结合MCP-1的核酸
专利汇可以提供结合MCP-1的核酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及核酸，其优选地结合MCP－1，所述核酸选自1A型核酸、1B型核酸、2型核酸、3型核酸、4型核酸和具有根据SEQ.ID.No.87至115中任一个的核酸序列的核酸。，下面是结合MCP-1的核酸专利的具体信息内容。
1.一种核酸，其优选地结合MCP-1，所述核酸选自1A型核酸、 1B型核酸、2型核酸、3型核酸、4型核酸和具有根据SEQ.ID.No.87 至115中任一个的核酸序列的核酸。
2.权利要求1的核酸，其中所述1A型核酸以5’->3’方向包含 第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B3、第四序列段 盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6和第七序列段盒B1B，其 中
第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCRUG，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGW，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUR，
第四序列段盒B4包含核苷酸序列RYA，
第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGRCGCGAYC，
第六序列段盒B6包含核苷酸序列UGCAAUAAUG或URYAWUUG，并且
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CRYGCU。
3.权利要求2的核酸，其中
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUG。
4.权利要求2或3的核酸，其中
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGU。
5.权利要求2至4中任一项的核酸，其中
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUG。
6.权利要求2至5中任一项的核酸，其中
第四序列段盒B4包含核苷酸序列GUA。
7.权利要求2至6中任一项的核酸，其中
第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC。
8.权利要求2至7中任一项的核酸，其中
第六序列段盒B6包含核苷酸序列UACAUUUG。
9.权利要求2至8中任一项的核酸，其中
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACGCU。
10.权利要求2至9中任一项的核酸，其中所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 21的核酸序列。
11.权利要求1的核酸，其中所述1B型核酸以5’->3’方向包 含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B3、第四序列 段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6和第七序列段盒B1B， 其中
第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGYRUG，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGCU或CCAGY，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUG，
第四序列段盒B4包含核苷酸序列AUG，
第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC
第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA或CAUUUA，并且
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CAYRCU。
12.权利要求11的核酸，其中
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUG。
13.权利要求11或12的核酸，其中
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGU。
14.权利要求11至13中任一项的核酸，其中
第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA。
15.权利要求11至14中任一项的核酸，其中
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACGCU。
16.权利要求11至15中任一项的核酸，其中所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 28和SEQ.ID.No 27的核酸序列。
17.权利要求1的核酸，其中所述2型核酸以5’->3’方向包含 第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2和第三序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自ACGCA、CGCA和GCA的核苷酸序列，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列 CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC，并且
第三序列段盒B1B包含选自UGCGU、UGCG和UGC的核苷酸序列。
18.权利要求17的核酸，其中
第二序列段盒B2包含核苷酸序列 CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC。
19.权利要求17至18中任一项的核酸，其中
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列ACGCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCGU；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CGCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCG；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGC或UGCG。
20.权利要求17至19中任一项的核酸，其中
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCA。
21.权利要求17至20中任一项的并且优选权利要求20的核酸， 其中
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCG。
22.权利要求17至21中任一项的核酸，其中所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 37、SEQ.ID.No 116、SEQ.ID.No 117和SEQ.ID.No 278的 核酸序列。
23.权利要求1的核酸，其中所述3型核酸以5’->3’方向包含 第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2A、第三序列段盒B3、第四序列 段盒B2B、第五序列段盒B4、第六序列段盒B5A、第七序列段盒B6、 第八序列段盒B5B和第九序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第九序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第二序列段盒B2A和第四序列段盒B2B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第六序列段盒B5A和第八序列段盒B5B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自GURCUGC、GKSYGC、KBBSC和BNGC的 核苷酸序列，
第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GKMGU，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列KRRAR，
第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC，
第五序列段盒B4包含选自CURYGA、CUWAUGA、CWRMGACW和 UGCCAGUG的核苷酸序列，
第六序列段盒B5A包含选自GGY和CWGC的核苷酸序列，
第七序列段盒B6包含选自YAGA、CKAAU和CCUUUAU的核苷酸序列，
第八序列段盒B5B包含选自GCYR和GCWG的核苷酸序列，并且
第九序列段盒B1B包含选自GCAGCAC、GCRSMC、GSVVM和GCNV的 核苷酸序列。
24.权利要求23的核酸，其中
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GAGAA或UAAAA。
25.权利要求23或24的核酸，其中
第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGACU或CAACGACU。
26.权利要求23至25中任一项的核酸，其中
第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGACU，并且第三序列段盒 B3包含核苷酸序列UAAAA。
27.权利要求23至25中任一项的核酸，其中
第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAACGACU，并且第三序列段盒 B3包含核苷酸序列GAGAA。
28.权利要求23至27中任一项的核酸，其中
第七序列段盒B6包含核苷酸序列UAGA。
29.权利要求23至28中任一项的核酸，其中
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GURCUGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GKSYGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCRSMC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KBBSC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSVVM；或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列BNGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNV。
30.权利要求29的核酸，其中
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCUGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCGCAC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KKSSC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSSMM；或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列SNGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNS。
31.权利要求30的核酸，其中
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GGGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCCC。
32.权利要求23至31中任一项的核酸，其中第二序列段盒B2A 包含核苷酸序列GKMGU，并且第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC。
33.权利要求32的核酸，其中第二序列段盒B2A包含核苷酸序列 GUAGU，并且第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACUAC。
34.权利要求23至33中任一项的核酸，其中
a)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGY，
并且
第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCYR；或者
b)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列CWGC，
并且
第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCWG。
35.权利要求34的核酸，其中
第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGC，
并且
第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCCG。
36.权利要求23至35中任一项的，优选权利要求34′至35中任 一项的核酸，其中第六序列段盒B5A与第八序列段盒B5B的核苷酸GCY 杂交。
37.权利要求23至26和28至36中任一项的核酸，其中所述核 酸包含根据SEQ.ID.No 56的核酸序列。
38.权利要求23至25和27至36中任一项的核酸，其中所述核 酸包含选自根据SEQ.ID.No 57至61、SEQ.ID.No 67至71和SEQ.ID.No 73的核酸序列的核酸序列。
39.权利要求1的核酸，其中所述4型核酸以5’->3’方向包含 第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自AGCGUGDU、GCGCGAG、CSKSUU、GUGUU 和UGUU的核苷酸序列；
第二序列段盒B2包含选自AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG、 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG和CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA的核苷酸序 列，并且
第三序列段盒B1B包含选自GNCASGCU、CUCGCGUC、GRSMSG、GRCAC 和GGCA的核苷酸序列。
40.权利要求39的核酸，其中
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRCAC；
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCGCGAG，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列CUCGCGUC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CSKSUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG，或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列UGUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GGCA，或者
e)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUGDU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GNCASGCU。
41.权利要求40的核酸，其中第一序列段盒B1A包含核苷酸序列 CSKSUU，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG。
42.权利要求41的核酸，其中第一序列段盒B1A包含核苷酸序列 CCGCUU，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GGGCGG。
43.权利要求39至42中任一项的核酸，其中
第二序列段盒B2包含核苷酸序列AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG。
44.核酸权利要求39至43中任一项的核酸，其中所述核酸包含 根据SEQ.ID.No 80的核酸序列。
45.权利要求1至44中任一项的核酸，其中所述核酸能够结合趋 化因子，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3。
46.权利要求1至45中任一项的核酸，其中所述核酸能够结合趋 化因子，其中所述趋化因子选自人嗜酸性粒细胞趋化因子、人MCP-1、 人MCP-2和人MCP-3。
47.权利要求1至46中任一项的核酸，其中所述核酸能够结合 MCP-1，其中MCP-1优选地选自猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1、猪MCP-1和人MCP-1。
48.权利要求1至47中任一项的核酸，其中所述核酸能够结合人 MCP-1。
49.权利要求1至48中任一项的，优选权利要求48的核酸，其 中所述MCP-1具有根据SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
50.一种核酸，其优选地结合鼠MCP-1，其中所述核酸包含根据 SEQ.ID.No.122、SEQ.ID.No.253和SEQ.ID.No.254的核酸序列。
51.一种核酸，其优选地结合鼠MCP-1，其中所述核酸包含根据 SEQ.ID.No.127的核酸序列。
52.权利要求50或51的核酸，其中所述鼠MCP-1包含根据 SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
53.权利要求1至52中任一项的核酸，其中所述核酸包含修饰物， 其中所述修饰物优选为高分子量部分和/或其中所述修饰物优选使得 能够改变权利要求1至52中任一项的核酸在动物或人体，优选人体内 的停留时间方面的特征。
54.权利要求53的核酸，其中所述修饰物选自HES部分和PEG 部分。
55.权利要求54的核酸，其中所述修饰物是由直链或支化的PEG 组成的PEG部分，其中所述PEG部分的分子量优选为大约20至120kD， 更优选大约30至80kD，和最优选大约40kD。
56.权利要求54的核酸，其中所述修饰物是HES部分，其中优选 地，所述HES部分的分子量为大约10至130kD，更优选大约30至130 kD，和最优选大约100kD。
57.权利要求53至56中任一项的核酸，其中所述修饰物经由连 接体偶联至所述核酸。
58.权利要求53至57中任一项的核酸，其中所述修饰物于所述 核酸的5’-末端核苷酸和/或所述核酸的3’-末端核苷酸处偶联至所 述核酸，和/或于所述5’-末端核苷酸和所述3’-末端核苷酸之间偶 联至所述核酸的核苷酸。
59.权利要求1至58中任一项的核酸，其中所述核酸的核苷酸或 形成所述核酸的核苷酸是L-核苷酸。
60.权利要求1至59中任一项的核酸，其中所述核酸是L-核酸。
61.权利要求1至59中任一项的核酸，其中能够结合MCP-1的所 述核酸的所述部分由L-核苷酸组成。
62.药物组合物，其包含权利要求1至61中任一项的核酸和任选 地另外的成分，其中所述另外的成分选自可药用赋形剂、可药用载体 和药物学活性试剂。
63.权利要求62的药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要 求1至61中任一项的核酸和可药用载体。
64.权利要求1至61中任一项的核酸在制备药剂中的用途。
65.权利要求64的用途，其中所述药剂用于人医学或用于兽医 学。
66.权利要求1至61中任一项的核酸在制备诊断工具中的用途。
67.权利要求64或65的用途，其中所述药剂用于治疗和/或预防 疾病或病症，所述疾病或病症选自炎性疾病，自身免疫疾病，自身免 疫性脑脊髓炎，中风，急性和慢性多发性硬化症，慢性炎症，类风湿 性关节炎，肾病，再狭窄，血管成形术后再狭窄，急性和慢性变态反 应，原发性和继发性免疫反应或变态反应，哮喘，结膜炎，支气管炎， 癌症，动脉粥样硬化，动脉硬化性心血管心力衰竭或中风，牛皮癣， 牛皮癣性关节炎，神经系统炎症，特应性皮炎，结肠炎，子宫内膜异 位，眼色素层炎，视网膜病症，包括黄斑变性、视网膜脱离、糖尿病 性视网膜病变、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎、增殖性玻璃体 视网膜病变和浆液性中心性脉络膜视网膜病变；特发性肺纤维化，结 节病，多肌炎，皮肌炎，避免免疫抑制，降低感染风险，脓毒症，肾 脏炎症，肾小球肾炎，急骤进展性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎， 糖尿病性肾病，梗阻性肾病，急性肾小管坏死，和弥漫性肾小球硬化， 全身性红斑狼疮，慢性支气管炎，贝赫切特病，肌萎缩性脊髓侧索硬 化(ALS)，川畸病之后的过早动脉粥样硬化，心肌梗死，肥胖症，慢 性肝病，佩罗尼病，急性脊髓损伤，肺或肾移植，心肌炎，阿尔茨海 默病和神经病，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，卵巢癌，错构瘤，结肠直肠 癌，结肠腺瘤，胰腺炎，慢性阻塞性肺部疾病(COPD)，和炎性肠病 例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。
68.一种复合物，其包含趋化因子和权利要求1至61中任一项的 核酸，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3，其中优选地，所述复合物是晶体复合物。
69.权利要求68的复合物，其中所述趋化因子选自人嗜酸性粒细 胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
70.权利要求68或69的复合物，其中所述趋化因子是MCP-1， 其中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛 MCP-1、犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
71.权利要求1至61中任一项的核酸用于检测趋化因子的用途， 其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和 MCP-3。
72.权利要求71的用途，其中所述趋化因子选自人嗜酸性粒细胞 趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
73.权利要求71或72的用途，其中所述趋化因子是MCP-1，其 中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
74.用于筛选趋化因子拮抗剂或趋化因子激动剂的方法，其包括 下列步骤：
-提供候选趋化因子拮抗剂和/或候选趋化因子激动剂，
-提供权利要求1至61中任一项的核酸，
-提供测试系统，其在存在趋化因子拮抗剂和/或趋化因子激动剂时 提供信号，和
-确定所述候选趋化因子拮抗剂是否为趋化因子拮抗剂和/或所述 候选趋化因子激动剂是否为趋化因子激动剂，
其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和 MCP-3。
75.权利要求74的方法，其中所述趋化因子选自人嗜酸性粒细胞 趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
76.权利要求74或75的方法，其中所述趋化因子是MCP-1，其 中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
77.用于筛选趋化因子激动剂和/或趋化因子拮抗剂的方法，其包 括下列步骤：
-提供固定至相，优选固相的趋化因子，
-提供权利要求1至61中任一项的核酸，优选权利要求1至52中 任一项的核酸，其是经标记的，
-加入候选趋化因子激动剂和/或候选趋化因子拮抗剂，和
-确定所述候选趋化因子激动剂是否为趋化因子激动剂和/或所述 候选趋化因子拮抗剂是否为趋化因子拮抗剂，
其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和 MCP-3。
78.权利要求77的方法，其特征在于，进行所述测定，从而能够 评估所述核酸是否被所述候选趋化因子激动剂或候选趋化因子拮抗剂 所替代。
79.权利要求77或78的方法，其中所述趋化因子选自人嗜酸性 粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
80.权利要求77至79中任一项的方法，其中所述趋化因子是 MCP-1，其中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、 牛MCP-1、犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
81.用于检测趋化因子的试剂盒，其包含权利要求1至61中任一 项的核酸，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、 MCP-2和MCP-3。
82.权利要求81的试剂盒，其中所述趋化因子选自人嗜酸性粒细 胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
83.权利要求81或82的试剂盒，其中所述趋化因子是MCP-1， 其中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛 MCP-1、犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
84.通过权利要求74至80中任一项的方法能够获得的趋化因子 拮抗剂，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3。
85.权利要求84的趋化因子拮抗剂，其中所述趋化因子选自人嗜 酸性粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
86.权利要求84或85的趋化因子拮抗剂，其中所述趋化因子是 MCP-1，其中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、 牛MCP-1、犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
87.通过权利要求74至80中任一项的方法能够获得的趋化因子 激动剂，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3。
88.权利要求87的趋化因子激动剂，其中所述趋化因子选自人嗜 酸性粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
89.权利要求87或88的趋化因子激动剂，其中所述趋化因子是 MCP-1，其中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、 牛MCP-1、犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
90.用于检测样品中的权利要求1至61中任一项的核酸的方法， 其中所述方法包括下列步骤：
f)提供含有根据本发明的核酸的样品；
g)提供捕获探针和检测探针，其中所述捕获探针与权利要求1 至61中任一项的核酸的第一部分至少部分地互补，和所述检测探针与 权利要求1至61中任一项的核酸的第二部分至少部分地互补，或者备 选地，所述捕获探针与权利要求1至61中任一项的核酸的第二部分至 少部分地互补，和所述检测探针与权利要求1至61中任一项的核酸的 第一部分至少部分地互补；
h)允许所述捕获探针和所述检测探针同时地或者以任何顺序依 次地与权利要求1至61中任一项的核酸或其部分反应；
i)任选地，检测所述捕获探针是否与在步骤a)中提供的权利要 求1至61中任一项的核酸杂交；和
j)检测在步骤c)中形成的复合物，其由权利要求1至61中任 一项的核酸以及所述捕获探针和所述检测探针组成。
91.权利要求90的方法，其中所述检测探针包含检测工具，和/ 或其中所述捕获探针可以固定至支持物，优选固体支持物。
92.权利要求90或91的方法，其中将不作为所述复合物的一部 分的任何检测探针从所述反应体系中去除，从而在步骤e)中仅检测作 为所述复合物的一部分的检测探针。
93.权利要求90至92中任一项的方法，其中步骤e)包括下列步 骤：比较当所述捕获探针和所述检测探针在权利要求1至61中任一项 的核酸或其部分存在的情况下和所述核酸或其部分不存在的情况下进 行杂交时由所述检测工具所产生的信号。
94.权利要求90至93中任一项的方法，其中所述待检测的核酸 是具有根据SEQ.ID.NO.37、116、117或278的核酸序列的核酸，并 且所述捕获探针或检测探针包含根据SEQ.ID.NO.255或SEQ.ID.NO. 256的核酸序列。
95.权利要求90至93中任一项的方法，其中所述待检测的核酸 是具有根据SEQ.ID.NO.122、253或254的核酸序列的核酸，并且所 述捕获探针或检测探针包含根据SEQ.ID.NO.281和SEQ.ID.NO.282 的核酸序列。
本发明涉及结合MCP-1的核酸及其分别用于制备药剂 (medicament)和诊断剂的用途。
人MCP-1(单核细胞化学吸引蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1)；其他名称为MCAF[单核细胞趋化和活化因子(monocyte chemoattracting and activating factor)]、CCL2、SMC-CF[平滑 肌细胞集落刺激因子]、HC-11、LDCF、GDCF、TSG-8、SCYA2、A2； SwissProt登录号为P13500)由三个研究组独立地表征(Matsushima 1988；Rollins 1989；Yoshimura 1989)。它由76个氨基酸组成， 并且像所有趋化因子一样以肝素结合位点为特点。两个分子内二硫键 赋予该分子以稳定的刚性结构。此外，MCP-1在其氨基末端携带有焦 谷氨酸。位于Thr 71处的是潜在的0-联糖基化位点。另外的MCP家 族成员既存在于人中(MCP-2、-3、-4)也存在于小鼠中(MCP-2、-3、 -5)。人蛋白质与人MCP-1具有大约70％的同源性。
MCP-1的结构已经通过NMR(Handel 1996)和X-射线(Lubkowski 1997)进行了解析。MCP-1单体具有典型的趋化因子折叠，其中氨基 末端的半胱氨酸后面接着是在希腊钥匙模体(Greek key motif)中导 致三个反平行β-折叠片的长环。该蛋白质终止于叠加在这三个β折叠 片上的α螺旋(PDB数据登录号1DOK)。
尽管通常保持了来自不同哺乳动物物种的MCP-1形式的三维结 构，但氨基酸序列在进化过程中没有特别好地保守。序列比对结果表 明，在前76个氨基酸中人和鼠MCP-1(也称为JE)之间的总体序列相 似性为55％。除了氨基酸序列，鼠MCP-1与人MCP-1的区别在于分子 大小(鼠MCP-1有125个氨基酸)和糖基化程度。鼠MCP-1含有49- 氨基酸的羧基末端结构域，该结构域在人MCP-1中不存在并且不是体 外生物活性所必需的。人MCP-1与来自下面的MCP-1具有如下百分比 的相同氨基酸：
·猕猴(Macaca mulatta)MCP-1 97％
·欧洲野猪(Sus scrofa)MCP-1 79％
·家马(Equus caballus) 78％
·家犬(Canis familiaris)MCP-1 76％
·穴兔(Oryctolagus cuniculus)MCP-1 75％
·家牛(Bos Taurus) 72％
·智人(Homo sapiens)MCP-3 71％
·智人嗜酸性粒细胞趋化因子 64％
·智人MCP-2 62％
·小家鼠(Mus musculus)MCP-1 55％
·褐家鼠(Rattus norvegicus)MCP-1 55％
考虑到这种高程度的趋异性，可能有必要产生啮齿动物MCP-1的 拮抗剂以用于在啮齿动物模型中成功地实施药理学研究。
MCP-1是强效的单核细胞/巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、激活的T细 胞和NK细胞的引诱剂。多种细胞类型，例如内皮细胞、上皮细胞、成 纤维细胞、角质形成细胞、滑膜细胞、肾小球膜细胞、成骨细胞、平 滑肌细胞，以及众多肿瘤细胞均表达MCP-1(Baggiolini 1994)。它 的表达受到几种类型的促炎剂，例如IL-1β、TNF-α、IFN-γ、LPS (脂多糖)和GM-CSF刺激。
在混杂的趋化因子网络中相当与众不同的是，MCP-1在其受体使 用上是高度特异的，只以高亲和力与趋化因子受体CCR2结合。像所有 趋化因子受体一样，CCR2是GPCR(Dawson 2003)。CCR2看来似乎由 于编码羧基末端区域的mRNA的选择性剪接而表达成两种稍微不同的 形式(CCR2a和CCR2b)(Charo 1994)。这些受体在单核细胞、骨髓 前体细胞和激活的T细胞中表达(Myers 1995；Qin 1996)。MCP-1 与转染入HEK-293细胞中的受体的解离常数是260pM，该值与在单核 细胞上测得的值相一致(Myers 1995；Van Riper 1993)。用MCP-1 激活在经转染的HEK-293细胞上的CCR2b，在浓度为90pM时抑制腺 苷酸环化酶，并且在稍微更高的浓度时动员细胞内的钙，这看似不依 赖于磷脂酰肌醇的水解。对腺苷酸环化酶和细胞内钙释放的影响受到 百日咳毒素的强烈抑制，这意味着Gi型异源三聚体G-蛋白参与了信号 转导(Myers 1995)。
MCP-1参与将单核细胞募集入发炎的组织中。在那里，定居巨噬 细胞释放趋化因子例如MCP-1等，和细胞因子例如TNF、IL-1β等， 它们激活内皮细胞以表达一批粘着分子。所产生的“粘性”内皮导致 血管中的单核细胞沿着它的表面滚动。在这里，单核细胞遇到内皮表 面上递呈的MCP-1，其结合单核细胞上的CCR2并将它们激活。这最终 导致被牢固地捕获，单核细胞沿着内皮扩散，并移行入周围组织中， 在那里单核细胞分化成巨噬细胞并迁移至最大MCP-1浓度的位点。
MCP-1是趋化因子家族的成员，该家族是一类小的(约8-14kDa)、 结合肝素的、大多数为碱性的且在结构上相关的分子的家族。它们主 要在发炎的组织中形成并调节白血球(白细胞)的募集、激活和增殖 (Baggiolini 1994；Springer 1995；Schall 1994)。趋化因子选 择性地诱导嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、 巨噬细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞的趋化性。除了它们的趋化效 应，它们还可以在应答细胞中选择性地发挥其他作用，如改变细胞形 状，瞬时升高游离的细胞内钙离子的浓度，脱粒，上调整联蛋白，形 成生物活性脂质例如白三烯、前列腺素、血栓烷，或呼吸爆发(释放 活性氧类别来破坏致病微生物或肿瘤细胞)。因此，通过引起另外的 促炎介质的释放以及白细胞向感染或炎症位点的趋化性和外渗，趋化 因子引发炎性应答逐步升级。
基于四个保守的半胱氨酸残基中的前两个的排列，将趋化因子分 成四类：其中所述半胱氨酸串联的CC或β-趋化因子，其中所述半胱 氨酸由一个另外的氨基酸残基隔开的CXC或α-趋化因子，只具有一个 二硫桥的XC或γ趋化因子(迄今为止，淋巴细胞趋化因子 (lymphotactin)是唯一的代表)，以及特征为在所述半胱氨酸之间 有3个氨基酸残基的CX3C-趋化因子(迄今为止已知唯一的该类型的 成员是膜结合的fractalkin(Bazan 1997))。
CXC趋化因子主要作用于嗜中性粒细胞，特别是在它们的氨基末 端处携带有氨基酸序列ELR的那些CXC趋化因子。对于嗜中性粒细胞 具有活性的CXC趋化因子的实例是IL-8、GRO-α、GRO-β和GRO-γ、 NAP-2、ENA-78和GCP-2。CC趋化因子作用于更多类别的白细胞上， 例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及T和B 淋巴细胞(Oppenheim 1991；Baggiolini 1994；Miller 1992；Jose 1994；Ponath 1996a)。这些趋化因子的实例是I-309、MCP-1、MCP-2、 MCP-3、MCP-4、MIP-1α和MIP-β、RANTES和嗜酸性粒细胞趋化因子。
趋化因子通过属于七跨膜G蛋白偶联受体(GPCRs；Murphy 2000) 超家族的受体起作用。一般而言，趋化因子和趋化因子受体的相互作 用是趋于混杂的，因为一个趋化因子可以结合许多趋化因子受体，并 且反而言之，单个趋化因子受体可以与几种趋化因子相互作用。一些 已知的CC趋化因子的受体包括结合MIP-1α和RANTES的CCR1(Neote 1993；Gao 1993)；结合包括MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4在内的 趋化因子的CCR2(Charo 1994；Myers 1995；Gong 1997；Garcia-Zepeda 1996)；结合包括嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTES和MCP-3在内的趋 化因子的CCR3(Ponath 1996b)；已经发现响应于MCP-1、MIP-1α和 RANTES而产生信号的CCR4(Power 1995)；以及已经显示响应于MIP-1 α和MIP-β及RANTES而产生信号的CCR5(Boring 1996；Raport 1996； Samson 1996)。
如上所述，MCP家族的所有四个成员(1-4)都结合CCR2，而 MCP-2、MCP-3和MCP-4还可以与CCR1和CCR3相互作用(Gong 1997； Heath 1997；Uguccioni 1997)，并且在MCP-2的情况下可以与CCR5 相互作用(Ruffing 1998)。显示出与MCP家族具有高同源性的另一 种CC趋化因子是嗜酸性粒细胞趋化因子，其最初从获自受变应原攻击 的、致敏的豚鼠的支气管肺泡灌洗液中分离出来(Jose 1994)。已经 显示出，嗜酸性粒细胞趋化因子也能够激活CCR2(Martinelli 2001)。
作为本发明的基础的问题是提供与MCP-1特异性地相互作用的工 具(means)。更具体而言，作为本发明的基础的问题是提供与MCP-1 特异性地相互作用的基于核酸的工具。
作为本发明的基础的另一个问题是提供用于制备用于治疗人或非 人疾病的药剂的工具，其中所述疾病的特征为MCP-1直接或间接地参 与了这种疾病的致病机理。
作为本发明的基础的另外一个问题是提供用于制备用于治疗疾病 的诊断剂的工具，其中所述疾病的特征为MCP-1直接或间接地参与了 这种疾病的致病机理。
作为本发明的基础的这些和其他的问题通过所附的独立权利要求 的主题而得以解决。优选的实施方案可以从从属权利要求中获得。
作为本发明的基础的问题也在第一个方面中通过一种核酸(优选 地结合MCP-1)得以解决，所述核酸选自1A型核酸、1B型核酸、2型 核酸、3型核酸、4型核酸和具有根据SEQ.ID.No.87至115中任一个 的核酸序列的核酸。
在第一个方面的第一个子方面，所述1A型核酸以5’->3’方向 包含第一序列段(stretch)盒(Box)B1A、第二序列段盒B2、第三 序列段盒B3、第四序列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6 和第七序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCRUG，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGW，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUR，
第四序列段盒B4包含核苷酸序列RYA，
第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGRCGCGAYC，
第六序列段盒B6包含核苷酸序列UGCAAUAAUG或URYAWUUG，并且
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CRYGCU。
在第一个子方面的一个优选实施方案中，第一序列段盒B1A包含 核苷酸序列AGCGUG。
在第一个子方面的一个实施方案中，第二序列段盒B2包含核苷酸 序列CCCGGU。
在第一个子方面的一个实施方案中，第三序列段盒B3包含核苷酸 序列GUG。
在第一个子方面的一个实施方案中，第四序列段盒B4包含核苷酸 序列GUA。
在第一个子方面的一个实施方案中，第五序列段盒B5包含核苷酸 序列GGGGGGCGCGACC。
在第一个子方面的一个实施方案中，第六序列段盒B6包含核苷酸 序列UACAUUUG。
在第一个子方面的一个实施方案中，第七序列段盒B1B包含核苷 酸序列CACGCU。
在第一个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 21的核酸序列。
在第一个方面的第二个子方面，所述1B型核酸以5’->3’方向 包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B3、第四序 列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6和第七序列段盒B1B， 其中
第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGYRUG，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGCU或CCAGY，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUG，
第四序列段盒B4包含核苷酸序列AUG，
第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC
第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA或CAUUUA，并且
第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CAYRCU。
在第二个子方面的一个实施方案中，第一序列段盒B1A包含核苷 酸序列AGCGUG。
在第二个子方面的一个实施方案中，第二序列段盒B2包含核苷酸 序列CCAGU。
在第二个子方面的一个实施方案中，第六序列段盒B6包含核苷酸 序列CAUUUUA。
在第二个子方面的一个实施方案中，第七序列段盒B1B包含核苷 酸序列CACGCU。
在第二个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含根据 SEQ.ID.No28和SEQ.ID.No 27的核酸序列。
在第一个方面的第三个子方面中，所述2型核酸以5’->3’方向 包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2和第三序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自ACGCA、CGCA和GCA的核苷酸序列，
第二序列段盒B2包含核苷酸序列 CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC，并且
第三序列段盒B1B包含选自UGCGU、UGCG和UGC的核苷酸序列。
在第三个子方面的一个实施方案中，第二序列段盒B2包含核苷酸 序列CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC。
在第三个子方面的一个实施方案中，
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列ACGCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCGU；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CGCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCG；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCA，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGC或UGCG。
在第三个子方面的一个实施方案中，第一序列段盒B1A包含核苷 酸序列GCA。
在第三个子方面的一个优选实施方案中，第三序列段盒B1B包含 核苷酸序列UGCG。
在第三个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 37、SEQ.ID.No 116、SEQ.ID.No 117和SEQ.ID.No 278的 核酸序列。
在第一个方面的第四个子方面，所述3型核酸以5’->3’方向包 含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2A、第三序列段盒B3、第四序 列段盒B2B、第五序列段盒B4、第六序列段盒B5A、第七序列段盒B6、 第八序列段盒B5B和第九序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第九序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第二序列段盒B2A和第四序列段盒B2B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第六序列段盒B5A和第八序列段盒B5B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自GURCUGC、GKSYGC、KBBSC和BNGC的 核苷酸序列，
第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GKMGU，
第三序列段盒B3包含核苷酸序列KRRAR，
第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC，
第五序列段盒B4包含选自CURYGA、CUWAUGA、CWRMGACW和 UGCCAGUG的核苷酸序列，
第六序列段盒B5A包含选自GGY和CWGC的核苷酸序列，
第七序列段盒B6包含选自YAGA、CKAAU和CCUUUAU的核苷酸序列，
第八序列段盒B5B包含选自GCYR和GCWG的核苷酸序列，并且
第九序列段盒B1B包含选自GCAGCAC、GCRSMC、GSVVM和GCNV的 核苷酸序列。
在第四个子方面的一个实施方案中，第三序列段盒B3包含核苷酸 序列GAGAA或UAAAA。
在第四个子方面的一个实施方案中，第五序列段盒B4包含核苷酸 序列CAGCGACU或CAACGACU。
在第四个子方面的一个实施方案中，第五序列段盒B4包含核苷酸 序列CAGCGACU，并且第三序列段盒B3包含核苷酸序列UAAAA。
在第四个子方面的一个实施方案中，第五序列段盒B4包含核苷酸 序列CAACGACU，并且第三序列段盒B3包含核苷酸序列GAGAA。
在第四个子方面的一个实施方案中，第七序列段盒B6包含核苷酸 序列UAGA。
在第四个子方面的一个实施方案中，
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GURCUGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GKSYGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCRSMC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KBBSC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSVVM；或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列BNGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNV。
在第四个子方面的一个实施方案中，
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCUGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC；或者
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCGCAC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KKSSC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSSMM；或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列SNGC，
并且
第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNS。
在第四个子方面的另一个优选的实施方案中，第一序列段盒B1A 包含核苷酸序列GGGC，并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCCC。
在第四个子方面的一个实施方案中，第二序列段盒B2A包含核苷 酸序列GKMGU，并且第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC。
在第四个子方面的一个优选实施方案中，第二序列段盒B2A包含 核苷酸序列GUAGU，并且第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACUAC。
在第四个子方面的一个实施方案中，
a)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGY，
并且
第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCYR；或者
b)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列CWGC，
并且
第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCWG。
在第四个子方面的一个优选实施方案中，第六序列段盒B5A包含 核苷酸序列GGC，并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCCG。
在第四个子方面的一个更优选的实施方案中，第六序列段盒B5A 与第八序列段盒B5B的核苷酸GCY杂交。
在第四个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 56的核酸序列。
在第四个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含选自根据 SEQ.ID.No 57至61、SEQ.ID.No 67至71和SEQ.ID.No 73的核酸序 列的核酸序列。
在第一个方面的第五个子方面中，所述4型核酸以5’->3’方向 包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B1B，其中
第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任选地相互杂交，其中在 杂交后形成双链结构，
第一序列段盒B1A包含选自AGCGUGDU、GCGCGAG、CSKSUU、GUGUU 和UGUU的核苷酸序列；
第二序列段盒B2包含选自AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG、 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG和CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA的核苷酸序 列，并且
第三序列段盒B1B包含选自GNCASGCU、CUCGCGUC、GRSMSG、GRCAC 和GGCA的核苷酸序列。
在第五个子方面的一个实施方案中，
a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRCAC；
b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCGCGAG，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列CUCGCGUC；或者
c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CSKSUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG，或者
d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列UGUU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GGCA，或者
e)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUGDU，
并且
第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GNCASGCU。
在第五个子方面的一个优选实施方案中，第一序列段盒B1A包含 核苷酸序列CSKSUU，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG。
在第五个子方面的一个更优选的实施方案中，第一序列段盒B1A 包含核苷酸序列CCGCUU，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列 GGGCGG。
在第五个子方面的一个实施方案中，第二序列段盒B2包含核苷酸 序列AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG。
在第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸包含根据 SEQ.ID.No 80的核酸序列。
在第一个至第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸能够结合 MCP-1，优选人MCP-1。
在第一个至第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸能够结合 趋化因子，其中该趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3。
在第一个至第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸能够结合 趋化因子，其中该趋化因子选自人嗜酸性粒细胞趋化因子、人MCP-1、 人MCP-2和人MCP-3。
在第一个至第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸能够结合 MCP-1，其中MCP-1优选地选自猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1、猪MCP-1和人MCP-1。
在第一个至第五个子方面的一个实施方案中，所述核酸能够结合 人MCP-1。
在第一个至第五个子方面的一个优选实施方案中，MCP-1具有根 据SEQ ID No.1的氨基酸序列。
作为本发明的基础的问题在第二个方面中通过一种核酸(优选地 结合鼠MCP-1)得以解决，其中所述核酸包含根据SEQ.ID.No.122、 SEQ.ID.No.253和SEQ.ID.No.254的核酸序列。
作为本发明的基础的问题在第三个方面中通过一种核酸(优选地 结合鼠MCP-1)得以解决，其中所述核酸包含根据SEQ.ID.No.127的 核酸序列。
在第二个和第三个方面的一个实施方案中，鼠MCP-1包含根据 SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，所述核酸包含修饰物 (modification)，其中所述修饰物优选为高分子量部分和/或其中所 述修饰物优选使得能够改变根据第一个、第二个和第三个方面中任一 方面的核酸在动物或人体(优选人体)内的停留时间方面的特征。
在第一个至第三个方面的一个优选实施方案中，所述修饰物选自 HES部分和PEG部分。
在第一个至第三个方面的一个更优选的实施方案中，所述修饰物 是由直链或支化的PEG组成的PEG部分，其中所述PEG部分的分子量 优选为大约20至120kD，更优选大约30至80kD，和最优选大约40 kD。
在第一个至第三个方面的一个备选的更优选的实施方案中，所述 修饰物是HES部分，其中优选地，所述HES部分的分子量为大约10 至130kD，更优选大约30至130kD，和最优选大约100kD。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，所述修饰物经由连接 体偶联至所述核酸。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，所述修饰物于所述核 酸的5’-末端核苷酸和/或所述核酸的3’-末端核苷酸处偶联至所述 核酸，和/或于所述5’-末端核苷酸和所述3’-末端核苷酸之间偶联 至所述核酸的核苷酸。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，所述核酸的核苷酸或 形成所述核酸的核苷酸是L-核苷酸。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，所述核酸是L-核酸。
在第一个至第三个方面的一个实施方案中，能够结合MCP-1的所 述核酸的所述部分由L-核苷酸组成。
作为本发明的基础的问题在第四个方面中通过药物组合物得以解 决，所述药物组合物包含根据第一个、第二个和第三个方面的核酸和 任选地另外的成分，其中所述另外的成分选自可药用赋形剂、可药用 载体和药物学活性试剂。
在第四个方面的一个实施方案中，所述药物组合物包含根据第一 个至第三个方面中任一方面的核酸和可药用载体。
作为本发明的基础的问题在第五个方面中通过根据第一个、第二 个和第三个方面的核酸在制备药剂中的用途得以解决。
在第五个方面的一个实施方案中，所述药剂用于人医学或用于兽 医学。
作为本发明的基础的问题在第六个方面中通过根据第一个、第二 个和第三个方面的核酸在制备诊断工具中的用途得以解决。
在第五个方面的一个实施方案和在第六个方面的一个实施方案 中，所述药剂和诊断工具分别用于分别治疗和/或预防和诊断疾病或病 症，所述疾病或病症选自炎性疾病，自身免疫疾病，自身免疫性脑脊 髓炎，中风，急性和慢性多发性硬化症，慢性炎症，类风湿性关节炎， 肾病，再狭窄，血管成形术后再狭窄，急性和慢性变态反应，原发性 和继发性免疫反应或变态反应，哮喘，结膜炎，支气管炎，癌症，动 脉粥样硬化，动脉硬化性心血管心力衰竭(artheriosclerotic cardiovasular heart failure)或中风，牛皮癣，牛皮癣性关节炎， 神经系统炎症，特应性皮炎，结肠炎，子宫内膜异位，眼色素层炎， 视网膜病症，包括黄斑变性、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变、早 产儿视网膜病变、色素性视网膜炎、增殖性玻璃体视网膜病变和浆液 性中心性脉络膜视网膜病变；特发性肺纤维化，结节病，多肌炎，皮 肌炎，避免免疫抑制，降低感染风险，脓毒症，肾脏炎症，肾小球肾 炎，急骤进展性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎，糖尿病性肾病，梗 阻性肾病，急性肾小管坏死，和弥漫性肾小球硬化，全身性红斑狼疮， 慢性支气管炎，贝赫切特病，肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，川畸病 之后的过早动脉粥样硬化，心肌梗死，肥胖症，慢性肝病，佩罗尼病， 急性脊髓损伤，肺或肾移植，心肌炎，阿尔茨海默病和神经病，乳腺 癌，胃癌，膀胱癌，卵巢癌，错构瘤，结肠直肠癌，结肠腺瘤，胰腺 炎，慢性阻塞性肺部疾病(COPD)，和炎性肠病例如克罗恩病或溃疡 性结肠炎。
不希望受任何理论的束缚，对于诊断目的，本发明核酸的适用性 主要基于增加的或减少的趋化因子水平，其中此类趋化因子选自嗜酸 性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和MCP-3，更特别地为MCP-1。本 领域技术人员将会公认，大多数上述疾病显示出此类增加的或减少的 趋化因子水平。
作为本发明的基础的问题在第七个方面中通过一种复合物得以解 决，所述复合物包含趋化因子和根据第一个、第二个和第三个方面的 核酸，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2 和MCP-3，其中优选地，所述复合物是晶体复合物。
在第七个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性粒 细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第七个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其中 MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第八个方面中通过根据第一个、第二 个和第三个方面的核酸用于检测趋化因子的用途得以解决，其中所述 趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和MCP-3。
在第八个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性粒 细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第八个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其中 MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第九个方面中通过用于筛选趋化因子 拮抗剂或趋化因子激动剂的方法得以解决，该方法包括下列步骤：
-提供候选趋化因子拮抗剂和/或候选趋化因子激动剂，
-提供根据第一个、第二个或第三个方面的核酸，
-提供测试系统，其在存在趋化因子拮抗剂和/或趋化因子激动剂时 提供信号，和
-确定所述候选趋化因子拮抗剂是否为趋化因子拮抗剂和/或所述 候选趋化因子激动剂是否为趋化因子激动剂，
其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和 MCP-3。
在第九个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性粒 细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第九个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其中 MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第十个方面中通过用于筛选趋化因子 激动剂和/或趋化因子拮抗剂的方法得以解决，该方法包括下列步骤：
-提供固定至相，优选固相的趋化因子，
-提供根据第一个、第二个或第三个方面的核酸，优选根据第一个 方面的核酸，其是经标记的，
-加入候选趋化因子激动剂和/或候选趋化因子拮抗剂，和
-确定所述候选趋化因子激动剂是否为趋化因子激动剂和/或所述 候选趋化因子拮抗剂是否为趋化因子拮抗剂，
其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和 MCP-3。
在第十方面的一个实施方案中，进行所述测定，从而能够评估所 述核酸是否被所述候选趋化因子激动剂或候选趋化因子拮抗剂所替 代。
在第十个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性粒 细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第十个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其中 MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第十一个方面中通过用于检测趋化因 子的试剂盒得以解决，所述试剂盒包含根据第一个、第二个和第三个 方面的核酸，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、 MCP-2和MCP-3。
在第十一个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性 粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第十一个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其 中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第十二个方面中通过能够通过根据第 十个方面或第九个方面的方法获得的趋化因子拮抗剂得以解决，其中 所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和MCP-3。
在第十二个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性 粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第十二个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其 中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
作为本发明的基础的问题在第十三个方面中通过能够通过根据第 十个方面或第九个方面的方法获得的趋化因子激动剂得以解决，其中 所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-1、MCP-2和MCP-3。
在第十三个方面的一个实施方案中，所述趋化因子选自人嗜酸性 粒细胞趋化因子、人MCP-1、人MCP-2和人MCP-3。
在第十三个方面的一个实施方案中，所述趋化因子是MCP-1，其 中MCP-1优选地选自人MCP-1、猴MCP-1、马MCP-1、兔MCP-1、牛MCP-1、 犬MCP-1和猪MCP-1，更优选地MCP-1是人MCP-1。
本领域技术人员将会公认，趋化因子激动剂和/或趋化因子拮抗剂 优选地分别为针对本文指定的各自的趋化因子的激动剂和拮抗剂。因 此，所述趋化因子激动剂和趋化因子拮抗剂分别是例如MCP-1激动剂 和MCP-1拮抗剂。
作为本发明的基础的问题在第十四个方面中通过用于检测样品中 的根据第一个、第二个和第三个方面中任一方面的核酸的方法得以解 决，其中所述方法包括下列步骤：
a)提供含有根据本发明的核酸的样品；
b)提供捕获探针和检测探针，其中所述捕获探针与根据第一个、 第二个和第三个方面中任一方面的核酸的第一部分至少部分地互补， 和所述检测探针与根据第一个、第二个和第三个方面中任一方面的核 酸的第二部分至少部分地互补，或者备选地，所述捕获探针与根据第 一个、第二个和第三个方面中任一方面的核酸的第二部分至少部分地 互补，和所述检测探针与根据第一个、第二个和第三个方面中任一方 面的核酸的第一部分至少部分地互补；
c)允许所述捕获探针和所述检测探针同时地或者以任何顺序依 次地与根据第一个、第二个和第三个方面中任一方面的核酸或其部分 反应；
d)任选地，检测所述捕获探针是否与在步骤a)中提供的根据第 一个、第二个和第三个方面中任一方面的核酸杂交；和
e)检测在步骤c)中形成的复合物，其由根据第一个、第二个和 第三个方面中任一方面的核酸以及所述捕获探针和所述检测探针组 成。
在第十四个方面的一个实施方案中，所述检测探针包含检测工具， 和/或其中所述捕获探针可以固定至支持物，优选固体支持物。
在第十四个方面的一个实施方案中，将不作为所述复合物的一部 分的任何检测探针从所述反应体系中去除，从而在步骤e)中仅检测作 为所述复合物的一部分的检测探针。
在第十四个方面的一个实施方案中，步骤e)包括下列步骤：比较 当所述捕获探针和所述检测探针在根据第一个、第二个和第三个方面 中任一方面的核酸或其部分存在的情况下和所述核酸或其部分不存在 的情况下进行杂交时由所述检测工具所产生的信号。
在第十四个方面的一个实施方案中，所述待检测的核酸是具有根 据SEQ.ID.NO.37、116、117或278的核酸序列的核酸，并且所述捕 获探针或检测探针包含根据SEQ.ID.NO.255或SEQ.ID.NO.256的核 酸序列。
在第十四个方面的一个实施方案中，所述待检测的核酸是具有根 据SEQ.ID.NO.122、253或254的核酸序列的核酸，并且所述捕获探 针或检测探针包含根据SEQ.ID.NO.281和SEQ.ID.NO.282的核酸序 列。
作为本发明的基础的问题还通过所附的独立权利要求的主题得以 解决。优选的实施方案可以从所附的从属权利要求中获得。
如本文所述的根据本发明的核酸的特征可以在本发明的任一方面 中实现，其中单独地或者以任意的组合使用所述核酸。
人以及鼠MCP-1分别是具有根据SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2 的氨基酸序列的碱性蛋白质。
可以鉴定出对于MCP-1的短的且高亲和力结合性的核酸这一发现 是令人惊讶的，这是因为Eaton等人(1997)观察到针对碱性蛋白质 的适体(aptamer)(即结合靶分子的D-核酸)的产生通常是非常困 难的，因为这种类型的靶标产生了高的但非特异性的信噪比。这种高 的信噪比是由于由核酸所显示的对碱性靶标(例如MCP-1)的高的非 特异性亲和力而引起的。
如在权利要求书和实施例1中更详细概述的，本发明人能够更令 人惊讶地鉴定出许多不同的结合MCP-1的核酸分子，其中大多数核酸 可以根据核苷酸序列段(stretch)(其在本文中也称为盒)来表征。 基于所述盒和某些结构特征及元件，可以分别地对各种结合MCP-1的 核酸分子进行分类。如此确定的各种类别在本文中也称为类型，并且 更具体而言，称为1A型、1B型、2型、3型和4型。
根据本发明的核酸还应该包括与本文所公开的特定序列基本同源 的核酸。术语“基本同源”应该理解为，同源性为至少75％，优选85％， 更优选90％，和最优选大于95％、96％、97％、98％或99％。
存在于根据本发明的核酸中的同源核苷酸的实际百分比将取决于 存在于该核酸中的核苷酸的总数。修饰百分比可以基于存在于该核酸 中的核苷酸的总数。
同源性可以如本领域技术人员已知的方式来测定。更具体而言， 然后基于所指定的程序参数，用序列比较算法来计算出测试序列相对 于参考序列的序列同一性百分比。测试序列优选是这样的序列或核酸 分子，即所述序列或核酸分子据称被测试或待测试它是否与另一个核 酸分子同源(如果同源的话，同源到什么程度)，其中这种另一个核酸 分子也称为参考序列。在一个实施方案中，参考序列是如本文所描述 的核酸分子，更优选为具有根据SEQ.ID.NO.10-129、132-256和 278-282中任一个的序列的核酸分子。用于比较的最佳序列比对可以 例如通过下列方法来进行：Smith & Waterman的局部同源性算法 (Smith & Waterman(1981))，Needleman & Wunsch的同源性比对 算法(Needleman & Wunsch，1970)，Pearson & Lipman的相似性搜 索方法(Pearson & Lipman，1988)，这些算法的计算机化实施 (Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group， 575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)， 或目测检查。
适合于测定序列同一性百分比的算法的一个实例是在基本局部比 对搜索工具(basic local alignment search tool，在下文中称为 “BLAST”)中使用的算法，参见，例如Altschul等人(Altschul等 人，1990；和Altschul等人，1997)。用于进行BLAST分析的软件是 通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，在下文中称为“NCBI”)可公开获得的。在使用从NCBI 可获得的软件(例如BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基 酸序列))进行的序列同一性测定中所采用的默认参数描述在 McGinnis等人(McGinnis等人，2004)中。
术语“本发明的核酸”或“根据本发明的核酸”还应该包括包含 本文所公开的核酸序列或其部分的那些核酸，优选地至这样的程度， 即所述核酸或所述部分参与结合MCP-1。本文优选使用的术语“本发 明的核酸”在一个实施方案中还应该包括适合于结合选自MCP-2、 MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子的任何分子的核酸。本领域技 术人员将会公认，独个根据本发明的核酸将结合一个或几个此类分子。 在一个实施方案中，此类核酸是本文所描述的核酸分子之一，或者其 衍生物和/或代谢产物，其中此类衍生物和/或代谢产物优选地为相比 本文所描述的核酸分子而言截短的核酸。截短可以涉及本文所公开的 核酸的任一个末端或两个末端。此外，截短可以涉及所述核酸的内部 核苷酸序列，即其可以分别涉及在5’和3’末端核苷酸之间的核苷酸。 此外，截短应该包括从本文所公开的核酸序列中删除少至单个核苷酸。 截短还可以涉及本发明核酸的超过一个的序列段，其中该序列段可以 仅为一个核苷酸长。本领域技术人员可以通过用常规试验或者通过使 用或采用本文所描述的方法(优选在本文中于实施例部分中所描述的 方法)来测定根据本发明的核酸的结合，优选与选自MCP-1、MCP-2、 MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子的分子的结合。除非明确地说 明与此相反，在本发明的实施方案范围内的是，无论何时当本文提及 根据本发明的核酸结合至MCP-1或与MCP-1结合时，这也适用于根据 本发明的核酸结合至选自MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化 因子的任何分子或与之结合。
根据本发明的核酸可以是D-核酸或L-核酸。优选地，本发明的核 酸是L-核酸。另外，还可能的是，核酸的一个或几个部分作为D-核酸 存在或者核酸的至少一个或几个部分是L-核酸。术语核酸的“部分” 应该表示少至一个核苷酸。此类核酸在本文中通常分别称作D-核酸和 L-核酸。因此，在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的核酸由 L-核苷酸组成并包含至少一个D-核苷酸。此类D-核苷酸优选附着至与 定义根据本发明的核酸的序列段不同的部分，优选为其中涉及与该核 酸的其他部分相互作用的该核酸的那些部分。优选地，此类D-核苷酸 分别附着在根据本发明的任意序列段的末端和任意核酸的末端处。在 进一步优选的实施方案中，此类D-核苷酸可以用作间隔物或连接物， 其优选地将修饰物例如PEG和HES附着至根据本发明的核酸。
同样也在本发明的实施方案的范围内的是，每个和任意的在本文 中在它们的核酸序列方面以其整体描述的核酸分子局限于特定的核苷 酸序列。换而言之，术语“包含”或“包括”在这样的实施方案中应 该理解为“容纳”或“由...组成”。
也在本发明范围内的是，根据本发明的核酸是更长的核酸的部分， 其中该更长的核酸包含几个部分，其中至少一个此类部分是根据本发 明的核酸或其部分。这些更长的核酸的其他部分可以是一个或几个D- 核酸或一个或几个L-核酸。任何组合都可以用于本发明。更长的核酸 的这些其他部分，单独地或合在一起或者以其整体或以特定组合，可 以表现出不同于结合(优选结合MCP-1)的功能。一种可能的功能是 允许与其他分子(其中此类其他分子优选地与MCP-1不同)相互作用， 例如，用于固定、交联、检测或扩增。在本发明的另外的实施方案中， 根据本发明的核酸包含几个本发明核酸，作为独个或组合的部分。包 含几个本发明核酸的此类核酸也由术语“更长的核酸”所涵盖。
如本文所使用的，L-核酸是由L-核苷酸组成的核酸，优选完全由 L-核苷酸组成的核酸。
如本文所使用的，D-核酸是由D-核苷酸组成的核酸，优选完全由 D-核苷酸组成的核酸。
如果没有明确表明与此相反，则术语“核酸”和“核酸分子”在 本文中可以以可交换的方式使用。
此外，如果没有表明与此相反，则任何核苷酸序列在本文中以5’ →3’的方向示出。
无论本发明的核酸由D-核苷酸组成、由L-核苷酸组成还是由两者 的组合(该组合是例如随机的组合，或者是由至少一个L-核苷酸和至 少一个D-核酸组成的序列段的限定序列)组成，所述核酸可以由脱氧 核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合组成。
因为几种原因，将本发明的核酸设计成L-核酸是有利的。L-核酸 是天然存在的核酸的对映体。然而，由于核酸酶的广泛存在，D-核酸 在含水溶液中并且特别是在生物系统或生物样品中不是非常稳定的。 天然存在的核酸酶，特别是来自动物细胞的核酸酶不能降解L-核酸。 因此，L-核酸的生物学半衰期在此类系统(包括动物和人体)中显著 增加。由于缺乏L-核酸的可降解性，因此没有产生核酸酶降解产物并 因而没有观察到从中产生的副作用。该方面界定了事实上所有其他化 合物(其用于治疗涉及MCP-1的存在的疾病和/或病症)的L-核酸。 通过不同于Watson-Crick碱基配对的机制特异性地结合靶分子的L- 核酸，或者部分或完全由L-核酸组成的适体(尤其是该适体的那些部 分参与该适体与靶分子的结合)也称为镜像异构体(spiegelmer)。
也在本发明的范围内的是，本发明的核酸(在本文中也称为根据 本发明的核酸)可以作为单链或双链核酸存在，不论它们作为D-核酸、 L-核酸或D，L-核酸存在或者它们是DNA或RNA。通常，本发明的核酸 是表现出由一级序列限定的二级结构并因而也可以形成三级结构的单 链核酸。然而，本发明的核酸也可以是双链的，这意味着彼此互补或 部分互补的两条链相互杂交。这赋予核酸以稳定性，特别是，如果核 酸是以天然存在的D-形式而不是以L-形式存在，则其将是有利的。
可以修饰本发明的核酸。此类修饰物可以涉及核酸的单个核苷酸 并且是本领域熟知的。此类修饰物的实例尤其描述于Venkatesan (2003)；Kusser(2000)；Aurup(1994)；Cummins(1995)；Eaton (1995)；Green(1995)；Kawasaki(1993)；Lesnik(1993)；和Miller (1993)中。此类修饰物可以是在组成核酸的独个核苷酸的2’位置处 的H原子、F原子或者O-CH3基团或NH2-基团。此外，根据本发明的核 酸可以包含至少一个LNA核苷酸。在一个实施方案中，根据本发明的 核酸由LNA核苷酸组成。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸可以是多分体 (multipartite)核酸。如本文所使用的，多分体核酸是由至少两个 核酸链组成的核酸。这些至少两个核酸链形成功能单元，其中该功能 单元是靶分子的配体。所述至少两个核酸链可以衍生自任何本发明的 核酸，其中通过切割核酸以产生两条链而衍生，或者通过合成与本发 明的(即整体)核酸的第一个部分相对应的一条核酸和与整体核酸的 第二个部分相对应的另一条核酸而衍生。公认的是，切割和合成两者 均可用于产生其中存在超过两条的如上所例示的链的多分体核酸。换 而言之，所述至少两个核酸链通常不同于互补且相互杂交的两条链， 尽管在各个核酸部分之间可能存在一定程度的互补性。
最后，也在本发明范围内的是，实现了根据本发明的核酸的完全 闭合(即环状的)结构，也就是说，根据本发明的核酸是闭合的，优 选通过共价连接闭合，其中更优选地，此类共价连接在如本文所公开 的核酸序列的5’末端和3’末端之间发生。
本发明人已经发现，根据本发明的核酸表现出非常有利的KD值范 围。
测定结合常数的一种可能性是利用所谓的biacore装置，其也是 本领域技术人员已知的。如本文所使用的，亲和力也通过利用如实施 例中所描述的“pull-down测定法”来测量。为了表示根据本发明的 核酸与靶标(在当前情况下为MCP-1)之间的结合强度的合适量度是 所谓的KD值，该值以及用于测定它的方法是本领域技术人员已知的。
根据本发明的核酸通过某个KD值来表征。优选地，根据本发明的 核酸所显示的KD值低于1μM。大约1μM的KD值被认为是核酸与靶标 非特异性结合的特征。如本领域技术人员将公认的，一组化合物(例 如根据本发明的核酸)的KD值在某个范围内。上述的大约1μM的KD 是优选的KD值上限。结合靶标的核酸的KD的优选下限可以是约10pM 或更高。在本发明范围内的是，独个核酸与MCP-1结合的KD值优选在 这一范围内。优选的范围可以通过选择该范围内的任意第一个数字和 该范围内的任意第二个数字来限定。优选的上限值是250nM和100nM， 优选的下限值是50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。
根据本发明的核酸分子可以具有任意的长度，只要它们仍然能够 结合靶分子。本领域将公认，存在有根据本发明的核酸的优选长度。 通常，长度在15和120个核苷酸之间。本领域技术人员将公认，在 15和120之间的任何整数是根据本发明的核酸的可能长度。根据本发 明核酸的长度的更优选的范围是约20至100个核苷酸、约20至80 个核苷酸、约20至60个核苷酸、约20至50个核苷酸和约30至50 个核苷酸的长度。
在本发明的范围内的是，本文所公开的核酸包含这样的部分，所 述部分优选为高分子量部分和/或优选使得能够改变所述核酸尤其是 在动物体内(优选在人体内)的停留时间方面的特征。此类修饰物的 特别优选的实施方案是根据本发明的核酸的PEG化和HES化。如本文 所使用的，PEG表示聚(乙二醇)，而HES表示羟乙基淀粉。如本文所 优选使用的，PEG化是根据本发明的核酸的修饰，其中该修饰由附着 至根据本发明的核酸的PEG部分组成。如本文所优选使用的，HES化 是根据本发明的核酸的修饰，其中该修饰由附着至根据本发明的核酸 的HES部分组成。这些修饰物以及用此类修饰物来修饰核酸的方法在 欧洲专利申请EP 1 306 382中描述，该专利申请的公开内容在此通过 提及而整体合并入本文中。
优选地，由高分子量部分组成或包含高分子量部分的修饰物的分 子量，特别地在PEG作为此类高分子量部分的情况下为约2,000至 200,000Da，优选20,000至120,000Da，并且特别地在HES作为此 类高分子量部分的情况下优选为约3,000至180,000Da，更优选5,000 至130,000Da。HES修饰方法(例如)在德国专利申请DE 1 2004 006 249.8中描述，该专利申请的公开内容在此通过提及而整体合并入本 文中。
在本发明的范围内的是，PEG和HES中的任一者可以以直链或支 化的形式使用，如在专利申请WO2005074993和PCT/EP02/11950中进 一步描述的。原则上，此类修饰可以在本发明的核酸分子的任何位置 处进行。优选地，此类修饰在5’-末端核苷酸上、在3’-末端核苷酸 上和/或在该核酸分子的5’核苷酸和3’核苷酸之间的任意核苷酸上 进行。
该修饰物并且优选PEG和/或HES部分，可以或直接或通过连接体 附着至本发明的核酸分子上。同样也在本发明的范围内的是，根据本 发明的核酸分子包含一个或多个修饰物，优选一个或多个PEG和/或 HES部分。在一个实施方案中，独个连接体分子将超过一个的PEG部 分或HES部分附着至根据本发明的核酸分子。在本发明中使用的连接 体可以本身是直链的或支化的。这种类型的连接体是本领域技术人员 已知的并且在专利申请WO2005074993和PCT/EP02/11950中进一步描 述。
不希望受任何理论的束缚，看起来通过用高分子量部分例如聚合 物并且更特别是本文所公开的聚合物(其优选为生理学上可接受的) 来修饰根据本发明的核酸，改变了分泌动力学。更具体而言，看起来 由于这种经修饰的本发明核酸的分子量增加并且由于该核酸不经历代 谢(特别是在L形式时)，减少了从动物体内，优选从哺乳动物体内， 和更优选从人体内的分泌。由于分泌通常通过肾脏发生，因此本发明 人推测：经如此修饰的核酸的肾小球滤过率相比于不具有这种类型的 高分子量修饰的核酸显著减小，这导致在体内的停留时间增加。与之 相关，特别值得注意的是，尽管具有这种高分子量修饰，但是根据本 发明的核酸的特异性没有受到有害的影响。在这种情况下，根据本发 明的核酸具有令人惊讶的特征(该特征通常不能从药物学活性化合物 中预期)，从而使得不必需要具有持续释放性质的药物制剂以提供持续 释放。而是，以它们包含高分子量部分的修饰形式，根据本发明的核 酸本身就可用作持续释放制剂。在这种情况下，如本文所公开的核酸 分子的修饰和经如此修饰的核酸分子以及任何包含其的组合物可以提 供不同的，优选受控的药物动力学及其生物分布。这还包括在循环中 的停留时间和分配到组织中。此类修饰在专利申请PCT/EP02/11950 中有进一步的描述。
然而，同样也在本发明的范围内的是，本文所公开的核酸不包含 任何修饰，并且特别是不包含高分子量修饰例如PEG化或HES化。当 核酸显示出优先分配到体内的任何靶器官或组织时，这种实施方案是 特别优选的。具有这种分配特性的核酸试剂将使得能够在靶组织中建 立有效的局部浓度，同时保持低的全身浓度。这将使得能够使用低剂 量，这不但从经济学观点来说是有利的，而且还减少了其他组织对于 该核酸试剂的非必需的暴露，从而降低了潜在的副作用风险。
本发明的核酸(其在本文中也称为根据本发明的核酸)和/或根据 本发明的拮抗剂可用于产生或制备药剂。根据本发明的此类药剂或药 物组合物包含任选地与其他药物学活性化合物组合在一起的至少一种 本发明的核酸，其中本发明的核酸优选地本身用作药物学活性化合物。 在优选的实施方案中，此类药剂至少包含可药用载体。此类载体可以 是例如水、缓冲液、PBS、葡萄糖溶液(优选5％葡萄糖的盐平衡溶液)、 淀粉、糖、明胶或任何其他可接受的载体物质。此类载体通常是本领 域技术人员已知的。本领域技术人员将公认，本发明药剂的任何实施 方案、用途和方面或者与之相关的实施方案、用途和方面也可应用于 本发明的药物组合物，反之亦然。
用根据本发明的或根据本发明制备的核酸、药物组合物和药剂来 进行治疗和/或预防的适应症、疾病和病症是由于MCP-1直接或间接参 与各自的致病机理所致。然而，还可以治疗和预防MCP-2、MCP-3、MCP-4 和/或嗜酸性粒细胞趋化因子直接或间接参与了其致病机理的那些适 应症、疾病和病症。对本领域技术人员来说显而易见的是，特别是根 据本发明的那些核酸可以在这种范围内使用，即用于更广义地涉及 MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子的疾病，所述核酸分 别结合至MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子或与之相互 作用。
更具体而言，此类用途尤其起因于MCP-1的表达模式，这暗示了 其在特征为单核细胞浸润的人疾病中起重要作用。这种细胞浸润存在 于许多炎性疾病和自身免疫疾病中。
在动物模型中，已经显示，MCP-1在局灶性缺血后(Kim 1995； Wang1995)和在实验性自身免疫性脑脊髓炎期间(Hulkower 1993； Ransohoff 1993；Banisor 2005)于脑中表达。MCP-1可能是在由这 些动物模型所说明的疾病过程(例如中风和多发性硬化症)中靶向单 核细胞的重要趋化因子。
大量的证据支持这样的观点，即MCP-1/CCR2轴在单核细胞的趋化 过程中并因而在慢性炎症中具有独特的作用：(i)MCP-1或CCR2缺陷 型小鼠显示出显著减少的巨噬细胞趋化应答而在其他方面表现正常 (Kuziel 1997；Kurihara 1997；Boring 1997；Lu 1998)。(ii)尽 管在体外与其他趋化因子呈现出功能冗余，但在几种炎症模型中仅 MCP-1效应子功能的丧失才足以损害单核细胞的运输(Lloyd 1997； Furuichi 2003；Egashira 2002；Galasso 2000；Ogata 1997；Kennedy 1998；Gonzalo 1998；Kitamoto 2003)。(iii)在许多炎性疾病中MCP-1 的水平升高。事实上，MCP-1被认为在许多具有或没有明显炎性成分 的疾病中起作用，例如类风湿性关节炎(Koch 1992；Hosaka 1994； Akahoshi 1993；Harigai 1993；Rollins 1996)、肾病(Wada 1996； Viedt 2002)、血管成形术后再狭窄(Economou 2001)、变态反应和哮 喘(Alam 1996；Holgate 1997；Gonzalo 1998)、癌症(Salcedo 2000； Gordillo 2004)、动脉粥样硬化(Nelken 1991；Yla-Herttuala 1991； Schwartz 1993；Takeya 1993；Boring 1998)、牛皮癣(Vestergaard 2004)、神经系统炎症(Huang 2001)、特应性皮炎(Kaburagi 2001)、 结肠炎(Okuno 2002)、子宫内膜异位(Jolicoeur 2001)、眼色素层 炎(Tuaillon 2002)、视网膜病症(Nakazawa 2007)、特发性肺纤维 化和结节病(Iyonaga 1994)以及多肌炎/皮肌炎(De Bleecker 2002)。
使用抗-MCP-1试剂或CCR2拮抗剂的治疗性干预将会影响过量的 炎性单核细胞运输，但可以保留基本的巨噬细胞运输，从而避免全面 的免疫抑制和增加的感染风险(Dawson 2003)。
另外，基于对于炎症过程的分子机制和对于局部分泌的炎症介质 的相互作用的不断增加的认识，已经鉴定了用于治疗肾病的新靶标 (Holdsworth 2000；Segerer 2000)。那些靶标之一是MCP-1，对于 所述的那些靶标，存在大量的有关在合适的动物模型中用特异性拮抗 剂进行的表达和干预研究方面的数据。这种蛋白质对于将免疫细胞募 集到肾脏炎症的位点来说具有广泛地非冗余的作用。免疫细胞对肾脏 的浸润被认为在各种类型的肾病的发展中是结构性肾损伤和肾功能衰 退的主要机制。
所有类型的肾细胞在体外受到刺激时可以表达趋化因子，包括 MCP-1(Segerer 2000)；存在大量在体外引发MCP-1表达的刺激，包 括细胞因子、氧自由基、免疫复合物和脂质介质。
在大鼠和小鼠的健康肾脏中，MCP-1不表达，但是其在急性和慢 性的肾脏炎症啮齿动物模型的过程中容易被上调，所述模型包括免疫 复合物性肾小球肾炎、急骤进展性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎、 糖尿病性肾病、梗阻性肾病或急性肾小管坏死(Segerer 2000；Anders 2003)。MCP-1在啮齿动物中的表达数据与在人肾脏活组织检查中所发 现的相应的表达非常相关(Rovin 1994；Cockwell 1998；Wada 1999)。 此外，人肾脏中的肾表达与疾病活动度(disease activity)相关， 并且在合适的治疗导致疾病缓解时降低(Amann 2003)。
肾小球的单核细胞浸润与患有糖尿病性肾病的患者中的弥漫性肾 小球硬化的发展有关。MCP-1在肾小球内单核细胞和淋巴细胞的募集 和聚集中起重要作用(Banba 2000；Morii 2003)。
局部产生的MCP-1看来似乎特别是参与了肾小管间质损害的起始 和进展，如在使用患有肾毒性血清诱导的肾炎(NSN)的转基因小鼠进 行的实验中所证明的。主要是在血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和浸 润的单核细胞(在间质损害中)中检测到了MCP-1。MCP-1介导的肾小 管上皮细胞的激活与下列观念相一致：MCP-1促进了肾小管间质性炎 症(其为进行性肾病的标志)(Wada 2001；Viedt 2002)。
由于在一方面的MCP-1和另一方面的MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜 酸性粒细胞趋化因子之间的同源性，根据本发明的核酸，至少它们中 分别与MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子结合或与之相 互作用的那些核酸通常可以用于治疗、预防和/或诊断任何这样的疾 病，在所述疾病中分别有MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化 因子的直接或间接的参与。如本文优选使用的，“参与”表示，如果各 个参与该疾病的分子被阻止发挥其与该疾病的根本致病机理相关的功 能中的一种、几种或全部，则该疾病将会被治愈或其程度将会减轻或 其发作将会被阻止；至少此类疾病的症状或任何指示物(indicator) 将分别得到减轻和改善，从而使得所述症状和指示物分别与在未患该 疾病或不具有形成此类疾病的风险的受试者中所观察到的相同或相 近。
当然，由于根据本发明的结合MCP-1的核酸与人或鼠MCP-1相互 作用或与之结合，因此技术人员通常将会理解，根据本发明的结合 MCP-1的核酸可以容易地用于治疗、预防和/或诊断人和动物的如本文 所描述的任何疾病。
因此，单核细胞化学吸引蛋白(MCP)家族的这些成员，即MCP-2、 MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子，与MCP-1具有高度的序列相 似性。尽管不是排它性的，嗜酸性粒细胞趋化因子、MCP-2、MCP-3和 MCP-4经由CCR3(人嗜酸性粒细胞上的特征性的趋化因子受体)相互 作用(Heath 1997)。CCR3受体在赘生性病状，例如皮肤T细胞淋巴 瘤(Kleinhans 2003)、胶质母细胞瘤(Kouno 2004)或肾细胞癌(Johrer 2005)中被上调。
更特别地，增加的嗜酸性粒细胞趋化因子水平与哮喘诊断和受损 的肺功能直接相关(Nakamura 1999)。已经在特应性和非特应性哮喘 中均观察到嗜酸性粒细胞趋化因子在过敏性炎症位点处的表达增加 (Ying 1997；Ying 1999)。此外，编码MCP-2和MCP-4的mRNA在 各种组织中组成性地表达；但是它们在这些背景下的生理功能是未知 的。血浆MCP-2水平在脓毒症中与MCP-1一起增加(Bossink 1995)； MCP-3的表达在哮喘中发生(Humbert 1997)。最后，在动脉粥样硬 化的脉管的腔表面上可以发现MCP-4(Berkhout 1997)。
因此，可以用根据本发明的药剂进行治疗和/或预防的疾病和/或 病症和/或患病状况包括但不限于：炎性疾病，自身免疫疾病，自身免 疫性脑脊髓炎，中风，急性和慢性多发性硬化症，慢性炎症，类风湿 性关节炎，肾病，再狭窄，血管成形术后再狭窄，急性和慢性变态反 应，原发性和继发性免疫反应或变态反应，哮喘，结膜炎，支气管炎， 癌症，动脉粥样硬化，动脉硬化性心血管心力衰竭或中风，牛皮癣， 牛皮癣性关节炎，神经系统炎症，特应性皮炎，结肠炎，子宫内膜异 位，眼色素层炎，视网膜病症，包括黄斑变性、视网膜脱离、糖尿病 性视网膜病变、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎、增殖性玻璃体 视网膜病变和浆液性中心性脉络膜视网膜病变；特发性肺纤维化，结 节病，多肌炎，皮肌炎，避免免疫抑制，降低感染风险，脓毒症，肾 脏炎症，肾小球肾炎，急骤进展性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎， 糖尿病性肾病，梗阻性肾病，急性肾小管坏死，和弥漫性肾小球硬化， 全身性红斑狼疮，慢性支气管炎，贝赫切特病，肌萎缩性脊髓侧索硬 化(ALS)，川畸病之后的过早动脉粥样硬化，心肌梗死，肥胖症，慢 性肝病，佩罗尼病，急性脊髓损伤，肺或肾移植，心肌炎，阿尔茨海 默病和神经病，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，卵巢癌，错构瘤，结肠直肠 癌，结肠腺瘤，胰腺炎，慢性阻塞性肺部疾病(COPD)，和炎性肠病 例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在其他实施方案中，所述药剂包含另外的药物学活性试剂。此类 另外的药物学活性化合物尤其是(但不限于此)已知能控制血压和糖 尿病的那些，例如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素受体 阻断剂。在另外的实施方案中，所述另外的药物学活性化合物也可以 是减少免疫细胞浸润至慢性炎症位点中或一般地抑制过度的免疫应答 (所述过度的免疫应答存在于慢性炎症位置中并导致组织损伤)的那 些化合物中的一种。此类化合物可以是但不限于类固醇或免疫抑制剂， 并且优选选自皮质类固醇(例如泼尼松、甲泼尼龙、氢化可的松、地 塞米松)和通用免疫抑制剂(例如环磷酰胺、环孢素、苯丁酸氮芥、 硫唑嘌呤、他克莫司或吗替麦考酚酸酯)。另外，T-细胞共刺激的更特 异的阻断剂，如CD154或CD40或CD28或CD86或CD80的阻断剂；或 者T-细胞和/或B-细胞耗竭剂，如抗-CD20试剂，可用于其他实施方 案。最后，另外的药物学活性试剂可以是任何其他趋化因子的活性的 调节剂，其可以是趋化因子激动剂或拮抗剂或者趋化因子受体激动剂 或拮抗剂。备选地，或另外地，此类另外的药物学活性试剂是其他的 根据本发明的核酸。备选地，所述药剂包含至少多于一种这样的核酸， 所述核酸结合不同于MCP-1的靶分子或者显示出与根据本发明的核酸 的功能不同的功能。
在本发明的范围内，原则上将所述药剂备选地或另外地用于预防 任何在所述药剂用于治疗所述疾病的用途方面所公开的疾病。因此， 各自的标记物，即各自疾病的各自标记物，是本领域技术人员已知的。 优选地，各自的标记是MCP-1。备选地和/或另外地，各自的标记选自 MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子。另外一组标记物选 自血浆中的自身反应性抗体(例如抗-dsDNA抗体)或类风湿因子。
在本发明的药剂的一个实施方案中，将这种药剂与用于任何本文 所公开的疾病(特别是，将使用本发明的药剂进行治疗的那些疾病) 的其他治疗联合使用。
“联合疗法(combination therapy)”(或“综合疗法 (co-therapy)”)包括施用本发明的药剂和至少另一种试剂作为具体 治疗方案的一部分，以期望从这些治疗剂即本发明的药剂和所述另一 种试剂的共同作用中提供有益效应。这种联合的有益效应包括但不限 于由治疗剂的联合而产生的药物动力学或药效动力学共同作用。这些 治疗剂的联合施用通常在限定的时间内完成(通常为数分钟、数小时、 数天或数周，这取决于所选择的组合)。
“联合疗法”意在包括(但通常不包括)施用两种或更多种这些 治疗剂作为分开的单一疗法方案的一部分，所述单一疗法方案偶然地 地和不定地导致本发明的联合。“联合疗法”旨在包括以连续的方式 施用这些治疗剂，也就是说，其中每种治疗剂在不同的时间施用，以 及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或所述治疗剂中的至少两种。 基本上同时施用可以例如通过下列方式来完成：将具有固定比例的每 种治疗剂的单个胶囊或者将多个关于每种治疗剂的单胶囊施用给受试 者。
每种治疗剂的顺次施用或基本上同时施用可以通过任何合适的途 径来实现，包括但不限于局部途径、口服途径、静脉内途径、肌内途 径和经过粘膜组织的直接吸收。治疗剂可以通过相同的途径或通过不 同的途径施用。例如，所选择的联合的第一种治疗剂可以通过注射施 用而该联合中的其他治疗剂可以局部施用。
备选地，例如，所有治疗剂可以局部施用或者所有治疗剂可以通 过注射施用。治疗剂的施用顺序不是严格重要的，除非另外说明。“联 合疗法”还可以包括将如上所述的治疗剂以与其他生物活性成分的进 一步联合形式进行施用。如果联合疗法还包括非药物治疗，则该非药 物治疗可以在任何合适的时间进行，只要能实现从治疗剂和非药物治 疗的联合的共同作用中获得有益效应。例如，在适当的情况下，当非 药物治疗在时间上距离治疗剂的施用可能有几天或甚至几周时，仍然 能够达到有益效应。
如在上述通用术语中所论述的，根据本发明的药剂原则上可以以 本领域技术人员已知的任何形式施用。优选的施用途径是全身性施用， 更优选地，其通过肠胃外施用，优选通过注射施用来进行。备选地， 药剂可以局部施用。其他施用途径包括肌内、腹膜内和皮下、经口、 鼻内、气管内或肺部施用，优先选择侵入性最低并同时确保效力的施 用途径。
肠胃外施用通常用于皮下、肌内或静脉内注射和输注。另外，一 种用于肠胃外施用的方法采用了本领域技术人员熟知的缓释或持续释 放系统的植入，其确保维持恒定的剂量水平。
此外，本发明的优选药剂可以通过局部使用合适的鼻内媒介物 (vehicle)、吸入剂来以鼻内形式进行施用，或者可以采用那些本领 域技术人员所熟知的透皮贴剂的形式通过经皮途径进行施用。为了以 透皮递送系统的形式施用，在整个给药方案过程中，剂量的施用将(当 然)是连续的而不是间歇性的。其他优选的局部制剂包括乳膏剂、软 膏剂、洗剂、气雾喷雾剂和凝胶剂，其中活性成分的浓度的范围通常 将是0.01％至15％(w/w或w/v)。
本发明的药剂将通常包含溶解或分散于可药用介质中的有效量的 治疗活性成分，包括但不限于本发明的核酸分子。可药用介质或载体 包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗 剂和吸收延迟剂等。对于药物学活性物质使用此类介质和试剂是本领 域熟知的。补充的活性成分也可以掺入本发明的药剂中。
在进一步的方面，本发明涉及药物组合物。此类药物组合物包含 至少一种根据本发明的核酸并且优选包含可药用媒介物。此类媒介物 可以是本领域使用的和/或已知的任何媒介物或任何粘合剂。更特别 地，此类粘合剂或媒介物是任何在关于本文所公开的药剂的制备时所 论述的粘合剂或媒介物。在进一步的实施方案中，药物组合物包含另 外的药物学活性试剂。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道药剂和药物组合物的制 备。通常，此类组合物可以制备成注射剂(作为液体溶液或悬浮液)； 制备成适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式；制备成用于 口服施用的片剂或其他固体剂；制备成定时释放胶囊；或制备成当前 使用的任何其他形式，包括滴眼剂、乳膏剂、洗剂、油膏剂、吸入剂 等。由外科医生、内科医生或卫生保健工作者使用无菌制剂(例如基 于盐水的洗液)来处理手术区中的特殊区域也是特别有用的。组合物 也可以通过微型装置、微颗粒或海绵递送。
在配制后，药剂将以与剂量制剂相容的方式并以药理学有效的量 施用。制剂容易地以各种剂型，例如上述的可注射溶液的类型进行施 用，但是也可以采用药物释放胶囊等。
在该情形中，待施用的活性成分的量和组合物的体积取决于待治 疗的个体或受试者。对于施用而言所必需的活性化合物的具体量取决 于从业者的判断，并且对于每个个体是特殊的。
通常利用对于分散活性化合物而言所必需的最小体积的药剂。合 适的施用方案也是可变的，但是典型的是：最初施用所述化合物并监 测结果，然后以进一步的时间间隔提供进一步的受控剂量。
例如，对于以片剂或胶囊(例如明胶胶囊)形式的口服施用，活 性药物成分即本发明的核酸分子和/或任何另外的药物学活性试剂(在 本文中也称为治疗剂或活性化合物)可以与口服的、无毒的、可药用 的惰性载体例如乙醇、甘油、水等相组合。而且，当期望或需要时， 也可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合 适的粘合剂包括淀粉，硅酸镁铝，淀粉浆，明胶，甲基纤维素，羧甲 基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖类例如葡萄糖或β-乳糖， 玉米增甜剂，天然和合成的树胶例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠，聚 乙二醇，蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、 硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、 它的镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。崩解剂包括但不限于，淀粉、甲基 纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐、或泡腾 混合物等。稀释剂包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、 纤维素和/或甘氨酸。
本发明的药剂还可以以诸如定时释放和持续释放片剂或胶囊、丸 剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂的口服剂型 来进行施用。有利地由脂肪乳浊液或悬浮液制备栓剂。
药物组合物或药剂可以是经灭菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、 稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂(solution promoter)、用于 调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以包含其他在治疗上有 价值的物质。组合物根据传统的混合、粒化或包覆方法来制备，并且 通常含有约0.1％至75％，优选约1％至50％的活性成分。
液体的(特别是可注射的)组合物可以例如通过溶解、分散等来 制备。将活性化合物溶解于在药物学上纯的溶剂(例如水、盐水、含 水右旋糖、甘油、乙醇等)中或与之混合从而形成可注射的溶液或悬 浮液。另外，可以配制适合于在注射前溶解于液体中的固体形式。
对于固体组合物，赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬 脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。还可以 用例如聚亚烷基二醇如丙二醇作为载体将上文限定的活性化合物配制 成栓剂。在一些实施方案中，栓剂有利地由脂肪乳浊液或悬浮液制备。
各自地，本发明的药剂和核酸分子也可以以脂质体递送系统例如 小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式施用。脂质体可以由各种 磷脂(包含胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱)组成。在一些实施方案中， 将脂质成分的薄膜与药物水溶液水合以形成包囊该药物的脂质层，这 是本领域技术人员熟知的。例如，可以作为用本领域已知方法构建的 与亲脂化合物或非免疫原性高分子量化合物的复合物来提供本文所描 述的核酸分子。另外，脂质体可以在它们的表面上携带有此类核酸分 子，以便用于靶向和在内部携带细胞毒性试剂来介导细胞杀死。核酸 相关的复合物的实例在美国专利号6,011,020中提供。
各自地，本发明的药剂和核酸分子也可以与作为可靶向的药物载 体的可溶聚合物相偶联。此类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃 共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚 (polyhydroxyethylaspanamidephenol)或聚环氧乙烷聚赖氨酸，其 用棕榈酰残基取代。此外，各自地，本发明的药剂和核酸分子可以偶 联至一类可用于实现药物的受控释放的可生物降解的聚合物，例如聚 乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛类、聚二氢吡喃、 聚氰基丙烯酸酯类以及水凝胶的交联或两亲性的嵌段共聚物。
如果需要，各自待施用的药物组合物和药剂还可以含有较少量的 非毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其他物质例如 乙酸钠和三乙醇胺油酸酯。
各自使用本发明的核酸分子和药剂的给药方案可以根据多种因素 进行选择，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况； 待治疗的病状的严重度；施用途径；患者的肾和肝的功能；以及所采 用的具体适体或其盐。普通医师或兽医能够容易地确定和规定对于预 防、对抗或阻止病状进展而言所需的药物的有效量。
在治疗本文所公开的任何疾病中，根据本发明的核酸的有效血浆 水平的范围优选为500fM至500μM。
各自地，本发明的核酸分子和药剂可优选地以单次日剂量、每两 天或每三天、每周、每两周、以单次月剂量或者每三个月进行施用。
在本发明的范围内，本文所描述的药剂组成了本文所公开的药物 组合物。
在另外的方面，本发明涉及用于治疗需要这种治疗的受试者的方 法，其中该方法包括施用药物学活性量的至少一种根据本发明的核酸。 在一个实施方案中，受试者患有疾病或处于发展出该疾病的风险中， 其中该疾病是任何本文所公开的那些，特别是在关于任何根据本发明 的核酸用于制备药剂的用途时所公开的那些疾病中的任何一种。
应当理解，根据本发明的核酸以及拮抗剂不仅可用作药剂或用于 制备药剂，而且还可用于美容目的，特别是与MCP-1参与发炎的区域 性皮肤损害有关的美容目的。因此，根据本发明的核酸、药剂和/或药 物组合物可用于治疗或预防的其他病状或疾病是发炎的区域性皮肤损 害。
如本文优选使用的，诊断或诊断剂或诊断工具适合于直接或间接 地检测MCP-1，优选如本文所描述的MCP-1，和更优选如本文在关于本 文所描述的各种病症和疾病时所描述的MCP-1。然而，就根据本发明 的核酸分子也结合MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒细胞趋化因子中 的任何、一些或所有来说，此类核酸分子还可以分别用于诊断致病机 理直接或间接地与MCP-2、MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒细胞趋化因子 的过表达或过度活性相关或相关联的疾病和病症。该诊断适合于检测 和/或随访任何各自在本文中所描述的病症和疾病。此类检测通过根据 本发明的核酸与MCP-1的结合而成为可能。可以直接或间接地检测这 种结合。相应的方法和工具是本领域技术人员已知的。尤其是，根据 本发明的核酸可以包含标记，所述标记使得能够检测根据本发明的核 酸，优选结合至MCP-1的核酸。此类标记优选选自放射性标记、酶标 记和荧光标记。原则上，所有已知的对于抗体而开发的测定法都可用 于根据本发明的核酸，但是将靶结合性抗体替换成了靶结合性核酸。 在使用未标记的靶结合性抗体的抗体-测定法中，检测优选通过二抗来 进行，所述二抗用放射性标记、酶标记和荧光标记进行修饰并且在其 Fc-片段处结合该靶结合性抗体。在核酸，优选根据本发明的核酸的情 形中，核酸用这样的标记进行修饰，其中优选地，这种标记选自生物 素、Cy-3和Cy-5，并且这种标记通过针对此类标记的抗体例如抗生物 素抗体、抗Cy3抗体或抗Cy5抗体进行检测，或者在标记是生物素的 情况下，该标记通过天然结合生物素的链霉抗生物素蛋白或抗生物素 蛋白进行检测。继而，将此类抗体、链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋 白优选地用相应的标记例如放射性标记、酶标记或荧光标记进行修饰 (如同二抗一样)。
在另外的实施方案中，根据本发明的核酸分子通过第二种检测工 具进行检测或分析，其中所述检测工具是分子信标。分子信标的方法 学是本领域技术人员已知的。简而言之，核酸探针(其也称为分子信 标)是待检测的核酸样品的反向互补序列并因而能够与待检测的核酸 样品的部分杂交。在结合至核酸样品后，分子信标的荧光基团分开， 这导致荧光信号的变化，优选为强度的变化。这种变化与存在的核酸 样品的量相关。
应该承认，用根据本发明的核酸来检测MCP-1将特别使得能够检 测如本文所定义的MCP-1。
关于MCP-1的检测，优选的方法包括下列步骤：
(a)提供样品，其待就MCP-1的存在进行检测，
(b)提供根据本发明的核酸，
(c)让所述样品与所述核酸反应，优选在反应容器中进行反应，
其中步骤(a)可以在步骤(b)之前进行，或者步骤(b)可以在步骤(a) 之前进行。
在一个优选的实施方案中，提供了另外的步骤d)，其在于检测样 品与核酸的反应。优选地，将步骤b)的核酸固定至表面。该表面可以 是反应容器例如反应管、平板上的孔的表面，或者可以是包含于该反 应容器中的装置(例如珠)的表面。将核酸固定至该表面可以通过任 何本领域技术人员已知的手段来完成，包括但不限于非共价或共价连 接。优选地，通过在表面和核酸之间的共价化学键来建立连接。然而， 同样也在本发明范围内的是，将核酸间接地固定至表面，其中这种间 接固定涉及使用另外的组分或一对相互作用伙伴(interaction partner)。这种另外的组分优选为与待固定的核酸特异性地相互作用 的化合物(其也称为相互作用伙伴)，并因而介导核酸附着至该表面。 相互作用伙伴优选选自核酸、多肽、蛋白质和抗体。优选地，相互作 用伙伴为抗体，更优选为单克隆抗体。备选地，相互作用伙伴为核酸， 优选为功能性核酸。更优选地，此类功能性核酸选自适体、镜像异构 体和至少与该核酸部分互补的核酸。在另外的备选的实施方案中，核 酸与表面的结合由多分体相互作用伙伴(multi-partite interaction partner)介导。这种多分体相互作用伙伴优选为由第一个成员和第二 个成员组成的一对相互作用伙伴或一个相互作用伙伴，其中第一个成 员包含在该核酸中或与其连接，而第二个成员连接至该表面或包含在 该表面内。多分体相互作用伙伴优选选自包括生物素和抗生物素蛋白、 生物素和链霉抗生物素蛋白、以及生物素和中性链霉抗生物素蛋白 (neutravidin)的相互作用伙伴对。优选地，该相互作用伙伴对的第 一个成员是生物素。
该方法的优选的结果是形成了MCP-1和所述核酸的经固定的复合 物，其中更优选地，检测到所述复合物。在实施方案范围内的是，从 该复合物中检测出MCP-1。
符合这一需要的相应的检测工具是例如任何对于MCP-1的那个/ 那些部分特异的检测工具。特别优选的检测工具是选自核酸、多肽、 蛋白质和抗体的检测工具，所述检测工具的产生是本领域技术人员已 知的。
所述用于检测MCP-1的方法还包括将样品从已经优选地用于实施 步骤c)的反应容器中移除。
在另外的实施方案中，所述方法还包括将MCP-1的相互作用伙伴 固定在表面(优选如上定义的表面)上的步骤，其中该相互作用伙伴 是如本文中定义的，和优选如上面在关于相应的方法时所定义的，并 且更优选在它们的各种实施方案中包括核酸、多肽、蛋白质和抗体。 在这个实施方案中，特别优选的检测工具是根据本发明的核酸，其中 此类核酸可优选为经标记的或未标记的。在此类核酸为经标记的情况 下，它可以直接或间接地被检测。这种检测也可以涉及第二种检测工 具的使用，所述第二种检测工具也优选选自核酸、多肽、蛋白质和在 本文所描述的各种实施方案中的具体形式。此类检测工具优选为对于 根据本发明的核酸是特异性的。在更优选的实施方案中，第二种检测 工具是分子信标。在优选的实施方案中，所述核酸或所述第二种检测 工具或两者可以包含检测标记。所述检测标记优选选自生物素、溴脱 氧尿苷标记、洋地黄毒苷标记、荧光标记、UV-标记、放射性标记和螯 合剂分子。备选地，所述第二种检测工具与优选由该核酸所含有、由 该核酸所包含或附着至该核酸的检测标记相互作用。特别优选的组合 如下：
检测标记是生物素而第二种检测工具是针对生物素的抗体，或其 中
检测标记是生物素而第二种检测工具是抗生物素蛋白或携带抗生 物素蛋白的分子，或其中
检测标记是生物素而第二种检测工具是链霉抗生物素蛋白或携带 链霉抗生物素蛋白的分子，或其中
检测标记是生物素而第二种检测工具是中性链霉抗生物素蛋白或 携带中性链霉抗生物素蛋白的分子，或者
其中检测标记是溴脱氧尿苷而第二种检测工具是针对溴脱氧尿苷 的抗体，或其中
检测标记是洋地黄毒苷而第二种检测工具是针对洋地黄毒苷的抗 体，或其中
检测标记是螯合剂而第二种检测工具是放射性核素，
其中所述检测标记优选附着至所述核酸。将公认的是，这种类型 的组合也可以应用于其中核酸附着至表面的实施方案。在这种实施方 案中，检测标记优选附着至相互作用伙伴。
最后，同样也在本发明的范围内的是，用第三种检测工具检测第 二种检测工具，优选地，第三种检测工具是酶，更优选地为在检测第 二种检测工具时显示出酶促反应的酶，或者第三种检测工具是用于检 测辐射(更优选地，由放射性核素发射的辐射)的工具。优选地，第 三种检测工具特异性地检测第二种检测工具和/或与第二种检测工具 相互作用。
此外，在将MCP-1的相互作用伙伴固定在表面上并将根据本发明 的核酸优选加入至在相互作用伙伴和MCP-1之间形成的复合物中的实 施方案之中，可以将样品从反应体系中移除，更优选地从在其中进行 步骤c)和/或d)的反应容器中移除。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸包含荧光部分，并且其中 该荧光部分的荧光在所述核酸与MCP-1之间形成复合物和在所述核酸 与游离的MCP-1之间形成复合物时是不同的。
在另外的实施方案中，所述核酸是根据本发明的核酸的衍生物， 其中所述核酸的衍生物包含至少一种腺苷的荧光衍生物以替换腺苷。 在优选的实施方案中，所述腺苷的荧光衍生物是亚乙烯基腺苷。
在另外的实施方案中，利用荧光来检测由根据本发明的核酸的衍 生物和MCP-1组成的复合物。
在所述方法的一个实施方案中，信号在步骤(c)或步骤(d)中产生， 并且优选地，所述信号与样品中MCP-1的浓度相关。
在一个优选的方面，所述测定法可以在96孔板中进行，其中将成 分固定在如上描述的反应容器中并且将孔用作反应容器。
本领域技术人员将公认，至少就根据本发明的核酸也结合至 MCP-2、MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒细胞趋化因子或与之结合来说， 上文中所描述的内容也适用于MCP-2、MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒细 胞趋化因子。
本发明的核酸可以进一步用作用于药物设计的起始材料。主要存 在两种可能的方法。一种方法是筛选化合物文库，而此类化合物文库 优选为低分子量化合物文库。在一个实施方案中，所述筛选是高通量 筛选。优选地，高通量筛选是在基于靶标的测定法中对化合物进行快 速且有效的试错法(trial-and-error)评估。该分析最好是通过比色 测量法来进行。与之相关使用的文库是本领域技术人员已知的。
备选地，根据本发明的核酸可用于药物的合理设计。优选地，合 理药物设计是设计药物学先导结构。从靶标的三维结构开始，用计算 机程序把包含许多不同化合物的结构的数据库搜索一遍，所述三维结 构通常通过诸如X射线晶体学或核磁共振光谱学之类的方法来确定。 该选择通过计算机来完成，随后可在实验室中测试所确定的化合物。
合理药物设计可以从任何根据本发明的核酸开始，并涉及与本发 明核酸的结构相似的或与本发明核酸的结构中的介导结合的部分相同 的结构，优选三维结构。在任何情况下，此类结构仍然显示出与本发 明的核酸相同或相似的结合特征。在合理药物设计中的进一步的步骤 中或作为备选的步骤，优选地用不同于核苷酸和核酸的化学基团来模 拟结合至神经递质的所述核酸的那些部分的三维结构。通过这种模拟， 可以设计出不同于所述核酸的化合物。此类化合物优选为小分子或肽。
在例如通过使用本领域技术人员已知的竞争性测定法来筛选化合 物文库的情况下，可以发现合适的MCP-1类似物、MCP-1激动剂或MCP-1 拮抗剂。这种竞争性测定法可以如下建立。将本发明的核酸，优选作 为结合靶标的L-核酸的镜像异构体偶联至固相。为了鉴定MCP-1类似 物，可以将经标记的MCP-1加入至该测定法。潜在的类似物将与MCP-1 分子竞争结合该镜像异构体，这将伴随有通过相应标记获得的信号的 减少。筛选激动剂或拮抗剂可以涉及使用本领域技术人员已知的细胞 培养测定法。
根据本发明的试剂盒可以包含至少一种或几种本发明的核酸。另 外，试剂盒可以包含至少一种或几种阳性或阴性对照。阳性对照可以 例如是MCP-1，特别是针对其来选择本发明核酸或本发明核酸与其结 合的MCP-1，优选以液体形式。阴性对照可以例如是根据类似于MCP-1 的生物物理学性质而限定的肽，但是其不会被本发明的核酸所识别。 此外，所述试剂盒可以包含一种或几种缓冲液。各种成分可以以干燥 或冻干的形式，或者以溶解于液体中的形式包含在试剂盒中。试剂盒 可以包括一个或几个容器，所述容器继而可以包含一种或几种该试剂 盒的成分。在另外的实施方案中，试剂盒包括说明书或说明书散页， 其将有关如何使用试剂盒及其各种成分的信息提供给使用者。
根据本发明的核酸的药物学和生物分析测定主要用于评估它在几 种人体和非人体的体液、组织和器官中的药物动力学和生物动力学特 性。为这个目的，可以使用任何本文所公开的和本领域技术人员已知 的检测方法。在本发明的另外的方面，提供了用于检测根据本发明的 核酸的夹心杂交测定法。在该检测测定法中，使用了捕获探针和检测 探针。捕获探针与根据本发明的核酸的第一个部分互补，而检测探针 与根据本发明的核酸的第二个部分互补。捕获探针和检测探针都可以 由DNA核苷酸、经修饰的DNA核苷酸、经修饰的RNA核苷酸、RNA核 苷酸、LNA核苷酸和/或PNA核苷酸形成。
因此，捕获探针包含与根据本发明的核酸的5’-末端互补的序列 段，而检测探针包含与根据本发明的核酸的3’-末端互补的序列段。 在该情况下，将捕获探针经由其5’-末端固定至表面或基质，其中该 捕获探针可以在其5’-末端处直接固定，或者经由在其5’-末端和表 面或基质之间的连接体进行固定。然而，原则上，连接体可以连接至 捕获探针的每个核苷酸。连接体可以由本领域技术人员已知的亲水性 连接体形成，或者由D-DNA核苷酸、经修饰的D-DNA核苷酸、D-RNA 核苷酸、经修饰的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA 核苷酸、L-DNA核苷酸、经修饰的L-RNA核苷酸、经修饰的L-DNA核 苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
备选地，捕获探针包含与根据本发明的核酸的3’-末端互补的序 列段，而检测探针包含与根据本发明的核酸的5’-末端互补的序列段。 在该情况下，捕获探针经由其3’-末端固定至表面或基质，其中该捕 获探针可以在其3’-末端处直接固定，或者经由在其3’-末端和表面 或基质之间的连接体进行固定。然而，原则上，连接体可以连接至与 根据本发明的核酸互补的序列段的每个核苷酸。连接体可以由本领域 技术人员已知的亲水性连接体形成，或者由D-DNA核苷酸、经修饰的 D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、经修饰的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、 PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、经修饰的L-RNA核苷酸、 经修饰的L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
可以与根据本发明的核酸杂交的捕获探针和检测探针的核苷酸数 目是可变的并且可依赖于捕获和/或检测探针和/或根据本发明的核酸 自身的核苷酸数目。可与根据本发明的核酸杂交的捕获探针和检测探 针的核苷酸总数目的最大值应该是根据本发明的核酸所包含的核苷酸 数目。检测探针和捕获探针的核苷酸的最小数目(2至10个核苷酸) 应该使得能够分别与根据本发明的核酸的5’-末端或3’-末端杂交。 为了实现在根据本发明的核酸和存在于所分析的样品中的其他核酸之 间的高的特异性和选择性，捕获探针和检测探针的核苷酸总数目应该 是或者最多为根据本发明的核酸所包含的核苷酸数目。
此外，检测探针优选携带有如本文先前所描述的可检测的标记物 分子或标记。原则上，标记或标记物分子可以连接至检测探针的每个 核苷酸。优选地，标记或标记物位于检测探针的5’-末端或3’-末端， 其中在与根据本发明的核酸互补的检测探针内的核苷酸和所述标记之 间可以插入连接体。连接体可以由本领域技术人员已知的亲水性连接 体形成，或者由D-DNA核苷酸、经修饰的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷 酸、经修饰的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷 酸、L-DNA核苷酸、经修饰的L-RNA核苷酸、经修饰的L-DNA核苷酸 和/或L-LNA核苷酸形成。
根据本发明的核酸的检测可以如下进行：
将根据本发明的核酸以其一端与捕获探针杂交，并且以其另一端 与检测探针杂交。然后，通过例如一个或多个洗涤步骤来移除未结合 的检测探针。随后可以测量结合的检测探针的量，所述检测探针优选 携带有标记或标记物分子。
如本文优选使用的，术语“治疗”在一个优选的实施方案中额外 地或备选地包括预防和/或随访。
如本文优选使用的，如果没有指出与此相反，术语“疾病”和“病 症”应该以可交换的方式使用。
如本文使用的，术语“包含”优选地无意于限制该术语前面的主 题或由该术语所描述的主题。然而，在一个备选的实施方案中，术语 “包含”应该以容纳的含义理解，并因而理解为限制了该术语前面的 主题或由该术语所描述的主题。
本文所使用的根据本发明的核酸分子和靶分子MCP-1的各个序列 标识号、化学性质，其实际序列以及内部参考号概括在下表中。
本发明通过附图、实施例和序列表来进一步举例说明，从这些附 图、实施例和序列表中可获得另外的特征、实施方案和优点，其中
图1显示了结合人MCP-1的相关RNA配体的序列比对，其中指明 了在一个优选的实施方案中以其整体对于结合人MCP-1来说不可缺少 的序列基序(“1A型”)；
图2显示了结合人MCP-1的相关RNA配体以及RNA配体 180-D1-002的衍生物的序列比对，其中指明了在一个优选的实施方案 中以其整体对于结合人MCP-1来说不可缺少的序列基序(“1B型”)；
图3显示了结合人MCP-1的相关RNA配体的序列比对，其中指明 了在一个优选的实施方案中以其整体对于结合人MCP-1来说不可缺少 的序列基序(“2型”)；
图4显示了结合人MCP-1的相关RNA配体的序列比对，其中指明 了在一个优选的实施方案中以其整体对于结合人MCP-1来说不可缺少 的序列基序(“3型”)；
图5显示了RNA配体178-D5和181-A2(序列基序“3型”的人 MCP-1RNA配体)的衍生物；
图6显示了结合人MCP-1的相关RNA配体的序列比对，其中指明 了在一个优选的实施方案中以其整体对于结合人MCP-1来说不可缺少 的序列基序(“4型”)(其他序列)；
图7显示了几种不同的结合人MCP-1的RNA配体的序列的表格， 其不能与MCP-1结合性序列基序“1A型”、“1B型”、“2型”、“3型” 或“4型”相关；
图8显示了结合至鼠MCP-1的RNA配体188-A3-001和189-G7-001 的衍生物的比对；
图9显示了适体D-NOX-E36与生物素化的人D-MCP-1在室温和37 ℃下的结合分析的结果，表示为随生物素化的人D-MCP-1浓度而变化 的适体结合；
图10显示了适体D-mNOX-E36与生物素化的鼠D-MCP-1在37℃下 的结合分析的结果，表示为随生物素化的鼠D-MCP-1浓度而变化的适 体结合；
图11显示了在THP-1细胞中MCP-1诱导的Ca++-释放，其中获得 了关于人MCP-1的剂量-反应曲线，其中表明半数有效浓度(half effective concentration，EC50)为大约3nM，表示为随人MCP-1浓 度而变化的相对于空白的荧光差异；
图12显示了镜像异构体NOX-E36在钙释放测定法中的效力；细胞 用与各种量的镜像异构体NOX-E36在37℃下预孵育的3nM人MCP-1 进行刺激，表示为随NOX-E36浓度而变化的对照的百分比；
图13显示了镜像异构体mNOX-E36在钙释放测定法中的效力；细 胞用与各种量的镜像异构体mNOX-E36在37℃下预孵育的5nM鼠MCP-1 进行刺激，表示为随mNOX-E36浓度而变化的对照的百分比；
图14显示了人MCP-1诱导的THP-1细胞的趋化性，其中在THP-1 细胞朝向各种MCP-1浓度迁移3小时后，获得了关于MCP-1的剂量- 反应曲线，表示为随人MCP-1浓度而变化的相比于对照而言的X倍增 加；
图15显示了镜像异构体NOX-E36在趋化性测定法中的效力；让细 胞朝向与各种量的镜像异构体NOX-E36在37℃下预孵育的0.5nM人 MCP-1迁移，表示为随镜像异构体NOX-E36浓度而变化的对照的百分 比；
图16显示了镜像异构体mNOX-E36在趋化性测定法中的效力；让 细胞朝向与各种量的镜像异构体NOX-E36在37℃下预孵育的0.5nM 鼠MCP-1迁移，表示为随镜像异构体mNOX-E36浓度而变化的对照的百 分比；
图17显示了Biacore 2000传感图(sensorgram)，其指明了镜像 异构体NOX-E-36与人MCP-1(其通过胺偶联过程固定在PioneerF1传 感器芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应(RU)；
图18显示了Biacore 2000传感图，其指明了镜像异构体NOX-E36 与人MCP-家族蛋白质(huMCP-1、huMCP-2、huMCP-3)和人嗜酸性粒 细胞趋化因子(其通过胺偶联过程分别固定在PioneerF1和CM4传感 器芯片上)的结合，表示为随时间而变化的响应(RU)；
图19显示了Biacore 2000传感图，其指明了镜像异构体NOX-E36 与来自不同物种的MCP-1(犬MCP-1、猴MCP-1、人MCP-1、猪MCP-1、 兔MCP-1、小鼠MCP-1、大鼠MCP-1)(其中不同形式的MCP-1通过胺 偶联过程分别固定在PioneerF1和CM4传感器芯片上)的结合，表示 为随时间而变化的响应(RU)；
图20显示了Biacore 2000传感图，其指明了镜像异构体 181-A2-018与人MCP-1(其通过胺偶联过程固定在CM4传感器芯片上) 结合的KD值，表示为随时间而变化的响应(RU)；
图21显示了Biacore 2000传感图，其指明了镜像异构体 181-A2-018与人MCP-家族蛋白质(huMCP-1、huMCP-2、huMCP-3)和 人嗜酸性粒细胞趋化因子(其通过胺偶联过程分别固定在PioneerF1 和CM4传感器芯片上)的结合，表示为随时间而变化的响应(RU)；
图22显示了Biacore 2000传感图，其指明了镜像异构体 181-A2-018与来自不同物种的MCP-1(犬MCP-1、猴MCP-1、人MCP-1、 猪MCP-1、兔MCP-1、小鼠MCP-1、大鼠MCP-1)(其中不同形式的MCP-1 通过胺偶联过程分别固定在PioneerF1和CM4传感器芯片上)的结合， 表示为随时间而变化的响应(RU)；
图23显示了来自不同哺乳动物物种的MCP-1以及人MCP-2、MCP-3 和嗜酸性粒细胞趋化因子(仅位置1-76)的Clustal W比对；
图24A显示了概括了NOX-E36和181-A2-018对于来自不同哺乳动 物物种的MCP-1以及人MCP-2、MCP-3和嗜酸性粒细胞趋化因子的结合 特异性的表格；
图24B显示了概括了通过Biacore分析测定的NOX-E36的选择性 的表格，其中生物素化的NOX-E36固定在传感器芯片表面上，并且分 析了一组各种CC和CXC趋化因子与NOX-E36的结合；
图24C显示了通过Biacore分析测定的NOX-E36与趋化因子相互 作用的动力学分析，其中所述趋化因子共价固定在CM5传感器芯片表 面上并注射入各种浓度的NOX-E36，并且用BiaEvaluation软件来分 析NOX-E36的结合行为；
图24D显示了用MIP-1α刺激的THP-1细胞的趋化性剂量-反应曲 线，半数有效浓度为约0.2nM；
图24E显示了NOX-E36对于由MIP-1α诱导的趋化性的抑制。 NOX-E36对于由MIP-1α诱导的THP-1细胞的趋化性没有影响；
图25显示了镜像异构体NOX-E36-3’-PEG在钙释放测定法中的效 力；将细胞用与各种量的镜像异构体NOX-E36-3’-PEG在37℃下预孵 育的3nM人MCP-1进行刺激，表示为随镜像异构体NOX-E36-3’-PEG 浓度而变化的对照的百分比；
图26显示了镜像异构体NOX-E36-3’-PEG在趋化性测定法中的效 力；让细胞朝向与各种量的镜像异构体NOX-E36-3’-PEG在37℃下预 孵育的0.5nM人MCP-1迁移，表示为随NOX-E36-3’-PEG浓度而变化 的对照的百分比；
图27A显示了镜像异构体NOX-E36-5’-PEG在钙释放测定法中的 效力；将细胞用与各种量的镜像异构体NOX-E36-5’-PEG在37℃下预 孵育的3nM人MCP-1进行刺激，表示为随镜像异构体NOX-E36-5’-PEG 浓度而变化的对照的百分比；
图27B显示了镜像异构体NOX-E36-5’-PEG在趋化性测定法中的 效力；让细胞朝向与各种量的镜像异构体NOX-E36-5’-PEG在37℃下 预孵育的0.5nM人MCP-1迁移，表示为随镜像异构体NOX-E36-5’-PEG 浓度而变化的对照的百分比；
图28显示了在THP-1细胞中由鼠MCP-1诱导的Ca++-释放，其中 获得了关于鼠MCP-1的剂量-反应曲线，其中表明半数有效浓度(EC50) 为大约5nM，表示为随鼠MCP-1浓度而变化的相对于空白的荧光差异；
图29显示了抗-鼠MCP-1的镜像异构体mNOX-E36-3’-PEG在钙释 放测定法中的效力；细胞用与各种量的镜像异构体mNOX-E36-3’-PEG 在37℃下预孵育的3nM鼠MCP-1进行刺激，表示为随镜像异构体 mNOX-E36-3’-PEG浓度而变化的对照的百分比；
图30显示了鼠MCP-1诱导的THP-1细胞的趋化性，其中在THP-1 细胞朝向各种mMCP-1浓度迁移3小时后，获得了关于mMCP-1的剂量- 反应曲线，表示为随鼠MCP-1浓度而变化的相比于对照而言的X倍增 加；
图31显示了抗-鼠MCP-1的镜像异构体mNOX-E36-3’-PEG在趋化 性测定法中的效力；让细胞朝向与各种量的镜像异构体mNOX-E36-3’ -PEG在37℃下预孵育的0.5nM鼠MCP-1迁移，表示为随抗-鼠的镜像 异构体mNOX-E36-3’-PEG浓度而变化的对照的百分比；
图32显示了Biacore 2000传感图(sensorgram)，其指明了适体 D-mNOX-E36与鼠D-MCP-1(其通过胺偶联过程固定在PioneerF1传感 器芯片上)结合的KD值，表示为随时间而变化的响应(RU)；
图33显示了Biacore 2000传感图，其指明了适体D-mNOX-E36 与人D-MCP-1和鼠D-MCP-1(其中所述两种不同形式的D-MCP-1通过 胺偶联过程分别固定在PioneerF1和CM4传感器芯片上)的结合，表 示为随时间而变化的响应(RU)；
图34显示了24周龄的MRLlpr/lpr小鼠的肾脏切片，其如所示的用 过碘酸-希夫(PAS)、Mac-2(巨噬细胞)的抗体和CD3(T细胞)的抗 体进行染色；所述图像是每个组中7-12只小鼠的代表(原始放大倍数 PAS：×100，PAS插图：×400，Mac2：×400，CD3：×100)；
图35显示了表格，其图解说明了在不同组的24周龄的MRLlpr/lpr 小鼠中肾功能参数和组织学检查结果；
图36显示了组织学变化的定量，其通过在来自所有组的小鼠的银 染色切片上实施的形态计量法来进行；A，间隙体积指数(interstitial volume index)；B，肾小管扩张指数(tubular dilation index)； 和C，肾小管细胞损伤指数(tubular cell damage index)，被计算 为高倍视野的百分比并表示成平均值±SEM；
图37显示了通过Kaplan-Meier分析计算出的各个治疗组的 MRLlpr/lpr小鼠的存活；
图38显示了CC-趋化因子CCL2和CCL5的肾mRNA表达，其通过 使用从每个组的5只小鼠中汇集的总肾RNA经实时RT-PCR来测定，其 中每组小鼠的RNA水平按照各自的18S rRNA表达来表示；
图39显示了通过用mNOX-E36-3’PEG进行治疗引起肺病理学减少； 从24周龄的所有组中制备肺组织，并半定量地进行评分；用mNOX-E36 和mNOX-E36-3’PEG进行治疗减少了MRLlpr/lpr小鼠中的细支气管周炎 症；所述图像是每个组中7-11只小鼠的代表；原始放大倍数×100；
图40显示了24周龄的MRLlpr/lpr小鼠的皮肤狼疮表现，其通常出 现在面部或颈部区域(左边的小鼠)，其在用抗-mCCL2镜像异构体治 疗的小鼠(右边的小鼠)中较少发生；
图41显示了在24周龄的MRLlpr/lpr小鼠中血清和组织学检查结果；
图42显示了在该研究过程中在血浆中PEG化的和未PEG化的抗 -mCCL2镜像异构体的药物动力学，表示为作为时间的函数的镜像异构 体mNOX-E36的血浆浓度；
图43显示了在24周龄的用媒介物治疗的或用mNOX-E36-3’PEG- 治疗的MRLlpr/lpr小鼠中在骨髓和外周血中的CCR2的流式细胞术；数据 显示为在每个组的5只小鼠中，在骨髓或外周血中CCR2阳性细胞的平 均百分比±SEM；
图44显示了在用PoC-PEG治疗的(白色柱)和用mNOX-E36-3’ PEG(mNOX-E36-P)治疗的(黑色柱)1K db/db小鼠中的血清CCL2 水平，其在所示的不同时间点通过ELISA来测定；数据是平均值±SEM； *，p<0.05，mNOX-E36-3’PEG(mNOX-E36-P)对PoC-PEG；
图45显示了在未治疗的或者用POC-PEG或确切地说mNOX-E36-3’ PEG治疗的db/db小鼠的肾小球和间质中，Mac-2和Ki-67阳性细胞的 浸润的数目；
图46显示了在6个月大的db/db小鼠中的糖尿病性肾小球硬化； 将来自不同组的小鼠的肾切片用过碘酸-希夫进行染色，并对来自每个 肾切片的15个肾小球就糖尿病性肾小球硬化的程度进行评分；所述图 像显示了分级至所示的各自得分的代表性肾小球，原始放大倍数为 400×；所述图图解说明了每个组(n＝7-10)中所有小鼠的每个得分的 平均百分比±SEM；*，p<0.05，用mNOX-E36-3’PEG(mNOX-E36-P) 治疗的1K db/db小鼠对用PoC-PEG(PoC-P)治疗的1K db/db小鼠；
图47显示了在6个月大的用mNOX-E36-3’PEG(mNOX-E36-P)治 疗的和用PoC-PEG(PoC-P)治疗的1K db/db小鼠中的肾小球滤过率 (GFR)；在所述研究的末期，在用PoC-PEG治疗的和用mNOX-E36-3’ PEG治疗的1K db/db小鼠中，通过FITC-菊粉清除动力学来测定GFR；
图48显示了6个月大的db/db小鼠的肾小管萎缩和间隙体积；银 染色的肾切片的图像图解说明了来自各个组的代表性肾脏(原始放大 倍数为100×)；值表示每个组中的7-10只小鼠的各自形态计量分析 指数的平均值±SEM；*，p<0.05，2K db/db对BKS野生型小鼠；#， p<0.05，1K对2K db/db小鼠；，p<0.05，用mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-PEG)治疗的1K db/db小鼠对用PoC-PEG治疗的1K db/db 小鼠；
图49显示了db/db小鼠的肾CCL2mRNA表达，其通过使用从每个 组的6-10只小鼠中汇集的总肾RNA经实时RT-PCR来测定；每组小鼠 的mRNA水平按照各自的18S rRNA表达来表示；和
图50显示了如通过免疫染色所测定的在db/db小鼠肾脏中的空间 CCL2表达；所述图像图解说明了来自所示各个组的6个月大的小鼠的 肾脏的代表性切片(原始放大倍数，200×)。
实施例1：结合人MCP-1的核酸
使用生物素化的人D-MCP-1作为靶标，可以产生几种结合人MCP-1 的核酸，该核酸的核苷酸序列在图1至7中描绘。这些核酸如下进行表 征：采用使用生物素化的人D-MCP-1的竞争性或直接pull-down测定法 在适体(即D-核酸)水平上进行表征(实施例4)，或者通过使用Biacore 2000装置进行的表面等离子体共振测量法(实施例7)、体外细胞培养 物Ca++-释放测定法(实施例5)或体外趋化性测定法(实施例6)在镜 像异构体水平(即具有天然构型的MCP-1(L-MCP)的L-核酸)上进行 表征。
如此产生的核酸分子显示出不同的序列基序，四种主要的类型在 图1和图2(1A/1B型)、图3(2型)、图4和图5(3型)以及图6(4型) 中定义。另外的不能相互相关并且不能与本文所描述的不同序列基序 相关的结合MCP-1的核酸在图7中列出。对于核苷酸序列基序的定义， 使用了IUPAC缩写以用于不确定的核苷酸：
S 强 G或C；
W 弱 A或U；
R 嘌呤 G或A；
Y 嘧啶 C或U；
K 酮基 G或U；
M 亚氨基 A或C；
B 非A C或U或G；
D 非C A或G或U；
H 非G A或C或U；
V 非U A或C或G；
N 全部 A或G或C或U。
如果未指明与此相反，则任何核酸序列或者序列段和盒的序列都 分别以5’->3’的方向显示。
1A 型结合MCP-1的核酸(图1)
如在图1中所描绘的，所有1A型的结合MCP-1的核酸的序列都包 含几个序列段或盒，其中盒和是可以相互杂交的5’-和3’ -末端序列段。然而，在该分子中并非一定给出这种杂交，如在生理条 件下实际存在的。盒B2、B3、B4、和盒B6的侧翼为盒和盒
采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和竞争性pull-down测定 法，在适体水平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进 行分级(实施例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)， 并使用天然构型的MCP-1(L-MCP)在体外细胞培养物Ca++-释放测定法 中进行测试(实施例5)。
所定义的盒的序列在1A型的结合MCP-1的核酸之间可能不同，这 影响了对MCP-1的结合亲和力。基于对被概括为1A型结合MCP-1的核 酸的不同的结合MCP-1的核酸所进行的结合分析，如下描述的盒 B2、B3、B4、B6和以及它们的核苷酸序列独个地和更优选 地以其整体对于结合MCP-1来说是必需的：
·盒和是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段；其中 是优选并且其中是优选
·盒B2，其是CCCGGW，优选CCCGGU；
·盒B3，其是GUR，优选GUG；
·盒B4，其是RYA，优选GUA；
·盒其是优选
·盒B6，其是UGCAAUAAUG或URYAWUUG，优选 UACAUUUG；
如在图1中所描绘的，称为176-E10trc的核酸分子具有最好的对 MCP-1的结合亲和力(在pull-down测定法中作为适体，KD为5nM； 以及在体外细胞培养物Ca++-释放测定法中作为镜像异构体，IC50为4-5 nM)，并因此可以构成最佳序列以及序列元件B2、B3、B4、 B6和的最佳组合。
1B 型结合MCP-1的核酸(图2)
如在图2中所描绘的，所有1B型的序列都包含几个序列段或盒， 其中盒和是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段，并且 盒B2、B3、B4、和盒B6的侧翼为盒和盒然而，在该分 子中并非一定给出这种杂交，如在生理条件下实际存在的。
采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和竞争性pull-down测定 法，在适体水平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进 行分级(实施例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)， 并使用天然构型的MCP-1(L-MCP)在体外细胞培养物Ca++-释放测定法 中进行测试(实施例5)。
所定义的盒的序列在1B型的结合MCP-1的核酸之间可能不同，这 影响了对MCP-1的结合亲和力。基于对被概括为1B型结合MCP-1的核 酸的不同的结合MCP-1的核酸所进行的结合分析，如下描述的盒 B2、B3、B4、B6和以及它们的核苷酸序列独个地和更优选 地以其整体对于结合MCP-1来说是必需的：
·盒和其可以相互杂交；其中是优选 并且是优选
·盒B2，其是CCAGCU或CCAGY，优选CCAGU；
·盒B3，其是GUG；
·盒B4，其是AUG；
·盒其是
·盒B6，其是CAUUUUA或CAUUUA，优选CAUUUUA。
如在图2中所描绘的，称为176-C9trc的核酸具有最好的对MCP-1 的结合亲和力(在pull-down测定法中作为适体，KD为5nM；以及在 体外细胞培养物Ca++-释放测定法中作为镜像异构体，IC50为4-5nM)， 并因此可以构成最佳序列以及序列元件B2、B3、B4、B6和 的最佳组合。
2 型结合MCP-1的核酸(图3)
如在图3中所描绘的，所有2型的序列都包含几个序列段或盒， 其中盒和是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段，并且 盒B2是中心的序列元件。然而，在该分子中并非一定给出这种杂交， 如在生理条件下实际存在的。
采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和竞争性pull-down测定 法，在适体水平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进 行分级(实施例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)， 并使用天然构型的MCP-1(L-MCP)在体外细胞培养物Ca++-释放测定法 (实施例5)或体外趋化性测定法(实施例6)中进行测试。
所定义的盒的序列在3型的结合MCP-1的核酸之间可能不同，这 影响了对MCP-1的结合亲和力。基于对被概括为2型结合MCP-1的核 酸的不同的结合MCP-1的核酸所进行的结合分析，如下描述的盒 B2和以及它们的核苷酸序列独个地和更优选地以其整体对于结合 MCP-1来说是必需的：
·盒和其是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段； 其中是而是或者是而是 或者是而是或优选地，是而 是
·盒B2，其是CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC，优选 CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC。
如在图3中所描绘的，称为180-D1-002的核酸以及180-D1-002 的衍生物例如180-D1-011、180-D1-012、180-D1-035和180-D1-036 (＝NOX-E36)具有最好的对MCP-1的结合亲和力(在pull-down测定 法或竞争性pull-down测定法中作为适体，KD<1nM)，并因此可以构 成最佳序列以及序列元件B2和的最佳组合。
对于核酸分子D-NOX-E36(D-180-D1-036；SEQ.ID NO.159)，测 得解离常数(KD)在室温(RT)下为890±65pM而在37℃下为146± 13pM(实施例4；图9)。相应的镜像异构体NOX-E36(180-D1-036； SEQ.IDNO.37)在体外Ca++-释放测定法中显示出3-4nM的抑制浓度 (IC50)(实施例5；图12)，和在体外趋化性测定法中显示出约0.5nM 的抑制浓度(IC50)(实施例6；图15)。对于NOX-E36的PEG化的衍生 物NOX-E36-3’PEG和NOX-E36-5’PEG，在Ca++-释放测定法中测定出 约3nM的IC50(实施例5；图25和图27A)，和在趋化性测定法中测 定出<1nM的IC50(实施例6；图26和图27B)。
3 型结合MCP-1的核酸(图4+5)
如在图4和图5中所描绘的，所有3型的序列包含几个序列段或 盒，其中三对盒是3型结合MCP-1的核酸所特征性的。盒和 以及盒B2A和B2B以及盒B5A和B5B具有相互杂交的能力。然而， 在该分子中并非一定给出这种杂交，如在生理条件下实际存在的。非 杂交性核苷酸位于这些可能杂交的序列元件之间，其被定义为盒B3、 盒B4和盒
采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和竞争性pull-down测定 法，在适体水平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进 行分级(实施例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)， 并使用天然构型的MCP-1(L-MCP)在体外趋化性测定法(实施例6) 中或通过Biacore测量法(实施例7)进行测试。
所定义的盒的序列在3型的结合MCP-1的核酸之间可能不同，这 影响了对MCP-1的结合亲和力。基于对被概括为3型结合MCP-1的核 酸的不同的结合MCP-1的核酸所进行的结合分析，如下描述的盒 B2A、B3、B2B、B4、B5A、B5B、以及它们的核苷酸序列独 个地和更优选地以其整体对于结合MCP-1来说是必需的：
·盒和其是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段； 其中是而是优选地，是而 是
或者是而是优选地，是而 是
或者是而是优选地，是而 是
或者是而是优选地，是而是 最优选地，是而是
·盒B2A和B2B，其是可以相互杂交的序列段；其中B2A是GKMGU 而B2B是ACKMC；优选地，B2A是GUAGU而B2B是ACUAC；
·盒B3，其是KRRAR，优选UAAAA或GAGAA；
·盒B4，其是CURYGA或CUWAUGA或CWRMGACW或UGCCAGUG，优选 CAGCGACU或CAACGACU；
·B5A和B5B，其是可以相互杂交的序列段；其中B5A是GGY 而B5B是GCYR，其中GCY可以与B5A的核苷酸杂交；或者B5A 是CWGC而B5B是GCWG；优选地，B5A是GGC而B5B是GCCG；
·盒其是或或优选
如在图4和图5中所描绘的，称为178-D5的核酸及其衍生物 178-D5-030以及称为181-A2的核酸及其衍生物181-A2-002、 181-A2-004、181-A2-005、181-A2-006、181-A2-007、181-A2-017、 181-A2-018、181-A2-019、181-A2-020、181-A2-021和181-A2-023 具有最好的对MCP-1的结合亲和力。178-D5和178-D5-030在直接或 竞争性pull-down测定法中作为适体进行评估(实施例4)，其KD为约 500pM。在相同的实验设置下，测定出181-A2的KD约100pM。通过 Biacore分析(实施例7)，181-A2及其衍生物对于MCP-1的KD经测定 为200-300pM。在使用培养细胞的Ca++释放测定法和趋化性测定法(分 别为实施例5和6)中，测得178-D5和181-A2两者的IC50为约500pM。 因此，178-D5和181-A2以及它们的衍生物可以构成最佳序列以及序 列元件B2A、B3、B2B、B4、B5A、B5B和的最佳组合。
4 型结合MCP-1的核酸(图6)
如在图6中所描绘的，所有4型的序列都包含几个序列段或盒， 其中盒和是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段，并且 盒B2是中心的序列元件。
采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接pull-down测定法，在适 体水平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进行分级(实 施例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)，并使用天然 构型的MCP-1(L-MCP)在体外细胞培养物Ca++-释放测定法(实施例5) 和/或趋化性测定法(实施例6)中进行测试。
所定义的盒的序列在4型的结合MCP-1的核酸中可能不同，这影 响了对MCP-1的结合亲和力。基于对被概括为4型结合MCP-1的核酸 的不同的结合MCP-1的核酸所进行的结合分析，如下描述的盒 B2和以及它们的核苷酸序列独个地和更优选地以其整体对于结合 MCP-1来说是必需的：
·盒和其是可以相互杂交的5’-和3’-末端序列段； 其中是而是或者是而 是或者是而是或者是 而是或者是而是优选地，是 而是最优选的是而是 以及
·盒B2，其是AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG或 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG或CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA，优选 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG。
如在图6中所描述的，称为174-D4-004和166-A4-002的核酸具 有最好的对MCP-1的结合亲和力(在体外细胞培养物Ca++释放测定法 中作为镜像异构体，IC50为2-5nM)，并因此可以构成最佳序列以及序 列元件B2和的最佳组合。
另外，鉴定了29个其他的结合MCP-1的核酸，它们不能通过已对 于1-4型结合MCP-1的核酸而显示的核苷酸序列元件的组合来描述。 这些序列在图7中列出。
应当理解，任何在图1至图7中显示的序列都是根据本发明的核 酸，包括它们的那些截短形式，而且还包括它们的那些延伸形式，但 是条件是各自如此截短和延伸的核酸分子仍然能够结合靶标。
实施例2：结合鼠MCP-1的核酸
使用生物素化的鼠D-MCP-1作为靶标，可以产生几种与之结合的核 酸分子。这些核酸分子的序列分析的结果可从图8中获得。
采用使用生物素化的鼠D-MCP-1的pull-down测定法，在适体水 平上表征这些核酸，以便根据它们的结合行为对它们进行分级(实施 例4)。将选择出的序列合成为镜像异构体(实施例3)，并使用天然构 型的MCP-1(L-MCP)在体外细胞培养物Ca++-释放测定法(实施例5) 或趋化性测定法(实施例6)中进行测试。
如在图8中所描绘的，D-188-A3-001和D-189-G7-001以及它们 的衍生物在pull-down测定法中以亚纳摩尔浓度的KD结合D-MCP-1(图 8)。
对于D-mNOX-E36(＝D-188-A3-007；SEQ.IDNO.244)，测得在 37℃下解离常数(KD)为0.1-0.2nM(实施例4；图10)。相应的镜像 异构体mNOX-E36(188-A3-007；SEQ.IDNO.122)在体外Ca++-释放 测定法中显示出约12nM的抑制浓度(IC50)(实施例5；图13)，和在 体外趋化性测定法中显示出约7nM的抑制浓度(IC50)(实施例6；图 16)。对于mNOX-E36的PEG化的衍生物mNOX-E36-3’PEG(SEQ.IDNO. 254)，在Ca++-释放测定法中测定出约8nM的IC50(实施例5；图29)， 和在趋化性测定法中测定出约3nM的IC50(实施例6；图31)。
应当理解，任何在图1至图7中显示的序列都是根据本发明的核 酸，包括它们的那些截短形式，而且还包括它们的那些延伸形式，但 是条件是各自如此截短和延伸的核酸分子仍然能够结合靶标。
实施例3：适体和镜像异构体的合成和衍生化
小规模合成
利用2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学(M.J.Damha，K.K.Ogilvie， Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，Humana Press Inc.1993)，使用ABI 394合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，通过固相合成来制备适体和镜像异构体。D-和L-构 型的rA(N-Bz)-、rC(Ac)-、rG(N-ibu)-和rU-亚磷酰胺购自ChemGenes， Wilmington，MA。适体和镜像异构体通过凝胶电泳进行纯化。
大规模合成加修饰
利用2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学(M.J.Damha，K.K.Ogilvie， Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，Humana Press Inc.1993)，使用合成仪(Amersham Biosciences； General Electric Healthcare，Freiburg)，通过固相合成来制备镜 像异构体NOX-E36。L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-和L-rU- 亚磷酰胺购自ChemGenes，Wilmington，MA。5’-氨基-修饰剂购自 American International Chemicals Inc.(Framingham，MA，USA)。 未修饰的镜像异构体的合成开始于L-riboG修饰的CPG，孔径为 (Link Technology，Glasgow，UK)；对于3’-NH2-修饰的镜像异构 体，使用3’-氨基修饰剂-CPG，(ChemGenes，Wilmington，MA)。 对于偶联(每次循环15分钟)，使用0.3M在乙腈中的苄硫基四唑 (CMS-Chemicals，Abingdon，UK)和3.5当量的各自0.1M在乙腈 中的亚磷酰胺溶液。使用氧化封端循环。其他用于寡核苷酸合成的标 准溶剂和试剂购自Biosolve(Valkenswaard，NL)。合成镜像异构体， DMT-ON；在去保护后，使用Source15RPC介质(Amersham)，通过制备 型RP-HPLC(WincottF等人，(1995)Nucleic Acids Res 23：2677) 进行纯化。用80％乙酸除去5’DMT-基团(在室温下30分钟)。随后， 加入2M NaOAc水溶液，并使用5K再生纤维素膜(Millipore，Bedford， MA)通过切向流过滤来对镜像异构体进行脱盐。
NOX-E36的PEG化
为了延长镜像异构体在体内的血浆停留时间，将镜像异构体 NOX-E36在3’-末端或5’-末端处共价偶联至40kDa聚乙二醇(PEG) 部分。
NOX-E36的3’-PEG化
为了PEG化(关于PEG化方法的技术细节，可参见欧洲专利申请 EP 1 306 382)，将纯化的3’-氨基修饰的镜像异构体溶解于H2O(2.5 ml)、DMF(5ml)和缓冲液A(5ml；通过混合柠檬酸·H2O[7g]、硼 酸[3.54g]、磷酸[2.26ml]和1M NaOH[343ml]并加入H2O以达到 1L的终体积来制备；用1M HCl调节pH＝8.4)的混合物中。
用1M NaOH使镜像异构体溶液的pH达到8.4。然后，在37℃下 以4份(每份0.6当量)每30分钟添加40kDa PEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)，直至达到75至85％的最大收率。 在添加PEG-NHS酯的过程中，用1M NaOH将反应混合物的pH保持在 8-8.5。
将该反应混合物与4ml尿素溶液(8M)、4ml缓冲液A和4ml 缓冲液B(0.1M的在H2O中的乙酸三乙基铵)混合，并加热至95℃ 15 分钟。然后，采用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C：0.1M的在乙腈中 的乙酸三乙基铵)，使用Source 15RPC介质(Amersham)，通过RP-HPLC 来纯化PEG化的镜像异构体。在5％缓冲液C处洗脱过量的PEG，在 10-15％缓冲液C处洗脱PEG化的镜像异构体。将纯度>95％(这通过 HPLC来评估)的产物级分合并，并与40ml 3M NaOAC相混合。通过 切向流过滤(5K再生纤维素膜，Millipore，Bedford MA)对PEG 化的镜像异构体进行脱盐。
NOX-E36的5’-PEG化
为了PEG化(关于PEG化方法的技术细节，可参见欧洲专利申请 EP 1 306 382)，将纯化的5’-氨基修饰的镜像异构体溶解于H2O(2.5 ml)、DMF(5ml)和缓冲液A(5ml；通过混合柠檬酸·H2O[7g]、硼 酸[3.54g]、磷酸[2.26ml]和1M NaOH[343ml]并加入水以达到 1L的终体积来制备；用1M HCl调节pH＝8.4)的混合物中。
用1M NaOH使镜像异构体溶液的pH达到8.4。然后，在37℃下 以6份(每份0.25当量)每30分钟添加40kDa PEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)，直至达到75至85％的最大收率。 在添加PEG-NHS酯的过程中，用1M NaOH将反应混合物的pH保持在 8-8.5。
将该反应混合物与4ml尿素溶液(8M)和4ml缓冲液B(0.1M 的在H2O中的乙酸三乙基铵)混合，并加热至95℃15分钟。然后， 采用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C：0.1M的在乙腈中的乙酸三乙基 铵)，使用Source 15RPC介质(Amersham)，通过RP-HPLC来纯化PEG 化的镜像异构体。在5％缓冲液C处洗脱过量的PEG，在10-15％缓冲液 C处洗脱PEG化的镜像异构体。将纯度>95％(这通过HPLC来评估) 的产物级分合并，并与40ml 3M NaOAC相混合。通过切向流过滤(5 K再生纤维素膜，Millipore，Bedford MA)对PEG化的镜像异构体 进行脱盐。
实施例4：结合常数的测定(Pull-Down测定法)
直接pull-down测定法
分别在20或37℃下，在pull-down测定法中测量适体对D-MCP-1 的亲和力。使用[γ-32P]-标记的ATP(Hartmann Analytic， Braunschweig，Germany)，通过T4多核苷酸激酶(Invitrogen， Karlsruhe，Germany)对适体进行5’-磷酸标记。经标记的适体的比 放射性为200,000-800,000cpm/pmol。在变性和复性后将适体在37 ℃下以20pM的浓度与不同量的生物素化的D-MCP-1一起于选择缓冲 液(20mM Tris-HCl pH 7.4；137mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2； 1mM CaCl2；0.1％[w/vol]Tween-20)中孵育4-12小时以便在低浓 度下达到平衡。用10μg/ml人血清白蛋白(Sigma-Aldrich， Steinheim，Germany)和10μg/ml酵母RNA(Ambion，Austin，USA) 补充选择缓冲液，以便防止结合伴侣吸附至所使用的塑料器具或固定 基质的表面。生物素化的D-MCP-1的浓度范围被设定为8pM至100nM； 总反应体积为1ml。将肽和肽-适体复合物固定在1.5μl Streptavidin Ultralink Plus颗粒(Pierce Biotechnology， Rockford，USA)上，所述颗粒已用选择缓冲液预平衡并重悬于6μl 的总体积中。颗粒在相应的温度下于热混匀器中保持悬浮30分钟。在 分离上清液并适当洗涤后，在闪烁计数器中对固定的放射性进行定量。 将结合百分比对生物素化的D-MCP-1的浓度进行绘图，并且通过使用 软件算法(GRAFIT；Erithacus Sof tware；SurreyU.K.)并假定1:1 的化学计量来获得解离常数。
竞争性pull-down测定法
为了比较不同的结合D-MCP-1的适体，实施竞争性分级测定法。 为达到此目的，将可获得的最具亲和力的适体进行放射性标记(参见 上文)并用作参考。在变性和复性后，将它在一定的条件下于37℃与 生物素化的D-MCP-1在1ml选择缓冲液中进行孵育，所述条件导致在 NeutrAvidin琼脂糖或Streptavidin Ultralink Plus(两者都来自 Pierce)上固定和洗涤之后大约5-10％的与所述肽的结合(无竞争)。 将过量的变性和复性的未标记的D-RNA适体变体以不同的浓度(如2、 10和50nM)与经标记的参考适体一起加入，以便进行平行的结合反 应。待检测的适体与参考适体竞争结合靶标，从而减少了结合信号， 信号减少的情况取决于它们的结合特征。在该测定法中发现的最具活 性的适体随后可以作为新的参考以用于其他适体变体的比较分析。
实施例5：Ca++-释放测定法中抑制浓度的测定
将THP-1细胞(DSMZ，Braunschweig)以0.3 x 106/ml的细胞密 度，在37℃和5％ CO2下，在具有GlutaMAX(Invitrogen)的RPMI 1640 培养基中培养过夜，该培养基另外还含有10％胎牛血清、50单位/ml 青霉素、50μg/ml链霉素和50μM β-巯基乙醇。
于37℃在0.2ml薄型(low profile)96-管板中，在Hanks平 衡盐溶液(HBSS)中将镜像异构体与重组人MCP-1(Bachem)一起孵 育15至60分钟，所述Hanks平衡盐溶液含有1mg/ml牛血清白蛋白、 5mM丙磺舒和20mM HEPES(HBSS+)(“刺激溶液”)。
为了用钙指示剂染料进行加载，将细胞以300xg离心5分钟， 重悬于4ml指示剂染料溶液(10μM fluo-4[分子探针]、0.08％ pluronic 127[分子探针]，于HBSS+中)中，并在37℃下孵育60分 钟。随后，加入11ml HBSS+，并如上所述离心细胞，用15ml HBSS+ 洗涤一次，然后再重悬于HBSS+中以使细胞密度为1.1 x 106/ml。向 黑色96-孔板的每个孔中加入90μl该细胞悬浮液。
在Fluostar Optima多检测平板读取器(BMG)中以485nm的激 发波长和520nm的发射波长测量荧光信号。对于多个样品的平行测量， 同时记录96-孔平板的(垂直的)一排孔。进行时间延迟为4秒的最 初3次读取以用于确定基线。然后，中断记录，并将平板从该装置中 取出。用多道移液器将10μl刺激溶液加入孔中，然后将平板再次移 进装置中并继续测量。总共，进行时间间隔为4秒的20次记录。
对于每个孔，测定最大荧光值和基线值之间的差异，并对MCP-1 浓度进行绘图，或者在关于由镜像异构体抑制钙释放的实验中，对镜 像异构体的浓度进行绘图。
人MCP-1的半数最大有效浓度(EC50)的测定
在用各种浓度的hMCP-1刺激THP-1细胞并将最大信号和基线信号 之间的差异进行绘图后，获得了人MCP-1的剂量-反应曲线，其表明半 数有效浓度(EC50)为约2-4nM(图11)。该浓度被用于进一步的关于 由镜像异构体抑制Ca++-释放的实验。
鼠MCP-1的半数最大有效浓度(EC50)的测定
在用各种浓度的mMCP-1刺激THP-1细胞并将最大信号和基线信号 之间的差异进行绘图后，获得了鼠MCP-1的剂量-反应曲线，其表明半 数有效浓度(EC50)为约5nM(图28)。该浓度被用于进一步的关于由 镜像异构体抑制Ca++-释放的实验。
实施例6：在趋向性测定法中抑制浓度的测定
将如上所述进行生长的THP-1细胞离心，在HBH(HBSS，含有1 mg/ml牛血清白蛋白和20mM HEPES)中洗涤一次，并以3 x 106个细 胞/ml进行重悬浮。将100μl该悬浮液加入具有5μm孔的Transwell 插入物(inserts)(Corning，#3421)中。在较低的区室中，在加入 细胞之前，将MCP-1与各种浓度的镜像异构体一起于37℃在600μl HBH中预孵育20至30分钟。允许细胞在37℃下迁移3小时。随后， 移去插入物，并将60μl在磷酸盐缓冲盐水中的440μM刃天青(Sigma) 加入至较低的区室中。在37℃下孵育2.5小时后，在Fluostar Optima 多检测平板读取器(BMG)中以544nm的激发波长和590nm的发射波 长测量荧光。
人MCP-1的半数最大有效浓度(EC50)的测定
在THP-1细胞向各种浓度的人MCP-1迁移3小时后，获得了人 MCP-1的剂量-反应曲线，其表明最大有效浓度为约1nM，并且在更高 的浓度时活性减少(图14)。对于进一步的关于由镜像异构体抑制趋 化性的实验，使用的MCP-1浓度为0.5nM。
鼠MCP-1的半数最大有效浓度(EC50)的测定
在THP-1细胞向各种浓度的鼠MCP-1迁移3小时后，获得了鼠 MCP-1的剂量-反应曲线，其表明最大有效浓度为约1-3nM，并且在更 高的浓度时活性减少(图30)。对于进一步的关于由镜像异构体抑制 趋化性的实验，使用的鼠MCP-1浓度为0.5nM。
实施例7：通过表面等离子体共振测量进行的结合分析
7.1评估NOX-E36、181-A2-018和mNOX-E36的特异性
使用Biacore 2000装置(Biacore AB，Uppsala，Sweden)来分 析核酸与人MCP-1和相关蛋白质的结合。当偶联通过胺基团来实现时， 将蛋白质逆水透析1-2小时(Millipore VSWP混合的纤维素酯；孔尺 寸为0.025μM)以去除干扰性的胺。在蛋白质偶联之前，通过以5 μl/分钟的流速注射35μl 0.4M NHS和0.1M EDC的1:1稀释物来 活化PioneerF1或CM4传感器芯片(Biacore AB)。然后以2μl/分 钟的流速注射入浓度为0.1-1.5μg/ml的趋化因子，直到装置的响应 在1000-2000RU(相对单位)的范围内。通过以5μl/分钟的流速注 射35μl盐酸乙醇胺溶液(pH 8.5)来使未反应的NHS酯去活化。将 传感器芯片用结合缓冲液预处理两次，并以10μl/分钟平衡1-2小时 直到基线看起来稳定。对于所有蛋白质，通过一系列在选择缓冲液 (Tris-HCl，20mM；NaCl，137mM；KCl，5mM；CaCl2，1mM；MgCl2， 1mM；Tween 20，0.1％[w/v]；pH 7.4)中浓度为1000、500、250、 125、62.5、31.25和0nM的镜像异构体注射液来评估动力学参数和 解离常数。在所有实验中，在37℃下用Kinject命令来进行分析，所 述命令定义了在10μl/分钟的流速下缔合时间为180秒而解离时间为 360秒。数据分析和解离常数(KD)的计算采用BIAevaluation 3.0 软件(BIACORE AB，Uppsala，Sweden)来进行，其使用了Langmuir 1:1 化学计量拟合算法。
7.1.1NOX-E36和181-A2-018(人-MCP-1特异性核酸)
仅对于人MCP-1，描述了所有的传感图(分别为图17和20)；对 于其他蛋白质，为了清晰的目的，只显示了使用125nM镜像异构体浓 度获得的传感图(图18/19和21/22)。
NOX-E36●hMCP-1相互作用的分析：将重组人MCP-1按照生产商 的建议(胺偶联方法)固定在PioneerF1传感器芯片上，直到建立1381 RU(相对单位)的仪器响应。测得的NOX-E36与人MCP-1结合的解离 常数(KD)为约890pM(图17)。
181-A2-018●hMCP-1相互作用的分析：将重组人MCP-1按照生产 商的建议(胺偶联方法)固定在CM4传感器芯片上，直到建立3111 RU (相对单位)的仪器响应。测得的181-A2-018与人MCP-1结合的解离 常数(KD)为约370pM(图20)。
为了测定NOX-E36和181-A2-018的特异性，将各种人MCP-1家族 蛋白质以及人嗜酸性粒细胞趋化因子固定在PioneerF1和CM4传感器 芯片上(hMCP-1，1754 RU；hMCP-2，1558 RU；hMCP-3，1290 RU；嗜 酸性粒细胞趋化因子，1523 RU)。动力学分析显示，NOX-E36以5-10nM 的解离常数(KD)结合至嗜酸性粒细胞趋化因子和hMCP-2；hMCP-3不 被识别(图18和24A)。与之相反，181-A2-018结合嗜酸性粒细胞趋 化因子、hMCP-2和hMCP-3，但是亲和力略有降低(10-20nM；图21 和24A)。
使用在PioneerF1和CM4传感器芯片上的经胺偶联固定的来自人 (1460RU)、猴(1218RU)、猪(1428RU)、狗(1224RU)、兔 (1244RU)、大鼠(1267RU)和小鼠(1361RU)的MCP-1来评估 NOX-E36和181-A2-018的物种间交叉反应性。动力学分析显示， NOX-E36以相当的0.89-1.2nM的解离常数(KD)结合至人、猴、猪和 犬MCP-1，但是不识别来自小鼠、大鼠和兔的MCP-1(图19和24A)。 181-A2-018以相当的0.5-0.6nM的解离常数(KD)结合至人和猴 MCP-1，但是以低得多的亲和力结合猪、兔和犬MCP-1。NOX-A2-018 不识别大鼠和小鼠MCP-1(图22和24A)。
序列以及在来自不同物种的MCP-1蛋白质和密切相关的人蛋白质 之间的以相同氨基酸百分比表示的同源性程度在图23中描述；计算出 的NOX-E36和181-A2-018的KD值在图24A中以表格形式显示。
7.1.2mNOX-E36(鼠MCP-1特异性核酸)
为了分析mNOX-E36的结合行为，将3759RU的合成的、生物素化 的鼠D-MCP-1(流动池(flow cell)3)和3326 RU的生物素化的人 D-MCP-1(流动池4)分别固定在缀合有链霉抗生物素蛋白的传感器芯 片(Biacore AB，Freiburg，Germany)上。使用Kinject命令来注 射500、250、125、62.5、31.25和0nM的mNOX-E36适体(D-RNA) 溶液，所述命令定义了缔合时间为180秒而解离时间为360秒。将流 动池1用作缓冲液和葡聚糖基质对照(Biacore SA-芯片表面)，而在 流动池2上，固定非特异性的D-肽以测定适体的非特异性结合。图32 显示了D-NOX-E36结合至鼠D-MCP-1的动力学的传感图，计算出的解 离常数(KD)为200-300pM。mNOX-E36不结合人D-MCP-1(图33)； 为了清晰的目的，只显示了使用125nM镜像异构体获得的传感图。
7.2评估NOX-E36的选择性
通过将5’生物素化的NOX-E36固定在Streptavidin(SA-芯片) 上，利用表面等离子体共振分析来评估NOX-E36的选择性。在流动池 (FC)1上的352 RU的NOX-E36和相同量的在FC2上的5’-末端生物 素化的非功能性对照镜像异构体(POC)通过链霉抗生物素蛋白/生物 素的结合来进行固定。将FC3用作表面对照以测定与葡聚糖-SA传感 器表面的非特异性结合。
注射100nM的一组来自所有四个亚群(CC、CXC、CX3C和XC)的 人趋化因子360秒，并允许复合物在10μl/分钟的流速和37℃下解离 360秒。将在缔合(响应1；相互作用的程度)后和在解离(响应2， 相互作用的亲和力)后的响应单位进行绘图。在每次注射后，用240s 的含0.1％ Tween的1M氯化钠使芯片表面再生；随后允许固定的镜像 异构体在生理条件(走样缓冲液)下重折叠2分钟。将每种趋化因子 的注射重复3次。CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL9显示出与核糖核酸 和芯片葡聚糖表面的非特异性结合。只有关于CCL2/MCP-1、 CCL8/MCP-2、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL3/MIP1α和 CXCL7/NAP-2才能够检测到与固定的NOX-E36的特异性高亲和力结合 (图24B)。MCP-2和嗜酸性粒细胞趋化因子被NOX-E36结合这一发现 由于这些趋化因子和MCP-1之间具有62％和70％的相对较高的同源性而 并不令人惊讶，对于未预料到的阳性CCL3/MIP-1α和CXCL7/NAP-2， 已经分别实施或目前正在建立有关功能性抑制的体外测试。
最后，NOX-E36和CCL2/MCP-1、CCL8/MCP-2、CCL11/嗜酸性粒细 胞趋化因子、CCL3/MIP1α、CXCL7/NAP-2、CCL7/MCP-3及 CCL13/MCP-4之间的相互作用的动力学参数在“反向的(inverted)” 体系中进行了测定。这里，固定趋化因子，并注射游离的NOX-E36(关 于详细的方案，参见7.1)。动力学数据概括于图24C中。
7.3体外评估抗-MIP-1α功能性
Biacore测量已经显示出NOX-E36与MIP-1α的交叉反应性。应该 通过采用功能性的、基于细胞培养的体外测定法来检验NOX-E36与 MIP-1α的纯粹的Biacore结合是否也转化为功能性，如拮抗作用。
为了达到该目的，实施使用THP-1细胞的趋化性实验，所述THP-1 细胞可通过MIP-1α来进行刺激。将如上所述进行生长的THP-1细胞 离心，在HBH(HBSS，含有1mg/ml牛血清白蛋白和20mM HEPES)中 洗涤一次，并以3 x 106个细胞/ml进行重悬浮。将100μl该悬浮液 加入具有5μm孔的Transwell插入物(Corning，#3421)中。在较低 的区室中，在加入细胞之前，将MIP-1α与各种浓度的镜像异构体一 起于37℃在600μl HBH中预孵育20至30分钟。允许细胞在37℃下 迁移3小时。随后，移去插入物，并将60μl在磷酸盐缓冲盐水中的 440μM刃天青(Sigma)加入至较低的区室中。在37℃下孵育2.5小 时后，在Fluostar Optima多检测平板读取器(BMG)中以544nm的 激发波长和590nm的发射波长测量荧光。
在THP-1细胞向各种浓度的人MIP-1α迁移3小时后，获得了人 MIP-1α的剂量-反应曲线，其表明半数最大有效浓度为约1nM，并且 在更高的浓度时活性减少(图24D)。对于进一步的关于由镜像异构 体抑制趋化性的实验，使用的MIP-1α浓度为0.5nM。
使用0.5nM MIP-1α的刺激，实施用于测定NOX-E36对趋化性的 抑制的实验。可以清楚地显示，NOX-E36不抑制由MIP-1α诱导的趋化 性，直至1μM MIP-1α的最高测试浓度。作为阳性对照，平行实施了 使用MCP-1作为刺激物的各自实验(图24E)。
实施例8：用抗-mMCP-1镜像异构体治疗MRLlpr/lpr小鼠中的狼疮样疾病
阻断促炎介质已变成为一种成功的用于治疗慢性炎症的方法 (Steinman 2004)。除了TNF和白细胞介素外，CC-趋化因子也是对于 特异性拮抗作用的重要候选物，因为CC-趋化因子介导白细胞从血管 内腔募集至炎症位点(Baggiolini 1998，Luster 2005)。存在非常 强的证据表明，MCP-1(＝CCL2)及其各自的趋化因子受体CCR2在自 身免疫性组织损伤(例如全身性红斑狼疮的临床表现)中起至关重要 的作用(Gerard & Rollins 2001)。例如，Cc12或Ccr2基因缺陷的 MRLlpr/lpr小鼠受到保护而免于狼疮样自身免疫(Perez de Lema 2005， Tesch 1999)。因此，CCL2/CCR2轴可代表具有前景的治疗靶标，例如 对于狼疮肾炎。实际上，延迟的基因疗法或转移经转染的细胞(两者 都导致原位产生NH2-截短的MCP-1)显著减少了MRLlpr/lpr小鼠中的自身 免疫性组织损伤。可是，此类实验方法由于控制不住的拮抗剂产生和 肿瘤形成而不能用于人(Hasegawa 2003，Shimizu 2004)。因此，仍 然需要开发在体内具有有利的药物动力学特性曲线的新型CCL2拮抗 剂。在该实施例中显示了，用抗-mCCL2镜像异构体mNOX-E36或 mNOX-E36-3’PEG阻断鼠CCL2将适合用于治疗狼疮肾炎和全身性红斑 狼疮的其他疾病表现。最近开始的mCCL2镜像异构体疗法有效改善了 MRLlpr/lpr小鼠中的狼疮肾炎、自身免疫性支气管周炎和狼疮样皮肤疾 病，而不受与治疗性CCL2/CCR2阻断相关的任何先前问题的支配。
动物和实验方案
从Harlan Winkelmann(Borchen，Germany)获得10周龄的雌性 MRLlpr/lpr小鼠，并将其以12小时的光照和黑暗循环保持在正常居住条 件下。可以随意获得水和标准食物(Ssniff，Soest，Germany)。在 14周龄时，将12只小鼠的组如下每周三次接受皮下注射在5％葡萄糖 中的镜像异构体(注射体积为4ml/kg)：mNOX-E36，1.5μmol/kg； mNOX-E36-3’PEG，0.9μmol/kg；无功能的对照镜像异构体PoC(5’ -UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU-3’)，1.9μ mol/kg； PoC-PEG，0.9μ mol/kg；媒介物(5％葡萄糖)。从分别在注射后3或 24小时每周取自眶后窦的血样中测定mNOX-E36和mNOX-E36-3’PEG 的血浆水平。血浆样品中的镜像异构体水平通过如实施例8中描述的 夹心杂交方法的改进形式来进行测定。在年龄的第24周结束时，通过 颈脱位法处死小鼠。
全身性狼疮的评估
通过半定量评分来记录皮肤损害(Schwarting 2005)。计算出脾 和肠系膜淋巴结团块(bulk)与总体重的重量比作为与狼疮相关的淋 巴组织增生综合征的标志。在实验期结束时，通过在吸入醚进行全身 麻醉下从眶后静脉丛抽血来收集每只动物的血样和尿样。在实验结束 时收集每只动物的血样和尿样，并如以前所描述的(Pawar 2006)测 定尿白蛋白/肌酸酐比率和血清dsDNA自身抗体IgG同种型滴度。在 24周时，通过在单次推注后5、10、15、20、35、60和90分钟时的 血浆FITC-菊粉(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)的清除动力 学来测定肾小球滤过率(GFR)(Qi 2004)。荧光以485nm的激发进行 测定，并以535nm的发射进行读取。使用非线性回归曲线拟合软件 (GraphPad Prism，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)，基 于二室模型来计算GFR。使用对于IL-6、IL-12p40(OptEiA，BD Pharmingen)和IFN-α(PBL Biomedical Labs，USA)的商业ELISA 试剂盒来测定血清细胞因子水平。将来自所有小鼠的肾脏和肺在10％ 缓冲的福尔马林中固定，处理，并包埋于石蜡中。按照常规方案制备 用于银染色和过碘酸-希夫染色的5-μm切片(Anders 2002)。使用如 关于狼疮肾炎所描述的活性指数和慢性指数(Austin 1984)对肾脏损 害的严重度进行分级，并且如以前描述的(Anders 2002)进行肾间质 损伤的形态计量法。将支气管周围炎症的严重度半定量地分级为0-4。 对于免疫染色，将经福尔马林固定的且用石蜡包埋的组织切片脱蜡并 再水化。通过3％过氧化氢来阻断内源性的过氧化物酶，并且在高压灭 菌烘箱中于抗原提取溶液(Vector，Burlingame，CA)中进行抗原提 取(retrieval)。使用抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒(Vector)来 阻断生物素。将载玻片与一抗一起孵育1小时，之后与生物素化的二 抗(抗大鼠IgG，Vector)和ABC试剂(Vector)一起孵育。在孵育 步骤之间，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤载玻片。将具有金属增强作用的 3’3’二氨基联苯胺(DAB，Sigma，Taufkirchen，Germany)用作检 测体系，产生了黑色产物。将甲基绿用作复染剂，将载玻片脱水并放 置在Histomount(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)中。 使用下列一抗：大鼠抗-Mac2(巨噬细胞，Cederlane，Ontario，Canada， 1:50)、抗-小鼠CD3(1:100，克隆500A2，BD)、抗-小鼠IgG1(1:100， M32015，Caltag Laboratories，Burlingame，CA，USA)、抗-小鼠IgG2a (1:100，M32215，Caltag)、抗-小鼠C3(1:200，GAM/C3c/FITC， Nordic Immunological Laboratories，Tilburg，Netherlands)。阴 性对照包括用相应的同种型抗体进行孵育。对于定量分析，以每个切 片在15个皮质肾小球中计数肾小球细胞。15个皮质肾小球切片上， 对肾小球Ig和C3c沉积物在0-3范围内进行评分。
RNA的制备和实时定量(TaqMan)RT-PCR
将来自每只小鼠的肾组织在液氮中速冻并在-80℃下贮存。从每只 动物中，如所描述的(Anders 2002)进行总肾RNA的制备和逆转录。 引物和探针来自PE Biosystems，Weiterstadt，Germany。所使用的 用于检测Cc12、Cc15和18S rRNA的引物(300nM)，预先开发的TaqMan 测定法试剂，来自PE Biosystems。
流式细胞术
在该研究结束时，从所有组的小鼠中获得总血样和骨髓样品。使 用FACScalibur仪器和先前经表征的MC21抗-mCCR2抗体(Mack 2001) 进行流式细胞术。将生物素化的抗-大鼠IgG抗体(BD Biosciences) 用于检测。将大鼠IgG2b(BD Biosciences)用作同种型对照。
统计学分析
数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。组之间的比较用单 变量ANOVA来完成。将Posthoc Bonferroni校正用于多重比较。p< 0.05的值被认为是表明了统计学显著性。
夹心杂交测定法
基于如Drolet等人，2000(Pharm Res 17：1503)所描述的测定 法，通过夹心杂交测定法来定量样品中的镜像异构体量。平行收集血 样以跟踪NOX-E36的血浆清除。制备所选择的组织用以测定镜像异构 体浓度。
杂交平板的制备
将镜像异构体mNOX-E36通过使用未验证的夹心杂交测定法来进 行定量。简而言之，将在0.5M磷酸钠、1mM EDTA(pH 8.5)中的 0.75mM mNOX-E36捕获探针(Seq.ID.No：281)在4℃下固定至白色 的DNA-BIND 96孔板(Corning Costar，Wiesbaden，Germany)过夜。 将孔洗涤两次并在37℃下用在0.25M磷酸钠、1mM EDTA(pH 8.5) 中的0.5％ w/v BSA封闭3小时，再次洗涤并在4℃下贮存直到使用。 在杂交前，将孔预先升温至37℃，并用预先升温的洗涤缓冲液 (3×SSC，0.5％[w/v]十二烷基肌氨酸钠，pH 7.0；预先制备无月桂酰 基肌氨酸钠的20×储液[3M NaCl，0.3M柠檬酸钠]，并相应地进行 稀释)洗涤两次。
样品的制备
将所有样品一式两份地进行测定。将血浆样品在冰上解冻，涡旋 振荡，并在冷却的台式离心机中简短地进行离心。将组织匀浆物在室 温下解冻，并在最大速度和室温下离心5分钟。只移出5μl的每种 样品用于测定法，并随后将其放回冷冻室进行贮存。按照下列方案， 在室温下将样品用杂交缓冲液(8nM mNOX-E36检测探针[Seq.ID： 282]，在洗涤缓冲液中)进行稀释：
1:30 5μl样品 +145μl杂交缓冲液
1:300 20μl 1:30 +180μl杂交缓冲液
1:3000 20μl 1:300 +180μl杂交缓冲液
1:30000 20μl 1:3000 +180μl杂交缓冲液。
检测所有的样品稀释液。将mNOX-E36标准品系列稀释成跨越0-4 nM范围的8-点校准曲线。不制备和检测QC样品。校准标准品与所研 究样品的那个相同。
杂交和检测
将样品在95℃下加热10分钟，并冷却至37℃。将镜像异构体/ 检测探针复合物在37℃下与经固定的捕获探针退火30分钟。通过分 别用洗涤缓冲液和1×TBST(20mMTris-Cl，137mM NaCl，0.1％ Tween 20，pH 7.5)洗涤两次来除去未结合的镜像异构体。在室温下，通过 在1×TBST中以1:5000稀释的链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶来检测杂 交的复合物1小时。为了除去未结合的缀合物，将孔用1×TBST和20mM Tris-Cl，1mM MgCl2，pH 9.8再次洗涤(每孔洗涤两次)。最后，用 100ml CSDP底物(Applied Biosystems，Darmstadt，Germany)充 满孔，并在室温下孵育45分钟。在FLUOstar Optima微量培养板读取 器(BMG Labtechnologies，Offenburg，Germany)上测量化学发光。
数据分析
将下面经测定的样品稀释物用于定量数据分析：
大鼠EDTA血浆 1:2000。
作为背景信号，减去从媒介物组(没有施用镜像异构体)获得的 数据。
对于镜像异构体NOX-36、NOX-E36-5’-PEG和NOX-E36-3’-PEG， 也以类似的方式进行如本文所描述的夹心杂交测定法，其中必须使用 相应的NOX-E36捕获探针(Seq.ID：255)和相应的NOX-E36检测探针 (Seq.ID：256)(数据未显示)。
结果
mNOX-E36-3’PEG改善MRLlpr/lpr小鼠的存活和肾病
雌性MRLlpr/lpr小鼠发展出并随后死于增生性免疫复合物性肾小球 肾炎，这与人类中的弥散性增生性狼疮肾炎惊人地相似。在该治疗性 研究设计中，在年龄的第14至24周时，将待治疗的MRLlpr/lpr小鼠用 PEG化的和未PEG化的抗-mCCL2镜像异构体、PEG化的和未PEG化的 对照(＂PoC＂)-镜像异构体或媒介物进行治疗。这时，媒介物、PoC 或PoC-PEG治疗的MRLlpr/lpr小鼠显示出弥散性增生性肾小球肾炎，其 特征在于肾小球巨噬细胞浸润以及混合的肾小球周和间质的炎性细胞 浸润物(其由肾小球和间质的Mac2-阳性巨噬细胞和间质的CD3-阳性 淋巴细胞组成)(图34和35)。mNOX-E36-3’PEG改善了狼疮肾炎的活 性指数和慢性指数以及前面提及的肾脏炎症的标志(图35)。未PEG 化的分子mNOX-E36对于慢性指数以及间质巨噬细胞和T细胞计数的效 果较小(图35)。通过在经媒介物、PoC和PoC-PEG治疗的小鼠中的肾 小管萎缩和间质纤维化的汇合面积来进一步说明了晚期慢性肾病(图 34)。通过将形态计量法应用于定量这些变化，发现PEG化的和未PEG 化的mNOX-E36减少了间隙体积、肾小管细胞损伤和肾小管扩张，这些 都是慢性肾病的严重度和预后的标志(图36)。mNOX-E36-3’PEG，而 不是未PEG化的mNOX-E36，改善了50％死亡率(图37)。因此， mNOX-E36-3’PEG可以减少肾巨噬细胞和T细胞浸润物的数目，并改 善MRLlpr/lpr小鼠的狼疮肾炎和(肾)存活。为了研究用mNOX-E36和 mNOX-E36-3’PEG治疗是否会影响MRLlpr/lpr小鼠中的肾内炎症，实施实 时RT-PCR来评估促炎趋化因子CCL2和CCL5的表达水平，先前表明在 肾病的发展过程中，CCL2和CCL5的表达水平在MRLlpr/lpr小鼠的肾脏中 被逐渐上调(Perez de Lema 2001)。与经媒介物治疗的对照相比较， 在年龄的第14至24周用mNOX-E36和mNOX-E36-3’PEG进行治疗减少 了CCL2和CCL5mRNA的肾表达(图38)。
抗-CCL2镜像异构体在MRLlpr/lpr小鼠中减少肾外的自身免疫性组 织损伤
在MRLlpr/lpr小鼠中，皮肤和肺通常也受自身免疫性组织损伤的影 响。在经媒介物治疗的小鼠中，自身免疫性肺病的特征在于中等的细 支气管周的和血管周的炎性细胞浸润物，并且在60％的小鼠中观察到 皮肤损害(图39、40和35)。分别与经媒介物、PoC和PoC-PEG治疗 的MRLlpr/lpr小鼠相比较，mNOX-E36和mNOX-E36-3’PEG两者都减少了 支气管周的炎症和皮肤疾病(图39、40和35)。因此，CCL2-特异性 镜像异构体的效果不局限于狼疮肾炎，而是延伸到MRLlpr/lpr小鼠中的 自身免疫性组织损伤的其他表现。
mNOX-E36和在MRLlpr/lpr小鼠中的淋巴组织增生综合征、dsDNA自 身抗体及血清细胞因子水平
雌性MRLlpr/lpr小鼠发展出了淋巴组织增生综合征，其特征在于严 重的脾肿大以及颈部、腋窝、腹股沟和肠系膜淋巴结团块。mNOX-E36 和mNOX-E36-3’PEG两者都对MRLlpr/lpr小鼠中的脾重量和淋巴结重量 没有影响(图41)。MRLlpr/lpr小鼠中的自身免疫的特征在于针对多种核 抗原(包括dsDNA)的自身抗体的产生。在24周龄的MRLlpr/lpr小鼠中， 血清dsDNA IgG，IgG1、IgG2a、IgG2b自身抗体以高水平存在。mNOX-E36 和mNOX-E36-3’PEG两者都对任一种这些DNA自身抗体没有影响(图 41)。在经媒介物治疗的MRLlpr/lpr小鼠中的狼疮样疾病的特征在于升高 的IFN-α、IL-12p40和IL-6的血清水平。mNOX-E36和mNOX-E36-3’ PEG两者都对任一种这些炎症介质没有影响(图41)。因此，这两种 mNOX-E36变体都不影响MRLlpr/lpr小鼠中的淋巴组织增生、抗-dsDNA IgG 产生和血清细胞因子水平。
MRLlpr/lpr小鼠中mNOX-E36和mNOX-E36-3’PEG的血浆水平
以一周的间隔测定mNOX-E36和mNOX-E36-3’PEG血浆水平，以便 在MRLlpr/lpr小鼠的进行性肾病过程中监控药物暴露。在该研究的整个 过程中，在注射后3小时的平均mNOX-E36血浆水平和在注射后24小 时的平均mNOX-E36-3’PEG血浆水平分别为约300nM和1μM(图42)。 因此，PGE化增加了mNOX-E36的血浆水平，并且MRLlpr/lpr小鼠的进行 性肾病没有调节这两种镜像异构体的药物动力学。
mNOX-E36-3’PEG阻断单核细胞从骨髓中渗出
据显示，细菌感染过程中单核细胞从骨髓中的渗出涉及趋化因子 受体CCR2(Serbina 2006)，但是CCL2在自身免疫情形中的作用仍然 是假定的。因此，在24周龄MRLlpr/lpr小鼠的经mNOX-E36-3’PEG和媒 介物治疗的组的小鼠中，检查了外周血和骨髓中的CCR2-阳性单核细 胞群体。用mNOX-E36-3’PEG进行治疗使骨髓中的CCR2阳性细胞百分 比从13％增加至26％，而它使外周血中的该群体从26％减少至11％(图 43)。这些数据支持了CCL2对于在MRLlpr/lpr小鼠的自身免疫性疾病过 程中CCR2阳性细胞从骨髓中逃逸出的作用。
总结
通过应用镜像异构体技术，产生了新的且特异性的mCCL2拮抗剂， 其在体外和体内有效地阻断mCCL2。事实上，最近出现的使用CCL2镜 像异构体进行治疗在MRLlpr/lpr小鼠中显著改善了晚期狼疮样自身免疫 性组织损伤。这些数据支持了CCL2在慢性炎性组织损伤中的中心作 用，并将CCL2镜像异构体鉴定为新的用于自身免疫组织损伤的治疗 剂。
实施例9：使用抗-mMCP-1镜像异构体治疗在经单侧肾切除的糖尿病小 鼠中的糖尿病性肾病
糖尿病性肾病依然是终末期肾病的最主要原因，因为靶向血管紧 张素依赖性的病理机制常常不能防止疾病的进展(Zimmet 2001；Ritz 1999；United States Renal Data System 2004；Svensson 2003)。 因此，对于糖尿病性肾病的治疗方法需要加入其他治疗策略。
来自最近的实验研究的数据将糖尿病性肾病的发展与肾内炎症相 关联(Galkina 2006；Mora 2005；Meyer 2003；Tuttle 2005)。例 如，吗替麦考酚酸酯、甲氨蝶呤或辐射减少了患有经链脲佐菌素诱导 的糖尿病性肾病的大鼠中的尿白蛋白排泄和肾小球硬化(Yozai 2005； Utimura 2003)。然而，糖尿病性肾病中的肾内炎症的分子和细胞机 制依然很难表征。患有糖尿病性肾病的患者具有增加的炎症的急性期 标记物的血清水平，但这可能并不可代表肾内炎症(Dalla Vestra 2005； Navarro 2003)。患有糖尿病性肾病的患者将高水平的CC-趋化因子 单核细胞化学吸引蛋白1(MCP-1/CCL2)排泄于尿中，这可能对于肾 内炎症来说是更特异的(Morii 2003；Tashiro 2002；Takebayashi 2006)。事实上，MCP-1/CCL2是由暴露于高的葡萄糖浓度或高级糖基 化终产物的人肾小球膜细胞所表达的(Ihm 1998；Yamagishi 2002)。 CCL2参与白细胞从血管内募集至血管外区室(即肾小球和肾间质)中 这一复杂的多步骤过程(Baggiolini 1998)。实际上，巨噬细胞浸润 物是人和实验性的糖尿病性肾小球硬化及肾小管间质损伤中的普遍发 现(Bohle 1991；Furuta 1993；Chow 2007)。Cc12-缺陷型1型或2 型糖尿病小鼠具有更低的肾小球巨噬细胞计数，这与较少的肾小球损 伤相关(Chow 2004；Chow 2006)。在这些研究中，还证实了CCL2 对于1型和2型糖尿病性肾病的肾小球病理学的功能性作用。因此， CCL2可能代表了对于糖尿病性肾病的潜在的治疗靶标，并且具有有利 的药物动力学特性曲线的合适CCL2拮抗剂在该疾病情形中应当被证 实是有效的。在该实施例中，我们报导了PEG化的抗-CCL2镜像异构 体mNOX-E36-3’PEG在患有晚期糖尿病性肾病的2型糖尿病db/db小 鼠中的效果。我们显示，抗CCL2-镜像异构体应该适合用于治疗糖尿 病性肾病。
动物和实验方案
5周龄的雄性C57BLKS db/db或C57BLKS野生型小鼠从Taconic (Ry，Denmark)获得，并将其在研究期间圈养于具有过滤盖的笼中， 采用12小时黑暗/光照循环并且可不受限制地摄取食物和水。将笼、 草垫、小巢(nestlets)、食物和水在使用前通过高压灭菌法进行灭 菌。在6周龄时，如以前所描述的(Bower 1980)，在db/db和野生 型小鼠中通过1cm的胁腹切口实施单侧肾切除术(“1K”小鼠)或假 手术(“2K”小鼠)。在假手术组的小鼠中，肾脏保留在原位。10周 后，在4个月大时，将1K db/db小鼠分成两组，其每周3次接受使用 在5％葡萄糖中的mNOX-E36-3’PEG或PoC-PEG(剂量，0.9μ mol/kg； 注射体积，1ml/kg)的皮下注射。让该治疗持续8周(直到6个月大)， 到那时，将动物处死并获得组织以用于组织病理学评估。所有的实验 操作过程都已经得到当地政府机构的批准。
糖尿病性肾病的评估
如所描述的(Anders 2002)，在石蜡包埋的切片上实施所有免疫 组织学研究。将下列抗体用作一抗：大鼠抗-Mac2(肾小球巨噬细胞， Cederlane，Ontario，Canada，1:50)、抗-Ki-67(细胞增殖，Dianova， Hamburg，Germany，1:25)。对于组织病理学评估，从每只小鼠中， 将肾脏的一部分在磷酸盐缓冲盐水中的10％福尔马林中进行固定，并 包埋于石蜡中。按照供应商(Bio-Optica，Milano，Italy)的说明书， 将3μm-切片用高碘酸-希夫试剂或银进行染色。肾小球硬化损害通过 如下采用由不知情的观察者进行半定量评分来评估：分别地，0＝无损 害，1＝<25％硬化，2＝25-49％硬化，3＝50-74％硬化，4＝75-100％ 硬化。每个切片分析15个肾小球。如以前描述的(Anders 2002)， 通过将100个点的网格叠合在10个非重叠的皮质区域上来测定间隙体 积指数和肾小管扩张指数。由不知情的观察者在15个高倍视野(hpf， 400×)中测定间质细胞计数。从脱石蜡的肾小球中进行RNA制备和实 时定量(TaqMan)RT-PCR。在60℃下于裂解缓冲液(10mM Tris-HCl、 0.1mM EDTA、2％ SDS和20μg/ml蛋白酶K)中孵育16小时后，实施 基于苯酚-氯仿的RNA提取。将肾小球RNA溶解于10μl无RNA酶的水 中。如所描述的(Anders 2002，Cohen 2002)，从总器官和肾小球 RNA中实施逆转录和实时RT-PCR。关于靶和管家基因由ddH2O组成的 对照是阴性的。用于mCc12、Gapdh和18S rRNA的寡核苷酸引物(300 nM)和探针(100nM)是来自PE的预先开发的TaqMan测定法试剂。 引物和探针来自ABI Biosystems，Weiterstadt，Germany。通过在单 次推注后5、10、15、20、35、60和90分钟时的血浆FITC-菊粉 (Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)的清除动力学来测定肾小 球滤过率(GFR)(Qi 2004)。荧光以485nm的激发进行测定，并以 535nm的发射进行读取。使用非线性回归曲线拟合软件(GraphPad Prism，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)，基于二室模型 来计算GFR。将所有数据都表示为平均值±SEM。使用ANOVA来进行组 的比较，并且此后将Bonferroni校正用于多重比较。p<0.05的值 被认为是表明了统计学显著性。
结果
mNOX-E36-3’PEG减少了经单侧肾切除的db/db小鼠中的肾小球 巨噬细胞计数和总体肾小球硬化
当功能性CCL2的缺乏与db/db小鼠中肾小球巨噬细胞募集的减少 有关(Chow 2007)并且mNOX-E36-3’PEG能够在体外和体内阻断CCL2- 介导的巨噬细胞募集，则mNOX-E36-3’PEG应当削弱患有晚期2型糖 尿病性肾病的db/db小鼠中的肾巨噬细胞募集。为了检验这一假设， 我们在4个月大的经单侧肾切除的(＂1K＂)db/db小鼠中开始皮下注 射mNOX-E36-3’PEG或PoC-PEG。该治疗持续8周，到那时，收集组 织以用于评估糖尿病性肾病。在这一过程中，mNOX-E36-3’PEG治疗 没有显著影响白细胞或血小板计数、血糖水平或体重，而白细胞或血 小板计数、血糖水平或体重在所有db/db小鼠组中都相比非糖尿病 BLKS小鼠而言显著升高(数据未显示)。有趣的是，mNOX-E36-3’PEG 增加了1K db/db小鼠中的CCL2血清水平，这表明CCL2拮抗剂使CCL2 保留在循环中(图44)。与我们的假设相一致，与经PoC-PEG或媒介 物治疗的db/db小鼠相比较，mNOX-E36-3’PEG使肾小球巨噬细胞的 数目显著减少了40％，这与在经mNOX-E36-3’PEG治疗的db/db小鼠 的肾小球内Ki-67阳性增殖性细胞数目较低相关(图45)。这些发现 与1K db/db小鼠中总体糖尿病性肾小球硬化的显著改善有关(图46)。 实际上，mNOX-E36-3’PEG治疗使1K db/db小鼠中的糖尿病性肾小球 硬化减轻至在年龄相当的未经肾切除的(＂2K＂)db/db小鼠中所存在 的肾小球硬化的程度(图46)。这些发现显示，由mNOX-E36-3’PEG 引起的CCL2-依赖性肾小球巨噬细胞募集的延迟阻断可在2型糖尿病 db/db小鼠中预防总体糖尿病性肾小球硬化。
mNOX-E36-3’PEG改善了1K db/db小鼠中的GFR
mNOX-E36-3’PEG治疗对于1K db/db小鼠中的糖尿病性肾小球硬 化的有益效果应当与更好的GFR相关。我们在db/db小鼠中分析了作 为GFR的标志的FITC-菊粉清除动力学(Qi 2004)。与db/db小鼠中 正常的大约250ml/分钟的GFR(Qi 2004)相比较，我们发现在注射 了PoC-PEG的6个月大的1K db/db小鼠中GFR降低为112±23ml/ 分钟(图47)。mNOX-E36-3’PEG治疗在1K db/db小鼠中将GFR显著 改善至231±30ml/分钟(p<0.001)，这暗示阻断CCL2-依赖性 肾小球巨噬细胞募集也可以改善2型糖尿病小鼠中的肾功能。
mNOX-E36-3’PEG减少了1K db/db小鼠中的间质巨噬细胞计数和 肾小管间质损伤
人的晚期糖尿病性肾病与显著数量的间质巨噬细胞和肾小管间质 损伤相关(Bohle 1991)。在2K db/db小鼠中，间质巨噬细胞浸润物 和显著的肾小管间质损伤不在8月龄之前出现(Chow 2007)。在db/db 小鼠中，早期单侧肾切除术加速了肾小管间质病理学的发展(Ninichuk 2005)，因而我们对间质巨噬细胞、肾小管扩张和间隙体积进行定量 以作为6月龄的所有组的小鼠中肾小管间质损伤的标志。在这时，与 2K db/db小鼠相比较，1K db/db小鼠显示出间质巨噬细胞的数目增加 以及肾小管扩张和间隙体积显著升高(图45，图48)。mNOX-E36-3’ PEG治疗使1K db/db小鼠中的间质巨噬细胞数目减少了53％，而且还 减少了肾小管扩张和间隙体积(图45，图48)。因此，阻断CCL2-依 赖性肾巨噬细胞募集还可预防2型糖尿病db/db小鼠中的肾小管间质 损伤。
mNOX-E36-3’PEG减少了1Kdb/db小鼠中Cc12的肾表达
巨噬细胞浸润物增强了组织损伤中的炎症应答，例如局部的CCL2 表达。因此，我们假定，肾巨噬细胞的与mNOX-E36-3’PEG相关的减 少应该与较低的肾CCL2表达有关。我们利用实时RT-PCR来定量db/db 小鼠中CCL2的mRNA表达。与年龄相当的经PoC-PEG治疗的小鼠相比 较，mNOX-E36-3’PEG减少了6个月大的1K db/db小鼠肾脏中的CCL2 的mRNA水平(图49)。为了进一步评估CCL2的空间表达，我们在肾 切片上进行了对于CCL2蛋白质的免疫染色。与2K db/db小鼠或2K 野生型小鼠相比较，在1K db/db小鼠中，CCL2的表达在肾小球、肾 小管和间质细胞中明显提高(图50)。与经媒介物或PoC-PEG治疗的 1K db/db小鼠相比较，mNOX-E36-3’PEG明显减少了在所有这些区室 中的CCL2染色。这些数据表明，用mNOX-E36-3’PEG阻断CCL2-依赖 性肾巨噬细胞募集减少了1K db/db小鼠中CCL2的局部表达。
总结
炎症促进人糖尿病性肾病的发展这一概念逐渐变得为人所接受 (Tuttle 2005)，这使得MCP-1/CCL2作为潜在的靶标来治疗该疾病 成为焦点。在该实施例中，我们已经显示，用mNOX-E36-3’PEG治疗 经单侧肾切除的糖尿病小鼠在6月龄时减少了肾小球(和间质)的巨 噬细胞数目，这与较少的增殖性肾小球细胞相关。另外，用 mNOX-E36-3’PEG治疗使CCL2 mRNA的肾/肾小球表达明显减少。此外， 治疗组中较少数目的肾小球巨噬细胞和肾小球增殖性细胞与保护免于 总体肾小球硬化以及与显著改善的肾小球滤过率有关。mNOX-E36-3’ PEG对于糖尿病小鼠中的肾小球病理学和肾功能的有益效果与在其他 肾小球损伤模型中使用其他CCL2拮抗剂的那些研究(Lloyd 1997， Hasegawa 2003，Tang 1996，Wenzel 1997，Fujinaka 1997，Schneider 1999)相一致。引人注意的是，CCL2阻断的延迟发生也减少了1K db/db 小鼠中的间质巨噬细胞数目，这与较少的肾小管间质病理学相关。
总之，这些数据证实了CCL2为具有前景的用于糖尿病性肾病的治 疗靶标，并暗示了用镜像异构体起始CCL2阻断(即使在疾病的晚期) 仍然具有保护作用。
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如果未表明与此相反，本文所引用的文献的完整参考文献资料(将 其公开内容通过提及而合并入本文)如下：
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在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征(分开地 和以其任意组合)是用于以本发明的各种形式来实现本发明的材料。
序列表
<110>NOXXON Pharma AG
<120>结合MCP-1的核酸
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<223>合成的
<400>111
<210>112
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>112
<210>113
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>113
<210>114
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>114
<210>115
<211>37
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(37)
<223>合成的
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<210>116
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>NOX-E36-3’PEG
<220>
<221>L-RNA
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<223>合成的
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>3’PEG化
<400>117
<210>118
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<223>合成的
<400>118
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<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<223>合成的
<400>120
<210>121
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
<400>121
<210>122
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
<400>122
<210>123
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
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<223>合成的
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<210>125
<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
<400>125
<210>126
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
<400>126
<210>127
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>127
<210>128
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
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<223>合成的
<400>128
<210>129
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(46)
<223>合成的
<400>129
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<212>PRT
<213>人工序列
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<223>合成的
<220>
<221>生物素化
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<223>合成的
<400>130
<210>131
<211>76
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>D-蛋白质
<222>(1)..(76)
<223>合成的
<220>
<221>生物素化
<222>(1)..(1)
<223>合成的
<220>
<221>生物素化
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<223>合成的
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<210>132
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
<400>132
<210>133
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(45)
<223>合成的
<400>133
<210>134
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<400>134
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<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>135
<210>136
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(47)
<223>合成的
<400>136
<210>137
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<223>合成的
<400>137
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<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<221>D-RNA
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<223>合成的
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<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<223>合成的
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<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>142
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<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<223>合成的
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<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<210>145
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
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<223>合成的
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<212>RNA
<213>人工序列
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<223>MCP-1结合剂
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<223>合成的
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<211>43
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<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>150
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<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>151
<210>152
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<212>RNA
<213>人工序列
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<223>合成的
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<211>41
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
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<400>160
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<220>
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<223>合成的
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<210>162
<211>49
<212>RNA
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<223>MCP-1结合剂
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<211>48
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<223>合成的
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<211>46
<212>RNA
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<211>46
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<211>44
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<213>人工序列
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<221>D-RNA
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<211>44
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<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
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<223>MCP-1结合剂
<220>
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<222>(1)..(44)
<223>合成的
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<211>44
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<223>合成的
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<210>185
<211>44
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<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
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<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<400>187
<210>188
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>188
<210>189
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>189
<210>190
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>190
<210>191
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>191
<210>192
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>192
<210>193
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(42)
<223>合成的
<400>193
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<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>194
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<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>196
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<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>197
<210>198
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>198
<210>199
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>199
<210>200
<211>38
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>200
<210>201
<211>38
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(38)
<223>合成的
<400>201
<210>202
<211>34
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(34)
<223>合成的
<400>202
<210>203
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>203
<210>204
<211>34
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
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<223>合成的
<400>204
<210>205
<211>32
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(32)
<223>合成的
<400>205
<210>206
<211>34
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(34)
<223>合成的
<400>206
<210>207
<211>32
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(32)
<223>合成的
<400>207
<210>208
<211>30
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(30)
<223>合成的
<400>208
<210>209
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(52)
<223>合成的
<400>209
<210>210
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(52)
<223>合成的
<400>210
<210>211
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(52)
<223>合成的
<400>211
<210>212
<211>51
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(51)
<223>合成的
<400>212
<210>213
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>213
<210>214
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>214
<210>215
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>215
<210>216
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>216
<210>217
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>217
<210>218
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>218
<210>219
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>219
<210>220
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>220
<210>221
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>221
<210>222
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>222
<210>223
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>223
<210>224
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>224
<210>225
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>225
<210>226
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(47)
<223>合成的
<400>226
<210>227
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(47)
<223>合成的
<400>227
<210>228
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(45)
<223>合成的
<400>228
<210>229
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(45)
<223>合成的
<400>229
<210>230
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(45)
<223>合成的
<400>230
<210>231
<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(44)
<223>合成的
<400>231
<210>232
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>232
<210>233
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>233
<210>234
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>234
<210>235
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>235
<210>236
<211>39
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(39)
<223>合成的
<400>236
<210>237
<211>37
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(37)
<223>合成的
<400>237
<210>238
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(40)
<223>5’PEG化
<400>238
<210>239
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(40)
<223>3’-PEG化
<400>239
<210>240
<211>58
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(58)
<223>合成的
<400>240
<210>241
<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(56)
<223>合成的
<400>241
<210>242
<211>53
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(53)
<223>合成的
<400>242
<210>243
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(52)
<223>合成的
<400>243
<210>244
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<400>244
<210>245
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>245
<210>246
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(46)
<223>合成的
<400>246
<210>247
<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(44)
<223>合成的
<400>247
<210>248
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>248
<210>249
<211>48
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(48)
<223>合成的
<400>249
<210>250
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(46)
<223>合成的
<400>250
<210>251
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>D-RNA
<222>(1)..(46)
<223>合成的
<400>251
<210>252
<211>76
<212>PRT
<213>黑家鼠
<400>252
<210>253
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(50)
<223>5’-PEG化
<400>253
<210>254
<211>50
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>MCP-1结合剂
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(50)
<223>合成的
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(50)
<223>3’-PEG化
<400>254
<210>255
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NOX-E36捕获探针
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(11)
<223>合成的
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(11)
<223>-(间隔物18)2-nh4+，在3’末端
<400>255
<210>256
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NOX-E36检测探针
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(9)
<223>合成的
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(9)
<223>5’-生物素-(间隔物18)
<400>256
<210>257
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL1/I-309
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(73)
<223>合成的
<400>257
<210>258
<211>69
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL3/MIP-1？
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(69)
<223>合成的
<400>258
<210>259
<211>69
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL4/MIP-1beta
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(69)
<223>合成的
<400>259
<210>260
<211>68
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL5/RANTES
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(68)
<223>合成的
<400>260
<210>261
<211>82
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL13/MCP-4
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(82)
<223>合成的
<400>261
<210>262
<211>74
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CCL14/HCC-1
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(74)
<223>合成的
<400>262
<210>263
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL1/GROalpha
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(73)
<223>合成的
<400>263
<210>264
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL2/GRObeta
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(73)
<223>合成的
<400>264
<210>265
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL3/GROgama
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(73)
<223>合成的
<400>265
<210>266
<211>70
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL4/PF4
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(70)
<223>合成的
<400>266
<210>267
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL5/ENA-78
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(77)
<223>合成的
<400>267
<210>268
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL6/GCP-2
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(77)
<223>合成的
<400>268
<210>269
<211>94
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL7/NAP-2
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(94)
<223>合成的
<400>269
<210>270
<211>79
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL8/IL-8
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(79)
<223>合成的
<400>270
<210>271
<211>103
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL9/MIG
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(103)
<223>合成的
<400>271
<210>272
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL10/IP-10
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(77)
<223>合成的
<400>272
<210>273
<211>73
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL11/I-TAC
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(73)
<223>合成的
<400>273
<210>274
<211>72
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL12alpha/SDF-1alpha
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(72)
<223>合成的
<400>274
<210>275
<211>72
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CXCL12beta/SDF-1beta
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(72)
<223>合成的
<400>275
<210>276
<211>76
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CX3CL1/Fractalkine
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(76)
<223>合成的
<400>276
<210>277
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>XCL1/淋巴细胞趋化因子
<220>
<221>L-蛋白质
<222>(1)..(93)
<223>人工的
<400>277
<210>278
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>生物素化的NOX-E36
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>5’生物素
<400>278
<210>279
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>POC
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<400>279
<210>280
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>POC-PEG
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>合成的
<220>
<221>L-RNA
<222>(1)..(40)
<223>5’PEG化
<400>280
<210>281
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mNOX-E36捕获探针
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(11)
<223>合成的
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(11)
<223>3’-(间隔物18)2-NH4+
<400>281
<210>282
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mNOX-E36检测探针
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(9)
<223>合成的
<220>
<221>L-DNA
<222>(1)..(9)
<223>5’-生物素-(间隔物18)2-
<400>282
<210>283
<211>76
<212>PRT
<213>家马
<400>283
<210>284
<211>76
<212>PRT
<213>家牛
<400>284
<210>285
<211>125
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>285
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