三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的医药用途
阅读：505发布：2020-05-15
专利汇可以提供三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的医药用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及3，14，19－三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子 抑制剂 中的应用，其中炎性细胞因子包括TNF－α、IL－1α、IL－1β、IL－2、IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、IFN－γ、NO中的任何一种。，下面是三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的医药用途专利的具体信息内容。
1.3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制剂中的应用。
2.权利要求1所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子为前炎症细胞因子。
3.权利要求1所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子为具有炎性特质的一氧化氮(NO)。
4.权利要求2所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，所述前炎症细胞因子为TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ中的任何一种。
5.权利要求1所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子抑制剂可用于治疗下述疾病中的任 何一种或几种：全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克、感染性 休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、风 湿性关节炎、高血压、冠心病、心肌梗塞、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、 狼疮性肾炎、硬皮病、结节病、皮肌炎、白塞氏病、银屑病、抑郁症、呼吸道病 毒感染、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、炎症性肠病、获得性免疫缺 陷综合征、Castleman氏病、帕金森氏症、早老性痴呆、血管性头痛、中枢神经 损伤、脑梗塞、急性脑出血、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、 慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、肾小球肾炎、失血性休克、 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、心脏粘液瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨 髓增生异常综合征、肿瘤、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周病、 细菌感染、肥胖。
6.权利要求3所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，当所述炎性细胞因子为NO时，3，14，19—三乙酰 穿心莲内酯可用于治疗下列病症中的一种或几种：骨性关节炎、类风湿性关节炎、 风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、脓毒性休克、 多器官功能障碍综合征、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力 衰竭、肾小球肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血 管性头痛、哮喘、肿瘤。
7.权利要求4所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，当所述前炎症细胞因子为TNF-α时，3，14，19—三 乙酰穿心莲内酯可用于治疗下列病症中的一种或几种：全身炎性反应综合症、脓 毒血症、脓毒性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、 脊柱关节病、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节 病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、白 塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、中枢神经损伤、呼吸道病毒感染、 多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜 炎、牙周病、肥胖。
8.权利要求4所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，当所述前炎症细胞因子为IL-1β时，3，14，19—三 乙酰穿心莲内酯可用于治疗下列病症中的一种或几种：类风湿性关节炎、全身炎 性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍 综合征、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、骨性关节 炎、细菌感染、多发性骨髓瘤、早老性痴呆、骨性关节炎、呼吸道病毒感染、哮 喘、抑郁症、硬皮病。
9.权利要求4所述的3，14，19—三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制 剂中的应用，其特征在于，当所述前炎症细胞因子为IL-6时，3，14，19—三乙 酰穿心莲内酯可用于治疗下列病症中的一种或几种：类风湿性关节炎、全身炎性 反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综 合征、获得性免疫缺陷综合征、心脏粘液瘤、Castleman氏病、急性脑出血、急 性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰 腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、失血性 休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、肿瘤。
技术领域
本发明涉及三乙酰穿心莲内酯在制备炎性细胞因子抑制剂中的应用。
背景技术
炎性细胞因子主要由巨噬细胞分泌，包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ等前炎症细胞因子与具有炎性因子特性的一氧化氮(NO) 等。其中研究最多的为TNF-α、IL-1β、IL-6、NO。炎性细胞因子的过量分泌在 许多疾病的发生发展中起着重要作用。如：全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒 血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、骨 性关节炎、脊柱关节病、风湿性关节炎、高血压、冠心病、心肌梗塞、心力衰竭、 糖尿病、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、硬皮病、结节病、皮肌炎、白塞氏病、 银屑病、抑郁症、呼吸道病毒感染、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、 炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合征、Castleman氏病、帕金森氏症、早老性痴 呆、血管性头痛、中枢神经损伤、脑梗塞、急性脑出血、脑损伤、脑损伤后感染 性并发症、流感病毒性脑病、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、 肾小球肾炎、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、心脏粘液瘤、急性髓性 白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、肿瘤、坏疽性脓皮病、移植物抗 宿主病、葡萄膜炎、牙周病、细菌感染、肥胖等。故炎性细胞因子抑制剂的开发 已成为医药研究工作者关注的热点领域。
TNF-α是一种前炎症细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，参与多种 炎症反应的过程。内毒素(LPS)是TNF-α的诱导剂。研究发现，TNF-α具有杀 伤或抑制肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、增加过氧化物阴离子产生、参 与炎症反应、抗感染等生物活性。据文献报道，抑制TNF-α的释放可用于多种 疾病的治疗，包括全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障 碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎症性肠病、心力衰竭、 糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、 帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰 腺炎、中枢神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、 坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周病、肥胖。
IL-1β是由单核巨噬细胞、树突状细胞、纤维母细胞等产生的一种前炎症细 胞因子。它能刺激T细胞和B细胞的增殖和分化、刺激造血以及参与炎症反应。 据文献报道，IL-1β抑制剂可用于类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、 脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、牙周病、心力衰 竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、骨性关节炎、细菌感染、多发性骨 髓瘤、早老性痴呆、骨性关节炎、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁症、硬皮病等。
IL-6是由淋巴样和某些非淋巴样细胞产生的一种前炎症细胞因子。它具有刺 激细胞生长、促进细胞分化、加速肝细胞急性期蛋白(acute phase protein)的合成、 抑制M1髓样白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化等生物活性。IL-6与临床 上多种疾病的发生有一定的关系，如类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征 (SIRS)、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症、获得性 免疫缺陷综合征、心脏粘液瘤、Castleman氏病等自身免疫性疾病；急性脑出血、 急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症 胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、失血 性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、肿瘤等【慕澜，魏连波，李学.白介素6 的研究进展.深圳中西医结合杂志，2003，13(3)：185-188；赵有成，南琼，柯 青.脓毒症患者血清IL-6水平检测的临床评价.中国医师杂志，2006，(5)：608-610 等】。
一氧化氮参与机体许多生理和病理过程，参与巨噬细胞的细胞毒和免疫调 节、松驰血管平滑肌、抑制血小板聚集和传递神经信息等，同时在炎症反应中也 发挥复杂作用。一氧化氮生成过量或不足在许多疾病的发生中皆起着重要作用。 其中一氧化氮生成过量可见于：骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障 碍综合征、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球 肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮 喘、肿瘤【余跃.一氧化氮与疾病.北京；科学出版社】。
3，14，19—三乙酰穿心莲内酯(简称三乙酰穿心莲内酯)为穿心莲内酯经 结构改造后获得的化合物，结构式如下：
该化合物在日本专利文献中有报道，即JP63088124公开三乙酰穿心莲内酯 的结构式、制备方法及其抗肿瘤用途；另中国专利文献CN1695612亦公开该化 合物的结构、制备方法及抗炎、免疫抑制与抗肿瘤作用。但上述文献对三乙酰穿 心莲内酯抗炎、免疫抑制、抗肿瘤的作用仅公开了该化合物对蛋清所致大鼠足肿 胀动物模型的影响、小鼠炭粒廓清实验、对DNCB丙酮激发小鼠迟发型变态反 应的影响及体内外抗肿瘤的抑瘤活性，而未曾研究与揭示该化合物的抗炎、免疫 抑制、抗肿瘤的机理，亦未曾对该化合物对炎性细胞因子的抑制作用进行研究。 从中国专利文献CN1695612公开的实验数据分析，三乙酰穿心莲内酯对蛋清所 致大鼠足肿胀动物模型的影响、小鼠炭粒廓清实验、抗肿瘤活性虽较穿心莲内酯 强，但活性提高辐度很小，而且对DNCB丙酮激发小鼠迟发型变态反应的影响 实验显示活性没有提高。从以上分析可见，穿心莲内酯三乙酰化以后各种药理活 性的变化如何尚需进行研究方能得知。
中国专利文献CN1666985公开穿心莲内酯及其衍生物体外对TNF-α、IL-1β 的抑制活性，但其公开的化合物通式为3位未曾进行结构改变，即为羟基的穿心 莲内酯衍生物，而且其中公开的实施例中几个具代表性的穿心莲内酯类化合物抑 制TNF-α、IL-1β的活性中以穿心莲内酯为最强，且根据其公开的实验数据可知， 穿心莲内酯抑制TNF-α、IL-1β的活性为其它穿心莲内酯衍生物的数倍。可见该 专利文献并未公开三乙酰穿心莲内酯对炎性细胞因子的抑制作用。
综上所述可见，即使将上述所有公开的关于穿心莲内酯及三乙酰穿心莲内酯 的内容组合，亦无法推测出三乙酰穿心莲内酯是否具有炎性细胞因子抑制作用及 活性如何。
TNF-α是一种前炎症细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，参与多种 炎症反应的过程。内毒素(LPS)是TNF-α的诱导剂。研究发现，TNF-α具有杀 伤或抑制肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、增加过氧化物阴离子产生、参 与炎症反应、抗感染等生物活性。据文献报道，抑制TNF-α的释放可用于多种 疾病的治疗，包括全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障 碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎症性肠病、心力衰竭、 糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、 帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰 腺炎、中枢神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、 坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周病、肥胖。
IL-1β是由单核巨噬细胞、树突状细胞、纤维母细胞等产生的一种前炎症细 胞因子。它能刺激T细胞和B细胞的增殖和分化、刺激造血以及参与炎症反应。 据文献报道，IL-1β抑制剂可用于类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、 脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、牙周病、心力衰 竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、骨性关节炎、细菌感染、多发性骨 髓瘤、早老性痴呆、骨性关节炎、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁症、硬皮病等。
IL-6是由淋巴样和某些非淋巴样细胞产生的一种前炎症细胞因子。它具有刺 激细胞生长、促进细胞分化、加速肝细胞急性期蛋白(acute phase protein)的合成、 抑制M1髓样白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化等生物活性。IL-6与临床 上多种疾病的发生有一定的关系，如类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征 (SIRS)、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症、获得性 免疫缺陷综合征、心脏粘液瘤、Castleman氏病等自身免疫性疾病；急性脑出血、 急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症 胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、失血 性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、肿瘤等【慕澜，魏连波，李学.白介素6 的研究进展.深圳中西医结合杂志，2003，13(3)：185-188；赵有成，南琼，柯 青.脓毒症患者血清IL-6水平检测的临床评价.中国医师杂志，2006，(5)：608-610 等】。
一氧化氮参与机体许多生理和病理过程，参与巨噬细胞的细胞毒和免疫调 节、松驰血管平滑肌、抑制血小板聚集和传递神经信息等，同时在炎症反应中也 发挥复杂作用。一氧化氮生成过量或不足在许多疾病的发生中皆起着重要作用。 其中一氧化氮生成过量可见于：骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障 碍综合征、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球 肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮 喘、肿瘤【余跃.一氧化氮与疾病.北京；科学出版社】。
3，14，19—三乙酰穿心莲内酯(简称三乙酰穿心莲内酯)为穿心莲内酯经 结构改造后获得的化合物，结构式如下：
该化合物在日本专利文献中有报道，即JP63088124公开三乙酰穿心莲内酯 的结构式、制备方法及其抗肿瘤用途；另中国专利文献CN1695612亦公开该化 合物的结构、制备方法及抗炎、免疫抑制与抗肿瘤作用。但上述文献对三乙酰穿 心莲内酯抗炎、免疫抑制、抗肿瘤的作用仅公开了该化合物对蛋清所致大鼠足肿 胀动物模型的影响、小鼠炭粒廓清实验、对DNCB丙酮激发小鼠迟发型变态反 应的影响及体内外抗肿瘤的抑瘤活性，而未曾研究与揭示该化合物的抗炎、免疫 抑制、抗肿瘤的机理，亦未曾对该化合物对炎性细胞因子的抑制作用进行研究。 从中国专利文献CN1695612公开的实验数据分析，三乙酰穿心莲内酯对蛋清所 致大鼠足肿胀动物模型的影响、小鼠炭粒廓清实验、抗肿瘤活性虽较穿心莲内酯 强，但活性提高辐度很小，而且对DNCB丙酮激发小鼠迟发型变态反应的影响 实验显示活性没有提高。从以上分析可见，穿心莲内酯三乙酰化以后各种药理活 性的变化如何尚需进行研究方能得知。
中国专利文献CN1666985公开穿心莲内酯及其衍生物体外对TNF-α、IL-1β 的抑制活性，但其公开的化合物通式为3位未曾进行结构改变，即为羟基的穿心 莲内酯衍生物，而且其中公开的实施例中几个具代表性的穿心莲内酯类化合物抑 制TNF-α、IL-1β的活性中以穿心莲内酯为最强，且根据其公开的实验数据可知， 穿心莲内酯抑制TNF-α、IL-1β的活性为其它穿心莲内酯衍生物的数倍。可见该 专利文献并未公开三乙酰穿心莲内酯对炎性细胞因子的抑制作用。
综上所述可见，即使将上述所有公开的关于穿心莲内酯及三乙酰穿心莲内酯 的内容组合，亦无法推测出三乙酰穿心莲内酯是否具有炎性细胞因子抑制作用及 活性如何。
发明内容
本发明的目的是研究三乙酰穿心莲内酯对炎性细胞因子的抑制活性。其中所 述炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、 NO。
本发明提供了三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的应用。其中所述 炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、 NO。
本发明尤其提供了三乙酰穿心莲内酯在制备TNF-α抑制剂、IL-1β抑制剂、 IL-6抑制剂、一氧化氮生成抑制剂中的用途。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂可用于治疗下列病 症，包括但不限于：全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克、感 染性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、 风湿性关节炎、炎症性肠病、高血压、冠心病、心肌梗塞、心力衰竭、糖尿病、 系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、硬皮病、结节病、皮肌炎、白塞氏病、银屑病、 抑郁症、呼吸道病毒感染、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、获得性免 疫缺陷综合征、Castleman氏病、帕金森氏症、早老性痴呆、血管性头痛、中枢 神经损伤、脑梗塞、急性脑出血、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性 脑病、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、肾小球肾炎、失血性 休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、心脏粘液瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓 瘤、骨髓增生异常综合征、肿瘤、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、 牙周病、细菌感染、肥胖。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为TNF-α抑制剂可用于治疗下列病症，包 括但不限于：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障碍综 合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎症性肠病、心力衰竭、糖 尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、 帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰 腺炎、中枢神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、 坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周病、肥胖。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为IL-1β抑制剂可用于治疗下列病症包括但 不限于：类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰 腺炎、慢性阻塞性肺病、骨性关节炎、细菌感染、多发性骨髓瘤、早老性痴呆、 骨性关节炎、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁症、硬皮病等。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为IL-6抑制剂可用于治疗下列病症，包括 但不限于：类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性 休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、获得性免疫缺陷综合征、心脏粘液 瘤、Castleman氏病等自身免疫性疾病；急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑 损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢 性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸 暂停综合征、肿瘤。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为一氧化氮生成抑制剂可用于治疗下列病 症，包括但不限于：骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑 狼疮、全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障碍综合征、 感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球肾炎、肝硬 化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮喘、肿瘤。
在实现上述发明目的的过程中，产生以下两点意想不到的技术效果：
1、三乙酰穿心莲内酯体外前炎症因子抑制活性较穿心莲内酯提高1倍乃至 数倍。
2、通过发明人的大量研究发现：3位或14位乙酰化后可大大提高穿心莲内 酯类化合物的炎性细胞因子抑制活性。
本发明所述的三乙酰穿心莲内酯可以单独使用或以药物组合物的形式使用。 药物组合物包括作为活性成分的三乙酰穿心莲内酯及可药用载体。可药用载体不 会破坏本化合物的活性。
本发明所述三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的有效剂量范围为 0.003-6mg/kg/日/人。以上用量是根据体外试验及动物药理实验结果推算的，因 人体与动物的差异性、体内外的差异性、疾病的差异性、具体炎性细胞因子的差 异性，故允许临床实际用量有所调整。
用法：可根据具体疾病进行选择。下面实验例是以内毒素诱发兔体内炎性细 胞因子异常分泌模型为例，旨在说明三乙酰穿心莲内酯体内亦具有抗炎性细胞因 子分泌过多的作用，而非对给药途径的限制。
下面给出具体实施例用以对本发明进行解释。
本发明提供了三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的应用。其中所述 炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、 NO。
本发明尤其提供了三乙酰穿心莲内酯在制备TNF-α抑制剂、IL-1β抑制剂、 IL-6抑制剂、一氧化氮生成抑制剂中的用途。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂可用于治疗下列病 症，包括但不限于：全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休克、感 染性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、 风湿性关节炎、炎症性肠病、高血压、冠心病、心肌梗塞、心力衰竭、糖尿病、 系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、硬皮病、结节病、皮肌炎、白塞氏病、银屑病、 抑郁症、呼吸道病毒感染、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、获得性免 疫缺陷综合征、Castleman氏病、帕金森氏症、早老性痴呆、血管性头痛、中枢 神经损伤、脑梗塞、急性脑出血、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性 脑病、慢性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、肾小球肾炎、失血性 休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、心脏粘液瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓 瘤、骨髓增生异常综合征、肿瘤、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、 牙周病、细菌感染、肥胖。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为TNF-α抑制剂可用于治疗下列病症，包 括但不限于：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障碍综 合征、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎症性肠病、心力衰竭、糖 尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、 帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰 腺炎、中枢神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、 坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周病、肥胖。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为IL-1β抑制剂可用于治疗下列病症包括但 不限于：类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰 腺炎、慢性阻塞性肺病、骨性关节炎、细菌感染、多发性骨髓瘤、早老性痴呆、 骨性关节炎、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁症、硬皮病等。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为IL-6抑制剂可用于治疗下列病症，包括 但不限于：类风湿性关节炎、全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性 休克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、获得性免疫缺陷综合征、心脏粘液 瘤、Castleman氏病等自身免疫性疾病；急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑 损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢 性肾功能不全、原发性肾病综合征、返流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸 暂停综合征、肿瘤。
前面所述的三乙酰穿心莲内酯作为一氧化氮生成抑制剂可用于治疗下列病 症，包括但不限于：骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑 狼疮、全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、多器官功能障碍综合征、 感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球肾炎、肝硬 化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮喘、肿瘤。
在实现上述发明目的的过程中，产生以下两点意想不到的技术效果：
1、三乙酰穿心莲内酯体外前炎症因子抑制活性较穿心莲内酯提高1倍乃至 数倍。
2、通过发明人的大量研究发现：3位或14位乙酰化后可大大提高穿心莲内 酯类化合物的炎性细胞因子抑制活性。
本发明所述的三乙酰穿心莲内酯可以单独使用或以药物组合物的形式使用。 药物组合物包括作为活性成分的三乙酰穿心莲内酯及可药用载体。可药用载体不 会破坏本化合物的活性。
本发明所述三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂的有效剂量范围为 0.003-6mg/kg/日/人。以上用量是根据体外试验及动物药理实验结果推算的，因 人体与动物的差异性、体内外的差异性、疾病的差异性、具体炎性细胞因子的差 异性，故允许临床实际用量有所调整。
用法：可根据具体疾病进行选择。下面实验例是以内毒素诱发兔体内炎性细 胞因子异常分泌模型为例，旨在说明三乙酰穿心莲内酯体内亦具有抗炎性细胞因 子分泌过多的作用，而非对给药途径的限制。
下面给出具体实施例用以对本发明进行解释。
具体实施方式
穿心莲内酯粗品可以购买市售品，如四川广汉本草植化有限公司；亦可采用 常规方法提取分离获得。其余化学试剂均为市售品(分析纯)；油酸、精制蛋黄 卵磷脂(供注射用)：购自上海东尚实业有限公司；中链油、大豆油(供注射用)： 购自铁岭北亚药用油有限公司；甘油(供注射用)购自浙江遂昌惠康药业有限公 司。
制备例1 穿心莲内酯的制备
取穿心莲内酯粗品20g，72℃溶于450mL甲醇中，静置24小时抽滤得白色 晶体，干燥得穿心莲内酯。
制备例2 三乙酰穿心莲内酯的制备
1g穿心莲内酯溶于10mLAc2O，加热回流2小时，反应混合物用乙酸乙酯萃 取，有机层依次用水、饱和NaHCO3和饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥。经硅 胶柱层析得三乙酰穿心莲内酯白色固体。分子式为：C26H36O8。
化合物确认数据如下：
(cm-1)：3454，3080，2954，1731，1683，1375，1250，1191，1075，1026，895， 606。
1H(400MHz，CDCl3):δ
7.00(td，J＝6.84，1.48Hz，1H，H-12)，5.92(d，J＝5.96Hz，1H，H-14)，4.90(bs， 1H，H-17a)，4.60(dd，J＝11.68，4.26Hz，1H，H-15a)，4.55(dd，J＝11.24，6.08Hz， 1H，H-15b)，4.53(bs，1H，H-17b)，4.36(d，J＝11.80Hz，1H，H-19a)，4.25(dd，J＝ 11.24，1.80Hz，1H，H-3)，4.12(d，J＝11.80Hz，1H，H-19b)，2.52～2.37(m，3H)，2.12 (s，3H)，2.05(s，6H)，2.00～1.96(m，1H)，1.90～1.86(m，2H)，1.80～1.77(m，2H)， 1.73～1.66(m，1H)，1.57～1.47(m，1H)，1.37～1.31(m，2H)，1.03(s，3H，CH3-8)，0.76 (s，3H，CH3-20)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ
170.8，170.4，170.3，168.9，150.0，146.5，124.0，108.8，79.6，71.5，67.7，64.6， 55.8，55.2，41.2，38.9，37.8，37.0，25.1，24.6，24.2，22.6，21.1，21.0，20.6，14.4。
MS(ESI)m/z(％)：499([M+Na]+，100％)，477([M+H]+，13％)。
制备例3 3，19-二乙酰穿心莲内酯、14-乙酰穿心莲内酯、14，19-二乙酰穿心莲内 酯的制备
5g穿心莲内酯加入30mL乙酸搅拌加热至80℃，反应过夜。用乙酸乙酯萃 取，有机层依次用水和饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥。柱层析得3，19-二乙酰 穿心莲内酯(AP11)、14，19-二乙酰穿心莲内酯(AP12)、14-乙酰穿心莲内酯 (AP13)。
AP11化合物确认数据如下：
分子式：C24H34O7(434)
1H(400MHz，CDCl3)：6.97(1H，m，H-12)，5.03(1H，d，J＝5.6Hz，H-14)， 4.92(1H，s，H-17)，4.62(1H，s，H-17)，4.59(1H，dd，J＝11.2，4.8Hz，H-3)，4.47(1H，dd，J＝10.4，6 .0Hz，H-15)，4.38(1H，d，J＝11.6Hz，H-19)，4.26(1H，dd，J＝10.4，2.0Hz，H-15)，4.11(1H，d，J＝ 12.0Hz，H-19)，2.05(6H，s，CH3CO-)，1.04(3H，s，H-18)，0.78(3H，s，H-20)。
AP12化合物确认数据如下：
分子式：C24H34O7(434)
1H(400MHz，CDCl3)：7.00(1H，m，H-12)，5.91(1H，d，J＝6.0Hz，H-14)， 4.90(1H，s，H-17)，4.55(1H，dd，J＝11.2，6.0Hz，H-15)4.52(1H，s，H-17)，4.35(1H，d，J＝13.6H z，H-19)，4.25(1H，dd，J＝11.2，1.6Hz，H-15)，4.13(1H，d，J＝11.6Hz，H-19)，3.33(1H，dd，J＝12. 0，4.0Hz，H-3)，2.13(3H，s，CH3CO-)，2.06(3H，s，)，1.16(3H，s，H-18)，0.71(3H，s，H-20)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3)：170.9，170.5，169.0，150.3，146.6，124.0，108.8， 78.8，71.6，67.8，64.9，55.8，55.3，42.4，39.0，37.8，37.2，27.8，25.2，24.2，22.5，21.0， 20.7，14.7。
AP13化合物确认数据如下：
分子式：C22H32O6(392)m.p.169℃
(cm-1)：3436，2927，1738，1641，1384，1233，1077，1024，723，621。
1H(400MHz，Acetone)：
6.88(1H，td，J＝6.8，1.6Hz，H-12)，6.03(1H，d，J＝6.0Hz，H-14)，4.87(1H，d，J＝1.2Hz，H-1 7)，4.59(1H，d，J＝1.2Hz，H-17)，4.58(1H，dd，J＝11.2，6.0Hz，H-15)，4.26(1H，dd，J＝11.0，1.6H z，H-15)，4.11(1H，d，J＝10.8Hz，H-19)，3.42(1H，m，H-3)，3.28(1H，t，J＝10.4Hz，H-19)，2.08(3 H，s，CH3CO-)，1.20(3H，s，H-18)，0.70(3H，s，H-20)。
MS(ESI)m/z(％)：415([M+Na]+，100％)，393([M+H]+，56％)。
制备例4 三乙酰穿心莲内酯乳剂的制备
将三乙酰穿心莲内酯1.0g、蛋黄卵磷脂12g、加入到中链油20g和大豆油80g 的混合油中，加入油酸0.4g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油 相；将甘油22.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有三乙酰穿心 莲内酯的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至1000ml 后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟， 即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径164nm。
制备例5 空白乳的制备
将蛋黄卵磷脂12g、加入到中链油20g和大豆油80g的混合油中，加入油酸 0.4g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油22.5g溶于80ml 水中形成水相，加热至60-80℃；把油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所 得初乳加水定容至1000ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分 装后121℃灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径176nm。
实验例1 三乙酰穿心莲内酯体外TNF-α抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞RAW264.7 购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素、胎牛血清购 自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek)； 恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司)。Mouse TNF-αELISA试剂盒为R&D公 司产品，由晶美生物工程有限公司分装。穿心莲内酯、三乙酰穿心莲内酯样品： 按制备例1、2制备，并以DMSO溶解并稀释至合适浓度。
2、小鼠巨噬细胞RAW264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、TNF-α释放量的测定：
用RPMI 1640培养液将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5×105cells/mL，接 种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h 后，每孔加入LPS(1μg/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不 加入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品设3个平行孔。在37℃、 CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进 行标准曲线绘制和样品测定。
4、实验结果：三乙酰穿心莲内酯与穿心莲内酯皆可显著抑制LPS诱导的TNF-α 的分泌，前者IC50为后者的5倍以上，两者的活性皆远远高于氢化可的松。详见 下表1。
表1 各受试物体外TNF-α抑制活性
注：与模型组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实验例2 三乙酰穿心莲内酯体外IL-6抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞RAW 264.7 购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素、胎牛血清购 自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek)； 恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司)。Mouse IL-6ELISA试剂盒为R&D公司 产品，由上海森雄公司分装。穿心莲内酯、三乙酰穿心莲内酯样品：按制备例1、 2制备，并以DMSO溶解并稀释至合适浓度。
2、小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、IL-6释放量的测定：
用RPMI 1640培养液将小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释至5×105cells/mL，接 种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h 后，每孔加入LPS(1μg/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不 加入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品设3个平行孔。在37℃、 CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进 行标准曲线绘制和样品测定。
4、实验结果：三乙酰穿心莲内酯与穿心莲内酯皆可显著抑制LPS诱导的IL—6 的分泌，前者IC50为后者的2倍，两者的活性皆远远高于氢化可的松。详见表2。
表2 各受试物体外IL-6抑制活性
注：与模型组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实验例3 三乙酰穿心莲内酯体外NO抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MTT购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞 RAW264.7购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养基、青霉素、链霉素、 胎牛血清购自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美 国，Biotek集团生产)；恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司生产)。穿心莲内 酯、三乙酰穿心莲内酯、14-乙酰穿心莲内酯、3，19-二乙酰穿心莲内酯、14，19- 二乙酰穿心莲内酯样品：按制备例1、2、3制备，并以DMSO溶解用于体外细 胞实验。
2、小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、NO释放量的测定：
由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(NO2-)，故 采用Griess法测定样品中NO2-的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A： w(N-萘乙二胺盐酸盐)＝0.1％溶于水中；Griess试剂B：w(对氨基苯磺酰胺) ＝1％溶于(H3PO4)＝5％中，使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640 培养基将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5×105cells/mL，接种于96孔细胞培养 板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h后，每孔加入LPS(1 μg/mL)和不同浓度(0.1-200μmol/L)的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不加 入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品4个重复。在37℃、CO2恒 温培养箱中培养24h后吸取培养液上清100μL至酶标板中，加入等体积的Griess 试剂，室温反应10min后测定540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50 μmol/L的NaNO2绘制标准曲线，根据NaNO2标准曲线计算细胞培养上清液中 NO2-的浓度以及对NO释放的抑制率，抑制率计算公式为：
4、结果：测得抑制率后，计算各样品的IC50。详见下表3。
表3 各受试物体外NO抑制活性
从上表可见，三乙酰穿心莲内酯虽较3，19-二乙酰穿心莲内酯仅差14位的乙 酰基，但NO抑制活性却提高近6倍。14-乙酰穿心莲内酯较穿心莲内酯亦差14 位的乙酰基，但NO抑制活性却提高4倍余。可见14位的乙酰化对穿心莲内酯 类化合物的活性影响显著。三乙酰穿心莲内酯虽较14，19-二乙酰穿心莲内酯仅差 3位的乙酰基，但NO抑制活性却提高近6倍。可见3位的乙酰化对穿心莲内酯 类化合物的活性影响显著。
由于内毒素休克模型为全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症的代表模型，而炎性细胞因子 在上述疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用，而且该模型在阐述炎性细胞 因子与炎性细胞因子相关性疾病之间的关系中最具代表性，故下面以兔内毒素休 克模型为代表，阐述下面几方面内容：
1、三乙酰穿心莲内酯的体内炎性细胞因子抑制作用；
2、三乙酰穿心莲内酯对全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症的治疗作用；
3、三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂可用以治疗发明内容中所述 疾病的依据。
实验例4 三乙酰穿心莲内酯对兔内毒素休克模型的影响(三乙酰穿心莲内酯体内 对炎性细胞因子的抑制作用)
1、试验材料
1.1 受试品和阳性对照药：三乙酰穿心莲内酯乳剂及空白乳：按制备例4、5 制备；地塞米松注射液，天津药业集团新郑股份有限公司产品。
1.2 动物：日本大耳白兔，雌雄兼用，体重2.5～3.0kg，合格证号： SCXK-(吉)2003-0004，购自长春高新医学动物实验研究中心。
1.3 试剂：大肠杆菌内毒素(LPS，E.coli0111:B4)，为Sigma公司产品。白细 胞介素-1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子(TNF-α)放免测定试剂盒，解放军总医院科 技开发中心放免所生产。一氧化氮(NO)检测试剂盒，南京建成生物工程研究 所产品。
1.4 仪器：BL-820型八导生理记录仪，成都泰盟科技有限公司出品。WMY-01 型数字温度计，上海华辰医用仪表有限公司生产。F1-2008P型自动γ免疫记数仪， 国营西安二六二厂产品。
2、试验方法
2.1 造模：参照文献方法【朱愉，等.细菌内毒素等诱发的感染性休克.实 验动物的疾病模型.天津：天津科技翻译出版社.1997年3月第一版：372】， 兔以40mg/kg(5ml/kg)戊巴比妥钠腹腔注射(ip)麻醉，分离颈总动脉，颈总 动脉插入连有三通的静脉插管，通过压力换能器与八导生理记录仪连接，用于测 量平均动脉血压(MAP)和采血，密闭系统采用0.3％肝素抗凝。四肢标II导联 连接电极，八导生理记录仪测量心率变化。数字温度计测量肛温变化。兔耳静脉 注射LPS300μg/kg(1ml/kg)后形成兔内毒素休克模型。
2.2 给药：兔注射LPS后立即耳静脉缓慢推入受试药物，给药组分别为地塞 米松5mg/kg组；空白乳剂对照组；三乙酰穿心莲内酯乳剂高中低剂量组 (0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)，正常对照组及模型对照组给予同体积生理盐 水。空白乳剂对照组给予同体积空白乳剂。
2.3 检测：
①平均动脉压(MAP)、心率(HR)、肛温测量：兔于给LPS前及后30min， 60min，120min，180min，240min，300min分别以八导生理记录仪通过压力换能器 测量MAP，以肢体标II导联测量心率，以数字温度计测量肛温变化。
②血清TNF-α、IL-1β、NO测量：兔于给LPS前及后30min，60min，120min， 180min，240min，300min分别于颈总动脉采血1ml，2500rpm离心得血清，以放免 法测定血清TNF-α及IL-1β含量，以硝酸还原酶法测定血清NO含量。
3、试验结果
3.1 三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔平均动脉压(MAP)、心率(HR)、 肛温变化的影响
兔给予LPS后，模型对照组与正常对照组比较，所测各时间点MAP均明显 下降，120min时下降到最低点。地塞米松、三乙酰穿心莲内酯各剂量治疗组均 可明显抑制MAP降低；统计学分析表明，与模型对照组比较，地塞米松5mg/kg 给药后60min时有显著性差异(P<0.05)，120min时有高度显著性差异(P<0.01)； 与模型对照组比较，三乙酰穿心莲内酯1mg/kg组给药后120min时有高度显著性 差异(P<0.01)，60min时有显著性差异(P<0.05)，三乙酰穿心莲内酯0.5mg/kg 给药后120min时有显著性差异(P<0.05)，三乙酰穿心莲内酯0.25mg/kg给药后 120min时有显著性差异(P<0.05)；三乙酰穿心莲内酯1mg/kg同地塞米松5mg/kg 作用强度接近，三乙酰穿心莲内酯0.25mg/kg～1mg/kg范围内有剂量依赖关系， 结果见表4。
兔给予LPS后，与正常对照组比较，模型对照组所测各时间点HR均有减慢 趋势，但无统计学意义，各给药组与模型对照组比较无明显差异，结果见表4。
兔给予LPS后，模型对照组肛温持续下降，与正常对照组比较，所测各时间 点均有高度显著性差异(P<0.01)。与模型对照组相应时间点比较，地塞米松 5mg/kg给药后30min～120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲内 酯1mg/kg组给药后120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲内酯 0.5mg/kg给药后60min～120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲 内酯0.25mg/kg给药后各时间点作用均不明显，地塞米松5mg/kg较三乙酰穿心 莲内酯1mg/kg起效快但维持时间短。三乙酰穿心莲内酯在0.25mg/kg～1mg/kg 范围内有剂量依赖关系，结果见表4。
3.2.三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔血清TNF-α、IL-1β、NO含量的影响
兔给予LPS后，模型对照组同正常对照组比较，所测各时间点血清TNF-α、 IL-1β、NO含量均明显升高(P<0.01)。其中TNF-α、IL-1β分别在120min和60min 时达到峰值，NO含量给予LPS后持续增高。同模型对照组比较，地塞米松5mg/kg 给药后120min时可使TNF-α含量明显降低，30min、120min时可使IL-1β含量明 显降低，120min可使NO含量明显降低。三乙酰穿心莲内酯1mg/kg组给药后 30min～120min时可使TNF-α含量明显降低，30min、120min时可使IL-1含量 明显降低，60min～120min可使NO含量明显降低。三乙酰穿心莲内酯0.5mg/kg 给药后120min时可使NO含量明显降低，对TNF-α及IL-1作用不明显。三乙酰 穿心莲内酯0.25mg/kg上述作用均不明显，结果见表5。
4 结论
综上所述，三乙酰穿心莲内酯可明显改善内毒素休克兔的几个重要生命指 标，即体温、血压；且可显著降低内毒素休克兔的TNF-α、IL-1β、NO水平。说 明三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔具有治疗作用。
制备例1 穿心莲内酯的制备
取穿心莲内酯粗品20g，72℃溶于450mL甲醇中，静置24小时抽滤得白色 晶体，干燥得穿心莲内酯。
制备例2 三乙酰穿心莲内酯的制备
1g穿心莲内酯溶于10mLAc2O，加热回流2小时，反应混合物用乙酸乙酯萃 取，有机层依次用水、饱和NaHCO3和饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥。经硅 胶柱层析得三乙酰穿心莲内酯白色固体。分子式为：C26H36O8。
化合物确认数据如下：
(cm-1)：3454，3080，2954，1731，1683，1375，1250，1191，1075，1026，895， 606。
1H(400MHz，CDCl3):δ
7.00(td，J＝6.84，1.48Hz，1H，H-12)，5.92(d，J＝5.96Hz，1H，H-14)，4.90(bs， 1H，H-17a)，4.60(dd，J＝11.68，4.26Hz，1H，H-15a)，4.55(dd，J＝11.24，6.08Hz， 1H，H-15b)，4.53(bs，1H，H-17b)，4.36(d，J＝11.80Hz，1H，H-19a)，4.25(dd，J＝ 11.24，1.80Hz，1H，H-3)，4.12(d，J＝11.80Hz，1H，H-19b)，2.52～2.37(m，3H)，2.12 (s，3H)，2.05(s，6H)，2.00～1.96(m，1H)，1.90～1.86(m，2H)，1.80～1.77(m，2H)， 1.73～1.66(m，1H)，1.57～1.47(m，1H)，1.37～1.31(m，2H)，1.03(s，3H，CH3-8)，0.76 (s，3H，CH3-20)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ
170.8，170.4，170.3，168.9，150.0，146.5，124.0，108.8，79.6，71.5，67.7，64.6， 55.8，55.2，41.2，38.9，37.8，37.0，25.1，24.6，24.2，22.6，21.1，21.0，20.6，14.4。
MS(ESI)m/z(％)：499([M+Na]+，100％)，477([M+H]+，13％)。
制备例3 3，19-二乙酰穿心莲内酯、14-乙酰穿心莲内酯、14，19-二乙酰穿心莲内 酯的制备
5g穿心莲内酯加入30mL乙酸搅拌加热至80℃，反应过夜。用乙酸乙酯萃 取，有机层依次用水和饱和食盐水洗，无水MgSO4干燥。柱层析得3，19-二乙酰 穿心莲内酯(AP11)、14，19-二乙酰穿心莲内酯(AP12)、14-乙酰穿心莲内酯 (AP13)。
AP11化合物确认数据如下：
分子式：C24H34O7(434)
1H(400MHz，CDCl3)：6.97(1H，m，H-12)，5.03(1H，d，J＝5.6Hz，H-14)， 4.92(1H，s，H-17)，4.62(1H，s，H-17)，4.59(1H，dd，J＝11.2，4.8Hz，H-3)，4.47(1H，dd，J＝10.4，6 .0Hz，H-15)，4.38(1H，d，J＝11.6Hz，H-19)，4.26(1H，dd，J＝10.4，2.0Hz，H-15)，4.11(1H，d，J＝ 12.0Hz，H-19)，2.05(6H，s，CH3CO-)，1.04(3H，s，H-18)，0.78(3H，s，H-20)。
AP12化合物确认数据如下：
分子式：C24H34O7(434)
1H(400MHz，CDCl3)：7.00(1H，m，H-12)，5.91(1H，d，J＝6.0Hz，H-14)， 4.90(1H，s，H-17)，4.55(1H，dd，J＝11.2，6.0Hz，H-15)4.52(1H，s，H-17)，4.35(1H，d，J＝13.6H z，H-19)，4.25(1H，dd，J＝11.2，1.6Hz，H-15)，4.13(1H，d，J＝11.6Hz，H-19)，3.33(1H，dd，J＝12. 0，4.0Hz，H-3)，2.13(3H，s，CH3CO-)，2.06(3H，s，)，1.16(3H，s，H-18)，0.71(3H，s，H-20)。
13C-NMR(100MHz，CDCl3)：170.9，170.5，169.0，150.3，146.6，124.0，108.8， 78.8，71.6，67.8，64.9，55.8，55.3，42.4，39.0，37.8，37.2，27.8，25.2，24.2，22.5，21.0， 20.7，14.7。
AP13化合物确认数据如下：
分子式：C22H32O6(392)m.p.169℃
(cm-1)：3436，2927，1738，1641，1384，1233，1077，1024，723，621。
1H(400MHz，Acetone)：
6.88(1H，td，J＝6.8，1.6Hz，H-12)，6.03(1H，d，J＝6.0Hz，H-14)，4.87(1H，d，J＝1.2Hz，H-1 7)，4.59(1H，d，J＝1.2Hz，H-17)，4.58(1H，dd，J＝11.2，6.0Hz，H-15)，4.26(1H，dd，J＝11.0，1.6H z，H-15)，4.11(1H，d，J＝10.8Hz，H-19)，3.42(1H，m，H-3)，3.28(1H，t，J＝10.4Hz，H-19)，2.08(3 H，s，CH3CO-)，1.20(3H，s，H-18)，0.70(3H，s，H-20)。
MS(ESI)m/z(％)：415([M+Na]+，100％)，393([M+H]+，56％)。
制备例4 三乙酰穿心莲内酯乳剂的制备
将三乙酰穿心莲内酯1.0g、蛋黄卵磷脂12g、加入到中链油20g和大豆油80g 的混合油中，加入油酸0.4g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油 相；将甘油22.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80℃；把含有三乙酰穿心 莲内酯的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至1000ml 后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121℃灭菌15分钟， 即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径164nm。
制备例5 空白乳的制备
将蛋黄卵磷脂12g、加入到中链油20g和大豆油80g的混合油中，加入油酸 0.4g，加热至60～80℃，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油22.5g溶于80ml 水中形成水相，加热至60-80℃；把油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所 得初乳加水定容至1000ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分 装后121℃灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径176nm。
实验例1 三乙酰穿心莲内酯体外TNF-α抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞RAW264.7 购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素、胎牛血清购 自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek)； 恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司)。Mouse TNF-αELISA试剂盒为R&D公 司产品，由晶美生物工程有限公司分装。穿心莲内酯、三乙酰穿心莲内酯样品： 按制备例1、2制备，并以DMSO溶解并稀释至合适浓度。
2、小鼠巨噬细胞RAW264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、TNF-α释放量的测定：
用RPMI 1640培养液将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5×105cells/mL，接 种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h 后，每孔加入LPS(1μg/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不 加入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品设3个平行孔。在37℃、 CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进 行标准曲线绘制和样品测定。
4、实验结果：三乙酰穿心莲内酯与穿心莲内酯皆可显著抑制LPS诱导的TNF-α 的分泌，前者IC50为后者的5倍以上，两者的活性皆远远高于氢化可的松。详见 下表1。
表1 各受试物体外TNF-α抑制活性
注：与模型组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实验例2 三乙酰穿心莲内酯体外IL-6抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞RAW 264.7 购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素、胎牛血清购 自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek)； 恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司)。Mouse IL-6ELISA试剂盒为R&D公司 产品，由上海森雄公司分装。穿心莲内酯、三乙酰穿心莲内酯样品：按制备例1、 2制备，并以DMSO溶解并稀释至合适浓度。
2、小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、IL-6释放量的测定：
用RPMI 1640培养液将小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释至5×105cells/mL，接 种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h 后，每孔加入LPS(1μg/mL)和不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不 加入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品设3个平行孔。在37℃、 CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进 行标准曲线绘制和样品测定。
4、实验结果：三乙酰穿心莲内酯与穿心莲内酯皆可显著抑制LPS诱导的IL—6 的分泌，前者IC50为后者的2倍，两者的活性皆远远高于氢化可的松。详见表2。
表2 各受试物体外IL-6抑制活性
注：与模型组比较：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实验例3 三乙酰穿心莲内酯体外NO抑制活性研究
1、药品及仪器：
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MTT购自Sigma公司；小鼠巨噬细胞 RAW264.7购自中科院细胞库(ATCC)；RPMI 1640培养基、青霉素、链霉素、 胎牛血清购自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美 国，Biotek集团生产)；恒温CO2培养箱(美国，Thermo公司生产)。穿心莲内 酯、三乙酰穿心莲内酯、14-乙酰穿心莲内酯、3，19-二乙酰穿心莲内酯、14，19- 二乙酰穿心莲内酯样品：按制备例1、2、3制备，并以DMSO溶解用于体外细 胞实验。
2、小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养：
小鼠巨噬细胞RAW 264.7培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清 (FBS)、100U/mL青霉素钠、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、 (CO2)＝5％的恒温培养箱中孵育生长。
3、NO释放量的测定：
由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(NO2-)，故 采用Griess法测定样品中NO2-的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A： w(N-萘乙二胺盐酸盐)＝0.1％溶于水中；Griess试剂B：w(对氨基苯磺酰胺) ＝1％溶于(H3PO4)＝5％中，使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640 培养基将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5×105cells/mL，接种于96孔细胞培养 板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h后，每孔加入LPS(1 μg/mL)和不同浓度(0.1-200μmol/L)的测试样品0.4μL，同时设LPS组(不加 入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品4个重复。在37℃、CO2恒 温培养箱中培养24h后吸取培养液上清100μL至酶标板中，加入等体积的Griess 试剂，室温反应10min后测定540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50 μmol/L的NaNO2绘制标准曲线，根据NaNO2标准曲线计算细胞培养上清液中 NO2-的浓度以及对NO释放的抑制率，抑制率计算公式为：
4、结果：测得抑制率后，计算各样品的IC50。详见下表3。
表3 各受试物体外NO抑制活性
从上表可见，三乙酰穿心莲内酯虽较3，19-二乙酰穿心莲内酯仅差14位的乙 酰基，但NO抑制活性却提高近6倍。14-乙酰穿心莲内酯较穿心莲内酯亦差14 位的乙酰基，但NO抑制活性却提高4倍余。可见14位的乙酰化对穿心莲内酯 类化合物的活性影响显著。三乙酰穿心莲内酯虽较14，19-二乙酰穿心莲内酯仅差 3位的乙酰基，但NO抑制活性却提高近6倍。可见3位的乙酰化对穿心莲内酯 类化合物的活性影响显著。
由于内毒素休克模型为全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症的代表模型，而炎性细胞因子 在上述疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用，而且该模型在阐述炎性细胞 因子与炎性细胞因子相关性疾病之间的关系中最具代表性，故下面以兔内毒素休 克模型为代表，阐述下面几方面内容：
1、三乙酰穿心莲内酯的体内炎性细胞因子抑制作用；
2、三乙酰穿心莲内酯对全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒血症、脓毒性休 克、感染性休克、多器官功能障碍综合征、败血症的治疗作用；
3、三乙酰穿心莲内酯作为炎性细胞因子抑制剂可用以治疗发明内容中所述 疾病的依据。
实验例4 三乙酰穿心莲内酯对兔内毒素休克模型的影响(三乙酰穿心莲内酯体内 对炎性细胞因子的抑制作用)
1、试验材料
1.1 受试品和阳性对照药：三乙酰穿心莲内酯乳剂及空白乳：按制备例4、5 制备；地塞米松注射液，天津药业集团新郑股份有限公司产品。
1.2 动物：日本大耳白兔，雌雄兼用，体重2.5～3.0kg，合格证号： SCXK-(吉)2003-0004，购自长春高新医学动物实验研究中心。
1.3 试剂：大肠杆菌内毒素(LPS，E.coli0111:B4)，为Sigma公司产品。白细 胞介素-1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子(TNF-α)放免测定试剂盒，解放军总医院科 技开发中心放免所生产。一氧化氮(NO)检测试剂盒，南京建成生物工程研究 所产品。
1.4 仪器：BL-820型八导生理记录仪，成都泰盟科技有限公司出品。WMY-01 型数字温度计，上海华辰医用仪表有限公司生产。F1-2008P型自动γ免疫记数仪， 国营西安二六二厂产品。
2、试验方法
2.1 造模：参照文献方法【朱愉，等.细菌内毒素等诱发的感染性休克.实 验动物的疾病模型.天津：天津科技翻译出版社.1997年3月第一版：372】， 兔以40mg/kg(5ml/kg)戊巴比妥钠腹腔注射(ip)麻醉，分离颈总动脉，颈总 动脉插入连有三通的静脉插管，通过压力换能器与八导生理记录仪连接，用于测 量平均动脉血压(MAP)和采血，密闭系统采用0.3％肝素抗凝。四肢标II导联 连接电极，八导生理记录仪测量心率变化。数字温度计测量肛温变化。兔耳静脉 注射LPS300μg/kg(1ml/kg)后形成兔内毒素休克模型。
2.2 给药：兔注射LPS后立即耳静脉缓慢推入受试药物，给药组分别为地塞 米松5mg/kg组；空白乳剂对照组；三乙酰穿心莲内酯乳剂高中低剂量组 (0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)，正常对照组及模型对照组给予同体积生理盐 水。空白乳剂对照组给予同体积空白乳剂。
2.3 检测：
①平均动脉压(MAP)、心率(HR)、肛温测量：兔于给LPS前及后30min， 60min，120min，180min，240min，300min分别以八导生理记录仪通过压力换能器 测量MAP，以肢体标II导联测量心率，以数字温度计测量肛温变化。
②血清TNF-α、IL-1β、NO测量：兔于给LPS前及后30min，60min，120min， 180min，240min，300min分别于颈总动脉采血1ml，2500rpm离心得血清，以放免 法测定血清TNF-α及IL-1β含量，以硝酸还原酶法测定血清NO含量。
3、试验结果
3.1 三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔平均动脉压(MAP)、心率(HR)、 肛温变化的影响
兔给予LPS后，模型对照组与正常对照组比较，所测各时间点MAP均明显 下降，120min时下降到最低点。地塞米松、三乙酰穿心莲内酯各剂量治疗组均 可明显抑制MAP降低；统计学分析表明，与模型对照组比较，地塞米松5mg/kg 给药后60min时有显著性差异(P<0.05)，120min时有高度显著性差异(P<0.01)； 与模型对照组比较，三乙酰穿心莲内酯1mg/kg组给药后120min时有高度显著性 差异(P<0.01)，60min时有显著性差异(P<0.05)，三乙酰穿心莲内酯0.5mg/kg 给药后120min时有显著性差异(P<0.05)，三乙酰穿心莲内酯0.25mg/kg给药后 120min时有显著性差异(P<0.05)；三乙酰穿心莲内酯1mg/kg同地塞米松5mg/kg 作用强度接近，三乙酰穿心莲内酯0.25mg/kg～1mg/kg范围内有剂量依赖关系， 结果见表4。
兔给予LPS后，与正常对照组比较，模型对照组所测各时间点HR均有减慢 趋势，但无统计学意义，各给药组与模型对照组比较无明显差异，结果见表4。
兔给予LPS后，模型对照组肛温持续下降，与正常对照组比较，所测各时间 点均有高度显著性差异(P<0.01)。与模型对照组相应时间点比较，地塞米松 5mg/kg给药后30min～120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲内 酯1mg/kg组给药后120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲内酯 0.5mg/kg给药后60min～120min时有高度显著性差异(P<0.01)；三乙酰穿心莲 内酯0.25mg/kg给药后各时间点作用均不明显，地塞米松5mg/kg较三乙酰穿心 莲内酯1mg/kg起效快但维持时间短。三乙酰穿心莲内酯在0.25mg/kg～1mg/kg 范围内有剂量依赖关系，结果见表4。
3.2.三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔血清TNF-α、IL-1β、NO含量的影响
兔给予LPS后，模型对照组同正常对照组比较，所测各时间点血清TNF-α、 IL-1β、NO含量均明显升高(P<0.01)。其中TNF-α、IL-1β分别在120min和60min 时达到峰值，NO含量给予LPS后持续增高。同模型对照组比较，地塞米松5mg/kg 给药后120min时可使TNF-α含量明显降低，30min、120min时可使IL-1β含量明 显降低，120min可使NO含量明显降低。三乙酰穿心莲内酯1mg/kg组给药后 30min～120min时可使TNF-α含量明显降低，30min、120min时可使IL-1含量 明显降低，60min～120min可使NO含量明显降低。三乙酰穿心莲内酯0.5mg/kg 给药后120min时可使NO含量明显降低，对TNF-α及IL-1作用不明显。三乙酰 穿心莲内酯0.25mg/kg上述作用均不明显，结果见表5。
4 结论
综上所述，三乙酰穿心莲内酯可明显改善内毒素休克兔的几个重要生命指 标，即体温、血压；且可显著降低内毒素休克兔的TNF-α、IL-1β、NO水平。说 明三乙酰穿心莲内酯对内毒素休克兔具有治疗作用。
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