本发明的特征在于Mas，G-蛋白偶联受体激动剂和拮抗剂的用途， 作为凋亡活性调节剂，用于疾病的研究、预防和治疗。

本发明进一步的特征在于Mas，G-蛋白偶联受体激动剂和拮抗剂 的用途，用于调节涉及B/Akt激酶蛋白活性改变的凋亡活性。

本发明的另一个特征是Mas，G-蛋白偶联受体激动剂和拮抗剂， 包括血管紧张素-(1-7)肽及其类似物、激动剂和拮抗剂，肽或非肽的， 作为凋亡活性调节剂用于疾病的研究、预防和治疗的用途。

本发明进一步要求保护Mas，G-蛋白偶联受体激动剂和拮抗剂， 与药物学或药理学上可接受的载体一起配制，和Mas，G-蛋白偶联受 体激动剂和拮抗剂，包括血管紧张素-(1-7)肽及其类似物、激动剂和 拮抗剂，肽或非肽的，作为凋亡活性调节剂的用途。

另一个要求保护的特征是Mas，G-蛋白偶联受体激动剂和拮抗剂 包括血管紧张素-(1-7)肽及其类似物、激动剂和拮抗剂(肽或非肽的) 的制剂的微粒和纳米颗粒、可植入或可注射装置，作为凋亡活性调节 剂的用途。

本发明描述的给药形式包含但不限于使用Mas，G-蛋白偶联受体 激动剂和拮抗剂，包括血管紧张素-(1-7)肽及其类似物、激动剂和拮 抗剂，肽或非肽的，及其制剂，通过口服，肌内，静脉内，皮下，局 部，经皮，肛门，吸入(肺，鼻内，颊内)给药途径或作为可植入或 注射的装置来使用，用于疾病的研究、预防和治疗。

肾素-血管紧张素-系统(RAS)作为体液和血压体内稳态调节剂的 作用是公知的。RAS负责生理和病理情况中的血压、心血管体内稳态 和水电解质平衡的调节(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.； Andrade，S.P.Angiotensin-(1-7)：an update.Regul Pept.91： 45-62，2000)。最近发现除了在血液循环中产生Ang II的系统以外， 不同的组织也可以在局部产生该系统的各种生物活性肽(组织RAS)。 在多种器官和组织包括心脏，血管，肾脏，雄性和雌性生殖系统，内 分泌腺，骨髓和脑中，发现了组织RAS的成分。这些RAS在不同组织 中的功能仍然没有得到完全阐明(Santos，RAS，Campagnole-Santos， MJ，Andrade，SP，Angiotensin-(1-7)：an update.Regul Pept.91： 45-62，2000；Yoshimura，Y.The ovarian rennin-angiotensin system in reproductive physiology.Front Neuroendocrinol.；18： 247-291，1997)。

经典RAS的主要成分是：肾素-催化血管紧张素原蛋白水解转化成 血管紧张素I(Ang I)的酶；血管紧张素原-肾素的主要底物和血管 紧张素II(Ang II)的前体；血管紧张素转化酶(ACE)，其通过水解 两个羧基末端氨基酸将Ang I转化成Ang II；血管紧张素II-该系统 的主要生物活性肽；以及AT1和AT2受体，负责AngII的细胞效应的启 动。向该公知系统中，已经加入了其它肽，如血管紧张素III(Ang III)， 血管紧张素IV(Ang IV)，和血管紧张素-(1-7)[(Ang-(1-7))]。 Ang-(1-7)可以通过组织内肽酶从Ang I或Ang II产生(Santos，R. A.，Brosnihan，K.B.，Cappell，M.C.，Pesquero，J.，Chernicky， C.L.，Greene，L.J.；Ferrario，C.M.Converting enzyme activity and angiotensin metabolism in the dog brainstem，Hypertension (11(2-Pt2)：I153-I1537，1988)。

已经在血浆和多种人和动物器官和组织中鉴定出Ang-(1-7) (Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J；Andrade，SP. Angiotensin-(1-7)：an update.Regul Pept.91：45-62，2000)， 包括雌性大鼠卵巢(Costa APR，Fagundes-Moura CR，Pereira VM， Silva LF，Vieira MA，Santos RA，Reis AM)，Angiotensin-(1-7)： a novel peptide in the ovary.Endocrinology.144：1942-1948， 2003)。Santos等1988已证明了其不依赖于ACE的产生(Santos， R.A.，Brosnihan，K.B.，Cappell，M.C，Pesquero，J.，Chernicky， CL.，Greene，L.J.；Ferrario，C.M.Converting enzyme activity and angiotensin metabolism in the dog brainstem.Hypertension. 11(2-Pt2)：I153-I153-I1537，1988)并且Santos等1994(Santos， RAS，Campagnole-Santos，M.J.，Baracho，N.C，Fontes，M.A.， Silva，L.C，Neves，L.A.，Oliveira，D.R.，Caligiorne，S.M.， Rodrigues，A.R.，Gropen Junior，C.Characterization of a new angiotensin antagonist selective for angiotensin-(1-7)： evidence that the actions of angiotensin-(1-7)are mediated by specific angiotensin receptors.Brain Res Bull.35(4)：293-298， 1994)和Tallant等1997(Tallant，E.A，Lu，X.，Weiss，R.B.， Cappell，M.C；Ferrario，C.M.Bovine aortic endothelial cells contain an angiotensin-(1-7)receptor.Hypertension 29：388-393， 1997)提出其附着于特定受体。已经获得这些发现，尤其是作为可以 得到Ang(1-7)的选择性拮抗剂A-779的结果， (Asp1-Arg2-Val3-Tir4-Lle5-His6-D-Ala7；Santos，R.A.， Campagnole-Santos，M.J.Barracho，N.C，Fontes，M.A，Silva， L.C，Neves，L.A，Oliveira，D.R.，Caligione，S.M.，Rodrigues， A.R.，Groppen Junior，C.Characterization of a new angiotensin-antagonist selective for angiotensin-(1-7)： evidence that the actions of angiotens in-(1-7)are mediated by specific angiotensin receptors.Brain Res Bull.35(4)：293-298， 1994；Ambuhl，P，Felix，D.Khosla，M.C. [7-D-ALA]-Angiotensin-(1-7)：selective antagonism of angiotensin-(1-7)in the rat paraventricular nucleus.Brain Res Bull.1994；35(4)：289-91)。

多种酶参与RAS级联的几个步骤，在其中它们负责一些肽片段的 降解，以及负责其他肽片段的产生。ACE负责将Ang I转化成Ang II； PEP(脯氨酰内肽酶)从Ang I和Ang II产生Ang-(1-7)，而NEP(中 性内肽酶)催化Ang I转化成An-(1-7)。ACE还水解Ang-(1-7)，产 生Ang-(1-5)(Chappell MC，Pirro NT，Sykes，A，Ferrario CM. Metabolism of angiotensin-(1-7)by angiotensin-converting enzyme.Hypertension.31：362-367，1998)。因此，ACE途径对循 环和组织RAS生物活性肽的产生和降解都是重要的。最近，描述了另 一种酶ACE2，其对于Ang-(1-7)的形成是重要的(SR Tipnis，NM Hooper，R Hyde，E Karran和G Christie.The human homolog of angiotensin-converting enzyme.Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J. Biol Chem.275(43)：33238-33243，200)。这种酶形成Ang-(1-7)， 尤其是从Ang II。

血管紧张素-(1-7)和血管紧张素II是主要的RAS效应物。两个重 要的特征将Ang-(1-7)与Ang II区分开来：首先，Ang-(1-7)具有高 度特异性的生物作用，并且根据Ang-(1-7)形成的途径，可完全不依 赖于ACE(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade， S.P.Angiotensin-(1-7)：an update.Regulatory Peptides. 91：45-62，2000)。

由于其在体内的弱致瘤活性，最初将Mas调节基因描述为原癌基 因(Young D.Waitches G，Birchmeier C.Fasano O.Wigler M. Isolation and characterization of a new cellular oncogene encoding a protein with multiple potential transmembrane domains.Cell.1986；45：711-71)。

在哺乳动物中，主要在睾丸和不同的脑区域包括海马和扁桃体中 检测到其基因的表达，在肾脏和心脏中不那么强烈但仍以显著水平 (Bunnemann B，Fuxe K，Metzger R，Mullins J，Jackson TR，Hanley MR，Ganten D.Autoradiographic localization of Mas proto-oncogene mRNA in adult rat brain using in situ hybridization.Neurosci Lett.114：147-153，1990；Alenina N， Bader M，Walther T.Imprinting of the murine MAS proto-oncogene is restricted to its antisense RNA.Biochem Biophys Res Commun. 290：1072-1078，2002)。

其基因修饰具有7个跨膜结构域的蛋白质，所述蛋白质具有I类 G-蛋白偶联受体的特征。在最初的研究中，提出该基因作为八肽血管 紧张素II的受体的编码者(codifier)(Jackson TR，Blair LA， Marshall J，Goedert M，Hanley MR.The Mas oncogene encodes an angiotensin receptor.Nature 335：437-440，1988)。然而，Ambroz 和同事以及后来Ardaillou显示了在Mas转染的细胞中Ang II所致的 胞内钙升高，只发生在内源表达Ang II的AT1受体的细胞中(Ambroz C，Clark A，Catt KJ.The Mas oncogene enhances angiotensin-induced[Ca2+]i responses in cells with pre-existing angiotensin Il receptors.Biochem Biophys Acta. 1133：107-111，1991；Ardaillou R.Angiotensin Il receptors. J Am Soc Nephrol.10：S30-S39，1999)。最近观察到，事实上，Mas 是Ang-(1-7)的受体(Santos，R.A.，e Silva A C，Marie， C，Silva，D.M.，Machado，R.P.，de Buhr，I.，Heringer-Walther， S.，Pinheiro，S.V.，Lopes，M.T.，Bader，M.，Mendes，E.P.，Lemos， V.S.，Campagnole-Santos，M.J.，Schultheiss，H.P.，Speth，R.； Walther，T.Angiotensin-(1-7)is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas Proc Natl.Acad Sci USA，100 (14)：8258-8263，2003)。

内皮功能障碍是与靶器官(其中特别是，心脏，肾脏，脑，血管， 生殖器官)损伤相关的各种病理情况的建立和发展时更早发生的事件 (Goligorsky MS.Endothelial cell dysfunction：can′t live with it，how to live without it.Am J.Physiol Renal Physilo. 288(5)：F871-80，2005)。一氧化氮生物利用率的降低是内皮功能障 碍开始的关键因素，因为该分子具有血管舒张，抗增殖，抗血栓形成， 抗动脉粥样硬化的特性并中和活性氧产生(Ogita H，Liao J. Endothelial function and oxidative stress.Endothelium. 11(2)：123-32，2004)。最近证明了除了依赖于钙的经典途径外，通 过经由B/Akt激酶蛋白直接磷酸化内皮一氧化氮合酶(eNOS)的位点 如1177丝氨酸也可以形成一氧化氮，该机理大大促成内皮完整性的维 持。Akt的激活，通过磷酸化eNOS，参与人内皮中Ant-(1-7)刺激的 一氧化氮释放，结果参与内皮功能性改善，这是本发明的一个特征。 本发明的另一个特征是证明Ang-(1-7)负向调节Ang II在人内皮中的 作用，通过抑制涉及活性氧产生的近端胞内途径如c-SRC。此外， Ang-(1-7)抑制NAD(P)H氧化酶的活性，后者是血管壁中产生活性氧的 最大来源(Touyz RM.Reactive oxygen species and angiotensin Il signaling in vascular cells-implications in cardiovascular disease.Braz J Med Bio Res.37(8)：1263-73，2004)。通过Ang II激活NAD(P)H(氧化酶)需要c-SRC的存在，以发生该酶的亚基 p47phox的磷酸化和迁移至膜。此外，以Ang II慢性刺激中，c-SRC 参与NAD(P)H氧化酶的亚基gp91phox，p22phox和p47phox的蛋白表 达的增加(Touyz RM，Yao G，Schiffrin EL.c-Src induces phosphorylation and translocation of p47pho role in super oxide generation by angiotensin II in human vascular smooth muscles cells.Arterioscler Thromb Vase Biol 23(6)：981-7，2003)。该 事实是特别重要的，因为促氧化和抗氧化因素之间的失衡是内皮功能 障碍开始的决定因素之一。因此，除了通过释放一氧化氮直接促进维 持内皮完整性外，Ang-(1-7)还中和氧化自由基的产生。活性氧的产生 又与凋亡活性具有密切关联，因为其刺激信号转导级联，包括MAPK 类，胱天蛋白酶类和其他-细胞死亡的决定因素(Matuzawa，A.，lchijo， H.Stress-responsive protein kinases in redox-regulated apoptosis signaling.Antioxid Redos Signal 7(3-4)：472-81； 2005)。然而，在现有技术中不存在涉及以下内容的发明，即Ang-(1-7) 或其肽或非肽的类似物的制剂的用途，所述Ang-(1-7)或其类似物通 过Mas受体激活级联PI3K/Akt/eNOS以及灭活NAD(P)H氧化酶和降低 参与活性氧产生和内皮凋亡的机理，用于预防和治疗涉及内皮功能障 碍的病理情况，例如，但不限于，心血管疾病，肾病，多代谢综合征， 勃起功能障碍，中枢神经系统疾病等等。

Ant-(1-7)提高探究行为并有助于记忆(Santos，RA， Campagnole-Santos，MJ.Central and Peripheral actions of Angiotensin-(1-7).Braz J Med Bio Res.27(4)：1033-47，1994； Hellner，K.，Walther，T.，Schubert，M.，Albrecht，D. Angiotensin-(1-7)enhances LTP in the hippocampus through the G-protein-coupled receptor Mas.Mol Cell Neurosci.29 (3)：427-35，2005)。Mas受体定位于涉及这些功能的大脑区域中， 包括海马，扁桃体和脑皮层(K.A Martin，S.G.Grant，S.Hockfield. The Mas proto-oncogene is developmentally regulated in the rat central nervous system.Brain Res Dev Brain Res 68(1)：75-82， 1992)。Mas受体与Ang-(1-7)的相互作用激活了具有抗凋亡特征的信 号转导途径，更具体的是PKI3/Akt的途径。通过Ang-(1-7)提高的B (Akt)激酶蛋白的磷酸化，减少了细胞凋亡(Z.-Z.Yang，O.Tschopp， A.Baudry，B.Dümmler，D.Hynx和B.A Hemmings.Physiological functions of protein kinase B Akt Biochem Soc Trans.32：350-354， 2004)。Akt的大脑亚型Aktγ敲除小鼠，呈现出大脑重量的显著减 轻(Z.-Z.Yang，O.Tschopp，A.Baudry，B.Dümmler，D.Hynx 和B.A Hemmings.Physiological functions of protein kinase B Akt Biochem Soc Trans.32：350-354，2004)。脑中Akt表达的一 些部位是海马和大脑皮层，所述区域还富含RNAM(对于Mas受体)。 然而，现有技术中不存在涉及血管紧张素-(1-7)制剂用于控制或预防 变性脑疾病或记忆或学习障碍的发明，所述发明基于通过Ang-(1-7) 与Mas受体的相互作用诱导的对Akt介导的抗凋亡活性的刺激。相似 地，不存在涉及Mas受体激动剂或拮抗剂用于研究、预防或治疗变性 脑疾病或记忆或学习障碍的用途的发明，所述用途基于通过肽或非肽 Mas受体激动剂与该受体的相互作用诱导的对Akt介导的抗凋亡活性 的刺激。

本发明的特征在于含有Ang-(1-7)、Ang-(1-7)的类似物或衍生物 的控释系统的应用，其有助于接入以与Mas G蛋白偶联受体相互作用。 G蛋白，Mas和Ang-(1-7)、类似物或衍生物之间的这种相互作用，使 得能够控制或预防特征在于凋亡活性提高的变性脑疾病，包括变性脑 障碍，如阿尔茨海默氏病，帕金森病，亨廷顿病等。令人满意的控释 系统包括但不限于环糊精，生物相容性聚合物，生物可降解聚合物， 其他聚合基质，胶囊，微胶囊，微粒，推注(bolus)制剂，渗透泵， 扩散装置，脂质体，lipospheres和经皮给药系统。

最近，多篇论文表明IP3k/AKT途径对介导胰岛素受体与其底物信 号转导起关键作用(Zdychova J，Komers R.Emerging role of Akt kinase/protein kinase B signaling in pathophysiology of diabetes and its complications.Physiol Res；54(1)：1-16，2005)。 改变该级联的介质，如生长因子，血管紧张素II，活性氧，皮质类固 醇，雌激素，和血糖状态的改变自身，将促进增殖性细胞改变，由于 PI3K/Akt途径实质上是抗凋亡途径，这将导致从糖尿病中固有的内皮 功能障碍到糖尿病怀孕妇女中胚胎产生畸形改变(Reece EA，Ma XD， Zhao Z，Wu YK，Dhanasekaran D.Aberrant patterns of cellular communication in diabetes-induced embryopathy in rats：II， apoptotic pathways Am J.Obstet Gynecol.192(3)：967-972，2005)。 Akt可受到指导该途径介导的信号转导的各种因素的调节。例如，D- 葡萄糖调节Akt的磷酸化，并且高血糖已与糖尿病中的内皮功能障碍 相关(Varma S，Lal BK，Zhen R，Breslin JW，Saito S，Pappas PJ， Hobson Ii RW，Duran WN.Hyperglycemia Alters PI3k and Akt Signaling and Leads to Endothelial Cell Proliferative Dysfunction.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2005印刷中)。 此外，丝氨酸的磷酸化与e-NOS的激活相关(Kobayashi T，Taguchi K， Yasuhiro T，Matsumoto T，Kamata K.Impairment of PI3-K/Akt pathway underlies attenuated endothelial function in aorta of type 2 diabetic mouse model.Hypertension.44(6)：956-962， 2004)，并可以通过提高脂质水平来抑制，表明除了内皮保存和活化 循环内皮祖细胞(EPC)外，Akt可能还与动脉粥样硬化保护效果相关。 在骨骼肌中，Akt磷酸化的改变与2型糖尿病中通过GLUt4的运输中 的改变相关(Karlsson HK，Zierath JR，Kane S，Krook A，Lienhard GE，Wallberg-Henriksson H.Insulin-Stimulated Phosphorylation of the Akt Substrate AS160 Is Impaired in Skeletal Muscle of Type 2 Diabetic Subjects.Diabetes.54(6)：1692-7，2005)。 另一个令人感兴趣的方面是该级联似乎涉及β细胞自身的增殖和存 活，并且其被神经酰胺激活的磷酸酶(CAPP)灭活可能引起I型糖尿 病中胰岛素分泌的改变(Kowluru A.Novel regulatory roles for protein phosphatase-2A in the islet beta cell.Biochem Pharmacol.69(12)：1681-1691，2005)。指出通过PI3K/Akt/TOR 途径介导的负反馈过程的存在作为胰岛素抵抗和肿瘤发生的关键事件 (Manning BD，Balancing Akt with S6K：implications for both metabolic diseases and tumorigenesis，J.Cell Biol， 167(3)：399-403，2004)。因此，Akt途径在成因因素和由糖尿病引 起的并发症如血管病变中的参与是明显的。

在肾素-血管紧张素系统和胰岛素受体信号转导之间似乎存在着 密切的关联。已经证明了Ang II抑制胰岛素受体介导的Akt的磷酸化。 此外，通过Ang II刺激的氧化应激也改变胰岛素激活的胞内级联的多 个步骤(Taniyama Y，Hitomi H，Shah A，Alexander RW，Griendling KK.Mechanisms of reactive oxygen species-dependent downregulation of insulin receptor substrate-1 by angiotensin II.Arterioscler Thromb Vasc.Biol.25(6)：1142-1147，2005)。 这部分解释了为什么Ang II抑制剂的应用可改善胰岛素抵抗，并因此 改善与糖尿病相关的共发病，如微血管损伤。Ang-(1-7)是有效的生物 学Ang II拮抗剂并具有各种与内皮功能改善相关的作用。其水平在该 系统药理性阻断过程中升高，表明Ang-(1-7)是ACE抑制剂和AT1受 体拮抗剂的有益效果的重要介质。如以上已经提及的，Ang-(1-7)附着 于Mas受体导致Akt的强磷酸化。然而，在现有技术中不存在涉及血 管紧张素-(1-7)或其肽或非肽的类似物的制剂用于研究、预防或治疗 胰岛素抵抗或该激素产生不足的结果的用途的发明。

血管紧张素-(1-7)存在于心脏中并具有重要的心脏作用，如提高 收缩性和减轻心律不齐(Ferreira，AJ和Santos，RAS. Cardiovascular actions of Angiotensin-(1-7).Braz.J.Med.Biol Res.38(4)：499-507，2005)。Mas受体也在心脏中表达并且其缺乏 使得心功能显著降低(Ferreira，AJ Santos，RAS.Cardiovascular actions of Angiotensin-(1-7).Braz.J.Med.Biol Res. 38(4)：499-507，2005)。激酶Akt蛋白也在心脏中表达，尤其是在心 肌细胞中。在这些细胞中，Akt也通过PIK3磷酸化，提高心肌收缩性 和减轻再灌注心律不齐。心脏中Akt表达提高的小鼠呈现出糖酵解途 径中涉及的蛋白的合成的改变，如“胰岛素样生长因子结合蛋白5” 的增加，其最终升高该途径的活性(Latronico，MGV，Costinean，S.， Lavitrano，M.L.Peschle，C，Condorelli，G.Regulation of Cell Size and Contractile Function by AKT in Cardiomyocytes，Ann. N.Y.Acad.Sci.1015：250-260，2004；Cook，S.A.Matsui，T.， Li1L.，Rosenzweig，A.Transcriptional Effects of Chronic Akt Activation in the Heart.J Biol Chem：277(25)：22528-22533， 2002)。Ang-(1-7)的给药保护了心脏对抗心肌梗塞的结果(Loot A.E.， Roks A.J.，HENNING，R.H.，Tio，R.A.，Suurmeijer，A.J.， Boomsma，F，van Gilst，W.H..Angiotensin-(1-7)attenuates the development of heart failure after myocardial infarction in rats.Circulation.2002：105(13)：1548-50)。表达产生Ang-(1-7) 的融合蛋白的转基因大鼠应答异丙肾上腺素处理具有较低的心脏肥 大，且再灌注心律不齐的持续时间和发生较短(Santos，R.A.， Ferreira，A.J.，Nadu，A.P.，Braga，A.N.，de A.meida，A.P.， Campagnole-Santos，M.J.，Baltatu.O.，Iliescu，R.，Reudelhuber， T.L.，Bader，M.Expression of an angiotensin-(1-7)-producing fusion protein produces cardioprotective effects in rats. Physiol Genomics.2004；19(7)：292-9)。另一方面，通过腺病毒 冠状动脉内给药Akt基因，产生了大鼠中梗塞面积大小的减少(W.Miao， Z.Luo，R.N.Kitsis和K.Walsh.Intracoronary， Adenovirus-mediated Akt Gene Transfer in Heart Limits Infarct Sice Following Ischemia-reperfusion Injury in vivo. J.Mol Cell Cardiol.32：2397-2402，2000)。在大鼠中用Akt修饰的干细胞防 止梗塞心脏的重塑并恢复梗塞心脏的心功能(Mangi，A.A，Noiseux， N.，Kong，D.，He，H.，rezvani，M.，Ingwall，J.S.，Dzau，V. J.Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts Nat Med. 9：1195-1201，2003)。然而，在现有技术中不存在涉及血管紧张素 -(1-7)或其肽或非肽的类似物的制剂的以下用途的发明，用于提高心 脏性能或控制或预防心肌变性疾病，提高心脏内给药后干细胞的生存 力，或降低心脏重塑或心脏的电生理障碍，这是基于通过Ang-(1-7) 与Mas受体的相互作用，对胞内转导途径的刺激，如通过刺激PIK3/Akt 途径产生的抗凋亡活性。

肌萎缩是由多种病症如恶病质，癌症，AIDS，由于多种因素引起 的长期卧床(restriction to bed)，糖尿病，类皮质激素的长期应 用和各种神经综合征和创伤病引起的严重病态(Lai KM，Gonzalez M. Poueymirou WT，Kline WO，Na E，Zlotchenko E，Stitt tN， Ecomonides An，Yancopoulos GD.GIass DJ.Conditional activation of act in adult skeletal muscle induces rapid hypertrophy.Mol Cell Biol.(21)：9295-304，2004)。最近，已经研究了可激活骨骼 肌中能够恢复肌肉向性的信号转导途径的策略。在这些途径中，Akt 值得强调，因为它能够激活合成代谢途径且同时和主要地能够抑制分 解代谢途径(Stitt TN，Duran D.，Clarke BA，Planar F，Timofeyva Y，Kline WO，Gonzalez M，Yancopoulos GD，Glass DJ.Mol Cell. 14(3)：395-403，2004).The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors.Mol Cell；14(3)：395-403， 2004)。Ang-(1-7)在外周肌肉组织中的作用包括增加骨骼肌中的血流 (Sampaio WO，Nascimento AAS，Santos RAS，Systemic and regional hemodynamic effects of angiotensin-(1-7)in rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol.，284(6)：H1985-94，2003)和突触易化 (Bevilaqua ER，Kushmerick C，Beirao PS，Naves LA.Angiotensin 1-7 increases quantal content and facilitation at the frog neuromuscular junction.Brain Res.；927(2)208-11，2002)。 此外，Ang-(1-7)激活Akt。然而，在现有技术中不存在涉及Ang-(1-7) 或其肽或非肽的类似物的制剂的以下用途的发明，其激活 Ang-(1-7)/Mas/Akt轴，用于预防和治疗涉及肌肉分化、成熟和再生 中的改变的病状，以及用作生力(ergogenic)源。

基于通过Ang-(1-7)或其他激动剂与Mas受体的相互作用介导的 Akt激活的抗凋亡活性的激活也可以发生在其他组织和器官中，包括， 皮肤，内分泌腺，肝脏，肾脏，胃肠道和泌尿生殖道等等。

借助以下非限制性的实施例和详述可以更好地理解本发明。

实施例1

该实施例描述了涉及生理功能中枢控制的大脑区域中MAS受体的 鉴定。

用三溴乙醇(0.25g/Kg)将动物麻醉，然后用PBS(0.02M pH 7.4) 经心脏(transcardially)灌注2分钟，然后用PBS中10％低聚甲醛 溶液灌注15分钟。取出脑并置入相同固定溶液中2h。然后将组织在 PBS溶液中洗涤3次，此后置入蔗糖溶液(PBS中30％)中过夜。在-18 ℃温度的冷冻切片机中以额面制备30μm脑切片。通过“自由飘浮” 方法将延髓(bulb)和海马的切片在PBS，0.5％吐温和5％BSA中各温 育15分钟，然后将切片与Mas一抗(1∶500)在4℃温育48小时。在 与由Mas蛋白预吸收的一抗温育的邻近切片中进行阴性对照。48小时 后，将切片在PBS溶液中洗涤3次5分钟，然后与缀合荧光化合物的 二抗在室温温育60分钟。在该阶段后，将切片在PBS中洗涤3次5 分钟并保持在干凝胶化的载玻片上并分别在含有1∶3甘油和PBS的封 固溶液中覆盖载玻片。在共焦显微镜下分析切片，使用对于每种使用 的荧光化合物特定的激发和发射滤光器。通过中性红方法将含有接受 免疫荧光测定的邻近切片的载玻片染色，用于组织的结构分析和不同 区域的鉴定。使用了Atlas de G.Paxinos，C.Watson，The rat brain in stereotaxic coordinates，第二版，Academic Press，New York， 1986，用于定义脑中观察到的区域。图1显示了，在海马的额切片中， 在多个区域中(图1A)和用于不同区域的组织学鉴定的中性红染色的 邻近切片中(图1B)，通过免疫反应性显示的Mas Ang-(1-7)受体的 存在。图2显示了在室旁核(PVN，图2A)和外侧视前区(LPO，图2C) 和对照的邻近切片(图2B和2D)中，通过免疫反应性显示的Mas Ang(1-7)受体的存在，进行用合成Mas蛋白预吸收抗体时，显示出标 记的消失。在图3中，箭头显示在视上核(CSO，图3A)中通过免疫 反应性显示的Mas，Ang-(1-7)受体的存在。进行用合成Mas蛋白预吸 收抗体时，邻近切片(图3B和3D)显示出标记的消失。图4显示了 在扁桃体(图4A)和丘脑的前背侧核中(图4C)和邻近切片对照中(图 4B和4D)通过免疫反应性显示的Mas Ang-(1-7)受体的存在，当进行 用Mas合成蛋白预吸收抗体时显示出标记的消失。图5显示了在皮层 (HL，图5A)和海马(HC，图5C)及其邻近切片对照中(图5B和5D) 通过免疫反应性显示的Mas Ang-(1-7)受体的存在，进行用Mas合成 蛋白预吸收抗体时显示出标记的消失。图6显示了(A中)延髓的额 切片，图示了多个区域中Mas Ang-(1-7)受体的免疫反应性。在B和 邻近切片中，使用中性红染色，用于不同区域的组织学鉴定。图7显 示了延髓的尾腹外侧区(CVLM，图7A)和头腹外侧区(RVLM，图7C) 及其对照邻近切片(图7B和7D)中Mas Ang-(1-7)受体的免疫反应性， 显示出进行用Mas合成蛋白预吸收抗体时标记的消失。图8通过免疫 反应性显示出在孤束中(NTS，图8A)和下橄榄核(IO，图8C)和对 照邻近切片中(图8B和8D)Mas Ang-(1-7)受体的存在，显示出进行 用Mas合成蛋白预吸收抗体时标记的消失。图9通过免疫反应性显示 出在舌下神经(12，图9A)和对照邻近切片(图9B)中Mas Ang-(1-7) 受体的存在，显示出进行用Mas合成蛋白预吸收抗体时标记的消失。 图9C显示了延髓的头腹外侧区中Mas受体和AKT的免疫共定位，表明 在该区域的神经调节中受体Mas和AKT之间可能的相互作用。

实施例2

该实施例描述了Ang-(1-7)与其Mas受体的相互作用激活 PIK3/Akt途径的鉴定。

培养用Mas受体转染的CHO细胞(CHO-Mas)和人胸主动脉内皮 细胞(HAEC)直至大约80％汇合并用裂解缓冲液处理，用于蛋白质印 迹。处理后，测定蛋白质浓度并将裂解产物接受聚丙烯酰胺/SDS凝胶 电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体(抗-磷酸-Akt，抗-Akt， 抗-磷酸-eNOS和抗-β-肌动蛋白)温育膜。通过化学发光显现后观察 条带。图10显示出CHO-Mas细胞中激酶B(Akt)磷酸化中Ang-(1-7) 产生的刺激。Ang-(1-7)拮抗剂A-779阻断了该作用。图11显示出Akt 参与CHO-Mas细胞中Ang-(1-7)刺激的内皮一氧化氮合酶刺激位点 (S1177)的磷酸化。磷脂酰肌醇3激酶拮抗剂(PI3K)阻断了该作用。 图12显示出Ant-(1-7)对人内皮细胞(HAEC)在激酶B(Akt)磷酸化 中的刺激作用。Ang-(1-7)拮抗剂A-779阻断了该作用。图13显示Akt 参与人内皮细胞(HAEC)中Ang(1-7)刺激的eNOS刺激位点(S1177) 的磷酸化。PI3K拮抗剂渥曼青霉素阻断了该作用。

实施例3

该实施例描述了清醒大鼠中PIK3/Ak t途径参与An-(1-7)刺激的 内皮功能改善(经由Mas受体)的鉴定。

在实验前24小时，将Wistar大鼠接受手术植入导管至股动脉(用 于分析血压和心率)，股静脉(用于注射和输注药物)和左颈动脉(用 于注射药物)。通过连接微型计算机的数据获取系统(BIOPAC System， INc.)获得血压和心率的记录。图14A显示了在清醒的Wistar大鼠 (n＝7)中，乙酰胆碱(ACh)的血管舒张作用不受到静脉内输注盐水 (NaCl 0.9％，0.4mL/h)改变。然而，静脉内输注Ang-(1-7) (7.0pmol/min)增强了清醒Wistar大鼠(n＝9)中乙酰胆碱(Ach) 的血管舒张作用(图14B)。图14C显示了静脉内推注渥曼青霉素(10-6M) (PI3k抑制剂)，接着静脉内输注渥曼青霉素(10-6M)伴随Ang-(1-7) (7.0pmol/min)，阻断了清醒Wister大鼠(n＝7)中Ang-(1-7)对乙 酰胆碱(Ach)的血管舒张作用的增强。我们观察到没有一个组的压力 反射有任何改变。

实施例4

该实施例描述了在NADPH氧化酶的活性中通过Ang-(1-7)与Mas 受体的相互作用而激活PIK3/Akt途径的鉴定。

为了定量NAD(P)H氧化酶的活性，用血管紧张素II(10-7M)刺激 人主动脉内皮细胞(HAEC)10分钟。在一些实验中，将细胞预先暴露 于AT1受体拮抗剂Ibesartan(10-5M)30分钟或Ang-(1-7)(10-7M)15 分钟。将源自光泽精(lucigenin)的化学发光用来测定细胞匀浆中的 NAD(P)H氧化酶的活性。为了定量Ang-(1-7)在c-SRC磷酸化中的调节 作用，培养HAEC直至达到约80％汇合并用裂解缓冲液处理，用于蛋白 质印迹。处理后，测定蛋白质浓度并将裂解产物接受聚丙烯酰胺/SDS 凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体(抗-磷酸-c-SRC， 抗-c-SRC)温育膜。通过化学发光显现后观察条带。图15显示了人内 皮细胞(HAEC)中Ang II刺激的c-SRC磷酸化中Ang-(1-7)的调节作 用。柱状图显示了4个实验的平均值±EPM。*P＜0.05和**P＜0.001相 对于对照。图16显示出Ang-(1-7)(10-7M，预温育15分钟)对Ang II (10-7M，10min)刺激的HAEC中NAD(P)H氧化酶活性的作用。在一些 实验中，用Ibesartan(10-5M，30min)预温育细胞。用4个实验的平 均值±EPM来呈现数据。*p＜0.05相对于对照。+p＜0.05相对于Ang II+Ang(1-7)。

实施例5

该实施例描述了Mas，G-蛋白偶联受体拮抗剂在精子发生中的作 用。

在用三溴乙醇(2.5％，1ml/100g体重)麻醉下，将含有Mas G- 蛋白偶联受体拮抗剂A-779(2.5μg/h，14天，n＝5)或载体(NaCl 0.9％， 1μl/h，14天，n＝6)的渗透迷你泵(ALZET，模型2002)皮下植入 C57小鼠的背部区域中。该阶段之后，将动物称重，然后通过腹膜内 途径注射125UI/kg体重浓度的肝素。十五分钟后，用硫喷妥钠使这 些动物镇静(50mg/kg体重)并通过左心室灌注。在第一个步骤中， 在大约80mmHg压力下，在室温用0.9％生理盐水进行血管床清洗大约5 分钟。在该操作后立即给动物灌注在磷酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.2-7.4)中的4％戊二醛固定溶液约25分钟。该步骤后，取出睾丸并 与各自的附睾分离并称重。从睾丸重量和体重，估算每只动物的性腺 躯体指数(睾丸重量和体重之间的百分比关系)。为了显微镜分析， 收集至多约3mm厚的睾丸碎片，将其浸入4％缓冲的戊二醛中二至四小 时(4℃)。然后，将碎片储存于4℃的磷酸盐缓冲液中，直至将它们 处理用于组织学分析(凋亡的存在)。将这些睾丸碎片在递增浓度的 乙醇(70°，80°，90°，100°，每三十分钟更换)中脱水。脱水 后，将碎片包括于乙二醇甲基丙烯酸酯(metacrylate glycol)中 (Leica Historesin Embedding Kit，Leica Instrumnts)，随后在 切片机中用玻璃保险刀片切成4μm厚。用1％甲苯胺硼酸钠蓝将获得 的切片染色，用Entellan(Merck)封固，并在Olympus显微镜下分 析。图17显示了用Mas G-蛋白偶联受体拮抗剂A-779处理的动物， 相对于对照组，每个横切片呈现出更大数目的凋亡，但是性腺躯体指 数不存在差异。

实施例6

该实施例描述了Mas-KO小鼠卵巢中的形态学改变。

通过去头将未成熟雌性小鼠(30天，11-14g)WT(野生型；n＝4) 和Mas-KO(n＝3)处死。取出卵巢，固定于PBS 0.1m中的4％戊二醛中， 并包括于乙二醇甲基丙烯酸酯(glycolmetacrylate)中。将每第5 个切片(5μm)收集在组织学载玻片上并用甲苯胺蓝染色。将形态学 分析用于建立生长、窦性和闭锁初级卵泡的数量。KO的卵巢呈现出显 著低于WT的卵泡总数(1494相对于3332)，尤其是原始卵泡(418 相对于1930)。此外，与WT小鼠相比较时，KO雌性小鼠闭锁卵泡的 百分比约50％更高。这些数据表明作为Mas受体缺失的结果，卵巢凋 亡活性的提高。

实施例7

该实施例通过RT-PCR证明了，Mas受体在多种组织中的表达，在 其中这些受体的存在可有助于凋亡活性的调节(图18)。