用于蛋白质、肽和其它分子的改进的F-18标记的方法和组合物
阅读：365发布：2020-07-20
专利汇可以提供用于蛋白质、肽和其它分子的改进的F-18标记的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了合成和使用用于PET或MRI成像的68Ga、18F或19F标记分子的组合物和方法。优选地，通过与IIIA族金属形成复合物，且将该复合物结合至螯合部分来将18F或19F缀合至靶向分子，所述螯合部分可直接或间接连接至靶向分子。在其它实施方案中，68Ga、18F或19F标记的部分可包含与双特异性 抗体 组合使用以靶向 疾病 相关 抗原 的可靶向构建体。在更优选实施方案中，螯合部分或可靶向构建体可缀合至靶向分子例如抗体或抗体 片段 。，下面是用于蛋白质、肽和其它分子的改进的F-18标记的方法和组合物专利的具体信息内容。
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1.一种用 F或 F标记分子的方法，所述方法包括将 F或 F与IIIA族金属的复合
物连接至螯合部分，其中将所述螯合部分缀合至所述分子或将所述螯合部分随后连接至所述分子。
2.权利要求1所述的方法，其中将所述螯合部分缀合至所述分子。
3.权利要求1所述的方法，其中将所述螯合部分随后连接至所述分子并且所述方法还包括将所述螯合部分连接至所述分子。
4.权利要求1所述的方法，其中所述分子为蛋白质或肽。
5.权利要求1所述的方法，其中所述分子为选自抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白和抗原结合抗体片段的靶向分子。
6.权利要求5所述的方法，其中将所述螯合部分缀合至可靶向构建体。
7.权利要求6所述的方法，其还包括；
c)给受试者施用所述靶向分子；
d)允许充足的时间以便所述靶向分子结合靶抗原；和
e)随后给所述受试者施用所述可靶向构建体，其中所述可靶向构建体结合所述靶向分子。
8.权利要求1所述的方法，其中所述IIIA族金属选自铝、镓、铟、镥和铊。
9.权利要求1所述的方法，其中所述IIIA族金属为铝。
10.权利要求1所述的方法，其中所述螯合部分选自DOTA、TETA、NOTA、NODA、NODA衍生物、(叔丁基)2NODA、NODA-MPAA、NETA、C-NETA、L-NETA、S-NETA和NOTA衍生物。
11.权利要求6所述的方法，其中所述可靶向构建体选自IMP448、IMP 449、IMP 460、IMP 461、IMP 462、IMP 465、IMP 466、IMP 467、IMP 468、IMP 469、IMP 470、IMP 471、IMP
473、IMP 479、IMP 485、IMP 486和IMP 487。
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12.权利要求1所述的方法，其中所述 F或 F标记分子在所述方法开始后不到30分
钟内产生。
18
13.权利要求7所述的方法，其还包括使用PET扫描以成像所述受试者中所述 F标记分子的分布。
18 19
14.权利要求1所述的方法，其中将所述 F或 F复合物在含水介质中连接至所述螯
合部分。
18 19
15.权利要求1所述的方法，其中向所述介质中添加有机溶剂以将 F或 F复合物连
接至螯合部分。
18 19
16.权利要求1所述的方法，其中通过微波辐射将所述 F或 F复合物连接至所述螯
合部分。
18 19
17.权利要求1所述的方法，其中通过加热将所述 F或 F复合物连接至所述螯合部
分。
18.权利要求5所述的方法，其中通过停靠和锁定技术制备所述靶向分子。
19.权利要求18所述的方法，其中所述靶向分子为TF2或TF10。
20.权利要求3所述的方法，其中通过点击化学反应将螯合部分连接至所述分子。
21.权利要求3所述的方法，其中通过马来酰亚胺-巯基反应将所述螯合部分连接至所述分子。
22.权利要求6所述的方法，其中放射性标记的可靶向构建体的收率为至少85%。
23.权利要求6所述的方法，其中所述可靶向构建体的比放射性活度为至少115GBq/μmol。
24.权利要求6所述的方法，其中在放射性标记之前冻干所述可靶向构建体以用于贮存。
25.权利要求24所述的方法，其中将所述可靶向构建体在选自山梨醇、甘露醇和海藻糖的填充剂中冻干。
18
26.权利要求1所述的方法，其中将所述螯合部分在3.8至4.5的pH下连接至 F或
19
F复合物。
27.权利要求7所述的方法，其中所述靶向分子结合患病细胞或病原体并且还包括通
18 19
过 F标记分子的PET成像或 F标记分子的NMR成像来检测、诊断或成像所述疾病或病原体的存在。
28.权利要求27所述的方法，其中所述疾病选自癌症、心血管疾病、传染性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、免疫功能障碍疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥和神经疾病。
29.权利要求28所述的方法，其中所述靶向分子结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、c-met、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PIGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
30.权利要求28所述的方法，其中所述传染性疾病与病原体相关，所述病原体选自真菌、病毒、寄生虫、细菌、人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌属、乙型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产杆菌、结核分枝杆菌和破伤风梭菌。
31.权利要求28所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自免疫介导的血小板减少症、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、斯耶格伦氏综合征、多发性硬化、西登哈姆舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安动脉炎、艾迪生病、类风湿性关节炎、肉瘤样病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊椎炎、古德帕斯丘综合征、闭塞性血栓性脉管炎、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动型肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎。
32.权利要求27所述的方法，其中所述靶向分子为选自hR1(抗-IGF-1R)、
hPAM4(抗-胰腺癌粘蛋白)、hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、hIMMU31(抗-AFP)、hLL1( 抗 -CD74)、hLL2( 抗 -CD22)、hMu-9( 抗 -C SAp)、hL243( 抗 -HLA-DR)、hMN-14(抗-CEACAM5)、hMN-15(抗-CEACAM6)、hRS7(抗-EGP-1)和hMN-3(抗-CEACAM6)的抗体。
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33.一种可靶向构建体，其包含连接至金属- F、金属- F或 Ga的螯合部分。
34.权利要求33所述的可靶向构建体，其中所述可靶向构建体选自IMP 448、IMP 449、IMP 460、IMP 461、IMP 462、IMP 465、IMP466、IMP 467、IMP 468、IMP 469、IMP 470、IMP
471、IMP 473、IMP 479、IMP 485、IMP 486和IMP 487。
35.权利要求33所述的可靶向构建体，其中所述螯合部分选自DOTA、TETA、NOTA、NODA、NODA衍生物、(叔丁基)2NODA、NODA-MPAA、NETA、C-NETA、L-NETA、S-NETA和NOTA衍生物。
36.权利要求32所述的可靶向构建体，其中所述螯合部分为NOTA或NODA的烷基或芳基衍生物。
37.一种组合物，其包含NODA-MPAA。
38.权利要求37的组合物，其中将所述NODA-MPAA缀合至分子。
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39.权利要求37的组合物，其中将所述NODA-MPAA与金属 F复合。
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40.权利要求37的组合物，其中将所述NODA-MPAA与Al- F复合。
68
41.权利要求37的组合物，其中将所述NODA-MPAA与 Ga复合。
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42.一种利用 F或 F标记分子的方法，其包括；
a)在含水介质中将IIIA族金属连接至螯合部分以形成金属-螯合部分复合物，其中将所述螯合部分缀合至所述分子或随后将所述螯合部分连接至所述分子；和
18 19 18 19
b)将 F或 F添加至金属-螯合部分复合物，其中所述 F或 F结合所述金属。
43.权利要求42的方法，其中所述螯合部分为NODA-MPAA。
用于蛋白质、肽和其它分子的改进的F-18标记的方法和组
合物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2009年12月4提交的美国临时专利申请No.61/266,773；2010年2月8日提交的61/302,280；2010年3月22日提交的61/316,125；2010年5月24日提交的61/347,486；2010年9月10日提交的61/381,720和2010年9月30日提交的61/388,268的优先权。将每个优先权申请通过引用整体并入本文。
[0004] 本申请包括已通过EFS-Web以ASCII格式提交的并且通过引用整体并入本文的序列表。2010年12月2日创建的所述ASCII拷贝命名为IMM31WO7.txt并且大小为16,889个字节。
[0005] 领域
[0006] 本发明涉及利用在例如PET或NMR体内成像中使用的18F或19F标记肽或其它分子18 19
的方法。优选地，F或 F与铝或另一种金属通过螯合部分连接为缀合物[复合物]，所述螯合部分可共价连接至蛋白质、肽或其它分子。通过使用本文中描述的技术，高特异活性的
18 19
F或 F标记的分子可在30分钟或更短内制备并且适合用于成像技术而无需标记分子的HPLC纯化。标记可在适合于体内直接使用的盐水介质中存在。在替代实施方案中，可加入有机溶剂来提高标记的效率。标记分子在体内条件下是稳定的，尽管为了某些目的，例如试剂盒配制，可加入稳定剂例如抗坏血酸、海藻糖、山梨醇或甘露醇。在其它替代实施方案中，
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可用铝预先加载螯合部分，将其冻干以用于贮存，然后用 F或 F进行标记。
的方法。优选地，F或 F与铝或另一种金属通过螯合部分连接为缀合物[复合物]，所述螯合部分可共价连接至蛋白质、肽或其它分子。通过使用本文中描述的技术，高特异活性的
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F或 F标记的分子可在30分钟或更短内制备并且适合用于成像技术而无需标记分子的HPLC纯化。标记可在适合于体内直接使用的盐水介质中存在。在替代实施方案中，可加入有机溶剂来提高标记的效率。标记分子在体内条件下是稳定的，尽管为了某些目的，例如试剂盒配制，可加入稳定剂例如抗坏血酸、海藻糖、山梨醇或甘露醇。在其它替代实施方案中，
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可用铝预先加载螯合部分，将其冻干以用于贮存，然后用 F或 F进行标记。
[0007] 背景
[0008] 正电子发射断层摄影(PET)已经成为诊断医学中最重要的功能成像模式之一，具有极高的灵敏度(fmol)、高分辨率(4-10mm)和可被适当定量的组织堆积(tissue18
accretion)(Volkow 等，1988，1988，Am.J.Physiol.Imaging 3:142)。 尽 管 [ F]2- 脱
18
氧-2-氟-D-葡萄糖([ F]FDG)是肿瘤学中最广泛使用的功能成像剂(Fletcher等，2008，J.Nucl.Med.49:480)，但在开发功能成像的其它标记化合物以补充或增进解剖成像方法中存在浓厚兴趣(Torigian等，2007，CA Cancer J.Clin.57:206)，特别是目前使用的组合型PET/计算机断层摄影系统。因此，需要具有使放射正电子的放射性核素与各种生物学和医学目标分子缀合的简易方法。
accretion)(Volkow 等，1988，1988，Am.J.Physiol.Imaging 3:142)。 尽 管 [ F]2- 脱
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氧-2-氟-D-葡萄糖([ F]FDG)是肿瘤学中最广泛使用的功能成像剂(Fletcher等，2008，J.Nucl.Med.49:480)，但在开发功能成像的其它标记化合物以补充或增进解剖成像方法中存在浓厚兴趣(Torigian等，2007，CA Cancer J.Clin.57:206)，特别是目前使用的组合型PET/计算机断层摄影系统。因此，需要具有使放射正电子的放射性核素与各种生物学和医学目标分子缀合的简易方法。
[0009] 肽或其它小分子可以用正电子发射体18F、64Cu、11C、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、86Y和124I来标记。PET同位素的较低发射能量是期望的，以使正电子在产生被PET相机成像的两个511keV γ射线之前从靶位点移行的距离最短。许多发射正电子的同位素在其衰变链中还具有其它发射，例如γ射线、α粒子或β粒子。还期望具有是纯正电子发射体的PET同位素，以使任何剂量测定问题最小化。同位素的半衰期也是重要的，因为半衰期必须足够长以使同位素连接至靶向分子，分析产物，将其注入患者，并使得产物定位、从非靶组织清除并然后成像。如果半衰期太长，则比活度可能不能高至足以获得清晰图像所需的足够光子，而如果半衰期太短，则生产、商业分销和生物分布所需的时间可能不足。由于其较低的正电
18 +
子发射能量，不存在侧向发射以及适当的半衰期，F(β635keV 97%，t1/2110分钟)是最广泛使用的PET发射同位素之一。
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子发射能量，不存在侧向发射以及适当的半衰期，F(β635keV 97%，t1/2110分钟)是最广泛使用的PET发射同位素之一。
[0010] 常规地，18F通过将其结合至碳原子而连接至化合物(Miller等，2008，Angew Chem Int Ed 47:8998-9033)，但是也已经报道了连接至硅(Shirrmacher等，2007，Bioconj Chem18:2085-89；Hohne等，2008，Bioconj Chem 19:1871-79)和硼(Ting等，2008，Fluorine Chem129:349-58)。结合至碳通常涉及多步合成，包括多个纯化步骤，这对具有110分钟半
18
衰期的同位素而言是有问题的。目前用于肽的 F标记方法通常包括标记低比活度试剂，HPLC纯化试剂，然后缀合至目标肽。缀合物通常在缀合后再次纯化以获得期望的标记肽比活度。
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衰期的同位素而言是有问题的。目前用于肽的 F标记方法通常包括标记低比活度试剂，HPLC纯化试剂，然后缀合至目标肽。缀合物通常在缀合后再次纯化以获得期望的标记肽比活度。
[0011] 一个实 例是Poethko等(J.Nucl.Med.2004；45:892-902)的标 记方法，其中4-[18F]氟苯甲醛被 首先合成并纯 化(Wilson等，J.Labeled Compounds andRadiopharm.1990；XXVIII:1189-1199)，然后缀合至肽。然后通过HPLC纯化肽缀合物以去
18
除用来促进缀合完全的过量肽。其它实例包括用以下物质标记：琥珀酰[ F]氟代苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992，Int.J．Rad.Appl.Instrum.B 19:275)，其它酰基化合物(Tada等，1989，Labeled Compd.Radiopharm.XXVII:1317；Wester等，1996，Nucl.Med.Biol.23:365；Guhlke等，1994，Nucl.MEd.Biol 21:819)或点击化学加合物(Li等，2007，Bioconjugate Chem.18:1987)。这些方法的总合成和配制时间范围为1-3小时，大部分时
18
间用于标记肽的HPLC纯化以获得体内靶向所需的比活度。对于2小时的半衰期，使 F与肽连接所需的所有操作是很大的负担。这些方法也操作冗长并且需要使用专门设计来产生标记产物的设备和/或需要专门专业化学人员的努力。它们也不利于可常规用于临床环境的试剂盒配制。
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除用来促进缀合完全的过量肽。其它实例包括用以下物质标记：琥珀酰[ F]氟代苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992，Int.J．Rad.Appl.Instrum.B 19:275)，其它酰基化合物(Tada等，1989，Labeled Compd.Radiopharm.XXVII:1317；Wester等，1996，Nucl.Med.Biol.23:365；Guhlke等，1994，Nucl.MEd.Biol 21:819)或点击化学加合物(Li等，2007，Bioconjugate Chem.18:1987)。这些方法的总合成和配制时间范围为1-3小时，大部分时
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间用于标记肽的HPLC纯化以获得体内靶向所需的比活度。对于2小时的半衰期，使 F与肽连接所需的所有操作是很大的负担。这些方法也操作冗长并且需要使用专门设计来产生标记产物的设备和/或需要专门专业化学人员的努力。它们也不利于可常规用于临床环境的试剂盒配制。
[0012] 需要快速简单的18F标记靶向部分(例如蛋白质或肽)的方法，所述方法产生用于适合检测和/或成像的比活度和体内稳定性的靶向构建体，同时最大限度减少对专门设备或高度培训人员的需求并减少操作人员暴露于高水平放射。更优选地，需要制备用于预靶向技术的18F标记的靶向肽。还需要可提供进行这种新方法所需的组合物的预包装试剂盒。
[0013] 概述
[0014] 在各种实施方案中，本发明涉及关于用于PET或NMR成像的18F-或19F标记分子的18 18
组合物和方法。如本文中所论述，当本申请提及 F时，本领域技术人员将了解可利用 F、
19 68 18
F或另一种金属(例如 Ga)结合放射性核素。在示例性方法中，将 F与金属结合，并且
18
将 F-金属复合物连接至肽或其它分子上的配体。如下文中所描述的，IIIA族的金属(铝、
18
镓、铟和铊)适合于 F结合，尽管铝是优选的。也可以使用镥。金属结合配体优选为螯合剂例如NOTA、NETA，DOTA、DTPA和在下文更详细讨论的其它螯合基团。或者，可以首先使金
18
属或分子连接，然后添加 F来结合所述金属。
组合物和方法。如本文中所论述，当本申请提及 F时，本领域技术人员将了解可利用 F、
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F或另一种金属(例如 Ga)结合放射性核素。在示例性方法中，将 F与金属结合，并且
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将 F-金属复合物连接至肽或其它分子上的配体。如下文中所描述的，IIIA族的金属(铝、
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镓、铟和铊)适合于 F结合，尽管铝是优选的。也可以使用镥。金属结合配体优选为螯合剂例如NOTA、NETA，DOTA、DTPA和在下文更详细讨论的其它螯合基团。或者，可以首先使金
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属或分子连接，然后添加 F来结合所述金属。
[0015] 本领域技术人员将了解，实际上任何递送分子可连接至18F以用于成像目的，只要其含有可以被修饰而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作18
用的可衍生化基团。尽管下文实施例主要关注 F-标记的肽部分，但是许多其它类型的递送分子，例如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等可
18
以被 F-标记并用于成像目的。
用的可衍生化基团。尽管下文实施例主要关注 F-标记的肽部分，但是许多其它类型的递送分子，例如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等可
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以被 F-标记并用于成像目的。
[0016] 下文实施例中描述的用于18F或其它试剂的预靶向递送的可靶向构建体肽包括但不限于IMP 449、IMP 460、IMP 461、IMP 467、IMP469、IMP 470、IMP 471、IMP 479、IMP 485和IMP 487，其包含螯合部分，所述螯合部分包括但不限于DTPA、NOTA、苄基-NOTA、NOTA的烷基或芳基衍生物、NODA-GA、C-NETA、琥珀酰-C-NETA和双-叔丁基-NODA。
[0017] 在某些实施方案中，示例性18F-标记的肽可在使用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中用作可靶向构建体。在这种情况下，抗体或片段将包括疾病或病症相关靶的一个或多个结合位点，所述靶例如肿瘤相关抗原或自身免疫疾病相关抗原或病原生物产生或展示的抗原，所述病原生物例如病毒、细菌、真菌或其它微生物。第二结合位点将特异性结合至可靶向构建体。使用双特异性或多特异性抗体进行预靶向的方法是本领域公知的(参见例如，美国专利No.6,962,702，将其实施例部分通过引用并入本文)。类似地，结合可靶向构建体的抗体或其片段也是本领域公知的，例如与HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体或与In-DTPA结合的734抗体(参见，美国专利No.7,429,381、7,563,439、7,666,415和7,534,431，将所述每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。
一般在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体并允许结合至细胞或组织靶抗
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原。在未结合抗体从循环中清除适量时间之后，例如 F-标记的可靶向构建体施用给患者并结合至集中于靶细胞或组织的抗体，然后例如通过PET扫描进行成像。
一般在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体并允许结合至细胞或组织靶抗
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原。在未结合抗体从循环中清除适量时间之后，例如 F-标记的可靶向构建体施用给患者并结合至集中于靶细胞或组织的抗体，然后例如通过PET扫描进行成像。
[0018] 在替代实施方案中，直接结合受体的分子例如生长抑素、奥曲肽、铃蟾肽、叶酸或叶酸类似物、RGD肽或其它已知的受体配体可被标记并且用于成像。受体靶向性试剂可包括例如TA138，一种整联蛋白ανβ3受体的非肽拮抗剂(Liu等，2003，Bioconj.Chem.14：1052-56)。使用金属螯合剂的受体靶向成像的其它方法在本领域是己知的并且可用于实施所要求保护的方法(参见例如，Andre等，2002，J.Inorg.Biochem.88:1-6；Pearson等，
1996,J.Med.，Chem.39:1361-71)。
1996,J.Med.，Chem.39:1361-71)。
[0019] 可以被成像的疾病或病症的类型仅受用于靶向与疾病或病症相关的细胞或组织的适合递送分子的可用性限制。许多此类递送分子是己知的。例如，与患病组织或靶(例18
如癌症)结合的任何蛋白质或肽可以通过所公开的方法用 F标记并用于检测和/或成像。
在某些实施方案中，此类蛋白或肽可以包括但不限于结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体或抗
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体片段。任何己知的TAA结合抗体或片段可以通过所描述的方法用 F标记并用于肿瘤的成像和/或检测，例如通过PET扫描或其它己知技术。
如癌症)结合的任何蛋白质或肽可以通过所公开的方法用 F标记并用于检测和/或成像。
在某些实施方案中，此类蛋白或肽可以包括但不限于结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体或抗
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体片段。任何己知的TAA结合抗体或片段可以通过所描述的方法用 F标记并用于肿瘤的成像和/或检测，例如通过PET扫描或其它己知技术。
[0020] 某些替代实施方案包括使用点击化学反应将金属-18F-螯合部分连接至分子。优选地，所述点击化学包括靶向分子例如抗体或抗原结合抗体片段(包含激活部分例如炔、硝酮或叠氮基)与连接至一个或多个螯合基团并且包含对应的反应性部分例如叠氮化物、炔或硝酮的螯合部分或载体分子的反应。当靶向分子包含炔时，螯合部分或载体将包含叠氮化物、硝酮或类似的反应性部分。点击化学反应可在体外发生以形成高度稳定的标记的靶向分子，随后将所述分子给受试者施用。
[0022] 下列附图被包括以示例性说明本发明的特定实施方案并且不意味着限制所要求保护的主题的范围。
[0023] 图1.18F标记试剂在携带肿瘤的裸小鼠中的生物分布，通过显微PET成像。每个18
左肋携带小的皮下LS174T肿瘤的3只裸小鼠在注射以下任一个之后的冠状切片：(A)[ F]
18 18
FDG、(B)用抗-CEA x抗-HSGbsMAb预靶向的Al[ F]IMP449、(C)单独的Al[ F]IMP449(未用bsMAb预靶向)。在成像期结束时给出从动物取出的组织的生物分布数据，表示为每克百分比注射剂量(%ID/g)。缩写：B，骨髓；H，心脏；K，肾；T，肿瘤。
左肋携带小的皮下LS174T肿瘤的3只裸小鼠在注射以下任一个之后的冠状切片：(A)[ F]
18 18
FDG、(B)用抗-CEA x抗-HSGbsMAb预靶向的Al[ F]IMP449、(C)单独的Al[ F]IMP449(未用bsMAb预靶向)。在成像期结束时给出从动物取出的组织的生物分布数据，表示为每克百分比注射剂量(%ID/g)。缩写：B，骨髓；H，心脏；K，肾；T，肿瘤。
[0024] 图2.给至在上肋携带35-mg LS174T人结肠直肠癌异种移植物的裸小鼠的预靶向18
Al[ F]IMP 449的动态成像研究。上方三个图分别显示冠状、径向和横向截面，经120分钟的成像期在6个不同的5分钟间隔取自集中于肿瘤外周位置的身体区域。每个剖视图中左侧第一个图像显示十字线交叉处肿瘤的定位，由箭头突出显示。动物在成像期间向其右侧部分倾斜。下方2个图显示其它冠状和径向截面，其集中于冠状截面更前方的平面以突出显示在肝和肠中的分布，而径向视图在身体中更中心地交叉。缩写：Cor，冠状；FA，前臂；H，心脏；K，肾；Lv，肝；Sag，径向；Tr，横向；UB，膀胱。
Al[ F]IMP 449的动态成像研究。上方三个图分别显示冠状、径向和横向截面，经120分钟的成像期在6个不同的5分钟间隔取自集中于肿瘤外周位置的身体区域。每个剖视图中左侧第一个图像显示十字线交叉处肿瘤的定位，由箭头突出显示。动物在成像期间向其右侧部分倾斜。下方2个图显示其它冠状和径向截面，其集中于冠状截面更前方的平面以突出显示在肝和肠中的分布，而径向视图在身体中更中心地交叉。缩写：Cor，冠状；FA，前臂；H，心脏；K，肾；Lv，肝；Sag，径向；Tr，横向；UB，膀胱。
[0025] 图3.18F-标记的IMP 468铃蟾肽类似物的体内组织分布。
[0026] 图4.在注射后2h，AR42J肿瘤携带小鼠(n=5)中18F-IMP 466和68Ga-IMP 466的生物分布对比。作为对照，单独组的小鼠(n=5)接受过量未标记的奥曲肽以证明受体特异性。
[0027] 图5.在注射后2h，颈部具有s.c.AR42J肿瘤的小鼠中18F-IMP466和68Ga-IMP 466的PET/CT扫描的冠状切片。清晰可见在肿瘤和肾中的累积。
[0028] 图6.在静脉内注射68Ga-IMP 288后1小时，具有皮下LS174T和SK-RC52肿瘤的125 68
BALB/c裸小鼠中6.0nmol I-TF2(0.37MBq)和0.25nmol Ga-IMP 288(5MBq)的生物分布。值以平均值±标准偏差给出(n=5)。
BALB/c裸小鼠中6.0nmol I-TF2(0.37MBq)和0.25nmol Ga-IMP 288(5MBq)的生物分布。值以平均值±标准偏差给出(n=5)。
[0029] 图7.在用6.0nmol TF2预靶向之后静脉内注射后1小时，5MBqFDG和5MBq68
Ga-IMP288(0.25nmol)的生物分布。值以平均值±标准偏差给出(n=5)。
Ga-IMP288(0.25nmol)的生物分布。值以平均值±标准偏差给出(n=5)。
[0030] 图8.在右后腿具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)(亮箭头)并且在左大腿肌肉具有炎18
症(暗箭头)的BALB/c裸小鼠的PET/CT图像，所述小鼠接受了5MBq F-FDG并且在一天
68 18
后以16小时的间隔接受6.0nmolTF2和5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol)。动物在 F-FDG和
68
Ga-IMP288注射后一小时被成像。图显示FDG-PET扫描的3D体积透视(A)、肿瘤区域的横截面(B)，以及预靶向免疫PET扫描的3D体积透视(C)、肿瘤区域的横截面(D)。
症(暗箭头)的BALB/c裸小鼠的PET/CT图像，所述小鼠接受了5MBq F-FDG并且在一天
68 18
后以16小时的间隔接受6.0nmolTF2和5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol)。动物在 F-FDG和
68
Ga-IMP288注射后一小时被成像。图显示FDG-PET扫描的3D体积透视(A)、肿瘤区域的横截面(B)，以及预靶向免疫PET扫描的3D体积透视(C)、肿瘤区域的横截面(D)。
[0031] 图9.在之前16小时6.0nmol TF2，静脉内注射后1小时，0.25nmol Al18F-IMP18 18
449(5MBq)的生物分布，没有预靶向的Al F-IMP449的生物分布，或Al[ F]的生物分布。值以平均值±标准偏差给出。
449(5MBq)的生物分布，没有预靶向的Al F-IMP449的生物分布，或Al[ F]的生物分布。值以平均值±标准偏差给出。
[0032] 图10.以16小时的间 隔静脉内接受 6.0nmol TF2 和0.25nmolAl18F-IMP449(5MBq)的、在右侧具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)(箭头)的BALB/c裸小鼠的静态PET/
18
CT成像研究。动物在注射Al F-IMP449之后1小时被成像。图显示3D体积透视(A)后视图，以及在肿瘤区域的横截面(B)冠状、(C)径向。
18
CT成像研究。动物在注射Al F-IMP449之后1小时被成像。图显示3D体积透视(A)后视图，以及在肿瘤区域的横截面(B)冠状、(C)径向。
[0033] 图11.IMP 479(SEQ ID NO:35)的结构。
[0034] 图12.IMP 485(SEQ ID NO:36)的结构。
[0035] 图13.IMP 487(SEQ ID NO:37)的结构。
[0036] 图14.二-叔丁基-NODA-MPAA的合成。
[0038] 详细描述
[0039] 提供下述定义以帮助理解本文公开内容。未明确定义的术语根据其明显且普通的含义使用。
[0040] 本文使用的术语“一(a)”或“一个(an)”可以表示一个或超过一个的项目。
[0041] 本文使用的术语“和”和“或”可以用来表示合取或析取。即，除非另有说明，否则两个术语都应该被理解为等价于“和/或”。
[0042] 本文使用的“约”表示在数字的正或负10%之内。例如，“约100”指90和110之间的任何数字。
[0043] 本文使用的“肽”指长度为2至100个氨基酸残基、更优选长度为2至10个、更优选在2至6个氨基酸的天然存在或非天然存在氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。
[0044] 本文使用的术语“病原休”包括但不限于真菌、病毒、寄生虫和细菌，包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilis influenzaeB)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风梭菌(Chlostridium tetani)。
[0045] 本文使用的“辐射分解保护剂”指可添加至18F-标记的复合物或分子以减小18F-标记的复合物或分子被辐射分解的分解速率的任何分子、化合物或组合物。可以使用任何己知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。
[0046] 18F标记技术
[0047] 用18F标记分子的各种技术是己知的。表1列出了几种较普遍报道的氟化程序的18
性质。通过碳标记的肽经常包括通过亲核取代 F-结合至辅基，通常以2或3个步骤，其中所述辅基被标记并纯化，连接至化合物，然后再次纯化。该一般方法已经用于经酰胺键、醛和“点击化学”连接辅基(Marik等，2006，Bioconjug Chem 17:1017-21；Poethko等，2004，J Nucl Med 45：892-902；Li等，2007，Bioconjug Chem 18:989-93)。最常见的酰胺键形成
18 18
试剂是4- F氟代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯( F-SFB)，但是已经测试了许多其它基团(Marik
18
等，2006)。在一些情况下，例如当使用 F-标记的活性酯酰胺形成基团时，可能有必要在偶
18
联反应期间保护肽上的某些基团，之后将它们裂解。该 F-SFB试剂的合成以及随后与肽的缀合需要许多合成步骤并耗费约2-3小时。
性质。通过碳标记的肽经常包括通过亲核取代 F-结合至辅基，通常以2或3个步骤，其中所述辅基被标记并纯化，连接至化合物，然后再次纯化。该一般方法已经用于经酰胺键、醛和“点击化学”连接辅基(Marik等，2006，Bioconjug Chem 17:1017-21；Poethko等，2004，J Nucl Med 45：892-902；Li等，2007，Bioconjug Chem 18:989-93)。最常见的酰胺键形成
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试剂是4- F氟代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯( F-SFB)，但是已经测试了许多其它基团(Marik
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等，2006)。在一些情况下，例如当使用 F-标记的活性酯酰胺形成基团时，可能有必要在偶
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联反应期间保护肽上的某些基团，之后将它们裂解。该 F-SFB试剂的合成以及随后与肽的缀合需要许多合成步骤并耗费约2-3小时。
[0048] Poethko等(2004)开发了一种更简单、更有效的18F-肽标记方法，其中4-18F-氟代苯甲醛试剂通过肟键合在约75-90min内缀合至肽，包括离心干燥(dry-down)步骤。更新18
的“点击化学”方法在铜催化剂存在下用乙炔或叠氮化物将 F-标记分子连接至肽(Li等，
2007；Glaser和Arstad，2007,Bioconjug Chem 18:989-93)。叠氮化物与乙炔基团之间的反应形成三唑连接，该连接是非常稳定的并且在肽上非常有效地形成而无需保护基。使用
18
离心干燥步骤，点击化学在约75-90分钟内以良好收率(～50%)产生 F-标记的肽。
的“点击化学”方法在铜催化剂存在下用乙炔或叠氮化物将 F-标记分子连接至肽(Li等，
2007；Glaser和Arstad，2007,Bioconjug Chem 18:989-93)。叠氮化物与乙炔基团之间的反应形成三唑连接，该连接是非常稳定的并且在肽上非常有效地形成而无需保护基。使用
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离心干燥步骤，点击化学在约75-90分钟内以良好收率(～50%)产生 F-标记的肽。
[0049] 表1．选择的18F-肽标记方法的概述
[0050]
[0051] a包括离心干燥时间
[0052] b衰减校正
[0053] 18F结合至硅的最近方法使用同位素交换来用18F代替19F(Shirrmacher等，2007)。在室温下10分钟内进行，该反应产生具有高比活度(225-680GBq/μmol；6,100-18,400Ci/
18 18
mmol)的 F-醛辅基。随后将 F标记的醛缀合至肽并且通过HPLC进行纯化，并且在40分钟(包括离心干燥)内以约55%收率获得纯化的标记的肽。该方法后来通过在标记反应之
18
前将硅并入肽而被修改为一步过程(Hohne等，2008)。然而，使用 F-硅-铃蟾肽衍生物在小鼠中的生物分布研究显示，骨吸收随时间增加(0.5h 1.35±0.47%注射剂量(ID)/g与
18 18
4.0h5.14±2.71%ID/g)，表明 F从肽释放，因为己知未结合的 F集中在骨中(Hohne等，
18 18
2008)。尿的HPLC分析显示空隙体积中大量的 F活度，推测这是由于从肽释放的 F-氟
18
阴离子。因此，似乎 F-硅标记分子在血清中不稳定。还报道了大量的肝胆排泄，归因于
18 18
F-硅-结合底物的亲脂性，因此需要未来的衍生物更具亲水性。还研究了使 F连接至硼的方法；然而，现有方法产生具有低比活度的缀合物(Ting等，2008)。
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mmol)的 F-醛辅基。随后将 F标记的醛缀合至肽并且通过HPLC进行纯化，并且在40分钟(包括离心干燥)内以约55%收率获得纯化的标记的肽。该方法后来通过在标记反应之
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前将硅并入肽而被修改为一步过程(Hohne等，2008)。然而，使用 F-硅-铃蟾肽衍生物在小鼠中的生物分布研究显示，骨吸收随时间增加(0.5h 1.35±0.47%注射剂量(ID)/g与
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4.0h5.14±2.71%ID/g)，表明 F从肽释放，因为己知未结合的 F集中在骨中(Hohne等，
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2008)。尿的HPLC分析显示空隙体积中大量的 F活度，推测这是由于从肽释放的 F-氟
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阴离子。因此，似乎 F-硅标记分子在血清中不稳定。还报道了大量的肝胆排泄，归因于
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F-硅-结合底物的亲脂性，因此需要未来的衍生物更具亲水性。还研究了使 F连接至硼的方法；然而，现有方法产生具有低比活度的缀合物(Ting等，2008)。
[0054] 抗体和肽与放射性金属常规偶联，通常在15分钟内并具有定量收率(Meares等，1984，Acc Chem Res 17:202-209；Scheinberg等，1982，Science 215:1511-13)。为了PET
64 68
成像，Cu和 Ga通过螯合剂结合至肽，并已经显示相当好的PET-成像性质(Heppler等，
18
2000，Current Med Chem 7:971-94)。因为氟化物结合大部分金属，我们试图确定 F-金属复合物是否能够结合至靶向分子上的螯合剂(Tewson，1989，Nucl Med Biol.16:533-51；
18
Martin，1996，Coordination Chem Rev 141:23-32)。我们专注于Al F复合物的结合，因为氟化铝可以在体内相对稳定(Li，2003，Crit Rev Oral Biol Med 14:100-114；Antonny等，1992，JBiol Chem 267:6710-18)。最初的研究显示该方法制备使用双特异性抗体
18
(bsMAb)预靶向系统体内靶向癌症的 F-标记的肽的可行性，这是一种高度灵敏和特异
18
性的定位癌症的技术，在一些情况下好于 F-FDG(氟代脱氧葡萄糖)(McBride等，2008，J Nucl Med(增刊)49:97P；Wagner，2008，J Nucl Med 49:23N-24N；Karacay等，2000，Bioconj Chem 11:842-54；Sharkey 等，2008，CancerRes 68:5282-90；Gold 等，2008，Cancer Res
68:4819-26；Sharkey 等，2005，NatureMed11:1250-55；Sharkey 等，2005，Clin Cancer Res 11:7109s-7121s；McBride 等，2006,J Nucl Med 47:1678-88；Sharkey 等，2008，
18
Radiology246:497-508)。这些研究揭示，Al F复合物可以稳定结合至1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)，但是收率低。
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成像，Cu和 Ga通过螯合剂结合至肽，并已经显示相当好的PET-成像性质(Heppler等，
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2000，Current Med Chem 7:971-94)。因为氟化物结合大部分金属，我们试图确定 F-金属复合物是否能够结合至靶向分子上的螯合剂(Tewson，1989，Nucl Med Biol.16:533-51；
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Martin，1996，Coordination Chem Rev 141:23-32)。我们专注于Al F复合物的结合，因为氟化铝可以在体内相对稳定(Li，2003，Crit Rev Oral Biol Med 14:100-114；Antonny等，1992，JBiol Chem 267:6710-18)。最初的研究显示该方法制备使用双特异性抗体
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(bsMAb)预靶向系统体内靶向癌症的 F-标记的肽的可行性，这是一种高度灵敏和特异
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性的定位癌症的技术，在一些情况下好于 F-FDG(氟代脱氧葡萄糖)(McBride等，2008，J Nucl Med(增刊)49:97P；Wagner，2008，J Nucl Med 49:23N-24N；Karacay等，2000，Bioconj Chem 11:842-54；Sharkey 等，2008，CancerRes 68:5282-90；Gold 等，2008，Cancer Res
68:4819-26；Sharkey 等，2005，NatureMed11:1250-55；Sharkey 等，2005，Clin Cancer Res 11:7109s-7121s；McBride 等，2006,J Nucl Med 47:1678-88；Sharkey 等，2008，
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Radiology246:497-508)。这些研究揭示，Al F复合物可以稳定结合至1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)，但是收率低。
[0055] 在下文实施例中，检验了新的标记条件和几种新的螯合部分，其使收率从约10%18
提高至约80%，提供了 F标记用于PET成像的肽和其它分子的可行方法。
提高至约80%，提供了 F标记用于PET成像的肽和其它分子的可行方法。
[0056] 可靶向构建体
[0057] 在某些实施方案中，用18F或其它诊断剂和/或治疗剂标记的部分可以包括肽或其它可靶向构建体。可选择标记的肽(或蛋白质)以直接结合至靶向细胞、组织、病原生物或用于成像、检测和/或诊断的其它靶。在其它实施方案中，可选择标记的肽以间接结合，例如使用具有一个或多个可靶向构建体肽的结合位点和一个或多个疾病或病症相关靶抗原的结合位点的双特异性抗休。双特异性抗体可以例如用于预靶向技术，其中可首先将抗体施用给受试者。可以提供足够的时间来使双特异性抗体结合至靶抗原并使未结合抗体从循环中清除。然后，可将可靶向构建体(例如标记的肽)施用给受试者并使得结合至双特异18
性抗体并集中于患病细胞或组织。可以通过PET扫描或其它己知技术确定 F-标记的可靶向构建体的分布。
性抗体并集中于患病细胞或组织。可以通过PET扫描或其它己知技术确定 F-标记的可靶向构建体的分布。
[0058] 此类可靶向构建体可以具有多种结构并且根据以高亲和力结合至可靶向构建体的抗体或片段的可用性以及当用于预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体时快速体内清除来选择。疏水剂在引发强免疫应答方面是最好的，而亲水剂是快速体内清除所优选的。因此，建立疏水特征和亲水特征之间的平衡。这可以部分通过使用亲水螯合剂来抵消许多有机部分的固有疏水性来实现。而且，可以选择具有相反溶液性质的可靶向构建体的亚基，例如含有一些疏水性氨基酸和一些亲水性氨基酸的肽。除了肽以外，还可以使用碳水化合物。
[0059] 可以使用具有少至2个氨基酸残基、优选2至10个残基的肽并且可以偶联至其它部分，例如螯合剂。接头应该是低分子量缀合物，优选具有小于50,000道尔顿、且有利地小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量。更通常地，可靶向构建体肽具有四个或更多个残基，例如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:1)，其中DOTA是1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7,10-四乙酸，并且HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基团。或者，DOTA可以被NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(对-溴代乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4,7-二羧基甲基[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-乙基]-2-羰基甲基-氨基]乙酸)或其它己知螯合部分所替代。
[0060] 可靶向构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸，例如D-氨基酸以增加肽的体内稳定性。在替代实施方案中，可使用其它主链结构例如由非天然氨基酸或类肽构建的主链结构。
[0061] 用作可靶向构建体的肽适宜使用固相载体和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动肽合成仪上合成。在后来用于螯合部分或其它试剂的缀合的肽中的游离氨基有利地使用标准保护基(例如Boc基团)封闭，而N-末端残基可以被乙酰化以提高血清稳定性。这种保护基是熟练技术人员公知的。参见Greene和Wuts ProtectiveGroups in Organic Synthesis，1999(John Wiley和Sons，N.Y.)。当肽被制备以随后用于双特异性抗体系统时，它们有利地从树脂被裂解以产生对应的C-末端酰胺，以抑制体内羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公开于下文实施例中。
[0062] 当使用利用双特异性抗体的预靶向时，所述抗体将包含用于由靶组织产生的或与靶组织相关的抗原的第一结合位点或可靶向构建体上的半抗原的第二结合位点。示例性半抗原包括但不限于HSG和In-DTPA。针对HSG半抗原而产生的抗体是己知的(例如679抗体)并且可以易于并入适当的双特异性抗体(参见例如，美国专利No.6,962,702、
7,138,103和7,300,644，将实施例部分通过引用并入本文)。然而，其它半抗原和与其结合的抗体是本领域己知的并且可以使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利No.7,534,431，将实施例部分通过引用并入本文)。
7,138,103和7,300,644，将实施例部分通过引用并入本文)。然而，其它半抗原和与其结合的抗体是本领域己知的并且可以使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利No.7,534,431，将实施例部分通过引用并入本文)。
[0063] 本领域技术人员应了解，虽然下面实施例部分公开的大部分可靶向构建体为肽，但也可将其它类型的分子用作可靶向构建体。例如，聚合物分子，例如聚乙二醇(PEG)可易18
于与螯合部分衍生化以结合 F-Al。此类载体分子的许多实例在本领域是已知的并且可利
18
用，包括但不限于聚合物、纳米颗粒、微球体、脂质体和胶束。为了用于 F的预靶向递送，唯
18
一的要求是载体分子包含一个或多个用于连接金属- F的螯合部分和一个或多个半抗原部分以结合双特异性或多特异性抗体或其它靶向分子。
于与螯合部分衍生化以结合 F-Al。此类载体分子的许多实例在本领域是已知的并且可利
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用，包括但不限于聚合物、纳米颗粒、微球体、脂质体和胶束。为了用于 F的预靶向递送，唯
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一的要求是载体分子包含一个或多个用于连接金属- F的螯合部分和一个或多个半抗原部分以结合双特异性或多特异性抗体或其它靶向分子。
[0064] 螯合部分
[0065] 在一些实施方案中，18F-标记分子可以包括一个或多个亲水性螯合部分，其可以结合金属离子并且还帮助确保快速体内清除。螯合剂可以根据其特定的金属结合性质来选择，并且可以容易地交换。
[0066] 特别有用的金属-螯合剂组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。大环螯合剂例如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-1,4,7-三乙酸)、DOTA、TETA(对-溴代乙
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酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)和NETA也可与可能用作 F缀合的配体的多种金属一起使用。
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酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)和NETA也可与可能用作 F缀合的配体的多种金属一起使用。
[0067] 其中配体包括硬碱螯合功能例如羧酸酯或胺基的DTPA和DOTA-型螯合剂对螯合硬酸阳离子，特别是IIa族和IIIa族金属阳离子最有效。此类金属-螯合剂复合物可以通过根据目标金属来调整环尺寸而成为非常稳定。其它环类型螯合剂(例如大环聚醚)因为稳定结合核素而令人关注。卟啉螯合剂可用于多种金属复合物。超过一种类型的螯合剂可以被缀合至载体以结合多个金属离子。螯合剂例如美国专利No.5,753,206中公开的那些螯合剂，特别是缩氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和缩氨基硫脲基-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂有利地用于结合与软碱配体紧密结合的Tc、Re、Bi和其它过渡金属、镧系元素和锕系元素的软酸阳离子。将超过一种类型的螯合剂与肽连接可能是有用的。因为针对二-DTPA半抗原的抗体是己知的(Barbet等，美国专利号5,256,395)并且可以容易地偶联至靶向抗体以形成双特异性抗体，所以在预靶向方案中可能使用具有冷二DTPA螯合18
剂和另一种用于结合 F复合物的螯合剂的肽半抗原。此类肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(公开为SEQ ID NO:2的核心肽)。其它硬酸螯合剂例如DOTA、TETA等可以取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且对它们有特异性的MAb可以使用与用于产生抗-二-DTPA MAb的技术类似的技术来产生。
剂和另一种用于结合 F复合物的螯合剂的肽半抗原。此类肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(公开为SEQ ID NO:2的核心肽)。其它硬酸螯合剂例如DOTA、TETA等可以取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且对它们有特异性的MAb可以使用与用于产生抗-二-DTPA MAb的技术类似的技术来产生。
[0068] 另一种有用的螯合剂可以包括NOTA-型部分，例如Chong等(J.Med.Chem.，2008，51:118-25)中公开的。Chong等公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体的产生和用
177 205/206
途，当与 Lu或 Bi复合时显示在血清中多达14天的稳定性。所述螯合剂不是限制性的，并且本领域己知的和/或下文实施例中描述的螯合剂的这些和其它实例可用于实施本发明。
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途，当与 Lu或 Bi复合时显示在血清中多达14天的稳定性。所述螯合剂不是限制性的，并且本领域己知的和/或下文实施例中描述的螯合剂的这些和其它实例可用于实施本发明。
[0069] 应理解，两种不同的硬酸或软酸螯合剂可以被并入可靶向构建体，例如具有不同螯合环尺寸，以优选结合两种不同的硬酸或软酸阳离子，归因于阳离子的不同尺寸、螯合环的几何学和优选的阳离子复合离子结构。这将使得两种不同的金属(其一者或两者都可以18
连接至 F)并入可靶向构建体以最终被预靶向双特异性抗体捕获。
连接至 F)并入可靶向构建体以最终被预靶向双特异性抗体捕获。
[0070] 抗体
[0071] 靶抗原
[0072] 使用的靶向抗体可以对于多种细胞表面或疾病相关抗原具有特异性或选择性。用于成像或治疗诸如恶性疾病、心血管疾病、传染性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、代谢病或神经(例如，神经变性)疾病的各种疾病或病症的示例性靶抗原可以包括碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、AFP、CEACAM5、CEACAM-6、c-met、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、P53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PIGF、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、PLAGL2和癌基因产物。
[0073] 在某些实施方案中，例如成像或治疗肿瘤，使用抗体可靶向肿瘤相关抗原。这些抗原性标志物可以是肿瘤产生的物质，或者可以是在肿瘤部位、肿瘤细胞表面或肿瘤细胞内聚集的物质。此类肿瘤相关标志物为以下公开的那些标志物：Herberman，“Immunodiagnosis of Cancer”，Fleisher编，“The ClinicaIBiochemistry of Cancer”，第347页(American Association of Clinical Chemists，1979)和美国专利No.4,150,149、
4,361,544和4,444,744，每篇上述美国专利的实施例部分通过引用并入本文。有关肿瘤相关抗原(TAA)的报道包括Mizukami等，(2005，Nature Med.11:992-97)；Hatfield等，(2005，Curr.Cancer Drug Targets 5:229-48)；Vallbohmer 等 (2005，J．Clin.Oncol.23:3536-44)；以及Ren等(2005，Ann.Surg.242:55-63)，将每篇上述文献有关鉴定的TAA的内容通过引用并入本文。
4,361,544和4,444,744，每篇上述美国专利的实施例部分通过引用并入本文。有关肿瘤相关抗原(TAA)的报道包括Mizukami等，(2005，Nature Med.11:992-97)；Hatfield等，(2005，Curr.Cancer Drug Targets 5:229-48)；Vallbohmer 等 (2005，J．Clin.Oncol.23:3536-44)；以及Ren等(2005，Ann.Surg.242:55-63)，将每篇上述文献有关鉴定的TAA的内容通过引用并入本文。
[0074] 肿瘤相关标志物已经被Herberman(同上)分类到多种类别，包括癌胚抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、肿瘤相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。偶尔地，肿瘤相关标志物的亚基有利地用于产生具有较高肿瘤特异性的抗体，例如，人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β-亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激对非肿瘤物质的交叉反应性大大降低的抗体产生，如美国专利No.4,361,644和4,444,744中公开的。
[0075] 另一种目标标志物是跨膜激活剂和CAML-交互作用剂(TACI)。参见Yu等Nat.Immunol.1:252-256(2000)。简言之，TACI是B-细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的标志物。TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)被肿瘤坏死因子同源物-增殖诱导配体(APRIL)结合。APRIL体外刺激原代B细胞和T细胞的增殖并由于B细胞体内累积而增加脾重量。APRIL还与TALL-I(也称为BLyS或BAFF)竞争受体结合。可溶性BCMA和TACI特异性阻止APRIL的结合并阻断APRIL-刺激的原代B细胞增殖。BCMA-Fc还抑制小鼠中针对钥孔戚血蓝蛋白和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体产生，表明经由BCMA和/或TACI的APRIL和/或TALL-I信号转导是产生体液免疫所需要的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与刺激B和T细胞功能的两个配体-两个受体途径。
[0076] 当疾病涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫疾患时，靶向抗原可以选自CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、癌基因(例如，c-met或PLAGL2)、癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
[0077] 产生抗体的方法
[0078] 可通过多种良好建立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括利用蛋白A或蛋白G Sepharose的亲和色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等，"Purification of Immunoglobulin G(IgG),"于METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)中。在针对免疫原初步产生抗体后，可对抗体进行测序，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体及抗体片段的人源化和嵌合化对于本领域技术人员来说是公知的，如下文中论述的。
[0079] 嵌合抗体
[0080] 嵌合抗体是其中人抗体的可变区已被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替代的重组抗体。当给受试者施用时，嵌合抗体展示减小的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 6:3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术对于本领域技术人员来说是公知的。作为实例，Leung等，Hybridoma 73:469(1994)通过将编码鼠LL2(抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与各自的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。
[0081] 人源化抗体
[0082] 用于产生人源化MAb的技术在本领域是公知的(参见，例如，Jones等，Nature 321:522(1986)，Riechmann 等，Nature 332:323(1988)，Verhoeyen 等，Science
239:1534(1988)，Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89:4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)和Singer等，J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链转移到人抗体的对应可变结构域来进行人源化。还可用人FR序列替代嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)。由于简单地将小鼠CDR转移到人FR通常导致抗体亲和力的减小或甚至丧失，为了恢复鼠抗体的原始亲和力可能需要进行额外的修饰。这可通过将FR区内的一个或多个人残基用它们的鼠对应残基进行替代来实现，以获得具有对其表位的良好结合亲和力的抗体。参见，例如，Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)。用于置换的优选残基包括位于CDR残基侧链的1、2或3埃内的FR残基，与CDR序列邻近的FR残基，或经预测与CDR残基相互作用的FR残基。
239:1534(1988)，Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89:4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)和Singer等，J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链转移到人抗体的对应可变结构域来进行人源化。还可用人FR序列替代嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)。由于简单地将小鼠CDR转移到人FR通常导致抗体亲和力的减小或甚至丧失，为了恢复鼠抗体的原始亲和力可能需要进行额外的修饰。这可通过将FR区内的一个或多个人残基用它们的鼠对应残基进行替代来实现，以获得具有对其表位的良好结合亲和力的抗体。参见，例如，Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)。用于置换的优选残基包括位于CDR残基侧链的1、2或3埃内的FR残基，与CDR序列邻近的FR残基，或经预测与CDR残基相互作用的FR残基。
[0083] 人抗体
[0084] 使用重组方法或利用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域是已知的(例如，Mancini等，2004，New Microbiol.27:315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Pharmacol.3:544-50)。完全人抗体还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术(其全部在本领域是已知的)来构建。参见，例如McCafferty等，Nature348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体展示甚至比嵌合或人源化抗体更小的副作用以及在体内基本上用作内源人抗体。
[0085] 在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4:126-40)。可由正常人或由展示特定疾病状态例如癌症的人产生人抗体(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病个体构建人抗体的有利方面在于可使循环抗体组成成分(repertoire)偏向于抗疾病相关抗原的抗体。
[0086] 在该方法的一个非限定性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，从循环血液淋巴细胞(同上)获得总RNA。由μ、γ和κ链抗体组成成分克隆重组Fab，且将其插入噬菌体展示文库(同上)。将RNA转化成cDNA并且使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物将其用于制备Fab cDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222:581-97)。按照Andris-Widhopf等(2000，于:Phage Display Laboratory Manual，Barbas等(编)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY pp.9.1至9.22中)进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化终Fab片段，且将其插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。此类文库可通过本领域已知的标准噬菌体展示方法来筛选。可以以多种方式进行噬菌体展示，关于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology
3:5564-571(1993)。
3:5564-571(1993)。
[0087] 还可通过体外活化的B-细胞来产生人抗体。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275，将其通过引用整体并入本文。本领域技术人员将了解，这些技术是示例性的并且可使用任何已知的用于制备和筛选人抗体或抗体片段的方法。
[0088] 在另一个替代方案中，可使用标准免疫方案，将已对其进行了遗传工程化以产生人抗体的转基因动物用于产生针对基本上任何免疫原性靶的人抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法公开于Green等，Nature Genet.7:13(1994)，Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)中。这样的系统的非限定性实例为来自Abgenix(Fremont，CA)的 (例如，Green等，1999，J.Immunol.Methods
231:11-23，通过引用并入本文)。在 和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活
并且由功能性人抗体基因替换，然而小鼠免疫系统的其余部分仍然未受损伤。
231:11-23，通过引用并入本文)。在 和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活
并且由功能性人抗体基因替换，然而小鼠免疫系统的其余部分仍然未受损伤。
[0089] 利用包含人IgH和Igκ基因座的部分(包括大部分可变区序列以及附加基因和调控序列)的种系构造的(germline-configured)YCA(酵母人工染色体)转化
可将人可变区组成成分用于产生抗体产生性B-细胞，通过已知技术可将所
述B-细胞加工成杂交瘤。利用靶抗原免疫的 将通过正常免疫应答产生人抗
体，可通过上文中论述的标准技术收获和/或产生所述抗体。多个 品系是可
获得的，其每一个品系能够产生不同种类的抗体。已显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将了解，要求保护的组合物和方法不限于 系统的使用，而且还可利用已被遗传工程化
以产生人抗体的任何转基因动物。
可将人可变区组成成分用于产生抗体产生性B-细胞，通过已知技术可将所
述B-细胞加工成杂交瘤。利用靶抗原免疫的 将通过正常免疫应答产生人抗
体，可通过上文中论述的标准技术收获和/或产生所述抗体。多个 品系是可
获得的，其每一个品系能够产生不同种类的抗体。已显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将了解，要求保护的组合物和方法不限于 系统的使用，而且还可利用已被遗传工程化
以产生人抗体的任何转基因动物。
[0090] 已知的抗体
[0091] 本领域技术人员将了解，用于成像、检测和/或诊断的靶向分子可包括本领域已知的具有对于疾病状态或病症相关靶抗原的结合特异性的任何抗体或片段。此类已知的抗体包括但不限于hR1(抗-IGF-1R，3/12/10提交的美国专利申请序列No.12/772,645)、hPAM4(抗-胰腺癌粘蛋白，美国专利No.7,282,567)、hA20(抗-CD20，美国专利No.7,251,164)、hA19(抗-CD19，美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗-AFP，美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗-CD74，美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗-CD22，美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗-CSAp，美国专利No.7,387,773)、hL243(抗-HLA-DR，美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利No.7,662,378，2010年7月29日提交的美国专利申请序列No.12/846,062)、hRS7(抗-EGP-l，美国专利No.7,238,785)、hMN-3(抗-CEACAM6，美国专利No.7,541,440)、Ab124和Ab125(抗-CXCR4，美国专利No.7,138,496)，将每个引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。
[0092] 候选抗-HIV抗体包括Johansson等(AIDS.2006年10月3日；20(15):1911-5)描述的抗包膜抗体以及Polymun(Vienna，Austria)描述并出售以及在美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等，AIDS 2007;21(16):2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006;50(5):1773-9中描述的抗HIV抗体，所有文献通过引用并入本文。
[0093] 当使用双特异性抗体时，第二MAb可选自本领域己知的任何抗-半抗原抗体，包括但不限于h679(美国专利No.7,429,381)和734(美国专利No.7,429,381、7,563,439、7,666,415和7,534,431)，每个上述专利的实施例部分通过引用并入本文。
[0094] 使用的多种其它抗体在本领域是已知的(例如，美国专利No.5,686,072、5,874,540、6,107,090、6,183,744、6,306,393、6,653,104、6,730.300、6,899,864、
6,926,893、6,962,702、7,074,403、7,230,084、7,238,785、7,238,786、7,256,004、
7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,585,491、7,612,180、7,642,239和美国专利申请公布No.20060193865；将每个所述专利和专利申请通过引用并入本文)。这类已知的抗体用于检测和/或成像多种疾病状态或病症(例如，hMN-14或TF2(表达CEA的癌症)、hA20或TF-4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10(胰腺癌)、RS7(肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3(炎症)、抗-gp120和/或抗-gp41(HIV)、抗-血小板和抗-凝血酶(凝块成像)、抗-肌球蛋白(心脏坏死)、抗-CXCR4(癌症和炎性疾病))。
6,926,893、6,962,702、7,074,403、7,230,084、7,238,785、7,238,786、7,256,004、
7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,585,491、7,612,180、7,642,239和美国专利申请公布No.20060193865；将每个所述专利和专利申请通过引用并入本文)。这类已知的抗体用于检测和/或成像多种疾病状态或病症(例如，hMN-14或TF2(表达CEA的癌症)、hA20或TF-4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10(胰腺癌)、RS7(肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3(炎症)、抗-gp120和/或抗-gp41(HIV)、抗-血小板和抗-凝血酶(凝块成像)、抗-肌球蛋白(心脏坏死)、抗-CXCR4(癌症和炎性疾病))。
[0095] 使用的抗体可商业途径获自多种己知来源。例如，多种分泌抗体的淋巴瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。针对各种疾病靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于要求保护的方法和组合物。参见例如美国专利No.7,312,318、7,282,567、7,151,164、7,074,403、7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、
7,041,293、7,038,018、7037,498、7012,133、7,001,598、6,99,468、6,994,976、6,994,852、
6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、
6,946,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、
6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、
6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、
6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、
6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、6,783,758、6,770,450、6,767,711、
6,764,688、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、
6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、
6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,653,104、6,652,852、6,635,482、
6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、
6,576,745、6,572,856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、
6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、
6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、
6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、
6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,276、
6,395,274、6,387,350、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、
6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、
6,340,459、6,331,175、6,306,393、6,254,868、6,187,287、6,183,744、6,129,914、
6,120,767、6,096,289、6,077,499、5,922,302、5,874,540、5,814,440、5,798,229、
5,789,554、5,776,456、5,736,119、5,716,595、5,677,136、5,587,459、5,443,953、
5,525,338。这些仅是示例性的，并且多种其它抗体及其杂交瘤是本领域己知的。本领域技术人员将了解，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤可通过ATCC、NCBI和/或USPTO数据库对针对选定的目标疾病相关靶的抗体的简单检索而获得。可使用本领域公知的标准技术将克隆抗体的抗原结合结构域扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并用于蛋白产生。
7,041,293、7,038,018、7037,498、7012,133、7,001,598、6,99,468、6,994,976、6,994,852、
6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、
6,946,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、
6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、
6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、
6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、
6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、6,783,758、6,770,450、6,767,711、
6,764,688、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、
6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、
6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,653,104、6,652,852、6,635,482、
6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、
6,576,745、6,572,856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、
6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、
6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、
6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、
6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,276、
6,395,274、6,387,350、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、
6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、
6,340,459、6,331,175、6,306,393、6,254,868、6,187,287、6,183,744、6,129,914、
6,120,767、6,096,289、6,077,499、5,922,302、5,874,540、5,814,440、5,798,229、
5,789,554、5,776,456、5,736,119、5,716,595、5,677,136、5,587,459、5,443,953、
5,525,338。这些仅是示例性的，并且多种其它抗体及其杂交瘤是本领域己知的。本领域技术人员将了解，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤可通过ATCC、NCBI和/或USPTO数据库对针对选定的目标疾病相关靶的抗体的简单检索而获得。可使用本领域公知的标准技术将克隆抗体的抗原结合结构域扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并用于蛋白产生。
[0096] 抗体片段
[0097] 识别特定表位的抗体片段可通过已知的技术来产生。抗体片段为抗体的抗原结合位点，例如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab′)2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，且Fab′片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫键来产生。或者，可构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science，246:1274-1281)以使得快速且容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab′片段。可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E.coli)或另一种宿主中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。这些方法例如由Goldenberg，美国专利No.4,036,945和4,331,647以及本文中包括的参考资料进行描述，将所述专利通过引用整体并入本文。此外还参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter，Biochem.J.73:119(1959)，Edelman等，于METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
[0098] 单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子和设计适当的肽接头的方法描述于美国专利No.4,704,692、美国专利No.4,946,778，R.Raag和M.Whitlow，"Single Chain Fvs"FASEB第9卷:73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，"Single Chain Antibody Variable Regions"TIBTECH，第9卷:132-137(1991)(通过引用并入本文)中。
[0099] 具有大量组成成分的scFv文库可以通过从非免疫的人供体分离V基因来构建，使用对应于所有己知的VH、Vκ和V80基因家族的PCR引物。参见，例如，Vaughn等，Nat.Biotechnol.，14:309-314(1996)。扩增之后，Vκ和Vλ库(pool)被组合形成一个库。使这些片段连接到噬菌粒载体。然后将scFv接头连接到VL片段的噬菌粒上游。VH和接头-VL片段被扩增并组装在JH区。将所得到的VH-接头-VL片段连接到噬菌粒载体。可淘选噬菌粒文库用于与选择的抗原的结合。
[0100] 其它抗体片段例如单结构域抗体片段在本领域是已知的并且可用于要求保护的构建体。单结构域抗体(VHH)可以例如利用标准免疫技术(参见，例如，Muyldermans等，TIBS 26:230-235,2001；Yau等，J Immunol Methods 281:161-75,2003；Maass等，J Immunol Methods324:13-25,2007)从骆驼、羊驼或美洲驼(llamas)获得。所述VHH可具有强力抗原结合能力并且可与常规VH-VL对不可用的新型表位相互作用(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG包含约50%的骆驼重链唯一IgG抗体(Cab)(Maass等，2007)。羊驼可用已知的抗原免疫，可分离结合并且中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已鉴定扩增实际上所有羊驼VHH编码序列的PCR引物并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，通过本领域公知的标准淘选技术可将所述文库用于抗体片段分离(Maass等，2007)。这类和其它已知的抗原结合抗体片段可用于要求保护的方法和组合物。
[0101] 用于抗体克隆和产生的一般技术
[0102] 例如产生嵌合或人源化抗体的各种技术可以包括抗体克隆和构建的程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得，例如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠MAb的细胞的MAb的V基因可以通过PCR扩增来克隆并被测序。为了证实其可靠性，克隆的VL和VH基因可以作为嵌合Ab在细胞培养物中表达，如Orlandi等，(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86:3833(1989))所描述。基于V基因序列，人源化MAb则可如Leung等(Mol.Immunol.，32:1413(1995))所描述来设计并构建。
[0103] cDNA可通过一般分子克隆技术从任何己知产生鼠MAb的杂交瘤细胞系或转染的细 胞系 制备(Sambrook等，Molecular Cloning，Alaboratory manual，第2 版(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VKIBACK和VKIFOR(Orlandi等，1989)或者Leung等(BioTechniques，15:286(1993))所述的延伸引物组来扩增。VH序列可使用引物对VHIBACK/VHIFOR(Orlandi等，1989)或Leung等(Hybridoma，13:469(1994))所述的与鼠IgG恒定区退火的引物来扩增。人源化V基因可通过将长寡核苷酸模板合成与PCR扩增组合来构建，如由Leung等(Mol.Immunol，32:1413(1995))所描述的。
[0104] 可以将Vκ的PCR产物亚克隆到分期载体中，例如基于pBR327的分期载体VKpBR，其含有Ig启动子、信号肽序列和适宜的限制酶切位点。可以将VH的PCR产物亚克隆到类似的分期载体中，例如基于pBluescript的VHpBS。可将含有Vκ和VH序列的表达盒与启动子和信号肽序列一起从VKpBR和VHpBS切除并且分别连接到适当的表达载体中，例如pKh和pG1g(Leung等，Hybridoma，13:469(1994))。可将表达载体共转染到适当的细胞中，并监测上清液中嵌合、人源化或人MAb的产生。或者，可切除Vκ和VH表达盒并且亚克隆到单一表达载体中，例如pdHL2，如Gillies等(J.Immunol.Methods125:191(1989)所述并且还显示于Losman等，Cancer,80:2660(1997))中。
[0105] 在替代实施方案中，可将表达载体转染到已经在无血清培养基中预适应转染、生长和表达的宿主细胞中。可以使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如，美国专利No.7,531,327、7,537,930和7,608,425，将所述每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤细胞系，用突变的Bcl-EEE基因转染，暴露于氨甲喋呤以扩增转染的基因序列并预适应无血清细胞系以进行蛋白质表达。
[0106] 双特异性和多特异性抗体
[0107] 某些实施方案涉及利用双特异性抗体和具有半抗原的可靶向构建体的预靶向方法。产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是己知的，如公开于例如美国专利No.7,405,320中，其实施例部分通过引用并入本文。双特异性抗体可以通过细胞杂交瘤方法产生，该方法包括两个不同杂交瘤的融合，每个杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature，1983；305:537-540)。
[0108] 产生双特异性抗体的另一方法使用异型双功能交联剂来化学栓系两个不同的单克隆抗体(Staerz等，Nature.1985；314:628-631；Perez等，Nature.1985；316:354-356)。双特异性抗体的产生还可通过将两个亲本单克隆抗体的每一个还原为其各自的半分子，然后将所述半分子混合并使得再氧化以获得杂合结构(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA．1986；83:1453-1457)。其它方法包括提高产生杂交杂交瘤的效率，通过将不同选择性标记经由逆转录病毒源穿梭载体基因转移到各自的亲本杂交瘤中，其随后融合(DeMonte等，Proc Natl Acad Sci U S A．1990，87:2941-2945)；或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。
[0109] 同源VH和VL结构域可以与具有适当组成和长度(通常由超过12个氨基酸残基组成)的肽接头连接以形成单链Fv(scFv)，如上文中所论述。肽接头长度减少至小于12个氨基酸残基，防止同一链上VH和VL结构域的配对并促进VH和VL结构域与其它链上的互补结构域配对，导致功能性多聚体的形成。与3至12个氨基酸残基的接头连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双链抗体)。使用0至2个氨基酸残基的接头，有利于形成三聚体(称为三链抗体)和四聚体(称为四链抗体)，但是寡聚化的确切模式除了取决于接头长度，似乎还取决于V-结构域的组成和方向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
[0110] 用于产生多特异性或双恃异性抗体的这些技术表现出在技术的低收率、纯化的必要性、低稳定性或劳动密集等方面的各种困难。最近，已经利用称为“停靠和锁定”(DNL)的技术(在下文更详细描述)来产生实际上任何所需抗体、抗体片段和其它效应分子的组合(参见例如，美国专利申请公布No.20060228357、20060228300、20070086942、20070140966和20070264265，将每个专利申请公布的实施例部分通过引用并入本文)。DNL技术使得单特异性、双特异性或多特异性抗体的组装，作为裸抗体部分或与多种其它效应分子组合，所述效应分子为例如免疫调节剂、酶、化学治疗剂、趋化因子、细胞因子、诊断剂、治疗剂、放射性核素、成像剂、抗血管生成剂、生长因子、寡核苷酸、激素、肽、毒素、促凋亡剂或其组合。本领域己知用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实施本文要求保护的方法。
[0111] 停靠和锁定(DNL)
[0112] 在优选实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其它构建体可以使用停靠和锁定技术产生(参见例如，美国专利No.7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400，将每个专利的实施例部分在通过引用并入本文)。DNL方法利用cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等，FEBS Letters.2005；579:3264。Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。在1968年首次从兔骨骼肌中分离PKA，所述PKA在研究最充分的通过第二信使cAMP与R亚基结合而触发的信号转导途径之一中起核心作用(Walsh等，J．Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶结构由两个催化亚基组成，通过R亚基保持为非活性形式(Taylor，J．Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，且每种类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50:123)。已将R亚基仅作为稳定二聚体分离，并且已经显示二聚化结构域由前
44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。cAMP与R亚基的结合导致广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述亚基经由其与AKAP停靠通过PKA区室化而定向于选定的底物(Scott等，J．Biol.Chem.1990;265:21561)。
44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。cAMP与R亚基的结合导致广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述亚基经由其与AKAP停靠通过PKA区室化而定向于选定的底物(Scott等，J．Biol.Chem.1990;265:21561)。
[0113] 自从1984年表征了首个AKAP(微管相关蛋白-2)以后(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81:6723)，已经在范围从酵母到人的物种中鉴定了具有多样结构的超过50种AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。AKAP针对PKA的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J．Biol.Chem.1991；266:14188)。个体AKAP中AD的氨基酸序列有很大不同，其中对RII二聚体报道的结合亲和力范围为2至90nM(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。AKAP将仅结合二聚体R亚基。对于人RIIα，AD结合到由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999;6:216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位于相同N-末端44氨基酸序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6:222；Newlon等，EMBO J．2001；20:1651)，其在本文称为DDD。
[0114] 我们已经开发了利用人RIIα的DDD和AKAP的AD作为优良的接头模块对用于将在下文称为A和B的两个实体停靠成非共价复合物的平台技术，所述非共价复合物可以通过将半胱氨酸残基在策略位置引入DDD和AD以促进二硫键形成而被进一步锁定成稳定连接的结构。“停靠和锁定”方法的一般方法如下。实体A通过将DDD序列与A前体连接来构建，产生在下文称为a的第一组分。因为DDD序列将影响二聚体的自发形成，因此A由a2构成。实体B通过将AD序列与B的前体连接来构建，产生在下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚体基序将产生用于结合b中含有的AD序列的停靠位点，从而促进a2和b的易于缔合以形成由a2b构成的二组分三聚体复合物。该结合事件通过随后反应以经由二硫桥共价束缚两个实体而成为不可逆的，这基于有效局部浓度的原理而非常有效地发生，因为最初的结合相互作用将使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chimura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98:8480)以位点特异性地连接。使用接头、适配模块(adaptor module)和前体的各种组合，可以产生并使用不同化学计量的多种DNL构建体，包括但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体DNL构建体(参见例如，美国专利No.7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400)。
[0115] 通过连接远离两个前体的官能团的DDD和AD，这种位点特异性连接也预期保留两个前体的原始活性。该方法在性质上是模块化的，并且可潜在地应用于位点特异性且共价地连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有广泛活性的其它效应物部分。利用下文实施例中描述的构建AD和DDD缀合的效应物的融合蛋白方法，可以将实际上任何蛋白或肽并入DNL构建体。然而，该技术不是限制性的并且可以利用其它缀合方法。
[0116] 己知许多方法用于制备融合蛋白，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可以通过标准分子生物学技术插入用于产生融合蛋白的表达载体(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可以连接至效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，本领域技术人员将了解，AD或DDD部分与效应物部分的连接位点可以改变，取决于效应物部分的化学性质以及效应物部分中参与其生理活性的部分。多种效应物部分的位点特异性连接可以使用本领域己知的技术来进行，例如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
[0117] 预靶向
[0118] 双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术。预靶向是多步骤过程，最初被发展来解决直接靶向抗体的缓慢血液清除，这种缓慢血液清除促成对正常组织(例如骨髓)的不期望的毒性。使用预靶向，放射性核素或其它诊断剂或治疗剂与在数分钟内从血液中清除的小的递送分子(可靶向构建体)连接。首先施用具有可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使得游离抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。
[0119] 预靶向方法公开于例如Goodwin等，美国专利No.4,863,713；Goodwin等，J.Nucl.Med.29:226,1988；Hnatowich 等，J.Nucl.Med.28:1294,1987；Oehr 等，J.Nucl.Med.29:728,1988；Klibanovs 等，J.Nucl.Med.29:1951,1988；Sinitsyn 等，J.Nucl.Med.30:66,1989；Kalofonos 等，J.Nucl.Med.31:1791,1990；Schechter 等，Int.J.Cancer48:167,1991；Paganelli 等，Cancer Res.51:5960,1991；Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,1991；美 国 专 利 No.5,256,395；Stickney 等，Cancer Res.51:6650,1991；Yuan 等，Cancer Res.51:3119,1991；美 国 专 利 No.6,077,499、7,011,812、7,300,644、7,074,405、6,962,702、7,387,772、7,052,872、7,138,103、
6,090,381、6,472,511、6,962,702和6,962,702，将所述每个专利和文献通过引用并入本文。
6,090,381、6,472,511、6,962,702和6,962,702，将所述每个专利和文献通过引用并入本文。
[0120] 治疗或诊断受试者中疾病或病症的预靶向方法可以通过以下步骤提供：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并使得组合物从循环中清除抗体；和(3)向受试者施用可靶向构建体，所述可靶向构建体含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。
[0121] 免疫缀合物
[0122] 可将本文中描述的任何抗体、抗体片段或抗体融合蛋白缀合至螯合部分或其它载体分子以形成免疫缀合物。用于螯合部分与其它官能团的共价缀合的方法在本领域是已知的并且可使用任何此类已知的方法。
[0123] 例如，可经由二硫键形成在还原的抗体组分的铰链区连接螯合部分或载体。或者，可使用异型双功能交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)连接此类试剂。Yu等，Int.J.Cancer56:244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等，"Modification of Antibodies by Chemical Methods,"于MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)中；Price，"Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," 于 MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等 ( 编 )，第 60-84 页 (Cambridge University Press1995)中。
[0124] 或者，可经由抗体的Fc区域中的碳水化合物部分缀合螯合部分或载体。用于经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Shih等，Int.J.Cancer41:832(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 46:1101(1990)；和Shih等，美国专利No.5,057,313，将所述专利的实施例部分通过引用并入本文。一般方法包括将具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺功能的载体聚合物反应。该反应产生初始希夫碱(亚胺)键合，可通过还原成仲胺而稳定所述连接以形成终缀合物。
[0125] 如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体为抗体片段，则Fc区域可以不存在。然而，可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如Leung等，J.Immunol.154:5919(1995)；美国专利No.5,443,953和6,254,868，将所述专利的实施例部分通过引用并入本文。使用工程化的碳水化合物部分将官能团连接至抗体片段。
[0126] 将螯合剂缀合至蛋白质的其它方法在本领域是公知的(参见，例如，美国专利申请No.7,563,433，将其实施例部分通过引用并入本文)。可将螯合剂直接连接至抗体或肽，例如通过引用整体并入本文的美国专利4,824,659中所公开。
[0127] 点击化学
[0128] 用于将螯合部分、肽或其它官能团连接至靶向分子的替代方法包括使用点击化学反应。点击化学法最初被设想为通过以模块方式将小亚基连接在一起来快速产生复杂物质的方法。(参见，例如，Kolb等，2004,Angew Chem Int Ed 40:3004-31；Evans，2007.Aust J Chem60:384-95)。点击化学反应的各种形式在本领域是已知的，例如Huisgen 1,3-偶极环加成铜催化的反应(Tornoe等，2002,J Organic Chem 67:3057-64)，其通常被称为"点击反应"。其它替代包括环加成反应例如Diels-Alder，亲核取代反应(特别是对于小的具有张力的环如环氧和氮丙啶化合物)，脲化合物的羰基化学形成以及涉及碳-碳双键(例如巯基-炔反应中的炔类)的反应。
[0129] 叠氮化物炔烃Huisgen环加成反应在还原剂存在的情况下使用铜催化剂催化末端炔基团连接至第一分子的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子存在的情况下，叠氮化物与激活的炔反应以形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。铜催化的反应在室温下发生并且具有足够的特异性以致通常无需纯化反应产物。(Rostovstev等，2002,Angew Chem Int Ed41:2596；Tornoe等，2002,J Org Chem 67:3057)。叠氮化物和炔官能团对于含水介质中的生物分子主要是惰性的，从而使得反应在复杂溶液中发生。形成的三唑在化学上是稳定的并且不经历酶促裂解，使得点击化学产物在生物系统中高度稳定。虽然铜催化剂对活细胞是有毒性的，但基于铜的点击化学反应可在体外用于免疫缀合物形成。
[0130] 已提出用于生物分子的共价修饰的无铜点击反应。(参见，例如，Agard等，2004,J Am Chem Soc 126:15046-47.)。无铜反应使用环张力替代铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔环加成反应(同上)。例如，环辛炔为包括内部炔键的8-碳环结构。闭合环结构诱导乙炔的显著键角变形，这与叠氮基高度反应从而形成三唑。因此，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。
[0131] 无铜点击反应的另一种类型由Ning等(2010，Angew Chem Int Ed49:3065-68)报道，包括张力促使的炔-硝酮环加成。为了解决起始环辛炔加成反应的缓慢速率，将吸电子基团与三键邻接(同上)。此类取代环辛炔的实例包括二氟化环辛炔，4-二苯并环辛醇和氮杂环辛炔(同上)。替代性无铜反应包括张力促使的炔-硝酮环加成以产生N-烷基化异噁唑啉(同上)。所述反应据报道具有特别快的反应动力学并且用于肽和蛋白质的位点特异性修饰的一锅三步方案(one-pot three-step protocol)(同上)。通过将适当的醛与N-甲基羟胺的缩合来制备硝酮，且环加成反应在乙腈与水的混合物中发生(同上)。这些和其它已知的点击化学反应可用于在体外将螯合部分连接至抗体或其它靶向分子。
[0132] 施用方法
[0133] 在各种实施方案中，双特异性抗体和可靶向构建体可用于对正常或患病组织和器官进行成像(参见，例如，美国专利No.6,126,916、6,077,499、6,010,680、5,776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、
5,128,119、5,101,827和4,735,210，将每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。
5,128,119、5,101,827和4,735,210，将每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。
[0134] 双特异性抗体(bsAb)和18F-标记的可靶向构建体的施用可以通过在施用可靶向构建体之前某个时间施用bsAb抗体来进行。试剂剂量和施用时间可以由技术人员容易地确定，并且取决于使用的试剂的具体性质。如果首先给予bsAb-F(ab’)2衍生物，则在施用可靶向构建体之前等待24-72小时(或者48-96小时)是适当的。如果IgG-Fab’bsAb缀合物是初级靶向载体，则需要在施用可靶向构建体之前等待更长时间，范围在3-10天。bsAb18
靶向患病组织经过足够时间后，施用 F-标记的可靶向构建体。在施用可靶向构建体之后，可以进行成像。
靶向患病组织经过足够时间后，施用 F-标记的可靶向构建体。在施用可靶向构建体之后，可以进行成像。
[0135] 某些实施方案涉及使用具有至少三个不同的靶结合位点的多价靶结合蛋白，如专利申请序列No.60/220,782中所描述的。通过经由化学接头交联几种Fab样片段制备了多价靶结合蛋白。参见美国专利No.5,262,524、5,091,542和Landsdorp等Euro.J．Immunol.16:679-83(1986)。还通过共价连接几个单链Fv分子(scFv)以形成单个多肽制备了多价靶结合蛋白。参见美国专利No.5,892,020。基本上是scFv分子聚集体的多价靶结合蛋白已经公开于美国专利No.6,025,165和5,837,242。包括三个scFv分子的三价靶结合蛋白已经描述于Krott等Protein Engineering 10(4):423-433(1997)。
[0136] 或者，已经证明在下文更详细描述的称为“停靠和锁定(dock-and-lock)”(DNL)的技术用于简单且可重现构建多种多价复合物，包括包含两个或更多个不同抗体或抗体片段的复合物。(参见例如，美国专利No.7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400，每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。此类构建体还用于实施本文描述的要求保护的方法和组合物。
[0137] 可以使用清除剂，其在双特异性抗体(bsAb)和可靶向构建体剂量之间给予。可以使用具有新机制作用的清除剂，即，针对bsAb的疾病靶向臂靶向的糖基化抗独特型Fab’片段。在一个实例中，给予抗CEA(MN-14Ab)x抗肽bsAb并使得其在疾病靶中累积至其最大程度。为了从循环中清除残留的bsAb，给予MN-14的抗独特型Ab(称为WI2)，优选作为糖基化Fab’片段。清除剂以单价方式结合至bsAb，而其附加的糖基残基引导完整复合物至肝，18
其中发生快速代谢。然后，将 F-标记的可靶向构建体给予受试者。针对bsAb的MN-14臂的WI2具有高亲和力，并且清除机制不同于其它己公开的机制(参见Goodwin等，同上)，因为其涉及交联，因为WI2-Fab’是单价部分。然而，替代的方法和清除剂组合物是己知的并且可以使用任何此类己知的清除剂。
其中发生快速代谢。然后，将 F-标记的可靶向构建体给予受试者。针对bsAb的MN-14臂的WI2具有高亲和力，并且清除机制不同于其它己公开的机制(参见Goodwin等，同上)，因为其涉及交联，因为WI2-Fab’是单价部分。然而，替代的方法和清除剂组合物是己知的并且可以使用任何此类己知的清除剂。
[0138] 配制和施用
[0139] 可以配制18F-标记分子以获得包括一种或多种药学上可接受的赋形剂、一种或多种其它成分或这些的某种组合的组合物。这些可通过制备药学上有用剂量的己知方18
法来完成，藉此活性成分(即，F-标记分子)与一种或多种药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合的赋形剂是本领域技术人员己知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company1990)及其修订版。
法来完成，藉此活性成分(即，F-标记分子)与一种或多种药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合的赋形剂是本领域技术人员己知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company1990)及其修订版。
[0140] 本文描述的组合物的优选施用途径是胃肠外注射。注射可以是静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内或腔内(即，胃肠外)。在胃肠外施用中，组合物以可注射的单位剂量形式配制，例如溶液、悬浮液或乳液，与药学上可接受的赋形剂组合。此类赋形剂本身是无毒且无治疗性的。此类赋形剂的实例为盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克斯溶液。也可以使用非水性赋形剂，例如不挥发油和油酸乙酯。优选的赋形剂是5%右旋糖的盐水溶液。赋形剂可以含有少量添加剂，例如提高等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲液和防腐剂。还包括其它施用方法，包括口服施用。
[0141] 包含18F-标记分子的配制的组合物可用于通过例如快速推注注射或连续输注来静脉内施用。用于注射的组合物与添加的防腐剂以单位剂量形式在例如安瓿瓶或多剂量容器中存在。组合物还可采取例如在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，组合物可以是粉末形式，在使用前用适合介质(例如无菌无热原的水)复原。
[0142] 组合物可在溶液中施用。溶液pH范围应该是pH 5至9.5、优选pH 6.5至7.5。其制剂应该是具有适合的药学上可接受缓冲液的溶液，所述缓冲液例如磷酸盐、TRIS(羟基甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐等。缓冲液浓度范围应该是1至100mM。配制的溶液还可以含有浓度为50至150mM的盐，例如氯化钠或氯化钾。还可以包括有效量的稳定剂，例如甘油、白蛋白、球蛋白、去污剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。组合物可以皮下、静脉内、肌内或通过其它胃肠外途径施用给哺乳动物。而且，施用可以通过连续输注或通过单次或多次快速推注。
[0143] 当施用双特异性抗体时，例如在预靶向技术中，施用给人的抗体的剂量将根据例如患者年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和既往医疗史等因素而变化。通常，对于成像目的，期望以单次静脉内输注形式给接受者提供约1mg至200mg范围内的双特异性抗体剂量，但也可以根据情况要求施用更低或更高的剂量。通常，对于典型成人，期望给接受者提供范围从约10mg/平方米体表面积或17至18mg/平方米体表面积的抗体的剂量，但也可以根据情况要求施用更低或更高的剂量。为成像目的而可以施用给人受试者的双特异性抗体的剂量实例是1至200mg、更优选1至70mg、最优选1至20mg，但是也可以使用更高或更低的剂量。
[0144] 一般而言，待施用的18F标记的剂量将根据例如患者年龄、体重、身高、性别、一般18
医疗状况和既往医疗史等因素而变化。优选地，给患者施用 F-标记分子的饱和剂量。对
18 18
于 F-标记分子的施用，可以通过毫居里测量剂量。 F成像研究的典型范围在5至10mCi。
医疗状况和既往医疗史等因素而变化。优选地，给患者施用 F-标记分子的饱和剂量。对
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于 F-标记分子的施用，可以通过毫居里测量剂量。 F成像研究的典型范围在5至10mCi。
[0145] 肽的施用
[0146] 要求保护的方法和/或组合物的各种实施方案可能涉及待施用给受试者的一种18
或多种 F-标记的肽。施用可以通过本领域己知的任何途径而发生，包括但不限于口服、鼻内、口腔、吸入、直肠、阴道、局部、原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注
18
射。例如，当 F-标记的肽在预靶向方案中施用时，所述肽优选静脉内施用。
或多种 F-标记的肽。施用可以通过本领域己知的任何途径而发生，包括但不限于口服、鼻内、口腔、吸入、直肠、阴道、局部、原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注
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射。例如，当 F-标记的肽在预靶向方案中施用时，所述肽优选静脉内施用。
[0147] 口服施用给受试者的未修饰肽可以在消化道内降解并根据序列和结构可以表现出差的跨肠壁吸收。然而，用于化学修饰肽以使它们对内源蛋白酶降解的敏感性较低或更易通过消化道吸收的方法是公知的(参见例如，Blondelle等，1995,Biophys.J.69:604-11；Ecker 和 Crooke，1995,Biotechnology 13:351-69；Goodman 和 Ro，1995,BURGER ′ S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY，第1 卷 ,Wollf，John Wiley&Sons编；Goodman和Shao，1996,Pure&Appl.Chem.68:1303-08)。用于制备肽类似物
18
文库的方法也已经被描述并可以用于构建适合口服施用给受试者的基于肽的 F-标记分子，所述肽类似物例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽(例如乙烯化的类肽)。
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文库的方法也已经被描述并可以用于构建适合口服施用给受试者的基于肽的 F-标记分子，所述肽类似物例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽(例如乙烯化的类肽)。
[0148] 在某些实施方案中，标准肽键键合可以被一个或多个替代的连接基团所取代，所述替代的连接基团例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH=CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。用于制备肽模拟物的方法是公知的(例如，Hruby，1982,Life Sci 31:189-99；Holladay等，1983,Tetrahedron Lett.24:4401-04；Jennings-White 等，1982,Tetrahedron Lett.23:2533；Almquiest 等，1980,J.Med.Chem.23:1392-98；Hudson 等，1979,Int.J.Pept.Res.14:177-185；Spatola 等，1986,Life Sci38:1243-49； 美 国 专 利No.5,169,862、5,539,085、5,576,423、5,051,448、5,559,103)。肽模拟物可以表现出与其肽类似物相比增强的稳定性和/或体内吸收。
[0149] 或者，肽可以通过口服递送来施用，使用N-末端和/或C-末端加帽以防止肽链端解酶活性。例如，C-末端可以使用酰胺肽加帽并且N-末端可以通过肽的乙酰化而加帽。还可以将肽环化以阻断肽链端解酶，例如通过形成环酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。
[0150] 肽稳定化还可以通过用D-氨基酸取代天然存在的L-氨基酸而发生，特别是在其中己知肽链端解酶起作用的位置。肽链端解酶结合并且裂解的序列是本领域己知的，已经描述了制备和使用并入了D-氨基酸的肽的方法(例如，美国专利申请公布No.20050025709，McBride等，2004年6月14日提交，其实施例部分通过引用并入本文)。在某些实施方案中，肽和/或蛋白可以通过与蛋白酶和/或肽酶抑制剂共配制来口服施用。
[0151] 用于口服递送治疗性肽的其它方法 公开于Mehta(“Oral deliveryand recombinant production of peptide hormones,“2004 年 6 月，BioPharm International)。肽与调节肠蛋白水解活性并增强肽跨肠壁转运的赋形剂一起以肠溶包衣的固体剂型施用。使用该技术的完整肽的相对生物利用率的范围是施用剂量的1%至10%。
胰岛素已经使用具有胆酸钠和蛋白酶抑制剂的肠溶包衣的微囊在狗中成功施用(Ziv等，
1994，J．Bone Miner.Res.18(增刊2):792-94。使用酰基肉毒碱作为渗透增强剂和肠溶包衣进行了肽的口服施用(Eudragit L30D-55，RohmPharma Polymers，参见Mehta，2004)。用于口服施用肽的赋形剂一般可以包括肠蛋白酶/肽酶的一种或多种抑制剂以及去污剂或提高肽的溶解度或吸收的其它试剂，其可以包装在肠溶包衣的胶囊或片剂中(Mehta，2004)。
有机酸可以包括在胶囊中以酸化肠并在胶囊溶在肠中溶解时抑制肠蛋白酶活性(Mehta，
2004)。口服递送肽的另一替代方法包括与基于聚乙二醇(PEG)的两亲寡聚物缀合，增加吸收和对酶降解的抗性(Soltero和Ekwuribe，2001，Pharm.Technol.6:110)。
胰岛素已经使用具有胆酸钠和蛋白酶抑制剂的肠溶包衣的微囊在狗中成功施用(Ziv等，
1994，J．Bone Miner.Res.18(增刊2):792-94。使用酰基肉毒碱作为渗透增强剂和肠溶包衣进行了肽的口服施用(Eudragit L30D-55，RohmPharma Polymers，参见Mehta，2004)。用于口服施用肽的赋形剂一般可以包括肠蛋白酶/肽酶的一种或多种抑制剂以及去污剂或提高肽的溶解度或吸收的其它试剂，其可以包装在肠溶包衣的胶囊或片剂中(Mehta，2004)。
有机酸可以包括在胶囊中以酸化肠并在胶囊溶在肠中溶解时抑制肠蛋白酶活性(Mehta，
2004)。口服递送肽的另一替代方法包括与基于聚乙二醇(PEG)的两亲寡聚物缀合，增加吸收和对酶降解的抗性(Soltero和Ekwuribe，2001，Pharm.Technol.6:110)。
[0152] 使用标记分子成像
[0153] 使用标记分子成像的方法是本领域公知的，并且任何此类己知方法可与本文公开18
的 F-标记分子一起使用。参见例如，美国专利No.6,241,964、6,358,489、6,953,567和公开的美国专利申请公布No.20050003403、20040018557、20060140936，每个专利和专利申请公布的实施例部分通过引用并入本文。还参见Page等，NuclearMedicine And Biology，
21:911-919，1994；Choi等，Cancer Research55:5323-5329，1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.,33:575-582,1992；Woessner等Magn.Reson.Med.2005,53:790-99。
的 F-标记分子一起使用。参见例如，美国专利No.6,241,964、6,358,489、6,953,567和公开的美国专利申请公布No.20050003403、20040018557、20060140936，每个专利和专利申请公布的实施例部分通过引用并入本文。还参见Page等，NuclearMedicine And Biology，
21:911-919，1994；Choi等，Cancer Research55:5323-5329，1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.,33:575-582,1992；Woessner等Magn.Reson.Med.2005,53:790-99。
[0154] 在某些实施方案中，18F-标记分子可以用于成像正常或患病的组织或器官，例如使用以下中描述的方法：美国专利No.6,126,916、6,077,499、6,010,680、5,776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、
5,128,119、5,101,827和4,735,210，每个专利均通过引用并入本文。此类成像可以通过
18
适当靶向分子的直接 F标记或者通过以下所述预靶向成像方法来进行：Goldenberg等(2007，Update Cancer Ther.2:19-31)；Sharkey 等 (2008，Radiology 246:497-507)；
Goldenberg 等 (2008,J.Nucl.Med.49:158-63)；Sharkey 等 (2007，Clin.Cancer Res.13:5777s-5585s)；McBride 等 (2006,J.Nucl.Med.47:1678-88)；Goldenberg 等(2006，J.Clin.Oncol.24:823-85)，还参见美国专利公布No.20050002945、20040018557、
20030148409和20050014207，每个专利均通过引用并入本文。
5,128,119、5,101,827和4,735,210，每个专利均通过引用并入本文。此类成像可以通过
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适当靶向分子的直接 F标记或者通过以下所述预靶向成像方法来进行：Goldenberg等(2007，Update Cancer Ther.2:19-31)；Sharkey 等 (2008，Radiology 246:497-507)；
Goldenberg 等 (2008,J.Nucl.Med.49:158-63)；Sharkey 等 (2007，Clin.Cancer Res.13:5777s-5585s)；McBride 等 (2006,J.Nucl.Med.47:1678-88)；Goldenberg 等(2006，J.Clin.Oncol.24:823-85)，还参见美国专利公布No.20050002945、20040018557、
20030148409和20050014207，每个专利均通过引用并入本文。
[0155] 使用标记的肽或MAb诊断性成像的方法是公知的。例如，在免疫闪烁成像技术中，配体或抗体用γ-发射放射性同位素标记并引入患者。使用γ相机来检测γ-发射放射性同位素的定位和分布。参见例如Srivastava(编)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING ANDTHERAPY(Plenum Press 1988),Chase，“Medical Applications of Radioisotopes”于REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Gennaro等(编)，第624-652页(Mack Publishing Co.，1990)，和Brown，“Clinical Use of Monoclonal Antibodies,”于BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49,Pezzuto等(编)(Chapman&Hall1993)中。还优选使用正电子发射放射性核素(PET同位素)，例如具有511keV能量，例如
18 68 64 124
F、Ga、Cu和 I。此类放射性核素可以通过公知的PET扫描技术来成像。
18 68 64 124
F、Ga、Cu和 I。此类放射性核素可以通过公知的PET扫描技术来成像。
[0156] 在优选实施方案中，18F-标记的肽、蛋白质和/或抗体用于癌症成像。癌症实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。此类癌症的更特定实例在下文提出并包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移至不同于原始恶性肿瘤或肿瘤部位的受试者体内部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，源于转移瘤的那些，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于原始肿瘤部位的继发部位)。
[0157] 癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：儿童急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓细胞样白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓细胞样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性淋巴瘤、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、胰腺内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞肿瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇及口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性疾患、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮细胞瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血痫、髓细胞性白血病、骨髓增生性疾患、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、怀孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节肉瘤、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行性肾盂和输尿管癌、滋养层细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、特发性巨球蛋白血症、威尔姆斯肿瘤以及除了肿瘤以外的位于上列器官系统中的任何其它异常增生疾病。
[0158] 本文描述和要求保护的方法和组合物可以用于检测或诊断恶性或恶变前病症。此类用途指示在进展至瘤形成或癌症之前己知或疑似的病症，特别是其中已经发生由增生、化生或更特别地发育异常组成的非肿瘤细胞生长(关于此类异常生长病症的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版，W.B Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
[0159] 发育异常经常是癌症的先兆，并且主要在上皮中发现。这是非肿瘤细胞生长的最混乱形式，涉及个体细胞均一性和细胞建筑方向中的缺失。发育异常在存在慢性刺激或炎症时特征性地发生。可以被检测的发育异常疾患包括但不限于：无汗性外胚层发育异常、异侧发育异常(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育异常、心房手指发育异常、支气管肺发育异常、大脑发育异常、宫颈发育异常、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚叶发育异常、颅骨骨干发育异常、颅腕跖骨发育异常、颅骨干骺端发育异常、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、牙釉质发育异常、脑性眼球发育异常、偏侧骨骺发育异常、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育异常、上皮发育异常、面-指-生殖器发育异常、家族性颌骨纤维异常增殖症、家族性白色折叠发育异常、纤维肌性发育异常、纤维性骨发育异常、旺盛骨性发育不良、遗传性肾-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚叶发育异常、淋巴细胞减少胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌面发育异常、干骨后端发育异常、Mondini发育异常、单骨性纤维发育异常、粘膜上皮发育异常、多骨骺发育异常、眼-耳-脊椎发育异常、眼-牙-指发育异常、眼-脊椎发育异常、生牙性发育异常、眼-下颚发育异常(opthalmomandibulomelic dysplasia)、根尖牙骨质发育异常、多骨纤维发育异常、假性软骨脊椎骨骺发育异常、视网膜发育异常、视隔发育异常、脊椎骨骺发育异常和室桡骨发育异常(ventriculoradial dysplasia)。
[0160] 可以被检测的其它肿瘤前病患包括但不限于：良性异常增生疾患(例如，良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食管发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、慢性光化性皮炎(Farmer′s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
[0161] 其它异常增生疾病、疾患和/或病症包括但不限于恶性肿瘤的进展和/或转移以及相关疾患，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链疾病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤(Wilm′s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
[0162] 在优选实施方案中，可使用要求保护的组合物和方法治疗的疾病包括心血管疾病例如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。针对纤维蛋白的抗体(例如，scFv(59D8)、T2G1s、MH1)是已知的并且在临床试验中作为用于显示所述凝块和肺栓子的成像剂，然而抗-粒细胞抗体例如MN-3、MN-15、抗-NCA95和抗-CD 15抗体可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见，例如，美国专利No.5,487,892、5,632,968、6,294,173、7,541,440，将所述每个专利的实施例部分通过引用并入本文)。可将抗-巨噬细胞、抗-低密度脂蛋白(LDL)和抗-CD74(例如，hLL1)抗体可用于靶向粥样硬化斑块。阿昔单抗(抗-糖蛋白IIb/IIIa)已被批准为用于预防经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention)和不稳定心绞痛治疗中的再狭窄(Waldmann等，2000，Hematol
1:394-408)。已报道抗-CD3抗体减少动脉粥样硬化的发展和进展(Steffens等，2006，Circulation114:1977-84)。已报道利用封闭MIF抗体的治疗诱导已建立的动脉粥样硬化性损伤的消退(Sanchez-Madrid和Sessa，2010,Cardiovasc Res86:171-73)。抗氧化的LDL的抗体也在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的消退(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol 52:2319-21)。已显示抗-ICAM-1抗体在大鼠的脑动脉闭塞后减少局部缺血损伤(Zhang等，1994,Neurology 44:1747-51)。商购可得的针对白细胞抗原的单克隆抗体由如下抗体代表：结合正常T-淋巴细胞的OKT抗-T-细胞单克隆抗体(可从Ortho Pharmaceutical Company获得)；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP 15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；和FMCll(Sera Labs)。抗纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述包括在Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
1:394-408)。已报道抗-CD3抗体减少动脉粥样硬化的发展和进展(Steffens等，2006，Circulation114:1977-84)。已报道利用封闭MIF抗体的治疗诱导已建立的动脉粥样硬化性损伤的消退(Sanchez-Madrid和Sessa，2010,Cardiovasc Res86:171-73)。抗氧化的LDL的抗体也在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的消退(Ginsberg,2007,J Am Coll Cardiol 52:2319-21)。已显示抗-ICAM-1抗体在大鼠的脑动脉闭塞后减少局部缺血损伤(Zhang等，1994,Neurology 44:1747-51)。商购可得的针对白细胞抗原的单克隆抗体由如下抗体代表：结合正常T-淋巴细胞的OKT抗-T-细胞单克隆抗体(可从Ortho Pharmaceutical Company获得)；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP 15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；和FMCll(Sera Labs)。抗纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述包括在Knight,Semin.Nucl.Med.,20:52-67(1990)中。
[0163] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有代谢病的患者，例如淀粉样变性或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、亨廷顿病、橄榄体脑桥小脑萎缩、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、弥漫性路易体疾病、皮质基底节变性(corticodentatonigral degeneration)、进行性家族性肌阵挛性癫痫(progressive familial myoclonic epilepsy)、纹状体黑质变性、扭转性张力障碍、家族性震颤、日勒德拉图雷特综合征(Gilles de la Tourette syndrome)或Hallervorden-Spatz病。巴品珠单抗(Bapineuzumab)处于阿尔茨海默病治疗的临床试验中。被提出用于治疗阿尔茨海默病的其它抗体包括Alz 50(Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem263:7943-47)、罗氏单抗(gantenerumab)和索拉珠单抗(solanezumab)。英利昔单抗，一种抗-TNF-α抗体，据报道减少淀粉质斑块并且提高认知。由加拿大国际保藏机构(International Depositary Authority of Canada)保藏的杂交瘤细胞系(登录号ADI-290806-01、ADI-290806-02、ADI-290806-03)产生的抗突变体SOD1的抗体已被建议用于治疗ALS、帕金森病和阿尔茨海默尔(参见美国专利申请公布No.20090068194)。抗-CD3抗体已被建议用于治疗I型糖尿病(Cernea等，2010，Diabetes Metab Rev 26:602-05)。此外，本发明的药物组合物可用于治疗患有免疫调节障碍疾患例如移植物抗宿主病或器官移植排斥的受试者。
[0164] 可被检测、诊断和/或成像的上文所列出的示例性病症不是限制性的。本领域技术人员将意识到，已知用于多种病症例如自身免疫疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、代谢病、癌症、传染性疾病和异常增生疾病的抗体、抗体片段或靶向肽。可如本文中所述，对可18
利用本文中描述的方法制备和利用针对其的 F标记分子例如蛋白质或肽的任何这样的病症进行成像、诊断和/或检测。
利用本文中描述的方法制备和利用针对其的 F标记分子例如蛋白质或肽的任何这样的病症进行成像、诊断和/或检测。
[0165] 试剂盒
[0166] 各种实施方案可能涉及含有适合使用标记的化合物成像、诊断和/或检测患者中患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有抗体、片段或融合蛋白，例如在本文所述的预靶向方法中使用的双特异性抗体。其它组分可以包括与此类双特异性抗体一起使用的可靶向构建体。在优选实施方案中，可靶向构建体与螯合基团预先缀合，所述螯合剂可用于18 18
连接Al F复合物或 F与不同金属的复合物。然而，在替代实施方案中，预期可将可靶向构
68
建体连接至一种或多种不同的诊断剂，例如 Ga。
连接Al F复合物或 F与不同金属的复合物。然而，在替代实施方案中，预期可将可靶向构
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建体连接至一种或多种不同的诊断剂，例如 Ga。
[0167] 如果含有施用组分的组合物未被配制为经消化道递送，例如通过口服递送，则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。例如胃肠外递送应用的一种类型的装置是注射器，用于将组合物注射入受试者体内。吸入装置也可用于某些应用。
[0168] 试剂盒组分可以被包装在一起或者分开在两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可以是管形瓶，含有适合复原的组合物的无菌冻干制剂。试剂盒还可以含有适合复原和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。可以使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可以被无菌包装或保持在容器内。可以被包括的另一种组分是供使用试剂盒的人的使用说明书。实施例
[0169] 实施例1.肽IMP 272的18F标记
[0170] 第一个被制备并被18F-标记的肽是IMP 272：
[0171] DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:3)
[0172] 乙酸盐缓冲溶液-将1.509g乙酸稀释于～160mL水中，并通过添加1M NaOH来调节pH，然后稀释至250mL以制备pH 4.03的0.1M溶液。
[0173] 乙酸铝缓冲溶液-通过将0.1028g AlCl3六水合物溶解于42.6mLDI水中来制备铝溶液。4mL等份的铝溶液与pH4的16mL 0.1MNaOAc溶液混合以提供2mM Al储液。
[0174] IMP 272乙酸盐缓冲溶液-0.0011g肽、7.28x10-7mol IMP 272溶解于364μL0.1M pH 4乙酸盐缓冲溶液以获得2mM肽的储液。
[0175] IMP 272的F-18标记-将3μL等份的铝储液置于REACTI VIALTM中并与18
50μL F(按原样)和3μL IMP 272溶液混合。溶液在加热器中在110℃加热15分钟并通过
18
反相HPLC分析。HPLC图谱(未显示)显示93%游离 F和7%与肽结合。将额外10μLIMP
272溶液添加到反应中并再次加热并通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC图谱显示在空隙
18
容积时的8% F和92%与肽连接的活度。其余肽溶液在室温下与150μLPBS孵育～1hr，然
18
后通过反相HPLC检查。HPLC(未显示)显示58% F未结合，并且42%依然连接至肽。数据
18
显示，当与磷酸盐混合时，F-Al-DTPA复合物可能是不稳定的。
50μL F(按原样)和3μL IMP 272溶液混合。溶液在加热器中在110℃加热15分钟并通过
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反相HPLC分析。HPLC图谱(未显示)显示93%游离 F和7%与肽结合。将额外10μLIMP
272溶液添加到反应中并再次加热并通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC图谱显示在空隙
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容积时的8% F和92%与肽连接的活度。其余肽溶液在室温下与150μLPBS孵育～1hr，然
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后通过反相HPLC检查。HPLC(未显示)显示58% F未结合，并且42%依然连接至肽。数据
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显示，当与磷酸盐混合时，F-Al-DTPA复合物可能是不稳定的。
[0176] 实施例2.用其它金属进行IMP 27218F标记
[0177] 将～3μL等份的金属储液(6x10-9mol)置于聚丙烯锥形瓶中并与75μL 18F(按原-8样)混合，在室温下孵育～2分钟，然后与20μL2mM(4x10 mol)IMP 272溶液在0.1M NaOAc pH 4缓冲液中混合。溶液在加热器中在100℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。IMP272
18
用铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)标记(未显示)。这些结果证明，F金属标记技术不限于铝配体，而是还可以利用其它金属。对于不同的金属配体，可以利用不同的螯合部分来优化F-18-金属缀合物的结合。
18
用铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)标记(未显示)。这些结果证明，F金属标记技术不限于铝配体，而是还可以利用其它金属。对于不同的金属配体，可以利用不同的螯合部分来优化F-18-金属缀合物的结合。
[0178] 实施例3.血清稳定的18F-标记的肽IMP 449的产生和使用
[0179] IMP 449
[0180] NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:4)[0181] 在Sieber酰胺树酯上制备肽IMP 448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:5)，通过以所示顺序将下述氨基酸添加至树脂：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc 被裂解，Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc被裂解，Fmoc-D-Ala-OH，最后裂解Fmoc以制备期望的肽。然后肽从树脂被裂解并通过HPLC纯化以产生IMP 448，其然后被偶联至ITC-苄基NOTA。
[0182] 肽IMP 448(0.0757g，7.5x10-5mol)与0.0509g(9.09x10-5mol)ITC苄基NOTA混合并溶解于1mL水。然后将无水碳酸钾(0.2171g)缓慢添加至搅拌的肽/NOTA溶液。在添加所有碳酸盐之后，反应溶液为pH 10.6。使反应在室温搅拌过夜。14小时后，反应用1M HCl小心猝灭，并通过HPLC纯化以获得48mg IMP 449。
[0183] IMP 449的18F标记
[0184] 将IMP 449(0.002g，1.37x10-6mol) 溶 解 于 686μL(2mM肽 溶 液 )0.1MNaOAc18
pH4.02。在pH 4乙酸盐缓冲液中的3毫升2mM Al溶液与15μL，1.3mCi F混合。然后溶液与20μL2mM IMP 449溶液混合，并在105℃下加热15分钟。反相HPLC分析显示，35%的活度(tR～10min)连接至肽，并且65%的活度以柱的空隙容积洗脱(3.1分钟，未显示)，表明大多数活度与肽不缔合。粗制的标记混合物(5μL)与收集的人血清混合并在37℃下孵育。15分钟后去除等份并通过HPLC分析。HPLC显示，9.8%的活度依然与肽连接(35%以下)。1小时后去除另一等份并通过HPLC分析。HPLC显示，7.6%的活度依然连接至肽(35%以下)，这基本上与15分钟图谱相同(数据未显示)。
pH4.02。在pH 4乙酸盐缓冲液中的3毫升2mM Al溶液与15μL，1.3mCi F混合。然后溶液与20μL2mM IMP 449溶液混合，并在105℃下加热15分钟。反相HPLC分析显示，35%的活度(tR～10min)连接至肽，并且65%的活度以柱的空隙容积洗脱(3.1分钟，未显示)，表明大多数活度与肽不缔合。粗制的标记混合物(5μL)与收集的人血清混合并在37℃下孵育。15分钟后去除等份并通过HPLC分析。HPLC显示，9.8%的活度依然与肽连接(35%以下)。1小时后去除另一等份并通过HPLC分析。HPLC显示，7.6%的活度依然连接至肽(35%以下)，这基本上与15分钟图谱相同(数据未显示)。
[0185] 高剂量18F标记
[0186] 使用纯化的IMP 449的进一步研究证明，18F-标记的肽在37℃人血清中高度稳定(91%，未显示)至少1小时，并且在37℃人血清中部分稳定(76%，未显示)至少4小时。进行其它研究，其中IMP 449在作为稳定剂的抗坏血酸存在下制备。在那些研究中(未显示)，18 18
金属- F-肽复合物在37℃血清中4小时后显示没有可检测的分解。在注射 F-标记的肽
18 18
后30分钟，发现小鼠尿液含有与肽结合的 F(未显示)。这些结果证明，本文公开的 F-标
18
记的肽在用于 F成像研究的适当体内条件下表现出足够的稳定性。
金属- F-肽复合物在37℃血清中4小时后显示没有可检测的分解。在注射 F-标记的肽
18 18
后30分钟，发现小鼠尿液含有与肽结合的 F(未显示)。这些结果证明，本文公开的 F-标
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记的肽在用于 F成像研究的适当体内条件下表现出足够的稳定性。
[0187] 由于IMP 449肽含有对放射分解敏感的硫脲键合，通过RP-HPLC观察到了几种产物。然而，当将抗坏血酸添加至反应混合物时，产生的副产物显著减少。
[0188] 实施例4.通过预靶向制备用于18F成像的DNL构建体
[0189] DNL技术可以用于制备二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等，包括实际上任何抗体或其片段或其它效应物部分。对于某些优选实施方案，IgG抗体、Fab片段或其它蛋白质或肽可以被制备为含有DDD(二聚化和停靠结构域)或AD(锚定结构域)序列的融合蛋白。双特异性抗体可以通过组合第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白来18
形成。或者，可以制备组合了IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白的构建体。为了 F检测的目的，含有与待成像的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原结合位点的抗体或片段可以与
18
第二抗体或片段组合，所述第二抗体或片段结合可与金属- F连接的可靶向构建体(例如IMP 449)上的半抗原。将双特异性抗体(DNL构建体)施用给受试者，使得循环抗体从血液
18
中清除并集中于靶组织，并且添加 F-标记的可靶向构建体并结合集中的抗体以成像。
形成。或者，可以制备组合了IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白的构建体。为了 F检测的目的，含有与待成像的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原结合位点的抗体或片段可以与
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第二抗体或片段组合，所述第二抗体或片段结合可与金属- F连接的可靶向构建体(例如IMP 449)上的半抗原。将双特异性抗体(DNL构建体)施用给受试者，使得循环抗体从血液
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中清除并集中于靶组织，并且添加 F-标记的可靶向构建体并结合集中的抗体以成像。
[0190] 可以为每个Fab或IgG融合蛋白开发独立的转基因细胞系。一经产生，模块可以按需要被纯化或保持在细胞培养上清液中。产生后，任何DDD2-融合蛋白模块可以与任何对应的AD-融合蛋白模块组合以产生双特异性DNL构建体。对于不同类型的构建体，可以利用不同的AD或DDD序列。下列DDD序列基于PKA R Ⅱα的DDD部分，而AD序列基于最优化合成的AKAP-IS序列的AD部分(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100:4445)。
[0191] DDD1：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:6)[0192] DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:7)[0193] AD1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:8)
[0194] AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO:9)
[0195] 质粒载体pdHL2已经用于产生许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125:191-202；Losman 等，Cancer(Phila)(1997)，80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。载体序列对于许多不同的IgG-pdHL2构建体而言大部分相同，而仅在可变结构域(VH和VL)序列中存在差异。使用本领域技术人员己知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和人RIIα的前44个残基(称为DDD1)的序列替代。为了产生Fab-AD表达载体，IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1)的序列替代，其使用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100:4445-50。
[0196] 两个穿梭载体经设计用以帮助IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下文中所描述的。
[0197] CH1的制备
[0198] 使用pdHL2质粒载体作为模板通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)末端和SacII限制核酸内切酶位点组成，其为CH1编码序列的5’。右侧引物由编码铰链的前4个残基的序列、随后四个甘氨酸和丝氨酸以及包括Bam HI限制位点的最后两个密码子(GS)组成。将410bp PCR扩增子克隆到pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)中并且根据T7(5’)方向的插入序列来筛选克隆。
[0199] 合成双链体寡核苷酸以编码DDD1的氨基酸序列，之前有11个残基的接头肽，以及包括BamHI限制位点的前两个密码子。终止密码子和EagI限制位点附加于3’末端。下面显示了编码的多肽序列，DDD1序列加下划线标示。
[0200] GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：10)[0201] 合成在其3’末端重叠30个碱基对的命名为RIIA1-44(上端)和RIIA1-44(下端)的两个寡核苷酸(Sigma Genosys)，并组合以包括174bpDDD1序列的中心154个碱基对。使寡核苷酸退火并经历Taq聚合酶的引物延伸反应。引物延伸之后，双链体通过PCR扩增。将扩增子克隆到pGemT中并根据T7(5’)方向的插入序列来筛选。
[0202] 合成双链体寡核苷酸(Sigma Genosys)以编码AD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列之前有11个残基的接头肽，以及包括BamHI限制位点的前两个密码子。终止密码子和EagI限制位点附加于3’末端。下面显示了编码的多肽序列，AD1的序列加下划线标示。
[0203] GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：11)
[0204] 合成命名为AKAP-IS(上端)和AKAP-IS(下端)的编码上述肽序列的两个互补重叠寡核苷酸并退火。双链体通过PCR扩增。将扩增子克隆到pGemT载体中并根据T7(5’)方向的插入序列来筛选。
[0205] 连接DDDl与CH1
[0206] 编码DDD1序列的190bp片段用BamHI和NotI限制酶从pGemT切除，然后连接到CH1-pGemT中的相同位点以产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
[0207] 连接AD1与CH1
[0208] 含有AD1序列的110bp片段用BamHI和NotI从pGemT中切除，然后连接到CH1-pGemT中的相同位点以产生穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
[0209] 将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体
[0210] 使用该模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过从pdHL2去除SacII/EagI限制片段(CH1-CH3)并用从各自的pGemT穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段替代它，将完整的重链恒定结构域替换为上述构建体之一。
[0211] h679-Fd-AD1-pdHL2的构建
[0212] h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生h679Fab的表达载体，其中AD1经由14个氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔序列偶联至Fd的CH1结构域的羧基末端。含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体可以通过用CH1-AD1片段替换SacII/EagI片段而转变为h679-Fd-AD1-pdHL2，所述CH1-AD1片段用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3穿棱载体切除。
[0213] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
[0214] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是 用 于 产 生 包 括 两 个 拷 贝 的 融 合 蛋 白C-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1经由柔性肽间隔序列在CH1的羧基末端连接至hMN-14Fab。将已经用于产生hMN-14IgG的质粒载体hMN14(I)-pdHL2转变为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2，通过用SacII和EagI限制核酸内切酶消化以除去CH1-CH3结构域并插入使用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除的CH1-DDD1片段。
[0215] 已经使用相同的技术产生用于多种己知抗体的Fab表达的质粒，所述抗体例如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其它抗体。一般而言，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中，并且使该表达载体如上所述转化用于产生AD-或DDD-融合蛋白。将包括任何此类抗体的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以每一个AD-融合蛋白两个DDD-融合蛋白的适当比例组合，以产生包含第一抗体的两个Fab片段和第二抗体的一个Fab片段的三聚体DNL构建体。
[0216] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
[0217] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加于hMN-14的Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。分泌的融合蛋白由两个相同拷贝的hMN-14Fab构成，两个相同拷贝的hMN-14Fab由DDD2结构域的非共价相互作用固定在一起。
[0218] 合成制备了两个重叠的互补寡核苷酸，其包括部分接头肽和DDD2的残基1-13的编码序列。使寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，在5’和3’末端产生分别适合与用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的突出端。
[0219] 双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化而制备的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接，以产生穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。507bp片段用SacII和EagI从CH1-DDD2-pGemT切除，并与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2连接。将最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2，已经使用类似的技术来产生许多不同人源化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。
[0220] H679-Fd-AD2-pdHL2
[0221] 将h679-Fab-AD2 设 计 为 作 为 B与 作 为 A的 C-DDD2-Fab-hMN-14配 对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加于CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定结构域序列。AD2具有在AD1锚定结构域序列前的一个半胱氨酸残基以及在AD1锚定结构域序列后的一个半胱氨酸残基。
[0222] 将表达载体如下工程化。合成制备了两个重叠的互补寡核苷酸(AD2上端和AD2下端)，其包括AD2和部分接头序列的编码序列。使寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，在5’和3’末端产生分别适合与用限制核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的突出端。
[0223] 将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化而制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT中，以产生穿梭载体CH1-AD2-pGemT。含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段用SacII和EagI限制酶从穿梭载体切除并连接到使用那些相同酶消化而制备的h679-pdHL2载体。最终的表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。
[0224] 实施例5.TF2DNL构建体的产生
[0225] 命名为TF2的三聚体DNL构建体通过C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应而获得。以>90%的收率如下产生试验批次的TF2。蛋白L纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1摩尔比混合。在含有1mM EDTA的PBS中的总蛋白浓度是1.5mg/ml。随后步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP291亲和色谱。在添加TCEP之前，SE-HPLC未显示a2b形成的任何迹象。添加5mM TCEP快速导致a2b复合物形成，与对于二元结构所预期的157kDa蛋白质一致。通过IMP 291亲和色谱，TF2被纯化至接近均一(未显示)。IMP 291是合成的肽，含有679Fab结合的HSG半抗原(Rossi等，2005，Clin Cancer Res 11:7122s-29s)。IMP 291未结合级分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物去除(未显示)。
[0226] 非还原SDS-PAGE分析证明，大部分TF2作为大的共价结构存在，具有与IgG接近的相对迁移率(未显示)。其它键表明在实验条件下二硫化物形成不完全(未显示)。还原SDS-PAGE显示在非还原凝胶中明显的任何其它条带是产物相关的(未显示)，因为代表TF2组成多肽的唯一条带是明显的。MALDI-TOF质谱(未显示)揭示了156,434Da的单峰，其在TF2计算质量(157,319Da)的99.5%之内。
[0227] TF2的功能性通过BIACORE分析确定。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原的a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白)并通过固定有HSG的传感器芯片。对TF2的响应约为两种对照样品的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合并保留在传感器芯片上。随后注射WI2IgG，hMN-14的抗-独特型抗体，证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密结合的DDD-Fab-hMN-14组分，如通过其它信号响应所指示的。WI2与固定于传感器芯片上的TF2的结合产生的响应单位的额外增加对应于两个完全功能性结合位点，每个由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基贡献。这由TF2与WI2的两个Fab片段结合的能力证实(未显示)。
[0228] 实施例6.TF10DNL构建体的产生
[0229] 使用类似方案产生三聚体TF10 DNL构建体，包括两个拷贝的C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝的C-AD2-Fab-679。TF10双特异性([hPAM4]2xh679)抗体使用如上所述的用于产生(抗CEA)2x抗HSGbsAb TF2所公开的方法产生。TF10构建体带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
[0230] 使两个融合蛋白(hPAM4-DDD2和h679-AD2)在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立表达。合并组织培养上清液，导致两倍摩尔过量的hPAM4-DDD2。反应混合物使用1mM还原型谷胱甘肽在温和还原条件在室温孵育24小时。还原后，DNL反应使用2mM氧化型谷胱甘肽通过温和氧化来完成。TF10通过使用IMP 291-亲和凝胶树脂的亲和色谱来分离，所述树脂以高特异性结合h679Fab。
[0231] 实施例7.DNL的序列变体
[0232] 在某些优选实施方案中，被并入细胞因子-MAb DNL复合物的AD和DDD序列包括AD1或AD2和DDD1或DDD2的氨基酸序列，如上所论述的。然而，在替代实施方案中，AD和/或DDD部分的序列变体可以用于构建DNL复合物。例如，仅存在4个人PKA DDD序列的变体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文中公开的DDD1和DDD2的基础。4个人PKADDD序列示于下面。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应指出，DDD1的序列从人PKA RIIαDDD部分略微修饰而来)。
[0233] PKA RIα
[0234] SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ ID NO：12)[0235] PKA RIβ
[0236] SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO：13)[0237] PKA RIIα
[0238] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO：14)
[0239] PKA RIIβ
[0240] SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO：15)
[0241] AD和DDD结构域的结构-功能关系已经成为考察的主题。(参见例如，Burns-Hamuro 等，2005，Protein Sci 14:2982-92；Carr 等，2001,JBiol Chem
276:17332-38；Alto 等，2003，Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50；Hundsrucker 等，
2006，Biochem J 396:297-306；Stokka等，2006，Biochem J 400:493-99；Gold等，2006，Mol Cell 24:383-95；Kinderman等，2006，Mol Cell 24:397-408，每篇文献的全部内容通过引用并入本文)。
276:17332-38；Alto 等，2003，Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50；Hundsrucker 等，
2006，Biochem J 396:297-306；Stokka等，2006，Biochem J 400:493-99；Gold等，2006，Mol Cell 24:383-95；Kinderman等，2006，Mol Cell 24:397-408，每篇文献的全部内容通过引用并入本文)。
[0242] 例如，Kinderman等(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多对于二聚体形成或AKAP结合而言重要的保守氨基酸残基，在下文SEQ ID NO:6中加下划线。(参见Kinderman等，2006的图l，通过引用并入本文)。本领域技术人员将了解，在设计DDD序列的序列变体时，将期望避免改变任何加下划线的残基，而可以对二聚化和AKAP结合不太重要的残基进行保守的氨基酸取代。
[0243] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：6)
[0244] Alto等(2003)进行各种AKAP蛋白的AD序列的生物信息分析以设计称为AKAP-IS(SEQ ID NO:8)的RII选择性AD序列，对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计为AKAP结合至PKA的肽拮抗剂。当取代趋向于减弱对DDD结合的AKAP-IS序列中的残基在SEQ ID NO:8中加下划线。本领域技术人员将了解，在设计AD序列的序列变体时，将期望避免改变任何加下划线的残基，而可以将对于DDD结合不太重要的残基进行保守的氨基酸取代。
[0245] AKAP-IS序列
[0246] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:8)
[0247] Gold(2006)利用了结晶学和肽筛选来开发SuperAKAP-IS序列(SEQ IDNO:16)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置，所述氨基酸取代增加了对RIIα的DDD部分的结合。在该序列中，将N末端Q残基编号为残基号4，而C末端A残基是残基号20。可以被取代以影响对RIIα亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，2006)。在某些替代实施方案中，预期可以用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。可以取代AKAP-IS AD序列的其它替代序列显示于SEQ ID NO:17-19。相对于AKAP-IS序列的取代被加下划线。与SEQ ID NO:9中显示的AD2序列一样，预期AD部分还可以包括其它N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
[0248] SuperAKAP-IS
[0249] QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ IDNO:16)
[0250] 替代的AKAP序列
[0251] QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:17)
[0252] QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:19)
[0253] Stokka等(2006)还开发了AKAP与PKA结合的肽竞争剂，示于SEQ ID NO:20-22。肽拮抗剂被命名为Ht31(SEQ ID NO:20)、RIAD(SEQ ID NO:21)和PV-38(SEQ ID NO:22)。
Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型更高的亲和力，而RIAD和PV-38显示对RI更高的亲和力。
Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型更高的亲和力，而RIAD和PV-38显示对RI更高的亲和力。
[0254] Ht31
[0255] DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：20)
[0256] RIAD
[0257] LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：21)
[0258] PV-38
[0259] FFELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：22)
[0260] Hundsrucker等(2006)还开发了AKAP与PKA结合的其它肽竞争剂，对PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗肽的序列提供于Hundsrucker等的表1(通过引用并入本文)。不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO:8)加下划线来指示。残基与Alto等(2003)观察到的相同，添加了C末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4，通过引用并入本文)。对RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列显示于SEQ ID NO:23-25。
[0261] AKAP-IS
[0262] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：8)
[0263] AKAP7δ-wt-pep
[0264] PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：23)
[0265] AKAP7δ-L304T-pep
[0266] PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：24)
[0267] AKAP7δ-L308D-pep
[0268] PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：25)
[0269] Carr等(2001)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度和DDD序列中鉴定的在不同DDD部分中表现出最高度保守的残基。这些在下文通过参考SEQ ID NO:6的人PKA RIIαDDD序列加下划线来指示。特别保守的残基通过斜体来进一步指示。与Kinderman等(2006)提出的那些重叠但不相同的残基对于AKAP蛋白的结合是重要的。本领域技术人员将了解，在设计DDD序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体表示)，而可以考虑对未加下划线也未用斜体表示的残基进行保守的氨基酸取代。
[0270] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：6)
[0271] 实施例8.使用预靶向抗体和18F-标记的肽的体内研究
[0272] 18F-标记的IMP 449如下制备。18F(54.7mCi于～0.5mL中)与3μL0.1M NaOAc pH 4缓冲液中的2mM Al混合。3分钟后，添加10μL0.5M pH 4NaOAc缓冲液中的0.05M IMP449，反应在96℃加热器中加热15分钟。然后通过HPLC在C18柱上纯化粗制标记肽。HPLC纯化的肽样品通过使目标级分在水中稀释两倍并将溶液置于1cc 柱桶中
而被进一步加工。柱筒用3x1mL水洗脱以除去乙腈和TFA，随后通过400μL l:1EtOH/H2O
18 18
以洗脱 F-标记的肽。纯化的[Al F]IMP 449在分析型HPLC C18柱上作为单峰被洗脱(未显示)。
而被进一步加工。柱筒用3x1mL水洗脱以除去乙腈和TFA，随后通过400μL l:1EtOH/H2O
18 18
以洗脱 F-标记的肽。纯化的[Al F]IMP 449在分析型HPLC C18柱上作为单峰被洗脱(未显示)。
[0273] 将携带四个缓慢生长的sc CaPanl异种移植物的Taconic裸小鼠用于体内研究。18
给三只小鼠注射TF10(162μg)，随后在18h后注射[Al F]IMP 449。TF10是用于肿瘤成像研究的人源化双特异性抗体，对PAM-4限定的肿瘤抗原具有二价结合，而对HSG具有单价结合(参见例如，Gold等，2007，J.Clin.Oncol.25(18S):4564)。一只小鼠被注射单独的肽。
所有小鼠在肽注射后1h进行解剖。立即计数组织。平均值分布对比显示在肿瘤靶向双特
18
异性抗体存在下集中于肿瘤的 F-标记的肽比任何正常组织中明显更高的水平。
给三只小鼠注射TF10(162μg)，随后在18h后注射[Al F]IMP 449。TF10是用于肿瘤成像研究的人源化双特异性抗体，对PAM-4限定的肿瘤抗原具有二价结合，而对HSG具有单价结合(参见例如，Gold等，2007，J.Clin.Oncol.25(18S):4564)。一只小鼠被注射单独的肽。
所有小鼠在肽注射后1h进行解剖。立即计数组织。平均值分布对比显示在肿瘤靶向双特
18
异性抗体存在下集中于肿瘤的 F-标记的肽比任何正常组织中明显更高的水平。
[0274] 组织吸收在给予单独[Al18F]IMP 449的动物或预靶向环境中是类似的(表2)。与单独肽相比较，在1h时，在预靶向动物中人胰腺癌异种移植物CaPan1的吸收增加至5倍(4.6±0.9%ID/g与0.89%ID/g)。此时达到罕见的肿瘤/非肿瘤比值(例如，肿瘤/血液和肝的比值分别是23.4±2.0和23.5±2.8)。
[0275] 表2.在肽注射后1h的组织吸收，平均值和个体动物：
[0276]
[0277] 实施例9.具有预靶向抗体的[Al18F]IMP 449的生物分布
[0278] 研究目标是检查在用双特异性抗体TF2预靶向之后在携带scLS174T异种移植物18
的裸小鼠中[Al F]IMP 449的生物分布。
的裸小鼠中[Al F]IMP 449的生物分布。
[0279] [Al18F]IMP 449：标记如上所述进行，除了18F在标记之前在QMA柱上纯化，如Kim等(Applied Radiation and Isotopes 61，2004，1241-46)所述。柱用1mL 0.4M KHCO318 18
以200μL级分洗脱。用10μL冰醋酸调节 F溶液的pH，将来自峰级分的 F与3μL2mM Al(于0.1M pH4NaOAc缓冲液中)混合。随后将样品与10μL 0.5M NaOAc缓冲液(pH 4)
18
中的0.05M IMP 449混合，反应溶液在94℃加热15分钟。[Al F]IMP 449通过RP-HPLC纯化。含有产物的级分通过HLB柱以交换缓冲液。产物用400μL1:1EtOH:H2O洗脱。因为收率低，所以比活度低，并将更多的肽注射入小鼠，造成bsMAb:肽比值为6.9:1而不是10:1。
以200μL级分洗脱。用10μL冰醋酸调节 F溶液的pH，将来自峰级分的 F与3μL2mM Al(于0.1M pH4NaOAc缓冲液中)混合。随后将样品与10μL 0.5M NaOAc缓冲液(pH 4)
18
中的0.05M IMP 449混合，反应溶液在94℃加热15分钟。[Al F]IMP 449通过RP-HPLC纯化。含有产物的级分通过HLB柱以交换缓冲液。产物用400μL1:1EtOH:H2O洗脱。因为收率低，所以比活度低，并将更多的肽注射入小鼠，造成bsMAb:肽比值为6.9:1而不是10:1。
[0280] 结果
[0281] 预靶向18F标记的IMP 449在小鼠中的生物分布概述于表3中。标记的肽显示在双特异性TF2抗体存在的情况下高水平的集中于肿瘤组织。在TF2不存在的情况下，标记的肽未显示比至正常组织显著更高的在肿瘤的集中(未显示)。
[0282] 表3.给小鼠静脉内注射TF2(163.2μg，1.035x10-9mol)，随后在16h后注射18 -10
[Al F]IMP 449(1.5x10 mol)。肽注射后1h的肽组织吸收(%ID/g)显示如下。
[Al F]IMP 449(1.5x10 mol)。肽注射后1h的肽组织吸收(%ID/g)显示如下。
[0283]
[0284] 该研究显示，本文描述的简单可重现方法和组合物产生适合用于体内成像多种疾18
病状态的 F-标记的靶向肽。本领域技术人员将了解，上述公开的双特异性抗体是非限制性的，但是可以包括针对多种疾病或病原体靶抗原的任何己知抗体。而且所述方法不限于用双特异性抗体预靶向。在其它实施方案中，直接结合待成像的靶细胞、组织或有机体的分
18
子或复合物可以使用本文公开的方法用 F标记并施用给受试者以进行PET成像(参见下文实施例)。
病状态的 F-标记的靶向肽。本领域技术人员将了解，上述公开的双特异性抗体是非限制性的，但是可以包括针对多种疾病或病原体靶抗原的任何己知抗体。而且所述方法不限于用双特异性抗体预靶向。在其它实施方案中，直接结合待成像的靶细胞、组织或有机体的分
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子或复合物可以使用本文公开的方法用 F标记并施用给受试者以进行PET成像(参见下文实施例)。
[0285] 由IMP 449示例的Al18F-标记的肽在体内条件下足够稳定以在己知成像方案(例18
如PET扫描)中使用。而且，要求保护的方法导致准备在1小时的制备时间内注射的 F-标
18
记的靶向肽制剂，完全在 F的衰变时间之内以允许进行适合的成像程序。最后，与制备用
18
于成像研究的制备 F-标记的化合物的己知方法相比，所描述和要求保护的方法导致操作人员对放射性同位素暴露的最小暴露。
如PET扫描)中使用。而且，要求保护的方法导致准备在1小时的制备时间内注射的 F-标
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记的靶向肽制剂，完全在 F的衰变时间之内以允许进行适合的成像程序。最后，与制备用
18
于成像研究的制备 F-标记的化合物的己知方法相比，所描述和要求保护的方法导致操作人员对放射性同位素暴露的最小暴露。
[0286] 实施例10.使用18F-标记的肽体内成像并与18F[FDG]对比
[0287] 将使用双特异性抗体和标记的靶向肽预靶向的体内成像技术用于成功检测相对18
小尺寸的肿瘤。 F在 PlusQMA Light柱上纯化。将用0.4M KHCO3
18 3+ 18
洗脱的 F与3μL的pH4乙酸盐缓冲液中的2mM Al 混合。然后将Al F溶液注入抗坏血酸IMP449标记管形瓶中并被加热至105℃进行15分钟。使反应溶液冷却并与0.8mL DI水混合。将反应内容物加载到 HLB柱上并用2x200μL 1:1EtOH/
H2O洗脱。如上所述制备TF2。TF2二价结合至癌胚抗原(CEA)并单价结合至合成的半抗原HSG(组胺-琥珀酰基-甘氨酸)。
小尺寸的肿瘤。 F在 PlusQMA Light柱上纯化。将用0.4M KHCO3
18 3+ 18
洗脱的 F与3μL的pH4乙酸盐缓冲液中的2mM Al 混合。然后将Al F溶液注入抗坏血酸IMP449标记管形瓶中并被加热至105℃进行15分钟。使反应溶液冷却并与0.8mL DI水混合。将反应内容物加载到 HLB柱上并用2x200μL 1:1EtOH/
H2O洗脱。如上所述制备TF2。TF2二价结合至癌胚抗原(CEA)并单价结合至合成的半抗原HSG(组胺-琥珀酰基-甘氨酸)。
[0288] 生物分布和显微PET成像
[0289] 给六周龄的NCr nu-m雌性裸小鼠s.c.移植人结肠癌细胞系LS174T(ATCC，Manassas，VA)。当肿瘤被显影建立时，向预靶向的动物静脉内注射162μg(～1nmol/0.1mL)TF2或TF10(对照非靶向三-Fab bsMAb)，然后在16-18h后，静脉内注射～
18
0.1nmol[Al F]IMP449(84μCi，3.11MBq/0.1mL)。其它非预靶向对照动物接受单独的
18 18 18
F(150μCi，5.5MBq)、单独的Al F复合物(150μCi，5.55MBq)、单独的[Al F]IMP 449肽
18 18 18
(84μCi，3.11MBq)或[ F]FDG(150μCi，5.55MBq)。 F和[ F]FDG在使用当天获自IBA
18
Molecular(Somerset，NJ)。使接受[ F]FDG的动物禁食过夜，但是水随意提供。
18
0.1nmol[Al F]IMP449(84μCi，3.11MBq/0.1mL)。其它非预靶向对照动物接受单独的
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F(150μCi，5.5MBq)、单独的Al F复合物(150μCi，5.55MBq)、单独的[Al F]IMP 449肽
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(84μCi，3.11MBq)或[ F]FDG(150μCi，5.55MBq)。 F和[ F]FDG在使用当天获自IBA
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Molecular(Somerset，NJ)。使接受[ F]FDG的动物禁食过夜，但是水随意提供。
[0290] 在放射性示踪剂注射后1.5h，将动物麻醉，心脏内取血并解剖。将组织称重并与由各自产物的每一个制备的标准稀释液一起计数。由于18F的短的物理半衰期，标准物间插在来自每个动物的组织的每一个组之间。将组织中的吸收表示为每克计数除以总注射活度以得到每克的百分比注射剂量(%ID/g)。
[0291] 进行两种类型的成像研究。在一组中，携带小LS174T皮下肿瘤的3只裸小鼠接18 18
受预靶向的[Al F]IMP 449、单独的[Al F]IMP 449(未被预靶向)(都是135μCi(5MBq；
18
0.1nmol))或[ F]FDG(135μCi，5MBq)。在静脉内放射性示踪剂注射后2h，动物用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉并在扫描期间保持温暖，在 动物PET扫描仪(Siemens
Preclinical Solutions，Knoxville，TN)上进行。
受预靶向的[Al F]IMP 449、单独的[Al F]IMP 449(未被预靶向)(都是135μCi(5MBq；
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0.1nmol))或[ F]FDG(135μCi，5MBq)。在静脉内放射性示踪剂注射后2h，动物用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉并在扫描期间保持温暖，在 动物PET扫描仪(Siemens
Preclinical Solutions，Knoxville，TN)上进行。
[0293] 在单独的动态成像研究中，在16h前给予TF2bsMAb的携带单个LS174T的裸小鼠用O2/N2O和异氟烷(2%)的混合物麻醉，仰卧放在照相床上，然后静脉内注射
18
219μCi(8.1MBq)[Al F]IMP 449(0.16nmol)。立即开始120分钟时段的数据获取。扫描使用OSEM3D/MAP重建。为了展示，对每个横截面(冠状、径向和横向)展示在5、15、30、60、90和120分钟结束的时帧。对于含有肿瘤的截面，在每个间隔，调整图像强度直至像素饱和首先出现在肿瘤中。图像强度按需要随时间增加以维持肿瘤内的像素饱和。将在相同间隔得到的没有肿瘤的冠状和径向横截面调整至与含有肿瘤的横截面相同的强度。背景活度未被调整。
18
219μCi(8.1MBq)[Al F]IMP 449(0.16nmol)。立即开始120分钟时段的数据获取。扫描使用OSEM3D/MAP重建。为了展示，对每个横截面(冠状、径向和横向)展示在5、15、30、60、90和120分钟结束的时帧。对于含有肿瘤的截面，在每个间隔，调整图像强度直至像素饱和首先出现在肿瘤中。图像强度按需要随时间增加以维持肿瘤内的像素饱和。将在相同间隔得到的没有肿瘤的冠状和径向横截面调整至与含有肿瘤的横截面相同的强度。背景活度未被调整。
[0294] 结果
[0295] 虽然单独的18F和[Al18F]复合物在所有组织中具有相似的吸收，但是当复合物被18
螯合至IMP 449时发现显著差异(表4)。最显著差异发现于骨中的吸收，其中非螯合的 F
18
在肩胛骨中为60至约100倍更高并且在脊椎中为～200倍更高。因为己知 F或甚至金属-氟化物复合物在骨中累积(Franke等1972，Radiobiol.Radiother.(Berlin)13:533)，
18
预期该分布。还在肿瘤和肠中以及肌肉和血液中观察到更高的吸收。螯合的[Al F]IMP 449在除了肾的所有组织中具有显著更低的吸收，说明螯合剂-复合物通过尿排泄而从机体有效去除的能力。
螯合至IMP 449时发现显著差异(表4)。最显著差异发现于骨中的吸收，其中非螯合的 F
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在肩胛骨中为60至约100倍更高并且在脊椎中为～200倍更高。因为己知 F或甚至金属-氟化物复合物在骨中累积(Franke等1972，Radiobiol.Radiother.(Berlin)13:533)，
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预期该分布。还在肿瘤和肠中以及肌肉和血液中观察到更高的吸收。螯合的[Al F]IMP 449在除了肾的所有组织中具有显著更低的吸收，说明螯合剂-复合物通过尿排泄而从机体有效去除的能力。
[0296] 使用TF2抗-CEA bsMAb预靶向[Al18F]IMP 449使吸收转移至肿瘤，使其从0.20±0.05增加至1.5h的6.01±1.72%每克注射剂量，而正常组织中的吸收与单独的
18
[Al F]IMP 449类似。血液、肝、肺和肾中的肿瘤/非肿瘤比值分别是146±63、59±24、
18 18
38±15和2.0±1.0，此时其它肿瘤/组织比值>100:1。尽管单独的 F和单独的[Al F]
18
在肿瘤中都具有比螯合[Al F]IMP 449更高的吸收，分别产生6.7±2.7和11.0±4.6与
5.1±1.5的肿瘤/血液比值，但是肿瘤吸收和肿瘤/血液比值被预靶向显著提高(所有P值<0.001)。
18
[Al F]IMP 449类似。血液、肝、肺和肾中的肿瘤/非肿瘤比值分别是146±63、59±24、
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38±15和2.0±1.0，此时其它肿瘤/组织比值>100:1。尽管单独的 F和单独的[Al F]
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在肿瘤中都具有比螯合[Al F]IMP 449更高的吸收，分别产生6.7±2.7和11.0±4.6与
5.1±1.5的肿瘤/血液比值，但是肿瘤吸收和肿瘤/血液比值被预靶向显著提高(所有P值<0.001)。
[0297] 生物分布与靶向组织的最常用肿瘤成像剂[18F]FDG相当，具有高葡萄糖消耗和代18
谢活性(表4)。其在除了肾以外的所有正常组织中的吸收比[Al F]IMP 449明显更高。对
18 18 18
于预靶向的[Al F]IMP 449和[ F]FDG而言，肿瘤吸收类似，但是因为[ F]FDG在大部分
18
正常组织中较高的累积，因此[ F]FDG的肿瘤/非肿瘤比值显著低于预靶向动物中的那些(所有P值<0.001)。
谢活性(表4)。其在除了肾以外的所有正常组织中的吸收比[Al F]IMP 449明显更高。对
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于预靶向的[Al F]IMP 449和[ F]FDG而言，肿瘤吸收类似，但是因为[ F]FDG在大部分
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正常组织中较高的累积，因此[ F]FDG的肿瘤/非肿瘤比值显著低于预靶向动物中的那些(所有P值<0.001)。
[0298] 表4.TF2-预靶向的[Al18F]IMP 449和其它对照18F-标记的试剂在携带LS174T人18
结肠异种移植物的裸小鼠中的生物分布。为了预靶向，动物在注射[Al F]IMP449之前16h给予TF2。所有注射被静脉内施用。
结肠异种移植物的裸小鼠中的生物分布。为了预靶向，动物在注射[Al F]IMP449之前16h给予TF2。所有注射被静脉内施用。
[0299]
[0300] 将几只动物成像以进一步分析单独的[Al18F]IMP 449或TF2预靶向的[Al18F]IMP449以及[18F]FDG的生物分布。在注射放射性之后2.0h开始的静态图像证实了之前的组织分布数据，显示几乎完全在肾中的吸收(图1)。21-mg肿瘤在预靶向动物中容易显影，18
而给予单独[Al F]IMP 449的动物未能定位肿瘤，仅具有肾吸收。没有观察到骨增生的证
18
据，表明Al F与IMP449牢固结合。这在经历动态成像研究的另一只预靶向动物中证实，
18 18
所述动态成像研究监测[Al F]IMP449在120分钟内以5-min间隔的[Al F]IMP 449分布(图2)。冠状和径向切片显示在前5分钟主要的心脏、肾和一些肝吸收，但在接下来的10分钟心脏和肝活度明显下降，而肾在整个研究中保持突出。在整个120分钟扫描中，没有肠或骨中活度的证据。首先在15分钟到30分钟观察到35-mg LS174T肿瘤中的吸收，该信号从背景被非常清晰地描绘，强肿瘤活度在整个120分钟扫描期间是突出的。
而给予单独[Al F]IMP 449的动物未能定位肿瘤，仅具有肾吸收。没有观察到骨增生的证
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据，表明Al F与IMP449牢固结合。这在经历动态成像研究的另一只预靶向动物中证实，
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所述动态成像研究监测[Al F]IMP449在120分钟内以5-min间隔的[Al F]IMP 449分布(图2)。冠状和径向切片显示在前5分钟主要的心脏、肾和一些肝吸收，但在接下来的10分钟心脏和肝活度明显下降，而肾在整个研究中保持突出。在整个120分钟扫描中，没有肠或骨中活度的证据。首先在15分钟到30分钟观察到35-mg LS174T肿瘤中的吸收，该信号从背景被非常清晰地描绘，强肿瘤活度在整个120分钟扫描期间是突出的。
[0301] 比较之下，来自给予[18F]FDG的动物的静态图像显示了之前在骨、心肌和脑中观察到的预期的放射性模式(McBride等，2006，J．Nucl.Med.47:1678；Sharkey等，2008，Radiology 246:497)，在机体中明显更高的背景活度(图1)。在静态成像研究结束时解剖18
的3只动物中测量的组织吸收证实在所有组织中高得多的组织 F放射性(未显示)。虽
18
然在该动物中[ F]FDG的肿瘤吸收比预靶向动物中的高，但是肿瘤/血液比值更有利于预靶向；并且在体中具有少得多的残基活度，肿瘤显影通过预靶向被增强。
的3只动物中测量的组织吸收证实在所有组织中高得多的组织 F放射性(未显示)。虽
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然在该动物中[ F]FDG的肿瘤吸收比预靶向动物中的高，但是肿瘤/血液比值更有利于预靶向；并且在体中具有少得多的残基活度，肿瘤显影通过预靶向被增强。
[0302] 这些研究证明，预靶向成像中使用的半抗原-肽可用18F快速标记(60分钟的总制备时间)，通过简单形成氟化铝复合物，然后氟化铝复合物被适合的螯合剂结合且被并入半18
抗原-肽。这可以通过将[Al F]-螯合剂简单偶联至可连接至螯合部分的任何分子并随后被纯化而更普遍地制备。在优选实施方案中，标记物的百分比并入以及标记化合物的比活度是足够的，以致于不必纯化标记分子。
抗原-肽。这可以通过将[Al F]-螯合剂简单偶联至可连接至螯合部分的任何分子并随后被纯化而更普遍地制备。在优选实施方案中，标记物的百分比并入以及标记化合物的比活度是足够的，以致于不必纯化标记分子。
[0303] 该报道描述将18F经由铝缀合物结合至各种化合物的直接、简易和快速方法。当被18 18
基于NOTA的螯合剂结合时，[Al F]肽在体外和体内是稳定的。收率在使用常规 F标记程
18
序发现的范围内。这些结果进一步证明使用与多种靶向分子螯合的金属 F进行PET成像的可行性。
基于NOTA的螯合剂结合时，[Al F]肽在体外和体内是稳定的。收率在使用常规 F标记程
18
序发现的范围内。这些结果进一步证明使用与多种靶向分子螯合的金属 F进行PET成像的可行性。
[0304] 实施例11.IMP 460的制备并用Al-18F标记
[0305] 化 学 合 成 IMP460NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO：26)。NODA-Ga配体购自 并像其它氨基酸一样被连接至肽合成仪。使用以下述顺序添加的氨基酸和其它试剂在Sieber酰胺树脂上
合 成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去 除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Ala-OH和NODA-GA(tBu)3。然后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物。HRMS C61H92N18O18。
合 成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去 除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Ala-OH和NODA-GA(tBu)3。然后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物。HRMS C61H92N18O18。
[0306] IMP 460的放射性标记
[0307] 使IMP 460(0.0020g)溶解于732μL，pH 4，0.1M NaOAc。18F如上所述被纯化，用冰乙酸中和并与Al溶液混合。然后添加20μL肽溶液，且溶液在99℃加热25分钟。然后18
在 柱上纯化粗制产物。[Al F]标记的肽在1:1EtOH/H2O柱洗脱液中。在
0.1%TFA缓冲液中反相HPLC图谱显示在预期位置标记肽的清晰的HPLC单峰(未显示)。
在 柱上纯化粗制产物。[Al F]标记的肽在1:1EtOH/H2O柱洗脱液中。在
0.1%TFA缓冲液中反相HPLC图谱显示在预期位置标记肽的清晰的HPLC单峰(未显示)。
[0308] 实施例12.IMP 461和IMP 462NOTA-缀合肽的合成和标记
[0309] 制备最简单的可能的NOTA配体(为了肽合成而被保护)并且并入两个用于预靶向的肽-IMP 461和IMP 462。
[0310] 二-叔丁基-NOTA的合成
[0311] NO2AtBu(0.501g1.4x10-3mol)溶解于5mL无水乙腈。将苄基-2-溴乙酸酯-3
(0.222mL，1.4x10 mol)添加至溶液，随后添加0.387g无水K2CO3。使反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤并浓缩以获得0.605g(86%收率)的苄基酯缀合物。然后将粗制产物溶解于50mL异丙醇，与0.2g 10%Pd/C(Ar下)混合并置于50psi H2持续3天。然后将产物过滤并真空下浓缩以获得0.462g期望的产物ESMS MH415。
(0.222mL，1.4x10 mol)添加至溶液，随后添加0.387g无水K2CO3。使反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤并浓缩以获得0.605g(86%收率)的苄基酯缀合物。然后将粗制产物溶解于50mL异丙醇，与0.2g 10%Pd/C(Ar下)混合并置于50psi H2持续3天。然后将产物过滤并真空下浓缩以获得0.462g期望的产物ESMS MH415。
[0312] IMP 461的合成
[0313] 使用以下述顺序添加的氨基酸和其它试剂在Sieber酰胺树脂上合成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去 除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Ala-OH和双-叔丁基NOTA-OH。然+
后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物IMP 461 ESMS MH1294(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；SEQ ID NO：27)。
后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物IMP 461 ESMS MH1294(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；SEQ ID NO：27)。
[0314] IMP462的合成
[0315] 使用以下述顺序添加的氨基酸和其它试剂在Sieber酰胺树脂上合成 肽：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去 除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去 除、Fmoc-D-Asp(But)-OH 和 双- 叔 丁 基+
NOTA-OH。然后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物IMP462ESMSMH1338(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；SEQ ID NO：28)。
NOTA-OH。然后使肽裂解并通过HPLC纯化以提供产物IMP462ESMSMH1338(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；SEQ ID NO：28)。
[0316] IMP 461&IMP 462的18F标记
[0317] 将肽溶解于pH 4.13，0.5M NaOAc以制备0.05M肽溶液，将其贮存在冷藏器中直至TM需要时。在2mL水中接受F-18，并捕获在 Light， ACCELL Plus
18
QMA柱上。用200μL等份的0.4M KHCO3将 F从柱上洗脱。通过在添加活度之前添加
18
10μL冰乙酸至管形瓶而将等份的碳酸氢盐中和至～pH 4。使100μL等份的纯化 F溶液去除并与3μLpH 4，0.1M NaOAc中的2mM Al混合。添加10μL(0.05M)肽，并且使溶液在～100℃加热15分钟。粗制反应混合物用700μL DI水稀释并置于HLB柱上，然后用
18 18
2x100μL1:1EtOH/H2O洗脱 F以获得纯化的 F-标记的肽。
18
QMA柱上。用200μL等份的0.4M KHCO3将 F从柱上洗脱。通过在添加活度之前添加
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10μL冰乙酸至管形瓶而将等份的碳酸氢盐中和至～pH 4。使100μL等份的纯化 F溶液去除并与3μLpH 4，0.1M NaOAc中的2mM Al混合。添加10μL(0.05M)肽，并且使溶液在～100℃加热15分钟。粗制反应混合物用700μL DI水稀释并置于HLB柱上，然后用
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2x100μL1:1EtOH/H2O洗脱 F以获得纯化的 F-标记的肽。
[0318] 实施例13.IMP467的制备和18F标记
[0319] IMP 467 C-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:29)[0320] 产生四叔丁基C-NETA-琥珀酰基。叔丁基{4-[2-(二-(叔丁氧基羰基)甲基-3-(4-硝基苯基)丙基]-7-叔-丁氧基羰基[1,4,7]三氮杂壬-1-基)如Chong等
(J.Med.Chem.2008，51:118-125)所述制备。
(J.Med.Chem.2008，51:118-125)所述制备。
[0321] 肽 IMP 467 C-NETA- 琥 珀 酰 -D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:29)在Sieber酰胺树脂上制备，通过以所示顺序向树脂添加下述氨
基 酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被裂解、{4-[二-(叔丁氧基羰基甲基)氨基)-3-(4-琥珀酰氨基苯基)丙基]-7-叔-丁氧基羰基甲基[1,4,7]三氮杂壬-1-基)乙酸叔丁酯。然后使肽从树脂上裂解并通过RP-HPLC纯化以产生6.3mg IMP 467。使用C18柱通过高效液相色谱(HPLC)纯化粗制肽。
基 酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被裂解、{4-[二-(叔丁氧基羰基甲基)氨基)-3-(4-琥珀酰氨基苯基)丙基]-7-叔-丁氧基羰基甲基[1,4,7]三氮杂壬-1-基)乙酸叔丁酯。然后使肽从树脂上裂解并通过RP-HPLC纯化以产生6.3mg IMP 467。使用C18柱通过高效液相色谱(HPLC)纯化粗制肽。
[0322] 放射性标记
[0323] 2mM的IMP 467溶液在pH 4，0.1M NaOAc中制备。18F、139mCi通过TM 18
ACCELL Plus QMA柱被洗脱并用1mL 0.4M KHCO3洗脱 F。标记的IMP
18
467通过HLB RP-HPLC分析被纯化。RP-HPLC显示两个洗脱峰(未显示)，其被认为是Al F IMP467的非对映体。支持该假设，当IMP 467在37℃孵育时，两个HLB峰之间似乎存在一
18
些互交(未显示)。在如下论述的预靶向技术中，因为Al F-螯合剂复合物不是抗体结合的
18
半抗原位点的一部分，所以非对映体的存在似乎不影响 F-标记的肽对患病组织的靶向。
ACCELL Plus QMA柱被洗脱并用1mL 0.4M KHCO3洗脱 F。标记的IMP
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467通过HLB RP-HPLC分析被纯化。RP-HPLC显示两个洗脱峰(未显示)，其被认为是Al F IMP467的非对映体。支持该假设，当IMP 467在37℃孵育时，两个HLB峰之间似乎存在一
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些互交(未显示)。在如下论述的预靶向技术中，因为Al F-螯合剂复合物不是抗体结合的
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半抗原位点的一部分，所以非对映体的存在似乎不影响 F-标记的肽对患病组织的靶向。
[0324] 放射性标记肽的收率的对比
[0325] 在试图提高标记收率而同时保持体内稳定性时，合成了预靶向肽的三个NOTA衍生物(IMP 460、IMP 461和IMP 467)。在这些衍生物中，IMP 467是其它肽标记收率的近二倍(表5)。表5中所有的标记研究以相同摩尔数的肽和铝进行。表5所示的结果代表每个肽的示例性标记实验。
[0326] 当仅40nmol的IMP 467(约为IMP 449的1/13)与1.3GBq(35mCi)18F一起使用18 18
时，IMP 467的 F-标记收率为～70%，表明该配体提高了Al F复合物的结合性质。通过增强配体结合的动力学，相对于IMP 449(520nmol．44%收率)，尽管使用较少摩尔的IMP
467(40nmol)但收率明显提高(平均65-75%收率)。
时，IMP 467的 F-标记收率为～70%，表明该配体提高了Al F复合物的结合性质。通过增强配体结合的动力学，相对于IMP 449(520nmol．44%收率)，尽管使用较少摩尔的IMP
467(40nmol)但收率明显提高(平均65-75%收率)。
[0327] 表5.含有不同NOTA的肽的收率对比
[0328]肽 收率
IMP 449 44%
IMP 460 5.8%
IMP 461 31%
IMP 497 87%
IMP 449 44%
IMP 460 5.8%
IMP 461 31%
IMP 497 87%
[0329] 实施例14.使用18F-标记的IMP 467在携带LS174T肿瘤的裸小鼠中的预靶向生物分布
[0330] 将以上述相同方式制备的18F-标记的IMP 467肽稀释，用于注射到携带LS174T肿18
瘤的裸小鼠中。制备Al F-IMP 467并注射到裸小鼠中，并且在1.5h后解剖该小鼠。表6
18
显示使用TF2预靶向方案的 F-标记的IMP 467的生物分布。与IMP 449类似，单独的肽
18 18 18
从血液和机体快速清除(未显示)。与 F或Al F相比在骨中的低吸收说明Al F螯合剂的稳定性及其适合预靶向(未显示)。与IMP 449一样，使用TF2双特异性抗体和标记IMP
467的预靶向分布主要限于肿瘤和肾，骨或其它正常组织具有非常少的分布(表6)。利用
18
F-标记的IMP467的成像研究报告如下。数据表明AIF-18IMP467在体内是稳定的，并且肽靶向肿瘤表面的抗体。
瘤的裸小鼠中。制备Al F-IMP 467并注射到裸小鼠中，并且在1.5h后解剖该小鼠。表6
18
显示使用TF2预靶向方案的 F-标记的IMP 467的生物分布。与IMP 449类似，单独的肽
18 18 18
从血液和机体快速清除(未显示)。与 F或Al F相比在骨中的低吸收说明Al F螯合剂的稳定性及其适合预靶向(未显示)。与IMP 449一样，使用TF2双特异性抗体和标记IMP
467的预靶向分布主要限于肿瘤和肾，骨或其它正常组织具有非常少的分布(表6)。利用
18
F-标记的IMP467的成像研究报告如下。数据表明AIF-18IMP467在体内是稳定的，并且肽靶向肿瘤表面的抗体。
[0331] 表6.携带LS174T肿瘤的裸小鼠中TF2预靶向的生物分布：
[0332]
[0333] 实施例15.影响IMP 467标记的收率和稳定性的因素
[0334] 肽浓度18
[0335] 为了检查各种肽浓度对收率的影响，在恒定体积(63μL)中测定了Al F与肽结合3+ 18
的量，使用恒定量的Al (6nmol)和 F，但是添加的肽量不同。标记的肽IMP 467的收率随如下肽浓度的降低而下降：40nmol肽(82%收率)、30nmol(79%收率)、20nmol(75%收率)、
10nmol(49%收率)。因此，在20至40nmol之间改变肽量对IMP 467收率影响很小。然而，在标记混合物中从10nmol肽开始观察到下降的收率。
的量，使用恒定量的Al (6nmol)和 F，但是添加的肽量不同。标记的肽IMP 467的收率随如下肽浓度的降低而下降：40nmol肽(82%收率)、30nmol(79%收率)、20nmol(75%收率)、
10nmol(49%收率)。因此，在20至40nmol之间改变肽量对IMP 467收率影响很小。然而，在标记混合物中从10nmol肽开始观察到下降的收率。
[0336] 铝浓度3+
[0337] 当IMP 467在增加量的Al (0、5、10、15、20μL pH 4乙酸盐缓冲液中2mM Al，并保持总体积恒定)存在下被标记时，分别达到3.5%、80%、77%、78%和74%的收率。这些结果3+ 3+
表明，(a)在Al 缺乏下，18F对该肽的非特异性结合最小，(b)10nmol Al 足以实现最大的
18 3+
F-结合，并且(C)更高量的Al 不显著减少结合，表明在该肽浓度下足够的螯合能力。
18
表明，(a)在Al 缺乏下，18F对该肽的非特异性结合最小，(b)10nmol Al 足以实现最大的
18 3+
F-结合，并且(C)更高量的Al 不显著减少结合，表明在该肽浓度下足够的螯合能力。
18
[0338] Al F IMP 467放射性标记的动力学
[0339] 动力学研究显示，结合在107℃在5分钟内完成(5分钟，68%；10分钟，61%；15分钟，71%；和30分钟，75%)，而反应时间长达30分钟时分离的收率仅适度增加。
[0340] 50℃下进行的IMP 467的放射性标记反应显示，在较低温度下未实现结合。
[0341] pH的影响
[0342] 进行标记的最佳pH为4.3至5.5。收率范围从pH 2.88下的54%；pH 3.99下的70-77%；pH 5下的70%；pH 6下的41%至pH 7.3下的3%。该过程可通过利用硝酸盐或氯离子而非碳酸盐离子从阴离子交换柱洗脱来加速，这消除了对在与AlCl3混合之前用冰醋酸将洗脱液调整至pH 4的需要。
[0343] IMP 467的高剂量放射性标记3+ 18
[0344] 将5毫升2mM Al 储液与50μL F 1.3GBq(35mCi)混合，随后添加20μL 0.1mM pH 4.1乙酸盐缓冲液中的2mM IMP 467。反应溶液被加热至104℃持续15分钟，然后如上所述在HLB柱上纯化(～10分钟)，以69%放射性化学收率分离0.68GBq(18.4mCi)纯化肽，比活度为17GBq/μmol(460Ci/mmol)。反应时间为15分钟并且纯化时间为12分钟。反18 18
应在1.3GBq(35mCi) F被纯化之后10分钟开始，所以从分离 F到纯化的终产物的总时间是37分钟，未校正衰减的收率是52%。
应在1.3GBq(35mCi) F被纯化之后10分钟开始，所以从分离 F到纯化的终产物的总时间是37分钟，未校正衰减的收率是52%。
[0345] 人血清稳定性测试
[0346] 等份的HLB纯化肽(～30μL)用200μL人血清(之前被冷冻)稀释并置于37℃HPLC样品室中。在不同时间点取出等份并通过HPLC分析。HPLC分析显示，血清中
18 18
F-标记的肽在37℃至少5小时非常高的稳定性(未显示)。 F-标记的肽在血清中孵育
5小时后没有可检测的分解(未显示)。
18 18
F-标记的肽在37℃至少5小时非常高的稳定性(未显示)。 F-标记的肽在血清中孵育
5小时后没有可检测的分解(未显示)。
[0347] IMP 461和IMP 462配体具有可用于结合铝的两个羧基，而IMP467中的NOTA配体具有四个羧基。血清稳定性研究显示，具有IMP467的复合物在模拟体内使用的条件下在血18
清中是稳定的。而且，对标记IMP 467的体内生物分布研究显示，F-Al标记肽在实际的体内条件下是稳定的。
清中是稳定的。而且，对标记IMP 467的体内生物分布研究显示，F-Al标记肽在实际的体内条件下是稳定的。
[0348] 肽可以通过形成Al18F复合物用18F快速(30分钟)且高收率地标记，Al18F复合物18
可以结合至肽上的NOTA配体，比活度为至少17GBq/μmol，无需HPLC纯化。Al F NOTA-肽在血清中和体内是稳定的。NOTA配体的修饰可以导致收率和比活度的提高，而依然保持
18
Al F-NOTA复合物的期望的体内稳定性，并在肽的肾清除中与亲水接头助剂连接。而且，该
18 18
方法避免了用 F标记肽所常用的离心干燥步骤。如下实施例所示，该新的 F-标记方法适用于标记范围广泛的靶向肽。
可以结合至肽上的NOTA配体，比活度为至少17GBq/μmol，无需HPLC纯化。Al F NOTA-肽在血清中和体内是稳定的。NOTA配体的修饰可以导致收率和比活度的提高，而依然保持
18
Al F-NOTA复合物的期望的体内稳定性，并在肽的肾清除中与亲水接头助剂连接。而且，该
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方法避免了用 F标记肽所常用的离心干燥步骤。如下实施例所示，该新的 F-标记方法适用于标记范围广泛的靶向肽。
[0349] Al18F IMP 467的最佳标记
[0350] 鉴定用于IMP 467的18F标记的最佳条件。这些条件包括利用商业无菌盐水(pH18
5-7)洗脱 F-氟化物，将其在100μL的总体积中与20nmol AlCl3和40nmol IMP 467于pH
4醋酸盐中混合，加热至102℃持续15分钟，然后进行SPE分离。在单步骤(简单固相提取(SPE)分离后的30分钟的程序，而无需进行HPLC纯化)中对于IMP 467获得高收率(85%)
18
和高比活度(115GBq/μmol)。 F-IMP 467在PBS或人血清中是稳定的，在37℃于任一介
18
质中孵育6小时后，损失2%的 F。
5-7)洗脱 F-氟化物，将其在100μL的总体积中与20nmol AlCl3和40nmol IMP 467于pH
4醋酸盐中混合，加热至102℃持续15分钟，然后进行SPE分离。在单步骤(简单固相提取(SPE)分离后的30分钟的程序，而无需进行HPLC纯化)中对于IMP 467获得高收率(85%)
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和高比活度(115GBq/μmol)。 F-IMP 467在PBS或人血清中是稳定的，在37℃于任一介
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质中孵育6小时后，损失2%的 F。
[0351] 18F的浓度和纯化
[0352] 放射化学级18F在使用前需要纯化和浓缩。我们检查了4个不同的SPE纯化程序以18 18
在其使用之前处理 F。使用通过常规方法制备的 F进行大部分放射性标记程序。将2mL
18 TM
的水中的 F加载至 上，用10mL 0.4M KHCO3预洗涤Waters Accell QMAPlus
18
柱，然后利用10mL水进行洗涤。在将 F加载至柱上后，用5mL水洗涤以除去任何溶解的金属和放射性金属杂质。随后用~1mL的几个级分中的0.4M KHCO3洗脱同位素以分离具有最高浓度的活度的级分。每100μL溶液用5μL冰醋酸中和洗脱的级分以将洗脱液调节至pH
4-5。
在其使用之前处理 F。使用通过常规方法制备的 F进行大部分放射性标记程序。将2mL
18 TM
的水中的 F加载至 上，用10mL 0.4M KHCO3预洗涤Waters Accell QMAPlus
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柱，然后利用10mL水进行洗涤。在将 F加载至柱上后，用5mL水洗涤以除去任何溶解的金属和放射性金属杂质。随后用~1mL的几个级分中的0.4M KHCO3洗脱同位素以分离具有最高浓度的活度的级分。每100μL溶液用5μL冰醋酸中和洗脱的级分以将洗脱液调节至pH
4-5。
[0353] 在第二步骤中，用10mL pH 8.4，0.5M NaOAc，然后用10mL DI H2O洗涤QMA柱。如上所述将18F加载至柱上，然后用1mL，pH 6的200-μL级分(所述级分之一中具有60-70%的活度)中的0.05MKNO3洗脱。不必调节该溶液的pH。
[0354] 在第三步骤中，用10mL pH 8.4，0.5M NaOAc，然后用10mL DI H2O洗涤QMA柱。如18
上所述将 F加载至柱上，然后用1mL，pH 5-7的200-μL级分(所述级分之一中具有80%的活度)中的0.154M商业生理盐水洗脱。不必调节该溶液的pH。
上所述将 F加载至柱上，然后用1mL，pH 5-7的200-μL级分(所述级分之一中具有80%的活度)中的0.154M商业生理盐水洗脱。不必调节该溶液的pH。
[0355] 最后，我们设计了使用串联离子交换制备更浓缩且高活度的18F溶液的方法。简而TM言之，将聚乙烯管(1.27cm长，0.64cm OD)插入TRICORN 5/20柱，填充~200μLAG 1-X8树脂，100-200目。用6mL0.4M K2CO3，然后用6mL H2O洗涤树脂。用DI H2O洗涤
TM 18
Waters ACCELL Plus CM柱。使用注射泵，将2mLDI H2O中5-mL注射器中接收的粗制 FTM
在5分钟的时间内缓慢流过CM柱和TRICORN 柱，然后用6mL DI H2O通过两个离子结合柱TM
进行洗涤。最后，将0.4M K2CO3以50-μL级分仅通过TRICORN 柱。通常，40至60%的洗脱活度存在于一个50-μL级分中。将所述级分收集在2.0mL含有5μL冰醋酸的自立螺旋帽微量离心管中以中和碳酸盐溶液。随后将具有最高活度的洗脱瓶用作反应瓶。
TM 18
Waters ACCELL Plus CM柱。使用注射泵，将2mLDI H2O中5-mL注射器中接收的粗制 FTM
在5分钟的时间内缓慢流过CM柱和TRICORN 柱，然后用6mL DI H2O通过两个离子结合柱TM
进行洗涤。最后，将0.4M K2CO3以50-μL级分仅通过TRICORN 柱。通常，40至60%的洗脱活度存在于一个50-μL级分中。将所述级分收集在2.0mL含有5μL冰醋酸的自立螺旋帽微量离心管中以中和碳酸盐溶液。随后将具有最高活度的洗脱瓶用作反应瓶。
[0356] 实施例16.IMP 470的合成和标记
[0357] IMP 470L-NETA-琥珀酰基-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:30)[0358] 通过以所示顺序将下述氨基酸添加至树脂来在Sieber酰胺树脂上制备肽IMP 470：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 被 裂 解、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH。去除Aloc之后获得的游离胺与琥珀酸酐反应以在N末端产生羧酸基团，羧酸基团使用DMF中的DIC活化并随后与叔丁基保护的L-NETA偶联。
然后使肽从树脂上裂解并通过RP-HPLC纯化以产生16.4mg IMP 470。还获得了对应于无L-NETA肽的分子量为1037.15的产物，且保留时间为9.001分钟。
然后使肽从树脂上裂解并通过RP-HPLC纯化以产生16.4mg IMP 470。还获得了对应于无L-NETA肽的分子量为1037.15的产物，且保留时间为9.001分钟。
[0359] 对于18F标记，向3μL 2mM AlCl3溶液中添加40μLF-18溶液[1.736mCi的18F]，随后添加20μL(40nmol)2mM IMP 470溶液，并加热至101℃持续15分钟。反相HPLC分析显示在26.10%(RT 8.90分钟)和47.29%(RT 9.30分钟)上的两个放射性标记的肽峰，并且26.61%的活度以柱的空隙容积洗脱(2.70分钟)(未显示)。
[0360] 通过HLB柱色谱纯化粗制标记的肽，用1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽。收集的790μCi代表65.83%的标记的肽的回收。
[0361] 60μLHLB柱纯化的18F-标记的肽与100μL人血清混合，且样品在整个RP-HPLC分18
析期间保持在37℃。 F-标记的IMP 470在血清中具有至少4小时的稳定性(未显示)。
析期间保持在37℃。 F-标记的IMP 470在血清中具有至少4小时的稳定性(未显示)。
[0362] 实施例17.通过将18F添加至与铝预孵育的肽来标记
[0363] 含有与铝复合的大环NOTA连接的肽(IMP 465，NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D18
-Lys(HSG)-NH2)(SEQ ID NO:31)的HSG用F-18成功标记。使用40nmol IMP 465的 F并入是13.20%。如上所述制备中间体肽IMP 461。然后将25.7mg IMP 461溶解于2mLDI水，向其中添加10.2mg AlCl3.6H2O，并且将得到的溶液加热至100℃持续1h。粗制反应混合物通过RP-HPLC纯化以产生19.6mg IMP465。
-Lys(HSG)-NH2)(SEQ ID NO:31)的HSG用F-18成功标记。使用40nmol IMP 465的 F并入是13.20%。如上所述制备中间体肽IMP 461。然后将25.7mg IMP 461溶解于2mLDI水，向其中添加10.2mg AlCl3.6H2O，并且将得到的溶液加热至100℃持续1h。粗制反应混合物通过RP-HPLC纯化以产生19.6mg IMP465。
[0364] 对于18F标记，将50μL 18F溶液[0.702mCi的18F]和20μL(40nmol)2mM IMP 465溶液(0.1M NaOAc，pH 4.18)加热至101℃进行17分钟。反相HPLC分析显示15.38%(RT下约8.60分钟)的活度被连接至肽并且在84.62%的活度被洗脱在柱的空隙容积中(2.60分钟)。
[0365] 在单独实验中，18F-标记的肽的百分比收率可以通过改变添加的肽的量而提高。观察到的百分比收率对于IMP 465在10nmol肽时是0.27％，在20nmol肽时是1.8％，并且在40nmol肽时是49%。
[0366] IMP 467显示当肽在暴露于18F之前与铝预孵育时，收率比IMP461更高。IMP 467在室温下与铝孵育，然后冷冻并冻干。添加用于预孵育的铝的量是变化的。
[0367] 表7.添加18F之前与铝预孵育的IMP 467的标记
[0368] 预混合、冷冻和冻干的IMP 467+Al分离的标记收率
[0369] 40nmol IMP 467+10nmol Al预混合
[0370] 40nmol IMP 467+10nmol Al预混合
[0371] 40nmol IMP 467+20nmol Al预混合
[0372] 40nmol IMP 467+6nmol Al标准标记(首先混合Al+18F)77%
[0373] 收率与当通过添加Al18F复合物标记IMP 467而获得的那些相当。因此，通过向具18 18
有已经结合至螯合部分的铝的肽添加 F的 F标记是在添加螯合部分之前预孵育金属与
18
F的可行的替代方法。
有已经结合至螯合部分的铝的肽添加 F的 F标记是在添加螯合部分之前预孵育金属与
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F的可行的替代方法。
[0374] 实施例18.IMP 468铃蟾肽的合成与标记
[0375] 18F标记的靶向部分不限于抗体或抗体片段，而是可以包括特异性或选择性结合至18 18
与可通过 F PET成像的疾病或其它病症相关的或诊断可通过 F PET成像的疾病或其它病症的细胞靶的任何分子。铃蟾肽是与神经调节肽B和胃泌素释放肽以及癌症例如肺癌和胃癌以及成神经细胞瘤的肿瘤标志物同源的14个氨基酸的肽。IMP468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N H2；SEQ ID NO:32)作为铃蟾肽类似物合成
18
并用 F标记以靶向胃泌素释放肽受体。
与可通过 F PET成像的疾病或其它病症相关的或诊断可通过 F PET成像的疾病或其它病症的细胞靶的任何分子。铃蟾肽是与神经调节肽B和胃泌素释放肽以及癌症例如肺癌和胃癌以及成神经细胞瘤的肿瘤标志物同源的14个氨基酸的肽。IMP468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N H2；SEQ ID NO:32)作为铃蟾肽类似物合成
18
并用 F标记以靶向胃泌素释放肽受体。
[0376] 肽通过基于Fmoc的固相肽合成在Sieber酰胺树脂上合成，使用文献(Prasanphanich等，2007，PNAS USA 104:12463-467)报道的合成方案的改变形式。合成的不同在于，二-叔-丁基NOTA配体在树脂上肽合成过程中添加至肽。
[0377] IMP 468(0.0139g，1.02x10-5mol)溶解于203μL0.5M pH 4.13NaOAc缓冲液。肽溶解但静置形成凝胶，因此肽凝胶用609μL0.5MpH 4.13NaOAc缓冲液和406μL乙醇稀释以-3 18产生8.35x10 M肽溶液。 F在QMA柱上纯化并用0.4M KHCO3以200μL级分洗脱，用10μL
18
冰乙酸中和。将纯化的 F(40μL，1.13mCi)与3μLpH 4，0.1M NaOAc缓冲液中的2mM ALCL3-7 18
混合。将IMP 468(59.2μL，4.94x10 mol)添加至Al F溶液并置于108℃加热器中持续15
18
分钟。使粗制产物在HLB柱上纯化，用2x200μL1:1EtOH/H2O洗脱以获得纯化的 F-标记的肽(34%收率)。
18
冰乙酸中和。将纯化的 F(40μL，1.13mCi)与3μLpH 4，0.1M NaOAc缓冲液中的2mM ALCL3-7 18
混合。将IMP 468(59.2μL，4.94x10 mol)添加至Al F溶液并置于108℃加热器中持续15
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分钟。使粗制产物在HLB柱上纯化，用2x200μL1:1EtOH/H2O洗脱以获得纯化的 F-标记的肽(34%收率)。
[0378] 实施例19.使用18F标记的铃蟾肽成像肿瘤
[0379] 如上所述制备NOTA-缀合的铃蟾肽衍生物(IMP 468)。我们开始测试其阻断放射性标记铃蟾肽与PC-3细胞结合的能力，如Prasanphanich等(PNAS 104:12462-12467，2007)所进行的。我们的初始实验是确定IMP 468是否能够特异性阻断铃蟾肽与PC-3细
6
胞结合。我们使用IMP 333作为非特异性对照。在该实验中，3x10PC-3细胞暴露于恒定量
125
(～50,000cpm)的 I-铃蟾肽(Perkin-Elmer)，向其中添加增加量的IMP 468或IMP333。
将56至0.44nM的范围用作我们的抑制浓度。
6
胞结合。我们使用IMP 333作为非特异性对照。在该实验中，3x10PC-3细胞暴露于恒定量
125
(～50,000cpm)的 I-铃蟾肽(Perkin-Elmer)，向其中添加增加量的IMP 468或IMP333。
将56至0.44nM的范围用作我们的抑制浓度。
[0380] 结果显示，我们可以用IMP 468而不是用对照肽(IMP333)阻断125I-BBN的结合(未显示)，因此说明了IMP 468的特异性。Prasanphanich指示其肽的IC50为3.2nM，这为我们对于IMP 468所发现的IC50(21.5nM)的约1/7。
[0381] 使用可商业途径获得的BBN肽重复该实验。我们增加了抑制肽的量从250至2nM125
的范围以阻断 I-BBN与PC-3细胞的结合。我们发现IMP 468和BBN阳性对照非常类似的IC50值，IC50值(35.9nM)比之前报道的(3.2nM)高，但是接近BBN对照所达到的(24.4nM)。
的范围以阻断 I-BBN与PC-3细胞的结合。我们发现IMP 468和BBN阳性对照非常类似的IC50值，IC50值(35.9nM)比之前报道的(3.2nM)高，但是接近BBN对照所达到的(24.4nM)。
[0382] 为了检查体内靶向，在携带scPC3前列腺癌异种移植物的雄性裸小鼠中检查了18
Al F IMP 468的分布；单独的与用铃蟾肽阻断的。对于放射性标记，氯化铝(10μL，2mM)、
18
51.9mCi F(来自QMA柱)、乙酸和60μLIMP 468(8.45mM于乙醇/NaOAc中)在100℃加热15分钟。反应混合物在反相HPLC上纯化。收集级分40和41(3.56，1.9l mci)并加至HLB柱用于溶剂交换。产物以800μL(3.98mCi)洗脱，910μCi保留在柱上。饱和NaCl中展开的ITLC显示0.1%未结合的活度。
Al F IMP 468的分布；单独的与用铃蟾肽阻断的。对于放射性标记，氯化铝(10μL，2mM)、
18
51.9mCi F(来自QMA柱)、乙酸和60μLIMP 468(8.45mM于乙醇/NaOAc中)在100℃加热15分钟。反应混合物在反相HPLC上纯化。收集级分40和41(3.56，1.9l mci)并加至HLB柱用于溶剂交换。产物以800μL(3.98mCi)洗脱，910μCi保留在柱上。饱和NaCl中展开的ITLC显示0.1%未结合的活度。
[0383] 向一组6只携带肿瘤的小鼠注射[Al18F]IMP 468(167μCi，～9x10-10mol)并在18 -8
1.5h后解剖。另一组6只小鼠在施用[Al F]IMP 468之前18分钟用100μg(6.2x10 mol)
18
铃蟾肽静脉内注射。第二组也在注射后1.5h解剖。数据显示[Al F]IMP 468对肿瘤的特
18
异性预靶向(图3)。当铃蟾肽在[Al F]IMP 468之前18分钟给予时，肽的肿瘤吸收减少
18
(图3)。生物分布数据指示[Al F]IMP 468至少1.5h的体内稳定性(未显示)。
1.5h后解剖。另一组6只小鼠在施用[Al F]IMP 468之前18分钟用100μg(6.2x10 mol)
18
铃蟾肽静脉内注射。第二组也在注射后1.5h解剖。数据显示[Al F]IMP 468对肿瘤的特
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异性预靶向(图3)。当铃蟾肽在[Al F]IMP 468之前18分钟给予时，肽的肿瘤吸收减少
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(图3)。生物分布数据指示[Al F]IMP 468至少1.5h的体内稳定性(未显示)。
[0384] 较大肿瘤显示[Al18F]IMP 468的较高吸收，可能由于较大肿瘤中较高的受体表达18
(未显示)。生物分布数据显示[Al F]IMP 468肿瘤靶向，其在与由Prasanphanich等报道
68 18
的对于用 Ga标记的相同肽所报道的相同的范围内(未显示)。结果说明，F肽标记方法可用于体内靶向在肿瘤中上调的受体，使用除了抗体以外的靶向分子。在这种情况下，IMP
468靶向利用天然存在的配体-受体相互作用。肿瘤靶向是显著的，P值为P=0.0013。许多此类配体-受体对是己知的，并且任何此类靶向相互作用可以形成使用本文描述的方法
18
进行 F-成像的基础。
(未显示)。生物分布数据显示[Al F]IMP 468肿瘤靶向，其在与由Prasanphanich等报道
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的对于用 Ga标记的相同肽所报道的相同的范围内(未显示)。结果说明，F肽标记方法可用于体内靶向在肿瘤中上调的受体，使用除了抗体以外的靶向分子。在这种情况下，IMP
468靶向利用天然存在的配体-受体相互作用。肿瘤靶向是显著的，P值为P=0.0013。许多此类配体-受体对是己知的，并且任何此类靶向相互作用可以形成使用本文描述的方法
18
进行 F-成像的基础。
[0385] 实施例20.生长抑素类似物IMP 466的合成和标记
[0386] 生长抑素是用于成像生长抑素受体蛋白分布的另一种非抗体靶向肽。123I-标记的奥曲肽(生长抑素类似物)已经用于成像表达生长抑素受体的肿瘤(例如，Kvols等，1993，123
Radiology 187:129-33；Leitha等，1993，J Nucl Med 34:1397-1402)。然而，I还未广泛
18
用于成像，因为其昂贵、物理半衰期短和制备放射性标记化合物困难。本文描述的 F-标记方法对于表达生长抑素受体的肿瘤的成像是优选的。
Radiology 187:129-33；Leitha等，1993，J Nucl Med 34:1397-1402)。然而，I还未广泛
18
用于成像，因为其昂贵、物理半衰期短和制备放射性标记化合物困难。本文描述的 F-标记方法对于表达生长抑素受体的肿瘤的成像是优选的。
[0387] IMP 466 NOTA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl(SEQ ID NO:33)[0388] 生长抑素类似物奥曲肽(IMP 466)的NOTA-缀合的衍生物通过标准的基于Fmoc的固相肽合成来制备，以产生线性肽。C末端Throl残基是苏氨醇(threoninol)。该肽通过-6用DMSO处理过夜而环化。将0.0073g，5.59x10 mol的该肽溶解在111.9μL0.5M pH 4NaOAc缓冲液中以制备0.05M的IMP 466溶液。溶液随时间的推移形成凝胶，因此通过添加更多的0.5M NaOAc缓冲液来将其稀释至0.0125M。
[0389] 18F用QMA柱纯化并浓缩以提供200μL在0.4M KHCO3中的18F。碳酸氢盐溶液18
用10μL冰乙酸中和。将40μL等份的中和的 F洗脱液与3μL 2mM AlCl3混合，随后添加40μL 0.0125M IMP 466溶液。将混合物在105℃加热17分钟。然后将反应物在
18
Waters1cc(30mg)HLB柱上纯化，通过将反应溶液加载至柱并用水(3mL)洗掉未结合的 F，然后用2x200μL 1:1EtOH水洗脱放射性标记的肽。HLB纯化后放射性标记的肽的收率是
34.6%。
用10μL冰乙酸中和。将40μL等份的中和的 F洗脱液与3μL 2mM AlCl3混合，随后添加40μL 0.0125M IMP 466溶液。将混合物在105℃加热17分钟。然后将反应物在
18
Waters1cc(30mg)HLB柱上纯化，通过将反应溶液加载至柱并用水(3mL)洗掉未结合的 F，然后用2x200μL 1:1EtOH水洗脱放射性标记的肽。HLB纯化后放射性标记的肽的收率是
34.6%。
[0390] 离子强度的影响
[0391] 为了降低反应混合物的离子强度，向标记混合物中加入递增量的乙腈(终浓度：0-80%)。放射性标记的IMP 466的收率随介质中乙腈浓度的增加而增加。在80%乙腈的终浓度中获得最佳放射性标记收率(98%)，尽管体积增加(500μL于80%中与200μL于0%乙腈中)。在0%乙腈中，在3个实验中放射性标记收率的范围为36%至55%。
[0392] 实施例21.利用18F-标记的IMP 466和68Ga-标记的IMP 466对神经内分泌肿瘤成像
[0393] 进行研究以对比使用18F-标记的生长抑素类似物肽与68Ga-标记的生长抑素类似物肽并直接靶向表达生长抑素受体的肿瘤而获得的PET图像。
[0394] 方法
[0395] 18F标记-如上实施例所述，通过多种方法合成IMP 466并进行18F-标记。用18
3mL无金属水洗涤具有的2-6GBq F(BV Cyclotron VU，Amsterdam，The Netherlands)的
18
QMA 柱(Waters，Milford，MA)。 F用0.4M KHCO3从柱洗脱，收集200μL的
级分。用10μL无金属冰醋酸将级分的pH调节至pH 4。加3μL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH
4)中的2mM AlCl3。随后，在0.5M醋酸钠(pH 4.1)中添加10-50μL IMP 466(10mg/mL)。
除非另外说明，否则将反应混合物在100℃孵育15分钟。在RP-HPLC上纯化放射性标记
18
的肽。收集含 F-IMP 466的级分，用H2O将其稀释2倍，在1-cc Oasis HLB柱(Waters，Milford，MA)上纯化以除去乙腈和TFA。简而言之，将级分用于柱上，用3mL H2O洗涤柱。随后用2x200μL 50%乙醇洗脱放射性标记的肽。为了注射到小鼠，用0.9%NaCl稀释肽。获得45,000GBq/mmol的最大比活度。
3mL无金属水洗涤具有的2-6GBq F(BV Cyclotron VU，Amsterdam，The Netherlands)的
18
QMA 柱(Waters，Milford，MA)。 F用0.4M KHCO3从柱洗脱，收集200μL的
级分。用10μL无金属冰醋酸将级分的pH调节至pH 4。加3μL 0.1M醋酸钠缓冲液(pH
4)中的2mM AlCl3。随后，在0.5M醋酸钠(pH 4.1)中添加10-50μL IMP 466(10mg/mL)。
除非另外说明，否则将反应混合物在100℃孵育15分钟。在RP-HPLC上纯化放射性标记
18
的肽。收集含 F-IMP 466的级分，用H2O将其稀释2倍，在1-cc Oasis HLB柱(Waters，Milford，MA)上纯化以除去乙腈和TFA。简而言之，将级分用于柱上，用3mL H2O洗涤柱。随后用2x200μL 50%乙醇洗脱放射性标记的肽。为了注射到小鼠，用0.9%NaCl稀释肽。获得45,000GBq/mmol的最大比活度。
[0396] 68Ga标记-使用0.1M超纯HCl(J.T．Baker，Deventer，The Netherlands)从基于68 68 68
TiO2的1,110MBq Ge/ Ga生成器(Cyclotron Co.Ltd.，Obninsk，Russia)洗脱的 GaCl3标
68
记IMP 466。将IMP 466溶解在1.0M HEPES缓冲液，pH7.0中。添加四倍柱体积 Ga洗脱液(120-240MBq)，将混合物在95℃加热20分钟。然后添加50mM EDTA至终浓度5mM以复
68 3+ 68
合未并入的 Ga 。 Ga-标记的IMP 466在OasisHLB柱上纯化并用50%乙醇洗脱。
TiO2的1,110MBq Ge/ Ga生成器(Cyclotron Co.Ltd.，Obninsk，Russia)洗脱的 GaCl3标
68
记IMP 466。将IMP 466溶解在1.0M HEPES缓冲液，pH7.0中。添加四倍柱体积 Ga洗脱液(120-240MBq)，将混合物在95℃加热20分钟。然后添加50mM EDTA至终浓度5mM以复
68 3+ 68
合未并入的 Ga 。 Ga-标记的IMP 466在OasisHLB柱上纯化并用50%乙醇洗脱。
[0397] 辛醇-水分配系数(logP辛醇/水)-为了确定放射性标记肽的亲油性，将大约50,000dpm的放射性标记肽稀释于0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)。添加等体积的辛醇以获得双相系统。涡旋系统2分钟后，通过离心(100xg，5分钟)分离两个层。从每层取三个
100μL样品，在井型γ计数器(Wallac Wizard 3”，Perkin-Elmer，Waltham，MA)中测量放射性。
100μL样品，在井型γ计数器(Wallac Wizard 3”，Perkin-Elmer，Waltham，MA)中测量放射性。
[0398] 稳定性-10μL18F-标记的IMP 466在500μL新鲜收集的人血清中孵育并在37℃下孵育4h。添加乙腈，且将混合物涡旋，随后在1000xg离心5分钟以沉淀血清蛋白。如上所述在RP-HPLC上分析上清液。
[0399] 细胞培养-AR42J大鼠胰腺肿瘤细胞系在补充有4500mg/L D-葡萄糖、10%(v/v)胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)培养基(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)中培养。细胞在5%CO2下加湿环境中37℃下培养。
[0400] IC50确 定-在 使 用19F-IMP 466、69Ga-IMP 466或115In-DTPA-奥 曲 肽 竞 争111
In-DTPA-奥曲肽的结合的竞争性结合测定中确定结合AR42J细胞上的生长抑素受体的表观50%抑制浓度(IC50)。
In-DTPA-奥曲肽的结合的竞争性结合测定中确定结合AR42J细胞上的生长抑素受体的表观50%抑制浓度(IC50)。
[0401] 通过将氟化铝(AlF)溶液(0.5M NaAc，pH 4中的0.02M AlCl3，0.5M NaAc，pH 419
中的0.1M NaF)与IMP 466混合并且在100℃加热15分钟来形成 F-IMP 466。如上所述，通过在C-18柱上进行RP-HPLC来纯化反应混合物。
中的0.1M NaF)与IMP 466混合并且在100℃加热15分钟来形成 F-IMP 466。如上所述，通过在C-18柱上进行RP-HPLC来纯化反应混合物。
[0402] 通过将硝酸镓(2.3x10-8mol)与20μl的10mM NaAc(pH 5.5)中的IMP 466(1mg/69
mL)在30μL体积中混合溶解，在90℃加热15分钟来制备 Ga-IMP 466。使用混合物的样品而无需进一步纯化。
mL)在30μL体积中混合溶解，在90℃加热15分钟来制备 Ga-IMP 466。使用混合物的样品而无需进一步纯化。
[0403] 通过将氯化铟(1x10-5mol)与10μL的50mM NaAc(pH 5.5)中的DTPA-奥曲肽115
(1mg/mL)混合，在室温下(RT)孵育15分钟来制备 In-DTPA-奥曲肽。可使用该样品而无需进一步纯化。按照制造商的方案放射性标记111In-DTPA-奥曲肽
(1mg/mL)混合，在室温下(RT)孵育15分钟来制备 In-DTPA-奥曲肽。可使用该样品而无需进一步纯化。按照制造商的方案放射性标记111In-DTPA-奥曲肽
[0404] 将AR42J细胞在12孔板中生长至汇合，用结合缓冲液(具有0.5%牛血清白蛋白的DMEM)洗涤2次。在RT下在结合缓冲液中孵育10分钟后，以范围为0.1至1000nM的终浓19 69 115 111
度将 F-IMP 466、Ga-IMP466或 In-DTPA-奥曲肽与痕量(10,000cpm)的 In-DTPA-奥曲肽(放射化学纯度>95%)一起添加。在RT下孵育3小时后，用冷PBS洗涤细胞2次。刮取细胞，测定细胞结合的放射性。在这些条件下，可发生有限程度的内化。我们因而将该竞争性结合测定的结果描述为“表观IC50”值而非IC50。表观IC50定义为在无竞争剂的情况下达到50%的结合时的肽浓度。
7
度将 F-IMP 466、Ga-IMP466或 In-DTPA-奥曲肽与痕量(10,000cpm)的 In-DTPA-奥曲肽(放射化学纯度>95%)一起添加。在RT下孵育3小时后，用冷PBS洗涤细胞2次。刮取细胞，测定细胞结合的放射性。在这些条件下，可发生有限程度的内化。我们因而将该竞争性结合测定的结果描述为“表观IC50”值而非IC50。表观IC50定义为在无竞争剂的情况下达到50%的结合时的肽浓度。
7
[0405] 生物分布研究-雄性BALB/c裸小鼠(6-8周)用0.2mL AR42J细胞悬浮液(10 个细胞/mL)在右肋腹皮下注射。在肿瘤细胞接种后大约两周，此时肿瘤直径为5-8mm，静脉内18 68
施用(n=5)370kBq F-标记的IMP466或 Ga-标记的IMP 466。单独的组(n=5)用1,000
18
倍摩尔过量的未标记IMP 466注射。一组三只动物注射未螯合的[Al F]。所有小鼠在注射后(p.i.)2h通过CO2/O2窒息而处死。收集目标器官、称重并在γ计数器中计数。计算每个组织的每克组织注射剂量的百分比(%ID/g)。动物实验由当地动物福利委员会批准并根据国家法规进行。
18
施用(n=5)370kBq F-标记的IMP466或 Ga-标记的IMP 466。单独的组(n=5)用1,000
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倍摩尔过量的未标记IMP 466注射。一组三只动物注射未螯合的[Al F]。所有小鼠在注射后(p.i.)2h通过CO2/O2窒息而处死。收集目标器官、称重并在γ计数器中计数。计算每个组织的每克组织注射剂量的百分比(%ID/g)。动物实验由当地动物福利委员会批准并根据国家法规进行。
18
[0406] PET/CT成像-向具有s.c.AR42J肿瘤的小鼠静脉内注射10MBqAl F-IMP 466或68
Ga-IMP 466。肽注射后1小时和2小时，小鼠在Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)上扫描，固有的空间分辨率为1.5mm(Visser等，JNM，2009)。动物以仰卧位放到扫描仪中。经15分钟获得PET发射扫描，随后CT扫描用于解剖参考(空间分辨率113μm，80kV，500μA)。使用Inveon Acquisition Workplace软件版本1.2(Siemens PreclinicalSolutions，Knoxville，TN)重建扫描，使用有序集预期最大化-3D/最大后验(OSEM3D/MAP)算法，具有下述参数：矩阵256x256x159，像素大小
3
0.43x0.43x0.8mm 和先验MAP 0.5mm。
Ga-IMP 466。肽注射后1小时和2小时，小鼠在Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)上扫描，固有的空间分辨率为1.5mm(Visser等，JNM，2009)。动物以仰卧位放到扫描仪中。经15分钟获得PET发射扫描，随后CT扫描用于解剖参考(空间分辨率113μm，80kV，500μA)。使用Inveon Acquisition Workplace软件版本1.2(Siemens PreclinicalSolutions，Knoxville，TN)重建扫描，使用有序集预期最大化-3D/最大后验(OSEM3D/MAP)算法，具有下述参数：矩阵256x256x159，像素大小
3
0.43x0.43x0.8mm 和先验MAP 0.5mm。
[0407] 结果
[0408] 缓冲液的影响-调查了缓冲液对IMP 466标记效率的影响。IMP466以10mg/mL(7.7mM)溶解于柠檬酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液。所有缓冲液的摩尔浓度是1M，pH是4.1。向200μg(153nmol)IMP 466中加入100μL Al-F-18(pH 4)并在100℃孵育15分钟。使用RP-HPLC确定放射性标记收率和比活度。当使用乙酸钠、MES或HEPES时，放射性标记收率分别是49%、44%和46%。在柠檬酸钠存在时，没有观察到标记(<1%)。当标记反应在乙酸钠缓冲液中进行时，制剂的比活度是10,000GBq/mmol，而在MES和HEPES缓冲液中分别获得
20,500和16,500GBq/mmol的比活度。
20,500和16,500GBq/mmol的比活度。
[0409] AlCl3浓度的影响-制备了AlCl3在乙酸钠中的三种储液(pH 4.1)：0.2、2.0和18 18
20mM。从这些溶液中，将3μL添加至200μL F以形成[Al F]。向这些样品中，添加153nmol肽并在100℃下孵育15分钟。以6nmol AlCl3的终浓度孵育后放射性标记收率是49％。与
0.6nmolAlCl3和60nmol AlCl3孵育导致放射性标记收率显著下降：分别是10％和6％。
20mM。从这些溶液中，将3μL添加至200μL F以形成[Al F]。向这些样品中，添加153nmol肽并在100℃下孵育15分钟。以6nmol AlCl3的终浓度孵育后放射性标记收率是49％。与
0.6nmolAlCl3和60nmol AlCl3孵育导致放射性标记收率显著下降：分别是10％和6％。
[0410] 肽量的影响-调查了肽量对标记效率的影响。IMP 466以7.7mM(10mg/mL)的浓度18
溶解于乙酸钠缓冲液(pH 4.1)，并且将38、153或363nmol IMP 466添加至200μL[Al F](581-603MBq)。放射性标记收率随肽量的增加而增加。在38nmol时放射性标记收率范围
4-8％，在153nmol时收率增加至42-49％，并且在最高浓度时放射性标记收率为48-52％。
溶解于乙酸钠缓冲液(pH 4.1)，并且将38、153或363nmol IMP 466添加至200μL[Al F](581-603MBq)。放射性标记收率随肽量的增加而增加。在38nmol时放射性标记收率范围
4-8％，在153nmol时收率增加至42-49％，并且在最高浓度时放射性标记收率为48-52％。
[0411] 辛醇-水分配系数-为了确定18F和68Ga-标记的IMP 466的亲油性，测定了辛18 68
醇-水分配系数。Al F-IMP 466的log P辛醇/水值是-2.44±0.12，并且 Ga-IMP 466的
18
logP辛醇/水值是-3.79±0.07，表明 F-标记的IMP466亲水性略低。
醇-水分配系数。Al F-IMP 466的log P辛醇/水值是-2.44±0.12，并且 Ga-IMP 466的
18
logP辛醇/水值是-3.79±0.07，表明 F-标记的IMP466亲水性略低。
[0412] 稳定性-在人血清中37℃孵育4h后18F-标记的IMP 466不显示18F的释放，表明18
Al F-NOTA复合物的优良稳定性。
Al F-NOTA复合物的优良稳定性。
[0413] IC50确定-Al19F-标记的IMP 466的表观IC50为3.6±0.6nM，而69Ga-标记的IMP466的表观IC50为13±3nM。参照肽115In-DTPA-奥曲肽 的表观IC50为
6.3±0.9nM。
6.3±0.9nM。
[0414] 生物分布研究-在具有s.c. AR42J肿瘤的BALB/c裸小鼠中研究注射后2h的18 68 18 18
Al F-IMP 466和 Ga-IMP 466两者的生物分布(图4)。Al F作为对照被包括。 F-IMP466的肿瘤靶向高，在注射后2h累积28.3±5.7％ID/g。在过量未标记IMP 466存在下的吸收是8.6±0.7％ID/g，表明肿瘤吸收是受体介导的。血液水平非常低(0.10±0.07％ID/g，注射后2h)，导致肿瘤与血液比为299±88。器官中的吸收低，在表达受体的器官(例如肾上
8 18
腺、胰腺和胃)中特异性吸收。AlF-IMP466的骨吸收与非螯合Al F相比可忽略不计(注
18
射后2h分别是0.33±0.07与36.9±5.0％ID/g)，表明 F-标记的NOTA-肽的良好体内稳定性。
18 68
Al F-IMP 466和 Ga-IMP 466两者的生物分布(图4)。Al F作为对照被包括。 F-IMP466的肿瘤靶向高，在注射后2h累积28.3±5.7％ID/g。在过量未标记IMP 466存在下的吸收是8.6±0.7％ID/g，表明肿瘤吸收是受体介导的。血液水平非常低(0.10±0.07％ID/g，注射后2h)，导致肿瘤与血液比为299±88。器官中的吸收低，在表达受体的器官(例如肾上
8 18
腺、胰腺和胃)中特异性吸收。AlF-IMP466的骨吸收与非螯合Al F相比可忽略不计(注
18
射后2h分别是0.33±0.07与36.9±5.0％ID/g)，表明 F-标记的NOTA-肽的良好体内稳定性。
18 68
[0415] Al F-IMP 466的生物分布与 Ga-IMP 466的生物分布相比较(图4)。68 18
Ga-IMP466(29.2±0.5%ID/g，注射后2h)的肿瘤吸收类似于Al F-IMP 466(p<0.001)。
68 18
Ga-IMP466的肺吸收为 F-IMP 466两倍(分别是4.0±0.9%ID/g与1.9±0.4%ID/
68 18
g)。此外，Ga-IMP 466的肾保留比Al F-IMP 466略高(分别是16.2±2.86%ID/g与
9.96±1.27%ID/g)。
18
Ga-IMP466(29.2±0.5%ID/g，注射后2h)的肿瘤吸收类似于Al F-IMP 466(p<0.001)。
68 18
Ga-IMP466的肺吸收为 F-IMP 466两倍(分别是4.0±0.9%ID/g与1.9±0.4%ID/
68 18
g)。此外，Ga-IMP 466的肾保留比Al F-IMP 466略高(分别是16.2±2.86%ID/g与
9.96±1.27%ID/g)。
18
[0416] 合并的PET和CT扫描示于图5。PET扫描证实了生物分布数据。Al F-IMP 466和68
Ga-IMP 466都显示在肿瘤中的高吸收和在肾中的保留。肾中的活度主要集中在肾皮质。
再次，证明Al18F被NOTA螯合剂稳定螯合，因为没有观察到骨吸收。
18 68
Ga-IMP 466都显示在肿瘤中的高吸收和在肾中的保留。肾中的活度主要集中在肾皮质。
再次，证明Al18F被NOTA螯合剂稳定螯合，因为没有观察到骨吸收。
18 68
[0417] 图5清楚显示，生长抑素(奥曲肽)的 F-标记的类似物的分布模拟 Ga-标记的生长抑素类似物的分布。这些结果是显著的，因为已经显示在具有神经内分泌肿瘤的人受68
试者中的 Ga-标记的奥曲肽PET成像与常规生长抑素受体闪烁扫描术和诊断CT相比具有显著更高的检出率，灵敏度为97%，特异性为92%和准确度为96%(例如，Gabriel等，2007，J
68 111
Nucl Med 48:508-18)。据报道，Ga-标记的奥曲肽的PET成像优于 In-标记的奥曲肽的SPECT分析，并对检测甚至小的脑膜瘤高度灵敏(Henze等，2001，J Nucl Med 42:1053-56)。
68 18 18 68
因为 Ga与 F相比具有更高的能量，预期基于 F的PET成像将显示甚至比基于 Ga的PET
18 68
成像更高的空间分辨率。这通过比较使用 F-标记的IMP466(图5，左)与 Ga-标记的IMP
68 18
466(图5，右)获得的肾图像而在图5中说明。使用 Ga获得的PET图像比用 F获得的图像显示更发散的边缘和更低的分辨率。这些结果证明了使用本文所述方法和组合物制备的
18 18
F-标记的靶向部分获得的优质图像，并证实了所述 F标记技术用于非抗体靶向肽的实用性。
试者中的 Ga-标记的奥曲肽PET成像与常规生长抑素受体闪烁扫描术和诊断CT相比具有显著更高的检出率，灵敏度为97%，特异性为92%和准确度为96%(例如，Gabriel等，2007，J
68 111
Nucl Med 48:508-18)。据报道，Ga-标记的奥曲肽的PET成像优于 In-标记的奥曲肽的SPECT分析，并对检测甚至小的脑膜瘤高度灵敏(Henze等，2001，J Nucl Med 42:1053-56)。
68 18 18 68
因为 Ga与 F相比具有更高的能量，预期基于 F的PET成像将显示甚至比基于 Ga的PET
18 68
成像更高的空间分辨率。这通过比较使用 F-标记的IMP466(图5，左)与 Ga-标记的IMP
68 18
466(图5，右)获得的肾图像而在图5中说明。使用 Ga获得的PET图像比用 F获得的图像显示更发散的边缘和更低的分辨率。这些结果证明了使用本文所述方法和组合物制备的
18 18
F-标记的靶向部分获得的优质图像，并证实了所述 F标记技术用于非抗体靶向肽的实用性。
[0418] 实施例22.使用预靶向进行68Ga和18F PET成像的对比
[0419] 我们比较了使用如上所述制备的双特异性TF2抗体预靶向的68Ga-或18F-标记的68 18
肽获得的PET图像。Ga(t1/2=68分钟)和 F(t1/2=110分钟)的半衰期符合放射性标记肽的
68 68 68
药物代谢动力学，因为在肿瘤中数小时内达到其最大累积。而且，Ga可容易获自 Ge/ Ga
18
生成器，而 F是在PET中最普遍使用和广泛可得的放射性核素。
肽获得的PET图像。Ga(t1/2=68分钟)和 F(t1/2=110分钟)的半衰期符合放射性标记肽的
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药物代谢动力学，因为在肿瘤中数小时内达到其最大累积。而且，Ga可容易获自 Ge/ Ga
18
生成器，而 F是在PET中最普遍使用和广泛可得的放射性核素。
[0420] 方法
[0421] 具有表达s.c.CEA的LS 174T肿瘤的小鼠静脉内接受TF2(6.0nmol；0.94mg)和68 18
5MBq Ga-标记的IMP 288(0.25nmol)或 F-标记的IMP 449(0.25nmol)，双特异性抗体和放射性标记肽注射之间间隔16小时。注射放射性标记肽之后1小时或2小时，获得PET/CT图像并确定放射性标记肽的生物分布。LS174T肿瘤中的吸收与s.c CEA-阴性SK-RC 52肿瘤中的吸收相比较。预靶向免疫PET成像与具有s.c.LS174T肿瘤和对侧感染大腿肌肉的
18
鼠中的 F-FDG-PET成像相比较。
5MBq Ga-标记的IMP 288(0.25nmol)或 F-标记的IMP 449(0.25nmol)，双特异性抗体和放射性标记肽注射之间间隔16小时。注射放射性标记肽之后1小时或2小时，获得PET/CT图像并确定放射性标记肽的生物分布。LS174T肿瘤中的吸收与s.c CEA-阴性SK-RC 52肿瘤中的吸收相比较。预靶向免疫PET成像与具有s.c.LS174T肿瘤和对侧感染大腿肌肉的
18
鼠中的 F-FDG-PET成像相比较。
[0422] IMP 288DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO:34)[0423] 预靶向-如上所述通过DNL方法制备双特异性TF2抗体。TF2是包含来自h679抗体的HSG结合Fab片段和两个来自hMN-14抗体的CEA结合Fab片段的三价双特异性抗体。DOTA缀合的含有HSG的肽IMP 288通过如上所述的肽合成来进行合成。如上所述合成的
18
IMP449肽含有1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)螯合部分以方便用 F标记。作为抗体组分的示踪剂，TF2通过iodogen方法(Fraker和Speck，1978，Biochem Biophys Res
125
Comm 80:849-57)用 I(Perkin Elmer，Waltham,MA)标记TF2至比活度为58MBq/nmol。
18
IMP449肽含有1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)螯合部分以方便用 F标记。作为抗体组分的示踪剂，TF2通过iodogen方法(Fraker和Speck，1978，Biochem Biophys Res
125
Comm 80:849-57)用 I(Perkin Elmer，Waltham,MA)标记TF2至比活度为58MBq/nmol。
[0424] IMP 288的标记-在严格的无金属条件下以32MBq/nmol的比活度用111
In(Covidien，Petten，The Netherlands)标记IMP 288，用于生物分布研究。用使用0.1M
68 68
超纯HCl从基于TiO的1,110MBq Ge/ Ga生成器(CyclotronCo.Ltd.，Obninsk Russia)洗
68
脱的 Ga标记IMP 288。收集五个1ml级分，且第二个级分用于标记肽。将一个体积的1.0M
68
HEPES缓冲液(pH 7.0)添加至3.4nmol IMP 288。添加四体积的 Ga洗脱液(380MBq)，将混合物加热至95℃持续20分钟。然后添加50mM EDTA至终浓度为5mM以复合非螯合的
68 3+ 68
Ga 。 Ga-标记的IMP 288肽在1-mL Oasis HLB-柱(Waters，Milford，MA)上纯化。在
68
用水洗涤柱后，用25%乙醇洗脱肽。用 Ga标记IMP 288的程序在45分钟内进行，制剂准备用于体内。
In(Covidien，Petten，The Netherlands)标记IMP 288，用于生物分布研究。用使用0.1M
68 68
超纯HCl从基于TiO的1,110MBq Ge/ Ga生成器(CyclotronCo.Ltd.，Obninsk Russia)洗
68
脱的 Ga标记IMP 288。收集五个1ml级分，且第二个级分用于标记肽。将一个体积的1.0M
68
HEPES缓冲液(pH 7.0)添加至3.4nmol IMP 288。添加四体积的 Ga洗脱液(380MBq)，将混合物加热至95℃持续20分钟。然后添加50mM EDTA至终浓度为5mM以复合非螯合的
68 3+ 68
Ga 。 Ga-标记的IMP 288肽在1-mL Oasis HLB-柱(Waters，Milford，MA)上纯化。在
68
用水洗涤柱后，用25%乙醇洗脱肽。用 Ga标记IMP 288的程序在45分钟内进行，制剂准备用于体内。
[0425] IMP 449的标记-IMP 449如上所述用18F标记。555-740MBq18F(B.V．Cyclotron18
VU，Amsterdam，The Netherlands)用0.4M KHCO3从QMA柱洗脱。Al F活度被添加至含有肽(230μg)和抗坏血酸(10mg)的管形瓶。将混合物在100℃孵育15分钟。反应混合物通过RP-HPLC纯化。在添加一体积水之后，肽在1-mL Oasis HLB柱上纯化。在用水洗涤之
18
后，放射性标记的肽用50%乙醇洗脱。 F-IMP 449在60分钟内制备，制剂准备用于体内应用。
VU，Amsterdam，The Netherlands)用0.4M KHCO3从QMA柱洗脱。Al F活度被添加至含有肽(230μg)和抗坏血酸(10mg)的管形瓶。将混合物在100℃孵育15分钟。反应混合物通过RP-HPLC纯化。在添加一体积水之后，肽在1-mL Oasis HLB柱上纯化。在用水洗涤之
18
后，放射性标记的肽用50%乙醇洗脱。 F-IMP 449在60分钟内制备，制剂准备用于体内应用。
[0426] 研究中使用的125I-TF2、111In-和68Ga-IMP 288和Al18F-IMP 449的放射化学纯度经常超过95%。
[0427] 动物实验-实验在体重20-25克的雄性BALB/c裸小鼠(6-8周龄)中进行。小鼠6
接受了用0.2mL 1x10LS174T细脆悬浮液的皮下注射，LS174T细胞是一种表达CEA的人结肠癌细胞系(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA)。当肿瘤达到约0.1-0.3g的尺寸时(肿瘤接种后10-14天)，开始研究。
接受了用0.2mL 1x10LS174T细脆悬浮液的皮下注射，LS174T细胞是一种表达CEA的人结肠癌细胞系(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA)。当肿瘤达到约0.1-0.3g的尺寸时(肿瘤接种后10-14天)，开始研究。
[0428] TF2和IMP 288注射之间的间隔是16小时，因为该时段足以从循环中清除未结合125 111 68
的TF2。在一些研究中， I-TF2(0.4MBq)与未标记的TF2共注射。IMP 288用 In或 Ga
18 68
标记。IMP 449用 F标记。小鼠静脉内接受TF2和IMP 288(0.2mL)。 Ga-标记的肽注射
18
后1小时和 F-IMP 449注射后2小时，小鼠通过CO2/O2安乐死，并且通过心脏穿刺获得血液并解剖组织。
的TF2。在一些研究中， I-TF2(0.4MBq)与未标记的TF2共注射。IMP 288用 In或 Ga
18 68
标记。IMP 449用 F标记。小鼠静脉内接受TF2和IMP 288(0.2mL)。 Ga-标记的肽注射
18
后1小时和 F-IMP 449注射后2小时，小鼠通过CO2/O2安乐死，并且通过心脏穿刺获得血液并解剖组织。
[0429] 使用Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)获得PET图像。获取15分钟的PET发射扫描，之前通过CT扫描用于解剖参考(空间分辨率113μm，80kV，500μA，暴露时间300毫秒)。
[0430] 在成像后，解剖目标肿瘤和器官，称重和在γ计数器中利用125I、111In、68Ga或18F的适当能量窗口进行计数。计算每克组织的注射剂量百分比(%ID/g)。
[0431] 结果
[0432] 在1小时内，预靶向的免疫PET导致68Ga-IMP 288在肿瘤中的高度且特异性靶向(10.7±3.6%ID/g)，在正常组织中(例如，肿瘤/血液69.9±32.3)、CEA-阴性肿瘤中(0.35±0.35%ID/g)和炎性肌肉中(0.72±0.20%ID/g)吸收非常低。未用TF2预靶向的肿68 18
瘤也具有低 Ga-IMP 288吸收(0.20±0.03%ID/g)。[ F]FDG在肿瘤(7.42±0.20%ID/g)
68
以及在炎性肌肉(4.07±1.13%ID/g)和许多正常组织中有效累积，因此预靶向的 Ga-IMP
68 18
288提供了更好的特异性和灵敏度。在用TF2预靶向之后接受 Ga-IMP 288或 F-标记的IMP 449的小鼠的相应PET/CT图像清楚显示放射性标记肽在皮下LS174T肿瘤中的有效靶
18
向，而炎性肌肉未显影。相反，使用[ F]FDG，肿瘤以及炎症被清楚描绘。
瘤也具有低 Ga-IMP 288吸收(0.20±0.03%ID/g)。[ F]FDG在肿瘤(7.42±0.20%ID/g)
68
以及在炎性肌肉(4.07±1.13%ID/g)和许多正常组织中有效累积，因此预靶向的 Ga-IMP
68 18
288提供了更好的特异性和灵敏度。在用TF2预靶向之后接受 Ga-IMP 288或 F-标记的IMP 449的小鼠的相应PET/CT图像清楚显示放射性标记肽在皮下LS174T肿瘤中的有效靶
18
向，而炎性肌肉未显影。相反，使用[ F]FDG，肿瘤以及炎症被清楚描绘。
[0433] 剂量优化-确定了TF2bsMAb剂量对固定0.01nmol(15ng)剂量的IMP 288的肿瘤靶向的影响。五只小鼠的组用0.10、0.25、0.50或1.0nmol TF2(分别是16、40、80或125 111
160μg)静脉内注射，用痕量 I(0.4MBq)标记。注射 In-IMP 288(0.01nmol，0.4MBq)后
1小时，确定放射性标记的生物分布。
160μg)静脉内注射，用痕量 I(0.4MBq)标记。注射 In-IMP 288(0.01nmol，0.4MBq)后
1小时，确定放射性标记的生物分布。
[0434] TF2从血液和正常组织快速清除。注射后18小时，所有测试的TF2剂量下的血液浓度小于0.45%ID/g。TF2在肿瘤中的靶向在注射后2h为3.5%ID/g，并且不依赖于TF2剂111
量(数据未显示)。在所有TF2剂量下， In-IMP288在肿瘤中有效累积(未显示)。在较高
111
的TF2剂量下，观察到肿瘤中提高的 In-IMP 288吸收；在1.0nmol TF2剂量下，达到IMP
288的最大靶向(26.2±3.8%ID/g)。因此在0.01nmol肽剂量下，在1.0nmol的最高TF2剂量下达到最大的肿瘤靶向和肿瘤-血液比(TF2:IMP 288摩尔比=100:1)。在正常组织中，
111
肾具有最高的 In IMP 288吸收(1.75±0.27%ID/g)，并且肾中的吸收不受TF2剂量的影响(未显示)。所有其它正常组织具有非常低的吸收，导致极高的肿瘤-非肿瘤比，在所有测试的TF2剂量下超过50:1。
量(数据未显示)。在所有TF2剂量下， In-IMP288在肿瘤中有效累积(未显示)。在较高
111
的TF2剂量下，观察到肿瘤中提高的 In-IMP 288吸收；在1.0nmol TF2剂量下，达到IMP
288的最大靶向(26.2±3.8%ID/g)。因此在0.01nmol肽剂量下，在1.0nmol的最高TF2剂量下达到最大的肿瘤靶向和肿瘤-血液比(TF2:IMP 288摩尔比=100:1)。在正常组织中，
111
肾具有最高的 In IMP 288吸收(1.75±0.27%ID/g)，并且肾中的吸收不受TF2剂量的影响(未显示)。所有其它正常组织具有非常低的吸收，导致极高的肿瘤-非肿瘤比，在所有测试的TF2剂量下超过50:1。
[0435] 对于使用68Ga-标记的IMP 288的PET成像，需要较高的肽剂量，因为如果PET成68 68
像在注射后1h进行，则需要对每只小鼠注射5-10MBq Ga的最小活度。 Ga-IMP 288制剂的比活度在注射时是50-125MBq/nmol。因此，对于PET成像，必须施用至少0.1-0.25nmol IMP288。以0.1nmol IMP 288剂量测试相同的TF2:IMP 288摩尔比。LS174T肿瘤通过注射1.0、2.5、5.0或10.0nmol TF2(160、400、800或1600μg)而被预靶向。与较低肽剂量
111
的结果相反，肿瘤中 In-IMP288吸收不受TF2剂量的影响(在所有测试剂量下15%ID/g，数据未显示)。在较高剂量，根据%ID/g，肿瘤中的TF2靶向下降(3.21±0.61%ID/g与
1.16±0.27%ID/g，分别以1.0nmol和10.0nmol的注射剂量)(数据未显示)。肾吸收也不依赖于bsMAb剂量(2%ID/g)。基于这些数据，我们选择6.0nmol的bsMAb剂量用于将
0.1-0.25nmolIMP 288靶向至肿瘤。
像在注射后1h进行，则需要对每只小鼠注射5-10MBq Ga的最小活度。 Ga-IMP 288制剂的比活度在注射时是50-125MBq/nmol。因此，对于PET成像，必须施用至少0.1-0.25nmol IMP288。以0.1nmol IMP 288剂量测试相同的TF2:IMP 288摩尔比。LS174T肿瘤通过注射1.0、2.5、5.0或10.0nmol TF2(160、400、800或1600μg)而被预靶向。与较低肽剂量
111
的结果相反，肿瘤中 In-IMP288吸收不受TF2剂量的影响(在所有测试剂量下15%ID/g，数据未显示)。在较高剂量，根据%ID/g，肿瘤中的TF2靶向下降(3.21±0.61%ID/g与
1.16±0.27%ID/g，分别以1.0nmol和10.0nmol的注射剂量)(数据未显示)。肾吸收也不依赖于bsMAb剂量(2%ID/g)。基于这些数据，我们选择6.0nmol的bsMAb剂量用于将
0.1-0.25nmolIMP 288靶向至肿瘤。
[0436] PET成像-为了证明使用TF2和68Ga-IMP 288的预靶向免疫PET成像用于成像表达CEA的肿瘤的效力，在五只小鼠中诱导皮下肿瘤。在右肋腹诱导s.c.LS174T肿瘤，同6
时在相同小鼠的左肋腹中接种1x10 个SK-RC 52细胞以诱导CEA阴性肿瘤。十四天后，
125
当肿瘤尺寸为0.1-0.2g时，用6.0nmol I-TF2静脉内预靶向小鼠。16小时后，小鼠接受
68
5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol，20MBq/nmol的比活度)。单独组的3只小鼠接受相同量的单
68 68
独 Ga-IMP 288，未用TF2预靶向。在注射 Ga-IMP 288后1h，获得小鼠的PET/CT扫描。
时在相同小鼠的左肋腹中接种1x10 个SK-RC 52细胞以诱导CEA阴性肿瘤。十四天后，
125
当肿瘤尺寸为0.1-0.2g时，用6.0nmol I-TF2静脉内预靶向小鼠。16小时后，小鼠接受
68
5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol，20MBq/nmol的比活度)。单独组的3只小鼠接受相同量的单
68 68
独 Ga-IMP 288，未用TF2预靶向。在注射 Ga-IMP 288后1h，获得小鼠的PET/CT扫描。
[0437] 小鼠 中125I-TF2和68Ga-IMP 288的 生物 分布 示 于图 6。再 次观 察 到bsMAb(2.17±0.50%ID/g)和肽(10.7±3.6%ID/g)在肿瘤中的高吸收，在正常组织中具68
有非常低的吸收(肿瘤-血液比:64±22)。CEA阴性肿瘤SK-RC 52中 Ga-IMP 288的
68
靶向非常低(0.35±0.35%ID/g)。同样，未用TF2靶向的肿瘤具有低的 Ga-IMP288吸收(0.20±0.03%ID/g)，表明IMP 288在表达CEA的LS174T肿瘤中的特异性累积。
有非常低的吸收(肿瘤-血液比:64±22)。CEA阴性肿瘤SK-RC 52中 Ga-IMP 288的
68
靶向非常低(0.35±0.35%ID/g)。同样，未用TF2靶向的肿瘤具有低的 Ga-IMP288吸收(0.20±0.03%ID/g)，表明IMP 288在表达CEA的LS174T肿瘤中的特异性累积。
[0438] 68Ga-IMP 288在用TF2预靶向的表达CEA的肿瘤中的特异性吸收在注射68Ga-标记的肽后1h获得的PET图像中清晰显影(未显示)。通过对目标区域绘图来定量评价肿瘤68
中的吸收，使用50%最大强度阈值。腹部区域用作背景区。接受TF2和 Ga-IMP 288的小鼠的图像中肿瘤-背景比是38.2。
中的吸收，使用50%最大强度阈值。腹部区域用作背景区。接受TF2和 Ga-IMP 288的小鼠的图像中肿瘤-背景比是38.2。
[0439] 然后，我们检查了[18F]FDG预靶向的免疫PET。在两组五只小鼠中，在右后腿诱导s.c.LS174T肿瘤，并通过肌肉内注射50μL松节油诱导左大腿肌肉的炎症病灶(18)。注射68
松节油后3天，一组小鼠接受6.0nmol TF2，16h后接受5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol)。另
18
一组接受[ F]FDG(5MBq)。小鼠在注射前10个小时期间禁食并麻醉，然后在37℃保持温暖直至注射后1h安乐死。
松节油后3天，一组小鼠接受6.0nmol TF2，16h后接受5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol)。另
18
一组接受[ F]FDG(5MBq)。小鼠在注射前10个小时期间禁食并麻醉，然后在37℃保持温暖直至注射后1h安乐死。
[0440] 68Ga-IMP 288在炎性肌肉中的吸收很低，而在相同动物肿瘤中吸收高(0.72±0.20%ID/g与8.73±1.60%ID/g，p<0.05，图7)。在炎性肌肉中的吸收在与肺、肝和脾中的吸收相同的范围内(分别是0.50±0.14%ID/g、0.72±0.07%ID/g、0.44±0.10%ID/
68
g)。在这些小鼠中 Ga-IMP 288的肿瘤-血液比为69.9±32.3；炎性肌肉-血液比为
18
5.9±2.9；肿瘤-炎性肌肉比为12.5±2.1。在另一组小鼠中，F-FDG在肿瘤中有效累积
18
(7.42±0.20%ID/g，肿瘤-血液比为6.24±1.5，图4)。 F-FDG还在炎性肌肉中明显累积(4.07±1.13%ID/g)，炎性肌肉-血液比为3.4±0.5，肿瘤-炎性肌肉比为1.97±0.71。
68
g)。在这些小鼠中 Ga-IMP 288的肿瘤-血液比为69.9±32.3；炎性肌肉-血液比为
18
5.9±2.9；肿瘤-炎性肌肉比为12.5±2.1。在另一组小鼠中，F-FDG在肿瘤中有效累积
18
(7.42±0.20%ID/g，肿瘤-血液比为6.24±1.5，图4)。 F-FDG还在炎性肌肉中明显累积(4.07±1.13%ID/g)，炎性肌肉-血液比为3.4±0.5，肿瘤-炎性肌肉比为1.97±0.71。
[0441] 用TF2预靶向后接受68Ga-IMP 288的小鼠的相应PET/CT图像清晰显示放射性标18
记肽在肿瘤中的有效累积，而炎性肌肉未显影(图8)。相反，接受 F-FDG的小鼠图像上，
68
肿瘤以及炎症是可见的(图8)。在按受 Ga-IMP 288的小鼠中，肿瘤-炎性组织比是5.4；
18
肿瘤-背景比是48；炎性肌肉-背景比是8.9。[ F]FDG吸收具有0.83的肿瘤-炎性肌肉比；肿瘤-背景比是2.4；炎性肌肉-背景比是2.9。
记肽在肿瘤中的有效累积，而炎性肌肉未显影(图8)。相反，接受 F-FDG的小鼠图像上，
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肿瘤以及炎症是可见的(图8)。在按受 Ga-IMP 288的小鼠中，肿瘤-炎性组织比是5.4；
18
肿瘤-背景比是48；炎性肌肉-背景比是8.9。[ F]FDG吸收具有0.83的肿瘤-炎性肌肉比；肿瘤-背景比是2.4；炎性肌肉-背景比是2.9。
[0442] 使用Al18F-标记的IMP 449测试预靶向免疫PET成像方法。五只小鼠接受18
6.0nmol TF2，16h小时后接受5MBq Al F-IMP 449(0.25nmol)。三只额外的小鼠接受5MBq
18 18
Al F-IMP449，之前不施用TF2，而两只对照小鼠注射[Al F](3MBq)。该实验的结果总结
18
于图9。用TF2预靶向的肿瘤中Al F-IMP 449的吸收高(10.6±1.7%ID/g)，而其在非预
18
靶向小鼠中很低(0.45±0.38%ID/g)。[Al F]在骨中累积(50.9±11.4%ID/g)，而放射性
18
标记IMP 449肽在骨中的吸收很低(0.54±0.2%ID/g)，表明Al F-IMP 449在体内是稳定
18
的。Al F-IMP 449在具有s.c.LS174T肿瘤的TF2预靶向小鼠中的生物分布高度类似于
68
Ga-IMP 288。
6.0nmol TF2，16h小时后接受5MBq Al F-IMP 449(0.25nmol)。三只额外的小鼠接受5MBq
18 18
Al F-IMP449，之前不施用TF2，而两只对照小鼠注射[Al F](3MBq)。该实验的结果总结
18
于图9。用TF2预靶向的肿瘤中Al F-IMP 449的吸收高(10.6±1.7%ID/g)，而其在非预
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靶向小鼠中很低(0.45±0.38%ID/g)。[Al F]在骨中累积(50.9±11.4%ID/g)，而放射性
18
标记IMP 449肽在骨中的吸收很低(0.54±0.2%ID/g)，表明Al F-IMP 449在体内是稳定
18
的。Al F-IMP 449在具有s.c.LS174T肿瘤的TF2预靶向小鼠中的生物分布高度类似于
68
Ga-IMP 288。
[0443] 用Al18F-IMP 449预靶向免疫PET的PET图像显示肿瘤中与用68Ga-IMP 288相同18 68 18
的强度，但是 F-图像的分辨率优于 Ga-图像的分辨率(图10)。Al F-IMP 449信号的肿瘤-背景比是66。
的强度，但是 F-图像的分辨率优于 Ga-图像的分辨率(图10)。Al F-IMP 449信号的肿瘤-背景比是66。
[0444] 结论
[0445] 本研究显示，用与68Ga-或18F-标记的二-HSG-DOTA-肽组合的抗-CEA x抗-HSG双特异性抗体TF2预靶向免疫PET是用于表达CEA的肿瘤的PET成像的快速和特异性的技术。
[0446] 用与68Ga-IMP 288或Al18F-IMP 449组合的TF2预靶向免疫PET包括两次静脉内施用。输注bsMAb和放射性标记肽之间的间隔使用16h。16h后，大部分TF2从血液中清除(血液浓度<1%ID/g)，防止了循环中TF2与IMP 288的复合。
[0447] 对于这些研究，优化用68Ga标记IMP 288的程序，产生一步标记技术。我们发现，68 68
需要在C18/HLB柱上纯化以除去 Ga胶体，Ga胶体当肽在95℃下以超过150GBq/nmol的
68
比活度标记时形成。如果制剂含有小百分比的胶体并静脉内施用，则 Ga胶体在单核吞噬
68
细胞系统(肝、脾和骨髓)的组织中聚集，损害图像质量。 Ga-标记的肽可以在C18-柱上快速纯化。为施用进行的放射性标记和纯化可以在45分钟内完成。
需要在C18/HLB柱上纯化以除去 Ga胶体，Ga胶体当肽在95℃下以超过150GBq/nmol的
68
比活度标记时形成。如果制剂含有小百分比的胶体并静脉内施用，则 Ga胶体在单核吞噬
68
细胞系统(肝、脾和骨髓)的组织中聚集，损害图像质量。 Ga-标记的肽可以在C18-柱上快速纯化。为施用进行的放射性标记和纯化可以在45分钟内完成。
[0448] 68Ga的半衰期符合IMP 288肽在预靶向系统中的动力学：在肿瘤中的最大累积在68 68 68
1h内达到。Ga可以在一天从 Ge/ Ga生成器洗脱两次，避免了对现场回旋加速器的需要。
68
然而，Ga(1.9MeV)发射的正电子的高能量限制获得图像的空间分辨率为3mm，而显微PET系统的固有分辨率低至1.5mm。
1h内达到。Ga可以在一天从 Ge/ Ga生成器洗脱两次，避免了对现场回旋加速器的需要。
68
然而，Ga(1.9MeV)发射的正电子的高能量限制获得图像的空间分辨率为3mm，而显微PET系统的固有分辨率低至1.5mm。
[0449] PET中最普遍使用的放射性核素18F具有更有利于预靶向PET成像的半衰期18 68
(t1/2-110分钟)。NOTA-缀合肽IMP 449如上所述用 F标记。类似于用 Ga标记，其是一
18 68
步程序。获得了高达50%的标记收率。Al F-IMP 449的生物分布高度类似于 Ga-标记的
18
IMP 288，表明对于该标记方法，F是剩余化的放射性核素。
(t1/2-110分钟)。NOTA-缀合肽IMP 449如上所述用 F标记。类似于用 Ga标记，其是一
18 68
步程序。获得了高达50%的标记收率。Al F-IMP 449的生物分布高度类似于 Ga-标记的
18
IMP 288，表明对于该标记方法，F是剩余化的放射性核素。
[0450] 与FDG-PET相反，预靶向放射免疫检测是肿瘤特异性成像模式。尽管已经在患者中报道了FDG-PET在检测复发性结肠直肠癌损伤中的高灵敏度和特异性(Huebner等，2000，J Nucl Med 41:11277-89)，但是FDG-PET图像可以导致在区分恶性损伤与良性损伤
68 18
中的诊断困境，如对炎症观察到的高标记水平所指示的。相反，使用TF2 Ga-或 F-标记的肽的预靶向免疫PET的CEA阳性肿瘤的高肿瘤-背景比和清晰显影支持了所述方法在临床成像癌症和其它病症中的用途。除了检测转移瘤和区分CEA阳性肿瘤与其它损伤以外，预靶向免疫PET还可用于在预靶向放射免疫疗法之前评估递送至肿瘤和正常组织的放射剂量。因为TF2是人源化抗体，其具有低免疫原性，开辟了多成像或治疗循环的道路。
68 18
中的诊断困境，如对炎症观察到的高标记水平所指示的。相反，使用TF2 Ga-或 F-标记的肽的预靶向免疫PET的CEA阳性肿瘤的高肿瘤-背景比和清晰显影支持了所述方法在临床成像癌症和其它病症中的用途。除了检测转移瘤和区分CEA阳性肿瘤与其它损伤以外，预靶向免疫PET还可用于在预靶向放射免疫疗法之前评估递送至肿瘤和正常组织的放射剂量。因为TF2是人源化抗体，其具有低免疫原性，开辟了多成像或治疗循环的道路。
[0451] 实施例23.叶酸NOTA缀合物的合成
[0452] 如所述活化叶酸(Wang等Bioconjugate Chem.1996，7，56-62.)并缀合至Boc-NH-CH2-CH2-NH2。缀合物通过色谱纯化。然后通过用TFA处理而除去Boc基团。氨基叶酸衍生物然后与p-SCN-Bn-NOTA(Macrocyclics)在碳酸盐缓冲液中混合。然后产物通过18 18
HPLC纯化。叶酸NOTA衍生物如之前实施例所述用Al F标记，然后HPLC纯化。 F-标记的叶酸静脉内注射到受试者并成功用于成像叶酸受体在例如癌症或炎性疾病中的分布(参见例如，Ke等，Advanced DrugDelivery Reviews，56:1143-60，2004)。
HPLC纯化。叶酸NOTA衍生物如之前实施例所述用Al F标记，然后HPLC纯化。 F-标记的叶酸静脉内注射到受试者并成功用于成像叶酸受体在例如癌症或炎性疾病中的分布(参见例如，Ke等，Advanced DrugDelivery Reviews，56:1143-60，2004)。
[0453] 实施例24.人中预靶向的PET成像
[0454] 向患有疑似复发的肿瘤的患者(1.7m2体表面积)注射17mg双特异性单克隆抗体18
(bsMab)。使得bsMab定位于靶并从血液清除。当99%bsMab从血液清除时，注射 F-标记-9
的肽(5-10mCi 5.7x10 mol)。PET成像显示微转移肿瘤的存在。
(bsMab)。使得bsMab定位于靶并从血液清除。当99%bsMab从血液清除时，注射 F-标记-9
的肽(5-10mCi 5.7x10 mol)。PET成像显示微转移肿瘤的存在。
[0455] 实施例25.通过18F标记对血管生成受体成像
[0456] 标记的Arg-Gly-Asp(RGD)肽已经用于例如缺血组织中血管生成的成像，其中涉及αvβ3整联蛋白。(Jeong等，J．Nucl.Med.2008，4月15日电子公开)。RGD根据Jeong18
等(2008)等缀合至SCN-Bn-NOTA。[Al F]如上所述连接至NOTA-衍生的RGD肽，通过将
18
铝储液与 F和衍生的RGD肽混合并在110℃加热15分钟，使用过量肽促使标记反应完成。
18
F标记的RGD肽用于体内生物分布和PET成像，如Jeong等(2008)所公开。RGD-NOTA的
18
[Al F]缀合物被吸收入缺血组织并提供血管生成的PET成像。
等(2008)等缀合至SCN-Bn-NOTA。[Al F]如上所述连接至NOTA-衍生的RGD肽，通过将
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铝储液与 F和衍生的RGD肽混合并在110℃加热15分钟，使用过量肽促使标记反应完成。
18
F标记的RGD肽用于体内生物分布和PET成像，如Jeong等(2008)所公开。RGD-NOTA的
18
[Al F]缀合物被吸收入缺血组织并提供血管生成的PET成像。
[0457] 实施例26.碳水化合物标记
[0458] NOTA氨基硫脲衍生物通过使p-SCN-Bn-NOTA与肼反应、然后通过HPLC纯化配体来18 18
制备。[Al F]如在之前实施例所述来制备，并且将[Al F]添加至NOTA氨基硫脲并加热15
18 18
分钟。任选地，[Al F]NOTA氨基硫脲复合物通过HPLC纯化。[Al F]NOTA氨基硫脲通过己
18
知方法与氧化的碳水化合物缀合。 F-标记的碳水化合物成功用于使用PET扫描的成像研究。
制备。[Al F]如在之前实施例所述来制备，并且将[Al F]添加至NOTA氨基硫脲并加热15
18 18
分钟。任选地，[Al F]NOTA氨基硫脲复合物通过HPLC纯化。[Al F]NOTA氨基硫脲通过己
18
知方法与氧化的碳水化合物缀合。 F-标记的碳水化合物成功用于使用PET扫描的成像研究。
[0459] 实施例27.有机溶剂对F-18标记的影响
[0460] 螯合部分(例如NETA和NOTA)对铝的亲和力比铝对18F的亲和力高得多。Al对18
F亲和力受例如溶液离子强度等因素的影响，因为其它抗衡离子的存在趋于彼此屏蔽带正电荷的铝和带负电荷的氟离子并因此降低了离子结合的强度。因此，低离子强度介质应增
18
加Al和 F的有效结合。
F亲和力受例如溶液离子强度等因素的影响，因为其它抗衡离子的存在趋于彼此屏蔽带正电荷的铝和带负电荷的氟离子并因此降低了离子结合的强度。因此，低离子强度介质应增
18
加Al和 F的有效结合。
[0461] 向18F反应添加乙醇的初始研究发现增加了放射性标记肽的收率。IMP 461如上所述制备。
[0462] 表8.IMP461在乙醇中的18F标记
[0463]# 2mM AlCl3 F-18 2mM IMP 461 溶剂 收率＊
1 10μL 741μCi 20μL EtOH 60μL 64.9％
2 10μL 739μCi 20μL H2O 60μL 21.4％
3 10μL 747μCi 20μL EtOH 60μL 46.7％
4 5μL 947μCi 10μL EtOH 60μL 43.2％
1 10μL 741μCi 20μL EtOH 60μL 64.9％
2 10μL 739μCi 20μL H2O 60μL 21.4％
3 10μL 747μCi 20μL EtOH 60μL 46.7％
4 5μL 947μCi 10μL EtOH 60μL 43.2％
[0465] 初步结果显示，向反应混合物添加乙醇使 F-标记的肽收率提高1倍多。表8还18
显示，微波辐射可以用于替代加热以促进[Al F]并入IMP 461的螯合部分。60秒的微波辐射(#3)似乎具有比加热至101℃持续5分钟(#1)略低(18%)的有效性。
显示，微波辐射可以用于替代加热以促进[Al F]并入IMP 461的螯合部分。60秒的微波辐射(#3)似乎具有比加热至101℃持续5分钟(#1)略低(18%)的有效性。
[0466] 检查了其它试剂对肽的19F标记的影响。在每种情况下，反应物的浓度相同而仅19
改变溶剂。反应条件包括混合25μLNa F+20μLAlCl3+20μLIMP-46l+60μL溶剂，随后在
19
101℃加热5分钟。表9显示溶剂的存在确实显著提高了[Al F]IMP-46l(IMP 473)的收率。
19
改变溶剂。反应条件包括混合25μLNa F+20μLAlCl3+20μLIMP-46l+60μL溶剂，随后在
19
101℃加热5分钟。表9显示溶剂的存在确实显著提高了[Al F]IMP-46l(IMP 473)的收率。
19
[0467] 表9.在各种溶剂中进行的IMP 461的 F标记
[0468]溶剂 H2O MeOH EtOH CH3CN
Al-IMP-461 2.97 3.03 2.13 1.54
IMP-465 52.46 34.19 31.58 24.58
IMP-473 14.99 30.96 33.00 37.48
IMP-473 15.96 31.81 33.29 36.40
IMP-461 13.63 - - -
Al-IMP-461 2.97 3.03 2.13 1.54
IMP-465 52.46 34.19 31.58 24.58
IMP-473 14.99 30.96 33.00 37.48
IMP-473 15.96 31.81 33.29 36.40
IMP-461 13.63 - - -
[0469]
[0470]溶剂 IPA 丙酮 THF 二噁烷
Al-IMP-461 2.02 2.05 3.20 16.67
IMp-465 32.11 28.47 34.76 10.35
IMP-473 27.31 34.35 29.38 27.09
IMP-473 27.97 35.13 29.28 11.62
IMP-461 10.58 - 4.37 34.27
Al-IMP-461 2.02 2.05 3.20 16.67
IMp-465 32.11 28.47 34.76 10.35
IMP-473 27.31 34.35 29.38 27.09
IMP-473 27.97 35.13 29.28 11.62
IMP-461 10.58 - 4.37 34.27
[0471]溶剂 DMF DMSO tR(分针)
Al-IMP-461 - - 9.739
IMP-465 19.97 37.03 10.138
IMP-473 27.77 31.67 11.729
IMP-473 27.34 31.29 11.952
IMP-461 - - 12.535
Al-IMP-461 - - 9.739
IMP-465 19.97 37.03 10.138
IMP-473 27.77 31.67 11.729
IMP-473 27.34 31.29 11.952
IMP-461 - - 12.535
[0472] [Al19F]IMP 461＝IMP 473
[0473] 实施例28.用碳酸氢盐洗脱18F18
[0474] 将 F(10.43mCi)以2mL接收到注射器中。溶液通过Plus QMA柱。然后将柱用5mL DI水洗涤。18F用0.4M KHCO3洗
脱，级分示于下面的表10中。
脱，级分示于下面的表10中。
[0475] 表10.用KHCO3洗脱QMA柱
[0476]管形瓶 体积乙酸μL 体积0.4M KHCO3μL 活度mCi
1 7.5 150 0.0208
2 10 200 7.06
3 5 100 1.653
4 25 500 0.548
1 7.5 150 0.0208
2 10 200 7.06
3 5 100 1.653
4 25 500 0.548
[0477] 检查了其它溶剂(CH3CN)的量对IMP-461的18F标记的影响。在每种情况下，反应18
物的浓度相同并且仅改变溶剂的量。反应条件包括混合10μLAlCl3+20μL F+20μLIMP-4
61+CH3CN，随后在101℃加热5分钟。表11显示在过量溶剂存在下，标记效率开始提高并随后降低。
物的浓度相同并且仅改变溶剂的量。反应条件包括混合10μLAlCl3+20μL F+20μLIMP-4
61+CH3CN，随后在101℃加热5分钟。表11显示在过量溶剂存在下，标记效率开始提高并随后降低。
[0478] 表11.使用不同量的CH3CN对IMP461进行18F标记
[0479]CH3CN(μL) F-18mCi tR 2.70分钟(％) tR 8.70分钟(％) RCY％(HLB)
0 0.642 13.48 86.52 50.7
100 0.645 1.55 98.45 81.8*
200 0.642 2.85 97.15 80.8
400 0.645 14.51 85.49 57.8
0 0.642 13.48 86.52 50.7
100 0.645 1.55 98.45 81.8*
200 0.642 2.85 97.15 80.8
400 0.645 14.51 85.49 57.8
[0480] *含水洗液含有标记的肽。RCY＝HLB纯化后的放射化学收率
[0481] 实施例29.IMP 461的高剂量放射性标记
[0482] 将18F(163mCi)以2mL接 收到 注 射器 中。溶 液 通过Plus QMA柱。然后将柱用5mL DI水洗涤。18F用0.4M K2CO3洗
脱，级分显示于表12。
脱，级分显示于表12。
[0483] 表12.高剂量标记
[0484]管形瓶 体积乙酸μL 体积0.4M K2CO3μL 活度mCi
1 18.5 185 5.59
2 5 50 35.8
3 5 50 59.9
4 5 50 20.5
5 5 50 5.58
6 50 500 4.21
1 18.5 185 5.59
2 5 50 35.8
3 5 50 59.9
4 5 50 20.5
5 5 50 5.58
6 50 500 4.21
[0485] 将氯化铝溶液(10μL，2mM pH 4，2mM NaOAc)添加至表12的第3号管形瓶。将肽(20μL，2mM pH 4，2mM NaOAc)添加至管形瓶，随后添加170μLCH3CN。溶液在103℃加热10分钟，用6mL水稀释。将溶液吸入10mL注射器并注射至串联设置的两个18
Plus柱。然后用8mL水洗涤柱。然后用10mL 1∶1EtOH/H2O洗脱放射性标记的肽Al FIMP
18
461，30.3mCi，63.5％收率，比活度750Ci/mmol。通过HPLC，标记的肽不含未结合的 F。总反应和纯化时间为20分钟。
Plus柱。然后用8mL水洗涤柱。然后用10mL 1∶1EtOH/H2O洗脱放射性标记的肽Al FIMP
18
461，30.3mCi，63.5％收率，比活度750Ci/mmol。通过HPLC，标记的肽不含未结合的 F。总反应和纯化时间为20分钟。
[0486] 实施例30.19F标记肽的制备
[0487] 含有27Al和/或19F的产物用于某些应用如NMR成像。开发了用于制备[Al19F]标19
记化合物的改进方法。IMP 461如上文所述制备并用 F标记。IMP 461与AlCl3+NaF反应导致形成三种产物(未显示)。然而，通过IMP 461与AlF3.6H2O反应，我们获得了更高的
19
[Al F]IMP 461收率。
记化合物的改进方法。IMP 461如上文所述制备并用 F标记。IMP 461与AlCl3+NaF反应导致形成三种产物(未显示)。然而，通过IMP 461与AlF3.6H2O反应，我们获得了更高的
19
[Al F]IMP 461收率。
[0488] IMP 473的合成：向在2mL NaOAc(2mM，pH 4.18)中的([Al19F]IMP 461)(14.1mg，10.90μmol)IMP 461溶液添加(4.51mg，32.68μmol)AlF3.6H2O和500μL乙醇。使用3μL
1N NaOH调节溶液pH至4.46，并在沸水浴中加热30分钟。粗制反应混合物通过制备型+
RP-HPLC纯化以产生4.8mg(32.9％)IMP 473。HRMS(ESI-TOF)MH 预期为1337.634l；实测为1337.6332。
1N NaOH调节溶液pH至4.46，并在沸水浴中加热30分钟。粗制反应混合物通过制备型+
RP-HPLC纯化以产生4.8mg(32.9％)IMP 473。HRMS(ESI-TOF)MH 预期为1337.634l；实测为1337.6332。
[0489] 这些结果证明，19F标记分子可以通过形成金属-19F复合物并将金属-19F结合至螯18
合部分来制备，如上对 F标记所论述。本实施例显示，用于预靶向检测、诊断和/或成像的靶向肽可以使用本方法制备。
合部分来制备，如上对 F标记所论述。本实施例显示，用于预靶向检测、诊断和/或成像的靶向肽可以使用本方法制备。
[0490] 实施例31.IMP 479、IMP 485和IMP 487的合成和标记
[0491] 设计用于18F-标记的额外肽IMP 479(SEQ ID NO:35)、IMP485(SEQ ID NO:36)和IMP 487(SEQ ID NO:37)的结构示于图11至图13。IMP 485示于图12。通过以所示顺序向树脂添加如下氨基酸来在Sieber酰胺树脂上制备IMP 485：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被裂解、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被裂解、(叔-丁基)2NODA-MPAA(甲基苯基乙酸)。然后使肽从树脂分离并通过RP-HPLC纯化以产生44.8mg IMP 485。
[0492] 用于IMP 485合成的二-叔-丁基-NODA-MPAA:NO2AtBu-MPAA的合成
[0493] 在0℃在1h内向CH3CN(无水)(50mL)中的4-(溴甲基)苯基乙酸(Aldrich310417)(0.5925g，2.59mmol)溶液逐滴加入CH3CN(无水)(50mL)中的NO2AtBu(1.0087g，
2.82mmol)溶液。4小时后，向反应混合物中加入无水K2CO3(0.1008g，0.729mmol)并且使其在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，通过制备型RP-HPLC纯化粗制混合物以产生白色固体(0.7132g，54.5%)。
2.82mmol)溶液。4小时后，向反应混合物中加入无水K2CO3(0.1008g，0.729mmol)并且使其在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，通过制备型RP-HPLC纯化粗制混合物以产生白色固体(0.7132g，54.5%)。
[0494]
[0495] 虽然这是一步合成，但是收率因产物被4-(溴甲基)苯基乙酸酯化而较低。使用甲基(4-溴甲基)苯基乙酸酯对NO2AtBu进行的烷基化用于防止酯化(图14)。
[0496] 18F标记
[0497] 对于在水中进行18F标记，向40nmol的IMP-479/485/487(使用海藻糖+抗坏血酸+AlCl3配制)中加入250μL F-18溶液[~919-1112μCi的F-18]并且加热至101℃持续15分钟。在乙醇中，向40nmol的IMP-479/485/487(使用海藻糖+抗坏血酸+AlCl3配制)中加入250μLF-18溶液[1.248-1.693mCi的F-18]、100μL EtOH并且加热至101℃持续15分钟。显示标记不同肽的示例性实验示于表13。在最低程度的优化中，已观察到达到88%收率和2,500Ci/mmol的比活度的IMP485的放射性标记。在该比活度时，放射性标记的肽的HPLC纯化对于使用放射性标记肽进行的体内PET成像是不需要的。
[0498] 表13.IMP 479、IMP 485和IMP 487的标记
[0499]
[0500] 血清中的稳定性
[0501] 利用200μL盐水中的纯化的18F复原包括40nmol IMP 485或IMP 487、20nmol AlCl3、0.1mg抗坏血酸和0.1g海藻糖(调节至pH 3.9)的试剂盒，并在106℃加热15分钟。然后用800μL水稀释反应混合物，将其置于HLB柱上。在洗涤后，用2x200μL 1:1EtOH/H2O
18
洗脱柱以获得纯化的 F-IMP 485，分离收率为64.6%。将50μL放射性标记的肽与250μL新鲜人血清在管形瓶中混合，并在37℃下孵育。
18
洗脱柱以获得纯化的 F-IMP 485，分离收率为64.6%。将50μL放射性标记的肽与250μL新鲜人血清在管形瓶中混合，并在37℃下孵育。
[0502] 两种放射性标记的肽在测试的4小时中在37℃下在新鲜血清中是稳定的(未显示)。
[0503] 填充剂(Bulking Agent)对冻干的肽的收率的影响
[0504] 进行实验以比较使用具有200微升盐水中的2mCi F-18(来自F-18的相同批次)标记的不同填充剂的IMP 485试剂盒(40nmol)的收率。按200微升/瓶的剂量，以水中5重量%的浓度引入填充剂。我们测试作为填充剂的山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和甘氨酸。结果示于表14。
[0505] 表14.填充剂对放射性标记收率的影响
[0506]填充剂 活度mCi 收率％
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
[0507] 山梨醇、甘露醇和海藻糖全都以相同的收率给予放射性标记的产物。甘露醇试剂盒和海藻糖试剂盒都形成良好的饼状物。蔗糖试剂盒和甘氨酸试剂盒都具有显著较低的收率。我们最近还测试了作为填充剂的2-羟丙基-β-环糊精并且对于40nmol试剂盒获得58%的收率。我们已发现，放射性标记是对pH非常敏感的并且需要针对配体以及可能地甚至针对肽+配体进行调整。在IMP 485的情况下，最佳pH为pH 4.0±0.2，然而对于IMP
467最佳pH为pH 4.5±0.5。在两种情况下，收率在理想的pH区域外快速下降。
467最佳pH为pH 4.5±0.5。在两种情况下，收率在理想的pH区域外快速下降。
[0508] 标记的时间过程
[0509] 检查IMP 485的标记的时间过程。向40nmol的IMP 485(使用海藻糖+AlCl3(20nmol)+抗坏血酸配制)中加入~200-250μLF-18溶液(0.9%盐水)并且加热至104℃持续5至15分钟。标记收率的结果为：5分钟(28.9%)、10分钟(57.9%)、15分钟(83.7%)和30分钟(88.9%)。因此，标记的时间过程为约15分钟。
[0510] 单独的IMP 485的生物分布
[0511] 在携带小的或无BXPC3胰腺癌异种移植物的雌性Taconic裸小鼠(10周龄)中检18
查IMP 485在任何预靶向抗体不存在的情况下的生物分布。用 F-IMP 485(340μCi，2.29x -9
10 mol，100μL于盐水中)静脉内注射小鼠。在注射后30分钟和90分钟时对小鼠解剖，每个时间点6只小鼠。在预靶向抗体不存在的情况下，在肿瘤中和大多数正常组织中看到低水平的累积。绝大部分放射性标记在膀胱中发现，较少程度在肾中发现。大部分活度在
90分钟时间点前清除。
查IMP 485在任何预靶向抗体不存在的情况下的生物分布。用 F-IMP 485(340μCi，2.29x -9
10 mol，100μL于盐水中)静脉内注射小鼠。在注射后30分钟和90分钟时对小鼠解剖，每个时间点6只小鼠。在预靶向抗体不存在的情况下，在肿瘤中和大多数正常组织中看到低水平的累积。绝大部分放射性标记在膀胱中发现，较少程度在肾中发现。大部分活度在
90分钟时间点前清除。
[0512] 利用TF2DNL靶向分子预靶向IMP 485
[0513] 18F-IMP 485放射性标记-纯化18F(218mCi)以分离145.9mCi。将纯化的18
F(135mCi)添加至含有40nmol预复合的Al-IMP 485的冻干瓶中。将反应瓶在110℃加热17分钟。在HLB纯化之前向反应混合物中添加水(0.8mL)。用0.6mL水:乙醇(1:1)混合物将产生(22mCi)洗脱进入含有冻干的抗坏血酸的瓶中。用盐水稀释产物。用于注射的
18
F-Al IMP 485比活度为550Ci/mmol。
F(135mCi)添加至含有40nmol预复合的Al-IMP 485的冻干瓶中。将反应瓶在110℃加热17分钟。在HLB纯化之前向反应混合物中添加水(0.8mL)。用0.6mL水:乙醇(1:1)混合物将产生(22mCi)洗脱进入含有冻干的抗坏血酸的瓶中。用盐水稀释产物。用于注射的
18
F-Al IMP 485比活度为550Ci/mmol。
[0514] 单独的18F-Al IMP 485的生物分布-用18F-Al IMP 485(28μCi，5.2x10-11mol，100μL)注射携带sc LS174T异种移植物的小鼠。在注射后1小时和3小时将小鼠解剖，每个时间点6只小鼠。
[0515] 以20:1bsMAb-肽 比 率 预 靶 向 的 TF2+18F-Al IMP 485的 生 物 分 布- 用-9TF2(163.2μg，1.03x10 mol，iv)注射携带sc LS174T异种移植物的小鼠，使小鼠其进行清
18 -11
除16.3h，然后注射 F-Al IMP 485(28μCi，5.2x10 mol，100μL iv)。在注射后1小时和
3小时将小鼠解剖，每个时间点7只小鼠。
18 -11
除16.3h，然后注射 F-Al IMP 485(28μCi，5.2x10 mol，100μL iv)。在注射后1小时和
3小时将小鼠解剖，每个时间点7只小鼠。
[0516] 尿稳定性-用18F-Al-IMP 485(400μCi，于盐水中，100μL)注射10只携带s.c.Capan-1异种移植物的小鼠。在注射后第55分钟从3只小鼠收集尿。通过反相和SE HPLC分析尿样品。观察到放射性标记的IMP 485在尿中的稳定性。
[0517] 表15.注射后1小时单独的T-IMP 485：
[0518]
[0519] 表16.注射后3小时单独的18F-IMP 485
[0520]
[0521] 表17.肽注射后1小时TF2+18F-IMP 485
[0522]
[0523] 表18.肽注射后3小时TF2+18F-IMP 485
[0524]
[0525] 结论
[0526] IMP 485标记与IMP 467一样好或好于IMP 467，在血清中具有同等的稳定性。然18
而，IMP 485比IMP 467合成容易得多。初步研究已显示冻干的IMP 485的 F标记与非冻干的肽同样有效(数据未显示)。检查将螯合部分连接至肽的其余部分的接头中的烷基或芳基的存在。接头中芳基的存在相对于接头中烷基的存在似乎增加放射性标记的收率。
而，IMP 485比IMP 467合成容易得多。初步研究已显示冻干的IMP 485的 F标记与非冻干的肽同样有效(数据未显示)。检查将螯合部分连接至肽的其余部分的接头中的烷基或芳基的存在。接头中芳基的存在相对于接头中烷基的存在似乎增加放射性标记的收率。
[0527] 在预靶向抗体存在或不存在的情况下IMP 485的生物分布与对于IMP 467观察的相似。在预靶向抗体不存在的情况下，肿瘤和大多数正常组织中放射性标记的肽的分布低并且肽被肾排泄从循环中除去。在TF2抗体存在的情况下，放射性标记的IMP 485主要见于肿瘤中，几乎不分布至正常组织。在预靶向抗体存在的情况下，肾放射性标记显著减少。18
我们得出结论：在接头中具有芳基的IMP 485和其它肽非常适合用于利用 F的PET成像。
我们得出结论：在接头中具有芳基的IMP 485和其它肽非常适合用于利用 F的PET成像。
[0528] 实施例32.用于成像的IMP 485的试剂盒配制
[0529] 试剂列表
[0530] 从下列来源获得试剂：乙酸(JT Baker 6903-05或9522-02)、氢氧化钠(Aldrich半导体级99.99%30,657-6)、α,α-海藻糖(JT Baker4226-04)、氯化铝六水合物(Aldrich99%237078)、抗坏血酸(Aldrich25,556-4)。
-4
-4
[0531] 醋酸盐缓冲液2mM-用200mL水稀释22.9μL(4.0x10 mol)醋酸，并用6NNaOH(~15μL)中和以将溶液调节至pH 4.22。
-5
-5
[0532] 铝溶液2mM-将铝六水合物0.0225g(9.32x10 mol)溶解在47mLDI水中。
[0533] α，α-海藻糖溶液-将α,α-海藻糖4.004g溶解在40mL DI水中以制备10%溶液。
[0534] 肽溶液，IMP 4852mM-将肽IMP 485(0.0020g，1.52μmol)溶解在762μL的2mM醋酸盐缓冲液中。pH为2.48(将肽冻干为TFA盐)。通过加入4.1μL1M NaOH将肽溶液的pH调节至pH 4.56。
[0535] 抗坏血酸溶液5mg/mL-将0.0262g(1.49x10-4mol)抗坏血酸溶解在5.24mL DI水中。
[0536] 肽试剂盒的配制
[0537] 将20μL(40nmol)肽与12μL(24nmol)的Al、100μL的海藻糖、20μL(0.1mg)抗坏血酸和900μL的DI水在3mL冻干管形瓶中混合。溶液的终pH应当为~pH 4.0。冷冻管18
形瓶，将其冻干，在真空下密封。在该制剂中，在结合 F之前加载肽和铝。
形瓶，将其冻干，在真空下密封。在该制剂中，在结合 F之前加载肽和铝。
[0538] 还已制备10和20nmol的试剂盒。与所述40nmol试剂盒一样地制备这些试剂盒，3+ 3+
使肽-Al 比率为1份肽:0.6份Al ，但配制于2mL管形瓶中，总共充填0.5mL。
使肽-Al 比率为1份肽:0.6份Al ，但配制于2mL管形瓶中，总共充填0.5mL。
[0539] 18F的纯化
[0540] 将2mL DI水中的粗制18F接收于注射器中。将注射器置于注射泵上，使液体通过Waters CM柱，然后通过QMA柱。用10mL DI水洗涤两个柱。转换两个柱之间的无菌一次性使用的三通阀门，使1mL商业无菌盐水以200μL级分通过QMA柱。第二级分通常包含~80%18 18
的 F，无论应用的 F的量如何(测试10-300mCi的加载量)。
的 F，无论应用的 F的量如何(测试10-300mCi的加载量)。
[0541] 我们替代地使用商业的盐水中的18F，其已在QMA柱上进行了纯化。其为商业的骨成像试剂的浓缩形式，因此其可容易地获得并且用于人。在0.5mL结核菌素注射品中以200μL提供活度。
[0542] 放射标记
[0543] 通过将200μL盐水中的18F添加至卷曲密封的管形瓶中的冻干的肽，然后将溶液加热至90-105℃持续15分钟来放射性标记所述肽。通过将1mL注射器中的800mL DI水添加至反应管形瓶，用1mL注射器取出液体并且将液体用于Waters HLB柱(1cc，30mg)来纯化肽。将HLB柱置于卷曲密封的5mL管形瓶上，在通过远距离(使用无菌一次性的线)10mL注射器提供的真空下将液体抽入管形瓶中。用2个1mL等份的DI水洗涤反应管形瓶，也将所述DI水抽吸通过柱。然后再用1mL DI水洗涤注子。然后将柱移至含有缓冲的冻干的抗坏血酸(~pH 5.5，15mg)的管形瓶。用3个200份的1:1EtOH/DI水洗脱放射性标记的产物。通过在反应管形瓶中、水洗液中和产物管形瓶中测量HLB柱上的活度来测定收率，以获得收率百分比。
[0544] 向放射性标记反应中加入乙醇可增加标记收率。可用200μL盐水中的F-18和200μL乙醇的混合物复原20nmol试剂盒。随后将溶液在卷曲密封的管形瓶中加热至
100-110℃持续15分钟。加热后，在于3cc(60mg)HLB提取柱上纯化之前用3mL水稀释反应物。使用该方法可以以良好的收率和高至4,100Ci/mmol的比活度标记肽。
100-110℃持续15分钟。加热后，在于3cc(60mg)HLB提取柱上纯化之前用3mL水稀释反应物。使用该方法可以以良好的收率和高至4,100Ci/mmol的比活度标记肽。
[0545] 当用1.0mCi18F标记时，该试剂盒和所述标记的收率为80-90%。当使用18
F(~100mCi)的更高剂量时，收率下降。然而，如果向标记混合物中加入乙醇，则收率上升。
如果肽在盐水中稀释得太多则收率下降。标记对pH也非常敏感。对于我们的肽和该配体，我们已发现终制剂的最佳pH为pH 4.0±0.2。
F(~100mCi)的更高剂量时，收率下降。然而，如果向标记混合物中加入乙醇，则收率上升。
如果肽在盐水中稀释得太多则收率下降。标记对pH也非常敏感。对于我们的肽和该配体，我们已发现终制剂的最佳pH为pH 4.0±0.2。
[0546] 将50μL 1:1EtOH/H2O中的纯化的放射性标记的肽与150μL的人血清混合，并置于加热至37℃的HPLC自动进样器中，通过RP-HPLC进行分析。甚至在4小时后未在空隙容18
积中观察到高于背景的可检测的 F。
积中观察到高于背景的可检测的 F。
[0547] 表19.IMP 485标记
[0548]
[0549] IMP 486(Al-OHIMP485)的合成和放射性标记
[0550] 将 IMP 485(21.5mg，0.016mmol) 溶 解 在 1mL 2mM NaOAc，pH4.4 中， 用AlCl3.6H2O(13.2mg，0.055mmol)处理。将pH调节至4.5-5.0，将反应混合物回流15分钟。通过制备型RP-HPLC纯化粗制混合物以产生白色固体(11.8mg)。
[0551] 还在配制到冻干的试剂盒后以优良的收率放射性标记预填充的Al-NOTA复合物(IMP 486)。当在盐水中标记时，利用IMP 486的标记收率与IMP 485试剂盒一样好或好于IMP 485试剂盒(表19)。对于任何测试的其它Al-NOTA复合物未观察到利用用铝预加载的螯合剂进行的放射性标记的高功效(数据未显示)。也未观察到在盐水和1:1乙醇/水中标记收率与其它螯合部分的标记的等价性(未显示)。
[0552] 表20.IMP 486标记
[0553]
[0554] 填充剂的影响
[0555] 进行实验以比较使用具有不同填充剂的IMP 485试剂盒(40nmol)的收率。用200微升盐水中的2mCi的来自相同F-18批次的F-18标记肽。按200微升/瓶的剂量，以5重量%的于水中的浓度引入填充剂。我们测试作为填充剂的山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和甘氨酸。结果示于表20。
[0556] 表21.填充剂对放射性标记收率的影响
[0557]填充剂 活度mCi 收率％
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
山梨醇 2.17 82.9
甘氨酸 2.17 41.5
甘露醇 2.11 81.8
蔗糖 2.11 66.1
海藻糖 2.10 81.3
[0558] 山梨醇、甘露醇和海藻糖全都以相同的收率给予放射性标记的产物。蔗糖试剂盒和甘氨酸试剂盒都具有显著较低的收率。当以200μL复原时，将海藻糖以范围在按重量计2.5%至50%内的浓度配制入IMP485试剂盒。对于所有浓度获得相同放射性标记收率~83％，表明IMP485的18F-放射性标记对海藻糖填充剂的浓度不敏感。配制IMP 485试剂盒，并在冻干以评估冻干延迟对放射性标记的影响之前将其在氮气氛下于2-8℃贮存达到3天。放射性标记实验显示在冻干之前对于1、2和3天的延迟在时间为0时收率都为~80%。
[0559] pH对放射性标记的影响
[0560] pH对IMP 485的放射性标记的影响示于表21中。标记的效率是pH敏感性的并且在比约4.0的最佳pH更高或更低的pH下减小。
[0561] 表22.pH对IMP 485的放射性标记效率的影响
[0562]pH 收率％
3.27 33
3.53 61
3.84 85
3.99 88
4.21 89
4.49 80
5.07 14
3.27 33
3.53 61
3.84 85
3.99 88
4.21 89
4.49 80
5.07 14
[0563] 生物分布
[0564] 在携带皮下LS174T肿瘤异种移植物的Taconic裸小鼠中进行生物分布研究。
[0565] 单独的Al18F-IMP 485：用Al18F-IMP 485(28μCi，5.2x10-11mol，100μL，iv)注射携带sc LS174T异种移植物的小鼠。将小鼠在注射后1小时和3小时解剖，每个时间点6只小鼠。
[0566] 以20:1的bsMab-肽比进行的TF2+Al18F-IMP 485预靶向：用TF2(163.2μg，1.03x10-9mol，iv)注射携带sc LS174T异种移植物的小鼠，使其进行清除16.3小时，然后注射Al18F-IMP 485(28μCi，5.2x10-11mol，100μL，iv)。将小鼠在注射后1小时和3小时解剖，每个时间点7只小鼠。
[0567] 表23.在携带LS174T人结肠癌异种移植物的裸小鼠中在肽注射后1小时和3小时TF2预靶向的Al18F[IMP 485]和单独的Al18F[IMP485]的生物分布
[0568]
[0569] IMP 492(Al19FIMP485)的合成
[0570] 将IMP485(16.5mg，0.013mmol)溶解在1mL的2mM NaOAc，pH 4.43，0.5mL乙醇中，用AlF3.3H2O(2.5mg，0.018mmol)处理。将pH调节至4.5-5.0，并将反应混合物回流15分钟。当冷却时，pH再次升高至4.5-5.0，并将反应混合物回流15分钟。通过制备型RP-HPLC纯化粗制物以产生白色固体(10.3mg)。
[0571] IMP 490的合成
[0572] NODA-MPAA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lvs-Thr-Cys-Throl(SEQ ID NO:38)
[0573] 以如下顺序添加氨基酸来在苏氨醇树脂上合成肽：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、
Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和(tBu)2NODA-MPAA。然后使肽裂解并通过制备型RP-HPLC纯化。通过用DMSO处理二巯基肽来环化所述肽。
Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和(tBu)2NODA-MPAA。然后使肽裂解并通过制备型RP-HPLC纯化。通过用DMSO处理二巯基肽来环化所述肽。
[0574] IMP 491(Al19FIMP490)的合成
[0575] 如上所述(IMP492)制备Al19FIMP490以在HPLC纯化后产生期望的肽。
[0576] IMP 493的合成
[0577] NODA-MPAA-(PEG)3-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(SEQ ID NO:39)[0578] 以如下顺序添加氨基酸来在Sieber酰胺树脂上合成肽：Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、
Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-NH-(PEG)3-COOH和(tBu)2NODA-MPAA。然后使肽裂解并通过制备型RP-HPLC纯化。
Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-NH-(PEG)3-COOH和(tBu)2NODA-MPAA。然后使肽裂解并通过制备型RP-HPLC纯化。
[0579] IMP 494(Al19FIMP493)的合成
[0580] 如上所述(IMP492)制备Al19FIMP493以在HPLC纯化后产生期望的肽。
[0581] 实施例33.使用Al18F或Al19F的其它辅基标记方法
[0582] 在某些实施方案中，可使用用于对热敏感的分子的辅基标记法来进行氟化铝标记法。对于热敏感性分子可在更低的温度下进行辅基缀合。
[0583] 如上所述用18F或19F标记辅基NOTA，随后将其连接至靶向分子。在一个非限定性实例中，这可用醛基NOTA来进行，随后将其连接至靶向分子上的氨基-氧基化合物。或者，将氨基-氧基马来酰亚胺与醛反应，然后将马来酰亚胺连接至靶向分子上的半胱氨酸(Toyokuni等，2003，Bioconj Chem 14:1253)。
[0584] 在另一个替代方案中，通过点击化学将AlF-螯合剂复合物连接至靶向分子。首先18 19
如上所论述，用Al F或Al F标记配体。然后通过点击化学反应将AlF-螯合剂缀合至靶向分子。例如，按照Marik和Stucliffe(2006，Tetrahedron Lett 47:6681)标记炔烃NOTA，将其缀合至含有叠氮化物的靶向试剂。
如上所论述，用Al F或Al F标记配体。然后通过点击化学反应将AlF-螯合剂缀合至靶向分子。例如，按照Marik和Stucliffe(2006，Tetrahedron Lett 47:6681)标记炔烃NOTA，将其缀合至含有叠氮化物的靶向试剂。
[0585] 利用盐水中的18F放射性标记试剂盒
[0586] 将18F(0.01mCi或更高)以200μL的盐水接收到0.5mL注射器中，并将所述溶液与200μL乙醇混合，注射到上述冻干的试剂盒。将溶液在卷曲密封的容器中于100-110℃加热15分钟。用3mL水稀释溶液，并通过HLB柱进行洗脱。用2x1mL部分的水洗涤反应管形瓶和柱，然后使用1:1乙醇/水以0.5mL级分将产物洗脱进含有缓冲的抗坏血酸的管形瓶中。可在惰性气体流下将一些乙醇蒸发掉。然后将溶液稀释在盐水中，在注射之前使其通过0.2μm无菌过滤器。
[0587] 实施例34.用于18F标记的NOTA的马来酰亚胺缀合物
[0588] 如上文中论述的，在某些实施方案中，NOTA的马来酰亚胺衍生物可具有用于低温标记分子的用途。制备马来酰亚胺衍生的NOTA的示例性方法论述于下文中。详细内容示于图15。
[0589] 二-叔-丁基-NODA-MPAA NHS酯：(tBu)2NODA-MPAA NHS酯的合成
[0590] 向 CH2Cl2(5mL) 中 的 (tBu)2NODA-MPAA(175.7mg，0.347mmol) 溶 液 添 加347μL(0.347mmol)DCC(1M于CH2C12中)、42.5mg(0.392mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和20μL N，N-二异丙基乙胺(DIEA)。3h后，过滤掉DCU，蒸发溶剂。在(230-400目)硅胶(CH2Cl2:MeOH::100:0至80:20)上通过快速色谱法纯化粗制混合物以产生(128.3mg，+
61.3%)的NHS酯。C31H46N4O8(M+H) 的HRMS(ESI)计算值为603.3388，实测值为603.3395。
61.3%)的NHS酯。C31H46N4O8(M+H) 的HRMS(ESI)计算值为603.3388，实测值为603.3395。
[0591] NODA-MPAEM：(MPAEM=甲基苯基乙酰氨基乙基马来酰亚胺)的合成
[0592] 向CH2Cl2(5mL)中的(tBu)2NODA-MPAA NHS酯(128.3mg，0.213mmol)溶液中添加250μL DMF和20μL DIEA中的52.6mg(0.207mmol)N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐溶液。3h后，蒸发溶剂，用2mL TFA处理浓缩物。用水稀释粗制产物，通过制备型RP-HPLC+
纯化以产生(49.4mg，45%)期望的产物。C25H33N5O7(M+H) 的HRMS(ESI)计算值为516.2453，实测值为516.2452。
纯化以产生(49.4mg，45%)期望的产物。C25H33N5O7(M+H) 的HRMS(ESI)计算值为516.2453，实测值为516.2452。
[0593] NODA-MPAEM的18F标记
[0594] 向10μL(20nmol)2mM NODA-MPAEM溶液中添加5μL 2mMAlCl3、40μL18F溶液18
[2.41mCi，Na F，PETNET]，然后添加50μLCH3CN并且加热至110℃持续15分钟。通过将所
18
得的溶液转移到 1cc(30mg)柱中并用DI H2O洗脱以除去未结合的 F，然后
18
用1:1EtOH/H2O洗脱 F-标记的肽来纯化粗制反应混合物。将粗制溶液通过HLB柱以进入
5mL管形瓶，用3x1mL DI H2O(49.9μCi)级分洗涤柱。然后将HLB柱置于新的3mL管形瓶中，用4x200μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(0.978mCi)。反应容器保持7.73μCi，而柱保持22.1μCi的活度。
[2.41mCi，Na F，PETNET]，然后添加50μLCH3CN并且加热至110℃持续15分钟。通过将所
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得的溶液转移到 1cc(30mg)柱中并用DI H2O洗脱以除去未结合的 F，然后
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用1:1EtOH/H2O洗脱 F-标记的肽来纯化粗制反应混合物。将粗制溶液通过HLB柱以进入
5mL管形瓶，用3x1mL DI H2O(49.9μCi)级分洗涤柱。然后将HLB柱置于新的3mL管形瓶中，用4x200μL1:1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(0.978mCi)。反应容器保持7.73μCi，而柱保持22.1μCi的活度。
[0595] 0.978mCi=>92.5%的Al18F(NODA-MPAEM)。
[0596] 实施例34.hMN14F(ab′)2的制备和标记
[0597] 胃蛋白酶消化-向90ml的9.8mg/ml hMN14IgG C/N 0206078(总共882mg)中加入9.0ml的0.1M柠檬酸盐，pH 3.5缓冲液，用1M柠檬酸调节至pH 3.7，添加1.2ml的0.1M柠檬酸盐，pH 3.5缓冲液中的1mg/ml胃蛋白酶(胃蛋白酶的终浓度为12μg/ml)。将混合物在37℃孵育40分钟。通过SE-HPLC监控消化，并通过加入10%3M Tris，pH 8.6终止反应。
[0598] 纯化-在蛋白A柱(2.5x8cm，40mL)上进行纯化。收集流过液(flowthrough)(150ml)，其包含未结合的F(ab′)2峰。将F(ab′)2通过0.22μm过滤器进行过滤。终浓度为15mg/ml(33ml，总共500mg)。第二步骤包括 柱色谱(1x20，16mL)。浓缩蛋白A纯化的hMN14F(ab′)2，利用30K搅拌式超滤装置(stir cell)将其渗滤至
0.02MTris，0.01M NaCl，pH 8.5中。将F(ab′)2加载至 柱上。收集
流过峰(flow-through peak)，合并级分3和4，浓缩并且渗滤入0.04M PBS，pH 7.4。使用
0.22μm过滤器过滤后，终浓度为5.5mg/ml，40mL，总共220mg蛋白质。
0.02MTris，0.01M NaCl，pH 8.5中。将F(ab′)2加载至 柱上。收集
流过峰(flow-through peak)，合并级分3和4，浓缩并且渗滤入0.04M PBS，pH 7.4。使用
0.22μm过滤器过滤后，终浓度为5.5mg/ml，40mL，总共220mg蛋白质。
[0599] 冻干的hMN14Fab′SH的制备-如下进行TCEP还原。向3.8mL的5.5mg/mLhMN14F(ab′)2(总共20.9mg)加入0.38mL的稀释于PBS中的20mM TCEP-HCl。将混合物在室温下孵育2小时，通过SE-HPLC监控反应。浓缩Fab′SH并且利用10K搅拌式超滤装置(stir cell)将其渗滤入制剂缓冲液(0.025M NaOAc，5%海藻糖，pH 6.7)。使用约80mL缓冲液。将抗体通过0.22μm过滤器进行过滤。终浓度为2.3mg/mL(9mL，总共20.7mg)。每抗体的巯基含量通过Elman′s测定法测定为2.4个SH/Fab。使用0.45mL(1mg蛋白质)/瓶进行冻干。
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[0600] F-标记-将冻干的hMN-14Fab′溶解在100μL20mM PBS，pH7.01中。用20nmol18
的 F标记NODA-MPAEM。然后将600μL的F-18NODA-MPAEM(于1∶1EtOH/H2O中)添加至Fab′管形瓶，将混合物在RT下孵育10分钟，然后在 离心柱上进行
纯化。约80%的添加的活度(80%收率)作为标记的抗体从离心柱洗脱。在添加CEA后，几乎所有活度被SEC偏转，这表明标记与抗体Fab′片段相关。
的 F标记NODA-MPAEM。然后将600μL的F-18NODA-MPAEM(于1∶1EtOH/H2O中)添加至Fab′管形瓶，将混合物在RT下孵育10分钟，然后在 离心柱上进行
纯化。约80%的添加的活度(80%收率)作为标记的抗体从离心柱洗脱。在添加CEA后，几乎所有活度被SEC偏转，这表明标记与抗体Fab′片段相关。
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