自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物及其构建方法
阅读：538发布：2020-05-12
专利汇可以提供自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及组织工程和医学创面修复技术领域。目前传统的 皮肤 替代物移植后血管化速度慢、存活率低，无法在临床推广应用。本发明构建了一种能自动捕获外周血中内皮祖细胞， 加速 血管化的新型皮肤替代物，将低 氧 反应元件调控的基质细胞衍生因子9HRE-CMV基因 转染 到 成 纤维 细胞 ，然后将表皮细胞和转基因的成纤维细胞分别种植到真皮 支架 两面形成夹心式皮肤替代物，移植后适时、适度地表达、分泌SDF-1α，介导外周血中EPC迁移、归巢到皮肤替代物移植部位，从而促进皮肤替代物的血管化，提高移植后存活率。本发明的皮肤替代物能明显提高对EPC细胞的趋化诱导，加速皮肤替代物的血管化，平均存活率达95％，而传统不含转基因成纤维细胞的皮肤替代物平均存活率仅为72％。，下面是自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物及其构建方法专利的具体信息内容。
1.一种能自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物的构建方法，该方法包括如下步骤：
A)分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞；
B)构建含SDF-1α基因表达的载体；
C)构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体，并转染成纤维细胞；
D)构建含表皮细胞-转基因成纤维细胞的皮肤替代物。
2.根据权利要求1所述的能自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物的构建方法，，其特征在于该方法的具体步骤如下：
A)分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞：
利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细胞，
5
分别制备成单细胞悬液，按2-3×10 个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养，成纤维细胞以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达
70％-80％融合时进行传代、扩增；
B)构建含SDF-1α基因的表达载体：
从人的内皮细胞中克隆出SDF-1α基因并测序，将SDF-1α基因插入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-SDF-1α表达载体。
C)构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体，并转染成纤维细胞：
获得多 拷贝低氧 反应元件启 动子9HRE-CMV，并 与SDF-1α基因片断 连接，插入pcDNA3.1载体，构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因 表达载体：
pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体；
利用Lipofectamine 2000介导pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体转染体外培养的成纤维细胞；
D)构建含表皮细胞-转基因成纤维细胞的皮肤替代物：
以真皮支架为载体，于其两面分别种植体外培养的表皮细胞和转染9HRE-CMV-SDF-1α基因的成纤维细胞，经体外培养后形成夹心式皮肤替代物。
3.根据权利要求2所述的能自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物的构建方法，，其特征在于步骤D)中的真皮支架为脱细胞真皮、海绵状胶原膜、透明质酸膜或聚乳酸/聚羟基乙酸膜。
4.一种如权利要求1、2或3所述的方法构建的皮肤替代物。
5.如权利要求4所述的皮肤替代物在制备创面修复移植材料中的应用。
自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物及其构建方
法
技术领域
[0001] 本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，具体涉及一种能自动捕获外周血内皮祖细胞，促进血管化的新型皮肤替代物，可明显提高皮肤替代物的移植成活率。
背景技术
[0002] 皮肤组织工程经过20余年的发展，单纯表皮细胞培养与移植、真皮支架的研制与应用技术均已较为成熟，并成功地应用于临床。在此基础上，研究者将体外培养的表皮细胞种植于真皮支架表面构建了含表皮细胞层的夹心式皮肤替代物，试图一次性修复缺损的表皮层和真皮层。然而，将夹心式皮肤替代物移植于深度烧伤切痂创面，抗感染能力差、存活率低，波动在0％～50％之间，难以在临床上推广应用。关键原因之一是皮肤替代物移植后血管化速度慢。在移植早期，皮肤替代物血供差，表皮细胞层营养供应不足，导致增殖缓慢、甚至死亡脱落(Caruso DM，Schuh WH，Al-Kasspooles MF，et al.Culturedcomposite autografts as coverage for an extensive body surface area burn：casereport and review of the technology.Burns，1999，25(8)：771-779.Scuderi N，OnestiMG，Bistoni G，et al.The clinical application of autologous bioengineered skinbased on a hyaluronic acid scaffold.Biomaterials，2008，29(11)：1620-9.)。因此，构建一种血管化速度快、移植存活率高的皮肤替代物是皮肤组织工程研究中需迫切解决的难题。
[0003] 存在于外周循环血液中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是新生血管形成的关键参与者。在某种病理状态下(如组织缺血、心血管手术后等)，缺血缺氧组织局部分泌基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derivedfactor-1α，SDF-1α)，SDF-1α是EPC的强大趋化剂(Avci-Adali M，ZiemerG，Wendel HP.Induction of EPC homing on biofunctionalized vascular grafts forrapid in vivo self-endothelization-a review of current strategies.BiotechnolAdv.2010；28(1)：119-29)，它通过与EPC表面的特异性受体CXCR4(chemokineCXC receptor type 4，CXCR4)结合，在短时间内即可迅速动员骨髓中EPC进入外周血，并介导外周血中的EPC迁移、归巢到缺血缺氧组织局部，从而参与了血管新生及损伤血管的重新内皮化(Madeddu P，Kraenkel N，Barcelos LS，et al.Phosphoinositide 3-kinase gamma gene knockout impairs postischemicneovascularization and endothelial progenitor cell functions.Arterioscler ThrombVasc Biol，2008，28(1)：68-76.)。研究者将质粒DNA编码的SDF-1a基因转染到鼠缺血肢体内，观察到转染鼠的外周血中EPC增多，缺血部位毛细血管密度增大，血液灌流量明显恢复(Hiasa K，Ishibashi M，Ohtani K，et al.Gene transfer ofstromal cell-derived factor-1alpha enhances ischemic vasculogenesis andangiogenesis via vascular endothelial growth factor/endothelial nitric oxidesynthase-related pathway：next-generation chemokine therapy for therapeuticneovascularization.Circulation，2004，25；109(20)：2454-61.)。而直接将外周血中分离的EPC种植到真皮支架表面，经体外培养后移植，可见血管化明显加快，并证实移植的EPC同时参与了局部新生血管形成和干细胞血管发生这两种再血管化过程(Kung EF，Wang F，Schechner JS.In vivo perfusion of human skinsubstitutes with microvessels formed by adult circulating endothelial progenitorcells.Dermatol Surg，2008，34(2)：137-46.Shepherd BR，Enis DR，Wang F，et al.Vascularization and engraftment of a human skin substitute using circulatingprogenitor cell-derived endothelial cells.FASEB J，2006，20(10)：1739-41.)。因此，EPC的发现与应用为组织工程器官的再血管化提供了新的思路。
[0004] 然而，由于分离、培养自体EPC的方法尚未成熟，使EPC的应用受到极大的限制。既使能培养、扩增足量的EPC，接种到真皮支架表面培养，EPC粘附性差，存活率低，且长时间培养后易导致干细胞分化，失去血管生成能力(Hofmann NA，Reinisch A，Strunk D.Isolation and large scale expansion of adulthuman endothelial colony forming progenitor cells.J VisExp.2009；28(32)：1524-29)。因此，采用传统的分离、培养和移植EPC的方法促进皮肤替代物的血管化存在各种技术上的瓶颈。
发明内容
[0005] 本发明目的在于构建一种血管化速度快、移植存活率高的皮肤替代物。
[0006] 本发明设想：如果使皮肤替代物高表达SDF-1a，那么可通过SDF-1/CXCR4轴迅速介导外周血中EPC迁移、归巢到皮肤替代物移植部位，加速血管化，提高移植存活率。从而避免EPC体外分离、培养、移植所带来的多种不足。
[0007] 本发明的技术方案是通过基因转染技术，构建了一种高表达基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)的皮肤替代物，移植后可释放SDF-1α，与外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)表面特异性受体CXCR4(chemokine CXC receptor type 4，CXCR4)结合，从而介导EPC的迅速迁移、归巢到皮肤替代物移植部位，加速血管化，提高移植存活率。具体是将低氧反应元件调控的基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)基因转染到成纤维细胞，然后将表皮细胞和转基因的成纤维细胞分别种植到真皮支架两面形成夹心式皮肤替代物，移植后适时、适度地表达、分泌SDF-1α，促进皮肤替代物的血管化，提高移植存活率。
[0008] 本发明提供了一种能自动捕获内皮祖细胞促进血管化的皮肤替代物的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0009] 1.分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞(参考：刘德伍，李国辉，邹萍，刘德明.表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤.中国临床康复，2004，8(8)：1439-1441.)；
[0010] 2.构建含SDF-1α基因表达的载体，表达载体为pcDNA3.1-SDF-1α；
[0011] 3.构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体，并转染成纤维细胞；
[0012] 4.构建含表皮细胞-转基因成纤维细胞的皮肤替代物。
[0013] 本发明的构建方法具体步骤如下：
[0014] 1.分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞：
[0015] 利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细胞。
[0016] 2.构建含SDF-1α基因的表达载体
[0017] 从人的内皮细胞中克隆出SDF-1α基因并测序，将SDF-1α基因插入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-SDF-1α表达载体。
[0018] 3.构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体
[0019] 采用分子生物学技术，获得多拷贝低氧反应元件启动子(9HRE-CMV)，并与SDF-1α基因片断连接，插入pcDNA3.1载体，构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体：pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体。
[0020] 4.pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α基因表达载体转染成纤维细胞
[0021] 利用Lipofectamine 2000介导pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体转染体外培养的成纤维细胞。
[0022] 5.构建含表皮细胞-转基因成纤维细胞的皮肤替代物
[0023] 以真皮支架为载体，于其两面分别种植体外培养的表皮细胞和转染9HRE-CMV-SDF-1α基因的成纤维细胞，经体外培养后形成夹心式皮肤替代物。
[0024] 临床上常用的真皮支架有脱细胞真皮、海绵状胶原膜、透明质酸膜和聚乳酸/聚羟基乙酸膜等。
[0025] 本发明还提供了根据上述方法构建的皮肤替代物。
[0026] 本发明还提供了根据上述方法构建的皮肤替代物作为创面修复移植材料的应用。
[0027] 本发明对目前所采用的加速皮肤替代物血管化的方法进行了明显改进。传统方法是从外周血中分离EPC后体外培养扩增，再种植到皮肤替代物的表面，从而加速皮肤替代物移植后血管化。本发明构建了表达SDF-1α基因产物的皮肤替代物，该皮肤替代物移植后通过SDF-1/CXCR4轴迅速介导外周血中EPC迁移、归巢到皮肤替代物移植部位，加速血管化，避免了常规分离、培养、种植EPC的各种不足。此外，该皮肤替代物将低氧反应元件(HRE)作为氧条件基因表达控制开关，调控SDF-1α基因的表达和关闭，即皮肤替代物未血管化前，在缺氧环境下，受HRE的调控，SDF-1α有效表达，而在血管化后，皮肤替代物处于常氧状态下，目的基因的表达即行中止，提高了基因治疗的安全性。
[0029] 图1为pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体构建示意图。
具体实施方式
[0030] 现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0031] 实施例1.制备能自动捕获内皮祖细胞促进血管化的新型皮肤替代物[0032] 1.分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞：
[0033] 利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细5
胞。分别制备成单细胞悬液，按2-3×10 个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养(DK-SFM，Gibco，美国)，成纤维细胞以完全型DMEM培养液(Gibco，美国)进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增。
胞。分别制备成单细胞悬液，按2-3×10 个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养(DK-SFM，Gibco，美国)，成纤维细胞以完全型DMEM培养液(Gibco，美国)进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增。
[0034] 2.构建含SDF-1α基因表达的载体
[0035] SDF-1α基因的序列：
[0036] ATGAACGCCAAGGTCGTGGTCGTGCTGGTCCTCGTGCTGACCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAGCCCGTCAGCCTGAGCTACAGATGCCCATGCCGATTCTTCGAAAGCCATGTTGCCAGAGCCAACGTCAAGCATCTCAAAATTCTCAACACTCCAAACTGTGCCCTTCAGATTGTAGCCCGGCTGAAGAACAACAACAGACAAGTGTGCATTGACCCGAAGCTAAAGTGGATTCAGGAGTACCTGGAGAAAGCTTTAAACAAGTAA
[0037] 设计引物：上游引物5’-CGGGATCCATGAACGCCAAGGTCG-3’
[0038] 下游引物5’-GGAATTCGGACCTCTTTCGAAATTTGTTCATT-3’
[0039] 提取人的内皮细胞中的mRNA，通过RT-PCR反转录得到cDNA，通过特定引物PCR得到SDF-1α，试剂盒回收PCR产物，连pMD-18T(TaKaRa)，做转化，提取质粒后酶切鉴定，选取正确的质粒送公司测序(委托Invitrogen公司测序)，测序正确后，用BamH I、EcoR I来酶切质粒pMD-18T-SDF-1α，得到具有粘性末端的SDF-1α基因，用T4连接酶将SDF-1α基因与已经用BamH I、EcoR I酶切好的pcDNA3.1(+)质粒链接，转化大肠杆菌，提取质粒pcDNA3.1-SDF-1α，送Invitrogen公司测序鉴定，得到pcDNA3.1-SDF-1α表达载体。
[0040] 3.构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体
[0041] 多拷贝低氧反应元件启动子(9HRE-CMV)委托Invitrogen公司构建，用PCR技术在基因5’端加上KpnI酶切位点，3’端加上BamH I酶切位点，与酶切后的SDF-1α基因和酶切后的pcDNA3.1(+)载体连接，构建低氧反应元件控制的SDF-1α基因表达载体：pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α载体(如图1所示)。
[0042] 4.pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α基因表达载体转染成纤维细胞
[0043] 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA。对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEM I培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α混合，保温时间过长会降低活性。)混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
[0044] 5.构建含表皮细胞-转基因成纤维细胞的皮肤替代物
[0045] 将海绵状胶原膜(PELNAC，郡是有限公司，日本)铺于培养板上，将已转染5 2
pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α的成纤维细胞以1-3×10 个/cm 的密度种植于胶原膜表面，
5 2
于体外培养1-2天。随后将胶原膜翻转，种植成纤维细胞面向下，对侧面以3-5×10 个/cm的密度接种角朊细胞，待细胞融合后，进行气-液界面培养2周，每2～3天换液一次，形成含表皮细胞-转基因成纤维细胞的夹心式皮肤替代物。
pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α的成纤维细胞以1-3×10 个/cm 的密度种植于胶原膜表面，
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于体外培养1-2天。随后将胶原膜翻转，种植成纤维细胞面向下，对侧面以3-5×10 个/cm的密度接种角朊细胞，待细胞融合后，进行气-液界面培养2周，每2～3天换液一次，形成含表皮细胞-转基因成纤维细胞的夹心式皮肤替代物。
[0046] 实施例2.本发明皮肤替代物的动物移植试验
[0047] 雄性Balb/c-nu小鼠(裸鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，体重18±2克，40只，共分为四组。分别为含转染SDF-1α基因成纤维细胞的皮肤替代物，含转染端加上pcDNA3.1-9HRE-CMV-SDF-1α成纤维细胞的皮肤替代物，含转染空载体的成纤维细胞的皮肤替代物及未转染基因的正常成纤维细胞的皮肤替代物。
[0048] 裸鼠经氯胺酮腹腔麻醉后，剃除背部皮肤毛发，切除脊柱偏腹侧部全层皮肤及深筋膜达肌肉层。将实施例1中所述的经体外培养2-3周的活性皮肤替代物移植于创面。为防止创周皮肤收缩及表皮爬行，影响移植结果的观察，采用隔离圈将创面与周边皮肤隔离。皮肤替代物上覆盖油砂，定期更换敷料并观察创面愈合情况。移植后1、3、6、9、12、14天后分别取材观察血管化、存活率及新生皮肤组织学。
[0049] 结果表明，本发明新型皮肤替代物能明显提高对EPC细胞的趋化诱导，加速皮肤替代物的血管化，平均存活率达95％，而传统不含转基因成纤维细胞的皮肤替代物平均存活率仅为72％。
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