贝母素甲用于制备免疫抑制剂的应用
阅读：768发布：2020-05-16
专利汇可以提供贝母素甲用于制备免疫抑制剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及贝母素甲的新用途，尤其涉及贝母素甲用于制备免疫 抑制剂 的应用。本发明经过贝母素甲对Kv1.2‑‑Kv1.8离子通道抑制作用的试验，发现贝母素甲能与Kv1.3通道有较强选择性结合，从而降低过度兴奋的T淋巴细胞，减弱对于T淋巴细胞的活化，从而降低T细胞活性，最终降低细胞免疫，而对其它 钾 离子通道作用很弱。由于贝母素甲是选择性通过抑制Kv1.3离子通道，可以降低如硬皮病，红斑狼疮等免疫系统功能亢进 疾病 治疗 所引起的不良反应而不影响正常的免疫功能，因此这一类新药的开发具有重大意义。，下面是贝母素甲用于制备免疫抑制剂的应用专利的具体信息内容。
1.式（Ⅰ）所示贝母类化合物或其药物学上可接受的盐在制备免疫抑制剂的应用；所述的免疫抑制剂的作用机制主要通过选择性抑制Kv1 .3 钾离子通道；
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的免疫抑制剂预防和/或治疗的自身免疫疾病包括器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：器官特异性自身免疫病中组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：器官特异性自身免疫病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征（goodpasture syndrome）、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：系统性自身免疫病包括硬皮病、红斑狼疮、类风湿性关节炎和结节性多动脉炎。
贝母素甲用于制备免疫抑制剂的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及贝母素甲的新用途，尤其涉及贝母素甲用于制备新型免疫抑制剂的应用。
背景技术
[0002] T淋巴细胞亚型参与免疫应答的各个阶段，在免疫调节中发挥关键作用，当免疫调控紊乱以及免疫平衡调节机制破坏时将会导致自身免疫疾病的发生。自身免疫性疾病主要包括硬皮病、系统性红斑狼疮、血清病、类风湿性关节炎等，其发生的原因是由于对自己或非己识别的控制机制出现了问题，使得一些自身反应性T细胞能够逃避克隆清除，识别自身的外周组织抗原并且引起自身免疫反应。通过调节T淋巴细胞膜离子通道功能来改变T细胞的活性，可达到治疗自身免疫疾病的目的。目前，传统治疗自身免疫疾病的方法均以免疫抑制为主，主要以遏制自身反应性淋巴细胞的增殖为目的，非特异性免疫抑制剂的应用以及特异地应用免疫耐受T细胞的疫苗会对整个免疫系统进行抑制，其结果往往导致疫苗等毒性累积而出现严重副作用，同时会不同程度地影响机体正常免疫反应而降低机体对感染和肿瘤等免疫作用。
[0003] 钾通道在T淋巴细胞的活化中起重要作用，T淋巴细胞活化的关键磷酸酶是钙依赖的神经钙蛋白磷酸酶，其中与T淋巴细胞关系最为密切的钾离子通道是：电压门控钾通道Kv1.3 和钙激活依赖的钾通道KCa 3.1(也称IKCal，KCNN 4，hKCa 4)。因此能选择性抑制电压门控钾通道Kv1.3或钙激活依赖的钾通道KCa 3.1，都会影响T淋巴细胞的功能。
[0004] Kv1.3钾离子通道是人类T淋巴细胞上表达最丰富、生理功能最重要的一类电压依赖型钾离子通道(PANYI G，2005；JASON R et al，2010)，在T淋巴细胞的活化、增殖、分化以及免疫功能调节中具有重要的作用，其表达数量与T细胞亚型、细胞分化状态和细胞活化状态有关。Kv1.3和IKCal共同为持续的钙内流提供必需的阳离子流出平衡，T细胞活化需要通过钙释放的钙通道从外部环境持续输入钙离子，钙离子内流使膜去极化。Kv1.3的开放适应膜的去极化和维持膜的静息电位，而IKCal开放则增加胞质钙和使膜电位超极化。Kv1.3是人类静息T细胞钙信号的基本调节器。
[0005] 钾通道在T淋巴细胞的活化中起重要作用，开放通道增加跨膜电位负值，这就反过来通过钙释放活化的钙通道增加钙内流，进一步导致钙依赖的神经钙蛋白磷酸酶活化，后者是T 淋巴细胞活化的关键磷酸酶。增加表达的钾通道能明显使活化的T淋巴细胞超极化，加速的钙内流保证了高水平的胞内钙离子，后者是T淋巴细胞充分活化和产生细胞因子所必须的。相应的，钾通道阻滞剂使T淋巴细胞保持负性膜电位和长效钙信号的能力降低。CD8+细胞分为三个主要的亚群，分别是幼稚细胞、中心记忆细胞和效应记忆细胞。静息的人类T淋巴细胞表达Kv1.3约300～400个/细胞，IKCal约8～10个/细胞，阻滞静息T细胞上的Kv1.3能使膜电位从-50mV升到-30mV。静息状态，幼稚的中心记忆细胞(TCM)和表达CD4及CD8的TCM 都表达过多的Kv 1.3(约200～300个/细胞)，而IKCal仅仅表达8～20个/细胞。幼稚的效应细胞和TCM在抗原或丝裂原刺激后表达相似数量的两种通道((Kv1.3约400～500个/细胞，IKCal约200～500个/细胞)。而抗原或丝裂原刺激的CD 4+和CD 8+TEM，Kv1.3表达增加至1500 个/细胞，远多于KCal的表达(约10个/细胞)。在人类的T淋巴细胞中，IKCal和Kv1.3在T 淋巴细胞的分化以及抗原介导的免疫反应如细胞因子白细胞介素(IL)-2，肿瘤坏死因子(TNF) -A，干扰素(IFN)-C中起调节作用。
[0006] 因此，针对T淋巴细胞上的Kv1.3和IKCal的钾通道阻滞剂对抑制T淋巴细胞增殖分化成为研究的重点。早期研究发现广谱钾离子通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP) 能改善MS(多发性硬化症)患者症状，但是由于其广谱阻断效应，副作用多，限制了它的应用，因此以Kv1.3和IKCal为靶点筛选出高选择性的钾离子通道阻滞剂成为研究的热点。
[0007] 膜片钳技术是用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。目前广泛应用于神经(脑)科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。
[0008] 本发明旨在利用膜片钳技术研究贝母素甲免疫抑制的作用机制。通过在通道电流记录中，分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物，研究它们对不同电压门控钾通道功能的可能影响，其确定其是否对Kv1.3钾通道作用有选择性阻滞作用。
[0009] 贝母素甲的概况
[0010] (1)贝母素甲(浙贝母碱)是从贝母类药材中提取的一种生物碱，英文名称：Peimine；贝母素甲的分子式为C27H45NO3、分子量为431.6511，结构式如下：
[0011]
[0012] (2)贝母素甲广泛存在于贝母类植物中。川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母和瓦布贝母都已被《中国药典》收录，药典规定含贝母素甲(C27H45NO3)和贝母素乙(C27H43NO3)的总量，不得少于O.080％。贝母来源于百合科贝母属多种植物的鳞茎，具有清热润肺，化痰止咳之功效。贝母中的生物碱种类多，是贝母止咳、化痰作用的有效成分。贝母为多年生草本植物，叶子长形，似韭，花黄绿色，下垂像钟，其鳞茎供药用，有止咳化痰、清热散结之功，产于四川、云南、甘肃、新疆等地。贝母为名贵药材，堪称药中之宝。新中国成立后曾列为国家计划管理品种，1980年以后改为市场调节产销产品。40年来，贝母的生产有较大的发展，年产量由20世纪50年代初的40多吨发展到2000年的2000吨左右，2014年产量估算接近4000 吨，产值接近70000万元，具备较大的市场供应能力及开发潜力。
[0013] (3)贝母素甲的提取与纯化方法：
[0014] 贝母素甲的提取方法大致有3类，一是传统的摇床浸提法，为了提高生物碱的提取率，人们还辅助添加了微波法和超声法；二是渗漉法，可用不同浓度的盐酸进行提取；三是醇提法，常用80％-95％的甲醇或乙醇进行提取，人们还在醇提工艺前使用纤维素酶预处理，降解细胞壁中的纤维素，促进有效成分溶出，提高提取率。
[0015] 常用的纯化方法有：大孔树脂纯化法和萃取纯化法两种。
发明内容
[0016] 本发明的第一个目的是提供贝母素甲在制备用于选择性抑制Kv1.3离子通道的药物中的应用。本发明的第二个目的是提供一种新型免疫抑制剂。
[0017] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0018] 式(Ⅰ)所示贝母类化合物或其药物学上可接受的盐在制备新型免疫抑制剂的应用；所述的新型免疫抑制剂的作用机制主要通过选择性抑制Kv1.3钾离子通道；
[0019]
[0020] 作为优选，所述的免疫抑制剂预防和/或治疗的自身免疫疾病包括器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病；器官特异性自身免疫病中组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。
[0021] 作为优选，器官特异性自身免疫病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture syndrome)、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
[0022] 作为优选，系统性自身免疫病包括硬皮病、红斑狼疮、类风湿性关节炎和结节性多动脉炎。
[0023] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0024] 一种新型免疫抑制剂，它的有效成分为上述的贝母类化合物或其药物学上可接受的盐，其作用机制主要通过选择性抑制Kv1.3钾离子通道。
[0025] 作为优选，所述的免疫抑制剂预防和/或治疗的自身免疫疾病包括器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病；器官特异性自身免疫病中组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。
[0026] 作为优选，器官特异性自身免疫病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture syndrome)、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
[0027] 作为优选，系统性自身免疫病包括硬皮病、红斑狼疮、类风湿性关节炎和结节性多动脉炎。
[0028] 本发明的有益技术效果：经过贝母素甲对Kv1.2--Kv1.8离子通道抑制作用的试验，发现贝母素甲能与Kv1.3通道有较强选择性结合，从而降低过度兴奋的T淋巴细胞，减弱对于T淋巴细胞的活化，从而降低T细胞活性，最终降低细胞免疫，而对其它钾离子通道作用很弱。由于贝母素甲是选择性通过抑制Kv1.3离子通道，可以降低如硬皮病，红斑狼疮等免疫系统功能亢进疾病治疗所引起的不良反应而不影响正常的免疫功能，因此这一类新药的开发具有重大意义。附图说明
[0029] 附图1贝母素甲对Kv1.3离子通道的抑制作用；
[0030] A不同浓度贝母素甲对Kv1.3离子通道电流的影响；B贝母素甲对Kv1.3峰值电流的量效曲线；采用Hill方程式得出其50％抑制浓度(IC50)为354.4μM(n＝6)；
[0031] C Kv1.3电流激活后的150ms处出现对电流使用依赖性量效曲线；数据符合Hill方程，50％使用依赖性抑制浓度(use-dependent IC50)为142.1μM(n＝6)。
[0032] 附图2贝母素甲对Kv1.2离子通道的end-pulse(稳态后的)电流的抑制百分率；
[0033] A不同浓度贝母素甲对Kv1.2离子通道电流抑制作用曲线；
[0034] B贝母素甲对Kv1.2end-pulse(稳态后的)电流的抑制作用曲线；适用Hill方程。其50％抑制浓度(IC50)为472.0μM(n＝5)；●代表Kv1.2曲线拟合；□代表与从图1叠加Kv1.3 use-dependent曲线拟合进行比较。
[0035] 附图3贝母素甲对Kv1.4-8离子通道的抑制作用曲线；三条曲线分别代表对照组0μM、100μM 和300μM贝母素甲；A贝母素甲对Kv1.4离子通道的抑制作用曲线B贝母素甲对Kv1.5离子通道的抑制作用曲线C贝母素甲对Kv1.6离子通道的抑制作用曲线D贝母素甲对Kv1.7离子通道的抑制作用曲线E贝母素甲对Kv1.8离子通道的抑制作用曲线。
[0036] 附图4 100μM和300μM贝母素甲对Kv1.2-8离子通道的抑制作用的比较；不同的条形图代表不同的Kv1.x离子通道；条形图上的数字代表示该通道的细胞数；**表示P<0.01。
具体实施方式
[0037] 以下实施例中所用贝母甲素购于四川成都曼斯特标准品有限公司。
[0038] 本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
[0039] 下面通过实施例对本发明作进一步描述：
[0040] 实施例1，贝母素甲对Kv1.3离子通道选择性抑制和对免疫的抑制作用，该贝母素甲的分子式为C27H45NO3、分子量为431.6511，其结构式如下：
[0041] 1贝母素甲对Kv1.3离子通道抑制作用的研究
[0042] 1.1溶液及试剂：细胞内液为门冬氨酸钾溶液组成(mmol/L)：137mM potassium aspartic 门冬氨酸钾，10mM HEPES，4mM MgATP，4mM MgCl2，10mM EGTA；用NaOH调节pH值到 7.3；细胞外液(浸浴溶液组成(de Vries et al.))：NaCl，136mM；KCl，8mM；CaCl2， 2mM；
MgCl2，2mM；葡萄糖，10mM；and HEPES，20mM；均购于美国San Diego公司。贝母素甲(Peimine)购于四川曼斯特公司，溶于DMSO溶液，制成300倍母液存于-80度冰箱备用；实验时稀释300倍于细胞外液中使用。
MgCl2，2mM；葡萄糖，10mM；and HEPES，20mM；均购于美国San Diego公司。贝母素甲(Peimine)购于四川曼斯特公司，溶于DMSO溶液，制成300倍母液存于-80度冰箱备用；实验时稀释300倍于细胞外液中使用。
[0043] 1.2细胞准备：Human Embryonic Kidney 293细胞用20％胎牛血清(FBS)(购于杭州四季青生物科技有限公司)，10％青、链霉素(P/S)和100μg/ml G418(一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。)培养。这些克隆细胞于实验前一天放入没有10％P/S和100mg/ml G418溶液中。
[0044] 1.3电压钳记录表达通道电流的Human Embryonic Kidney 293细胞在室温下(18～24℃) 记录电流。使用Warner公司505B放大器，Axon公司1322A数模转换器及PCLAM P 10.4来记录处理电流信号。采用以采样率的五分之一过滤噪音，补偿电容电流。记录槽始终以1ml /min灌流，记录过程中钳制电位为-80mV。
[0045] 1.4统计学方法使用PCLAMP 10.4(AXON公司)分析膜电流。采用Origin 7.0来拟合曲线(非线性化拟合)和作图。药物浓度依赖性曲线的拟合采用Hill方程：(Icon－Idrug) /Icon＝1/[1+(IC50/D)n]，其中Icon是对照峰电流，Idrug是施加药物后的峰电流幅值，IC50是阻断50％最大通道电流的药物浓度，D是药物浓度，n是Hill系数。所有数据用x±s表示，两组均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有显著。
[0046] 利用全细胞膜片钳技术式Human Embryonic Kidney 293细胞，钳制在-80mV，Kv1.3电流由从-80mV至40mV，时程为2，000ms，刺激频率为0.2和10Hz的去极化脉冲引出。待电流稳定后，记录正常对照电流(图1A)，然后灌流贝母素甲。由于溶解度问题，浓度高于300μM的贝母素没有用于实验。分别以10，30，100和300μM浓度贝母进行试验。记录贝母素甲对峰电流的抑制作用，其对通道抑制率分别为7.2±1.8％，12.6±2.3％， 26.5±2.5％，47.8±3.0％。根据Hill方程计算，其IC50(50％抑制浓度)为354.4μm。研究发现，抑制作用随着时间延长而加强，因此，贝母素甲具有使用依赖性抑制Kv1.3电流作用。为了正确地反映它的使用依赖效应，在电流诱发的150毫秒的时间点进行测量使用依赖性抑制，结果10，30，100和300μM的抑制率分别为11.6±1.4％，23.8±1.4％，44±3.1％ 63±3.3％(N＝6)，均明显高于峰值电流振幅的抑制作用(P＜0.01)。计算出的使用依赖性的IC50为142.1μM。
[0047] 为了进一步确定贝母素甲的是否选择性抑制Kv1.3，我们进一步用Kv1.2Kv1.4-8离子通道进行试验，判断是否能够抑制这些离子通道以及抑制的强度。首先，我们考察贝母甲素对Kv1.4-8的抑制作用。结果显示，100μM和300μM贝母甲素能抑制Kv1.4峰值电流幅度为8.3±3.1％和25.0±4.6％(n＝7)；Kv1.5的峰值电流抑制幅度为8.6±3.0％和26.8±4.8 ％(n＝9)；Kv1.6为2.1±0.7％和9.0±0.7％峰值电流幅度(n＝4)；Kv1.7峰值电流幅度由8.0±1.7％和19.8±1.9％(n＝2)，Kv1.8的分别为14.2±1.2％和32.1±1.3(n＝3)。
这些抑制作用显著低于贝母素对Kv1.3的相同浓度(P<0.01；图3)。我们进一步详细研究贝母甲素Kv1.2的IC50值。最大电流幅值测量在脉冲的结尾。10，30，100和300μM 贝母素的百分比的抑制分别为2.8±1.7％，7.7±1.9％，20.4±2.3％，39.8±2.5％，分别 (n＝5)。计算的IC50为472.0μM，其值也远高于Kv1.3因此，贝母甲素对Kv1.3有较强的选择性抑制作用。
这些抑制作用显著低于贝母素对Kv1.3的相同浓度(P<0.01；图3)。我们进一步详细研究贝母甲素Kv1.2的IC50值。最大电流幅值测量在脉冲的结尾。10，30，100和300μM 贝母素的百分比的抑制分别为2.8±1.7％，7.7±1.9％，20.4±2.3％，39.8±2.5％，分别 (n＝5)。计算的IC50为472.0μM，其值也远高于Kv1.3因此，贝母甲素对Kv1.3有较强的选择性抑制作用。
[0048] 综上所述，我们通过贝母素甲对Kv1.2-1.8离子通道的抑制作用试验研究，发现贝母素甲对Kv1.3离子通道有选择性抑制作用，贝母素甲能与Kv1.3通道结合，选择性的降低过度兴奋的T淋巴细胞，减弱T淋巴细胞活化、增殖具有重要作用的钙离子信号通路，从而降低 T细胞活性，最终降低细胞免疫。由于贝母素甲是选择性通过抑制Kv1.3离子通道，可以降低如硬皮病，红斑狼疮等免疫系统疾病治疗引起的不良反应，贝母素甲可能成为一个新的选择性的免疫抑制剂。
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