高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和用途
阅读：711发布：2023-03-14
专利汇可以提供高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白，所述融合蛋白包含Exendin‑4及其类似物、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺 激素 β亚基羧基末端肽刚性单元和人免疫球蛋白Fc 片段 。本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法和用途。所述融合蛋白具有较优的 生物 学活性，显著延长的循环 半衰期 、降低的免疫原性以及提高的生物利用度。所述融合蛋白可用于 治疗 糖尿病、肥胖以及通过降低 血浆 葡萄糖 、抑制胃和/或肠运动和抑制胃和/或肠排空、或抑制食物摄入而受益的其他 疾病 。，下面是高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.Exendin-4或其类似物的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含Exendin-4或其类似物、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和人免疫球蛋白Fc片段；或者，所述融合蛋白从N端至C端依次包含Exendin-4或其类似物、柔性肽接头、人免疫球蛋白Fc片段和至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元，其中，所述Exendin-4类似物包含的氨基酸序列为
His1-Xaa2-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Glu15-Glu-G lu-Ala-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Ile-Xaa24-Trp25-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30-Xaa31-Xa a32-
33 34 35 36 37 38 39
Xaa -Xaa -Xaa -Xaa -Xaa -Xaa -Xaa ；
其中：
Xaa2选自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
Xaa10选自Leu，Ala，Ser，Leu，Ile，Glu或Lys；
12
Xaa 选自Lys，Leu，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
Xaa13选自Gln，Thr，Ala，Val，Leu，Ile或Lys；
Xaa14选自Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，Ile或Lys；
Xaa19选自Val，Cys，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
Xaa20选自Arg，Thr，Tyr，Ser，Leu，Ile或Lys；
Xaa21选自Leu，Thr，Ala，Asp，Glu，His或Lys；
Xaa24选自Glu，Leu，Thr，Ala，Ser，Lys或Ile；
Xaa27选自Lys，Ala，Ser，Leu，Thr，Ile或Lys；
Xaa28选自Asp，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
Xaa30选自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Arg；
Xaa31选自Pro，Val，Ser，Ala，Leu，Ile或Lys；
Xaa32选自Ser，Thr，Glu，Ser，Asp，Lys或Ile；
Xaa33选自Thr，Ser，Ala，Met，Leu，Ile或Lys；
Xaa34选自Gly，Thr，Met，Ser，Ile，Leu或Lys；
Xaa35选自Ala，Thr，Ala，Glu，Leu，Ile或Phe；
Xaa36选自Pro，Ala，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
Xaa37选自Pro，Thr，Ser，Ala，His，Lys或Ile；
Xaa38选自Pro，Thr，Val，Ser，Leu，Lys或Ile；
Xaa39选自Ser，Tyr，Ala，Leu，Ser，Ile或Lys，
或者，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列为His1-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-
30 1 5 10
Lys-Asn-Gly-Gly 或His -Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu -Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-Lys40-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys45。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通过在哺乳动物细胞中表达而糖基化的。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达而糖基化的。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Exendin-4的氨基酸序列为His1-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端至C端依次包含Exendin-4或其类似物、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和人免疫球蛋白Fc片段。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端至C端依次包含Exendin-4或其类似物、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和人免疫球蛋白Fc片段。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列为His1-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列为
1 5 10 15
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu -Ser-Lys-Gln-Met-Glu -Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-Lys40-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys45。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头含有2个或更多个选自G、S、A和T的氨基酸。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头的氨基酸选自如下序列：
(i)GGGGS；
(ii)GSGGGSGGGGSGGGGS；
(iii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iv)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；
(vi)GGSGGSGGSGGS。
13.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含SEQ ID NO：1或其截短的序列，其中所述截短的序列包含至少2个糖基化位点，
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列：
(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(iii)SSSSKAPPPS；
(iv)SRLPGPSDTPILPQ；或
(v)SSSSKAPPPSLPSPSR。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元的氨基酸序列为SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ或
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
16.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元。
17.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc片段为具有降低的ADCC效应和/或CDC效应和/或与FcRn受体的结合亲和力增强的变体。
18.如权利要求17所述融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段选自人IgG Fc变体。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG Fc变体选自：
(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域；
(ii)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。
20.如权利要1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或10所示。
21.编码如权利要求1-20中任一项所述融合蛋白的DNA分子。
22.如权利要求21所述的DNA分子，其特征在于，包含如SEQ ID NO：7或9所示的序列。
23.一种载体，其特征在于，包含如权利要求21或22所述的DNA分子。
24.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求23所述的载体，或者转染了权利要求
23所述的载体。
25.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白。
26.一种制备如权利要求1-20中任一项所述融合蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求21或22所述编码融合蛋白的DNA序列引入哺乳动物细胞；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过50μg/106(百万)个细胞的高产细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；
(d)收获步骤(c)中得到的发酵液，纯化融合蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的哺乳动物细胞为CHO细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的哺乳动物细胞为CHO衍生细胞系DXB-11。
29.如权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白在制备用于治疗非胰岛素依赖性的II型糖尿病药物中的用途。
30.如权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白在制备治疗或预防肥胖症的药物中的用途。
高糖基化Exendin-4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和
用途
技术领域
[0001] 本发明涉及长效GLP-1类似物，更具体地，涉及Exendin-4及其类似物的融合蛋白，还涉及其制备方法和它在治疗糖尿病、肥胖以及通过降低血浆葡萄糖、抑制胃和/或肠运动和抑制胃和/或肠排空、或抑制食物摄入而受益的其他疾病中的应用。
背景技术
[0002] Exendin-4分离自南非大毒蜥唾液，它与哺乳动物的GLP-1氨基酸序列具有53％的同源性，是有效的GLP-1受体激动剂。Exendin-4的生理活性与GLP-1相似，但Exendin-4-NH2端第二位由Gly代替了GLP-1中的Ala，使其对DPP-IV酶具有一定的抵抗作用，不易被DPP-IV降解，在体内循环的半衰期较长，可以达到60-90分钟。此外，Exendin-4的-COOH端由9个氨基酸(PSSGAPPPS)形成的特殊Trp-cage结构，使其与GLP-1受体的结合亲和力显著高于GLP-1(Neidigh JW等,Biochemistry,2001,40:13188–13200)，它的生物学活性约为GLP-1的
1000倍。另外，Exendin-4与GLP-1的代谢途径也不同，Exendin-4主要是通过肾脏代谢，而GLP-1通过外周组织和肾脏进行代谢，且外周组织途径是主要的方式(Simonsen L.等,Regulatory Peptides,2013,181:17–21)，因而Exendin-4的代谢速率更低，这也是其半衰期显著长于天然GLP-1的重要原因。Exendin-4含有39个氨基酸，分子量小，单独重组表达的难度非常大，而且表达量低。因而，目前应用于临床的Exendin-4是化学合成品(Exenatide，中文名：艾塞那肽)。临床结果显示，艾塞那肽在人体内的平均半衰期只有2.4小时，每天需注射两次，给病人的生活带来极大的痛苦和不便。此外，由于与人GLP-1的同源性只有53％，使得患者产生抗体比率增加。综上所述，Exendin-4具有半衰期短、免疫原性强等不足，但同时其特殊的分子结构又赋予它天然GLP-1或其他GLP-1类似物所无法企及的优点，如与GLP-
1受体结合的亲和力强、生物活性高、临床用药剂量极低，结构稳定不易被DPP-IV酶解以及代谢速率低等优势，使其较其他GLP-1类似物具有更大的临床应用价值。
1000倍。另外，Exendin-4与GLP-1的代谢途径也不同，Exendin-4主要是通过肾脏代谢，而GLP-1通过外周组织和肾脏进行代谢，且外周组织途径是主要的方式(Simonsen L.等,Regulatory Peptides,2013,181:17–21)，因而Exendin-4的代谢速率更低，这也是其半衰期显著长于天然GLP-1的重要原因。Exendin-4含有39个氨基酸，分子量小，单独重组表达的难度非常大，而且表达量低。因而，目前应用于临床的Exendin-4是化学合成品(Exenatide，中文名：艾塞那肽)。临床结果显示，艾塞那肽在人体内的平均半衰期只有2.4小时，每天需注射两次，给病人的生活带来极大的痛苦和不便。此外，由于与人GLP-1的同源性只有53％，使得患者产生抗体比率增加。综上所述，Exendin-4具有半衰期短、免疫原性强等不足，但同时其特殊的分子结构又赋予它天然GLP-1或其他GLP-1类似物所无法企及的优点，如与GLP-
1受体结合的亲和力强、生物活性高、临床用药剂量极低，结构稳定不易被DPP-IV酶解以及代谢速率低等优势，使其较其他GLP-1类似物具有更大的临床应用价值。
[0003] 为了延长Exendin-4的体内半衰期，将Exendin-4或其它GLP-1类似物与Fc片段融合的技术方案已有研究报道，如礼来公司开发的与人IgG4Fc融合的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物——杜拉鲁肽(Dulaglutide)已经在美国上市，其平均生物半衰期长达90小时(中国专利号：CN1802386B)。另外，中国专利CN101891823中公开了一种Exendin-4及其类似物通过特定的连接肽与天然人IgG2Fc片段连接而成的融合蛋白。对应用于人的治疗而言，当GLP-1/Fc融合蛋白结合于靶细胞受体时，融合蛋白的Fc区域必须不会介导不良效应子功能而裂解或清除这些细胞。因此，融合配体Fc区域必须是非裂解性的，即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面，Fc必须是无活性或低活性的。然而，专利CN101891823中所公开的Exendin-4融合蛋白的天然Fc片段所介导的细胞毒作用和补体激活作用可能会对机体造成一定伤害。
[0004] 人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也具有延长某些蛋白质体内半衰期的作用，因此一些专利文献公开的融合蛋白包含的延长半衰期部分可以选择使用免疫球蛋白Fc、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。另外，CTP也可以作为接头，用于连接两个活性蛋白质或用于连接蛋白质的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素的beta亚基和alpha亚基。
[0005] 本发明人经过长期的研究，令人意外地发现在Exendin-4及其类似物C末端融合CTP肽段与Fc片段，这两者能够带来协同作用，用以抵抗肾脏的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期。尤其是，本发明人发现，处于Fc N端的CTP还具有相对稳定的立体构象，从而促使Exendin-4及其类似物和Fc段独立折叠形成更理想的三维构象，表明CTP作为接头肽的一部分(而非全部)在起作用。本发明的Exendin-4及其类似物的融合蛋白较杜拉鲁肽不仅具有更长的体内功能半衰期且生物学活性更高，而且更令人预料不到的是，它在动物体内的生物利用度更高。另外，本发明人的优选实施例中，融合蛋白的IgG Fc配体源自人IgG2而不是IgG4，从而相对于杜拉鲁肽具有更小的不良效应子功能，并且具有更长的体内循环半衰期。
发明内容
[0007] 本发明一方面，提供了一种高糖基化Exendin-4及其类似物融合蛋白(以下简称融合蛋白)，所述融合蛋白自N端至C端依次含有Exendin-4或其类似物(表示为Ex4)、柔性肽接头(表示为L)、与至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下表示为(CTP)n，n为1,2,3,4,或5)嵌合的人免疫球蛋白Fc片段(表示为Fc)，其中(CTP)n可嵌合于Fc的N端或C端；因而，所述融合蛋白可分别表示为Ex4-L-(CTP)n-Fc或Ex4-L-Fc-(CTP)n。
[0008] 其中，所述天然Exendin-4的一级结构为：His1-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39，可表示为Ex(1-39)。
[0009] 其中，所述Exendin-4类似物与天然Exendin-4的氨基酸序列至少70％同源；较优选地，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列与天然Exendin-4至少80％同源；更优选地，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列与天然Exendin-4至少90％同源。最优选地，所述Exendin-4类似物的氨基酸序列与天然Exendin-4至少95％同源。根据修饰方法不同，所述Exendin-4类似物分为突变型、截短型或延长型。
[0010] 本发明的一些实施例中，所述Exendin-4类似物为突变型，即至少1个非保守氨基酸被取代，它包含如式I的序列：His1-Xaa2-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Glu15-Glu-Glu-Ala-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Ile-Xaa24-Trp25-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39；
[0011] 式I中，至少1个非保守位点Xaa被取代：
[0012] Xaa2选自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
[0013] Xaa10选自Leu，Ala，Ser，Leu，Ile，Glu或Lys；
[0014] Xaa12选自Lys，Leu，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
[0015] Xaa13选自Gln，Thr，Ala，Val，Leu，Ile或Lys；
[0016] Xaa14选自Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，Ile或Lys；
[0017] Xaa19选自Val，Cys，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
[0018] Xaa20选自Arg，Thr，Tyr，Ser，Leu，Ile或Lys；
[0019] Xaa21选自Leu，Thr，Ala，Asp，Glu，His或Lys；
[0020] Xaa24选自Glu，Leu，Thr，Ala，Ser，Lys或Ile；
[0021] Xaa27选自Lys，Ala，Ser，Leu，Thr，Ile或Lys；
[0022] Xaa28选自Asp，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；
[0023] Xaa30选自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Arg；
[0024] Xaa31选自Pro，Val，Ser，Ala，Leu，Ile或Lys；
[0025] Xaa32选自Ser，Thr，Glu，Ser，Asp，Lys或Ile；
[0026] Xaa33选自Thr，Ser，Ala，Met，Leu，Ile或Lys；
[0027] Xaa34选自Gly，Thr，Met，Ser，Ile，Leu或Lys；
[0028] Xaa35选自Ala，Thr，Ala，Glu，Leu，Ile或Phe；
[0029] Xaa36选自Pro，Ala，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；
[0030] Xaa37选自Pro，Thr，Ser，Ala，His，Lys或Ile；
[0031] Xaa38选自Pro，Thr，Val，Ser，Leu，Lys或Ile；
[0032] Xaa39选自Ser，Tyr，Ala，Leu，Ser，Ile或Lys。
[0033] 如本发明的优选实施例中，所述Exendin-4类似物含有1个保守氨基酸的取代，即Xaa2为Ser，可表示为G2S Ex(1-39)；另一个实施例中，Xaa19为Ala，可表示为V19A Ex(1-39)；另一个实施例中，Xaa24为Thr，可表示为E24T Ex(1-39)；另一个实施例中，Xaa34为Leu，可表示为G34LEx(1-39)。
[0034] 又如，本发明的另一些实施例中，所述Exendin-4类似物为截短型。C端9个氨基酸残基不是Exendin-4与受体结合和其生物活性所必须的，本发明所述Exendin-4类似物可以缺失C端31-39位氨基酸，可表示为Ex(1-30)。
[0035] 再如，本发明的另一些实施例中，所述Exendin-4类似物为延长型，即在C端增加氨基酸。本发明一优选实施例中，在第39位Ser上连接LysLysLysLysLysLys(可表示为Ex(1-45))；本发明发现在Exendin-4的羧基末端增加KKKKKK这6个氨基酸，其抵抗DPP-IV酶水解作用的能力增强，即稳定性增强。
[0036] 其中，所述柔性肽接头优选非免疫原性的，并且在Exendin-4和Fc之间产生足够的距离，使相互之间的位阻效应降至最低。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸构成的柔性肽接头，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。
[0037] 优选地，所述柔性肽接头包含G和S残基。连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，优选地，所述柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。
[0038] 本发明的一些实施例中，所述肽接头选自如下序列：
[0039] (i)L1：GGGGS；
[0040] (ii)L2：GSGGGSGGGGSGGGGS；
[0041] (iii)L3：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
[0042] (iv)L4：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
[0043] (v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；
[0044] (vi)L6：GGSGGSGGSGGS。
[0045] 其中，所述CTP刚性单元选自由人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长或截短的序列，具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1或其截短的序列。
[0046] 优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1N端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1C端的14个氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另些实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第113、114、115、116、
117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。
117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：1N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。
[0047] 在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。
[0048] 示例性地，本发明所述CTP刚性单元可优选地包含如下序列：
[0049] (i)CTP1：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
[0050] (ii)CTP2：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
[0051] (iii)CTP3：SSSSKAPPPS；
[0052] (iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ；
[0053] (v)CTP5：SSSSKAPPPSLPSPSR。
[0054] 本发明一些实施例中，所述融合蛋白包含1个上述CTP刚性单元。
[0055] 本发明所述融合蛋白还可包含1个以上的上述CTP刚性单元，优选地，包含2，3，4或5个上述CTP刚性单元。如本发明的一实施例中，所述融合蛋白包含3个CTP3刚性单元：
SSSSKAPPPSSSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3-CTP3，或表示为(CTP3)3)；如本发明的另一实施例中，所述融合蛋白包含2个CTP5刚性单元：SSSSKAPPPSLPSPSRSSSSKAPPPSLPSPSR(CTP5-CTP5，或表示为(CTP5)2)。
SSSSKAPPPSSSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3-CTP3，或表示为(CTP3)3)；如本发明的另一实施例中，所述融合蛋白包含2个CTP5刚性单元：SSSSKAPPPSLPSPSRSSSSKAPPPSLPSPSR(CTP5-CTP5，或表示为(CTP5)2)。
[0056] 其中，Fc片段优选自人免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及其变体的Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段；其中，所述人IgG Fc变体(表示为vFc)包含位于野生型人IgG Fc中的至少一种氨基酸修饰，且Fc变体无裂解性，并显示出极小的Fc-介导的不良副作用(ADCC和CDC效应)和/或与FcRn受体的结合亲和力增强。
[0057] 进一步地，人IgG Fc变体可选自下组：
[0058] (i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列)；
[0059] (ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列)；
[0060] (iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)；
[0061] (iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列)。
[0062] (v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)。
[0063] 本发明所提供的IgG Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。
[0064] 本发明所述融合蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是FcγR非结合子。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备Exendin-4及其类似物融合蛋白。而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能的变体相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其半衰期。本发明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低或引起不良的构象变化，常见的突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。
[0065] 本发明的一优选实施例中，CTP刚性单元位于vFc的N端，所组成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；本发明的另一优选实施例中，CTP刚性单元位于vFc的C端，所组成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0066] 根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述融合蛋白的DNA。本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：7所示。本发明的另一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：9所示。
[0067] 根据本发明的再一个方面，提供一种载体。该载体包含上述DNA。
[0068] 根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述载体。
[0069] 在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB-11。
[0070] 根据本发明的再一个方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白。
[0071] 根据本发明的再一个方面，提供所述融合蛋白在制备治疗非胰岛素依赖性的II型糖尿病以及通过降低血浆葡萄糖而受益的其他疾病的药物中的用途。
[0073] 根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系(如CHO衍生的细胞系)制备或生产所述融合蛋白的方法，包含以下步骤：
[0074] (a)将编码上述融合蛋白的DNA引入哺乳动物细胞；
[0075] (b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过50μg/106个细胞的高产量细胞株；
[0076] (c)培养步骤(b)筛选获得的细胞株；
[0078] 优选地，所述步骤(a)中的哺乳动物细胞为CHO细胞；更优选为CHO衍生细胞系DXB-11。
[0079] 与现有产品相比，本发明人发现，本发明的所述Exendin-4或其类似物融合蛋白具有如下的突出优点：
[0080] 1、相对于不含CTP刚性单元的Exendin-4Fc融合蛋白具有更长的体内循环半衰期，在大鼠体内的循环半衰期长达约22小时，一方面可减小血清中药物浓度的波动，降低注射频率，从而提高患者的生活质量；另一方面减小因频繁注射给药引发的潜在抗体生成的风险，即免疫原性降低。
[0081] 2、具有延长的体内功能半衰期，在对db/db自发型糖尿病小鼠和STZ诱导胰腺损伤糖尿病模型小鼠单次给药后随机血糖值观测的药效评价试验中，分别在给予FP-A第168小时和144小时后仍具有显著的降血糖作用；而FP-B在两种糖尿病动物模型中具有更长的体内药效，给药后240h和216h其血糖值与模型组相比仍具有显著差异。FP-A和FP-B相对杜拉鲁肽更能长期、有效的控制小鼠血糖水平。
[0082] 3、更高的生物利用度，单次给药药代动力学研究数据显示，在给药剂量相同的情况下，FP-A和FP-B药物暴露量(AUC0～∞)均高于杜拉鲁肽，即FP-A和FP-B在大鼠体内的绝对生物利用度更高，可以预期其临床用药剂量也将降低。
[0084] 图1、显示了根据本发明实施例的在PCDNA3.1表达载体内SpeI/EcoRI片段的FP-A的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，由α1微球蛋白前导肽(1-19，以__标注)、Ex(1-39)(20-58)、柔性肽接头(59-85，以 标注)、CTP刚性单元(86-113，以 标注)和vFc(114-336)构成。
[0085] 图2、显示了根据本发明实施例的在PCDNA3.1表达载体内SpeI/EcoRI片段的FP-B的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，由α1微球蛋白前导肽(1-19，以__标注)、Ex(1-39)(20-58)、柔性肽接头(59-74，以 标注)、vFc(75-297)和CTP刚性单元(298-330，以 标注)构成。
[0086] 图3-1、db/db糖尿病小鼠单次注射FP-A 0～6h间RBG值变化曲线；统计学差异标记注释：FP-A组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；杜拉鲁肽组与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
[0087] 图3-2、db/db糖尿病小鼠单次注射FP-A 0～216h间RBG值变化曲线；统计学差异标记注释：FP-A组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；杜拉鲁肽组与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
[0088] 图4、STZ诱导糖尿病小鼠单次注射FP-A和FP-B在0～240h间RBG值变化曲线；统计学差异标记注释：FP-A组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；FP-B组与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；杜拉鲁肽组与模型组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
[0089] 图5、不同剂量组FP-A对db/db糖尿病小鼠HbA1c(％)的影响；统计学差异标记注释：FP-A组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0090] 图6、FP-A对高脂饲料喂养小鼠体重增长的影响。
[0091] 图7、FP-A对高脂饲料喂养小鼠糖耐量的影响(means±SD,n＝8)。注：与正常组相# ##比，P＜0.05，P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0092] 图8、FP-A对高脂饲料喂养小鼠血清胰岛素含量的影响(means±SD,n＝8)。注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0093] 图9、FP-A对高脂饲料喂养小鼠胰岛素耐受指数的影响(means±SD,n＝8)。注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0094] 图10、FP-A对高脂饲料喂养脂肪细胞横截面积的影响。注：A：正常组；B：高脂组；C：FP-A组。
[0095] 图11-1a、C57BL/6J小鼠给予FP-B 1d后糖耐量试验曲线。
[0096] 图11-1b、给药后1d FP-B对C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影响(means±SD，n＝8)。注：与正常组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
[0097] 图11-2a、C57BL/6J小鼠给予FP-B 4d后糖耐量试验曲线。
[0098] 图11-2b、给药后4d FP-B对C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影响(means±SD，n＝8)。注：与正常组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
[0099] 图11-3a、C57BL/6J小鼠给予FP-B 7d后糖耐量试验曲线。
[0100] 图11-3b、给药后7d FP-B对C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影响(means±SD，n＝8)。注：与正常组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
[0101] 图11-4a、C57BL/6J小鼠给予FP-B 10d后糖耐量试验曲线。
[0102] 图11-4b、给药后10d FP-B对C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影响(means±SD，n＝8)。注：与正常组相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
具体实施方式
[0103] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0104] 本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
[0105] 本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的―操作性相连”或―可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0106] 表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
[0107] 根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
[0108] 本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
[0109] 本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：
[0110] 1)提供编码融合蛋白的核酸序列；
[0111] 2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
[0112] 3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
[0113] 4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
[0114] 5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
[0116] 有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996；86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
[0117] 可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
[0118] 可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
[0119] 实施例1、构建编码融合蛋白的表达质粒
[0120] 编码α1微球蛋白(α1 microglobulin)前导肽和成熟Exendin-4及其类似物、柔性肽接头、CTP刚性单元和人IgG Fc变体的基因序列都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，全长序列经化学合成方法获得。为了便于将目的片段插入表达载体的特定位点，在所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶切位点，分别为SpeI和EcoRI。验证后的Exendin-4及其类似物融合蛋白基因用SpeI和EcoRI酶切，然后插入到经PCDNA3.1改造后的质粒PXY1A1相应酶切位点间，得到了融合基因表达质粒。该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PXY1A1表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而在存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增融合基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。
[0121] 如表1所示，本发明构建了一系列Exendin-4及其类似物的融合蛋白，它们包含不同长度的柔性肽接头(Linker)和几种不同亚型的IgG Fc变体(vFc)元件组成，而且CTP刚性单元位置和长度也不同。为了验证含有至少1个，并且不同长度的CTP刚性单元均具有较高的生物学活性，我们构建了融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G和FP-H；同时还构建了不含CTP刚性单元的FP-I。其中FP-A和FP-B的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列分别如图1和图2所示。融合蛋白的氨基酸组成见发明内容或序列表。
[0122] 表1.构建的几种融合蛋白的组成
[0123]
[0124] 实施例2、融合蛋白在转染细胞系中的表达
[0125] 将重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达Exendin-4及其类似物的融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为300V电场和1050μFd电容的Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯内的5×107个细胞中加入50μg高纯度的表达质粒。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗Exendin-4的ELISA进行融合蛋白表达量的定量。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平融合蛋白的孔。
[0126] 为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约30(较佳地约50)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养基纯化融合蛋白。
[0127] 实施例3、融合蛋白的纯化与定性
[0128] 用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH 7～8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的Protein A柱上。待融合蛋白结合于Protein A柱后，弃去流出的组分。用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH为3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。洗脱液用0.4体积的1M K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原和还原条件下，由SDS-PAGE对蛋白产物进行鉴定、分析。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
[0129] 实施例4、体外生物学活性测定
[0130] 建立以GLP-1信号通路为靶点的糖尿病药物筛选细胞模型，用于筛选GLP-1受体激动剂类的新型长效GLP-1类似物。根据文献(Zlokarnik G等,Science,1998,279(5347):84-88)所述方法测定。将带有人GLP-1R表达质粒和CRE-Luc报告基因的表达质粒PGL-4.29(Luc2P/CRE/Hygro)(购自Promega公司)共转染CHO-K1细胞，通过抗生素加压筛选获得共表达两种质粒的稳定细胞株。体外活性分析时，以16000个细胞/孔/200μl接种到96孔细胞培养板中，用含10％FBS的DMEM培养基培养16～24小时，待细胞生长至覆盖板底90％以上面积时，将用含10％FBS的DMEM培养基梯度稀释融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G、FP-H和FP-I，再按每孔10μl加入，浓度梯度设置为0.010、0.020、0.039、0.078、0.156、
0.313、0.625、1.25和2.5nM，同时设置等浓度的杜拉鲁肽阳性对照组(Eli Lilly Company生产，货号：9301897)。在37℃，5％CO2条件下孵育5-6小时后，吸去上清，缓慢加入300μl PBS洗涤细胞，随后吸去PBS，加入40μl裂解液，震荡15min，随后每孔加入40μl荧光素酶底物(荧光素酶(Luciferase)报告基因检测试剂盒，货号：GM-040501B，吉满生物有限公司产品)，反应2分钟，用多功能酶标仪(SpectraMax M5system，Molecular Device公司)于波长
560nm下测定荧光值，并根据荧光值绘制剂量反应曲线，计算出EC50值，结果见表2。FP-A和FP-B的EC50值约为0.03086nM和0.02854，而杜拉鲁肽的EC50值约为0.02987nM，说明FP-A、FP-B与杜拉鲁肽的生物学活性相当；FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G、FP-H和FP-I的EC50值详见表2；可见，各融合蛋白对GLP-1受体均有一定的激活作用。
0.313、0.625、1.25和2.5nM，同时设置等浓度的杜拉鲁肽阳性对照组(Eli Lilly Company生产，货号：9301897)。在37℃，5％CO2条件下孵育5-6小时后，吸去上清，缓慢加入300μl PBS洗涤细胞，随后吸去PBS，加入40μl裂解液，震荡15min，随后每孔加入40μl荧光素酶底物(荧光素酶(Luciferase)报告基因检测试剂盒，货号：GM-040501B，吉满生物有限公司产品)，反应2分钟，用多功能酶标仪(SpectraMax M5system，Molecular Device公司)于波长
560nm下测定荧光值，并根据荧光值绘制剂量反应曲线，计算出EC50值，结果见表2。FP-A和FP-B的EC50值约为0.03086nM和0.02854，而杜拉鲁肽的EC50值约为0.02987nM，说明FP-A、FP-B与杜拉鲁肽的生物学活性相当；FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G、FP-H和FP-I的EC50值详见表2；可见，各融合蛋白对GLP-1受体均有一定的激活作用。
[0131] 表2.各融合蛋白的体外活性EC50值比较
[0132]
[0133] 实施例5、db/db糖尿病小鼠单次注射FP-A的血糖变化情况
[0134] 雌性糖尿病db/db小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，8周龄，体重42±2g，按体重随机分为3组，每组6只。受试药组按3mg/kg剂量皮下注射FP-A，阳性组注射3mg/kg的杜拉鲁肽(Eli Lilly and Company生产，货号：9301897)，模型组注射等体积剂量(10mL/kg)的PBS缓冲液。各组动物分别于给药前(0h)、给药后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、
96h、120h、144h、168h、192h和216h进行尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定随机血糖值(Random blood glucose，RBG)，并记录数据。血糖数据以均数±标准差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
96h、120h、144h、168h、192h和216h进行尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定随机血糖值(Random blood glucose，RBG)，并记录数据。血糖数据以均数±标准差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0135] 在相同剂量下，FP-A和阳性对照药杜拉鲁肽均有降血糖作用，如图3-1和图3-2所示。经t-test检验，在0h～6h，FP-A组与杜拉鲁肽组动物的随机血糖值相对模型组均出现显著性降低，P<0.01(图3-1)，说明二者在体内的起效时间相近，短期内降糖效果相似；另外从给药后9天内小鼠RBG值变化曲线图(图3-2)中可以看出，杜拉鲁肽降血糖作用仅能维持至第4天，在给药后第120小时，其血糖值与模型组相比已不具有统计学差异，而FP-A能维持至给药后168小时，即第7天小鼠的血糖水平与模型组相比，仍具有统计学差异(P<0.05)。因而，有望将其开发成每周或更长周期给药一次的潜在的长效GLP-1受体激动剂。
[0136] 实施例6、db/db糖尿病小鼠单次注射FP-B的血糖变化情况
[0137] 选取SPF级、7周龄的雄性db/db小鼠和C57BL/6J雄性小鼠(购买于上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)：2012-0002)。饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。适应性饲养1周后，将30只db/db小鼠按随机血糖值和体重随机分为5组：模型对照组；杜拉鲁肽组(给药剂量：3mg/kg)；FP-B：设置0.75、1.5和3mg/kg低、中、高三个剂量组，每组6只；C57BL/6J小鼠作为正常对照组(n＝6)。各给药组皮下注射给予相应药物溶液，模型对照组和正常对照组皮下注射PBS缓冲液，给药体积均为10ml/kg。各组动物分别于给药前(0h)、给药后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定各组动物的随机血糖值RBG，并记录数据。数据以均数±标差 形式表示，采用SPSS 18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0138] 从表3中可知，单次给药后，FP-B中、高剂量组与杜拉鲁肽组相比，均表现出更持久的降血糖作用。杜拉鲁肽组在给药后第144h相比，与模型组的RBG值已无显著性差异，而此时FP-B中剂量组的RBG值与模型组相比，仍具有统计学差异(P<0.05)，FP-B高剂量组仍具有显著性差异(P<0.01)。另一方面，FP-B的降糖作用呈现剂量依赖性，与模型组相比，FP-B高剂量组的降糖作用持续至给药后第240h(P<0.05)；FP-B中剂量组的降糖作用持续至给药后第196h(P<0.05)；而FP-B低剂量组的降糖作用仅持续至给药后第120h(P<0.01)，与杜拉鲁肽降糖持续时间相似。
[0139] 表3.单次皮下注射FP-B对db/db小鼠随机血糖的影响(means±SD,n＝7)
[0140]
[0141] 注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01.
[0142] 续表3.单次皮下注射FP-B对db/db小鼠随机血糖的影响(means±SD,n＝7)
[0143]
[0144] 注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照相比，*P＜0.05，**P＜Δ ΔΔ0.01；与杜拉鲁肽组相比，P＜0.05， P＜0.01.
[0145] 续表3.单次皮下注射FP-B对db/db小鼠随机血糖的影响(means±SD,n＝7)
[0146]
[0147] 注：与正常对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01.
[0148] 实施例7、STZ诱导糖尿病小鼠单次注射FP-A和FP-B的药效学研究
[0149] 选取SPF级雄性昆明小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，体重25±2g，按体重随机分为糖尿病组和正常组。适应饲养1周的昆明小鼠，禁食18h，称重，糖尿病组按150mg/kg腹腔注射给予1％STZ溶液，pH＝4.4(购自Sigma公司，货号S0130)；正常组小鼠(n＝8)腹腔注射给予等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(购自国药集团化学试剂有限公司)。
注射后第10天检测糖尿病组小鼠随机血糖值(Random blood glucose，RBG)，其中RBG≥
16.7mmol/L为造模成功的糖尿病小鼠。为观察受试药物对STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，选取STZ-诱导糖尿病小鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别于皮下注射给予3mg/kg的FP-A、3mg/kg的FP-B和3mg/kg的杜拉鲁肽。模型组和正常组分别给予等体积剂量(10ml/kg)的PBS缓冲液。分别于给药前(0h)、给药后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、
168h、192h、216h和240h尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定各组动物的随机血糖值RBG，并记录数据。数据以均数±标差 形式表示，采用SPSS 18.0统计软件分析数据。
正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
注射后第10天检测糖尿病组小鼠随机血糖值(Random blood glucose，RBG)，其中RBG≥
16.7mmol/L为造模成功的糖尿病小鼠。为观察受试药物对STZ诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，选取STZ-诱导糖尿病小鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别于皮下注射给予3mg/kg的FP-A、3mg/kg的FP-B和3mg/kg的杜拉鲁肽。模型组和正常组分别给予等体积剂量(10ml/kg)的PBS缓冲液。分别于给药前(0h)、给药后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、
168h、192h、216h和240h尾静脉采血，用血糖仪(三诺安准血糖仪)测定各组动物的随机血糖值RBG，并记录数据。数据以均数±标差 形式表示，采用SPSS 18.0统计软件分析数据。
正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0150] 如图4所示，STZ诱导的糖尿病小鼠单次注射FP-A和FP-B后0-240小时随机血糖值变化曲线图显示，FP-A和FP-B均能有效地降低STZ诱导的糖尿病小鼠的随机血糖值。FP-A在给药后第24小时血糖水平降至最低，其后缓慢回升，在第96小时其随机血糖值与模型组相比，仍具有显著性差异(P＜0.05)；而FP-B组的降糖效果更佳，在给药后第24小时血糖水平还继续降低，于给药后48小时降至最低，在给药后第216小时随机血糖值与模型组相比，仍具有显著性差异(P＜0.01)。
[0151] 实施例8、db/db糖尿病小鼠连续10周给予FP-A的随机血糖及HbA1c含量变化
[0152] SPF级雌性db/db小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，8周龄，适应性饲养1周后，将24只db/db小鼠按随机血糖值(random blood glucose,RBG)随机分为4组(n＝6)：模型组、FP-A按低(0.75mg/kg)、中(1.5mg/kg)、高(3mg/kg)剂量给药。各给药组皮下注射给予相应剂量的药物溶液，模型组皮下注射PBS缓冲液，给药体积均为10ml/kg。各组动物每周给药一次，连续给药10周，分别用血糖仪(安准血糖仪，长沙三诺生物传感股份有限公司产品)检测给药后不同采血时间点各组小鼠RBG值，并记录数据。采血时间点设定：第一次给药前(0d)、给药后第7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d和70d。第70d，各组小鼠禁食14h后眼眶取血，然后立即用糖化血红蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)(深圳希莱恒医用电子有限公司产品，产品注册号：粤食药监械(准)字2013第2400025号)及其配套仪器H700特定蛋白分析仪(深圳希莱恒医用电子有限公司产品)检测全血中糖化血红蛋白(HbA1c)含量，结果以HbA1c占总血红蛋白的百分比(％)表示。
[0153] 数据以均数±标准差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用Dunnett t-检验，方差不齐采用Dunnett’T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0154] 从表4中各组小鼠连续给药10周随机血糖值的变化趋势可知，FP-A高、中、低剂量组的小鼠血糖值相对模型组都有一定程度的降低，并且其降血糖活性呈现剂量依赖性。提示FP-A能有效、持续地控制db/db糖尿病小鼠的血糖水平。而且，首次给药和末次给药FP-A的降糖效果相似，说明未出现由于受体的快速抗药性反应，引发对FP-A的耐受作用。
[0155] 糖化血红蛋白(HbA1c)是血中葡萄糖与红细胞的血红蛋白相结合的产物，它与血中的葡萄糖水平呈正比的关系。由于红细胞在血循环中的寿命约为120天，因此糖化血红蛋白可反映取血前4-12周血糖的总水平，弥补了空腹血糖只反映瞬时血糖的不足。因而，HbA1c是长期控制血糖最重要的评估指标，也是临床决定是否要更换治疗方案的重要依据。本实施例中HbA1c检查结果可以稳定、可靠的反映出取血前2～3个月小鼠的血糖控制情况。
连续给药10周后各组小鼠HbA1c含量测定结果如图5所示，显示高、中、低剂量组FP-A糖化HbA1c含量较模型组均发生显著性降低(P＜0.01)，且呈现剂量依赖性，其中高剂量组HbA1c(％)降低最显著(6.38±1.63)，但仍高于正常C57BL/6J小鼠的HbA1c水平(正常值参考范围：2.5％-3.5％)，说明即使3mg/kg的FP-A也不会引起长期低血糖反应的发生；以上结果提示FP-A能够长期、有效、平稳地控制小鼠血糖，且不增加引起低血糖的风险，这与表4中血糖变化趋势相符。
连续给药10周后各组小鼠HbA1c含量测定结果如图5所示，显示高、中、低剂量组FP-A糖化HbA1c含量较模型组均发生显著性降低(P＜0.01)，且呈现剂量依赖性，其中高剂量组HbA1c(％)降低最显著(6.38±1.63)，但仍高于正常C57BL/6J小鼠的HbA1c水平(正常值参考范围：2.5％-3.5％)，说明即使3mg/kg的FP-A也不会引起长期低血糖反应的发生；以上结果提示FP-A能够长期、有效、平稳地控制小鼠血糖，且不增加引起低血糖的风险，这与表4中血糖变化趋势相符。
[0156] 表4.FP-A对db/db小鼠随机血糖的影响(means±SD,n＝6)
[0157]
[0158] 注：各剂量组与模型组相比*P＜0.05；**P＜0.01。
[0159] 续表4.FP-A对db/db小鼠随机血糖的影响(means±SD,n＝6)
[0160]
[0161] 注：各剂量组与模型组相比*P＜0.05；**P＜0.01。
[0162] 实施例9、FP-A对高脂饲料诱导的肥胖小鼠预防减肥作用的实验研究
[0163] 一、模型建立与分组给药
[0164] 7周龄C57BL/6J雄性小鼠24只(购买自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)：2012-0002)。饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。C57BL/6J小鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为3组：正常组(NFD)、高脂组(HFD)、FP-A组(HFD+FP-A 0.3mg/kg)。高脂组、FP-A组给予高脂饲料(D12492高脂饲料，美国Research Diets公司产品)饲喂，正常组小鼠给予标准饲料(normal fat diet,NFD)喂养。FP-A组按
0.3mg/kg剂量每6天皮下注射相应药物溶液一次，正常组和模型组皮下注射PBS缓冲液，给药体积10ml/kg。96天后，各组小鼠禁食16小时，称重并检测空腹血糖值，眼眶取血，400×g离心15min，分离得血清。取血后，脱颈椎处死小鼠，测定小鼠鼻尖到肛门长度(体长)，计算Lee’s指数。分离双侧附睾周围脂肪组织，称湿重。取同一部位附睾脂肪组织保存于10％福尔马林溶液中，用于病理形态学检测。
0.3mg/kg剂量每6天皮下注射相应药物溶液一次，正常组和模型组皮下注射PBS缓冲液，给药体积10ml/kg。96天后，各组小鼠禁食16小时，称重并检测空腹血糖值，眼眶取血，400×g离心15min，分离得血清。取血后，脱颈椎处死小鼠，测定小鼠鼻尖到肛门长度(体长)，计算Lee’s指数。分离双侧附睾周围脂肪组织，称湿重。取同一部位附睾脂肪组织保存于10％福尔马林溶液中，用于病理形态学检测。
[0165] 二、指标检测
[0166] 2.1、体重及肥胖程度
[0167] 每6天小鼠称重一次，绘制小鼠体重增长曲线，并计算小鼠体重增长量。小鼠体重增长量＝小鼠末次称量时体重-小鼠分组时体重。以Lee’s指数评价小鼠肥胖程度。
[0168] 2.2、脂肪重量及指数
[0169] 以分析天平(BSA223S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品)称取小鼠两侧附睾周围脂肪组织，称湿重。计算附睾脂肪质量分数(mg/g)：附睾脂肪质量分数＝附睾脂肪质量(mg)/空腹体重(g)。
[0170] 2.3、口服糖耐量实验
[0171] 试验开展84天后，各组小鼠禁食16h(17:00am-9:00pm)，用血糖仪(安准血糖仪，长沙三诺生物传感股份有限公司产品)检测各组小鼠空腹血糖值(FBG)，称重。口服(i.g)给予2g/kg葡萄糖溶液(分析纯无水葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司产品)，检测灌胃后
30min，60min，90min和120min各组小鼠血糖值，绘制糖耐量曲线，梯形法计算修正血糖曲线下面积值(iAUC)。
30min，60min，90min和120min各组小鼠血糖值，绘制糖耐量曲线，梯形法计算修正血糖曲线下面积值(iAUC)。
[0172] 2.4、血清生化检测
[0173] 用全自动生化分析仪(欧霸XL-200全自动生化分析仪，德国欧霸公司产品)及配套试剂盒检测血清中TG(甘油三酯检测试剂盒，宁波美康生物科技有限公司产品)和TC(总胆固醇检测试剂盒，宁波美康生物科技有限公司产品)的含量，具体操作按照仪器说明书进行。
[0174] 2.5、胰岛素及胰岛素耐受指数
[0175] 用ELISA法(小鼠胰岛素ELISA检测试剂盒，美国ALPCO公司产品)检测小鼠血清胰岛素含量，并计算胰岛素耐受指数。
[0176] 2.6、脂肪组织病理检测
[0177] 取同一侧附睾脂肪组织，以苏木精-伊红染色法(简称HE染色)观察脂肪细胞组织形态学。
[0178] 三、统计与分析
[0179] 数据以均数±标准差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0180] 四、结果
[0181] 4.1、FP-A对高脂饲料喂养小鼠体重及肥胖程度的的影响
[0182] 与正常组相比，高脂组小鼠体重、体重增长量及Lee’s指数均显著升高(P＜0.01)。FP-A能显著降低高脂饲料饲喂小鼠的体重，体重增长量及Lee’s指数(P＜0.01)，结果见表5和图6。
[0183] 表5.FP-A对高脂饲料喂养小鼠体重和Lee’s指数的影响(means±SD,n＝8)
[0184]
[0185] 注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01.[0186] 4.2、FP-A对附睾脂肪质量和质量分数的影响
[0187] 如表6所示，与正常组相比，高脂组小鼠附睾脂肪质量及质量分数均显著升高(P＜0.01)。与高脂组相比，FP-A组小鼠附睾脂肪质量及质量分数均显著降低(P＜0.05)。
[0188] 表6.FP-A对附睾脂肪质量和质量分数的影响(means±SD,n＝8)
[0189]
[0190] 注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01.[0191] 4.3、FP-A对小鼠血清TG和TC含量的影响
[0192] 与正常组相比，高脂组小鼠血清TC和TG含量均显著升高(P＜0.01)。与高脂组相比，FP-A组小鼠血清TC含量显著降低(P＜0.01)，TG含量也发生显著降低(P＜0.01)。结果见表7。
[0193] 表7.FP-A对小鼠血清TG和TC含量的影响(means±SD,n＝8)
[0194]
[0195] 注：与正常组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与高脂组相比，*P＜0.05，**P＜0.01.[0196] 4.4、FP-A对高脂饲料喂养小鼠糖耐量的影响
[0197] 如图7所示，高脂组iAUC显著高于正常组(P＜0.05)。与高脂组相比，FP-A组的iAUC显著降低(P＜0.05)。
[0198] 4.5、FP-A对高脂饲料喂养小鼠血清胰岛素和胰岛素耐受指数的影响
[0199] 与正常组相比，高脂组小鼠的血清胰岛素浓度(P＜0.01)及胰岛素耐受指数(P＜0.05)均显著性升高，即小鼠已发生明显的胰岛素抵抗现象，因而会代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症。与高脂组相比，FP-A能显著降低小鼠血清胰岛素(INS)含量(P＜
0.05)，改善小鼠胰岛素耐受指数(HOMA-IR)(P＜0.05)。结果分别见图8和图9。
0.05)，改善小鼠胰岛素耐受指数(HOMA-IR)(P＜0.05)。结果分别见图8和图9。
[0200] 4.6、病理形态学检查
[0201] HE染色结果显示，与正常组相比，高脂组小鼠附睾脂肪细胞横截面积显著增加。与高脂组相比，FP-A组小鼠附睾脂肪细胞横截面积显著缩小，结果见图10。
[0202] 综合以上研究结果，证实FP-A可以有效地控制高脂饲料诱导的肥胖小鼠的体重，具有减肥作用。
[0203] 实施例10、FP-B对C57BL/6J小鼠糖耐量的影响
[0204] 8周龄SPF级别雄性C57BL/6J小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)：2012-0002)。饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。24只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应性饲养后，随机分为正常组和FP-B组，分别皮下注射给予PBS缓冲液或3mg/kg FP-B溶液。给药后1d、4d、7d和10d分别进行糖耐量实验。具体方法如下：各组小鼠禁食16h(17:30pm-9:30am)，检测各组小鼠血糖值，称重，i.p给予2g/kg葡萄糖溶液，给药体积10mL/kg。检测注射后15min，30min，60min，90min和120min各组小鼠血糖值，绘制糖耐量曲线，梯形法计算修正后血糖曲线下面积(iAUC)。
[0205] 数据以均数±标准差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异比较采用单因素方差分析，方差齐性选择LSD检验，方差不齐选择Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
[0206] C57BL/6J小鼠给予FP-B 1d、4d、7d和10d后糖耐量试验血糖曲线，分别如图11-1a、11-2a、11-3a和11-4a所示，显示FP-B给药组小鼠相对于正常组的糖耐量实验曲线下增长面积显著降低，在单次给药后10d仍具有显著增强的糖耐受作用。如图11-1b、11-2b、11-3b和
11-4b所示，C57BL/6J小鼠给予FP-B 1d、4d、7d和10d后，与正常组相比FP-B组的iAUC值均显著降低(P＜0.01)。本试验证实FP-B能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制外源性葡萄糖摄入所引起的暂时性血糖升高，促进葡萄糖利用，从作用机制上解释了FP-B长效降血糖作用。
11-4b所示，C57BL/6J小鼠给予FP-B 1d、4d、7d和10d后，与正常组相比FP-B组的iAUC值均显著降低(P＜0.01)。本试验证实FP-B能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制外源性葡萄糖摄入所引起的暂时性血糖升高，促进葡萄糖利用，从作用机制上解释了FP-B长效降血糖作用。
[0207] 实施例11、FP-A、FP-B和FP-I于大鼠体内单次给药药代动力学测定
[0208] 雄性SPF级SD大鼠(购自上海必凯实验动物有限公司)，预饲一周后单次皮下注射(sc)0.5mg/kg的FP-A、FP-B和FP-I，每组4只，分别于给药前0h，给药后2h、8h、24h、32h、48h、56h、72h、96h、120h和144h眼眶取血，每次约0.3ml左右，分别记作：T0、T2、T8、T24、T32、T48、T56、T72、T96、T120和T144。取血后静置，再以5000rpm离心10min分离血清，于-70℃冷冻保存后合并检验。用双抗夹心ELISA测定时，以自制或市售的抗Exendin-4或GLP-1的NH2末端单克隆抗体(如Santa Cruz公司生产，货号SC-65389)包被、以自制或市售的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG Fc单抗(如北京义翘神州生物技术有限公司，货号：10702-MM01E-50)进行检测。
后将数据输入分析软件PKSOLVER，得出待测药物在血液中T1/2，Cmax和AUC0～48h～∞等药代动力学参数。
后将数据输入分析软件PKSOLVER，得出待测药物在血液中T1/2，Cmax和AUC0～48h～∞等药代动力学参数。
[0209] 如表8中结果显示，0.5mg/kg的FP-I在大鼠体内的循环半衰期T1/2为14.1±1.67小时，而0.5mg/kg的FP-A和FP-B在大鼠体内的T1/2分别为21.4±2.51和22.6±3.6小时。FP-A和FP-B最大血药浓度Cmax值均显著高于FP-I。另外，通过比较表8中不同采血时间点测得的AUC0～t(t＝2h、5h、8h、24h、28h、32h或48h)可得知，在给药剂量相同的情况下，FP-A和FP-B的药物暴露量都高于FP-I，即FP-A和FP-B在大鼠体内的绝对生物利用度较不含CTP刚性单元的FP-I更高，可以预期其临床给药剂量也将降低。
[0210] 表8.雄性SD大鼠单次皮下注射0.5mg/kg的FP-A、FP-B和FP-I的药代动力学参数[0211]
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