～0.01mol/L的范围，更优选是5～0.05 mol/L的范围。
调制前述溶液后，在前述垫片15a、15b的间隙中注入该溶液。前 述注入没有特殊限制，例如，可以用自动驱动式注机等进行。再者， 为了防止微粒子的沉淀，优选边搅拌前述溶液边注入。
前述溶液的注入量，可根据所形成试剂层的大小、微粒子和试剂 的含有量等适当地确定，每10mm2的形成面积优选是10～0.1μL的 范围，更优选是5～0.2μL的范围。
前述注入后，使其干燥形成试剂层。干燥的手段没有特殊限制， 例如，可采用自然干燥、风干、减压干燥、冷冻减压干燥等的方法。 另外，也可以将这些的方法组合使用。
温风干燥时，作为其条件，例如是温度10～60℃的范围、相对湿 度RH5～40％的范围、时间1～30分钟的范围。
然后，在覆盖前述试剂层16的状态，在前述垫片15a、15b上配 置盖17。由此，在试剂层16与盖17之间所形成的细孔成为供给试料 用的孔18。
作为前述盖17的材料没有特殊限制，例如可以使用各种塑料等。
这样制作的生物传感器1，长期保存时为了防止湿气的影响，例 如，与分子筛、硅胶、氧化钙等的干燥剂一起密封保存为好。
前述生物传感器1，例如，可以与具备在某个一定的时间施加规定 的电压的手段、测定由生物传感器传达的电信号的手段、把前述电信 号演算成测定对象物浓度的演算手段等种种手段的测定机器组合而使 用。
对该生物传感器1的使用方法，列举试料是全血、测定对象是葡 萄糖、试剂是GOD和铁氰化钾的例子进行说明。
首先，利用毛细管现象等使生物传感器1的孔18吸入全血试料。 于是，利用前述微粒子的存在，防止血球等全血中的不纯物向电极附 着。另一方面，全血中的葡萄糖被试剂层16的GOD氧化，铁氰化钾被 因其氧化反应而移动的电子还原，生成亚铁氰化钾。并且自供给全血 试料经过一定时间后，采用前述施加电压的手段在对电极13与作用极 12之间外加电压，将前述还原型的亚铁氰化钾电化学氧化成铁氰化 钾，利用前述测定电信号的手段等检测这时的氧化电流。由于该氧化 电流的峰值与试料中的葡萄糖浓度成比例，因此采用前述演算手段将 该值演算成葡萄糖浓度则可求出试料中的葡萄糖浓度。采用这样的生 物传感器，如前述那样，由于试料中的不纯物不会吸附在电极上，因 此可防止灵敏度的降低，可高精度地测定。而且，也不受湿度的影响。
该生物传感器1，例如，前述试剂层还可以含有无机凝胶。作为前 述无机凝胶可以使用前述那样的无机凝胶。前述试剂层中无机凝胶的 含有量可根据无机凝胶的种类、试料的种类及其量等适当地确定，相 对于试料约2μL，例如，是100～0.1μg的范围，优选是50～0.5μg 的范围。含这样的无机凝胶的试剂层的形成，调制含前述试剂、微粒 子和无机凝胶的溶液，与前述同样地形成即可。 (实施方案2)
图2表示本发明的传感器的另一个例子。该图中图(A)是前述生 物传感器的平面图、图(B)是前图(A)的III-III方向截面图、图 (C)是前述图(A)的IV-IV方向截面图。在图2中与图1相同的地 方用相同的符号。
如图示，该生物传感器2，在基板11上配置由作用极12与对电极 13构成的电极系，在其一方的端部(图2的图(A)、(B)中右上) 形成按顺序层合了无机凝胶含有层21、试剂层16和表面活性剂含有层 22的叠层体。前述试剂层16含有试剂和微粒子。两个对电极13分别 配置在基板11的横向(箭头b方向)两端，作用极12配置在基板11 的横向中央，这些电极12、13沿基板11的纵向(箭头a方向)延伸。 另外，在作用极12和对电极13之间形成绝缘部分14。在该电极系的 一端的上面配置第1垫片15a、15b，使之与电极系垂直，在该垫片15a、 15b之间配置前述叠层体21、16、22。在第1垫片15a、15b的上面再 配置第2垫片23a、23b。然后，在第2垫片23a、23b上配置盖24， 使之覆盖前述叠层体21、16、22的上部，在盖24与叠层体21、16、 22之间，形成沿横向贯通的孔，该孔成为供给试料用孔18。再者，该 生物传感器2只要不特别地示出，就是与前述实施方案1的生物传感 器相同的形态。
前述无机凝胶含有层21中的无机凝胶的含有量，可根据供给试料 的种类和其量、无机凝胶的种类等适当确定，但相对于试料约2μl，例 如是1000～0.1μg的范围，优选是500～0.5μg的范围。
前述表面活性剂含有层22中的表面活性剂的含有量，可根据供给 试料的种类和其量、表面活性剂的种类等适当确定，但相对于试料约 2μL，例如是100～0.01μg的范围、优选是50～0.05μg的范围。
这样，层合了无机凝胶含有层21，试剂层16和表面活性剂含有层 22的生物传感器2，例如，可如以下所示地制造。再者，只要不特别 地显示，就可与前述实施方案1同样地制造。
在配置电极的基板11上配置第1垫片15a、15b以后，调制含无 机凝胶的溶液，在前述垫片15a、15b的间隙中注入和进行干燥。接着， 同样地把含试剂和微粒子的溶液、含表面活性剂的溶液分别注入和进 行干燥，把无机凝胶含有层21、试剂层16和表面活性剂含有层22顺 次地层合。再在前述第1垫片15a、15b的上面层合第2垫片23a、23b， 在该第2垫片23a、23b上面配置盖24，使之覆盖表面活性剂含有层 22的上面。由此，在表面活性剂含有层22与盖24之间所形成的细孔 成为供给试料用的孔18。
若这样地形成第2垫片，则可据此调节孔18的高度。第2垫片可 以使用与前述第1垫片相同的材料，并可同样地形成。
含前述无机凝胶的溶液，为了防止无机凝胶的沉降，优选搅拌1 小时以上，更优选是5小时以上。另外，因同样的理由，优选使用时 继续搅拌。前述溶液中的无机凝胶的浓度没有特殊限制，例如，是10～ 0.01重量％的范围，优选是5～0.05重量％的范围。
(实施方案3)
该实施方案，是试剂层为前述试剂含有层与微粒子含有层的叠层 体的本发明生物传感器的一个例子，把该生物传感器示于图3的截面 图。该图中与图1相同的部分用相同的符号。
如图示，该生物传感器3，除了在配置电极的基板11上通过试剂 含有层31层合微粒子含有层32以外，其他是与前述实施方案1同样 的构成。试剂含有层31和微粒子含有层32，例如，分别调制含试剂的 溶液和含微粒子的溶液，把含前述试剂的溶液在垫片的间隙中注入和 进行干燥后，把含前述微粒子的溶液注入到其上面和进行干燥而形 成。
该生物传感器3，与前述实施方案2的生物传感器同样，在形成试 剂层(本实施方案中为试剂含有层和微粒子含有层)之前，另行在电 极上形成无机凝胶含有层，然后，也可以在前述无机凝胶层上形成前 述试剂含有层等，也可以在微粒子含有层的上面再层合表面活性剂含 有层。
本发明的生物传感器并不受前述各实施方案任何限制，例如，所 有的层也可以含有微粒子、无机凝胶或它们二者。
实施例
以下，对本发明的实施例，与比较例一起进行说明。
(实施例1)
如以下所示，制作与前述图2同样的金电极生物传感器。首先， 作为支撑体，准备长30cm、宽30cm、厚250μm的透明PET片(以下相 同)，在该片一个表面进行金蒸镀。蒸镀条件与前述相同。使用的金 的纯度是99.95％以上。
用触刻装置，在前述PET片的金蒸镀面，在一个方向以1mm和5mm 的间隔交替地加工深0.1mm、宽0.1mm的直线缝隙(以下，称「半刻」) 该缝隙部分成为绝缘部分14，蒸镀的金被分割成作用极12和对电极 13。最后，把该PET片切断制成生物传感器，生物传感器的作用极12 的宽为1mm，对电极13的宽为2.5mm、绝缘部分14的宽为0.1mm。
又，用裁剪用机器(KINEMATIC公司制、商品名Matrix 2360)， 把前述PET片裁剪成长20mm、宽170mm。把该裁剪的片在10mmol/L 2- 巯基乙醇溶液(溶剂∶乙醇)中浸渍30分钟后，先用乙醇洗涤、再用 纯水洗涤，将其在净化实验台内室温干燥，来进行前述金蒸镀表面的 亲水化。
接着，把成为第1垫片15a，15b的两片聚酰胺制的单面胶带(住 友スリ一エム公司制、商品名Y-5579，厚度42μm)粘贴在前述金蒸镀 表面的规定位置。此时，使垫片15a与垫片15b的间隔为1mm，前述 垫片15a、15b的长度为5mm、宽为170mm。
然后，在前述垫片15a、15b的间隙形成无机凝胶含有层21。首 先，在有机硅处理过的广口瓶中加入无机凝胶(コ一プケミカル公司制、 商品名ル一センタイトSWN)150mg和纯水50.0g，在室温下搅拌一晚上 (10小时以上，500rpm)，来调制无机凝胶含有层21的原料液(以 下称「A液」)。前述A液，为了防止无机凝胶的沉淀，在即将使用前调 制，在后述的注液时也继续前述搅拌。
用注射器在前述PET片的第1垫片15a、15b的间隙部移入前述A 液。前述A液的注液量，相对于注液表面面积6mm×1mm(相当于1个 生物传感器)，为1.74μl。前述注液后，将其在净化实验台内或干燥 器内在室温下静置干燥30分钟以上。再用干燥机在35℃，相对湿度 10％以下的气氛中干燥30分钟(以下，称为蜂窝式干燥(ハニ-ドライ)) 形成无机凝胶含有层21。
接着，在前述无机凝胶含有层21上形成含无机凝胶与试剂的单层 的试剂层16。首先，调制试剂层16的原料液(以下、称「B液」)。在 有机硅处理过的广口瓶中加入无机凝胶(前述ル一センタイトSWN)400mg 和纯水50.0g，在室温下进行搅拌(10小时以上，500rpm)。在褐色 瓶中加入前述无机凝胶溶液1.0mL、纯水3.0mL和铁氰化钾 (ナカライテスク公司制)320mg在室温下进行搅拌。使铁氰化钾完全 溶解，调制铁氰化钾溶液。然后，在另外的褐色瓶中加入葡萄糖氧化 酶(天野制药公司制)2.40KU和微粒子(积水化成公司制，商品名 BMX-5，平均粒径5μm，原料化合物名PMMA)500mg，再加入前述铁氰 化钾溶液2.0mL，充分搅拌直到溶液变得均一，以此作为B液。搅拌时 要十分注意使溶液中不产生气泡。另外，前述B液，为了防止微粒子 的沉降，边搅拌边进行下述注液。
在前述片上的无机凝胶含有层21表面，用注液用机器(Bio Dot 公司制，商品名Dispenser System)注入前述B液。前述B液的注液 量，相对于注液表面面积6mm×1mm(相当1个生物传感器)，为1.30μL。 注液后，将其在烘箱中在50℃、无风状态下干燥10分钟，再同样地进 行前述蜂窝式干燥10分钟，形成试剂层16。
然后，在前述试剂层16上形成表面活性剂含有层22。首先，在褐 色瓶中加入高纯度蛋黄卵磷脂(キユ一ピ一食品公司制)250mg和乙醇 50.0mL，在室温下搅拌到变得均匀，调制表面活性剂含有层22的原料 液(以下，称「C液」)。
然后，在前述片11的试剂层16表面，用前述注液用机器注入前 述C液。前述C液的注液量，相对于注液表面面积6mm×1mm(相当1 个生物传感器)，为0.30μL。注液后将其进行前述蜂窝式干燥(干燥 时间15分钟)形成表面活性剂含有层22。接着，把该片与分子筛一起 放入减压保存容器中，在室温、压力约100Pa的条件下进行一晚减压 干燥。
然后，作为第2垫片，把PET薄膜中芯两面胶带(大日本油墨公 司制、商品名ダイダツク两面胶粘带、厚度150μm)配置在第1垫片15a、 15b上。一方的第2垫片23a是长5mm、宽160mm，另一方的第2垫片 23b是长5mm、宽160mm。然后，再粘贴长15mm、宽160mm、厚188μm 的PET制薄膜，以此作为盖24使之覆盖前述第2垫片23a、23b及其 间隙部分。
用前述裁剪用机器，把获得的该叠层体裁剪成宽6mm，制作长 20mm、宽6mm的目的生物传感器。再者，该生物传感器在使用之前， 在褐色瓶中与3g以上的分子筛一起保存。
(实施例2)
在前述B液的调制中，除了用商品ラポナイトXLS(ラポルテ公司制) 代替前述ル一センタイトSWN以外，其他与实施例1同样地制作生物传感 器。
(实施例3)
在前述5液的调制中，除了用纯水1.0mL代替前述无机凝胶溶液 1.0mL以外，其他与实施例1同样地制作生物传感器。
(实施例4)
除了在前述A液的调制中，作为无机凝胶用前述ラポナイトXLS代 替前述ル一センタイトSWN，而在前述B液的调制中用纯水1.0mL代替前 述无机凝胶溶液1.0mL以外，其他与实施例1同样地制作生物传感器。
(实施例5)
如以下所示，制作与前述图2同样的碳电极生物传感器。再者， 只要不特别显示，就与前述实施例1相同。
采用碳墨，在作为基板11的前述透明PET片的一个表面施行碳印 刷，形成作用极12与对电极13。印刷使用网版印刷机，其条件为 SUS·300目、刮墨刀(スキ-ジ)压力3～5MPa、印刷速度0.5m/s、 涂布速度0.5m/s、间隙2.0mm、触点断开(开路触点；off contact) 15度。把前述片在90℃干燥30分钟。
然后，在前述PET片的电极侧表面，采用以绝缘性UV固化树脂为 主成分的抗蚀墨(resist ink)进行抗蚀印刷，将其干燥后形成第1 垫片15a，15b。该抗蚀印刷使用网版印刷机，其条件为聚酯·250目、 刮墨刀压力3～5MPa，印刷速度0.15m/s，涂布速度0.15m/s，间隙 4.0mm，触点断开15度。再者，第1垫片的尺寸等与前述实施例1同 样地设定，其厚度，进行调整使得后述的干燥后的厚度为10μm。另外， 前述干燥使用UV干燥机在3.7m/s的条件下进行。
然后，在前述垫片15a、15b的间隙形成无机凝胶含有层21。前 述A液的调制，作为无机凝胶使用前述ラポナイトXLS 150mg代替前述 ル一センタイトSWM，前述A液的注液量，相对于注液表面面积6mm×1mm (相当1个传感器)为1.45μL。
然后，在前述无机凝胶含有层21上形成试剂层16。作为原料的B 液如下地进行调制。在褐色瓶中加入纯水3.0mL、前述微粒子750mg 和前述铁氰化钾240mg进行搅拌，使铁氰化钾完全溶解，调制铁氰化 钾溶液。接着，在另外的褐色瓶中加入前述葡萄糖氧化酶2.40KU和前 述铁氰化钾溶液2.0mL充分搅拌直到均匀，将此作为B液。前述B液 的注液量，相对于注液表面面积6mm×1mm(相当于1个传感器)，为 1.08μL。
以后，与前述实施例1同样地，通过进行表面活性剂含有层22的 形成，第2垫片23a、23b及盖24的配置，制作叠层体，将其裁剪， 制得目的生物传感器。
(实施例6)
除了不形成无机凝胶含有层21以外，其他与实施例5同样地制作 生物传感器。
(比较例1)
如以下所示制作以往的生物传感器。首先，与实施例5同样地在 前述PET片上形成碳电极，再与实施例1同样地形成垫片。而且，调 制3重量％羧甲基纤维素(CMC)水溶液后，将其注入在前述PET片的 电极系上进行干燥形成CMC层。前述CMC溶液的注液量，相对于注液 表面面积6mm×1mm为3μL。然后，在纯水4.0mL中加入铁氰化钾320mg 进行搅拌，使之完全溶解后，在该铁氰化钾水溶液2mL中加入葡萄糖 氧化酶2.40KU，充分搅拌直到均匀。把该试剂液注入在前述CMC层上， 与前述实施例1同样地进行干燥形成试剂层。前述试剂液的注液量， 相对于注液表面面积6mm×1mm为1.30μL。然后，与前述实施例1同样 地配置第2垫片，粘贴盖。
对如前述那样制得的各实施例与比实例1的生物传感器进行以下 所示的各种试验。
(Hct对金电极生物传感器的影响)
对前述实施例1～4的各生物传感器和比较例的生物传感器分别测 定电流值。作为试料，对于前述实施例1～4的生物传感器，分别使用 生理食盐水(以下，称「Sa」)，添加葡萄糖的(浓度1000mg/L)生理 食盐水(以下，称「GSa」)，人全血(以下，称「WB」)及人血浆(以下， 称「P」))，对于比较例的生物传感器使用前述人血液(WB)和人血浆 (P)。前述人血液(WB)的HCt是46％，人血液(WB)和人血浆(P) 的血浆中葡萄糖浓度是1270mg/L。
首先，把各生物传感器与稳压器(RAS公司制、商品名CV 100W) 相连接，在室温下将前述试料吸入生物传感器内后，保持开路状态25 秒钟。然后，测定外加电压5秒钟的时刻的电流值。对实施例1～4的 传感器，电压设定为250mV，对比较例的生物传感器电压设定为 500mV。对各生物传感器和各试料，在相同条件下分别测定前述电流值 3次，求其平均值。另外，对各生物传感器分别用下述式(1)和式(2) 求背离率A(％)和背离率B(％)。式中，ESa1、EGSa1、EWB及EP是用前 述各试料测定时的前述电流值的平均值。前述背离率A与背离率B均 是表示试料中不纯物的影响的程度的值，前述背离率A主要是有关血 球的影响的值，前述背离率B是除此之外还有有关盐类的影响的值。 这些绝对值愈小前述不纯物的影响愈小。
背离率A(％)＝[(EWB-EP)/EP]×100           …(1)
背离率B(％)＝[(EWB-EP)/(EP-ESa1)]×100   …(2)
把前述电流值的平均值和用前述平均值由前述式(1)和式(2) 算出的背离率A和背离率B示于下述的表1。
(表1)
             实施例1   实施例2    实施例3    实施例4    比较例
ESa1         0.509     0.493      0.293      0.231      -
EGSa1        2.125     2.285      1.808      2.173      -
EWB         2.868     2.539      2.123      2.059      2.364
EP          2.860     2.736      2.395      2.153      2.844
背离率A(％)  0.3       -7.2       -11.3      -4.4       -16.9
背离率B(％)  0.3       -8.8       -12.9      -4.9       -
如前述表1所示，实施例的生物传感器的背离率A的绝对值，比 比较例的生物传感器的背离率A的绝对值小。另外，实施例的背离率B 的绝对值也基本上与实施例的背离率A的绝对值相同。这表明采用实 施例的生物传感器，Hct导致的影响小，可准确地测定血液中的成分。
(开路时间的影响确认)
使用前述实施例4的金电极生物传感器，为了调查开路时间的影 响进行电流值测定。再者，作为试料，使用添加葡萄糖(浓度5000mg/L) 的生理食盐水。
首先，把实施例4的生物传感器与前述稳压器相连接，使前述生 物传感器吸引前述试料后，将开路状态保持规定的时间(0、5、10、 15、25秒)。然后，测定施加5秒钟250mV电压后的时刻的电流值。 将该结果示于图4。该图是表示开路时间和电流值的相关关系的曲线 图。
如图4所示，电流值基本上不受开路时间的影响。这表明实施例4 的生物传感器在吸引试料后在短时间内迅速地进行酶反应。由此说明 本发明的生物传感器可进行迅速的测定，具有良好的操作性。
(Het对碳电极传感器的影响确认)
对前述实施例5的碳电极生物传感器和实施例4的金电极生物传 感器以及比较例的生物传感器分别测定电流值。作为试料，对于实施 例4和5的生物传感器分别用生理食盐水(Sa1)、人全血(WB)、人 血管(P)，对于比较例的生物传感器用前述人全血(WB)、人血浆(P)。 前述人全血(WB)的Hct是49％，人全血(WB)和人血浆(P)的血浆 中葡萄糖浓度是1110mg/L。
首先，把实施例4的金电极生物传感器和实施例5的碳电极生物 传感器分别与前述稳压器相连接。然后，将前述试料吸入生物传感器 内后，测定施加20秒钟电压的时刻的电流值。电压，对于金电极传感 器为250mV，对于碳电极为350mV。另外，对于比较例的生物传感器， 与前述稳压器相连接，将前述试料吸入生物传感器内后，保持电路状 态25秒钟，测定施加5秒钟电压的时刻的电流值。对各生物传感器， 在相同条件下测定前述电流值4次，求其平均值。再者，与前述同样 求出背离率A(％)和背离率B(％)。把前述电流值的平均值、背离率 A(％)和背离率B(％)的结果示于下述表2。
(表2)
               实施例5    实施例4     比较例
ESa1          0.073      0.108       -
EWB           0.757      1.075       2.206
EP            0.766      1.140       2.404
背离率A(％)    -1.0       -6.0        -8.2
背离率B(％)    -1.2       -6.2        -
由前述表2看出，两实施例的生物传感器的背离率A的绝对值， 比比较例的生物传感器的背离率A的绝对值小。另外，两实施例的背 离率B的绝对值也分别大致与背离率A的绝对值相同。这表明采用实 施例的生物传感器，Hct的影响小，可准确地测定血液中的成分。另外， 有关该Hct的影响的回避，即使是实施例4的金电极生物传感器也比 比较例的过去产品获得良好的结果，采用实施例5的碳电极生物传感 器，显示更好的效果。
(湿度的影响)
对前述实施例4的金电极生物传感器、和实施5及实施例6的碳 电极生物传感器、以及比较例的生物传感器，为了调查湿度的影响， 用以下的方法测定电流值。
首先，使用充分干燥的未使用的生物传感器测定电流值。作为试 料，分别使用生理食盐水(Sa1)和添加葡萄糖(浓度100mg/L)的生 理食盐水(GSa1)。将生物传感器与前述稳压器相连接，生物传感器 内吸入前述试料后，保持开路状态25秒钟。然后，测定施加5秒钟电 压的时刻的电流值。前述电压，对于实施例4的金电极生物传感器设 定为250mV，对于实施例5及6的碳电极生物传感器设定为350mV，对 于比较例的生物传感器设定为500mV，关于各生物传感器，在相同条件 下测定前述电流值2次，求其平均值。另外，在温度保持在40℃，相 对湿度保持在85％的密闭容器(ADVANTEC公司制、商品名AE-215)中， 放置已充分干燥的未使用的生物传感器30分钟。然后，用这些生物传 感器，在与前述相同的条件下测定前述电流各2次，求其平均值。
这里，把前述放置前的生物传感器的电流值的平均值记为1ESa1、 1EGSa1，把放置后的生物传感器的电流值的平均值记为2ESa1、2EGSa1。另外， 前述放置后的电流值的平均值与前述放置前的电流值的平均值之比 RSa1(％)和RGSa1(％)，分别用下述式(3)与式(4)求出。RSa1(％) 和RGSa1(％)的值愈接近100，愈表明湿度的影响小。把对前述各生物 传感器测定的结果示于下述表3。
RSa1(％)＝(2ESa1/1ESa1)×100        …(3)
RGSa1(％)＝(2EGSa1/1EGSa1)×100     …(4)
(表3)
            实施例4     实施例5     实施例6     比较例
1ESa1      0.256       0.212       0.161       0.165
2ESa1      0.552       0.283       0.315       4.144
RSa1(％)   216         133         196         2519
1EGSa1     2.191       1.614       1.499       2.498
2EGSa1     2.357       1.711       1.963       6.164
RGSa1(％)  108         106         131         247
如前述表3所示，实施例的生物传感器与比较例的生物传感器比 较，获得RSa1(％)和RGSa1(％)接近100的结果。这表明湿度的影响小， 采用本发明生物传感器不受湿度的影响。
产业上利用的可能性
由以上可知，本发明生物传感器不容易受试料中的固体成分、可 溶性成分、不溶性成分等测定对象物以外的物质的影响、和湿度的影 响，能高精度地测定测定对象物。另外，由于酶反应迅速地进行，所 以操作性也好。