一种心血管保护药物组合物及其用途
阅读：161发布：2020-05-27
专利汇可以提供一种心血管保护药物组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种心血管保护药物组合物，包括如下配比的成分：血管紧张素转化酶 抑制剂 50～200摩尔份、抗 氧 化剂100000～600000 质量 份。本发明还公开了前述药物组合物的用途以及一种 血液代用品 。本发明心血管保护药物组合物可以有效保护心血管，降低血红蛋白类携氧载体的心血管 副作用 。本发明血液代用品无心血管副反应，克服了现有血红蛋白类血液替代品的 缺陷 ，临床应用前景优良。，下面是一种心血管保护药物组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种心血管保护药物组合物，其特征在于：包括如下配比的成分：血管紧张素转化酶抑制剂50～200摩尔份、抗氧化剂100000～600000质量份。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：包括如下配比的成分：血管紧张素转化酶抑制剂100～200摩尔份、抗氧化剂300000～600000质量份。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：
所述血管紧张素转化酶抑制剂为N-[(S)-3-巯基-2-甲基丙酰基]-L-脯氨酸或者(S)-1-[N-(1-乙氧羰基-3-苯基丙基)-L-丙氨酰基]-L-脯氨酸；
所述抗氧化剂为抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述抗氧化剂为超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和N-乙酰半胱氨酸的混合物，三者的重量配比为1:1:1；或者为超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的混合物，二者的重量配比为1:1。
4.权利要求1～3任意一项所述的组合物在制备治疗心血管疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述治疗心血管疾病的药物是治疗血红蛋白类携氧载体引起的心血管疾病的药物。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述治疗心血管疾病的药物是治疗血管内皮细胞损伤、高血压、心脏病和/或冠状动脉痉挛的药物。
7.一种血液代用品，其特征在于：它包含血红蛋白类携氧载体和权利要求1～3任意一项所述的组合物，其中，血红蛋白类携氧载体的浓度为37.5g～120g/L，血管紧张素转化酶抑制剂的浓度为50～200μmol/L、抗氧化剂的浓度为0.1～0.6g/L。
8.根据权利要求7所述的血液代用品，其特征在于：所述血红蛋白类携氧载体的浓度为75～80g/L，血管紧张素转化酶抑制剂的浓度为100～200μmol/L、抗氧化剂的浓度为
0.3～0.6g/L。
9.根据权利要求7或8所述的血液代用品，其特征在于：
所述血红蛋白携氧载体中，血红蛋白含量为20-84%（w/w）；
所述血红蛋白类携氧载体是聚合血红蛋白、PEG修饰血红蛋白或PEG-PCL纳米粒包裹的血红蛋白。
10.一种制备权利要求7～9任意一项所述血液代用品的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）按照权利要求7所述的配比，取血红蛋白类携氧载体、血管紧张素转化酶抑制剂和抗氧化剂，加水，混匀；
（2）调pH值至7.2～7.4，即可。
一种心血管保护药物组合物及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种心血管保护药物组合物及其用途。
背景技术
[0002] 随着血液资源的紧缺、保存期的限制以及输血造成的传染病传播，越来越需要寻找能够代替血液的代用品。目前，可载氧血液代用品主要包括氟碳类化合物和血红蛋白类制剂。血红蛋白（Hemoglobin，Hb）作为血液的重要组成部分，位于红细胞内，是机体运输氧的主要媒介。但是，单纯的血红蛋白溶液并不能直接输注，因为脱离红细胞的血红蛋白失去2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）的调节，氧亲和力急剧升高，不能向组织有效供氧。而游离血红蛋白在各种酶的作用下也会迅速解聚为二聚体和单体，经肾排泄或堵塞肾小管，产生强烈的肾毒性。此外，血红蛋白缺少了红细胞内还原酶系统的作用，会很容易氧化成高铁血红蛋白(MetHb)，失去携氧能力并产生自由基，造成机体氧化应激损伤。因此，需要对血红蛋白进行必要的修饰或处理，由此产生的一类制品统称为血红蛋白类携氧载体（HBOCs）。
[0003] 现有HBOCs产品在临床实践中，都发现了很多缺陷。雅培公司开发的HemAssist属第1代产品，因在III期临床试验中发现受试者死亡率明显增加而放弃。HemAssist和Polyheme也因为临床试验中出现严重心脏毒性而终止研究。美国Biopure公司研发的Hemopure（戊二醛交联的聚合牛血红蛋白）是目前唯一已经获准在临床应用的产品，但仅限于在南非上市。因为III期临床研究中暴露出心血管方面的安全性问题，也停止了进一步的研发。2008年，Natanson和其同事在世界著名的医学杂志《JAMA》上发表了1篇有关HBOC临床试验的Meta分析，指出其增加了患者的死亡率并有潜在的引起心肌梗死的风险。同时，《JAMA》杂志为这篇文章配发了编者按，指出在明确HBOC制品潜在毒副作用及其机理之前，不应再开展进一步的临床试验。针对HBOCs制品输注后的心血管副反应，学术界的观点普遍认为是由于HBOC中游离或未聚合的血红蛋白，包括氧合或非氧合状态，透过内皮屏障，消耗内皮舒张因子一氧化氮（NO）；同时，血红蛋白本身的氧化还原反应，生成的氧自由基造成机体氧化应激反应。目前，能够降低血红蛋白携氧载体心血管副反应的药物较少。
[0004] 血 管 紧 张 素 转 化 酶 抑 制 剂 (Angiotension Converting En-zyme Inhibitor,ACEI)是从蛇毒的毒汁中分离出来的肤类物质,经过一系列的构效关系研制而成。根据它们活性部分化学结构的不同可分为3类:第1类为琉基类,代表药为卡托普利(Captopril);第2类为磷酸基团类,代表药为福辛普利(Fosino Pril);第3类为梭基类,代表药为依那普利(Enala-pril)。血管紧张素转化酶抑制剂可以使血管舒张，降低血压，抑制血管增生、肥厚，抑制和逆转心肌肥厚，改善心脏冠状动脉供血，减轻心肌缺血再灌注损伤。
[0005] 抗氧化剂，是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。常见的抗氧化剂有抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸等。研究发现，摄入抗坏血酸、维生素E等抗氧化剂，可以有效预防高血压、冠心病，但是治疗作用不明显。
[0006] 未见将血管紧张素转化酶抑制剂与抗氧化剂联用，以降低血红蛋白类携氧载体引起的心血管副反应的报道。
发明内容
[0007] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种心血管保护药物及其用途，还提供了一种新的血液代用品。
[0008] 本发明心血管保护药物组合物，包括如下配比的成分：血管紧张素转化酶抑制剂50～200摩尔份、抗氧化剂100000～600000质量份。
[0009] 上述摩尔份：质量份=mol/g。
[0010] 所述组合物，包括如下配比的成分：血管紧张素转化酶抑制剂100～200摩尔份、抗氧化剂300000～600000质量份。
[0011] 所述血管紧张素转化酶抑制剂为N-[(S)-3-巯基-2-甲基丙酰基]-L-脯氨酸或者(S)-1-[N-(1-乙氧羰基-3-苯基丙基)-L-丙氨酰基]-L-脯氨酸。
[0012] N-[(S)-3-巯基-2-甲基丙酰基]-L-脯氨酸，商品名为卡托普利，经验分子式（希尔表示法）C9H15NO3S，分子量217.29，结构式如下：
[0013]
[0014] (S)-1-[N-(1-乙氧羰基-3-苯基丙基)-L-丙氨酰基]-L-脯氨酸，商品名为依那普利，经验分子式（希尔表示法）C20H28N2O5，分子量376.45，结构式如下：
[0015]
[0016] 所述抗氧化剂为抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或两种以上的组合。
[0017] 所述抗氧化剂为超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和N-乙酰半胱氨酸的混合物，三者的重量配比为1:1:1；或者为超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的混合物，二者的重量配比为1:1。
[0019] 所述治疗心血管疾病的药物是治疗血红蛋白类携氧载体引起的心血管疾病的药物。
[0020] 所述治疗心血管疾病的药物是治疗血管内皮细胞损伤、高血压、心脏病和/或冠状动脉痉挛的药物。
[0021] 本发明血液代用品，它包含血红蛋白类携氧载体和前述组合物，其中，血红蛋白类携氧载体的浓度为37.5g～120g/L，血管紧张素转化酶抑制剂的浓度为50～200μmol/L、抗氧化剂的浓度为0.1～0.6g/L。
[0022] 所述血红蛋白类携氧载体的浓度为75～80g/L，血管紧张素转化酶抑制剂的浓度为100～200μmol/L、抗氧化剂的浓度为0.3～0.6g/L。
[0023] 所述血红蛋白携氧载体中，血红蛋白含量为20-84%。
[0024] 所述血红蛋白类携氧载体是聚合血红蛋白、PEG修饰血红蛋白或PEG-PCL纳米粒包裹的血红蛋白。
[0025] 所述的血液代用品，其pH为7.2～7.4。
[0026] 本发明制备前述血液代用品的方法，包括如下步骤：
[0027] （1）按前述配比，取血红蛋白类携氧载体、血管紧张素转化酶抑制剂和抗氧化剂，加水，混匀；
[0028] （2）调pH值至7.2～7.4，即可。
[0029] 本发明药物组合物可以有效的保护心血管，治疗高血压、心脏病和冠状动脉痉挛，改善血红蛋白类携氧载体制品的心血管副反应，本发明血液代用品，克服了现有血红蛋白类血液替代品的缺陷，有效提高医疗质量和改善病人预后，临床应用前景优良。
[0030] 下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明：
[0031] 图1实施例7制备纳米粒的粒径分布图
[0032] 图2MTT法测定实施例8（A）和实施例9（B）制备的血液代用品对HUVECs细胞的作用结果
[0033] 图3实施例8（A）和实施例9（B）制备的血液代用品对昆明小鼠血压的作用结果[0034] 图4实施例6制备的血液代用品冠脉推注后对犬冠状动脉的作用结果
[0035] 图5实施例6制备的血液代用品冠脉推注后对犬心脏功能的作用结果具体实施方式：
[0036] 主要仪器、试剂及动物：
[0037] 血气分析仪：ABL800FLEX，Radiometer公司；BC-3000PLUS，迈瑞公司，中国；
[0038] HEMOXTM分析仪：TCS Scientific，USA；
[0040] 冠脉造影设备：AXIOM Artis dTA system；德国Siemens公司；
[0041] 心脏彩超仪：Vivid7，美国GE Healthcare公司；
[0042] 卡托普利，依那普利和MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）购于美国Sigma-Aldrich公司；
[0043] 二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乳酸、磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）均购于成都科龙化学试剂公司；
[0044] 细胞培养基DMEM培养基购自Gibico BRL公司；
[0045] 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来自四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室。
[0046] 成年雄性昆明小鼠和雄性Beagle犬均购自成都达硕生物科技有限公司。
[0047] 实施例1本发明心血管保护药物组合物的制备
[0048] 取卡托普利434.6μg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各4.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟，即可。
[0049] 实施例2本发明心血管保护药物组合物的制备
[0050] 取卡托普利217.3μg，抗坏血酸5.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟，即可。
[0051] 实施例3本发明心血管保护药物组合物的制备
[0052] 取依那普利1.5mg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各2.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟，即可。
[0053] 实施例4本发明心血管保护药物组合物的制备
[0054] 取依那普利1.9mg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各5.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟，即可。
[0055] 实施例5本发明心血管保护药物组合物的制备
[0056] 取卡托普利108.6μg，超氧化物岐化酶和过氧化氢酶各0.5mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟，即可。
[0057] 实施例6本发明血液代用品的制备
[0058] 在4℃低温条件下，取聚合人脐带血血红蛋白冻干粉(按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备)0.75g，其中血红蛋白含量80％，卡托普利434.6μg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各4.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4，然后定容体积至20mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0059] 该溶液中聚合人脐带血血红蛋白的含量为37.5g/L，血红蛋白含量为3g/dL，卡托普利含量为100μmol/L，抗氧化剂含量为0.6g/L，氧亲和力P50值28mmHg。
[0060] 实施例7本发明血液代用品的制备
[0061] 在4℃低温条件下，取PEG修饰猪血血红蛋白冻干粉（按照专利ZL200380109157.8说明书第7～8页的方法制备）1.2g，其中血红蛋白含量84％，卡托普利217.3μg，抗坏血酸5.0mg，加入6mL生理盐水，以转速800rpm，用搅拌子磁力搅拌5分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4，然后定容体积至10mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0062] 该溶液中PEG修饰猪血血红蛋白的含量为120g/L，血红蛋白含量为10g/dL，卡托普利含量为100μmol/L，抗氧化剂含量为0.5g/L，氧亲和力P50值21mmHg。
[0063] 实施例8本发明血液代用品的制备
[0064] 在4℃低温条件下，取PEG修饰牛血血红蛋白冻干粉（按照专利ZL200380109157.8说明书第7～8页的方法制备）1.6g，其中血红蛋白含量75％，依那普利1.5mg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各2.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌10分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2，然后定容体积至20mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0065] 该溶液中PEG修饰牛血血红蛋白的含量为80g/L，血红蛋白含量为6g/dL，依那普利含量为200μmol/L，抗氧化剂含量为0.3g/L，氧亲和力P50值13mmHg。
[0066] 实施例9本发明血液代用品的制备
[0067] 在4℃低温条件下，取聚合人脐带血血红蛋白冻干粉(按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备)5.0g，其中血红蛋白含量80％，依那普利1.9mg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各5.0mg，加入35mL生理盐水，以转速500rpm，用搅拌子磁力搅拌30分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4，然后定容体积至50mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0068] 该溶液中聚合人脐带血血红蛋白的含量为100g/L，血红蛋白含量为8g/dL，依那普利含量为100μmol/L，抗氧化剂含量为0.3g/L，氧亲和力P50值25mmHg。
[0069] 实施例10本发明血液代用品的制备
[0070] 在4℃低温条件下，取聚合人脐带血血红蛋白冻干粉(按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备)2.0g，其中血红蛋白含量80％，卡托普利434.6μg，超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、N-乙酰半胱氨酸各4.0mg，加入15mL生理盐水，以转速600rpm，用搅拌子磁力搅拌15分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4，然后定容体积至20mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0071] 该溶液中聚合人脐带血血红蛋白的含量为100g/L，血红蛋白含量为8g/dL，卡托普利含量为100μmol/L，抗氧化剂含量为0.6g/L，氧亲和力P50值24mmHg。
[0072] 实施例11本发明血液代用品的制备
[0073] 在4℃低温条件下，取聚合人脐带血血红蛋白冻干粉(按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备)0.38g，其中血红蛋白含量80％，卡托普利108.6μg，超氧化物岐化酶和过氧化氢酶各0.5mg，加入6mL生理盐水，以转速500rpm，用搅拌子磁力搅拌30分钟。搅拌完成后，以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2，然后定容体积至10mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0074] 该溶液中聚合人脐带血血红蛋白的含量为38g/L，血红蛋白含量为3g/dL，卡托普利含量为50μmol/L，抗氧化剂含量为0.1g/L，氧亲和力P50值27mmHg。
[0075] 实施例12本发明血液代用品的制备
[0076] 分别将8.57g己内酯（PCL）与1.43g分子量5000的聚乙二醇单甲醚（mPEG5000）按质量比6：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在137℃油浴中反应6小时。待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到mPEG-PCL。
[0077] 然后，将30mg游离人脐带血血红蛋白冻干粉（其中血红蛋白含量85％），溶于2mL PBS(PH7.4)，以每分钟1ml的速度在超声振荡下滴入5ml含100mgmPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后将制得的初乳迅速倒入20ml0.1%的PVA溶液中，在乳化分散机上乳化5分钟，然后加入100ml0.05%的PVA溶液中稀释搅拌30分钟，于旋转蒸发仪上挥去有机溶剂，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离。收集下层纳米囊泡，溶于5ml磷酸盐缓冲液，经凝胶色谱柱纯化，收集在400-600nm区域有血红蛋白特征吸收的洗脱液，经超滤浓缩后冻干，即得含有游离人脐带血血红蛋白的PEG-PCL纳米粒冻干粉。纳米粒的粒径约为224nm（如图1），血红蛋白载药率20％。
[0078] 取5批次纳米粒冻干粉600mg，卡托普利108.6μg，超氧化物岐化酶和过氧化氢酶各0.5mg，加入6mL生理盐水，以转速500rpm，用搅拌子磁力搅拌30分钟。以浓度0.1M的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2，然后定容体积至10mL，即得本发明所述无心血管活性血红蛋白类携氧载体溶液，4℃存放备用。
[0079] 该溶液中纳米粒冻干粉的含量为60g/L，血红蛋白含量为1g/dL，卡托普利含量为50μmol/L，抗氧化剂含量为0.1g/L，氧亲和力P50值6mmHg。
[0080] 以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
[0081] 预实验发现，如果仅仅单独将实施例1-5使用的抗氧化剂分别与血红蛋白携氧载体（HBOCs）同时使用，对HBOCs引起的心血管副作用几乎没有缓解能力。
[0082] 由于抑制剂血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）对HBOCs引起的心血管副作用有一定的缓解作用，因此，发明人将其设为阳性对照，并将本发明组合物分别与阴性对照组（单独的HBOCs）和阳性对照组（HBOCs+ACEI）进行比较试验，具体试验例如下；
[0083] 实验例1本发明组合物对血管内皮细胞的作用
[0084] 1、实验分组
[0085] 阴性对照1组（HBOCs组1）：使用PEG修饰牛血红蛋白（血红蛋白浓度6g/dL；按照专利ZL200380109157.8说明书第7～8页的方法制备）；
[0086] 对照1组（HBOCs+ACEI组1）：使用上述PEG修饰牛血红蛋白并加入依那普利（血红蛋白浓度6g/dL，依那普利浓度200μmol/L）；
[0087] 实验1组（本发明组合物组1：HBOCs+ACEI+抗氧化剂组）：使用实施例8制备的终产物。
[0088] 阴性对照2组（HBOCs组2）：使用聚合人脐带血血红蛋白（血红蛋白浓度8g/dL，按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备）；
[0089] 对照2组（HBOCs+ACEI组2）：使用上述聚合人脐带血血红蛋白并加入依那普利（血红蛋白浓度8g/dL，依那普利浓度100μmol/L）；
[0090] 实验2组（本发明组合物组2：HBOCs+ACEI+抗氧化剂组）：使用实施例9制备的终产物。
[0091] 样品临用前均水浴升温到37℃。
[0092] 2、实验方法
[0093] 实验操作：选取人脐静脉内皮细胞株（HUVECs），置于含有100μL DMEM培养基的3
96孔板中，细胞密度3×10，细胞培养箱中37℃培养24h后，加入上述样品100μL处理2h。
空白对照组加入DMEM培养基100μL处理2h。然后行MTT法检测细胞活性。
96孔板中，细胞密度3×10，细胞培养箱中37℃培养24h后，加入上述样品100μL处理2h。
空白对照组加入DMEM培养基100μL处理2h。然后行MTT法检测细胞活性。
[0094] 统计分析：细胞活性采用单因素方差分析，并用LSD检验比较两两差异。P<0.05被认为是有显著性差异。数据以均数±标准差表示，n＝5。*P<0.05和**P<0.01vs.阴性对照组。
[0095] 3、实验结果
[0096] 实验结果如图2所示，与空白对照组比较，HBOCs组1和HBOCs组2内皮细胞损伤明显，细胞活性明显降低（P<0.001和P<0.001vs.空白对照组）。与HBOCs组1相比，加入了依那普利的HBOCs+ACEI组1细胞活性虽有一定程度增加，但没有达到统计学差异（P>0.05），而同时加入依那普利和抗氧化剂后的本发明组合物组，细胞活性显著高于对照组（P<0.01）（图2A）。与HBOCs组2相比，加入了依那普利的对照HBOCs+ACEI组2显著增加了细胞活性（P<0.05），而加入依那普利和抗氧化剂后的本发明药物组合物，细胞活性增加效果更强（P<0.01）（图2B）
[0097] 结论：实验结果说明，单独的血红蛋白类携氧载体对血管内皮细胞损伤大，血管紧张素转化酶抑制剂可以减少其对血管内皮细胞的损伤，但是作用不明显。而采用本发明组合物，即将血管紧张素转化酶抑制剂与抗氧化剂联用可以明显降低血红蛋白类携氧载体对血管内皮细胞的损伤（P<0.01），说明本发明组合物可以用于降低血红蛋白类携氧载体的心血管副作用。
[0098] 实验例2本发明组合物的血管活性检测
[0099] 1、实验分组
[0100] 阴性对照1组（HBOCs组1）：使用PEG修饰牛血红蛋白（血红蛋白浓度6g/dL；按照专利ZL200380109157.8说明书第7～8页的方法制备）；
[0101] 对照1组（HBOCs+ACEI组1）：使用上述PEG修饰牛血红蛋白并加入依那普利（血红蛋白浓度6g/dL，依那普利浓度200μmol/L）；
[0102] 实验1组（本发明组合物组1：HBOCs+ACEI+抗氧化剂组）：使用实施例8制备的终产物。
[0103] 阴性对照2组（HBOCs组2）：使用聚合人脐带血血红蛋白（血红蛋白浓度8g/dL，按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法制备）；
[0104] 对照2组（HBOCs+ACEI组2）：使用上述聚合人脐带血血红蛋白并加入依那普利（血红蛋白浓度8g/dL，依那普利浓度100μmol/L）；
[0105] 实验2组（本发明组合物组2：HBOCs+ACEI+抗氧化剂组）：使用实施例9制备的终产物。样品临用前均水浴升温到37℃。
[0106] 2、实验方法
[0107] 实验操作：雄性昆明小鼠12只，22-25g，随机进入上述4组，每组3只。清醒动物称重后，置于BP-2000无创血压检测系统，尾部测压，测定得到基础血压，然后按照分组分别从尾静脉推注16％血容量（理论最大耐受量，约0.3ml/25g小鼠）的上述样品。另取3只动物，尾静脉推注同等剂量生理盐水作为空白对照组。然后，检测每组推注后10分钟和30分钟的血压的变化情况。
[0108] 统计分析：采用单因素方差分析，并用LSD检验比较两两差异。P<0.05被认为是有显著性差异。结果以均数±标准差表示，*P<0.05和**P<0.01vs.对照1组或对照2组；vs.对照1组或对照2组。
[0109] 3、实验结果
[0110] 与基础血压比较，空白对照组没有显著性差异，而推注样品10分钟后，HBOCs组1和HBOCs组2血压有明显升高。对比显示，加入了依那普利的HBOCs+ACEI组1的血压与HBOCs组1血压没有显著性差异，而同时加入依那普利和抗氧剂的本发明组合物组1，血压显著低于HBOCs组1（P<0.01），同时，还显著低于HBOCs+ACEI组1（P<0.05）（图3A）。类似的，同时加入依那普利和抗氧剂的本发明组合物组1，血压显著低于HBOCs组2（P<0.01）以及仅加入HBOCs+ACEI组2（P<0.05）（图3B）。
[0111] 结论：实验结果说明，血红蛋白类携氧载体会引起血压明显升高，血管紧张素转化酶抑制剂联用可以降低其副作用，但是作用不明显，而采用本发明组合物，即将血管紧张素转化酶抑制剂与抗氧化剂联用可以明显降低血红蛋白类携氧载体引起的高血压反应（P<0.05），说明本发明组合物可以用于降低血红蛋白类携氧载体的心血管副作用。
[0112] 实验例3本发明组合物对犬冠状动脉的影响
[0113] 1、实验分组
[0114] HBOCs组：按照专利ZL02133592.3说明书第7～8页的方法，制备聚合人脐带血血红蛋白溶液（血红蛋白浓度3g/dL）用于阴性对照组；
[0115] HBOCs+ACEI组：取上述聚合人脐带血血红蛋白溶液并加入卡托普利（血红蛋白浓度3g/dL，卡托普利浓度100μmol/L）用于对照组（无抗氧化剂）；
[0116] 本发明组合物组：取实施例6制备的终产品用于实验组（含抗氧化剂）。
[0117] 溶液临用前以95％氧气＋5％二氧化碳鼓泡式充氧氧合10分钟，再水浴升温到37℃。
[0118] 2、实验方法
[0119] 实验操作：选取心功能正常的成年雄性Beagle犬6只，体重8～10公斤，分为阴性对照组（2只）、对照组（无抗氧剂，2只）和实验组（含抗氧剂，2只）。各组的Beagle犬术前肌肉注射吗啡，以枸橼酸芬太尼、咪唑安定、丙泊酚、维库溴胺诱导麻醉，气管插管后接呼吸机，麻醉以力月西、丙泊酚、枸橼酸芬太尼、维库溴铵维持，根据需要静脉注射维持至手术结束。左侧股动脉穿刺置管监测血压、动脉血气及血清电解质水平，股静脉穿刺置管接三通延长管达下腔静脉水平建立输液通道。冠脉导管经皮穿刺入下肢股动脉，沿降主动脉逆行至升主动脉根部，再经冠状动脉，将导管固定于左右冠状动脉口，推注非离子型造影剂碘海醇（欧乃派克）10mL，X射线照射后显影，作为基础值。稳定10分钟后，阴性对照组、对照组（无抗氧剂）和实验组（含抗氧剂）分别冠脉推注10mL聚合人脐带血血红蛋白、聚合人脐带血血红蛋白＋卡托普利和实施例1制备的终产品，然后立即推注上述造影剂10mL显影。
[0120] 检测指标：（1）心脏功能指标：心脏射血分数由PHILIPS IE33彩色超声诊断系统采集，采集时间为每次冠脉造影后即刻。（2）冠状动脉变化率通过分析造影图像显示的冠状动脉左前降支血管腔直径在推注前后的变化得出，负值表示血管收缩，分析软件为德国Siemens公司的QuantCor QCA。（3）采集股动脉，并用Radiometer公司的ABL800FLEX血气分析仪实时监测血气和电解质指标，包括氧分压（PO2），氧饱和度（SO2），二氧化碳分压2+ + 2+
（PCO2），pH值，血红蛋白浓度，Ca 浓度，K 浓度，Mg 浓度等。
（PCO2），pH值，血红蛋白浓度，Ca 浓度，K 浓度，Mg 浓度等。
[0121] 统计分析：采用单因素方差分析，并用LSD检验比较两两差异。P<0.05被认为是有显著性差异。数据以均数±标准差表示。*P<0.05和***P<0.001vs.基础状态；和 vs.阴性对照组。
[0122] 3、实验结果
[0123] 1、冠脉造影图像分析结果如图4所示，HBOCs组冠脉出现明显收缩或痉挛，HBOCs+ACEI组的冠脉收缩程度有所减轻（P<0.05vs.HBOCs组），而本发明组合物组，冠脉在推注前后并没有出现血管收缩或痉挛，状态最好（P<0.01vs.HBOCs组）。
[0124] 2、射血分数如图5所示，基础时，三组动物心脏的射血分数没有显著性差异，但是推注样品后HBOCs+ACEI组心脏的射血分数显著高于HBOCs组（P<0.05），但与基础状态相比还是有明显降低（P<0.05）；而本发明组合物组的射血分数显著高于HBOCs组（P<0.05），且与基础状态相比无显著差异（P>0.05）。
[0125] 3、各组动物的血气和电解质指标在实验过程中均保持在正常水平。
[0126] 结论：实验结果说明，血红蛋白类携氧载体会引起冠状动脉收缩或痉挛，导致心脏机能降低，血管紧张素转化酶抑制剂可以降低其副作用，但是难以使机体恢复至正常水平，而采用本发明组合物，即将血管紧张素转化酶抑制剂与抗氧化剂联用则可以更加明显降低血红蛋白类携氧载体其副作用，使机体恢复至正常水品。
[0127] 对血红蛋白类携氧载体引起的副反应，如血管内皮细胞损伤、高血压、冠状动脉痉挛，发明人前期实验研究发现，单独使用抗氧化剂几乎不能缓解，同时，如上述实验例1～3所示，单独使用血管紧张素转化酶抑制剂有一定的缓解作用，但是作用仍然不明显，然而，本发明将抗氧化剂与血管紧张素转化酶组合使用时，其可以非常有效地降低前述副反应（p<0.05），说明本发明组合物中，抗氧化剂与血管紧张素转化酶发挥了协同增效的作用。
[0128] 综上，本发明组合物可以防止血管内皮细胞损伤，降低高血压反应，防止冠状动脉痉挛，维持心脏机能，能有效降低血红蛋白携氧载体的心血管副作用，本发明血液代用品输血，可以克服现有血液代用品存在心血管副反应的缺陷，临床应用前景良好。
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