技术领域

本发明涉及一种生物传感器，更具体地，涉及一种包含微孔膜载体， 第一电极系统，第二电极系统，和一对绝缘膜的生物传感器，其中第一 电极系统在微孔膜载体的表面形成并且第二电极系统在微孔膜载体的反 面形成。

发明技术

生物传感器是指一种设备，探针，或电极，其当与适当的样品接触 时，在存在目的分析物的条件下产生电信号。通常通过固定与合适的转 换系统紧密接触的生物敏感物质以将分析物的浓度转化成可定量的信号 来构建生物传感器。

尽管几个优点，当前可用的生物传感器全部有很多有待解决的问题： 化学干扰，环境影响，长期稳定性，信噪比和传感器包装系统的设计。

在生物传感器的发展中可看出下列趋势：

a)小型化

b)用组合多于一种敏感元件的阵列传感器系统测定几种试剂

c)开发可大规模生产的任意使用的(disposable)传感器

d)使用可植入生物芯片体内分析

e)处理来自具有人工智能系统的阵列传感器系统的输出

同时，一个长期目标是开发一种迅速，简单，免分离的检测蛋白的 方法。已经使用显色和发荧光的半乳糖苷-葡聚糖底物来设计针对C-活性 蛋白(C-reactive protein)，铁蛋白和免疫球蛋白的均相酶免疫测定(EIAs) (Gibbons等，“Homogeneous Enzyme Immunoassay for Proteins Employing β-Galactosidase，”Analytical Biochemistry 102/167-170，1980；和Armenta 等，“Improved Sensitivity in Homogeneous Enzyme Immunoassays Using a Fluorogenic Macromolecular Substrate：An Assay for Serum Ferritin，” Analytical Biochemistry 146/211-219，1985)。然而，在该均相方案中酶活 性的低程度调节已使该方法对于现实应用而言不切实际。

此外，已报道一种针对大分子的免分离的双固相EIA，其依赖于一种 酶偶联物(生物素-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-抗体)在结合了聚苯乙烯胶乳 的抗生物素蛋白和结合了聚苯乙烯胶乳的分析物的两种固体相之间的分 配(Schray等，“Separation-Free Dual Solid Phase Enzyme Immunoassay for Macromolecules，”Analytical Chemistry，60/353-56，1988)。然而，该测定 方案需要24小时来酶促产生可检测的产物。

早就认识到将电化学检测与EIAs结合将是有利的。电极对检测样品 的颜色或浊度不敏感，因此可用来开发可直接应用于全血样的方法。然 而，许多关于使用电化学检测来设计EIAs或“免疫传感器”的报道的大多 数已依赖于使用这样的传感器如多相测定设备中的固相，其中将抗体固 定在给定电极的表面。在样品与其它试剂温育后，在加入测量束缚酶 (bound enzyme)活性所需的底物之前必须洗涤电极表面。

作为一个具体实例，在1991年11月5日颁发的美国专利No.5,063,081 中，Cozzette等公开了一种用于检测特定分析物种类如抗原的基于配体/ 配体受体的生物传感器。这里，一种基底传感器(base sensor)，其包含 一种使用贵后过渡金属(noble late transition metal)如铱，金，铂或银的 催化指示电极，并被一种由例如银和氯化银制成的组合参比和对电极(柱 25-26)包围。一种抗体固定在基底传感器上。然后将得到的生物传感器 与含有样品和标记的第二种分析物特异性抗体的混合物接触(柱45-46)。 还可将选择透性硅烷层用作针对干扰物的筛子。然而，优选通过使用洗 涤溶液或通过使用含有酶底物作为洗涤物的溶液从传感器去除未结合物 质和干扰电活化粒种(柱47-49)。

作为另一个具体实例，在1998年11月3日颁发的美国专利No.5,830,680 中，Meyerhoff等公开了一种适合在任何本底信号上检测分析信号的酶夹 层免疫测定盒，所述本底信号是源自与所述盒接触的本体溶液(bulk solution)。这里，所述盒包含一种微孔膜载体，其一侧已经用一种导电金 属层涂布，和至少一个第一捕捉抗体层，其被固定在微孔膜载体的至少 一个第一空间独特区域中的导电金属层上。参考图1，其是扩散电池设备 的图解，可以看到该盒需要另外的辅助电极和/或参比电极，因此未实现 小型化和现场检测(point-of-care testing)。

因此，尽管该领域中所有过去和当前的研究活动，长期以来期望一 种可以避免上述缺点的新型生物传感器。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种生物传感器，其包含微孔膜载体，其 上固定生物活性物质的第一电极系统，第二电极系统和一对绝缘胶片， 其中第一电极系统在微孔膜载体的表面形成并且第二电极系统在微孔膜 载体的反面形成。

本发明的另一个目的是提供一种生物传感器，其包含微孔膜载体， 其上固定生物活性物质的第一电极系统，第二电极系统和一对绝缘膜， 一个垫板和一对带孔的盖子，其中第一电极系统在微孔膜载体的表面形 成并且第二电极系统在微孔膜载体的反面形成，并且将一种酶-分析物偶 联物或一种酶-抗体偶联体固定在垫板上。

附图简述

参考附图可最好的理解本发明最优实施方案的应用，附图中相同的 参考号用于相同和对应的部分，其中：

图1是现有技术扩散电池设备的示意图，其中在微孔膜载体上只形成 一个电极系统；

a：分析物溶液b：底物溶液

图2a为依照本发明实施方案1在整个条带上形成的基于对称微孔电极 的生物传感器的分解透视图；

图2b是本发明实施方案1的生物传感器的透视图；

图2c是基于对称微孔电极的生物传感器的分解透视图，其中依照本 发明实施方案1使用分别在两个绝缘基片上形成的电连接器改装生物传感 器；

图2d是2c生物传感器的透视图，其中依照本发明实施方案1改装生物 传感器；

图2e是基于不对称微孔电极的生物传感器的分解透视图，其中依照 本发明实施方案1使用分别在两个绝缘基片上形成的电连接器改装生物传 感器；    

图2f是2e生物传感器的透视图，其中依照本发明实施方案1改装生物 传感器；

图3是依照本发明实施方案1说明生物传感器应用实例的图解；

图4a是依照本发明实施方案2的生物传感器的分解透视图；

图4b是依照本发明实施方案2的生物传感器的透视图；

图5是说明依照本发明实施方案2将生物传感器应用于样品溶液的实 例的图解；

图6a和图6b是依照本发明实施方案2装备了改良进样毛细管的生物传 感器的截面图；

图7a是依照本发明实施方案3的生物传感器的分解透视图；

(关于图7b-7e我推荐使用单独的图号)

图7b-7e显示依照本发明实施方案3生物传感器的各种改装；

图8显示提及的免分离免疫测定步骤的原理和顺序的图解；

图9是本发明扩散电池设备的示意图；

图10是生物传感器的环状伏安图，该生物传感器是实施例1中基于不 对称微孔电极的生物传感器，其中将铁氰化钾用作电极的氧化还原剂；

图11是实施例1生物传感器的典型校正曲线，其中将葡糖氧化酶物理 固定在用于葡萄糖分析的工作电极上；

图12是实施例2生物传感器的动态响应曲线，其中将葡糖氧化酶和铁 氰化钾物理固定在工作电极上；

图13是实施例3生物传感器的校正曲线，其中将葡糖氧化酶-生物素 偶联物用作酶-分析物偶联物并且将抗生物素蛋白用作抗体；

图14是实施例3生物传感器的动态响应曲线和

图15是实施例4 CRP生物传感器的校正曲线；使用固定在前面微孔电 极的CRP抗体，在上垫板中干燥的碱性磷酸酶-CRP偶联物和通过底板浸 泡的对-氨基苯磷酸盐来获取信号。

发明详述

本发明涉及一种生物传感器，其包含微孔膜载体，第一电极系统， 第二电极系统和一对绝缘膜(或一对带有电连接器的绝缘基片)，其中第 一电极系统在微孔膜载体的表面形成并且第二电极系统在微孔膜载体的 反面形成。依照本发明的生物传感器不需要任何附加电极。

参考图2a和2b，依照本发明的生物传感器使用的电化学电池(100) 包含一个微孔膜载体(101)，第一电极系统(102)，第二电极系统(103)。 第一电极系统(102)由其上固定生物活性物质的工作电极(104)，第一 电极连接器(105)和第一引线出口(106)组成。第二电极系统由一个 对电极(107)，第二电极连接器(108)和第二引线出口组成(109)。第 一电极系统和第二电极系统(102，103)通过电极连接器(105，108) 经由例如鳄鱼夹或焊剂的连接被电连接。

参考图2b至2f，其中改装2a的生物传感器，按照本发明的生物传感器 中使用的电化学电池(100)包含微孔膜载体(101)，第一电极系统(102)， 和第二对称(2b)或不对称(2c)电极系统(103)。第一电极系统(102) 由其上固定生物活性物质的工作电极(104)，在顶部绝缘膜的下侧形成 的第一电极连接器(105)和第一引线出口(106)组成。第二电极系统 由一个对电极(107)，底部绝缘膜的上表面形成的第二电极连接器(108) 和第二引线出口(109)组成。将第一、第二引线出口(106和109)紧压 与第一、第二电极连接器(105和108)连接，并且还将在顶部绝缘膜下 侧形成的分段的第一连接器(105’)和在底部绝缘膜的表面形成的105紧 压连接以在底部基片上以面朝上的方向安装两个连接器(105’和105)。 通过将它们插入插座中连接电极连接器(105，108)电连接第一和第二 电极系统(102，103)。

通常通过化学气相淀积或物理蒸气淀积喷镀导电材料或通过丝漏印 刷导电材料形成第一和第二电极系统(102，103)。能够用来形成第一和 第二电极系统(102，103)的导电材料的实例包括但不限于导电聚合物， 碳，和导电金属如金，铂，银，铑，铱，钌，钯，锇或铜。导电材料通 常形成厚度为大约150至大约1000的层。更优选地，导电层厚200-800 ，最优选导电层厚300-600。

可用来形成微孔膜载体(101)的材料应与经常用于将生物活性物质 如酶，电子传递介质和抗体固定在电极系统上的有机溶剂相容，并且应 显示足够高的拉伸强度以抵抗在操作过程中多孔结构的撕裂和/或其它扭 变。可用来形成微孔膜载体(101)的材料的实例包括有机聚合物(例如 尼龙，硝化纤维，聚偏二氟乙烯，聚砜，聚酯或聚碳酸酯)和无机材料 如多孔陶瓷或吸附陶瓷。优选微孔尼龙网，因为它是天然亲水的而且可 以以基本上不含湿润剂的形式商购。

即使在用导电层涂布膜之后，它也仍可以是微孔性的，具有约0.01 微米至约10微米的通常范围内的孔径。甚至理论上更大的孔径也是可能 的，其只被用于部分封闭(occlude)孔的附加导电材料的费用所限制。优 选的平均孔径为约0.2μm至约0.45μm。该孔径允许具有不超过5000Da分 子量的分析物以及底物通过孔。

电化学电池(100)的表面，除了工作电极(104)，第一电极连接器 (105)，对电极(107)和第二电极连接器(108)的区域以外，都用绝 缘膜(110，111)覆盖。可以用来形成绝缘膜(110，111)的材料包括 但不限于聚氯乙烯(PVC)或它的共聚物如聚氯乙烯-二(2-乙基己基) 癸二酸酯，聚乙烯，聚氨基甲酸酯，聚碳酸酯，聚酯等。还可通过将绝 缘聚合物糊丝漏印刷在尼龙膜上，接着热处理来形成绝缘膜(110，111)。 绝缘膜(110，111)应该仅限制底物通过微孔膜区域的扩散并且应该最 小化生物传感器的扭变。如果微孔电极和尼龙膜的尺寸与图2c-2f中所 示相同，可以将电连接分别印刷在绝缘膜上，并且可以紧压以连接电极 和组装生物传感器系统。

该形式的生物传感器(2c-2f)在大规模制造方面有优势；可以分别 制备印在绝缘盖上沉积金的微孔电极和连接电极并且在将生物材料固定 在工作电极上后一步组装为一个整体。如果采用等离子沉积的方法，非 对称的双面电极(2e和2f)可能比对称的双面电极(2c和2d)更容易制 备；非对称双面电极，需要在丝漏印刷的对电极反面电极沉积一次即可， 而对称的双面电极需要在破坏真空后电极沉积两次。

按照本发明的生物传感器可以迅速，简单，免分离的电化学免疫测 定和选择性检测分析物。另外，该生物传感器不需要任何附加电极因此 可以实现小型化，现场检测和任意使用。

如图3所示，按照本发明的生物传感器可直接应用于人体来检测各种 样品，包括生物材料。待测的生物材料包括代谢物，例如葡萄糖，胆固 醇，乳酸，肌酸酐，蛋白质，过氧化氢，醇，氨基酸，谷氨酸丙酮酸酯 和谷氨酸草酰乙酯。例如，使用胆固醇氧化酶，乳酸氧化酶，谷氨酸氧 化酶，辣根过氧化物酶或醇氧化酶可分别定量分析胆固醇，乳酸，谷氨 酸，过氧化氢和乙醇。为工作电极提供的电子传送介质可使用二茂铁或 它的衍生物，醌或它的衍生物，有机导电盐类或viologen。电子传送介质 可固定在与酶结合的工作电极上，并且优选是一种能形成氧化还原对的 混合价化合物。优选的化合物包括六胺基氯化钌(III)，铁氰化钾，亚铁 氰化钾，二甲基二茂铁，二茂铁，一元羧酸二茂铁，7，7，8，8-四氰基对醌 二甲烷，四硫富瓦烯，二茂镍，N-methylacidinium，四硫并四苯 (tetrathiatetracene)，N-甲基吩嗪鎓(N-methylphenazinium)，氢醌，3-二 甲氨基安息香酸，3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone，2-甲氧基-4-烯 丙基苯酚，4-氨基安替比林(4-aminoantipyrin)，二甲替苯胺，4-氨基安替 比林(4-aminoantipyrene)，4-甲氧基萘酚，3，3，5，5-四甲基联苯胺，2，2-连 氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(酯)](2，2-azino-d-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]，邻联(二)茴香胺，邻甲苯胺，2，4-二氯苯酚，4-氨基非那宗， 联苯胺和普鲁士蓝。

按照本发明的生物传感器的另一个优选实施方案如图4a和4b所示， 其中生物传感器包含：一个微孔膜载体(101)；第一电极系统(102)， 其由一个其上固定生物活性物质的工作电极(104)组成，第一电极连接 器(105)和第一引线出口组成(106)；第二电极系统(103)，其由一个 对电极(107)组成，第二电极连接器(108)和第二引线出口组成(109)； 一对绝缘膜(110，111)；一个吸收垫板(112)；和一个多孔材料(113) 制成的薄膜，通过毛细管作用分析物透过其导入。

参照图4a，4b，和5，更详细地描述生物传感器的工作原理。透过与 微孔电极后的吸收垫板(112)结合的薄多孔材料(113)，通过毛细管作 用导入含有分析物的样品溶液(2)。在该过程中，通过尺寸和电荷排阻， 极性磷脂和混合控制，可以消除干扰如人血中含有的固体粒子(血细胞 比容)使得只有血浆接触到固定在工作电极(104)上的生物活性物质。 在生物活性物质的催化作用下，分析物是产生容易氧化或还原种类的电 化学活性种类。该氧化还原种类在电极传递或接受电子而产生与分析物 浓度成比例的电信号，因此可以实现定量测量。另外，在由微孔膜载体 (101)，吸收垫板(112)和薄多孔材料(113)作用产生的化学势的调 节下，可将样品溶液的流量调整在合适的范围。

同时，导入生物传感器内部的样品溶液以及通过酶反应产生的种类 被吸收到吸收垫板(112)中，这样可以保证大约30分钟至大约20小时的 连续测量。该类型的生物传感器可称为自动进样和流动生物传感器。维 持样品的连续流动不需要机械组件如蠕动泵和复杂的流体通道。此外， 由于可以连续测量，如图3所示，该生物传感器除了血液外还可以适用于 体液。

图6a和6b显示本发明另外的实施方案。在图6a中，生物传感器另外 包括第一和第二微孔膜载体(101a，101b)和粘合层(130)；在图6b中， 生物传感器另外包括第二微孔膜载体(101b)，粘附层(130)和塑料基 片(140)。

按照本发明的生物传感器还可用作通过EIA检测分析物蛋白质的免分 离固相免疫传感器。

图7a显示了按照本发明生物传感器的一个优选实施方案。参照图7a， 用于EIA的生物传感器包含：一个微孔膜载体(101)；第一电极系统 (102)，其由一个其上固定生物活性物质(抗体)的工作电极组成，第 一电极连接器(105)和第一引线出口(106)组成；第二电极系统(103)， 其由一个对电极(107)组成，第二电极连接器(108)和第二引线出口 (109)组成；一对绝缘膜(110，111)；一个其上吸收和干燥酶-分析物 偶联物的垫板(114a)；和一对分别带孔(117，118)的盖子(115，116)。

参照图7a和图8，更充分描述提及的免分离免疫测定步骤的原理和顺 序。通过顶盖(115)上形成的孔(117)将含有分析物的样品溶液(例 如血液)导入生物传感器。导入的溶液与吸收了预定量的酶-分析物偶联 物的垫板(114a)(例如硝化纤维膜，纸和玻璃纤维)接触。然后，分析 物蛋白质和溶解在溶液中的酶-分析物偶联物形成与固定在工作电极 (104)上的生物活性物质(抗体)的竞争性结合。在已经形成充分结合 后，通过在底盖(116)上形成的孔(118)导入对缀合酶特异的底物。 该底物穿过孔，与结合的酶-分析物偶联物接触，并引发酶反应。通过该 反应，将底物转化为产物，并且传递到电极的电子产生电信号。该电信 号传至电极系统(102)表面并通过适当的设备检测。通过底物与未结合 的酶-分析物偶联物的反应也可产生电信号。然而，未结合的酶-分析物 偶联物离电极表面足够远结果酶-底物反应产生的电子不能到达电极。由 此，可以省略洗涤步骤和分离步骤。

电信号与捕获的酶-分析物偶联体的量成比例，因此从校正曲线评估 可以定量分析物蛋白质的量。此外，由于对电极系统(103)是在微孔膜 载体(101)的反面形成，不需要另外的电极系统。因此可以实现一种小 型化，免分离的固相免疫传感器。

图7b，7c，7d，和7e各自显示其它使用改进的按照本发明生物传感 器的优选实施方案。如图7b和7d所示，可以加入吸附有底物的垫板 (114b)，其使得分析物蛋白质的检测更简单。如图7c和7d所示，可以加 入过滤垫(114c)，这样通过例如尺寸排阻，电荷排阻，极性磷脂和混合 控制，可以预先消除干扰如人血中含有的固体粒子(血细胞比容)。此外， 过滤垫(114c)上可吸收蛋白质稳定剂和/或缓冲溶液以实现改善的分析 物蛋白质检测。如图7e所示，通过其加入样品溶液的孔和经由毛细管与 底物槽(reservoir)连接、通过其加入底物溶液的孔可以在相同一侧形成， 这样可以实现更简单的样品和底物溶液供应。通过在底部基片(116)上 冲孔或模压图案可以形成连接毛细管(119)与底物槽(118’)的孔(118)。 如果将底部基片(116)模压以形成连接毛细管(119)与槽(118’)的 孔(118)，第二底板是不必要的。

如本领域的技术人员所熟知，可以将酶-抗体偶联物而不是酶-分析物 偶联物吸收于垫板中(114a)。此外，选择合适的酶-底物对也是众所周 知的。例如，尿酸酶-尿酸对，肌氨酸氧化酶-肌氨酸对，胆固醇氧化 酶-胆固醇对，3-磷酸甘油氧化酶-3-磷酸甘油对，丙酮酸氧化酶-丙 酮酸对，硫辛酰胺脱氢酶-NADH对，过氧化氢酶-H2O2对，L-谷氨酸 氧化酶-L-谷氨酸对，胆红素氧化酶-胆红素对，碱性磷酸化酶-对-氨 基苯酚磷酸盐对，和葡糖氧化酶-葡萄糖对都是合适的酶-底物对(见美 国专利No.5,830,680)。

也可以非干燥的形式使用依照本发明的生物传感器。

如图9所示，非干燥的生物传感器包含：一个微孔膜载体(101)；其 上固定抗体的第一电极系统(102)；第二电极系统(103)；和一对绝缘 膜，其中第一电极系统(102)在微孔膜载体(101)的表面形成而第二 电极系统(103)在微孔膜载体(101)的反面形成。将分析物和酶-偶联 物(酶-分析物偶联物或酶-抗体偶联物)放在第一个隔室(200)中，将 酶的底物放在第二个隔室(300)中。

如图9所示，因为第一电极系统(102)和第二电极系统(103)一起 在微孔膜载体(101)的两个表面形成，不需要另外的电极。

本发明的生物传感器可以适用于任何能够导致抗体产生的分析物， 例如，C-活性蛋白，hCG，PSA，肌氨酸磷酸激酶(同工酶MB，BB和MM)， 肌钙蛋白，肌红蛋白，肌球蛋白轻链，血纤蛋白原，促甲状腺激素，FSH， 肝炎抗原，糖基化蛋白(glycated proteins)(如Hb A1c和果糖胺)和与各 种各样的特异性病毒如马铃薯病毒相关的各种蛋白质。

所用的底物取决于使用的酶。技术人员将容易实现酶-底物对的合适 选择。例如，当将葡糖氧化酶用作酶时，优选底物为葡萄糖。通过葡糖 氧化酶的催化作用葡萄糖氧化为葡萄糖酸并产生H2O2。H2O2在大约+700 mV的电压下(相对于Ag/AgCl)产生电信号。

另一方面，当使用碱性磷酸化酶时，优选对-氨基苯磷酸盐。对-氨基 苯基磷酸盐通过碱性磷酸酶的作用产生电活性物质对-氨基苯酚，其进一 步被氧化而在+190mV的外加电压下(相对于Ag/AgCl)产生最优电信号。

同时，辣根过氧化物酶利用H2O2作为底物，其中用作电子传移介质 的Fe(II)氧化为Fe(III)。通过施加-100mV的还原电压可以检测由Fe(III)还原所产生的电流。

物理吸附或化学成键可以实现将生物活性物质固定在工作电极上， 如酶，电极传递介质或抗体。物理吸附是通过将生物活性物质溶液滴在 工作电极上，然后培养而实现的。该方法利用生物活性物质和电极形成 材料之间的亲和力。化学成键利用在工作电极表面形成的活化自组装单 层。通过各种方法使用活性化合物如烷基硫醇，胺和羧酸实现工作电极 表面的修饰。形成生物活性物质与自组装单层的共价结合(Meyerhoff 等，Mikrochim.Acta.117/195-206，1995)。

按照下列实施例可以获得本发明的更好理解，所述实施例是提出来 说明本发明而不可解释为来限制本发明。

试剂

使用材料和试剂的来源如下：

葡糖氧化酶(GOx；EC 1.1.3.4，VII-S类型，245-900单位/g，来源于 Aspergillus Niger；2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)，1-乙基-3，3-二甲氨基丙 基碳二亚胺(EDAC)，N-羟磺基琥珀酰亚胺(NHS)，铁氰化钾 (K3Fe(CN)6)，β-D(+)-葡萄糖，2-巯基乙胺和DL-6，8-硫辛酰胺，来源于 Sigma(St.Louis，Missouri，美国)；1，2-二硫戊环-3-戊酸，3-巯基丙酸， 11-巯基十一酸，16-巯基十六酸(MHDA/C16)，和乙酸二茂铁( Fc-COOH)，来源于Aldrich(Milwaukee，Wisconsin，美国)；磷酸氢二钠和 磷酸二氢钠，来源于Kanto Chemical(东京，日本)；Nytran中性微孔尼 龙膜(孔径0.2μm)，来源于Schleicher和Schuell ofKeene，New Hampshire； 硝化纤维素(NC)膜来源于Whatman International(Maidstone，英国)。 所有其它使用的化学药品为分析级。

在磷酸缓冲盐水(PBS，140mM NaCl)中制备样品和标准溶液。所 有水溶液用去离子水制备(18MΩcm)。碱性磷酸酶(AKP)，对-硝基苯 磷酸盐，抗生物素蛋白(来自于鸡蛋白)，生物素(维生素H)和明胶以 及牛血清清蛋白(BSA)购自St.Louis，Missouri Sigma。对氨基苯磷酸 盐是由对-硝基苯磷酸盐合成。制备缓冲液所用的去离子水是Yamato Millipore WQ 500(电阻：18MΩ)。

实施例1

1-1)对称双面微孔金电极的制作

将微孔尼龙膜(15×30mm2)置于直径为6mm的合适的面罩和13mm 宽的输出条(outlet strip)(用于电连接目的)下面。采用物理蒸气淀积 技术将膜两面都镀上金；喷镀时间300s，压力75m托，等离子体电流25- 30mA，电压350-500V。这样在膜的中心形成圆盘状的金电极，外径为 4mm，厚度大约为300。在中心圆盘电极周围，包括在狭窄的金引线出 口上浇铸溶解在四氢呋喃(THF)中(1∶6w/v)的PVC层(33％PVC和 67％二(2-乙基己基)癸二酸酯(均为w/w％))。这留下6mm的中心未 触动的圆盘状金电极。电极形状如图2a所示。在另一个实施方案中，在 无面罩的尼龙膜(6×6cm2)的两面都镀上金，并剪成如图2a中所示的 形状。然后，将镀金的电极片放置在两个带有丝网印刷的电极连接器的 绝缘膜之间，并压紧以组装为对称的双面微孔电极。

1-2)非对称双面微孔金电极的制作

使用碳糊(或任何导电糊如银/氯化银)将对电极丝网印刷在尼龙膜 的一面，所述对电极是模仿工作电极的轮廓线而内部中空。在膜的反面， 用实施例1-1中描述的物理沉积方法形成金电极。将电极剪成图2e中所示 的形状，并挤压于两个带有丝网印刷的电极连接器的绝缘膜之间。使用 环状伏安图(扫描速率：60mV/min)在含Fe(III)/Fe(II)的缓冲液中 检验非对称双面微孔电极的电化学特性；如图10所示，电极提供可逆响 应而在沉积金和丝网印刷的碳之间并未出现短路。

1-3)生物活性物质的固定

用MES缓冲液漂洗电极并立刻置于搅拌的10μl含有10mg/ml GOx和 140mM NaCl，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中一小时，使得Gox物理吸附 于金电极表面，其后用磷酸盐缓冲液漂洗它们。

1-4)葡萄糖传感器的制造

图4a和4b中所示的自动进样和流动的葡萄糖传感器是通过把微孔金 带状(strip)电极夹入多孔的硝化纤维(NC)带和作为吸收垫板的玻璃 纤维中间制成的。

1-5)葡萄糖传感器的分析性能

为了检测葡萄糖传感器的分析性能，使用标准葡萄糖溶液，通过一 种测量电流技术测量对葡萄糖的稳态响应。图11显示在0.8V电压下生物 传感器的典型校正曲线，其表明葡萄糖传感器能够对葡萄糖响应大约30 分钟。在0mg/dL至200mg/dL葡萄糖范围内观测到线性响应。斜率为2.60× 10-3nA/(mg/dL)并且相关系数为0.988。从这些结果，证实使用本发明 的生物传感器可以连续自动进样及检测。

实施例2

2-1)金电极的制造

以与实施例1-1中描述相同的方法获得金电极。

2-2)生物活性物质的固定

用MES缓冲液漂洗电极并立刻置于搅拌的10μl含有10mg/ml Gox，200 mM铁氰化钾和140mM NaCl，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中一小时，其 后用磷酸盐缓冲液漂洗它们。

2-3)葡萄糖传感器的制造

自动进样和流动的葡萄糖传感器是通过把微孔金带电极夹入多孔的 NC带和作为吸收垫板的玻璃纤维中间制成的。

2-4)葡萄糖传感器的分析性能

为了检验葡萄糖传感器的分析性能，通过测量电流技术测量对葡萄 糖的稳态响应。图12显示在0.38V电压下生物传感器的动态响应，其表明 葡萄糖传感器能够对每种葡萄糖溶液(50mg/dL，100mg/dL和200mg/dL) 响应一个小时。图12显示葡萄糖分析的典型动态响应曲线。在0mg/dL至 200mg/dL葡萄糖范围内观测到线性响应。斜率为85.8nA/(mg/dL)并且 相关系数为0.998。这些结果显示即使在0.38V的低电压下也可获得对葡 萄糖更敏感的响应。从这些结果，证实使用本发明的生物传感器可以连 续自动进样及检测。

实施例3

制备如图7a所说明的免分离，固相免疫传感器。

3-1)金电极的制造

以与实施例1-1中描述相同的方法获得金电极。

3-2)生物传感器的制造

用MES缓冲液漂洗电极。将10μl含有0.05mg/ml抗生物素蛋白和0.05 M碳酸钠，pH值为9.6的磷酸盐缓冲液滴至工作电极上。然后，将电极4 ℃温育16小时。使用其上吸附50μl葡糖氧化酶-生物素偶联物(2.5μg/ml) 的玻璃纤维膜(Whatman International of Maidstone，英国)作为垫板 (114a)。

3-3)校正

使用从实施例3-2获得的免疫传感器进行校正：将标准生物素溶液稀 释到10-5M至10-14M的浓度。通过顶盖(115)上形成的孔(117)将每种 标准溶液加至免疫传感器。在+800mV的外加电压下实现抗生物素蛋白 与生物素或酶偶联物之间稳定的竞争性结合。然后，通过底盖(116)上 形成的孔(118)加入底物(葡萄糖)。可以检测通过酶反应产生的电流。 图13显示电流变化依赖于生物素浓度的校正曲线。在10-7M(1.0μA)至 10-10M(0.5μA)生物素之间发现有显著的信号差异。

3-4)信号变化的测量

使用从实施例3-2中获得的免疫传感器获得动态响应曲线：分别将 10-12M生物素缓冲液和10-4M不含生物素的缓冲液加入免疫传感器。传感 器达到稳定后，通过孔(118)将10μl的葡萄糖溶液加至传感器的后部。 通过测量电流技术测量免疫传感器的动态响应，其结果见图14。

图14显示对于10-12M生物素缓冲液的电流变化为1μA，对于10-4M生 物素缓冲液的电流变化为0.4μA。对于不含生物素的缓冲溶液的电流变 化为大约0.05μA。从这些结果，证实为了检测合适的抗原-抗体反应可以 改进该模式免疫传感器。

实施例4

以如图7e所示的形式制备一种免分离的固相C-活性蛋白(CRP)免 疫传感器，并且与如在实施例3-1和3-2中描述相似的生物材料固定方法； 通过物理吸附将抗-CRP(0.0125mg/mL)固定在金电极上，将碱性磷酸 酶(ALP)而不是实施例3-1中的葡糖氧化酶-生物素用作与CRP连接酶 (ALP-CRP；0.2mg/mL)，并且使用对-氨基苯磷酸盐(5mg/mL)而不 是实施例3-2中的葡萄糖。通过将已知量的CRP溶解于再生血清 (reconstituted serum)中制备标准CRP溶液并加入到如图7e所示生物传 感器的孔(117)中。将底物对-氨基苯酚加至孔118，其通过毛细管119 扩散至槽118’，并且通过电极系统100(图7e)的微孔扩散而产生电化学 信号。在+150mV的外加电压下通过测量电流技术测量免疫传感器的电 流响应，其结果总结在图15中。

如图15所示，对于10-6mg/mL CRP/血清溶液的电流变化为0.75μA， 并且对于10-4mg/mL CRP/血清溶液的电流变化为0.6μA。从这些结果， 证实该免疫传感器可以有效用于高敏感检测CRP。