一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用组合物
阅读：123发布：2020-05-22
专利汇可以提供一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的 炎症 性 疾病 的 预防 或 治疗 用药物组合物。本 发明人 确认过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)比正常MSC具有更强的抗 氧 化活性和免疫调节功能，因此，过表达SOD3的MSC可以成为对炎症性疾病、自身免疫疾病或器官移植排斥等的有效治疗制剂。，下面是一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用组合物专利的具体信息内容。
1.一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用药物组合物。
2.根据权利请求第1项的所述组合物，其特征为，所述干细胞为间充质干细胞。
3.根据权利请求第2项的所述组合物，其特征为，所述间充质干细胞来源于由脐带、脐带血、胎盘、骨髓、脂肪组织、肌肉、羊水和羊膜组合的群中选择的组织。
4.根据权利请求第1项的所述组合物，其特征为，所述炎症性疾病为Th2或Th17介导性疾病。
5.根据权利请求第4项的所述组合物，其特征为，所述Th2或Th17介导性疾病选自由器官移植排斥反应、自身免疫疾病、炎症性肠道疾病、炎症性眼病、炎症性皮肤病和过敏性疾病组合的群。
6.根据权利请求第1项的所述组合物，其特征为，所述炎症性疾病选自由急性或慢性器官移植排斥、移植物抗宿主病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎症性皮肤病、多发性硬化症、胰腺炎、外伤引发休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、囊性纤维化、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性毛细支气管炎、慢性毛细支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、赖特尔综合症、银屑病性关节病、肠病性关节炎、幼年型关节炎、幼年型强直性脊柱炎、反应性关节病、感染性关节炎、后感染性关节炎、肌萎缩侧索硬化、结节性多动脉炎、过敏性血管炎、韦格纳肉芽肿病、类风湿性多发性肌痛、关节细胞动脉炎、钙晶体性关节病、假性痛风、非关节风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎、神经性关节疾病、关节出血症、过敏性紫癜、肥厚性骨关节炎、多发性网状组织细胞瘤、脊柱侧弯、血色素沉着病、血红蛋白病、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、家族性地中海热、贝切特氏病、系统性红斑性狼疮、回归热、多发性硬化症、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能障碍综合征、慢性阻塞性肺疾患、类风湿性关节炎、急性肺损伤、支气管肺发育不良、1型糖尿病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏痴呆、家族性寒冷自体炎症综合征、穆-韦二氏综合征、新生儿多发性炎性疾病、慢性婴儿神经性皮肤关节综合征、成人斯蒂尔病、接触性皮炎、葡萄胎、PAPA综合征(化脓性关节炎综合征、坏疽性脓皮病和痤疮)、超免疫球蛋白d综合征、冷吡啉相关的周期性综合征、角膜炎、结膜炎、视网膜炎、视网膜血管炎、葡萄膜炎、睑缘炎、过敏性结膜炎、干眼症、进行性系统性硬化症、多肌炎、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力、结节性多动脉炎和纤维肌痛综合征组合的群中的一种以上疾病。
7.根据权利请求第6项的所述组合物，其特征为，所述炎症性皮肤疾病选自由银屑病、特应性皮炎、湿疹性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、玫瑰糠疹、扁平苔藓、血管炎、毛发红糠疹、蜂窝织炎、毛囊炎、痈、天疱疮、大疱性天疱疮、表皮水疱、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、红斑和皮肤嗜酸性粒细胞增多症组合的群中的一种以上疾病。
8.根据权利请求第1项的所述组合物，其特征为，所述SOD3包含由SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
9.根据权利请求第1项的所述组合物，其特征为，所述过表达SOD3的干细胞通过用包含编码SOD3的多核苷酸的重组表达载体转染干细胞获得。
10.根据权利请求第9项的所述组合物，其特征为，所述重组表达载体选自由逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体和禽痘病毒载体组合的群。
11.根据权利请求第9项的所述组合物，其特征为，所述编码SOD3的多核苷酸包含由SEQ ID NO：2所示的或由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
12.一种用于制备炎症性疾病的治疗用制剂的过表达SOD3的干细胞的用途。
13.一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的药物组合物按照有效量投入到所需的个体。
一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的
技术领域
[0002] 本申请涉及一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用组合物，更具体而言，涉及一种包含过表达SOD3(extracellular superoxide dismutase)的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用药物组合物。
背景技术
[0003] 炎症性疾病是由于各种外部刺激或内部因素，使人体多种器官或组织出现炎症性免疫细胞的浸润以及浮肿、发红、疼痛，并显现出组织学变化的状态。这些炎症是由损伤组织和游走细胞(migrating cell)产生的多种化学介质因子引起的，这些化学介质因子根据炎症过程的形态而不同。正常情况下，人体通过炎症反应，将发病因素中和去除或再生受损的组织从而恢复正常的结构和功能，而在一些相反情况下也会导致慢性炎症等疾病状态。
[0004] 用于治疗炎症性疾病的最常见的炎症性疾病预防或治疗用制剂分为甾体和非甾体炎症性疾病预防或治疗用制剂，并且大多数合成的炎症性疾病预防或治疗用制剂除主要作用以外具有各种副作用，因此迫切需要开发一种具有优异的效果和较少副作用的炎症性疾病的预防或治疗用制剂。
[0005] 另一方面，间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是能够分化成间充质组织系统的多能前体细胞。这些细胞可以通过调节各种细胞中的适应性和先天性免疫反应来介导潜在的免疫调节效应，正在成为治疗自身免疫性疾病的新的对策。该细胞也已知具有免疫抑制和抗炎作用(欧洲注册专利第EP02298861号，美国公开专利第US20120269774号)以及抑制T细胞活化和增殖的作用(Li ZJ等，PloS ONE 8(10)：77159,2013)。
[0006] 然而，目前仅公开了MSC的一般抗炎症效果，而最优化的、从而使其对于炎症相关疾病具有更强效果的MSC干细胞治疗制剂尚未被开发出来。因此，迫切需要开发适用于预防或治疗炎症性疾病的MSC治疗制剂。发明内容
[0007] 为此，本发明者们在研究副作用小且包含适合于炎症性疾病的预防及治疗的干细胞的、炎症性疾病的治疗制剂的过程中，发现在间充质干细胞(MSC)中过表达SOD3时，免疫调节和抗氧化效果等功能显著提高，从而完成了本发明。
[0008] 因此，本发明的目的是，提供一种包含过表达SOD3(extracellular superoxide dismutase)的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用药物组合物。
[0009] 本发明的另一个目的是，提供用于制备炎症性疾病的治疗用制剂的过表达SOD3的干细胞的用途。
[0010] 本发明的又一个目的是，提供一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含所述过表达SOD3的干细胞作为活性成分的药物组合物按照有效量投入到所需的个体。
[0011] 因此，为了达到所述目的，本发明提供一种包含过表达SOD3(extracellular superoxide dismutase)的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用药物组合物。
[0012] 为了达到本发明的另一个目的，本发明提供用于制备炎症性疾病的治疗用制剂的过表达SOD3的干细胞的用途。
[0013] 为了达到本发明的又一个目的，本发明提供一种炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含所述过表达SOD3的干细胞作为活性成分的药物组合物按照有效量投入到所需的个体。
[0014] 下面将对本发明进行详细说明。
[0015] 除非另有定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义，并且符合以下文献的记载(Singleton et al,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2nd Ed.,1994；Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik,Immunobiology,5th Ed.,2001)。
[0016] 本发明提供一种包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用药物组合物。
[0017] 根据本发明的药物组合物可以是包含SOD3作为活性成分的组合物，由作为活性成分的SOD3组成的组合物或基本上由作为活性成分的SOD3组成的组合物。
[0018] 本说明书中术语“包含(comprising)..”与“含有(including)”或“作为特征(characterized by)”含义相同，对于本发明的组合物或方法，并不排除其他未提及的追加的组成成分或方法步骤。而且，术语“由...组成(consisting of)”意味着排除没有另外描述的任何追加的要素、步骤或成分。术语“基本上由...组成(essentially consisting of)”是指对于组合物或方法的范围，除了所描述的物质或步骤之外，还可包括不会实质上影响其基本特性的物质或步骤。
[0020] 术语“SOD3(超氧化物歧化酶3，胞外；superoxide dismutase 3,extracellular)”是指作为细胞外分泌超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，EC-SOD)蛋白质，在超氧化物歧化酶蛋白质的3个种类中向细胞外分泌的蛋白质。人的野生型(wild-type，WT)SOD3蛋白的氨基酸序列已知为NCBI基因银行数据库中的NP_003093.2等登录号(accession number)，编码人SOD3蛋白的mRNA的核苷酸序列已知为NM_003102.2等登录号(accession number)。
[0021] SOD3蛋白催化阴离子的歧化(dismutation)反应，并且分泌到细胞外，存在于细胞外基质(extracellular matrix)，具有抗血管生成、抗发炎、抗趋化、抗癌活性等效果。具体而言，对皮肤癌、色素沉着性疾病、光老化、皮炎、表皮增殖性疾病、银屑病、特应性皮炎、荨麻疹、过敏等疾病具有有效的治疗效果(韩国注册专利第100676502号)，并且对血管新生引起的疾病的治疗及预防也有效果(韩国注册专利第101019470号)。另外，已知对结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈部癌、恶性黑素瘤、淋巴瘤等也有治疗效果(韩国公开专利第10-2008-108876号)。
[0022] 在本发明中，SOD3是指来自包括人和小鼠的哺乳动物，优选来自人的蛋白质，最优选为包含由SEQ ID NO：1所示的人的野生型SOD3蛋白的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：3所示的重组SOD3蛋白(209E-SOD3)的氨基酸序列。
[0023] 所述人的野生型SOD3在N-末端位点含有起始的甲硫氨酸氨基酸到第18位的丙氨酸为止为信号肽，活化的SOD3由除去所述信号肽的222个氨基酸组成。SOD3的C末端区域(氨基酸残基第210-第215)具有肝素结合域(heparin binding domain)。由包括信号肽的240个氨基酸组成的全长人SOD3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0024] 在本发明中，SOD3可以由209个氨基酸组成，即全长人SOD3中去除包含N-末端位点的信号肽和C-末端位点的包含肝素结合域的13个氨基酸(氨基酸残基第210-第222)。所述去除了信号肽和肝素结合域的SOD3蛋白在本发明中可以被称为209E-SOD3或209E，并且优选具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。209E-SOD3也可以与抗SOD3抗体结合，并已被证实具有与野生型SOD3相同的酶活性和ROS去除活性(韩国公开专利第10-2008-0108876号)。
[0025] 本发明中的SOD3包括具有与野生型SOD3或209E-SOD3蛋白基本等同的生理活性的SOD3蛋白的功能等同物(functional equivalent)、功能衍生物(functional derivative)及所述SOD3蛋白的片段。基本等同的生理活性是指酶的活性和/或细胞外分泌特性及细胞内渗透性等同于野生型SOD3的水平，而且，由于酶活性等同于SOD3，在干细胞中，优选在充质干细胞中过表达时，可提高干细胞的免疫和炎症控制能力。所述干细胞的免疫和炎症控制能力是指抑制炎症引起的免疫细胞的浸润、抑制促炎性T细胞的增殖和分化以及促炎介质体/细胞因子的表达，增加具有炎症控制功能的Treg细胞的增殖和分化及与Treg相关细胞因子的表达，抑制NFkB信号传导通路的磷酸化，如本说明书中描述的本发明的过表达SOD3的干细胞所具有的特性。
[0026] 所述SOD3的功能等同物优选为与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％的序列同源性(homology)的多肽。所述功能等同物也可以是本发明的SOD3的一些氨基酸序列的添加，取代或缺失的产物。所述氨基酸的取代优选为保守取代。天然存在的氨基酸保守取代的实例包括：脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Pro)、疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)、芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)和含硫氨基酸(Cys、Met)。另外，所述功能等同物还包括在本发明的SOD3的氨基酸序列中的一部分氨基酸缺失的变体。所述氨基酸的缺失或取代优选地位于与蛋白质SOD3的生理活性无直接关联的区域。并且还包括在所述SOD3的氨基酸序列的两个末端或序列中添加一些氨基酸的变体。例如，可以是209E-SOD3，即不影响SOD3的酶活性且SOD3全长的一部分被去除的肽，也可以是具有与SOD3蛋白基本等同生理活性的SNP(小核苷酸多态，small nucleotide polymorphism)等SOD3的多态性(polymorphism)蛋白。
[0027] 本发明的功能等同物的范围还包括保持本发明的SOD3蛋白质的基本骨架及其生理活性的同时，蛋白质的一部分化学结构被修饰的多肽衍生物。实例包括但不限于改变本发明的SOD3蛋白质的稳定性、细胞内渗透性、储存性、挥发性或溶解度的结构修饰。
[0028] 本发明的药物组合物中包含的作为活性成分的过表达SOD3的干细胞优选为间充质干细胞。
[0029] 本发明的“间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)”可以为骨(bone)、软骨(cartilage)、脂肪组织(fat tissue)、筋(腱)、神经组织(nerve tissue)、成纤维细胞(fibroblast)和分化前的肌肉细胞(muscle cell)等分化为具体器官的细胞前的多能祖细胞(multipotent progenitor)。在本发明中，间充质干细胞以未分化状态，即以干细胞状态包含在组合物中。本发明的间充质干细胞可以来源于哺乳动物，优选来源于人。
[0030] 本发明的间充质干细胞可以来源于由脐带、脐带血、胎盘、骨髓、脂肪组织、肌肉、羊水和羊膜组合的群中选择的组织。优选地，本发明的间充质干细胞可以是来源于脐带血或胎盘的间充质干细胞，最优选来源于脐带血的间充质干细胞。来源于脐带血或胎盘的间充质干细胞的特征在于它们比来源于骨髓的间充质干细胞具有更出色的分化能力和增殖能力。
[0031] 本发明中使用的术语“脐带血”是指从连接胎盘和胎儿的哺乳动物的脐静脉采集的血液。所述脐带血可很容易在分娩时从供者的脐静脉采集。更具体地说，在正常阴道分娩的情况下，可在分娩后胎盘仍留在子宫内的状态下，从娩出的脐静脉中采集。或者在剖腹产的情况下，分娩后胎盘娩出在子宫外的状态下从脐静脉中采集。
[0032] 如本文所用，术语“胎盘干细胞”是指与形状、细胞表面标记、原代培养后的传代次数无关的源自哺乳动物胎盘的干细胞或祖细胞，并被附着在组织培养基质(tissue culture substrate)，如组织培养塑料板或纤连蛋白涂覆培养板上。然而，本说明书中的术语“胎盘干细胞”并不代表滋养层细胞(trophoblast)。如果一个细胞具有干细胞的至少一种特征，例如能够分化成至少一种细胞类型，那么它就是干细胞。
[0033] 根据本领域已知的方法，可从胎盘或脐带血中分离间充质干细胞。所述间充质干细胞的分离可以通过任何常规已知的分离方法分离。例如，有密度梯度分离(density gradient fractionation)、免疫选择(immunoselection)和差异粘附分离(differential adhesion separation)等。从脐带血或胎盘中分离和培养间充质干细胞的方法，可以使用以往已经使用过的任何方法。
[0034] 所述分离的间充质干细胞可以在本领域已知的细胞培养基中培养，包括但不限于DMEM培养基、McCoys 5A培养基、Eagle's基础培养基、CMRL培养基、Glasgow最低基本培养基、Ham's F-12培养基、Iscove改良Dulbecco’s培养基、Liebovitz'L-15培养基、RPMI 1640培养基、KSB-3基础培养基等。如果需要，可以在细胞培养基中加入一种或多种辅助成分，如胎儿小牛血清、马或人的血清等，也可使用用于防止微生物污染的抗生素和抗真菌剂。
[0035] 分离或培养的干细胞可以通过本领域已知的方法储存直至使用。一般来说，干细胞可以在冷冻保护(cyoprotection)处理后冷冻保管。所述冷冻保护处理可以使用本领域已知的DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤藓糖醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、i-肌醇、D-乳糖或氯化胆碱等冷冻保护剂。
[0036] 根据本发明的过表达SOD3的干细胞可以通过用包含编码SOD3的多核苷酸的重组表达载体转染干细胞来获得。
[0037] 如本文所用，术语“表达(expression)”是指细胞中蛋白质或核酸的产生，“过表达(overexpression)”是指特定基因的表达水平比正常或一般状态过度增加。在本发明中，过表达SOD3的干细胞是指由于SOD3蛋白的表达水平增加从而SOD3蛋白的活性增加的干细胞。
[0038] 如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”或核酸是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。除非另有限制，还包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
[0039] 在干细胞中过表达SOD3最常见的方法是将包含SOD3基因多核苷酸通过人工或实验引入干细胞，增加SOD3基因的复制数(copy number)。将原本细胞不具有的外源性(exogenous)多核苷酸注入细胞称为转染(transfection)，细胞遗传性质的变化现象称为转化(transformation)。将所述外源性多核苷酸通过病毒或病毒衍生载体注入细胞的过程称为转导(transduction)。在本说明书中，术语“转染”、“转化”和“转导”指细胞被导入外源性多核苷酸从而使其具有与野生型不同的遗传性质或这样的过程，均代表类似的含义。
[0040] 在本发明中，编码SOD3的多核苷酸可以是源自哺乳动物的SOD3基因，优选包含由SEQ ID NO：2所示的编码人野生型SOD3的核苷酸序列，或由SEQ ID NO：4所示的编码209E-SOD3的核苷酸序列。
[0041] 另外，所述编码SOD3的多核苷酸还包括人SOD3的核苷酸序列，优选与由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列显示基本相同性的序列。基本相同性是指，将编码人SOD3的多核苷酸的核苷酸序列与任何其他待比较的核苷酸序列尽可能地对应整理并使用本领域常用的分析方法和算法分析序列时，显示至少70％或更多同源性的序列。由与所述编码SOD3的多核苷酸的核苷酸序列基本相同的碱基序列编码的蛋白质可以是SOD3蛋白，并且优选包含由SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白质功能等同物。SOD3蛋白的功能等同物如本文先前所述。
[0042] 本说明书中，术语“重组表达载体”是指在合适的宿主细胞中可表达靶蛋白或靶核酸(RNA)的载体，是指一种基因构建物，其中包含必需的调节要素，该调节要素可操作地连接在一起，以表达多核苷酸(基因)插入物。术语“可操作地连接(operatively linked)”是指为了执行一般功能，核酸表达调控序列与编码靶蛋白或RNA的核酸序列的功能性连接(functional linkage)。即，指编码蛋白质或RNA的核酸序列通过表达调控序列以能够表达基因的方式连接，如，启动子与编码蛋白质或RNA的核酸序列可操作地连接，才能影响编码核酸序列的表达。本发明中的与重组载体的可操作地连接可以通过使用本领域已知的基因重组技术来制备，位点特异性DNA切割和连接可使用本领域通常已知的酶等进行。
[0043] 本发明的重组表达载体可以是克隆领域中常用的载体，对其种类没有特别限制，可包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但不限于此。优选地，可以使用来自病毒的载体。所述质粒有来自大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pET-22b(+))、来自枯草芽孢杆菌的质粒(pUB110和pTP5)和来自酵母的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)。所述病毒可以是逆转录病毒、腺病毒或痘苗病毒等动物病毒或杆状病毒等昆虫病毒，但不限于此。
[0044] 根据本发明的包含核酸的表达载体可以通过本领域已知的方法，包括但不限于瞬时转染(transient transfection)、显微注射、转导(transduction)、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染(liposome-mediated transfection)、DEAE葡聚糖介导的转染(DEAE Dextran-mediated transfection)、聚凝胺介导的转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔(electroporation)、基因枪(gene gun)以及其他可将核酸导入的已知方法，将包含核酸的表达载体导入干细胞。
[0045] 根据本发明的过表达SOD3的干细胞，可以通过优选使用电穿孔或病毒介导的转导方法将含有编码SOD3的多核苷酸的重组表达载体注入间充质干细胞来完成性质转化。
[0046] 利用重组病毒载体，通过以下步骤，可制备本发明的干细胞：(a)制备包含穿梭载体与编码SOD3的核酸和/或蛋白质转导结构域可操作地连接的DNA构建体的重组病毒载体的步骤；(b)通过用所述重组病毒载体转染病毒生产细胞株来制备表达SOD3的重组病毒的步骤；和(c)用所述表达SOD3的重组病毒感染间充质干细胞的步骤。
[0047] 所述穿梭载体有PUB110、PGX1416、PGX1417、PUL61、PSA77和PGX1418等，在本发明的一个实施例中，使用了ColE1的pCA14(Invitrogen)。本发明的病毒载体的特征在于病毒载体选自由逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体和禽痘病毒载体组合的群，并且优选使用腺病毒载体。
[0048] 根据本发明用SOD3转化并过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)，使免疫抑制基因的表达增加，并且它们能够调节炎症反应中的嗜中性粒细胞和树突细胞的功能和浸润，发挥强有力的免疫调节能力。此外，过表达SOD3的MSC显著降低促炎性介质/细胞因子的表达,并特异性抑制TLR-7和NFkB的活化。本发明人的实施例表明，过表达SOD3的MSC可以是炎症性疾病的有效治疗剂。
[0049] 本发明的过表达SOD3的干细胞的特征在于，具有至少一种以下特征：
[0050] (a)表现出对选自由CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞组成的群中至少一种的浸润抑制特性；
[0051] (B)表现出抑制CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞的分化及增殖，并且促进Treg的分化和增殖的特性；
[0052] (C)表现出抑制选自由IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IL-20、IL-22、IL-23、TNF-α、IFN-γ，CXCL1和CCL20组合的群中的至少一种炎性细胞因子的表达，同时增加Treg相关细胞因子IL-10和TGF-β的表达的特性；
[0053] (d)表现出抑制选自由NFkB、p38、JNK、STAT1和STAT3组合的群中至少一种磷酸化的特性；
[0054] (e)表现出增加体内cAMP水平的特性；
[0055] (f)增加icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1和IDO-1等具有免疫抑制功能的基因的表达的特性。
[0056] 具体而言，本发明人通过各种细胞实验和动物实验揭示的过表达SOD3的干细胞，特别是间充质干细胞(MSC)的免疫调节能力如下：
[0057] 在本发明的一个实施例中，与用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC)共培养的HaCaT细胞和与未转化的MSC共培养的HaCaT相比，通过用TNF-α和IFN-γ刺激诱导的促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)表达水平显著降低，而已知为抗炎细胞因子的TGF-β的表达显著增加。
[0058] 此外，在另一个实施例中，SOD3-MSC与未转化的MSC或用LacZ转化的对照组MSC(LacZ-MSC)相比，icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1及IDO-1等多种具有免疫抑制功能的基因的表达水平显著增加。这表明，与不会过表达SOD3的MSC相比，过表达SOD3的MSC具有显著改善的抑制过度免疫反应的免疫调节能力。特别是，据报告，HO-1和IDO-1抑制对炎性细胞因子和Th17的反应并具有诱导免疫细胞的凋亡等免疫调节活性。因此，可以理解，过表达SOD3的MSC，通过增加HO-1和IDO-1的表达，可有效地控制哮喘、银屑病、特应性皮炎等自身免疫性疾病和器官移植患者可发生的炎症和移植排斥反应。
[0059] 在本发明的另一个实施例中，在与MSC共培养的混合淋巴细胞培养实验中，证实与未转化的MSC相比，与SOD3-MSC共培养时CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分化和增殖受到抑制。另外，在本发明的另一个实施例中，将未分化T细胞与不同MSC(MSC、LacZ-MSC、SOD3-MSC和MSC+DETCA)共培养并用Th1、Th2、Th17、Treg细胞诱导分化，结果进一步确认，SOD3-MSC与未过表达SOD3的MSC相比，增强未分化的T细胞向Treg细胞分化并且抑制其向Th17和其他T细胞分化。
[0060] 在本发明的另一实施例中，作为炎症性疾病中的银屑病等急进性皮炎模型进行小鼠实验，与用MSC处理小鼠相比，用SOD3-MSC处理的小鼠的红斑和角化等皮肤症状、皮肤的厚度、免疫细胞对皮肤的浸润现象等被测定的慢性急进性皮炎的病变得到更有效的改善。与细胞实验的结果类似，发现SOD3-MSC处理的小鼠更有效地抑制促炎介质的表达并增加与Treg细胞相关的IL-10表达。另外，关于信号传导途径的实验证实它特异性抑制NFkB信号传导通路。
[0061] 此外，由卵清蛋白诱导的特应性皮肤炎症的小鼠模型显示，与MSC处理的小鼠相比，SOD3-MSC处理的小鼠中的炎性病变显著改善。
[0062] 因此，所述细胞和动物实验结果表明，SOD3的过表达显著提高了MSC的免疫调节能力，过表达SOD3的MSC与常规未经任何处理的MSC相比，在预防或治疗炎症性疾病中，可作为更有效的干细胞治疗制剂来使用。
[0063] 如本文所用，“治疗”是指旨在改变被治疗个体或细胞的自然病程的临床处理，并且也可以用于临床病理的预防。治疗的优选效果是抑制疾病的发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，降低疾病进展速度，以及带来疾病状态的改善、好转、缓解或改善的预后等。
[0064] 如本文所用，术语“预防”是指抑制疾病发作或延迟其发展的任何行为。
[0065] 作为本发明中的预防或治疗靶标的炎症性疾病可优选为Th2或Th17介导性疾病。“Th2或Th17介导性疾病”是指由Th2细胞或Th17细胞介导的疾病。本发明中Th2或Th17介导的疾病可进一步优选为选自由器官移植排斥反应、自身免疫疾病、炎症性肠道疾病、炎症性眼病、包括特应性皮炎的炎症性皮肤病和过敏性疾病组合的群。
[0066] 所述Th2介导性疾病是由Th2细胞介导的疾病，是指由引起过敏的过敏原(allergen)特异性Th2细胞的生成和活性所诱发的疾病。Th2细胞是表达CD4和T细胞受体(TCR)的免疫细胞，它们通过GATA3转录因子等的作用分泌如IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等细胞因子，以此参与体液性免疫。已知当Th2细胞对自身抗原(autoantigen)过度激活时，会产生肥大细胞(mast cell)和IgE相关的过敏和超免疫反应。由此可以知道，在包括特应性皮炎、与过敏性相关的其他皮肤病、过敏性鼻炎、过敏性哮喘等Th2介导的疾病中，通过抑制Th2分化或抑制其活性，可治疗Th2介导性疾病。
[0067] 所述Th17介导性疾病是指因Th17细胞的过度分化，导致Th17/Treg细胞的不平衡或由于Th17细胞的过度活性而发生或恶化的疾病。Th17作为一个典型的促炎性(proinflammatpry)细胞，未致敏的CD4+ T细胞在存在TGFβ与IL-6的环境下接收到抗原刺激时通过RORγt、STAT-3等转录因子的作用产生分化。成熟Th17细胞分泌炎性细胞因子如IL-17、IL-21、IL-22等，浸润到炎症开始的末梢组织，与巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、破骨细胞等相互作用，增加炎性细胞因子和其他炎症因子的分泌并引起组织损伤。已知这种Th17细胞是各种自身免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病和器官移植排斥中的主要致病细胞。另一方面，Treg细胞起到与Th17细胞相反的炎症调节作用，当未致敏的CD4+ T细胞在存在TGFβ的抗原下接收到适当的抗原刺激时，它们表达Foxp3等转录因子并分化。已知成熟的Treg细胞通过细胞因子如TGFβ和IL-10等降低T细胞增殖和活性。特别是，它在免疫系统中的自体耐受(self-tolerance)中发挥了重要作用，并且已经提出了通过在动物模型例如小鼠模型中调节Treg活性来治疗自身免疫疾病和器官排斥的可能性。
[0068] 所述Treg细胞和Th17细胞分别具有抑制炎症或放大炎症的相反功能，但它们都从相同的前体细胞分化并且在健康的正常状态下在两种细胞之间形成平衡。未致敏的CD4+ T细胞在TGFβ和抗原刺激下分化时，决定向Treg或Th17细胞的分化的方向取决于存在的炎性细胞因子的类型，如果致病性Th17细胞过度分化导致需要适当相互制约的Treg细胞和Th17细胞的平衡被打破，则会诱发Th17介导性疾病。因此，可以理解对于所述Th17介导性疾病，可通过抑制Th17细胞的增殖和分化并诱导Treg分化来恢复免疫细胞平衡和恒常性来治疗Th17介导性疾病。
[0069] 本发明人通过细胞和动物实验证实，为过表达SOD3而转化的MSC(SOD3-MSC)抑制Th2或Th17细胞的分化并增加Treg细胞的分化。在特异性T细胞分化条件下，将与SOD3-MSC共培养的未致敏的CD4+ T细胞与未与MSC共培养的对照组或与不会过表达SOD3的MSC共培养的T细胞进行比较，发现IL-4、GATA3等Th2标志物和RORγt和IL-17等Th17标志物的表达显著降低，Foxp3、TGFβ和IL-10等Treg标志物的表达相反显著增加，从而确认SOD3-MSC抑制Th2和Th17的分化并促进Treg的分化(实施例<1-7>)。另外，在慢性急进性皮肤炎症小鼠模型中，与不会过表达SOD3的MSC相比，注射SOD3-MSC的小鼠皮肤中，IL-6、IL-17和IL-22等Th2和Th17相关的促炎细胞因子的表达水平显著减少，而作为Treg相关炎性调节细胞因子IL-10的的表达水平却相反显著增加(实施例<2-3>)。此外，在所述急进性皮肤炎症小鼠模型和类似过敏性皮肤炎症的小鼠模型中，SOD3-MSC与不会过表达SOD3的MSC相比，具有显著改善疾病症状的效果。所述实验结果表明，过表达SOD3的MSC可以是Th2或Th17介导性疾病的有效细胞治疗制剂。
[0070] 此外，根据本发明的炎症性疾病可以包括但不限于由急性或慢性器官移植排斥、移植物抗宿主病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎症性皮肤病、多发性硬化症、胰腺炎、外伤引发休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、囊性纤维化、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性毛细支气管炎、慢性毛细支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、赖特尔综合症、银屑病性关节病、肠病性关节炎、幼年型关节炎、幼年型强直性脊柱炎、反应性关节病、感染性关节炎、后感染性关节炎、肌萎缩侧索硬化、结节性多动脉炎、过敏性血管炎、韦格纳肉芽肿病、类风湿性多发性肌痛、关节细胞动脉炎、钙晶体性关节病、假性痛风、非关节风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎、神经性关节疾病(neuropathic joint disease或charcot joint)、关节出血症(hemarthrosis)、过敏性紫癜、肥厚性骨关节炎、多发性网状组织细胞瘤、脊柱侧弯(scoliosis)、血色素沉着病、血红蛋白病、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、家族性地中海热(familial Mediterranean fever)、贝切特氏病、系统性红斑性狼疮、回归热、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能障碍综合征、慢性阻塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、急性肺损伤(acute lung injury)、支气管肺发育不良(broncho-pulmonary dysplasia)、1型糖尿病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏痴呆、家族性寒冷自体炎症综合征(familial cold autoinflammatory syndrome)、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)、新生儿多发性炎性疾病((neonatal multisystem inflammatory disease))、慢性婴儿神经性皮肤关节综合征(chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome)、成人斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、接触性皮炎、葡萄胎(hydatidiform mole)、PAPA综合征(化脓性关节炎综合征、坏疽性脓皮病和痤疮、syndrome of pyogenic arthritis、pyoderma gangrenosum and acne)、超免疫球蛋白d综合征(hyperimmunoglobulin d syndrome)、冷吡啉相关的周期性综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome)、角膜炎、结膜炎、视网膜炎、视网膜血管炎、葡萄膜炎、睑缘炎、过敏性结膜炎、干眼症(dry eye)、进行性系统性硬化症(progressive systemic sclerosis)、多肌炎(polymyositis)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(myasthenia gravis)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)和纤维肌痛综合征(fibromyalgia syndrome)组合群中选择的一种以上疾病。
[0071] 如本文所用，术语“器官移植排斥(transplant rejection)”是指在移植诸如心脏、肺、心脏和肺复合体、肝脏、肾脏、胰腺、皮肤、肠(bowel)或角膜等实体器官后接受移植的患者体内的免疫细胞浸润和攻击移植器官导致细胞凋亡和组织坏死而发生的急性或慢性移植物排斥反应及骨髓移植后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。
[0072] 所述炎症性疾病中的炎症性皮肤疾病的特征在于，选自由银屑病、特应性皮炎、湿疹性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、玫瑰糠疹、扁平苔藓、血管炎、毛发红糠疹、蜂窝织炎、毛囊炎、痈、天疱疮、大疱性(bullous)天疱疮、表皮水疱、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、红斑和皮肤嗜酸性粒细胞增多症组合的群中一种以上疾病。
[0073] 含有过表达SOD3的干细胞作为活性成分的本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体和稀释剂。所述药学上可接受的载体和稀释剂可以与干细胞及其受体在生物学和生理学上相容。药学上可接受的稀释剂的实例包括但不限于盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质(dispersion media)。
[0074] 另外，本发明还提供包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的自身免疫疾病或器官排斥反应的预防或治疗用药物组合物。
[0075] 如前所述，自身免疫疾病或器官移植的排斥反应中促炎性Th17细胞都会重要地参与其中，根据本发明者们确认，过表达SOD3的MSC抑制Th17的增殖和分化以及促进调节炎症的Treg细胞的分化。同时确认，过表达SOD3的MSC也显著增加各种免疫抑制基因如icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1和IDO-1等的表达水平，从而使抑制过度免疫反应的免疫调节能力大大提高。由此，普通技术人员可以知道，通过本发明的包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的药物组合物来抑制过度免疫反应从而可以期待预防或治疗自身免疫疾病和器官移植排斥反应的效果。
[0076] 如上所述，所述“器官移植排斥反应”是指在移植了心脏、肺、心脏和肺复合体、肝脏、肾等实体器官的患者中发生的急性或慢性排斥反应，以及骨髓移植后的移植患者出现的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。
[0077] 此外，所述“自身免疫疾病”是机体的免疫系统通过攻击内部正常细胞或蛋白质而不是来自外部的抗原而发生的疾病，其具体实例包括系统性红斑狼疮、狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性疾病、药物诱导的自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性内耳疾病、美尼尔氏病、1型糖尿病、白塞病、克罗恩氏病、桂林巴利综合征、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、溃疡性结肠炎、干燥综合征、系统性硬化症、多发性硬化症、结节性多动脉炎、银屑病、特应性皮炎、白斑、寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris)、皮肌炎、重症肌无力(myasthenia gravis)、艾迪生氏病(Addison's disease)等。
[0078] 由于器官移植排斥反应和自身免疫疾病都伴有过度炎症反应，因此可以将它们归类为炎症性疾病，本文中前述的炎症性疾病中描述的一些疾病属于这些范围。
[0079] 另外，可以使用本领域已知的方法配制本发明的药物组合物，以便在投入到哺乳动物后活性成分可以快速、持续或延迟释放。
[0080] 所述本发明的药物组合物优选以注射剂的形式配制，给药途径可以包括经皮、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻腔内、鞘内、口腔内，但不限于此。在本发明的实施例中，通过给小鼠局部皮下注射用SOD3转化的MSC来投入药物，并证实了治疗效果。
[0081] 另外，本发明的药物组合物可以使用导管插入法来施用，其中在外周静脉输液法中，细胞可以以单块或多个较小等分量通过导管注射。使用导管投入细胞可以包括例如通过标准外周静脉导管、中心静脉导管或肺动脉导管向静脉内输送。
[0082] 本发明的药物组合物的剂量可以根据给药途径、给药时间、治疗次数、治疗周期、需治疗的患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、对药物的敏感性、摄入排泄率等多种因素，由技术人员根据上述具体用途确定适当的有效量。所述“有效量”是指投入到个体时，足以表现出对炎症性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥等的改善、治疗、预防、检测或诊断效果的充分的量，所述“个体”是指动物，优选哺乳动物，最优选人，并且可以是来自动物的细胞、组织、器官等。所述个体可以是需要治疗的患者。
[0083] 本发明的方法，为了抑制炎症反应，可以使用必要量的干细胞。例如，所述干细胞可以包括1×102个、1×105个、1×107个、1×108个、1×109个或更多个干细胞。在本发明的一个实施例中，曾将2×106个用SOD3转化的MSC皮下注射到小鼠模型中。
[0084] 所述投入可以每天投入一次或分几次投入。本发明的药物组合物可以单独使用或与已知对预防或治疗炎症性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥等有效的其它治疗剂组合使用，并且当与其它治疗剂组合给药时，可以依次或同时施用。所述单独或组合给药时，本发明的药物组合物的给药量优选可以在无副作用的前提下以最小量获得最大效果的量来施用，并且这可以由本领域技术人员容易地确定。
[0085] 另外，本发明还提供了用于制备炎症性疾病治疗用制剂的过表达SOD3的干细胞的用途。
[0086] 关于所述用途，本发明的过表达SOD3的干细胞，特别是过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)的炎症调节活性和基于此活性的炎症性疾病的治疗效果，以及过表达SOD3的干细胞制备方法,如本说明书中所述。
[0087] 根据本发明的所述药物组合物可以是包含SOD3作为活性成分的组合物，由作为活性成分的SOD3组成的组合物或基本上由作为活性成分的SOD3组成的组合物。
[0088] 关于所述治疗炎症性疾病的方法，本发明的过表达SOD3的干细胞特别是过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)的炎症调节活性和基于此活性的炎症性疾病的治疗效果，以及为了显示治疗效果的有效量及投入方法等,如本说明书中所述。
[0089] 发明的效果：
[0090] 因此，本发明提供包含过表达SOD3的干细胞作为活性成分的炎症性疾病的预防或治疗用组合物。用SOD3转化并过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)比正常MSC具有更强的抗氧化活性和免疫调节功能，因此，SOD3-转导MSC可以成为对炎症性疾病、自身免疫疾病或器官移植排斥等的有效治疗制剂。附图说明
[0091] 图1显示出通过RT-PCR(图1A)，蛋白免疫印迹(图1B)和SOD3酶活性(图1C)确认的、用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC)与对照组MSC(MSC)的表达模式的实验结果；
[0093] 图3是显示用于确定SOD3转化对MSC细胞增殖的影响的、随时间的MTT测定结果(图3A)和测定的细胞数量(图3B)的图表；
[0094] 图4显示RT-PCR结果以证实SOD3-MSC或MSC对HaCaT细胞中炎性细胞因子表达的作用；
[0095] 图5显示了MSC、用LacZ转化的MSC(lACZ-MSC)、用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC)，通过RT-PCR结果测定的细胞内IL-1Ra(icIL-1Ra)、可溶性IL-1Ra(sIL-1Ra)以及未拼接的lL-1Ra的表达水平(图5A)及icIL-1Ra的mRNA水平的定量分析(图5B)及HO-1、DIO-1、TGF-β、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、IL-10的表达水平(图5C)和通过免疫测定法测量的相关细胞培养基中的PGE2水平(图5D)；
[0096] 图6显示分别与阴性对照组(Control(-))、阳性对照组(Control(+))以及根据实验条件与未进行任何处理的MSC(MSC)、用LacZ转化的MSC(LACZ-MSC)、用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC)、DETCA处理的用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC+DETCA)共培养的CFSE混合淋巴细胞反应实验中用于测量CD4+ T细胞和CD8+ T细胞增殖的流式细胞术分析(FACS)结果；DETCA是一种SOD3酶抑制剂；
[0097] 图7显示量化图6的FACS结果的图表，纵轴上的刺激指数(Stimulation index，％)表示施加刺激时细胞数量/未施加刺激时的细胞数量的百分比；
[0098] 图8是显示测量T细胞谱系特异性核心转录因子和细胞因子表达水平的RT-PCR结果的图表；
[0099] 图9显示了测量Treg系统特异性核心转录因子和细胞因子的表达水平的RT-PCR结果(上图)和显示MSC对Treg细胞分化的影响的流式细胞术分析结果(下图)；
[0100] 图10是IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验概要的示意图；
[0101] 图11是在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症生物模型实验中显示每个实验组小鼠的病变发展的小鼠背部皮肤的照片；
[0102] 图12是在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验中用H&E染色的每个实验组小鼠的背部皮肤切片的显微镜照片；
[0103] 图13是在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验中，比较每个实验组的背部皮肤的表皮厚度的测量结果的柱状图；
[0104] 图14是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验中，每个实验组中的小鼠的脾脏中浸润的T细胞、嗜中性粒细胞(Gr1+)和树突细胞(CD11c+)的比例的图表；
[0105] 图15是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验中，各实验组中浸润到小鼠皮肤中的T细胞、嗜中性粒细胞(Gr1+)和树突细胞(CD11c+)的免疫组织化学染色分析的显微镜照片。箭头表示染色的细胞；
[0106] 图16是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症生物模型实验中，每个实验组中浸润到小鼠皮肤中的T细胞、嗜中性粒细胞(Gr1+)和树突细胞(CD11c+)的数量的图表；
[0107] 图17是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的小鼠实验中测量每个实验组的小鼠皮肤中表达的促炎介质的mRNA水平的RT-PCR结果的图表；
[0108] 图18是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症的生物模型实验中，各实验组小鼠皮肤中的TLR-7、NF-kB、JNK、p38、STAT1、STAT3、JAK1和JAK2的表达量和磷酸化水平的蛋白免疫印迹实验的结果；
[0109] 图19是显示在IMQ诱导的慢性急进性皮肤炎症生物模型实验中，在每个实验组的小鼠血浆中测量的cAMP浓度的柱状图；
[0110] 图20是显示卵清蛋白(OVA)诱发的特应性皮肤炎症的小鼠实验过程的示意图；
[0111] 图21是显示由卵清蛋白(OVA)诱发的特应性皮肤炎症的小鼠实验中的各实验组中的小鼠病变进展的背部皮肤的照片。
具体实施方式
[0112] 下面将对本发明进行详细说明。
[0113] 但，以下实施例仅为本发明的示例性说明，本发明的范围并不局限于所述实施例。
[0114] <实验方法>MSC的培养和鉴定
[0115] 在供体的同意下，从人脐带的血液样品中收集来源于人脐带血的间充质干细胞(hUCB-MSC)。采集脐带血样品后并将其储存在含有作为抗凝血剂的柠檬酸磷酸葡萄糖的血液收集包中。实验的处理在24小时内进行。通过在Ficoll-Paque PLUS浓度梯度(Amersham Biosciences)下离心分离单核细胞组分。用HBSS(Jeil Biotech Services)洗涤，用低糖型Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Invitrogen Corp.)、20％胎牛血清(Gibco-BRL)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1％抗生素/抗真菌剂(Life Technologies)再悬浮。抗生素/抗真菌剂包括100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素B。7天后，将未附着的细胞移除，并将附着的细胞于用两种培养基进行每周更换培养。细胞在5％CO2和37℃的潮湿条件下培养。将约60％的融合细胞用0.1％胰蛋白酶-EDTA分离并转移至培养板中。
[0116] 通过流式细胞术(Epics XL，Beckman Coulter)研究了hUCB-MSC的免疫表型，并分析了与MSC相关的抗原阳性标志物的存在以及造血系统标志物的缺失。阳性标记物包括CD90(Thy-1)、CD105(内皮糖蛋白，endoglin)和SH3(CD73)，造血系标记物包括CD34、CD45和CD31等内皮细胞标记物。细胞对HLA I类呈阳性，但对HLA-DR呈阴性。每种荧光标记的单克隆抗体购自Becton Dickinson。
[0117] 利用电穿孔法的SOD3转化和SOD3过表达的确认
[0118] 本说明书的图1至4的实验结果使用了通过电穿孔用SOD3转化的MSC。电穿孔法(electroporation)根据NeonTM方案(Invitrogen)，通过向MSC施加电刺激(1000伏电压，1脉冲)进行电穿孔增加细胞膜的通透性后将DNA注入细胞,DNA过表达与否通过获取蛋白质进行蛋白免疫印迹测试或通过PCR扩增人SOD3基因(Genbank登录号NM_003102.2)并在1.5％琼脂糖凝胶(agarose gel)中证实。扩增程序为在94℃下5分钟；94℃下40秒，57℃下30秒，72℃下60秒(35个循环)；72℃下10分钟；4℃0-∞。(∞是无限的，这意味着没有指定的时间)。
[0119] 用于SOD3转导的腺病毒表达载体和转导条件
[0120] 本说明书图5至21的实验结果使用了通过腺病毒用SOD3转染的MSC。通过同源重组(homologous recombination)将含有人SOD3的pRC/CMV hSOD3载体插入E1穿梭载体pCA14中。通过同源重组，合并穿梭载体和载体dE1-k35/lacZ重组以最终产生dE1-k35/SOD3构建体。从噬菌斑中分离含有重组腺病毒的上清液并在293细胞中繁殖。将制备的含有人SOD3基因或LacZ基因的腺病毒以感染复数(multiplicity of infection，MOI)10转染至间充质干细胞(MSC)中。
[0121] SOD3的酶活性测定
[0122] 通过测量超氧自由基来证实SOD3的酶活性。20μl样品与200M黄嘌呤(Sigma)和PBS上的50M WST-1(Dojindo)混合后，处理0.0005单位XOD(Sigma)，并且对甲(formazan)染料信号发色进行光谱测量。
[0123] MTT测定
[0124] 进行MTT测定以确定MSC的细胞增殖(Man等人，2006；Weichert等人，1991)。将6×103个细胞的MSC培养24小时，通过电穿孔法用人SOD3基因转化，24小时、48小时和72小时后每个孔加入20μl的MTT(5mg/ml)进行处理并进一步培养4小时。去除培养基后，细胞用每孔
100μl的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)溶解，并在波长595nm处测量吸光度(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA)。
100μl的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)溶解，并在波长595nm处测量吸光度(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA)。
[0125] 通过TNF-α和IFN-γ刺激测量MSC中产生的活性氧簇物质
[0126] 将MSC分布在6孔板上并培养24小时，然后用10ng/ml TNF-α和100U/ml IFN-γ刺激1小时。细胞用Hanks平衡盐溶液(HBSS)稳定30分钟后，用10μM的2,7-二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)在37℃下染色30分钟。通过共聚焦显微镜(confocal microscopy)在513nm的发射波长和488nm的激发波长下通过DCF-荧光观察ROS，并且用荧光分光光度计(Synergy，BIO TEK，US)测量荧光。
[0127] 免疫抑制分子(immunosuppressive molecule)的表达分析
[0128] 以下述方式培养MSC以分析在MSC中表达的具有免疫抑制功能的基因表达，并且在不存在TNF-α和IFN-γ刺激或存在刺激的情况下分析基因表达：
[0129] -第0天：在60mm培养皿(dish,培养基体积：3ml)上培养MSC(1×104细胞/cm2)后，将细胞培养为70～80％汇合度(confluency)。
[0130] -第1天：将所述培养的MSC用含有野生型SOD3的腺病毒或对照组病毒(AdLacZ)感染24小时从而进行SOD3转导。
[0131] -第2天：病毒感染24小时后更换新的MSC生长培养基。
[0132] -第3天：将细胞进一步培养24小时，通过加入TNF-α(10ng/ml)和IFN-γ(100单位/ml)获得被刺激或未被刺激的细胞，测定mRNA水平来分析相关基因表达。
[0133] 使用QuantiTect逆转录试剂盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit，QIAGEN)从1μl总RNA合成cDNA用于基因表达分析。简而言之，使用gDNA拭去缓冲液(wipeout Buffer)从模板RNA(template RNA)中去除基因组DNA(genomic DNA)，在42℃下培养2分钟，并立即储存在冰上。随后，将逆转录酶(reverse transcriptase)，RT缓冲液和RT引物混合物与模板RNA混合，并且在42℃进行15分钟,在95℃进行3分钟反应。合成的cDNA保存于-20℃直至使用。然后，将0.25μl模板、1μl相应引物、10μl的TOP聚合酶混合物和8.75μl蒸馏水混合，并以20μl的终体积进行RT-PCR。PCR结果通过1％琼脂糖凝胶(agarose gel)电泳确认。用于RT-PCR和实时PCR的引物序列如下并且从Bioneer(Korea)定制：icIL-1Ra forward 5'-TTATGGGCAGCAGCTCAGTT-3'(SEQ ID NO:15),reverse 5'-TTGACACAGGACAGGCACAT-3'(SEQ ID NO:16)；sIL-1Ra forward 5'-TCCGCAGTCACCTAATCACTC-3'(SEQ ID NO:17),reverse 5'-TTGACACAGGACAGGCACAT-3'(SEQ ID NO:18)；unspliced IL-1Ra forward 5'-GGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCT-3'(SEQ ID NO:19),reverse 5'-GGTCGCACTATCC ACATCTGGG-3'(SEQ ID NO:20)；HO-1 forward 5'-CCTGGTGTCCCTTCAATCAT-3'(SEQ ID NO:
21),reverse 5'-GGCGATGAGGTGGAATACAT-3'(SEQ ID NO:22)；IDO-1 forward 5'-TGTGAACCCAAAAGCATTTTTC-3'(SEQ ID NO:23),reverse 5'-AAAGACGCTGCTTTGGCC-3'(SEQ ID NO:24)；TGF-β forward 5'-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3'(SEQ ID NO:25),reverse 5'-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3'(SEQ ID NO:26)；Galectin-1 forward 5'-
GGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAAT-3'(SEQ ID NO:27),reverse 5'-TGAGGCGGTTGGGGAACTTG-3'(SEQ ID NO:28)；IL-10 forward 5'-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3'(SEQ ID NO:29),reverse 5'-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3'(SEQ ID NO:30)；GAPDH forward 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'(SEQ ID NO:31),reverse 5'-
AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'(SEQ ID NO:32)。
21),reverse 5'-GGCGATGAGGTGGAATACAT-3'(SEQ ID NO:22)；IDO-1 forward 5'-TGTGAACCCAAAAGCATTTTTC-3'(SEQ ID NO:23),reverse 5'-AAAGACGCTGCTTTGGCC-3'(SEQ ID NO:24)；TGF-β forward 5'-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3'(SEQ ID NO:25),reverse 5'-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3'(SEQ ID NO:26)；Galectin-1 forward 5'-
GGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAAT-3'(SEQ ID NO:27),reverse 5'-TGAGGCGGTTGGGGAACTTG-3'(SEQ ID NO:28)；IL-10 forward 5'-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3'(SEQ ID NO:29),reverse 5'-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3'(SEQ ID NO:30)；GAPDH forward 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'(SEQ ID NO:31),reverse 5'-
AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'(SEQ ID NO:32)。
[0134] 前列腺素E2免疫测定
[0135] 所有标准品和样品重复测量前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)两次(duplicate)。将100μl标准稀释物质(standard diluent；Tissue Culture Media)置于NSB和Bo(0pg/mL标准物质)中，并将100μl标准物质加入到合适的孔中。类似地，将100μl样品加入孔中。然后，将50μl测定缓冲液(assay buffer)加入到NSB孔中，除总活性(total activity，TA)和空白孔外，向各孔中加入50μl蓝色结合物(blue conjugate)。然后，向每个孔中加入50μl黄色抗体(yellow antibody)，并在平板振荡器(～500rpm)中反应2小时。每孔用400μl洗涤溶液(wash solution)洗涤三次。最后一次洗涤后，取出各孔的所有缓冲液，用无绒纸巾(lint free paper towel)除去剩余的洗涤缓冲液，然后向TA孔中加入5μl蓝色结合物。接下来，将200μl的pNpp底物溶液(substrate solution)加入到每个孔中。使反应在室温下无振动地进行45分钟，向各孔添加50μl终止液(stop solution)后，在405nm处测定吸光度。
[0136] T细胞增殖分析
[0137] 进行CFSE(羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯，carboxyfluorescein diacetate succinimidly ester)-MLR分析以确认与MSC和与用SOD3转染的MSC共培养的CD4+和CD8+T6
细胞的增殖。将1×10个CFSE-标记的反应性细胞(应答细胞，responder cell，C57BL/6小鼠的全脾细胞)置于24孔板(Costar，Corning)中，并使用3000cGY放射能处理的1×106个刺激细胞(stimulator cell，Balb/c小鼠细胞)进行刺激，并重复三次(triplicate)。对于CFSE标签，将反应细胞以200×106细胞/ml的密度重悬于PBS中。加入CFSE(Molecular Probes，Inc。)至5μM的最终浓度，并将细胞在室温下振荡培养10分钟而不暴露于光下。通过加入冷的RPMI1640培养基(GIBCO)终止细胞的CFSE标记，并在冰上保持5分钟。分离细胞，用培养基洗涤两次，并重新悬浮。将CFSE标记的反应性细胞和放射性处理的刺激细胞在培养基上调整到2×106个细胞/ml的密度，并且在24孔板上以1ml的总体积使MSC或用SOD3转化的MSC和T细胞以10：1比例混合，并在37℃，5％CO2和100％湿度下共培养。培养5天后，收获细胞，洗涤两次并重悬于PBS中。使用FITC缀合的抗小鼠CD4和PE缀合的抗小鼠CD8(BD Biosciences Pharmingen)定量反应性细胞的下游因子。
细胞的增殖。将1×10个CFSE-标记的反应性细胞(应答细胞，responder cell，C57BL/6小鼠的全脾细胞)置于24孔板(Costar，Corning)中，并使用3000cGY放射能处理的1×106个刺激细胞(stimulator cell，Balb/c小鼠细胞)进行刺激，并重复三次(triplicate)。对于CFSE标签，将反应细胞以200×106细胞/ml的密度重悬于PBS中。加入CFSE(Molecular Probes，Inc。)至5μM的最终浓度，并将细胞在室温下振荡培养10分钟而不暴露于光下。通过加入冷的RPMI1640培养基(GIBCO)终止细胞的CFSE标记，并在冰上保持5分钟。分离细胞，用培养基洗涤两次，并重新悬浮。将CFSE标记的反应性细胞和放射性处理的刺激细胞在培养基上调整到2×106个细胞/ml的密度，并且在24孔板上以1ml的总体积使MSC或用SOD3转化的MSC和T细胞以10：1比例混合，并在37℃，5％CO2和100％湿度下共培养。培养5天后，收获细胞，洗涤两次并重悬于PBS中。使用FITC缀合的抗小鼠CD4和PE缀合的抗小鼠CD8(BD Biosciences Pharmingen)定量反应性细胞的下游因子。
[0138] T细胞分化分析
[0139] 使用MACS柱(Miltenyi Biotech)通过从C57BL/6小鼠的淋巴结和脾的阴性选择(negative selection)分离幼稚(naive)CD4+T细胞。分离的细胞用平板上附着的CD3抗体和添加到包含10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基的CD28抗体(2μg/ml)活化。在Th1极化条件(Th1 polarizing conditions；10μg/ml anti-IL4 Ab，10ng/ml IL-12)、Th2极化条件(Th2 polarizing conditions；10μg/ml anti-IFN-γAb,10ng/ml IL-4)或Th17极化条件(Th17 polarizing condition；20ng/ml IL-6,5ng/ml TGF-β,10μg/ml IFN-γ抗体,10μg/ml IL-4抗体)或Treg极化条件(Treg polarizing condition；5ng/ml TGF-β及10ng/ml IL-2)下，将细胞极化，与MSC或SOD3-转导MSC以10：1的比例共培养4天。用于分化CD4+T细胞的细胞因子和抗体购自BD Bioscience。培养4天后，获得细胞并分析利用Th1、Th2、Th17或Treg细胞分化的特异性的分子或细胞因子的mRNA表达模式。
[0140] 实验动物和疾病模型
[0141] 实验中使用的小鼠是第8周的C57BL/6小鼠(mouse)，并且在没有特定病原体的情况下喂养标准的小鼠饲料和水，并根据卫生和福利部的指导方针根据天主教大学天主教伦理委员会的指导方针进行处理。
[0142] 为了诱导小鼠皮肤的慢性急进性炎症，剃去小鼠背部的毛发并除去，并且将62.5mg咪喹莫特(imiquimod，IMQ)乳膏(5％，Aldara 3M药物)每日施用1次于小鼠的剃毛后的皮肤上，共施用12天。
[0143] 为了诱导特应性皮肤炎症，在实验开始时(D0)、第7天(D7)和第14天(D14)将10μg的OVA蛋白和4mg抗原佐剂氢氧化铝(aluminum hydroxide)注射到SPFT条件下饲养的小鼠腹腔中，使动物致敏。实验开始第21天，将100μg的OVA溶解于100μl的PBS中，用其浸渍1×1cm2的纱布来制作贴剂，将贴剂贴附于脱毛小鼠的背部共7天，诱发免疫反应。从第35天开始，再次以相同的方式用OVA贴剂诱导免疫反应一周。实验开始后第42天将MSC、LacZ-MSC和SOD3-MSC注射到病变部位，并在第49天肉眼观察皮肤变化。
[0144] 小鼠皮下注射MSC
[0145] 在利用IMQ和卵清蛋白(ovalbumin)的动物实验中，MSC皮下注射以符合每个实验条件的MSC按2×106个细胞数皮下注射到小鼠中，作为MSC皮下注射的对照，将相同体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)皮下注射到小鼠中。
[0146] 分析小鼠皮肤cAMP浓度
[0147] 施用IMQ 6天和12天后,获得小鼠背部皮肤细胞和血浆并测量cAMP浓度。对于cAMP浓度分析，使用cAMP ELISA试剂盒(BD immunocytometry)。
[0148] 小鼠模型的组织学评估和荧光组织染色
[0149] 在施用IMQ后的第6天和第12天从小鼠获得背部皮肤细胞，并将其固定在4％多聚甲醛(PFA)中并包埋在石蜡中。皮肤样品使用旋转切片机(Leica)制备具有4μm厚的组织切片来获得。此后，用二甲苯(xylene)将其脱脂并用梯度酒精脱水。所述预处理的组织切片用苏木精和伊红(H&E染色)染色。荧光组织染色通过使组织切片与CD4、CD8、CD11c和Gr-1等的一级抗体反应，随后与适当的荧光标记的二级抗体如Alexa fluor 488和Alexa fluor 647等反应来进行。
[0150] 小鼠脾细胞的流式细胞分析(flow cytometry analysis)
[0151] 从每个实验组的小鼠获得全脾细胞，并重悬于MACS缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中，用FITC缀合的抗小鼠CD4抗体、PE缀合的抗小鼠CD8抗体、APC-缀合抗小鼠Gr1抗体和PE缀合的抗小鼠CD11c抗体进行反应。抗体反应30分钟后，用MACS缓冲液洗涤细胞，离心并重悬于500μl的MACS缓冲液中以进行FACS分析。
[0152] 用于小鼠皮肤基因表达分析的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)
[0153] 使用TRIzol试剂(Invitrogen)从小鼠的背部皮肤获得RNA。使用逆转录系统(Qiagen)从1μg总RNA合成cDNA。IL-1α(QT00113505)、IL-1β(QT00021385)、IL-4(QT00160678)、IL-6(QT00182896)、IL-10(QT00106169)、IL-17(QT00103278)、IL-20(QT00126735)、IL-22(QT00128324)、IL-23(QT01663613)、IFNγ(QT00000525)、TNF-α(QT01079561)、TGF-β(QT00025718)、CXCL-1(QT00199752)、CCL20(QT00261898)及GAPDH(QT02448075)的引物组购自Qiagen(括号中的序列号是Qiagen目录号)。用于确认Foxp3、T-bet、GATA3、RORγt和SOD3表达水平的引物序列如下：Foxp3 forward GCAACAGCACTGGAACCTTC(SEQ ID NO:5),Foxp3 reverse GCATTGCTTGAGGCTGCGTA(SEQ ID NO:6)；T-bet forward AGCCAGCCAAACAGAGAAGA(SEQ ID NO:7),T-bet reverse AATGTGCACCCTTCAAACCC(SEQ ID NO:8)；GATA3 forward ACATGTCATCCCTGAGCCAC(SEQ ID NO:9),GATA3 reverse AGGAACTCTTCGCACACTTG(SEQ ID NO:10)；RORγt forward GCCTACAAT GCCACCACC(SEQ ID NO:11),RORγt reverse ATT GAT GAG AAC CAG GGC(SEQ ID NO:12)；SOD3 forward TGTTGGAGCAGAGGAGAAGCTCAAC(SEQ ID NO:13)；SOD3 reverse AAGCTCTCTTGGAGCAGCTGGAAA(SEQ ID NO:14)。使用GAPDH mRNA作为内源性对照(endogenous control)。使用Rotor-Gene 6000(Corbett)和QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)进行PCR。扩增程序由95℃下10分钟的1个循环，95℃下20秒、55℃下20秒和72℃下20秒的35个循环组成。
[0154] 用于小鼠皮肤蛋白表达分析的蛋白免疫印迹
[0155] 蛋白质样品从小鼠的背部皮肤获得。将相同量的蛋白质加载到每个泳道上，进行电泳，并将蛋白质印迹在膜上，并使靶蛋白质与靶蛋白质特异性第一抗体反应并通过化学发光系统(GE health care Life Science)进行检测。
[0156] 统计分析
[0157] 数据表示为平均值±标准偏差(平均值±SD)，统计显著性由独立组的学生t检验或方差分析(ANOVA)确定。统计学上的显著差异由图中的*，$，#表示。除非另有说明，所有实验重复了3次。
[0158] <实施例1>过表达SOD3的间充质干细胞(MSC)的制备和功效鉴定
[0159] <1-1>确认用SOD3转染的MSC的SOD3的过表达
[0160] 检测用人SOD3基因转化的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的SOD3蛋白表达模式和SOD3酶活性。
[0161] 采用电穿孔法用人SOD3基因转化，24小时后获取并进行RT-PCR和蛋白免疫印迹试验检测蛋白表达水平。通过测量培养24小时的细胞培养液中存在的超氧自由基的量来测定SOD3酶活性。
[0162] 如图1所示，用SOD3转化的MSC(SOD3-MSC)与未转化的MSC(MSC)相比，显示过表达SOD3的mRNA(图1A)和SOD3蛋白(图1B)。此外，对于SOD3活性，SOD3-MSC与MSC相比显示出显著更高的SOD3活性(图1C)。由此确认，用SOD3转染的MSC过表达SOD3并具有较高的SOD3酶活性。
[0163] <1-2>用SOD3转化的MSC的活性氧簇产生量的减少
[0164] 检测了用SOD3转化的MSC中由于TNF-α/IFN-γ刺激而产生的活性氧簇(ROS)的量。
[0165] 通过电穿孔用人SOD3基因转化MSC并用TNF-α(10ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)刺激1小时，所产生的ROS用H2DCF-DA荧光染色并使用荧光光度计测量。
[0166] 如图2所示，未转化的MSC由于TNF-α/IFN-γ刺激引起的大量ROS而显示强荧光，而SOD3-MSC即使被TNF-α/IFN-γ刺激后，也与PBS处理的对照组(control)差异不大，反而显示出荧光减少的趋势。即，确认了与未转化的MSC相比，SOD3-MSC显著抑制活性氧簇的产生。
[0167] <1-3>SOD3转化对MSC细胞增殖的影响
[0168] 利用MTT检测分析了SOD3转化对MSC细胞增殖的影响。
[0169] 如图3所示，与未转化的MSC相比，转化后24小时到72小时的SOD3-MSC显示细胞增殖增加(图3A)，细胞数也显著增加(图3B)。这些结果表明用SOD3转化促进MSC的细胞增殖。用SOD3转化的MSC的细胞增殖活性的增加表明，今后被开发为炎症性疾病的细胞治疗制剂时，具有可以进一步提高治疗效率的可能性。
[0170] <1-4>用SOD3转化的MSC对炎性细胞因子的表达抑制作用
[0171] 分析了用SOD3转化的MSC对细胞因子(炎症反应的重要介质)的表达的影响。
[0172] 将通过电穿孔转化的SOD3-MSC或MSC与人角质形成细胞(keratinocyte)即HaCaT细胞株共培养并用TNF-α和IFN-γ刺激12小时后，获得HaCaT细胞并通过qRT-PCT测量HaCaT细胞表达的各种炎性细胞因子的水平。
[0173] 如图4所示，确认了与MSC共培养的HaCaT细胞(MSC)中由于TNF-α和IFN-γ的刺激，IL-1α、IL-1β、TNF-α和CCL-20的细胞因子的mRNA表达水平大幅增加，与过表达SOD3的用SOD3转化的MSC共培养的HaCaT细胞(SOD3-MSC)中所述细胞因子的表达水平被有效抑制。对于CXCL-1，在与未转化的MSC共培养的HaCaT细胞(MSC)中在TNF-α和IFN-γ的刺激下表达水平几乎不变，而在与用SOD3转化的MSC共培养的HaCaT细胞(SOD3-MSC)中表达水平更加减少。另外，对于作为抗炎细胞因子和Treg的标志物TGF-β，在无TNF-α和IFN-γ刺激下，与用SOD3转化的MSC共培养的HaCaT细胞(SOD3-MSC)比与MSC共培养的HaCaT细胞(MSC)显示出更高的表达水平，并且观察到经过TNF-α和IFN-γ的刺激，增加幅度扩大。
[0174] 这些结果表明，与未转化的MSC相比，过表达和分泌SOD3的MSC在共培养的邻近的HaCaT细胞中更有效地抑制TNF-α和IFN-γ诱导的炎性细胞因子的表达，并大幅提高抗炎细胞因子的表达，表明可以多方面和有效地控制炎症反应。
[0175] <1-5>用SOD3转化的MSC的免疫抑制相关分子的表达分析
[0176] 分析用SOD3转化的MSC中表达的免疫抑制相关物质的表达模式。
[0177] 培养MSC并用AdLacZ或AdSOD3腺病毒转染并用TNF-α(10ng/ml)和IFN-γ(100U/ml)刺激或不刺激的状态下，利用RT-PCR测量细胞内IL-1Ra(intracellular IL-1Ra,icIL-1Ra)、水溶性IL-1Ra(sIL-1Ra)、未拼接的IL-1Ra(unspliced IL-1Ra)、HO-1、IDO-1、TGF-β、半乳糖凝集素-1(galectin-1)及IL-10的细胞内mRNA表达水平(图5A-C)。通过实时PCR分析icIL-1Rα的相对表达水平(图5B)，并使用GAPDH作为对照组(control)。另外，获得培养MSC的上清液(supernatant)，使用PGE2ELISA试剂盒(Enzo Life Sciences，NY，USA)测量PGE2浓度。
[0178] 如图5A至5C所示，为了过表达SOD3而转化的MSC(SOD3-MSC)与未转化的MSC(MSC)或用LacZ转化的对照组MSC(LacZ-MSC)相比，具有各种免疫抑制功能的基因如icIL-1Ra、TGF-β、IL-10、HO-1和IDO-1的表达水平显著增加。有趣的是，在用TNF-α和IFN-γ刺激的MSC中IDO-1和IL-10的表达增加，并且这些基因的表达在SOD3-MSC中进一步增加。而相反，SOD3的过表达对MSC中PGE2的分泌量(图5D)或半乳糖凝集素-1(galectin-1)的表达水平没有显著影响。
[0179] 据报告，对于施用IL-1Ra的器官移植患者，移植器官中的浸润性白细胞的数量迅速减少(Shiraishi M等，J Surg Res.，58(5):465-470，1995)。因此，由于在过表达SOD3的MSC中IL-1Ra的表达大幅增加，可以预计通过这个效果可以更有效地抑制器官移植患者的炎症反应和移植排斥反应。
[0180] 另一方面，TGF-β和HO-1促进IL-10的体外(in vitro)和体内(in vivo)生产以及免疫抑制细胞Treg的生成，同时抑制促炎性细胞因子。由于HO-1通过抑制p-STAT3-RORγt途径来控制RORγt和FOXP3表达速度(kinetics)并抑制Th17的反应从而显示抗炎作用，已经成为哮喘、银屑病和特应性皮炎的新型治疗剂的靶标。另外，已知人MSC可诱导吲哚胺-2,3-双加氧酶-1(IDO-1)的表达，而IDO-1通过抑制T细胞增殖并诱导免疫细胞凋亡(apoptosis)诱导免疫抑制，因此已成为移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)等自身免疫疾病的关键调节因子。因此，如上述实施例所确认，在MSC中过表达SOD3可以诱导如HO-1或IDO-1等色氨酸(Tryptophan)的分解代谢途径的活性化，可以成为许多自身免疫疾病的强效治疗靶标。
[0181] <1-6>用SOD3转化的MSC对T细胞增殖的影响
[0182] 检测了用SOD3转化的MSC对T细胞分化和增殖的抑制作用。
[0183] 根据实验条件，不使用MSC、使用未经处理的MSC、经LacZ转化的MSC、经SOD3转化的MSC与从不同种类的小鼠(C67BL/6和BalB/C)分离的T细胞共培养，进行CFSE混合淋巴细胞反应(CFSE based-mixed lymphocyte reaction，MLR)实验，并且对CD4+或CD8+细胞进行流式细胞分析(图6)，并定量分析流式细胞分析结果(图7)。
[0184] 如图7所示，和未与MSC共培养时(No MSCs)相比，当与未经任何处理的MSC(MSC)或LacZ转导的MSC(LACZ-MSC)共培养时，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖被抑制，当与SOD3-转导MSC(SOD3-MSC)共培养时，T细胞增殖被进一步抑制。另一方面，当用SOD3抑制剂DETCA处理SOD3-MSC时(SOD3-MSC+DETCA)，T细胞增殖抑制作用与未经任何处理的MSC(MSC)相似。也就是说，SOD3-转导MSC对T细胞增殖的抑制作用比未转导的MSC更强，是由于过表达的SOD3的酶活性。
[0185] <1-7>用SOD3转化的MSC对T细胞分化的影响
[0186] 检测了SOD3-转导MSC对T细胞分化的影响。
[0187] 根据Th1、Th2、Th17或Treg细胞的各自的分化条件下，根据实验条件，将幼稚T细胞与未经处理的MSC(MSC)、LacZ-MSC或SOD3-MSC共培养(coculture)，通过实时qRT-PCR测量分化诱导的T细胞表达的与分化相关的主要转录因子的表达水平。
[0188] 如图8所示，通过mRNA测量并确认在Th1、Th2和Th17分化条件下培养的T细胞的系统特异性转录因子和细胞因子IFNγ、T-bet、IL-4、GATA3、IL-17、RORγt和CCL20的表达模式的结果，与未与MSC共培养的对照组(图7(+))比较，与未经任何处理的MSC(MSC)或LacZ-MSC(LACZ-MSC)共培养的T细胞中所述基因的表达显著降低，而与SOD3-MSC共培养的细胞中，所述转录因子和细胞因子的表达进一步显著降低。SOD3-MSC对基因表达的抑制作用，在Th17细胞特异性基因IL-17、RORγt和CCL-20中表现得更强。另外，当与SOD3-MSC共培养中加入SOD3酶抑制剂DETCA(SOD3-MSC+DETCA)时，SOD3-MSC对所述基因表达的抑制效果与MSC或LacZ-MSC相似，这表明SOD3-MSC抑制基因表达的提升效果是由于SOD3的酶活性而产生的。
[0189] 如图9所示，通过mRNA测量并确认在Treg分化条件下培养的T细胞的系统特异性转录因子和细胞因子Foxp3、TGF-β和IL-10的表达模式的结果，与未与MSC共培养的对照组(图9(+))比较，与未经任何处理的MSC或LacZ-MSC共培养的T细胞中所述基因的表达显著增加，而与SOD3-MSC共培养的细胞中，所述转录因子和细胞因子的表达进一步显著增加。特别地，通过SOD3-MSC的FOXP3表达增加的作用可通过流式细胞术在细胞水平得到证实(图9下方)。
另一方面，当与SOD3-MSC共培养中加入SOD3酶抑制剂DETCA(SOD3-MSC+DETCA)时，SOD3-MSC对所述基因表达的抑制效果与MSC或LacZ-MSC相似，这表明SOD3-MSC的Treg相关基因表达的提升效果是由于SOD3的酶活性而产生的。
另一方面，当与SOD3-MSC共培养中加入SOD3酶抑制剂DETCA(SOD3-MSC+DETCA)时，SOD3-MSC对所述基因表达的抑制效果与MSC或LacZ-MSC相似，这表明SOD3-MSC的Treg相关基因表达的提升效果是由于SOD3的酶活性而产生的。
[0190] 这表明由于SOD3转导，原始MSC中的T细胞分化调节作用显著增强，特别是降低在炎症性疾病中充当致病细胞的Th17细胞的分化，并且诱导具有炎症抑制效果的Treg细胞的分化，因此可以更有效地抑制炎症。
[0191] <实施例2>由咪喹莫特诱导的慢性急进性皮肤炎症生物模型
[0192] <2-1>用SOD3转化的MSC对皮肤炎症症状的抑制作用
[0193] 基于<实施例1>中观察到的过表达SOD3的MSC对T细胞的分化和增殖的调节作用，检测了用SOD3转化的MSC是否对调节体内的炎症有效。
[0194] 咪喹莫特(IMQ)已知可通过激活先天性免疫系统(innate immune system)的信号诱发银屑病和类似的急性皮肤炎症，每日将其涂抹于脱毛的小鼠的背部皮肤上来诱发皮肤炎症。根据图10的实验概要，在涂抹IMQ前，根据处理条件将未经任何处理的MSC、LacZ转导的MSC和SOD3-转导MSC各按2×106皮下注射到每个实验组的小鼠(每组各5只小鼠)中，并连续施用IMQ12天后，比较和观察皮肤上的炎症反应。为了定量分析皮肤炎症症状，对小鼠的背部皮肤组织进行取样，用H&E对组织标本进行染色，并测量皮肤表皮(epidermis)的厚度。
[0195] 如图11所示，没有皮下注射MSC并涂抹IMQ的小鼠(IMQ)与未涂抹IMQ的对照组(Control)相比，2-3天后，出现肉眼可确认的红斑(erhythema)、脱皮(scaling)和皮肤增厚并伴有炎症症状。在实验开始后第6天(Day 6)可清楚地观察到这些症状，且这些症状持续进行到实验开始后第12天(Day 12)。在用未处理的MSC(MSC)或LacZ转导的MSC(LACZ-MSC)注射的小鼠中，IMQ诱导的皮肤症状有缓解倾向。另一方面，与注射MSC或LACZ-MSC的小鼠相比，注射了SOD3-转导MSC(SOD3-MSC)的小鼠用可观察到红斑、脱皮等症状以肉眼可识别的程度明显减少。
[0196] 如图12和13所示，在对照组和每个实验组的小鼠的背部皮肤切片中测量的皮肤表皮厚度与用肉眼观察到的皮肤炎症的状态有相似的结果。当不注射MSC条件下施用IMQ时，皮肤表皮厚度与对照组相比显著增加，而当注射MSC或LacZ-MSC时，IMQ导致的皮肤厚度的增加减少。另一方面，可以确认，在注射SOD3-MSC的小鼠中，施用IMQ后表皮厚度没有实质性增加，与没有施用IMQ的对照组相似，且表皮厚度明显薄于注射MSC或LACZ-SOD3的小鼠的表皮厚度。
[0197] 这些结果表明，通过用SOD3转化而过表达SOD3的MSC在缓解皮肤炎症方面显著优于一般MSC。
[0198] <2-2>用SOD3转化的MSC对嗜中性粒细胞和树突细胞浸润的抑制作用
[0199] 检测了具有IMQ诱导的皮肤炎症的小鼠的脾脏和皮肤中的免疫细胞的组成和募集(recruitment)现象。
[0200] 通过流式细胞术检查根据实验条件注射相应MSC的构成小鼠脾脏的CD4+T细胞、CD8+T细胞、嗜中性粒细胞(neutrophil,Gr1+cell)、树突细胞(dendritic cell,CD11c+cell)(图14)，并将施用IMQ的背部皮肤切片用其他种类的免疫细胞标志物染色，并测量细胞的数量(图15-16)。
[0201] 如图14所示，用IMQ处理的小鼠的脾脏中，与未用IMQ处理的对照组小鼠相比，CD4+T细胞和CD8+T细胞减少，在注射MSC的小鼠中，CD4+T细胞和CD8+T细胞略微增加。相反，由于IMQ处理，脾脏中的嗜中性粒细胞(Gr1+cell)和树突细胞(CD11c+cell)数量增加，并且由于SOD3-MSC处理，嗜中性粒细胞和树突细胞数量减少。
[0202] 如图15和图16所示，由于IMQ处理，皮肤中的CD3+T细胞、CD8+T细胞(数据未显示)、嗜中性粒细胞(Gr1+)和树突细胞(CD11c+)均显著增加，而用MSC或LacZ-MSC处理的小鼠中，IMQ诱导的免疫细胞浸润现象减少。并且观察到，在用SOD3-MSC处理的小鼠中，与其他MSC处理的小鼠相比，浸润现象被进一步抑制，并且存在于皮肤组织中的T细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞均显著减少。
[0203] <2-3>用SOD3转化的MSC对炎症反应介质的表达抑制作用
[0204] 通过qRT-PCR测量IMQ诱导的皮肤炎症小鼠的背部皮肤细胞因子的表达模式。
[0205] 如图17所示，由于涂抹IMQ，各种炎性细胞因子的mRNA的水平显著增加，并且在注射MSC或LacZ-MSC的小鼠中这些细胞因子的表达有略微降低的倾向。在注射SOD3-MSC的小鼠中，这些炎性细胞因子的抑制作用与其他MSC相比显示出最大的结果。具体地说，确认了由Th17细胞表达的IL-17、IL-22以及主要炎症介质的细胞因子IL-23、IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达量，由于SOD3-MSC而显著减少。
[0206] 另外，与其他炎性细胞因子不同，作为抗炎症细胞因子以及与Treg炎症调节有关的IL-10，观察到其表达量略微增加，而在在SOD3-MSC中IL-10增加效果更为显著。
[0207] 这些结果表明，由于SOD3的转导，更有效地增加了MSC的炎症调节作用，并且综合调节了各种细胞因子的表达和作用从而缓解了炎症性疾病的症状。
[0208] <2-4>用SOD3转化的MSC对炎症信号传递的影响
[0209] 已知IMQ激活TLR-7和/或TLR-8并通过下游NFkB信号传递系统表现出生物效应。因此，通过使用涂抹IMQ的皮肤，用蛋白免疫印迹试验确认包含过表达SOD3的MSC或未处理的MSC等MSC处理对TLR-7/TRL-8的信号传导的影响。
[0210] 如图18所示，证实在涂抹IMQ的小鼠背部皮肤中TLR-7和磷酸化的NFkB(p-NFkB)被激活并且表达水平也增加(图18A)。用IMQ激活的TLR-7信号通路通过MSC或LacZ-MSC处理表现出减少的趋势，而通过SOD3-MSC进一步降低。对STAT1/3和JAK1也观察到类似的结果，但SOD3-MSC尤其着重针对NF-kB信号传导系统显示出显著的抑制作用。
[0211] <2-5>血浆和细胞中cAMP浓度的增加
[0212] 炎症通过流入体内的抗原刺激T辅助细胞，T辅助细胞增殖并分泌炎症诱导物质而诱发。T辅助细胞的增殖通过改变影响细胞分裂的两种物质变cAMP与cGMP的比例而引发，当cGMP升高时，细胞分裂加速，当cAMP升高时，细胞分裂减慢。如果这些比例的平衡被破坏，则导致炎症性疾病的可能性增加。例如，在银屑病患者中，细胞或血浆中cGMP的浓度通常较高。因此根据实验条件，使用酶联免疫吸附测定检测用各个MSC处理的小鼠血浆中的cAMP的浓度。
[0213] 如图19所示，测量结果为注射MSC或LacZ-MSC的小鼠的血浆中的cAMP水平与对照组相比增加，特别是用SOD3-MSC注射的小鼠血浆的cAMP水平最高。这种趋势在涂抹IMQ的第6天变得更加明显。这些结果表明SOD3-MSC对细胞应激有保护功能。
[0214] <实施例3>卵清蛋白诱导的特应性皮炎生物模型
[0215] 通过使用其他动物模型，证实了过表达SOD3的MSC对体内(in vivo)炎症的影响。用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为抗原对Balb/C小鼠诱发特应性皮炎，比较观察MSC对炎症的抑制作用。
[0216] 根据图20的实验概要，在实验开始时(D0)、第7天(D7)，第14天(D14)，将OVA蛋白和抗原佐剂氢氧化铝混合并注射到在SPF条件饲养的小鼠腹腔中，使小鼠致敏。实验开始第21天起，将100μg的OVA溶解于100μl的PBS中，浸渍1×1cm2的纱布制备贴剂，贴附于脱毛小鼠的背部，诱发免疫反应7天。从第35天开始，用OVA贴剂再次以相同的方式诱导免疫反应一周。实验开始后第42天，根据实验条件将MSC、LacZ-MSC或MSC-SOD3注射到病变部位(每组5只小鼠)，并在第49天肉眼观察皮肤变化。
[0217] 如图21所示，可以证实与对照组相比，只用OVA处理的未注射MSC的小鼠(OVA)背部皮肤表现出皮肤粗糙，角化进展，变红肿胀等皮肤炎症。注射未处理的MSC的MSC的小鼠(OVA+MSC)或注射LacZ-MSC的小鼠(OVA+LACZ-MSC)，与仅用OVA处理的小鼠相比，在皮肤炎症方面表现出一些改善。在注射SOD3-MSC的小鼠(OVA+SOD3-MSC)中，可以确认皮肤角化和皮肤炎症几乎消失，并且皮肤状况改善至与对照组相似的状态，尤其与注射其他MSC的小鼠相比，显示出显著的炎症改善效果。这些结果表明过表达SOD3的MSC在缓解皮肤炎症方面显著优于一般MSC。
[0218] 产业利用可能性：
[0219] 过表达SOD3的间充质干细胞比正常间充质干细胞具有更强的抗氧化活性、免疫调节功能和细胞免疫调节作用。过表达SOD3的间充质干细胞可用于开发更有效的炎症性疾病、自身免疫疾病或器官移植排斥反应的干细胞治疗制剂。
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