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用于治疗伤口的组合物

阅读：177发布：2021-04-05

专利汇可以提供用于治疗伤口的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明描述了用于治疗伤口并促进其愈合的新型组合物，包括含有载体与具有较少同种型和增强的生物稳定性的重组血小板衍生生长因子的新型组合的组合物。本发明还描述了利用以最少治疗施加次数产生有效结果的给药程序，用新型治疗性组合物来治疗伤口的方法。，下面是用于治疗伤口的组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种包含无菌rhPDGF和无菌多孔基质的治疗性组合物，其中
(a)至少80％的rhPDGF是未剪切的rhPDGF；
(b)所述rhPDGF是生物稳定的，使得在与基质组合之前，当在16-32℃下储存至少约六个月时，所述rhPDGF能够保留其生物活性的至少80％；并且
(c)所述基质包含孔，所述孔允许细胞附着并向内生长至所述孔中。
2.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述无菌rhPDGF包含具有约0.05mg/ml至约5mg/ml rhPDGF-BB的rhPDGF-BB溶液。
3.根据权利要求2所述的治疗性组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质之比为约
4μl/cm3至约4,000μ1/cm3，或者rhPDGF-BB与所述基质之比为约1.2μg PDGF/cm3基质至约
12mg PDGF/cm3基质。
4.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其由含有冻干rhPDGF-BB的无菌rhPDGF粉末形成，其中基于重量，至少约80％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
5.根据权利要求3所述的治疗性组合物，其通过使所述rhPDGF粉末与无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液组合来重建所述冻干rhPDGF-BB而形成。
6.一种治疗性组合物，其包含：
(1)包含约0.05mg/ml至约5mg/ml rhPDGF-BB的rhPDGF-BB溶液，并且所述rhPDGF-BB溶液通过组合以下各项而形成：
a)含有冻干rhPDGF-BB的无菌粉末，其中基于重量，至少约80％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB，并且其中所述粉末能够在约16℃至约32℃下储存并且仍然保持至少80％的所述rhPDGF-BB的生物活性至少约一年，和
b)无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液，由此将所述冻干的未剪切rhPDGF-BB重建为溶液；
以及
(2)生物相容的、可再吸收的载体，
其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约4μl/cm3至约4,000μ1/cm3，或者rhPDGF-BB与所述载体之比为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述载体包含具有孔的基质，所述孔允许细胞附着并向内生长至所述孔中。
8.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述基质是天然聚合物、合成聚合物或其组合。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述基质是选自胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素、壳聚糖和纤连蛋白的天然聚合物。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述基质是选自聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(DL-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(e-己内酯)(PCL)和聚氨酯的合成聚合物。
11.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述基质是胶原蛋白海绵或胶原蛋白伤口敷料。
12.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述基质提供孔径范围为约50μm至约1mm的多孔细胞支架。
13.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述基质提供平均孔径为约50微米至约500微米的多孔细胞支架。
14.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述基质提供平均孔径为约100微米至约
300微米的多孔细胞支架。
15.根据权利要求12、13或14所述的组合物，其中大多数基质孔互相连接。
16.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液是预先配制的无菌PDGF溶液。
17.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.1mg/ml至约
1mg/ml的rhPDGF-BB。
18.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.2mg/ml至约
0.4mg/ml的rhPDGF-BB。
19.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.3mg/ml的rhPDGF-BB。
20.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.5mg/ml的rhPDGF-BB。
21.根据权利要求2或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约1.0mg/ml的rhPDGF-BB。
22.根据权利要求4或6所述的组合物，其中基于重量，至少约85％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
23.根据权利要求4或6所述的组合物，其中基于重量，至少约90％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
24.根据权利要求4或6所述的组合物，其中基于重量，至少约95％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
25.根据权利要求4或6所述的组合物，其中基于重量，至少约97％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
26.根据权利要求1或6所述的组合物，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB包含至少约90％的下述rhPDGF-BB，该rhPDGF-BB包含与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列。
27.根据权利要求1或6所述的组合物，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB基本由至少约80％的下述rhPDGF-BB组成，该rhPDGF-BB基本由与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列组成。
28.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.1ml/cm3至约30ml/cm3。
29.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.2ml/cm3至约20ml/cm3。
30.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.1ml/cm3至约10ml/cm3。
31.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.25ml/cm3至约10ml/cm3。
32.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.25ml/cm3至约5ml/cm3。
33.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.25ml/cm3至约2.5ml/cm3。
34.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.1ml/cm3至约1ml/cm3。
35.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述基质或载体之比为约0.5ml/cm3至约1.5ml/cm3。
36.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
30μg PDGF/cm3至约9mg PDGF/cm3。
37.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
60μg PDGF/cm3至约6mg PDGF/cm3。
38.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
75μg PDGF/cm3至约3mg PDGF/cm3。
39.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
75μg PDGF/cm3至约1.5mg PDGF/cm3。
40.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
75μg PDGF/cm3至约750μg PDGF/cm3。
41.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
120μg PDGF/cm3至约600μg PDGF/cm3。
42.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
150μg PDGF/cm3至约450μg PDGF/cm3。
43.根据权利要求3或6所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述基质或载体之比为约
75μg PDGF/cm3载体至约225μg PDGF/cm3载体。
44.根据权利要求5或7所述的组合物，其中当所述rhPDGF-BB溶液与所述基质组合时，所述基质能够使至少约20％的所述重建的未剪切rhPDGF-BB截留在所述基质的孔内，使得当所述组合物施加于患者的伤口时，所述重建的未剪切rhPDGF-BB随着该基质被患者身体吸收而随时间释放，由此提供rhPDGF-BB在伤口部位的延迟或延长递送并同时提供用于新细胞和组织向内生长的多孔基质。
45.根据权利要求1或6所述的组合物，其包含通过大肠杆菌表达系统产生的rhPDGF-BB。
46.一种包含干燥器具和基质的治疗性组合物，该器具包括含有rhPDGF的冻干组合物，其中所述基质包含允许细胞附着并向内生长至孔中的孔，至少80％的所述rhPDGF是未剪切的rhPDGF，并且所述干燥器具是生物稳定的，使得当在16-32℃下储存至少约六个月时，其中所包含的rhPDGF能够保留其生物活性的至少80％。
47.一种治疗伤口的方法，其中所述方法包括：
(1)为伤口清创；
(2)在伤口清创的48小时内将权利要求1、6或46的组合物施加于伤口；以及(3)任选地，根据伤口的严重程度，每3-42天再施加一次所述组合物；
其中就每次施加而言，所述组合物向伤口递送约10μg至1000μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
48.一种治疗伤口的方法，其中所述方法包括：
(1)为伤口清创以去除坏死或感染的组织；
(2)形成包含无菌rhPDGF-BB和无菌多孔生物相容性载体的治疗性组合物；
(3)将所述治疗性组合物施加于伤口表面，其中所述载体提供当伤口愈合时用于细胞附着和血管向内生长的基底；
(4)用敷料覆盖伤口；以及
(5)在治疗期内监视伤口的愈合，并以3天或更多天的治疗间隔重复步骤(1)-(4)以对该伤口进行再治疗。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述治疗间隔为每3至42天一次，并且所述治疗期为约2周至约20周。
50.根据权利要求48所述的方法，其中在第一个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
51.一种治疗伤口的方法，其中所述方法包括：
(1)为所述伤口清创；
(2)在约2周至约20周的治疗期内以大约每3至42天一次的治疗间隔将含有rhPDGF-BB的治疗性组合物施加于所述伤口，并且其中在第一个治疗间隔内施加的治疗性组合物包含至少约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积；
(3)在每次施加所述治疗性组合物之后用敷料覆盖所述伤口；以及
(4)建议所述患者避免在所述伤口上施加压力。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述治疗性组合物进一步包含无菌生物相容性载体。
53.根据权利要求52所述的方法，其进一步包括通过使含有所述rhPDGF-BB的溶液与所述载体组合来形成所述治疗性组合物的步骤。
54.根据权利要求48或53所述的方法，其中所述载体是多孔生物可吸收的伤口敷料，并且通过直接在伤口上形成所述治疗性组合物而使形成所述治疗性组合物的步骤和将所述治疗性组合物施加于伤口的步骤同时完成。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述治疗性组合物通过以下任一项形成：
(1)将所述多孔生物可吸收的伤口敷料施加于伤口并随后将rhPDGF-BB溶液施加于该敷料；或
(2)将rhPDGF-BB溶液施加于伤口并随后将敷料施加于所述伤口。
56.根据权利要求48或52所述的方法，其中所述rhPDGF-BB包括通过用无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液重建含有rhPDGF-BB的冻干的无菌粉末而形成的无菌rhPDGF-BB溶液。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗性组合物通过以使得所述载体被所述rhPDGF-BB溶液浸湿的方式将所述无菌rhPDGF-BB溶液无菌添加至所述载体而形成。
58.根据权利要求48或51所述的方法，其中在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约50mg的rhPDGF-BB。
59.根据权利要求48或51所述的方法，其中在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约25mg的rhPDGF-BB。
60.根据权利要求48或51所述的方法，其中在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约10mg的rhPDGF-BB。
61.根据权利要求48或51所述的方法，其中在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约5mg的rhPDGF-BB。
62.根据权利要求48或51所述的方法，其中对于每个治疗间隔的时间长度基本相同。
63.根据权利要求48或51所述的方法，其中对于一些治疗间隔的时间长度有所不同。
64.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述治疗间隔为每3至28天一次。
65.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述治疗间隔为每4至21天一次。
66.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述治疗间隔为每7至21天一次。
67.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述治疗间隔为每7至14天一次。
68.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述伤口再治疗0至46次。
69.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述伤口再治疗1至46次。
70.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述伤口再治疗0至20次。
71.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述伤口再治疗1至20次。
72.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含
2
至少约10μg rhPDGF/cm伤口表面积。
73.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约25μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
74.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约50μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
75.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
76.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约250μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
77.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含至少约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
78.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
79.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
80.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含约15μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约375μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
81.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含约30μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约190μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
82.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔施加的治疗性组合物包含约30μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约300μg rhPDGF/cm2伤口表面积。
83.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述敷料是半封闭或封闭敷料。
84.根据权利要求48或51所述的方法，其中在每个治疗间隔期间更换所述敷料，并在用敷料覆盖伤口之前用盐水或合适的抗菌伤口清洁剂和/或清创化学剂来清洁伤口。
85.根据权利要求48或51所述的方法，其中所述治疗性组合物包含：
(1)包含约0.05mg/ml至约5mg/ml rhPDGF-BB的rhPDGF-BB溶液，并且所述rhPDGF-BB溶液通过组合以下各项而形成：
a)含有冻干rhPDGF-BB的无菌粉末，其中基于重量，至少约80％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB，并且其中所述粉末能够在约16℃至约32℃下储存并仍然保持至少80％的所述rhPDGF-BB的生物活性至少约一年，和
b)无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液，由此将所述冻干的未剪切rhPDGF-BB重建为溶液；
以及
(2)生物相容的、可再吸收的载体，
其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约4μl/cm3载体至约4,000μ1/cm3载体，或者rhPDGF-BB与所述载体之比为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体是天然聚合物、合成聚合物或其组合。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体是选自胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素、壳聚糖和纤连蛋白的天然聚合物。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体是选自聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(DL-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(e-己内酯)(PCL)和聚氨酯的合成聚合物。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体是胶原蛋白海绵或胶原蛋白伤口敷料。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体提供孔径范围为约50μm至约1mm的多孔细胞支架。
91.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体提供平均孔径为约50微米至约500微米的多孔细胞支架。
92.根据权利要求85所述的方法，其中所述载体提供平均孔径为约100微米至约300微米的多孔细胞支架。
93.根据权利要求90、91或92所述的方法，其中大多数载体孔互相连接。
94.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.1mg/ml至约1mg/ml的rhPDGF-BB。
95.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.2mg/ml至约0.4mg/ml的rhPDGF-BB。
96.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.3mg/ml的rhPDGF-BB。
97.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.5mg/ml的rhPDGF-BB。
98.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约1.0mg/ml的rhPDGF-BB。
99.根据权利要求85所述的方法，其中基于重量，至少约85％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
100.根据权利要求85所述的方法，其中基于重量，至少约90％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
101.根据权利要求85所述的方法，其中基于重量，至少约95％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
102.根据权利要求85所述的方法，其中基于重量，至少约97％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
103.根据权利要求85所述的方法，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB包含至少约90％的下述rhPDGF-BB，该rhPDGF-BB包含与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列。
104.根据权利要求85所述的方法，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB基本由至少约80％的下述rhPDGF-BB组成，该rhPDGF-BB基本由与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列组成。
105.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
3 3
0.1ml/cm至约30ml/cm。
106.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.2ml/cm3至约20ml/cm3。
107.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
3 3
0.1ml/cm至约10ml/cm。
108.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.25ml/cm3至约5ml/cm3。
109.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.25ml/cm3至约2.5ml/cm3。
110.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.1ml/cm3至约1ml/cm3。
111.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.5ml/cm3至约1.5ml/cm3。
112.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约30μg PDGF/cm3至约9mg PDGF/cm3。
113.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约60μg PDGF/cm3至约6mg PDGF/cm3。
114.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3至约3mg PDGF/cm3。
115.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3至约1.5mg PDGF/cm3。
116.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3至约750μg PDGF/cm3。
117.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约120μg PDGF/cm3至约600μg PDGF/cm3。
118.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约150μg PDGF/cm3至约450μg PDGF/cm3。
119.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3载体至约225μg PDGF/cm3载体。
120.根据权利要求85所述的方法，其中当所述rhPDGF-BB溶液与所述载体组合时，所述载体能够使至少约20％的所述重建的未剪切rhPDGF-BB截留在所述载体的孔内，使得当所述组合物施加于患者的伤口时，所述重建的未剪切rhPDGF-BB随着该载体被患者身体吸收而随时间释放，从而提供rhPDGF-BB在伤口部位的延迟或延长递送并同时提供用于新细胞和组织向内生长的多孔载体。
121.根据权利要求85所述的方法，其中所述rhPDGF-BB包含通过大肠杆菌表达系统产生的rhPDGF-BB。
122.根据任一项权利要求所述的方法，其中所述伤口是慢性或急性伤口。
123.根据任一项权利要求所述的方法，其中所述伤口是糖尿病性足溃疡。
124.根据任一项权利要求所述的方法，其中所述伤口是静脉淤积性溃疡、压力性溃疡、烧伤或大手术伤口如腹壁成形术或手术组织瓣。
125.根据任一项权利要求所述的方法，其进一步包括采用感染控制的形式来治疗患者。
126.根据任一项权利要求所述的方法，其进一步包括采用负压伤口疗法的形式来治疗患者。
127.一种包含无菌rhPDGF-BB和无菌多孔生物相容性载体的治疗性组合物，其用于与伤口敷料联合在治疗期内以3天或更多天的治疗间隔多次施加，以治疗已经去除坏死或感染的组织的伤口，其中所述治疗性组合物用于提供当伤口愈合时用于细胞附着和血管向内生长的基底。
128.根据权利要求48所述的组合物，其用于在约2周至约20周的治疗期内以每3至42天一次的治疗间隔多次施加。
129.根据权利要求48所述的组合物，其针对初始治疗以至少约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量来使用。
130.一种包含无菌rhPDGF-BB的治疗性组合物，其与伤口敷料联合使用来治疗已经清创的伤口，其中所述组合物用于在约2周至约20周的治疗期内以大约每3至42天一次来多次施加，并且其中所述组合物针对初始治疗以至少约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量来使用。
131.根据权利要求51所述的组合物，其中所述治疗性组合物进一步包含无菌生物相容性载体。
132.根据权利要求52所述的组合物，其中所述治疗性组合物通过使含有所述rhPDGF-BB的溶液与所述载体组合而形成。
133.根据权利要求48或53所述的组合物，其中所述载体是多孔生物可吸收的伤口基质。
134.根据权利要求48或52所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB包括通过用无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液重建含有rhPDGF-BB的冻干无菌粉末而形成的无菌rhPDGF-BB溶液。
135.根据权利要求56所述的组合物，其中所述治疗性组合物通过以使得所述载体被所述rhPDGF-BB溶液浸湿的方式将所述无菌rhPDGF-BB溶液无菌添加至所述载体而形成。
136.根据权利要求48或51所述的组合物，其用于在治疗期内将rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约50mg的rhPDGF-BB施加于伤口。
137.根据权利要求48或51所述的组合物，其用于在治疗期内将rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约25mg的rhPDGF-BB施加于伤口。
138.根据权利要求48或51所述的组合物，其用于在治疗期内将rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约10mg的rhPDGF-BB施加于伤口。
139.根据权利要求48或51所述的组合物，其用于在治疗期内将rhPDGF-BB的累积总量为大于0mg但小于约5mg的rhPDGF-BB施加于伤口。
140.根据权利要求48或51所述的组合物，其中对于每个治疗间隔的时间长度基本相同。
141.根据权利要求48或51所述的组合物，其中对于一些治疗间隔的时间长度有所不同。
142.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述治疗间隔为每3至28天一次。
143.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述治疗间隔为每4至21天一次。
144.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述治疗间隔为每7至21天一次。
145.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述治疗间隔为每7至14天一次。
2
146.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约10μg rhPDGF/cm伤口表面积的剂量使用。
147.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约25μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
148.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约50μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
149.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
150.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约250μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
151.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以至少约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
152.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
153.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
154.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以约15μg rhPDGF/cm2伤口
2
表面积至约375μg rhPDGF/cm伤口表面积的剂量使用。
155.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以约30μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约190μg rhPDGF/cm2伤口表面积的剂量使用。
156.根据权利要求48或51所述的组合物，其对于每次治疗均以约30μg rhPDGF/cm2伤口
2
表面积至约300μg rhPDGF/cm伤口表面积的剂量使用。
157.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述敷料是半封闭或封闭敷料。
158.根据权利要求48或51所述的组合物，其中所述治疗性组合物进一步包含：
(3)包含约0.05mg/ml至约5mg/ml rhPDGF-BB的rhPDGF-BB溶液，并且所述rhPDGF-BB溶液通过组合以下各项而形成：
a)含有冻干rhPDGF-BB的无菌粉末，其中基于重量，至少约80％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB，并且其中所述粉末能够在约16℃至约32℃下储存并且仍然保持至少80％的所述rhPDGF-BB的生物活性至少一年，和
b)无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液，由此将所述冻干的未剪切rhPDGF-BB重建为溶液；
以及
(4)生物相容的、可再吸收的载体，
其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约4μl/cm3载体至约40ml/cm3载体，或者rhPDGF-BB与所述载体之比为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体，或者rhPDGF-BB与所述载体之比为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体。
159.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体是天然聚合物、合成聚合物或其组合。
160.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体是选自胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素、壳聚糖和纤连蛋白的天然聚合物。
161.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体是选自聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(DL-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(e-己内酯)(PCL)和聚氨酯的合成聚合物。
162.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体是胶原蛋白海绵。
163.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体提供孔径范围为约50μm至约1mm的多孔细胞支架。
164.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体提供平均孔径为约50微米至约500微米的多孔细胞支架。
165.根据权利要求85所述的组合物，其中所述载体提供平均孔径为约100微米至约300微米的多孔细胞支架。
166.根据权利要求90、91或92所述的组合物，其中大多数载体孔互相连接。
167.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.1mg/ml至约
1mg/ml的rhPDGF-BB。
168.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.2mg/ml至约
0.4mg/ml的rhPDGF-BB。
169.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.3mg/ml的rhPDGF-BB。
170.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约0.5mg/ml的rhPDGF-BB。
171.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液包含约1.0mg/ml的rhPDGF-BB。
172.根据权利要求85所述的组合物，其中基于重量，至少约85％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
173.根据权利要求85所述的组合物，其中基于重量，至少约90％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
174.根据权利要求85所述的组合物，其中基于重量，至少约95％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
175.根据权利要求85所述的组合物，其中基于重量，至少约97％的所述冻干rhPDGF-BB是冻干的未剪切rhPDGF-BB。
176.根据权利要求85所述的组合物，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB包含至少约90％的下述rhPDGF-BB，该rhPDGF-BB包含与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列。
177.根据权利要求85所述的组合物，其中所述治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB基本由至少约80％的下述rhPDGF-BB组成，该rhPDGF-BB基本由与SEQ ID NO.1具有至少约90％同源性的氨基酸序列组成。
178.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.1ml/cm3至约30ml/cm3。
179.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.2ml/cm3至约20ml/cm3。
180.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.1ml/cm3至约10ml/cm3。
181.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.25ml/cm3至约5ml/cm3。
182.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.25ml/cm3至约2.5ml/cm3。
183.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.1ml/cm3至约1ml/cm3。
184.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB溶液与所述载体之比为约
0.5ml/cm3至约1.5ml/cm3。
185.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约30μg PDGF/cm3至约9mg PDGF/cm3。
186.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约60μg PDGF/cm3至约6mg PDGF/cm3。
187.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3至约3mg PDGF/cm3。
188.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg
3 3
PDGF/cm至约1.5mg PDGF/cm。
189.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3至约750μg PDGF/cm3。
190.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约120μg
3 3
PDGF/cm至约600μg PDGF/cm。
191.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约150μg PDGF/cm3至约450μg PDGF/cm3。
192.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB与所述载体之比为约75μg PDGF/cm3载体至约225μg PDGF/cm3载体。
193.根据权利要求85所述的组合物，其中当所述rhPDGF-BB溶液与所述载体组合时，所述载体能够使至少约20％的所述重建的未剪切rhPDGF-BB截留在所述载体的孔内，使得当所述组合物施加于患者的伤口时，所述重建的未剪切rhPDGF-BB随着该载体被患者身体吸收而随时间释放，由此提供rhPDGF-BB在伤口部位的延迟递送并同时提供用于新细胞和组织向内生长的多孔载体。
194.根据权利要求85所述的组合物，其中所述rhPDGF-BB包含通过大肠杆菌表达系统产生的rhPDGF-BB。

说明书全文

用于治疗伤口的组合物

技术领域

[0002] 本发明涉及用于治疗伤口的组合物和方法，特别是用于治疗难以愈合的伤口如糖尿病患者中的下肢溃疡、静脉淤积性溃疡、压力性溃疡、严重烧伤和大手术伤口如腹壁成形术和其他类型的手术组织瓣的组合物和方法。

背景技术

[0003] 糖尿病为世界性的流行病。据报道，约3.7亿人患有糖尿病并且在每个国家中该数字都在增长。由糖尿病引起的最常见和严重的并发症之一是最常在足部表面的高压区域如在拇趾(大脚趾)下、跖趾关节、脚趾的顶部和端部、足部中间和侧面以及脚跟上发生的伤口愈合不良。足溃疡由造成足部此类压力点上感觉丧失的神经损伤而形成，该感觉丧失导致扩大的微创伤、覆盖组织的破裂以及最终的溃疡。此外，该感觉丧失可使得微小的擦伤或切口得不到适当的处理，并且最终导致溃疡的形成。很大比例的糖尿病患者将在其一生中发生足溃疡。一旦形成糖尿病性足溃疡(DFU)，则治疗可为困难的，特别是考虑到由于存在神经病、血管疾病、改变的嗜中性粒细胞功能、减少的组织灌注和/或有缺陷的蛋白质合成而导致的受损的愈合环境，所有这些通常伴随着糖尿病。

[0004] 亟需针对这些慢性溃疡形成的更好的治疗方式。DFU是截肢的主要原因。这些伤口维持的时间越长，它们的大小和深度增加以及感染的机会就越大。结果，这些并发症仅在美国就每年导致80,000例截肢。该慢性病理还严重地损害了患者的整体健康，导致了这些患者的健康进一步急剧恶化和医疗保健系统的额外费用；其治疗使受影响的糖尿病患者的医护费用翻倍。

[0005] DFU管理的主要目标是伤口闭合。在目前的医护标准下，DFU伤口医护集中于彻底和反复的清创，频繁的检查和细菌控制，减除伤口上的任何压力，以及小心控制水分平衡以防止浸软。然而，通过该方法尚未持续地实现有效的DFU愈合，并且结果可严重依赖于患者的依从性。因此，已开发辅助治疗来应对DFU。糖尿病性足溃疡管理的共识报告建议，对于在良好的标准伤口医护后4周时显示小于50％愈合的溃疡，应当考虑采用先进治疗以便加速伤口愈合和减少并发症。此类先进治疗包括负压伤口疗法、生物敷料、生物工程皮肤等同物、高压氧疗法、富含血小板的血浆和生长因子。

[0006] 然而，这些先进的伤口医护产品中只有少数已被证明在前瞻性随机化注册试验中加快DFU愈合，并且其结果中的一些甚至已受到其他研究的质疑。在前瞻性随机化注册试验中已研究的产品包括贝卡普勒明( Smith and Nephew)，一种含有重组人血小板衍生生长因子B链同源二聚体(rhPDGF-BB)的局部用凝胶，BioChaperone PDGF-BB
(Adocia,Lyon,France)，一种包含与PDGF复合的分子的局部用喷雾剂，两种活的皮肤等同物：双层皮肤替代物( Organogenesis,Inc.,Canton,MA)和人成纤维细胞衍生
的真皮替代物( Shire,Pic,Dublin,Ireland)，以及真空辅助的伤口闭合(
KCI,San Antonio,TX)。具有较少的严格试验数据的其他治疗方式包括胶原蛋
白、富含血小板的血浆、银产品、高压氧和电刺激。

[0007] 虽然从针对某些先进的伤口医护产品的前瞻性随机化注册试验得到一些有利结果，但它们的总体益处是令人失望的，如持续的高截肢率所证实的。在所发表的对评估糖尿病性足溃疡先进疗法的35个随机化带对照试验的荟萃分析中报道了以下结果：·与良好的标准伤口医护相比，富含血小板的血浆未改善糖尿病性溃疡愈合。
·在来自三项研究的合并结果中，生物皮肤等同物与标准医护相比显
示出非显著性的改善，其中Dermagraft更有利于溃疡愈合(35％相对于24％)。
·据报道，生物皮肤等同物双层比良好的标准伤口医护更好地改善愈合
(55％相对于34％，p＝.001；2项研究)。
·5， rhPDGF-BB显示与安慰剂或良好的标准伤口医护相比，愈合的溃疡的
百分比改善(58％相对于37％，p＝0.04；7项研究)。
· 负压伤口疗法比良好的标准伤口医护更加改善愈合(43％相对于29％，p<
0.05；1项研究)。
·对于所有研究，与溃疡愈合时间延长有关的证据均较少或不足。
此外，在四项研究中报告，对于Regranex，完全伤口闭合的发生率为50％或更低(48％、
50％、44％和36％)。

[0008] 此类先进疗法未导致治疗DFU的一致有效的解决方案。考虑到它们喜忧参半的临床结果以及与标准疗法相比更高的产品费用，这些先进疗法均未被广泛用作治疗DFU的新医护标准。

[0009] 如上所述，一种这样的先进疗法为Regranex凝胶(贝卡普勒明(becaplerman))，其由羧甲基纤维素钠凝胶中的浓度为100μg/g的rhPDGF-BB组成。具体地，将Regranex配制为多用途、非无菌、低生物负荷、防腐的羧甲基纤维素钠(CMC)基局部用凝胶，并且指示用于每日施加以在数月内改善慢性DFU的愈合。Regranex 包装插页(标签)声明，它应当在20周时间内每日施加最多140次日常施加，并且如果医生认为适于采用等于约0.006mg/cm2(6.25μg)伤口表面积的剂量，则施用更长时间。

[0010] Regranex仍然是用于伤口愈合的最先进的生长因子疗法，这得到以下事实的证明：虽然它在15年以前就被FDA批准，但它是由FDA批准用于治疗慢性伤口的唯一重组生长因子产品。此外，自FDA批准以来，尚无人成功地研发出另一种Regranex(即rhPDGF-BB)制剂。虽然临床和非临床数据支持其临床应用，但我们认为Regranex具有许多局限性，其包括：1)需要由患者每日施加于DFU，这要求患者每日更换伤口敷料；2)FDA批准的使用说明书中规定的剂量低，约0.006mg(6μg)/cm2伤口表面积；3)由于患者目测并从管(类似于牙膏管)中将凝胶施加于往往位于足底的伤口所经历的困难，导致经常不精确的给药；4)需要使产品保持冷藏(约2-8℃)；5)Regranex凝胶不具备无菌性；6)患者需要延长使用——长达且可能超过约五个月时间，140次每日施加，以及7)采用基于羧甲基纤维素(CMC)的局部用凝胶，其缺乏为细胞向内生长提供生物基质的能力。

[0011] 此外，Regranex作为DFU的有效治疗方法仅被医学界有限地认可。欧洲药品管理局(EMA)对来自四个Regranex功效临床试验的数据进行审核后，EMA得出以下结论：30μg PDGF/g制剂的效力比100μg PDGF/g低，并且100μg PDGF/g制剂与300μg PDGF/g制剂之间的差异很小。EMA进一步得出以下结论：100μg PDGF/g产品制剂仅具有“有限”功效。

[0012] 或许由于Regranex的“有限”功效，Regranex中的有效成分(即，rhPDGF-BB)在治疗伤口中的有效性已受到质疑。Park SA,Raghunathan VK,Shah NM,Teixeira L,Motta MJ等人(2014)PDGF-BB Does Not Accelerate Healing in Diabetic Mice with Splinted Skin Wounds,PLoS ONE 9(8):e104447.doi:10.1371/journal.pone.0104447报道了来自利用在db/db小鼠(2型糖尿病小鼠模型)中的受控全厚度夹板固定的切割伤口模型的研究的结果。在db/db小鼠中引入两个夹板固定的8mm背部全厚度伤口，并用30μl的5％PEG-PBS媒介物中的3μg PDGF-BB或等体积的媒介物每日局部处理一次，持续10天。该研究得出以下结论：即使在体外有生物活性，PDGF-BB也无法在采用夹板固定的伤口模型的db/db小鼠体内加快伤口愈合。

[0013] 虽然本领域专家质疑Regranex的活性成分rhPDGF-BB的有效性，但申请人认为Regranex的可疑功效存在许多原因。首先，Regranex通过凝胶载体递送至伤口部位。该制剂允许rhPDGF在数分钟至数小时内从该部位清除。其次，虽然凝胶载体是生物相容的，但我们认为它未提供用于细胞和血管向内生长的基底，并且事实上对伤口中的细胞生长和迁移可能是抑制性的，从而潜在地减缓愈合过程并导致愈合欠佳。第三，Regranex是非无菌的，仅当在2-8摄氏度(冷藏)下储存时稳定，并且必须每日施加于往往难以到达的解剖部位，这均导致患者依从性差；第四，虽然临床数据显示100μg/g制剂与300μg/g制剂之间没有差异，但申请人认为Regranex中的生长因子对于最佳的细胞募集和增殖来说浓度过低。每平方厘米伤口表面积的Regranex剂量仅为6μg，并且申请人认为该剂量对于最佳的细胞募集和增殖来说过低。第五且最后，尽管其在过去的15年间商业应用于患者，但本申请人认为Regranex中包含的生长因子不是完全有效的。在Regranex中使用的rhPDGF在酵母表达系统中重组产生。当在酵母中表达时，该蛋白质作为完全折叠的同源二聚体蛋白质被排出，其由通过两个链间二硫键保持在一起的两条反平行的B链组成。然而，在发酵过程中，可能发生内部蛋白水解(在残基Arg32与Thr33之间剪切(clipping))和C-末端截短(Arg32和Thr109)。内部蛋白水解产生三种可能的rhPDGF-BB形式：完整的(两条B链均是完整的)、单链剪切的(一条B链被剪切)和双链剪切的(两条B链均被剪切)。剪切还产生了用于进一步C-末端截短的新的C-末端位点，并且导致非常复杂的同种型混合物。申请人认为Regranex中包含的rhPDGF-BB的非完整同种型在治疗DFU方面远不如完全完整的同种型有效。

[0014] rhPDGF-BB还用于矫形外科和牙周适应征，其中愈合环境和愈合过程与真皮伤口迥然不同。两种这样的产品包括Augment Bone Graft和GEM21S，这两者均包含作为活性成分的rhPDGF-BB。GEM21S由rhPDGF-BB溶液和合成的微粒骨替代物组成，在2005年获得FDA批准且其适应征为改善慢性牙周缺损中的骨愈合。Augment Bone Graft也由rhPDGF-BB溶液和合成的微粒骨替代物组成。Augment在美国和加拿大的434例患者关键临床试验基础上被FDA批准用于在手术过程中单次植入骨缺损中后改善足部骨融合和踝融合。然而，这些产品均未将真皮伤口，如DFU的伤口列为适应征，并且两种产品均旨在通过单次手术内施加而使用该产品促进骨生长和融合——与皮肤伤口愈合迥然不同的细胞和生理过程。与Regranex一样，GEM21S和Augment Bone Graft产品必须冷藏(约2-8℃)储存，这有损于使用者的便利性和依从性。

[0015] 总之，导致高截肢率的不良患者结果以及互相矛盾的科学分析表明，仍然需要更可预测的、患者/使用者友好的且持续有效的用于促进真皮伤口愈合(包括治疗DFU和其他类型的难以愈合的伤口)的方法和治疗性组合物。

发明内容

[0016] 本发明的公开内容中提供的发明实施方案仅意为说明性的，并且意在提供本文公开的所选实施方案的概述。说明性且选择性的本发明的公开内容不限制任何权利要求的范围，不提供本文所公开或涵盖的发明实施方案的完整范围，并且不应被解释为限制或约束本公开内容或任何要求保护的发明实施方案的范围。

[0017] 本发明提供用于治疗或促进伤口愈合的方法和组合物，该伤口例如是糖尿病患者中的下肢溃疡、静脉淤积性溃疡、压力性溃疡、严重烧伤、外伤性损伤和大手术伤口如腹壁成形术和其他类型的手术组织瓣。在一些实施方案中，该伤口可延伸到皮下组织中或更深，或该伤口可以是糖尿病性足溃疡。

[0018] 本文提供了rhPDGF-BB的改进制剂，其同时包含以下改进和益处的组合：1)在延长的时间段内促进维持伤口部位处有效的PDGF剂量的载体；2)提供用于细胞附着和血管向内生长的基底的载体；3)无菌并因此更安全；4)不必冷藏，并因此患者更安全且更容易地处理；5)施加频率低于当前疗法，优选大约每隔一周一次，这有利于更好的患者依从性并且易于使用；6)具有以高于现有制剂的浓度存在的rhPDGF；以及7)与某些现有制剂相比含有更纯且更有效的具有更少同种型的rhPDGF-BB制剂。在本发明的某些实施方案中，所有以上改进和益处均同时实现。

[0019] 本文提供了治疗伤口的方法，其包括将治疗性组合物施加于伤口表面，监视伤口的愈合，以及如果认为必要，则定期地将该治疗性组合物重新施加于伤口表面以实现愈合。在一些实施方案中，该方法进一步包括在施加该治疗性组合物之前为伤口清创以去除坏死或感染的组织，以及在施加该治疗性组合物之后用敷料覆盖伤口。在某些实施方案中，半封闭或封闭敷料以及所述敷料可定期更换，如随着每次再施加该治疗性组合物而更换敷料。
本发明的方法还可以包括在更换敷料时用盐水或合适的抗菌伤口清洁剂和/或清创化学剂清洁伤口的步骤。本文提供的方法还可以包括采用感染控制或负压伤口疗法的形式来治疗患者。

[0020] 在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使无菌PDGF与无菌生物相容性基质组合来形成治疗性组合物。该无菌PDGF可以是预先配制的无菌PDGF溶液，或它可以作为治疗过程的一部分通过用无菌水或缓冲溶液重建含PDGF的冻干无菌粉末而形成。在一些实施方案中，该生物相容性基质是无菌的多孔基质并且可选自天然聚合物，如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素或纤连蛋白。或者，该生物相容性基质是无菌的多孔基质，其选自合成聚合物，如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(DL-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(e-己内酯)(PCL)、聚氨酯或其他。在一些实施方案中，该生物相容性基质是胶原蛋白海绵或天然和合成聚合物的混合物。

[0021] 在一些实施方案中，通过首先将基质如胶原蛋白海绵施加于伤口表面并随后将PDGF溶液施加于该胶原蛋白海绵，或者通过首先将PDGF溶液施加于伤口表面并随后将基质如胶原蛋白海绵施加于伤口表面，从而在该伤口表面直接形成治疗性组合物。在一些实施方案中，首先通过用无菌水或缓冲溶液重建含PDGF的冻干无菌粉末形成无菌PDGF溶液，并随后将该无菌PDGF溶液无菌地添加至无菌的多孔生物相容性基质如胶原蛋白海绵中以使得基质被该PDGF溶液浸湿，来形成治疗性组合物。

[0022] 根据本发明的另一方面，本文提供了治疗真皮伤口的方法，其包括：为伤口清创；大约每3至42天一次将含有重组血小板衍生生长因子BB(rhPDGF-BB)的治疗性组合物施加于伤口，持续约2周至约20周的治疗期，并且其中所述第一剂量包含至少约10μg的rhPDGF/cm2伤口表面积；以及在每次施加该治疗性组合物之后用敷料覆盖伤口。在一些实施方案中，该方法可进一步包括建议所述患者避免当伤口愈合时在伤口上施加压力。在一些实施方案中，在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量小于约25mg，或约10mg，或约5mg，或约4mg，或约3mg，或约2mg，或约1mg的rhPDGF-BB。在一些实施方案中，该方法包括每7至28天一次，或每7至21天一次，或每10至15天一次或每12至14天一次，将治疗性组合物施加于伤口。在一些实施方案中，每次治疗包括施加至少约10μg的rhPDGF/cm2伤口表面积，或约10
2 2
μg的rhPDGF/cm伤口表面积至约5,000μg的rhPDGF/cm伤口表面积。

[0023] 本发明还提供了一种治疗性组合物，其包含无菌PDGF和可为无菌和/或多孔的生物相容性基质。在一些实施方案中，该无菌PDGF包括预先配制的无菌PDGF溶液，并且在其他的实施方案中，该无菌PDGF包括用无菌水或缓冲溶液重建的含有PDGF的冻干无菌粉末。

[0024] 在某些实施方案中，包含在本发明的治疗性组合物中的无菌PDGF包括含有约0.05mg/ml至约5mg/ml rhPDGF-BB的rhPDGF-BB溶液。该rhPDGF-BB溶液可通过使含有冻干rhPDGF-BB的无菌粉末与无菌水或盐水进行组合，从而将冻干rhPDGF-BB重建为溶液来形成。在某些实施方案中，rhPDGF-BB可通过大肠杆菌(E.coli)表达系统来产生，其中基于重量，至少约80％的所述rhPDGF-BB是未剪切的rhPDGF-BB，随后可将其冻干。在某些实施方案中，冻干rhPDGF-BB能够在约20℃至约26℃下储存，并仍然保持至少80％的所述rhPDGF-BB的生物活性至少约六个月或至少约一年，或在约16℃至约32℃下储存，并仍然保持至少
80％的所述rhPDGF-BB的生物活性至少约六个月或至少约一年。

[0025] 在某些实施方案中，本发明的治疗性组合物中包含的基质可以选自胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素、壳聚糖(Chitan)或纤连蛋白。该基质可提供可再吸收的细胞支架，并且可包括胶原蛋白海绵。在某些实施方案中，该基质具有约10微米至约2,000微米的孔径分布，和/或约50微米至约500微米的平均孔径。在某些实施方案中，一部分孔互相连接或大多数孔互相连接。

[0026] 本文还提供了包含rhPDGF-BB溶液和载体如基质的治疗性组合物，其中rhPDGF-BB溶液与基质之比为约4μl/cm3至约40ml/cm3，或者rhPDGF-BB与基质之比为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体。本文公开的rhPDGF-BB溶液可包含约0.05mg/ml至约5mg/ml，或约0.1mg/ml至约1mg/ml或约0.2mg/ml至约0.4mg/ml的rhPDGF-BB。本文公开的rhPDGF-BB溶液可包含约0.3mg/ml或约0.5mg/ml或约1.0mg/ml的rhPDGF-BB。在某些实施方案中，基于重量，包含于PDGF溶液或治疗性组合物中的至少约80％或约85％或约90％或约
95％或约97％的rhPDGF-BB是未剪切的rhPDGF-BB。

[0027] 在某些方面，提供了一种包含rhPDGF-BB溶液和基质的治疗性组合物，其中至少约20％的rhPDGF-BB截留在基质的孔内，使得当所述组合物施加于患者的伤口上时，rhPDGF-BB随着基质被患者身体吸收而随时间释放。在某些实施方案中，该治疗性组合物提供了随着基质再吸收而在伤口部位持续递送rhPDGF-BB，并且同时提供了用于新细胞和组织向内生长的基质。

[0028] 除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本公开内容的方法和材料；还可以采用本领域已知的其他适宜的方法和材料。所述材料、方法和实例仅仅是说明性的而非旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其他参考文献均通过引用以其全文并入本文。如有冲突，则以包括定义在内的本说明书为准。附图说明

[0029] 图1图示了通过数显卡尺测量结果所计算的，在研究所包含的三组动物中的平均伤口面积随时间的变化。

[0030] 图2图示了利用ImageJ 软件计算的，在研究所包含的三组动物中的平均伤口面积随时间的变化。

[0031] 图3图示了在研究第0天对于每只测试动物利用ImageJ软件计算的伤口面积。

[0032] 图4图示了在研究第7天对于每只测试动物利用ImageJ软件计算的伤口面积。

[0033] 图5图示了在研究第14天对于每只测试动物利用ImageJ软件计算的伤口面积。

[0034] 图6图示了在研究第21天对于每只测试动物利用ImageJ软件计算的伤口面积。

[0035] 图7A图示了利用ImageJ软件，对于Regranex组1和rhPDGF/胶原蛋白组3的各个时间点的伤口愈合量(mm2)/累积剂量数。

[0036] 图7B图示了在治疗期内每组的伤口闭合平均百分比。

[0037] 图8包括一系列的伤口图像，其显示了在本发明测试组合物的研究中所包含的动物随时间的愈合程度。

[0038] 图9包括来自三只研究动物的第21天伤口部位的截面的一系列显微照片。

具体实施方式

[0039] 本发明提供了治疗真皮伤口如糖尿病性足溃疡(DFU)、静脉淤积性溃疡、压力性溃疡、烧伤、外伤性损伤和大手术伤口的新方法。本发明另外提供了用于治疗此类伤口的新型生物活性的治疗性组合物，制备可用于治疗伤口的生物活性敷料的新方法，以及改善患者依从性和伤口愈合的新型治疗方案。

[0040] 根据本发明的新方法和治疗性组合物将实现与现有产品相比在治疗真皮伤口方面等同或更佳的功效，并提供更好的安全性谱以及改善的患者依从性和便利性。本文提供的新型治疗性组合物提供：1)将来自每次施加的PDGF延长递送到伤口上，从而消除了患者对于更频繁施加的需要(例如，每日或每隔一天施加现有产品)；2)物理材料如胶原蛋白海绵，其可与Band-Aid一样每隔若干天一次施加在伤口上，从而改善患者依从性；3)室温下的稳定性，从而消除了将产品冷藏的需要；4)与现有产品相比安全性提高的无菌产品；5)与现有产品相比更高的PDGF初始剂量，其更好地启动愈合过程从而减少了对于延长患者使用的需要；6)使用改进的载体，该载体不仅维持PDGF的递送而且同时提供促进细胞、血管和新组织的向内生长的生物支架和/或开放的多孔基质，从而导致了与缺乏为细胞向内生长提供生物基质的能力的现有产品相比改善的愈合；以及7)含有与现有制剂相比具有更少同种型的更纯且更有效的rhPDGF-BB制剂。本文公开的新方法提供：1)与现有产品相比更高的PDGF初始剂量以更好地启动愈合过程，从而减少对于患者延长使用的需要；和2)治疗方案，其将通过减少治疗性组合物的定期施加的次数，也许与现有产品所要求的140次施加相比低至1至6次施加，来促进患者依从性和便利性改善。I.定义/命名

[0041] 如本文所用，除非另有说明，否则开放式术语如“含有”、“包括”、“包括”等意指包含。

[0042] 本文的一些实施方案涉及数值范围。当提供数值范围时，除非另有说明，否则该范围包括范围端点。除非另有说明，否则数值范围包括其中的所有值和子范围，如同这些值和子范围明确写出。

[0043] 本文的一些值被术语“约”修饰。在一些情况下，关于参考数值的术语“约”可以包括由该值加或减10％的值的范围。例如，量为“约10”可以包括9至11的量。在其他的实施方案中，关于参考数值的术语“约”可以包括由该值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。

[0044] 如本文所用，除非另有明确说明，冠词“一个”意指一个或多个。

[0045] 在本文描述的方法和步骤指示以某种顺序发生的某些事件的情况下，本领域普通技术人员将认识到某些步骤的排序可以改变，并且这样的改变符合本发明的变化。此外，某些步骤在可能时可以在并行过程中同时执行以及顺序地执行。

[0046] 缩写的含义如下：“C”意指摄氏或摄氏度，从其用法可知，“μL”或“uL”或“ul”意指微升，“mL”意指毫升，“L”意指升，“mm”意指毫米，“nm”意指纳米，“mM”意指毫摩尔浓度，“μM”或“uM”意指微摩尔浓度，“M”意指摩尔浓度，“mmol”意指毫摩尔，“μmol”或“uMol”意指微摩尔，“g”意指克，“μg”或“ug”意指微克，“ng”意指纳克，“％w/v”意指重量/体积百分比，“％v/v”意指体积/体积百分比，“HPLC”意指高效液相色谱法，“UPLC”意指超高效液相色谱法，而“GC”意指气相色谱法。

[0047] 术语“同源性”是指序列(核苷酸或氨基酸)的最佳比对，这可通过算法的计算机化执行来进行。例如，关于多核苷酸的“同源性”可通过利用BLASTN 2.0版采用默认参数进行分析来确定。关于多肽(即，氨基酸)的“同源性”可利用程序如BLASTP 2.2.2版采用默认参数来确定，该程序比对待比较的多肽或片段(并且还可以比对核苷酸片段)并确定它们之间的氨基酸同一性或相似性的程度。

[0048] 以上序列同源性的描述和方法旨在是示例性的，并且公认该概念在本领域中被很好地理解。另外，应当理解，核酸序列可以变化并且仍然提供功能酶，并且此类变化在本发明的范围内。术语“酶同源物”还可意指功能性变体。

[0049] 如本文所用，术语“载体”旨在广泛地指可充当PDGF的递送媒介物的任何生物相容性物质，而术语“基质”和“支架”可互换地使用，以指一种载体，该载体用作当伤口愈合时用于细胞附着和/或血管向内生长的基底，和/或提供将PDGF捕获在其结构内(例如，通过互相连接的孔)的工具，从而允许在伤口愈合时持续或延迟或延长递送PDGF。II.治疗伤口的新方法

[0050] 本发明提供了治疗伤口的新方法。在一个实施方案中，治疗伤口的方法包括提供包含并入生物相容性支架、基质或载体中的PDGF溶液的治疗性组合物，以及将该治疗性组合物施加于伤口。例如，包含并入生物相容性支架、基质或载体中的PDGF溶液的治疗性组合物可局部施加于伤口。在一些实施方案中，治疗伤口的方法包括在数周的时期内将治疗性组合物多次定期施加于伤口。

[0051] 根据本发明的一方面，用于治疗伤口的新型治疗方法包括以下步骤：(1)根据需要为伤口清创以去除坏死或感染的组织；
(2)形成包含无菌rhPDGF-BB和无菌多孔生物相容性载体的治疗性组合物；
(3)将含有PDGF的治疗性组合物施加于伤口表面，其中所述载体提供当伤口愈合时用
于细胞附着和血管向内生长的基底；
(4)用敷料覆盖伤口；以及
(5)在治疗期内监视伤口的愈合，并以3天或更多天的治疗间隔重复步骤(1)-(4)。
该新型治疗方法可进一步包括在将新型治疗性组合物施加于伤口表面之前制备该组
合物，其中该组合物包含PDGF和生物基质。制备该组合物的方法可包括：
(2a)用无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液重建冻干(冷冻干燥)的无菌PDGF粉末，以提供特定的安全且治疗浓度的PDGF；和
(1b)从小瓶(容器)中取出无菌PDGF溶液，并将其无菌地添加至干燥的亲水性无菌基质
或贴剂中以使得基质或贴剂被PDGF溶液浸湿。

[0052] 在一些实施方案中，所述敷料是封闭或半封闭敷料。在一些实施方案中，步骤(1)-(3)的重复还可以包括以下步骤：(A)去除敷料并在施加治疗性组合物敷料之前用盐水或适宜的抗菌伤口清洁剂清洁伤口，和(B)在施加治疗性组合物之后用新敷料覆盖伤口。在一些实施方案中，本文描述的新型生物活性的治疗性组合物可与治疗伤口的其他方面组合使用，这些方面包括例如感染控制、负压伤口疗法和/或指导患者避免在伤口部位施加压力。

[0053] 根据本发明的一方面，提供了用于定期再治疗伤口的时间表，即重复步骤(2)-(4)或将治疗性组合物定期重新施加于伤口。再治疗的实际次数和再治疗频率(即，治疗间隔)应根据若干因素来确定，所述因素包括伤口的严重程度(例如，伤口的等级、大小和深度)、自然伤口愈合环境受损的程度(例如，该部位的血管供给、患者的代谢状态、在该部位减除压力的能力、感染的存在、DFU的糖尿病阶段、对于烧伤而言的烧伤程度)、患者的年龄、伤口的持续时间以及其他共病如吸烟、肥胖、不受控制的血糖水平、患者依从性及其他。对于较严重的伤口或对于具有受损较严重的愈合环境的伤口应增加再治疗的次数和再治疗频率。此外，在治疗期内可根据伤口的愈合速度调整规定的治疗次数和/或治疗频率，即，对于愈合较慢的伤口增加再治疗的次数并且/或者提高再治疗频率，或对于愈合较快的伤口减少再治疗的次数并且/或者降低再治疗频率。

[0054] 根据本发明的一方面，再治疗频率为至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天或至少约15天，等等，直到至少约每六周一次，或其组合。根据本发明的另一方面，再治疗频率为每2至42天一次，或每3至42天一次，或每2至28天一次，或每3至28天一次，或每2至7天一次，或每3至7天一次，或每4至21天一次，每7至28天一次，或每7至21天一次，或每7至14天一次，或每10至15天一次，或每12至14天一次。根据本发明的另一方面，治疗频率为每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每12天、每14天、每15天、每21天、每28天、每30天、每35天、每42天一次，或其组合。

[0055] 根据本发明的另一方面，在治疗期内再治疗频率基本相同，并且再治疗频率为至少约每2天、至少约每3天、至少约每4天、至少约每5天、至少约每6天、至少约每7天、至少约每8天、至少约每9天、至少约每10天、至少约每11天、至少约每12天、至少约每13天、至少约每14天或至少约每15天一次，等等，直到至少约每六周一次。

[0056] 根据本发明的一方面，在治疗期内对伤口再治疗至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或至少5次。根据本发明的另一方面，在治疗期内对伤口再治疗0至6次、0至7次或0至8次。根据本发明的另一方面，在治疗期内对伤口治疗1至8次、或2至7次或3至6次。根据本发明的另一方面，在治疗期内对伤口再治疗1、2、3、4、5、6、7、8、10或20次。根据本发明的另一方面，对伤口再治疗0至46次，或1至46次，或0至20次，或1至20次，或0至27次，或1至27次。

[0057] 根据本发明的一方面，在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量优选为大于0mg，但小于约50mg，或小于约25mg，或小于约20mg，或小于约15mg，或小于约10mg，或小于约5mg，或小于约4mg，或小于约3mg，或小于约2mg，或小于约1mg的rhPDGF-BB。在某些实施方案中，在治疗期内施加于伤口的rhPDGF-BB的累积总量优选为约0.1mg至约50mg，或约0.5mg至约25mg，或约1mg至约10mg，或约2.5mg至约8mg，或约3mg至约7mg，或约4mg至约6mg。

[0058] 各种再治疗可涉及在施加于伤口的rhPDGF-BB的确切量(即，“绝对剂量”)方面，或在每平方厘米(cm2)伤口面积上施加的rhPDGF-BB的量(即，“面积剂量”)方面的相同或不同剂量的rhPDGF-BB。根据本发明的一方面，每次治疗施加绝对剂量为约10μg至约50mg，或约10μg至约25mg，或约10μg至约20mg，或约10μg至约15mg，或约10μg至约10mg，或约10μg至约
5mg的rhPDGF-BB，或约10μg至约1mg的rhPDGF-BB。根据本发明的另一方面，每次治疗施加约
10μg PDGF/cm2至约1.0mg PDGF/cm2，或约10μg PDGF/cm2至约0.5mg PDGF/cm2，或约10μg PDGF/cm2至约0.25mg PDGF/cm2，或约10μg PDGF/cm2至约0.1mg PDGF/cm2，或约10μg PDGF/cm2至约0.05mg PDGF/cm2的面积剂量。在某些实施方案中，采用rhPDGF-BB的每次治疗优选为约10μg至1000μg PDGF/cm2，或约0.01mg至约50mg PDGF/cm2，或约0.05mg至约25mg PDGF/cm2，或约0.1mg至约10mg PDGF/cm2，或约0.2mg至约2mg PDGF/cm2。在某些实施方案中，每次治疗施加至少约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或至少约25μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或至少约50μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或至少约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或至少约250μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或至少约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积的面积剂量。在某些实施方案中，每次治疗施加约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约500μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或约10μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约100μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或约15μg rhPDGF/cm2
2 2
伤口表面积至约375μg rhPDGF/cm伤口表面积，或约30μg rhPDGF/cm伤口表面积至约190μg rhPDGF/cm2伤口表面积，或约30μg rhPDGF/cm2伤口表面积至约300μg rhPDGF/cm2伤口表面积的面积剂量。

[0059] 根据本发明的一方面，采用本发明组合物的初始治疗可能是最重要的治疗。PDGF通过其对细胞增殖(有丝分裂发生)和定向细胞移动(趋化性)以及血管再生(生成新的血管)的影响来促进伤口愈合过程。许多细胞已被证明具有PDGF的受体(结合位点)，其包括结缔组织细胞(皮肤、骨、软骨、腱和韧带)、血管细胞和神经系统的细胞。具有PDGF受体的细胞通过向伤口部位(其中由于施加根据本发明的治疗性组合物，PDGF以升高的水平存在)迁移以及随后在结合PDGF之后增殖而应答。由于PDGF受体在激活之后很快降解，细胞增殖受到局部可用PDGF的存在以及细胞间相互作用的控制和限制，该细胞间相互作用导致细胞从伤口愈合的增生期行进到最终造成完全愈合的基质沉积期。因此，在初始治疗期间必须施加rhPDGF-BB的关键团注以确保患者的自然伤口愈合过程被适当地激活。因此，根据本发明，该初始治疗包括施加一种治疗性组合物，其含有至少10μg PDGF/cm2伤口表面积直至5000μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少20μg PDGF/cm2直至1000μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少302 2 2 2
μg PDGF/cm 直至600μg PDGF/cm伤口表面积，或至少40μg PDGF/cm直至400μg PDGF/cm伤口表面积，或至少50μg PDGF/cm2直至350μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少60μg PDGF/cm2直至300μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少200μg PDGF/cm2直至2000μg PDGF/cm2伤口表面积的面积剂量。根据本发明的另一方面，该初始治疗包括施加一种治疗性组合物，其含有至少
2 2 2
10μg PDGF/cm 伤口表面积，或至少20μg PDGF/cm伤口表面积，或至少25μg PDGF/cm 伤口表面积，或至少30μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少40μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少50μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少60μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少70μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少80μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少90μg PDGF/cm2伤口表面积，或至少100μg
2 2 2
PDGF/cm伤口表面积，或至少250μg PDGF/cm伤口表面积，或至少500μg PDGF/cm 伤口表面积的面积剂量。

[0060] 根据本发明的另一方面，每次治疗施加为约4μl PDGF溶液/cm3载体(其可为基质，如胶原蛋白海绵)至约40ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约30ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.2ml PDGF溶液/cm3载体至约20ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约10ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.25ml PDGF溶液/cm3载体至约5ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.25ml PDGF溶液/cm3载体至约2.5ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约1ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.5ml PDGF溶液/cm3载体至约
1.5ml PDGF溶液/cm3载体。在某些实施方案中，该PDGF溶液含有约0.3mg/ml的rhPDGF-BB。

[0061] 根据本发明的另一方面，每次治疗施加为约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体，或约30μg PDGF/cm3载体至约9mg PDGF/cm3载体，或约60μg PDGF/cm3载体至约6mg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约3mg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约1.5mg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约750μg PDGF/cm3载体，或约120μg PDGF/cm3载体至约600μg PDGF/cm3载体，或约150μg PDGF/cm3载体至约450μg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约225μg PDGF/cm3载体。

[0062] 根据本发明的一方面，初始PDGF治疗绝对剂量可大于后续再治疗剂量。初始PDGF治疗绝对剂量可以比每个后续再治疗PDGF剂量高约10％、约20％、约30％、约40％或约50％或直到约300％。

[0063] 根据本发明的一方面，所述方法包括在室温、通常16至32摄氏度下储存PDGF。在使用之前，它可以用无菌水、盐水、缓冲液或其他生理溶液重建以形成具有所需PDGF浓度的溶液。随后将该溶液添加至载体，优选为在所需体积中具有所需孔隙率以浸湿该基质的细胞基质(例如，胶原蛋白海绵)。随后将rhPDGF浸泡的基质施加至伤口表面。如果伤口是外部伤口，则随后用伤口敷料将其覆盖。随后可根据上述频率和持续时间参数重复该过程，直到伤口基本愈合。III.用于治疗伤口的新型治疗性组合物

[0064] 本发明还提供了用于治疗伤口的新型治疗性组合物，它包含并入生物相容性无菌载体、基质或支架中的无菌PDGF。例如，该治疗性组合物可局部施加于伤口以促进伤口愈合。

[0065] 根据本发明的一方面，提供了一种治疗性组合物，其包含rhPDGF-BB溶液和优选为生物相容性细胞支架的载体，其中将该rhPDGF-BB溶液置于或并入该细胞支架中。在一些实施方案中，该rhPDGF-BB溶液包含约0.05mg/ml至约5mg/ml的rhPDGF-BB，或约0.1mg/ml至约1mg/ml的rhPDGF-BB或约0.2mg/ml至约0.4mg/ml的rhPDGF-BB。根据本发明的一方面，该rhPDGF-BB溶液含有浓度为约0.05mg/ml，或约0.1mg/ml，或约0.2mg/ml，或约0.25mg/ml，或约0.3mg/ml，或约0.35mg/ml，或约0.4mg/ml，或约0.5mg/ml，或约0.6mg/ml，或约0.7mg/ml，或约0.8mg/ml，或约0.9mg/ml，或约1mg/ml，或约2mg/ml，或约3mg/ml，或约4mg/ml，或约
5mg/ml的rhPDGF-BB。

[0066] 在一些实施方案中，该rhPDGF-BB溶液是包含本文所述要素(例如，PDGF浓度、无菌溶液组成等)的预先配制的无菌PDGF溶液。在其他的实施方案中，该rhPDGF-BB溶液在使用时形成，优选通过将无菌溶液(例如，无菌水、盐水、缓冲溶液或生理溶液)与包含冻干rhPDGF-BB或基本由其组成的无菌粉末组合来形成。该无菌溶液用来重建该冻干rhPDGF-BB。该冻干rhPDGF-BB通过在无菌条件下将使用下文进一步描述的重组表达系统产生的液体rhPDGF-BB冻干而形成。

[0067] 在本发明的另一方面，rhPDGF可以并入优选为无菌、生物相容的、可吸收的细胞支架的载体中，并且随后将该PDGF饱和载体冻干以形成并入rhPDGF的无菌、干燥器具。只要其产生无菌粉末，用于冻干重组蛋白的任何已知技术可用来冻干rhPDGF-BB。所得的冻干rhPDGF-BB粉末能够在室温下储存，并仍然维持其生物活性的至少约80％至少约6个月，或至少约1年，或至少约2年，或至少约3年。无菌冻干的器具随后可直接施加于伤口部位或在放置在伤口之前被血液或其他无菌溶液浸湿。

[0068] 因为PDGF有粘附在容器如小瓶表面的趋势(特别是在较高pH下)，所以实现冻干PDGF在小瓶中的100％重建可能是具有挑战性的。因此，在某些实施方案中，在PDGF溶液中可包含添加剂以使其pH降至约7以下，或约6以下，或约5以下，或约4以下或约3以下。可促进冻干PDGF重建的添加剂包括盐、载体蛋白质如白蛋白，或低pH溶液如稀乙酸或盐酸。然而，如果PDGF溶液太酸，则它可能负面地影响生物相容性支架。因此，在某些实施方案中，冻干PDGF在pH低于约5的溶液中重建，并且一旦PDGF基本上完全重建，在它与生物相容性支架组合之前添加碱溶液以使PDGF溶液的pH升至约6至约8之间，或使之升至约7。当生物相容性支架是胶原蛋白海绵时，这样的pH调节步骤尤其有用。

[0069] 用来重建冻干rhPDGF-BB的缓冲溶液可包含但不限于水、盐水、碳酸盐、磷酸盐(例如磷酸盐缓冲盐水)、组氨酸、乙酸盐(例如乙酸钠)、酸性缓冲液如乙酸和HCl，以及有机缓冲液如赖氨酸、Tris缓冲液(例如三(羟甲基)氨基乙烷)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗琳基)丙磺酸(MOPS)。优选地，该缓冲溶液是无菌的。缓冲液可根据与PDGF的生物相容性以及缓冲液阻止不期望的蛋白质修饰的能力进行选择。缓冲液另外可根据与伤口组织的相容性进行选择。在一个实施方案中，使用乙酸钠缓冲液。可使用不同摩尔浓度下的缓冲液，例如，约0.1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约5mM至约40mM、约10mM至约30mM或约15mM至约25mM，或这些范围内的任何摩尔浓度。在一些实施方案中，使用摩尔浓度为约20mM的乙酸盐缓冲液。

[0070] 如上所述，将rhPDGF-BB溶液与载体组合以形成治疗性组合物。该载体可以是基质或支架，其用作当伤口愈合时用于细胞附着和/或血管向内生长的基底，并且/或者提供将PDGF捕获在其结构内(例如，通过互相连接的孔)的工具，从而允许当伤口愈合且基质或支架被身体再吸收时持续或延迟或延长递送PDGF。在一些实施方案中，该载体或基质是生物相容的、可再吸收的细胞支架。该载体或基质可以包含天然聚合物，如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、藻酸盐、纤维素、壳聚糖或纤连蛋白。该载体或基质还可包含合成的生物相容性聚合物，其选自合成聚合物如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(DL-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(e-己内酯)(PCL)、聚氨酯或其他。该载体或基质还可以是此类天然和合成聚合物的混合物。在一些实施方案中，该基质包含胶原蛋白或明胶海绵，该海绵可以是1型胶原蛋白海绵。胶原蛋白海绵使rhPDGF保持在伤口部位并同时提供用于细胞生长的支架，导致改善的使用者友好性和更快速且完全的愈合。在本发明的一方面，该载体或基质(其可以为胶原蛋白海绵)的孔隙率为约10微米至约2mm，或约50微米至约1000微米，或约100微米至约500微米。平均孔径可以为约50微米至约500微米，并且其中大多数孔互相连接。

[0071] 在一些实施方案中，载体或基质材料是生物可再吸收的。在一个实施方案中，载体或基质材料可以在其施加于伤口后的一个月内被再吸收至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、90％或100％。生物可再吸收性将依赖于：(1)材料的性质(即，其化学组成、物理结构和大小)；(2)在体内放置材料的位置；(3)使用的材料的量；(4)患者的代谢状态(糖尿病患者/非糖尿病患者、吸烟者、老年等)；以及(5)所治疗的伤口的程度和/或类型。

[0072] 在本发明的一方面，所述rhPDGF-BB溶液和载体应当以合适的比例组合，以便形成在愈合伤口方面具有最佳效力的治疗性组合物，在一些实施方案中，所述rhPDGF-BB溶液和载体以约4μl PDGF溶液/cm3载体(它可以是基质，如胶原蛋白海绵)至约40ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约30ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.2ml PDGF溶液/cm3载体至约20ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约10ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.25ml PDGF溶液/cm3载体至约5ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.25ml PDGF溶液/cm3载体至约2.5ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.1ml PDGF溶液/cm3载体至约1ml PDGF溶液/cm3载体，或约0.5ml PDGF溶液/cm3载体至约1.5ml PDGF溶液/cm3载体的比例进行组合。

[0073] 在一些实施方案中，所述rhPDGF-BB溶液和载体以约1.2μg PDGF/cm3载体至约12mg PDGF/cm3载体，或约30μg PDGF/cm3载体至约9mg PDGF/cm3载体，或约60μg PDGF/cm3载体至约6mg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约3mg PDGF/cm3载体，或约75μg
3 3 3 3
PDGF/cm 载体至约1.5mg PDGF/cm 载体，或约75μg PDGF/cm 载体至约750μg PDGF/cm 载体，或约120μg PDGF/cm3载体至约600μg PDGF/cm3载体，或约150μg PDGF/cm3载体至约450μg PDGF/cm3载体，或约75μg PDGF/cm3载体至约225μg PDGF/cm3载体的比例进行组合。

[0074] 在本发明的一方面，所述载体为支架且rhPDGF-BB/支架的比例使得当rhPDGF-BB溶液与支架组合时，该支架能够使至少约20％、30％、40％或50％直到至少约100％的rhPDGF-BB截留在该支架的孔内，使得rhPDGF-BB随着该支架被患者身体吸收而随时间释放，从而提供在延长的时间段内rhPDGF-BB在伤口部位的控制递送，并同时提供用于新细胞和组织向内生长的基质。在一些实施方案中，该支架能够使约20％至约100％，或约25％至约95％，或30％至约90％的rhPDGF-BB截留在该支架的孔内。上述PDGF截留的百分比也适用于重建的冻干PDGF-BB的截留。

[0075] 本发明的治疗性组合物中可以使用各种量的rhPDGF-BB。根据本发明的一方面，该治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB的总量少于50mg，或少于25mg，或少于10mg，或少于5mg，或少于2.5mg，或少于1mg。根据本发明的另一方面，该治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB的总量为约50mg，或约25mg，或约10mg，或约1.0mg，或约0.5mg，或约0.1mg。

[0076] 在本发明的实施方案中，PDGF的浓度可通过利用如通过引用并入本文的第6,221,625号、第5,747,273号和第5,290,708号美国专利中描述的酶联免疫测定，或本领域已知的用于测定PDGF浓度的任何其他测定来测定。在本发明的实施方案中，PDGF的浓度小于约
10mg/g，或小于约5mg/g，或小于约1mg/g，或小于约0.5mg/g，或小于约0.1mg/g，或小于约
0.05mg/ml。在本发明的另一方面，在本发明的实施方案中，PDGF的浓度为约0.05mg/g至约
5mg/g，或约0.1mg/g至约1mg/g，或约0.25mg/g至约0.5mg/g。

[0077] 在本发明的治疗性组合物中使用的PDGF-BB可来源于诸如天然来源、合成来源或重组来源的任何来源。根据本发明的一方面，PDGF通过重组DNA技术产生。当通过重组DNA技术产生PDGF时，将编码单个单体(例如，PDGF B链)的DNA序列插入用于表达B链单体的培养细胞中。随后从该细胞培养物中提取和分离该单体，并再折叠以形成生物活性同源二聚体(例如，PDGF-BB)，它可进一步处理以供另外的纯化。根据本发明的一方面，所培养的细胞为原核细胞或大肠杆菌细胞。通过这些重组技术产生的rhPDGF-BB可根据并入本文的PCT No.WO 2005/077973中概括的技术进行纯化。

[0078] 如上所述，现有技术重组DNA产生方法已产生了rhPDGF-BB片段的混合物。根据本发明的一方面，本文所述的治疗性组合物中包含的基本上所有的rhPDGF-BB均为完整的非剪切链。根据本发明的一方面，细菌表达系统为大肠杆菌表达系统，并且所得的蛋白质利用反相高效液相色谱法、凝胶过滤或离子交换色谱法或它们的一些组合进行纯化，其中纯化的蛋白质组合物中包含的所得rhPDGF-BB为基于重量至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约97％的未剪切的rhPDGF-BB。

[0079] 在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB为包含与SEQ ID NO.1具有至少约90％、约92％、约94％、约96％、约98％、约99％或约100％同源性的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成的rhPDGF-BB，SEQ ID NO.1提供如下：SEQ ID NO.1:

[0080] 根据本发明的另一方面，本发明的治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB包含基于重量至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约97％的未剪切的rhPDGF-BB或基本上由其组成。根据本发明的另一方面，本发明的治疗性组合物中包含的rhPDGF-BB则包含至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约97％的下述rhPDGF-BB或基本上由其组成，该rhPDGF-BB包含与SEQ ID NO.1具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成。

[0081] 在一些实施方案中，构成本发明的新型组合物的组分在试剂盒中提供。试剂盒可包含三个组件：a)无菌rhPDGF-BB冻干粉末的小瓶，
b)无菌水、缓冲液、盐水或生理溶液的小瓶，以及
c)载体。
该试剂盒将可以在室温下储存长达3年。在一些实施方案中，储存于16至32摄氏度下。
在一些实施方案中，该试剂盒中包含的粉末包含预定量的PDGF。在一些实施方案中，PDGF的量与本文提供的值一致。在一些实施方案中，该载体被包括在包含预定量的载体的泡罩包装中。在一些实施方案中，载体的量与本文提供的值一致，并且此类型的载体与本文所述的材料一致。

[0082] 使用时，该试剂盒中的rhPDGF-BB将用无菌水、盐水、缓冲液或生理溶液重建，并且该载体将被塑造为适合伤口的大小。在修剪载体以适应伤口之后，将其用rhPDGF溶液浸泡，使得该溶液完全充满该载体的内部孔。rhPDGF饱和的载体随后将施加于清创的伤口并用伤口敷料来覆盖。该过程根据上文所述的时间表重复进行。IV.治疗各种类型的伤口的方法

[0083] 本发明的方法和组合物可用于治疗各种伤口，包括糖尿病性溃疡、压力性溃疡、神经性溃疡、血管溃疡、烧伤、意外急性伤口和手术伤口。已有各种伤口分类系统并且其可用来鉴定本发明的方法和组合物在治疗上尤其对其有用的伤口。两种这样的溃疡分类系统包括Wagner分类系统(参见，Wagner(1987)Orthopedics 10:163-72)和德克萨斯大学分类系统(参见，Lavery(1996)J Foot Ankle Surg 35:528-31)。Wagner系统根据伤口的深度和感染的存在对伤口进行分级。它具有五个数字等级：1级：浅表糖尿病性溃疡
2级：溃疡扩大
累及韧带、腱、关节囊或筋膜
无脓肿或骨髓炎
3级：伴有脓肿或骨髓炎的深度溃疡
4级：部分前足的坏疽
5级：足部的大面积坏疽
德克萨斯大学分类根据伤口的深度具有四个数字等级。此外，存在与感染和缺血相关
的A到D四个字母等级。德克萨斯大学分类系统包括：
阶段
A期：无感染或缺血
B期：存在感染
C期：存在缺血
D期：存在感染和缺血
分级
0级：上皮形成的伤口
1级：浅表伤口
2级：穿透至腱或囊的伤口
3级：穿透至骨或关节的伤口
例如，数字等级为3且字母等级为D的伤口将会是穿透至骨或关节且感染和缺血性的伤
口。根据本发明的一方面，本发明的方法和组合物用来治疗在Wagner分类系统下为2级、3级或4级伤口，或在德克萨斯大学分类系统下为1级、2级或3级伤口(A期、B期、C期或D期)的伤口。

[0084] 在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用来治疗伤口，如下肢溃疡，且特别是糖尿病患者的足溃疡。本发明的方法和组合物在治疗未愈合的下肢糖尿病性溃疡中尤其有用，所述糖尿病性溃疡在以上发明背景中所述的当前医护标准下约4周的常规疗法之后约50％无法愈合。

[0085] 在一些实施方案中，本发明的组合物用来与1:1.5或1:1.3网格化分层厚皮移植物(网格化允许该移植物覆盖较宽的区域，但留下需要愈合的小开口)组合治疗烧伤、腹壁成形术(所谓的“整腹术”)、在其他类型的整形手术和成形手术之后的愈合，或截肢后的伤口。V.附加的治疗成分

[0086] 本发明的治疗性组合物可包含附加的治疗成分，以进一步促进伤口愈合。在一些实施方案中，包含PDGF的溶液可进一步包含附加的成分，如其他生物活性剂。在其他的实施方案中，包含PDGF的溶液可进一步包含细胞培养基，其他的稳定蛋白质如白蛋白，抗菌剂，蛋白酶抑制剂[例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、抑肽酶、ε-氨基己酸(EACA)等]和/或其他生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或其他PDGF，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和/或PDGF-DD的组合物。此外，除了PDGF以外还可并入本发明组合物中的生物活性剂可包括有机分子、无机材料、蛋白质、肽、核酸(例如，基因、基因片段、小插入核糖核酸[si-RNA]、基因调控序列、核转录因子以及反义分子)、核蛋白、多糖(例如，肝素)、糖蛋白和脂蛋白。序列号为11/159,533(公开号：20060084602)的美国专利申请中公开了可并入本发明组合物中的生物活性化合物的其他非限制性实例，包括例如抗癌剂、抗生素、镇痛药、抗炎剂、免疫抑制剂、酶抑制剂、抗组胺药、激素、肌肉松弛药、前列腺素、营养因子、生长因子和疫苗。

[0087] 用于递送附加的生物活性剂的标准方案和计划是本领域已知的。附加的生物活性剂可以以允许将合适剂量的该药剂递送至伤口部位的量引入到本发明的组合物中。在大多数情况下，利用从业者已知且适合于所讨论的特定药剂的指导准则来确定剂量。本发明组合物中包含的附加生物活性剂的量可取决于诸如病况的类型和程度、特定患者的总体健康状况、生物活性剂的配方、释放动力学以及生物相容性支架的生物可再吸收性这样的变量。标准临床试验可用来优化任何特定的附加生物活性剂的剂量和给药频率。
实施例
实施例1

[0088] 评估含有0.3mg/ml重组人血小板衍生生长因子-BB(rhPDGF-BB)的胶原蛋白伤口敷料在治疗由瘦蛋白受体突变引起糖尿病的小鼠(db/db)中手术诱导的全厚度伤口中的功效。A.研究设计

[0089] 从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)品系代码000642获得平均起始体重为41.46g的十五(15)只雄性C57/B6(Leprdb)db/db小鼠。在研究开始之前使动物适应环境。于此3天时间内，每天观察所述动物以便剔除状况表现不佳的动物。

[0090] 在该研究期间，将所有动物于相同条件下单独圈养在一次性笼子内。该研究在提供有HEPA过滤空气的动物房中在70°F+/-5°F的温度和50％+/-20％的相对湿度下进行。动物房被设置为保持最少每小时12至15次换气。动物房用自动定时器控制12小时开和12小时关(没有过渡光)的光/暗循环。使用垫草。最少每周更换一次垫草。用商业去污剂洗涤笼子、顶盖、瓶子等并使其风干。使用商业消毒剂对引入柜中的表面和材料进行消毒。每天清扫地板，并且每周最少用商业去污剂擦拭两次。每个月最少使用稀漂白剂溶液将壁和笼架用海绵擦拭一次。用具有鉴别该研究、剂量、动物编号和治疗组所需的适当信息的笼牌或标签标记所有笼子。在该研究期间记录温度和相对湿度，并保留记录。用无菌Purina
5053啮齿动物餐食来喂养动物，并提供无菌水自由饮用。

[0091] 在该研究开始时，将十五(15)只动物随机且前瞻性地分为三(3)组，每组各五(5)只动物：组1-如包装插页所规定的，每日施加Regranex凝胶0.01％rhPDGF-BB，持续21天。
组2-在第0天、第7天和第14天施加与缓冲液组合的胶原蛋白伤口敷料；以及
组3-在第0天、第7天和第14天施加含有0.3mg/ml重组人血小板衍生生长因子-BB
(rhPDGF-BB)的胶原蛋白伤口敷料。
每只动物通过对应于单独编号的耳标来辨别。在第0天，记录平均起始体重，以确保平均起始体重在各组之间是相当的。使用笼牌来辨别标有研究编号(LYN-01)、治疗组编号和动物编号的每个笼子或标签。

[0092] 在诱导伤口之后立即局部施用作为手术敷料的测试和对照胶原蛋白+/-PDGF制品(如下所述)，并且每七(Q7)天进行更换。根据如下概述的包含每日给药的产品插页中包含的产品使用说明(IFU)中所规定的，处理Regranex治疗的部位。利用TegadermTM来施加所有敷料且保持在适当位置，并用安息香固定在伤口区域外部的适当位置。在更换敷料时，用盐水冲洗伤口区域，并收集冲洗液且在-80℃下储存以供将来分析蛋白酶活性。对于用胶原蛋白伤口敷料处理的部位，将所有未粘附的胶原蛋白从愈合伤口处轻轻去除，用盐水冲洗该部位，并如上所述收集冲洗液。去除敷料并收集冲洗液之后，在重敷敷料/测试制品之前用卡尺测量伤口并拍照。所有伤口面积均以mm2为单位记录。

[0093] 为了拍照记载伤口愈合，将照相机安装在最佳位置处的三脚架上以确保所有照片是一致的。放置标尺使得它在图像中能捕捉到，以允许准确估算损伤大小。除了活体测量伤口面积之外，还采用Image J软件来分析所有的伤口照片，并在研究结束时描摹并量化伤口面积。

[0094] 在研究开始前测定血糖水平，并在第21天临处死前再次测定血糖水平以确认糖尿病状态。在研究结束时，将伤口部位收集在10％NBF中并准备用于组织病理学。研究设计总结在以下表1中。

[0095] 表1-研究设计B.测试制品和媒介物制品

[0096] 研究中所用的局部制剂为Regranex凝胶(羧甲基纤维素凝胶中的0.01％rhPDGF-BB)(组1)；用rhPDGF-BB浸湿的胶原蛋白伤口敷料(组3)；以及用盐水浸湿的胶原蛋白伤口TM敷料(组2)。所有敷料都用Tegaderm 覆盖并用安息香固定。
1.敷料组合物
a.组1rhPDGF剂量

[0097] 如Regranex包装插页中所述，“每平方厘米的溃疡表面积将需要从15克管中挤出约0.25cm长度的凝胶”。式：(1x w)÷4＝cm Regranex长度。对于1.5cmx1.5cm见方伤口：(1.5x1.5)÷4＝0.56cm Regranex长度。如Regranex包装插页中所述，“来自15g管的
Regranex凝胶的重量为0.25g/cm长度”。Regranex为0.01％rhPDGF-BB或100μg/g
Regranex。对于0.56cm长度的产品，对于14μg的PDGF-BB总剂量而言产品的重量为0.14g。对于用Regranex治疗21天的部位，对于该研究期间(假设从第0天起开放性伤口大小没有变化)的最大总剂量将为14μg/天x21天或294μg PDGF-BB。然而，在第7和14天，测定所有Regranex治疗的部位的开放性伤口大小，并利用上式((1x w)÷4＝cm Regranex长度)重新计算施加的Regranex的量。
b.组3rhPDGF和组2盐水剂量

[0098] 本研究中所用的rhPDGF-BB的浓度为0.3mg/ml或300μg/ml。为了不超过该研究期间的总剂量294μg PDGF-BB(与Regranex相同的最大研究总剂量)，在21天研究期内将总计0.98ml的0.3mg/ml PDGF-BB施加于伤口部位。假设总计3次施用(第0、7和14天)，每次施用将由胶原蛋白海绵上的约327μ1PDGF-BB组成，其代表每次施用约98μg PDGFBB的剂量(比Regranex治疗的部位的初始单独剂量的7倍稍大)。这表示每平方厘米的开放性伤口表面积
2
总计145μ1(327μ1/2.25cm开放性表面积)。

[0099] 利用下式确定在第7和14天施加于新胶原蛋白海绵的0.3mg/ml PDGF-BB(组3)或缓冲液/无菌盐水(组2)的体积：145xcm2开放性伤口表面积(开放性伤口的长度[cm]x宽度[cm])。c.胶原蛋白海绵

[0100] 如以上对于组1治疗的部位所述，在第7和14天评估和测量所有伤口，以记录每个单独部位的开放性伤口测量结果。对于用胶原蛋白海绵(组2和组3)治疗的部位，在去除敷料、轻轻冲洗该部位以及记录包括测量结果和摄影文件在内的发现结果之后，测量并修剪该海绵以适应原始伤口的开放性伤口部分。C.外科手术

[0101] 在第0天，用异氟醚将动物麻醉。剪掉背部的毛并用无菌溶液擦拭皮肤。使用模板标记动物的背中部上的1.5x1.5cm正方形，并且通过切除皮肤和肉膜造成对应于该模板的全厚度伤口。在手术期间将热水循环垫或等同物放在动物下面以维持正常的体温，并且动物在类似的热水循环垫上恢复。在从麻醉中恢复后立即且此后每12小时通过皮下注射给予丁丙诺啡(0.06mg/kg)，持续72小时。在小鼠恢复意识之后，通过皮下注射给予温热的Ringer溶液(0.5mL)。动物的创伤在无菌条件下进行。给伤口部位拍照，并在切除后立即用数显卡尺来测量长度和宽度，且在此后每天进行测量。从第0天至第21天，向小鼠施用表1中所列的测试制品。D.研究结果
1.动物存活

[0102] 在该研究期间有三只动物死亡或过早地被施以安乐死(所有动物均来自组1-Regranex)。第一只动物(动物编号3)在手术后一天被发现死亡。第二只动物(动物编号1)由于自残伤口部位后部的后胁而在第5天被处死。组1中的第5号动物由于体重相比其起始体重减轻超过20％而在第16天被处死。以下表2总结了动物死亡/处死：

[0103] 表2-动物死亡/处死的总结第1天第6天第16天
组1，动物编号3 组1，动物编号1 组1，动物编号5
发现死亡处死，自残超过20％的体重减轻
2.伤口测量

[0104] 利用数显卡尺来测量伤口面积并记录每个伤口的长度(L)和宽度(W)。利用下式计算伤口面积以计算正方形的面积，其中A＝LxW。图1显示在第0天、第7天、第14天和第21天每组的伤口面积。在第0天记录全部三组的伤口面积峰值，随后在第7天、第14天和第21天平均伤口面积减小。在该研究过程中所有治疗组均显示伤口面积大大减小。

[0105] 为了提供额外测量和考虑在正方形中可能没有愈合的伤口(因此没有在以上所用的公式中获得)，还通过使用ImageJ SoftwareTM描摹伤口边缘的内部来测量伤口的内部。图2表示对于每个治疗组使用该方法所得到的每只动物的伤口面积。图3-图6以散点图的方式显示到评估日(第0天、第7天、第14天和第21天)所有治疗组的平均伤口面积，以提供在那些天记录的单独测量结果的更详细的评估。对于在该研究期间死亡的动物，最后一个数据点在图3-图6中延续。图7A强调了本发明的关键方面，即用更少施用治疗性组合物获得积极结果。图7A显示对于组1和组3，在四个时间点(第0天、第7天、第14天和第21天)中的每一个时
2
间点处的伤口面积减少量(mm)/累积治疗次数。图7B显示对于每组在该研究的过程中伤口闭合的平均百分比。对于死亡的动物，延续最后一个数据点。
3.临床评估

[0106] 还针对在上皮再形成和肉芽组织形成方面愈合程度的可能差异而在临床上评估伤口图像。对于第0天(图8A)、第7天(图8B)、第14天(图8C)和第21天(图8D)，图8显示了在每个时间点来自每只动物的伤口的代表性图像。来自每次治疗的原始图像显示，与组2(用缓冲液处理的胶原蛋白海绵对照组)相比，组3(rhPDGF/胶原蛋白海绵组)导致了肉芽组织的形成和上皮再形成的明显加快。此外，每日用Regranex治疗的伤口(组1)也显示了与组2(缓冲液对照+胶原蛋白)相比更好的伤口闭合率。还进行了对福尔马林固定的伤口区域样品的组织病理学分析，并进一步证实了与缓冲液对照处理的海绵相比，由rhPDGF/胶原蛋白治疗以及Regranex治疗的伤口引起的伤口愈合加快。病理学还表明，rhPDGF/胶原蛋白治疗的伤口中的上皮再形成甚至比用Regranex治疗进一步改善。

[0107] 组织病理学样品的代表性样品在图9中提供，其包括在第21天来自三只研究动物的伤口部位的截面的一系列显微照片，包括组1-动物2(图9E和图9F)，组2-动物2(图9A和图9B)和组3-动物1(图9C和图9D)。对于各组显微照片，显示了2x放大倍数(图9A、图9C和图9E)和10x放大倍数(图9B、图9D和图9F)。

[0108] 关于组1，但图9E和图9F显示伤口在第21天100％表面重建，虽然可见真皮-表皮结构的脆性所致的一些剪切。图9E中的箭头60指示左侧相邻表皮的大概位置以及右侧的伤口床。图9F提供了来自伤口中部的更高放大倍数的图像。100％表皮表面重建是明显的，并且表皮中分化分层的存在表明其成熟。新皮仍然含有高密度毛细血管，并且新胶原蛋白形成正在进行中。

[0109] 关于组2，显微照片说明部分胶原蛋白海绵在伤口床中存留了21天。在该伤口边缘中，该海绵显示阻碍了上皮的表面重建。图9A中的箭头10指示伤口边缘。如图9A所示，在胶原蛋白海绵下面形成一些肉芽组织。参考图9B，箭头20和箭头30分别指示胶原蛋白海绵和肉芽组织。如图所示，尽管细胞渗透程度最低，但胶原蛋白海绵在该区域中呈现粘附。典型的肉芽组织显示在海绵下面形成。

[0110] 关于组3，图9C和图9D示出伤口为100％表皮表面重建。图9C中的箭头40指示伤口床的大致边缘，并且区域50是皮下脂肪。图9D是在伤口中部内拍摄的，并且显示原始胶原蛋白海绵的所有迹象消失。伤口100％表面重建并且分层良好，其中角质层表明成熟。新皮显示新胶原蛋白产生的迹象，并且细胞结构减少，表明真皮组织正在成熟且肉芽组织的未成熟特征正在消退。E.研究结论

[0111] 由该研究得出以下结论：(1)在组1中给予Regranex的21次施加，而在组2和组3中仅分别施加了缓冲液/胶原蛋
白或rhPDGF/胶原蛋白伤口敷料的3次施加。
(2)在该研究的活体部分期间来自组1(Regranex)的三只动物或者被发现死亡或者不
得不施以安乐死。
(3)如通过卡尺测量和采用Image J软件分析的伤口描摹二者确定的，在第0到21天中
所有治疗组均显示伤口面积的减小。处死时(第21天)，2/5的Regranex治疗的伤口、3/5的rhPDGF/胶原蛋白治疗的伤口以及0/5的胶原蛋白敷料治疗的伤口愈合。
(4)来自每次治疗的原始图像显示，与用缓冲液处理的胶原蛋白伤口敷料对照组(组2)
相比，组3(rhPDGF/胶原蛋白)导致了肉芽组织的形成和上皮再形成的明显加快。此外，每日用Regranex(组1)治疗的伤口也显示了与对照胶原蛋白海绵治疗的动物相比更好的闭合率。
(5)与21次施加Regranex(组1)或三次施加盐水浸湿的胶原蛋白伤口敷料相比，根据伤
口上皮再形成评估，愈合在施加三次rhPDGF/胶原蛋白(组3)治疗的伤口中是最好的。
(6)与胶原蛋白伤口敷料(组2)相比，每周三(3)次施加rhPDGF/胶原蛋白(组3)加快伤
口闭合，包括肉芽组织形成和上皮再形成，并且其表现出至少与Regranex凝胶(组1)的21次每日剂量一样有效。
(7)rhPDGF/胶原蛋白是安全且有效的，与市售的胶原蛋白伤口敷料相比促进了糖尿病
性伤口更好的愈合。如根据完全的上皮再形成所证明的，与0/5的胶原蛋白伤口敷料治疗的动物的伤口完全愈合相比，3/5的rhPDGF/胶原蛋白治疗的伤口完全愈合。
(8)如组织学所证实的，与市售的胶原蛋白伤口敷料相比，rhPDGF/胶原蛋白是安全且
有效的，促进了血管发生、肉芽组织形成和上皮再形成。
(9)如组织学所证实的，rhPDGF/胶原蛋白——一种无菌产品，是高度生物相容性的。
(10)rhPDGF/胶原蛋白比Regranex凝胶更易于施加，它将改善患者依从性。
(11)rhPDGF/胶原蛋白可能比Regranex更安全，因为接受Regranex的动物具有高死亡
率，而采用rhPDGF/胶原蛋白或胶原蛋白伤口敷料则未观察到这样的死亡率。
实施例2-预示性的

[0112] 进行研究以证明新型治疗性组合物以及本文所述的伤口治疗方法的功效。实施例1概括的相同的研究设计还用于本研究，其包括具有五个测试组的db/db小鼠模型——标准医护组(盐水湿润的纱布)、Regranex组、胶原蛋白海绵组以及利用根据本发明包含PDGF-BB和胶原蛋白海绵的治疗组合物的两组。然而，如下详细描述的，给药频率在本研究中改变。
本研究还被设计为使得在Regranex组和胶原蛋白海绵/PDGF-BB组中在研究过程中递送的PDGF的总剂量相同。
A.实验设计

[0113] 通过实施例1中描述的研究结果改进实验设计，然而，预期每组的动物数目更多(即八只)并且该研究的持续时间更长，即28天。此外，测试和对照胶原蛋白+/-PDGF制品作为伤口敷料在诱导伤口之后立即以及在约第14天予以局部施用，总计两次施加(组5)，或在手术后立即以及在第7天、第14天和第21天，总计四次施加根据本文所述新型组合物和治疗方法的测试制品(参见表X)。阴性对照(盐水湿润的纱布)和Regranex治疗的部位将根据规定的使用说明以伤口敷料的方式经历28次每日局部施用。

[0114] 在该实施例中，在研究开始之前测定血糖水平并在第28天临处死前再次测定血糖水平以确认糖尿病状态。在所有其他方面，本研究的设计与实施例1中所述相同。本研究的细节概括在以下表3中。

[0115] 表3.实施例2研究设计*伤口评估和尸检；#仅伤口评估。

[0116] 在研究期间的每一天，检查每只动物并记录其存活，以评估治疗组之间动物反应的可能的视觉差异。将测定伤口闭合率，也将测定任何给定时间点完全愈合的伤口的百分比。B.PDGF-BB 剂量计算

[0117] 本研究中所用的PDGF剂量被设计为模拟根据本发明的实际治疗剂量(组4和组5)或根据Regranex标签规定的实际治疗剂量(组2)。组2的剂量以与实施例1中Regranex组相同的方式来确定。对于用Regranex治疗28天的部位，本研究期间施用的PDGF的总剂量为14μg/天x28天或392μg PDGF-BB。该剂量还可以表示为PDGF的量/原始伤口大小的面积(“面积剂量”)，6.22μg/cm2/天或174μg/cm2的PDGF-BB。

[0118] 对于组4和组5，使用PDGF浓度为0.3mg/ml或300μg/ml的PDGF溶液。为了达到该研究期间的总剂量392μg PDGF-BB(与Regranex组相同的总研究剂量)，在28天研究期间内将总计1.307ml PDGF溶液施加于伤口部位。对于每7天接受一次敷料更换的部位，存在总计4次施用(第0天、第7天、第14天和第21天)。每次施用由胶原蛋白海绵上的327μ1PDGF-BB(或仅缓冲液)组成。关于PDGF的剂量，每次施用由0.3μg/μlx326μ1或98ug PDGF-BB(约7x Regranex单独剂量)组成。对于仅接受两次剂量的部位，在第0天和第14天存在总计2次施用。每次施用由胶原蛋白海绵上的654μ1PDGF-BB组成。每次施用将由0.3μg/μ1x654μ1或196ug PDGF-BB(约14x Regranex单独剂量)组成。这些剂量还可以表示为PDGF的量/原始伤
2 2
口大小的面积(“面积剂量”)。关于组4，PDGF剂量为43.5μg/cm/剂或174μg/cm的PDGF-BB。
关于组5，PDGF剂量为约87μg/cm2/剂或174μg/cm2的PDGF，即在所有组中具有相同的累积剂量，但组4和组5具有许多较低的剂量。
实施例3-预示性的

[0119] 进行随机临床试验以评估rhPDGF-BB和胶原蛋白的多种组合物与标准医护(由去除过量伤口渗出液的潮湿伤口愈合、对坏死组织清创、解除压力、盐水湿润的纱布、抗生素(如果需要)以及伤口敷料组成)以及Regranex相比在治疗慢性糖尿病性足溃疡中的有效性。以下表4总结了本研究设计。对于本研究的每个分支(1-37)，该产品以表4中所示的剂量和频率施加长达20周或直到伤口完全闭合。Regranex根据其批准的美国标签进行施加。根据上文第50段所述的程序(步骤1-5)施加rhPDGF-BB/胶原蛋白组合物。

[0120] 本研究的结果测量指标为：·发生完全的伤口闭合。
·达到完全伤口闭合的时间。
·每次访视时总溃疡表面积的百分比减少量。
·在伤口愈合后12周观察到的溃疡复发次数。
·处理突发紧急不良事件(直到52周)。

[0121] 本研究的入选标准包括：·年龄为18岁或以上的患有1型或2型糖尿病的男性或女性
·在治疗的足部具有单一溃疡的患者
·能够且愿意提供知情同意书的患者
·能够且愿意遵守协议访视和程序的患者
·愿意在整个研究持续时间内使用解除方法的患者
·肢体(踝以下)的全厚度足底、侧面或背面溃疡，不包括脚趾间溃疡(蹼空间)，延伸通过表皮和真皮，但不累及骨、腱、韧带或肌肉(根据德克萨斯大学糖尿病伤口分类定义为IA级，或根据Wagner分类为1级)
·尽管有适当的伤口医护，仍具至少六周的慢性溃疡
·在快速清创之后采用公式：长度x宽度x0.8测得的溃疡面积为1至10cm2，包含所述两
个端值
·在基线访视之前良好控制的感染或蜂窝织炎(系统性抗生物疗法)
·如通过Semmes-Weinstein单丝测试或通过生物测量仪(bio esthesimeter)(振动知
觉阈值)评估的周围神经病变
·踝臂压力指数＞0.60且＜1.3
·手术绝育、绝经后或同意实施充分避孕且在筛选时妊娠试验阴性的女性
·非哺乳期

[0122] 本研究的排除标准包括：·脚趾间溃疡
·其他病因或起源的溃疡：电、化学或辐射伤害，褥疮，血管溃疡或夏科氏(Charcot)畸形溃疡
·夏科氏足
·起源于截肢层的伤口
·通过临床检查和射线照相(如果需要)评估的活动性溃疡感染。存在不能通过清创去
除或不能通过标准伤口医护控制的坏死、化脓或窦道
·影响目标溃疡区域的活动性骨髓炎
·控制不良的糖尿病(不受控制的糖血症：HbAlc％>＝10％)，肾衰竭(血清肌酸酐>
3.0mg/dL)，营养状况不良(白蛋白<3.0g/dL或总蛋白质<6.5g/dL)
·已知的结缔组织或恶性病
·与皮质类固醇、免疫抑制剂、放射疗法或抗癌化学疗法联合治疗
·在30天内使用试验药/器具或生长因子
·在7天内在该伤口上局部施加任何预先的伤口医护(抗菌剂、抗生素、清创药、酶)
·在8周内血管重建
·预计不依从该方案(在该试验、治疗或伤口医护依从期间不可行)，或研究者因任何
其他原因感觉不适合的患者
·严重的脑血管事件史

[0123] 表4.实施例4研究设计

[0124] 每种rhPDGF/胶原蛋白海绵组合物在至少一项结果测量指标上表现均优于Regranex或标准医护，和/或采用在治疗期内施加较少的累积rhPDGF，或施加导致更好的患者依从性的更少次数的治疗而获得基本相同的结果。

[0125] 本文所述的实施方案、变化和顺序应提供本发明的实用性和多功能性的指示。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以采用未提供本文所阐述的所有特征和优点的其他实施方案。此类修改和变化被认为在本发明的范围内。

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