微粒子、血液代用品及其形成方法
阅读：501发布：2020-05-11
专利汇可以提供微粒子、血液代用品及其形成方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了形成微粒子的方法。所述方法包括以下步骤：‑提供包括至少阴离子的第一溶液；‑提供包括至少阳离子的第二溶液；‑在至少第一化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合来形成多孔性模板，其中通过盐的沉淀形成所述多孔性模板，所述盐包括所述阴离子和阳离子，并且其中第一化合物至少部分地被结合在多孔性模板中；和‑使在多孔性模板中的第一化合物至少部分地交联。，下面是微粒子、血液代用品及其形成方法专利的具体信息内容。
1. 形成微粒子的方法，包括： -提供包括至少阴离子的第一溶液； -提供包括至少阳离子的第二溶液； -在至少第一化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合来形成多孔性模板，其中通 过盐的沉淀形成所述多孔性模板，所述盐包括所述阴离子和阳离子，并且其中所述第一化 合物至少部分地被结合在多孔性模板中；和 -使在多孔性模板中的第一化合物至少部分地交联。
2. 根据权利要求1的方法，另外包括： -将所述多孔性模板溶解，以形成至少包括所述交联的第一化合物或所述交联的第一 的微粒子。
3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一溶液的阴离子选自包括碳酸根离 子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、及其混合物的组，且其中所述第二溶液的 阳离子选自包括Ca离子、Μη离子、Mg离子、Ba离子、及其混合物的组。
4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中第一化合物选自包括haemeproteins、血红 蛋白、肌红蛋白、白蛋白、及其混合物的组。
5. 根据前述权利要求中任一项的方法，另外包括： -将药学活性化合物结合到微粒子中。
6. 微粒子，包括： -至少第一化合物，所述第一化合物为至少部分交联的，其中所述第一化合物选自包括 haemeproteins、血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白、及其混合物的组;和 -至少由经过交联的第一化合物形成的多孔性或海绵状聚合物网状结构。
7. 根据权利要求6的微粒子，另外包括至少经过交联的第二化合物，其中所述第二化合 物选自包括聚合物、蛋白质、纳米粒子、药学活性化合物、营养增补剂、及其混合物的组。
8. 血液代用品，包括： -包括多孔性或海绵状的聚合物网络结构的微粒子，所述多孔性或海绵状的聚合物网 络结构至少由经过交联的血红蛋白形成。
9. 根据权利要求8的血液代用品，其中所述微粒子的大小为至少500nm，并且典型地为 约 Ιμπι-约 5μηι。
10. 试剂盒，包括： -适合作为血液代用品的交联的血红蛋白微粒子的干燥粉末，其中所述微粒子包括多 孔性或海绵状的聚合物网络结构的微粒子，所述多孔性或海绵状的聚合物网络结构至少由 经过交联的血红蛋白形成，其中所述微粒子的大小为至少500nm;和 生理溶液。
微粒子、血液代用品及其形成方法
[00011 本发明是申请日为2008年7月14日的中国专利申请200880106151.8的分案申请， 原申请的发明名称为"微粒子、血液代用品及其形成方法"。
技术领域
[0002] 本发明描述了与形成微粒子(特别是包括至少一种交联化合物的微粒子）的方法 有关的实施方案。另外的实施方案涉及微粒子。
背景技术
[0003] 微粒子在粒度级上比纳米粒子大且比宏观粒子小。在两个方向上都没有明确的边 界并且粒度范围主要定义为IOOnm到100μπι之间。如果按照大小来考虑，例如生物学细胞属 于微粒子。微粒子从几个不同方面加以区分:天然的和合成的；有机的和无机的；晶态的和 无定形的；多孔性的和无孔的；芯-壳构造、基质构造或均质构造等。微粒子的生产方法通常 分成自上向下和自下向上的方法。在第一种情况中，通过碾磨或高压匀化将宏观材料粉碎， 而在第二种情况中，通过沉淀、结晶化、喷雾干燥等从这些分子化合物组装粒子。
[0004] 此外，近年来已经开发了模拟生物学过程的微粒子组装方法。通常，通过所谓的仿 生过程通过有机和无机材料的交互构造生长形成粒子。
[0005] -些上述方法允许合成具有特定内部结构的微粒子。典型的实例是由于小孔和空 腔而具有巨大内表面的多孔性微粒子。如果将多孔性粒子用来组装互补构造，可以产生非 常感兴趣的精细结构。这样，粒子由多孔性模板和填充小孔和空腔的结构组成。
[0006] 对于各种应用，期望产生大量的微粒子并具有界限分明的平均大小。另外，所形成 的微粒子应该是稳定的，以便长时间储存。由不同化合物构成的微粒子的容易和成本有效 的生产方法也是当前的需求。
发明内容
[0007] 考虑到上述需要，提供了形成微粒子的方法，所述方法是简单的、多用途的、并且 适合于不同的材料。所形成的微粒子可以由单独的材料或化合物或不同的材料或化合物构 成，并且可用于各种目的。
[0008] 根据一个实施方案，提供了形成微粒子的方法。所述方法包括：
[0009] -提供包括至少阴离子的第一溶液；
[0010]-提供包括至少阳离子的第二溶液；
[0011] -在至少第一化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合来形成多孔性模板，其 中通过盐的沉淀形成所述多孔性模板，所述盐包括所述阴离子和阳离子，并且其中第一化 合物至少部分地被结合在多孔性模板中；和
[0012] -使在多孔性模板中的第一化合物至少部分地交联。
[0013] 根据一个实施方案，提供了形成微粒子的方法。所述方法包括：
[0014] -提供多孔性模板的悬浮液和包括至少第一化合物的溶液；
[0015] -将溶液与悬浮液混合，以便使第一化合物至少部分地结合在多孔性模板中；和
[0016] -在没有在单独的步骤中进一步结合另外的化合物的情况下，使至少在多孔性模 板中的第一化合物至少部分地交联。
[0017] 根据另一个实施方案，提供了形成微粒子的方法。所述方法包括：
[0018] -提供包括至少阴离子的第一溶液；
[0019] -提供包括至少阳离子的第二溶液；
[0020] -在微模板和至少第一化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合来形成多孔性 模板(所形成的多孔性模板包括所述微模板作为核心），其中通过盐的沉淀形成所述多孔性 模板，所述盐包括所述阴离子和阳离子，并且其中第一化合物至少部分地被结合在多孔性 模板中；和[0021 ]-使在多孔性模板中的第一化合物至少部分地交联。
[0022]根据一个实施方案，提供了微粒子。所述微粒子包括：
[0023]-至少一种交联的第一化合物;和
[0024] -至少由第一化合物形成的多孔性或海绵状聚合物网状结构。
[0025] 根据一个实施方案，提供了包括微粒子的血液代用品，所述微粒子包括至少由交 联的血红蛋白形成的多孔性或海绵状的聚合物网状结构。与通过在自由溶液中交联形成并 且密集填充的粒子不同，本文中所述的微粒子是开孔的或开放多孔的。用作血液代用品的 微粒子的大小可以为约Iwn-约5μηι的范围内，并且典型地在约2μηι-约4μηι的范围内。
[0026] 在一些实施方案中，通过使盐在要被结合在多孔性模板中的化合物的存在下沉淀 来形成多孔性模板。所述化合物在第一溶液和第二溶液中的至少一种中提供，或者在二者 中都提供。在沉淀过程中，模板生长并且累积地结合所述化合物。所述化合物可以以高浓度 提供，这样实现高的结合速率，使得模板具有高的化合物负载。在一些实施方案中，将化合 物的混合物结合在正在生长的多孔性模板中。在另外的实施方案中，通过多孔性模板的逐 步或重复沉淀相继结合至少两种化合物。
[0027] 所述阳离子和阴离子典型地选择为使得它们形成在溶剂中难溶的盐，所述溶剂典 型地是含水溶液。本文中使用的术语"难溶的盐"意在描述所述盐基本上不可溶解于水中， 使得所形成的多孔性模板在水中基本上是稳定的。
[0028] 另一个优点在于在用化合物填充模板并在可选的将模板溶解之后，可以大量生产 包括所述化合物的微粒子，以便得到大量的微粒子。
[0029] 被结合在多孔性模板中的化合物的交联允许容易地形成聚合物并避免在正常的 聚合条件(诸如在自由基聚合)下出现的苛刻条件。因此，可以在基本上不影响化合物功能 的温和条件下形成基于诸如生物分子的敏感(delicate)化合物(例如蛋白质和酶）的聚合 物。因此，经过交联的化合物保持其特有的特征，使得所形成的微粒子适合于要求交联的化 合物维持其特定功能或活性(诸如，酶活性、氧的吸附和解吸能力、药物活性，仅举几个例 子)的应用。化合物混合物的交联也是可能的，使得可以形成由至少两种不同的化合物构成 的聚合物。
[0030] 另外，可以形成即使在任选的多孔性模板溶解之后仍充分稳定的聚合物网状结 构。由于在多孔性模板溶解之后可得到的大的内表面，所述聚合物网状结构还提供大的面 积-体积比。典型地，所述微粒子具有由聚合物网络形成的开孔或开放的多孔结构。因此，进 而化合物可以被吸附或偶联于所述聚合物网络结构。
[0031] 可以通过例如控制用于形成多孔性模板的沉淀过程来调节所形成的微粒子的大 小。
[0033] 参考附图，在以下部分中更详细地阐述完整和本领域技术人员能够实施的本发明 的内容，包括其最佳实施方式。其中：
[0034] 图IA示出了以低搅拌速度持续1分钟制备的交联的白蛋白微粒子在漂洗之前的显 微照片。该样品包含1%FITC-标记的白蛋白，以便更好地观察。
[0035] 图IB示出了以高搅拌速度持续20秒钟制备的交联的白蛋白微粒子在漂洗之前的 显微照片。该样品包含1%FITC-标记的白蛋白，以便更好地观察。
[0036] 图2A示出了以极低搅拌速度持续2分钟制备的交联的血红蛋白微粒子在洗涤之前 的显微照片。
[0037] 图2B示出了以中等搅拌速度持续30秒制备的交联的血红蛋白粒子在洗涤之前的 显微照片。
[0038] 图3示出了在高和低p02时交联的血红蛋白微粒子的吸收光谱图。为了进行对比， 显示了氧化血红蛋白和血红蛋白的谱图。
[0039]图4示出了通过两步骤沉淀制备的交联的血红蛋白/白蛋白微粒子的显微照片。在 第二个沉淀步骤过程中，加入了 1%FITC标记的白蛋白（绿色），以便更好地观察。
[0040]图5示出了通过两步骤沉淀制备的交联的胰蛋白酶/白蛋白微粒子的显微照片。在 第二个沉淀步骤过程中，加入了 1%FITC标记的白蛋白（绿色），以便更好地观察。[0041 ]图6A示出了用分子量约64-约76kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐 微粒子的显微照片。
[0042]图6B示出了用分子量约564kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐微粒 子的显微照片。
[0043]图6C示出了用分子量约64-67kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐微 粒子的显微照片。
[0044]图6D示出了用分子量约464kDa的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐微粒子的显微照 片。
[0045]图6E示出了用分子量约464kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐微粒 子的显微照片。
[0046] 图7示出了用白蛋白和连接的胰岛素制备的表面修饰的微粒子的荧光强度的柱状 图。NK:阴性对照；I-MP:带有胰岛素的微粒子
[0047] 图8举例说明了用于形成微粒子的方法的程序。
[0048] 图9举例说明了模板的生长和小孔的填充。
[0049] 图10举例说明了包括核心和壳的微粒子的形成。
[0050] 发明详述
[0051] 为了促进对本发明的原理的理解，下面参考在附图中举例说明的优选实施方案， 并且使用了特定的术语来描述所述优选实施方案。尽管如此，应该理解，意在不对本发明的 范围进行限制，通常会由本发明所述技术领域技术人员在现在或以后考虑到对于所举例说 明的设备和/或方法的这种变化和进一步的改进、以及本文中所举例说明的本发明的原理 的这种进一步应用。
[0052] 本说明书所述的本发明的一个方面是通过使至少一种盐在一种化合物或物质的 存在下进行沉淀形成微粒子的方法，其中所沉淀的盐形成模板，所述化合物或物质在模板 的生长过程中结合在所述模板中。在一个实施方案中，如图7和8中所述，提供了包括阴离子 的第一溶液11。另外，提供了包括阳离子的第二溶液12。对所述阴离子和阳离子进行选择以 使得它们能够形成在水溶液中难溶的盐。所述阴离子和阳离子可以是有机的或无机的。典 型地，所述阳离子在性质上为无机的，并可以选自Ca离子、Mn离子、Mg离子、Ba离子及其混合 物。另外，所述阴离子在性质上典型地为无机的，并可以选自碳酸根离子、磷酸根离子、磷酸 氢根离子、磷酸二氢根离子及其混合物。例如，第一溶液可以包括CaCl 2来提供Ca离子，第二 溶液包括Na2CO3来提供碳酸根离子，导致CaCO 3粒子的形成。本领域技术人员应该理解，所述 阳离子和阴离子不限于上述实例。
[0053]所述阳离子和阴离子另外选择为使得它们允许通过沉淀形成多孔性模板。CaCO3 粒子是多孔性模板的一个实例。其它实例包括但不限于MnC03、所有的磷酸钙粒子(诸如Ca3 (PO4) 2、CaHP〇4和Ca (H2PO4) 2)、和BaCO3。
[0054]要被结合在所形成的多孔性模板中的化合物在第一或第二溶液11、12中提供，或 者同时在其二者中提供。作为选择，可以在第一溶液或第二溶液或同时在其二者中提供化 合物的混合物。还有可能在第一溶液中提供一种化合物，而在第二溶液中提供另一种化合 物，使得在沉淀过程中两种化合物都被结合。在单独的溶液中提供化合物有助于在结合之 前抑制不希望的两种化合物之间的相互作用。
[0055] 随后将第一和第二溶液11、12混合（13)。这导致由于所述阳离子和阴离子所形成 的溶解性差或者甚至是不溶性盐的沉淀而形成模板21(图9)。所述沉淀在一种或者多种化 合物25(图9)的存在下进行，因此，所述化合物同时地并且越来越多地结合到正在生长的模 板21中。所示一种或者多种化合物25的存在可以影响模板21的结晶化及其结构。模板的天 然的多孔结构促进所述一种或多种化合物的结合。因为模板的孔可以在生长过程中完全地 被所述一种或多种化合物25填充，可以得到高的化合物:模板比例，该比例典型地显著地高 于在随后结合化合物25到完全形成的多孔性模板21时可以得到的比例。图9举例说明了模 板21的生长。
[0056] 多孔性模板21典型地通过结晶化形成。为了引发和/或控制结晶化，可以将晶种加 入到混合物中或者加入到第一和第二溶液的任一种中或其二者中。所述晶种可以是例如包 括多孔性模板的材料的非常小的粒子。也可以将预先制备的或以其它方式制备的多孔性模 板用作晶种。这允许逐步形成微粒子，以便顺序地或逐步地结合单独的化合物。
[0057] 本文中所述的"沉淀方法"的优点在于模板的高填充量，由此可以实现微粒子的高 填充量。假定化合物或化合物的混合物填充正在生长的模板的小孔。因此，模板被"从内到 外"填充，这样允许模板的大体上完全加载。
[0058] 与其不同的是将化合物结合在所提供的预先形成的多孔性模板中的其它方法。其 中，将化合物与预先形成的模板混合，以便在形成模板之后进行吸附。因此，模板是"从外到 内"填充的。因为吸附在模板的外侧以及小孔的入口处开始，小孔可被阻塞并抑制了模板被 化合物进一步加载，使得内部的小孔没有被填充。因此，与这种方法相比，"沉淀方法"提供 与化合物类型无关的高填充比例。
[0059] 在一些实施方案中，如图10中所举例说明的，通过在第一化合物35或第一化合物 混合物的存在下使包括阴离子的第一溶液和包括阳离子的第二溶液混合形成的第一混合 物进行沉淀形成多孔性模板31。多孔性模板31可以例如在没有添加任何晶种的情况下通过 自发结晶化而形成。如此形成的结合了第一化合物35或第一化合物混合物的多孔性模板31 被称为前模板。在随后的步骤中，前模板31可用作晶种，由此使其进入第二混合物中或与第 二混合物混合，所述第二混合物是通过将包括阴离子的第三溶液与包括阳离子的第四溶液 混合形成的。所述第二混合物还包括第二化合物36或第二化合物混合物，所述第二化合物 36或第二化合物混合物在第三和第四溶液的至少一种中提供。所述第三和第四溶液可以包 括与第一和第二溶液相同的阴离子和阳离子。前模板31引起或引发由第二混合物的阴离子 和阳离子所形成的盐在前模板31的表面上结晶化，导致在前模板31上形成壳32。第二化合 物36或第二化合物混合物结合在在前模板31上生长的壳32中。这样所形成的模板37包括核 心31和壳32，各自填充有特定的化合物或化合物混合物。
[0060] 自发结晶化还可以在包括第三和第四溶液的混合物中发生，但是会产生仅包括第 二化合物或第二化合物混合物的较小的多孔性模板。可以通过诸如过滤、分选或离心的适 合的分离步骤容易地将这些模板从包括前模板的更大模板分离。
[0061] 本质上，可以将任何多孔性粒子或固体粒子用作前模板来引发壳的形成，所述壳 包括化合物或化合物混合物。这种多孔性粒子或固体粒子起到用于壳的结晶化的晶种的作 用。
[0062] 如果希望形成多个壳层，可以重复进行壳的形成，每个壳层可以包括特定的化合 物或化合物混合物。这允许进行微粒子的定制生产。例如，外壳的一种或多种化合物用于保 护内壳(或多个内壳)和核心的一种或多种化合物。这种方法还允许用形成壳的一种或多种 化合物包封材料。
[0063]包括核心和壳的微粒子的小孔可以具有约2nm-约50nm的平均大小(直径）。
[0064] 在一些实施方案中，使包括在模板中的一种或多种化合物交联（图14中的步骤 14)。所述交联可以在每个沉淀步骤之后或在模板形成结束时进行。例如，不同的化合物可 能需要不同的试剂来进行交联，这样提供了使化合物选择性交联的可能性。另外，可以使核 心和/或一个或多个壳的一种或多种化合物分别地或同时地交联。对于一种或多种化合物 的交联来说，使用典型地具有至少两个官能团的试剂。这种试剂例如是双官能试剂。所述一 种或多种交联剂可以选自但不限于表1。还可以使用其它交联剂，取决于要被交联的一种或 多种化合物。例如，也可以选择用于固定组织的固定溶液(fixation solution) 〇
[0065] 表1
[0067] 在一些实施方案中，可以在结合和沉淀之前使所述一种或多种化合物活化或为交 联进行准备。例如，将经过活化的化合物添加到用于沉淀的任何盐溶液中或添加到预先形 成多孔性模板的溶液中。预先活化可以包括例如打破后来用于交联的特定的分子桥接。在 某些实施方案中，蛋白质的二硫化物桥接可以通过例如二硫苏糖醇(DTT)来打破。随后由氧 气或空气引起交联。另一个选择是为一种或多种化合物键合合适的基团或分子，以使它们 准备用于交联。一个实例是生物素，其可以键合于多种化合物。然后通过抗生物素蛋白引起 交联。
[0068] 要进行交联的一种或多种化合物需要具有至少一个官能团，所述官能团可以通过 交联剂介导或者借助交联剂与相同或其它类型的其它官能团形成键。官能团的实例为羧 基、碳酰基、氨基、羟基、和疏基(sulfhydrilic)基团。
[0069] 通过将一种或多种化合物交联，在多孔性模板中形成聚合物网状结构。取决于化 合物和所使用的一种或多种交联剂，可以使所有的化合物互相交联，或者可以只进行选择 性交联。另外，可以使形成核心31的化合物35和形成壳32的化合物36选择性地或共同地交 联。
[0070] 所述化合物可以选自聚合物、生物分子、蛋白质、酶、纳米粒子、药学活性化合物、 营养增补剂、及其混合物。特定的实例包括能够结合分子氧的分子，诸如haemeproteins、血 红蛋白、肌红蛋白、白蛋白、及其混合物。其它实例包括适合于结合毒素的分子或适合于在 体内引发抗体形成的分子。毒素的特定实例是石房蛤毒素。
[0071] 典型地，具有被包封的一种或多种化合物的多孔性模板可以在交联之前经过洗 涤，以除去没有被结合在模板中的游离化合物。这样，基本上不形成未被交联的化合物，这 有利于另外的可选步骤，诸如模板的纯化和浓缩。另外，在每个沉淀/结合步骤之后，典型地 通过适合的分离步骤将得到的模板或前模板与混合物分离，所述分离步骤包括洗涤、过滤 和离心。
[0072] 在一些实施方案中，在交联之后将多孔性模板21、37溶解（图8中的步骤15)，以形 成包括至少一种交联化合物的微粒子24、38(图9和10)。本说明书中使用的术语"微粒子"意 在描述包括具有多孔结构或海绵状结构的聚合物网状结构的粒子。微粒子24、28典型地是 球形的，但是可以是任何其它形状，如立方体、椭圆形的或杆状的。微粒子可以具有至少 20nm、特别是至少100nm、更特别地至少500nm的大小(直径或最大长度）。另外，所述微粒子 可以具有小于50μπι、特别是小于20μπι、更特别是小于5μπι的大小。在一些实施方案中，微粒子 具有约3μηι~约5μηι的平均大小。
[0073]所形成的模板21、37的大小以及由此微粒子24、38的大小可以通过但不限于任何 以下参数的变化来调节:温度、盐溶液的浓度、在结晶化过程期间的搅拌速率和持续时间、 或这些参数的组合。
[0074]溶解应该在不影响或基本上不影响化合物的功能和/或活性的环境中进行。在 CaCO3的情况中，可以在对于大多数生物分子来说为温和的条件下通过螯合剂诸如EDTA容 易地溶解模板。
[0075] 要结合的化合物典型地具有至少20kDa的分子量，特别是至少30kDa。已经观察到， 最小分子量至少为20kDa的化合物在多孔性模板溶解之后形成稳定的微粒子。在多孔性模 板溶解之后为了持久或永久地结合较小的化合物（即分子量小于20kDa的化合物），可以使 用至少一种分子量大于20kDa的大化合物和所述小化合物的混合物。所述一种或多种大化 合物会形成聚合物网状结构的"骨架"，小化合物连接于所述骨架。
[0076] 在一些实施方案中，至少第一化合物被结合到预先制备的多孔性模板中。为此目 的，将多孔性模板提供在悬浮液中，将其与包括至少第一化合物的溶液混合。通过使第一化 合物在模板中吸附给定的时间，所述多孔性模板至少部分地被所述化合物填充。这里，在形 成模板之后吸附第一化合物。
[0077] 可以通过在溶液中一起提供两种或更多种化合物来结合两种或更多种化合物。如 果吸附是由静电相互作用介导的，则化合物应该具有相同的电荷，以避免静电障碍。这种方 法是其中在单个步骤中结合所有化合物的单步骤方法。没有任何另外的结合步骤，所结合 的一种或多种化合物如上所述至少部分地交联。经过填充的多孔性模板随后可用作晶种， 用于如上所述在经过填充的多孔性模板上形成壳。作为选择，可以如上所述将经过填充的 多孔性模板溶解，得到由如上所述的聚合物网状结构组成的微粒子。
[0078]用于单步骤方法的多孔性模板可以选自但不限于SiO2、碳酸盐（诸如Ca⑶3和 MnCO3)、磷酸盐(诸如Ca3 (P〇4) 2、CaHP〇4、Ca (H2P〇4)2)、及其混合物。
[0079]无论它们如何形成，微粒子可以进行标记、官能化和/或冷冻干燥。标记和官能化 可以在结合过程中、在模板溶解之前或之后进行。在一些实施方案中，微粒子在模板溶解之 后进行标记和/或官能化，以便容易接近所有的经过交联的化合物。微粒子可以在有或者没 有模板的情况下冷冻干燥。
[0080] 无论它们如何形成，所形成的微粒子或模板可用于不同的目的。一个实例是药物-载体。药学活性的药物可以是交联的化合物或在模板溶解之后被吸附在聚合物网状结构上 或者与之共价结合的化合物。如果药物是交联的，其通过键的体内裂解来释放，所述体内裂 解可以是例如酶促介导的。另一方面，如果药物被吸附于聚合物网状结构，其通过解吸来释 放，所述解吸可以是例如通过物理化学环境的变化诱导的。
[0081] 在本说明书中，术语"药学活性的药物"意在描述改变、抑制、活化或者以其它方式 影响生物学事件的化学实体。例如，药物包括但不限于抗癌物质、抗炎药、免疫抑制剂、抗凝 血剂、抗血栓剂、酶抑制剂、止痛剂、抗增殖剂、抗真菌物质、抑制细胞生长的物质、生长因 子、激素、留体、非留体物质、和抗组胺剂。
[0082] 在一些实施方案中，微粒子包括包封微粒子的涂层。所述涂层可以在模板溶解之 前或之后形成。典型地，涂层在溶解之前形成，使得存在有大体上稠密的表面用来在表面上 形成涂层。所述涂层可以通过不同的方法形成，诸如沉积聚合物、脂质和/或聚电解质。
[0083] 特定的实施例涉及包括可以体内释放的胰岛素的微粒子。这种微粒子可以包括胰 岛素，胰岛素在沉淀期间被结合到多孔性模板中或通过吸附进入到预先制备的多孔性模板 中。然后，使用包含右旋糖酐的溶液进行第二沉淀，导致在包含胰岛素的微粒子上及其周围 生成壳。随后使壳中的右旋糖酐交联并使多孔性模板溶解。截留的胰岛素的释放取决于右 旋糖酐壳的结构。
[0084] 另一个特定的实施例涉及用作血液代用品的微粒子。这种微粒子可以包括交联的 血红蛋白，其在沉淀期间被结合到多孔性模板中或通过吸附进入到预先制备的多孔性模板 中。交联的血红蛋白形成多孔性聚合物网状结构，典型地具有开孔结构并允许溶剂和氧气 扩散。这种经过交联的血红蛋白微粒子允许氧气的吸附和解吸，使得它们适合于作为血液 代用品。通过交联，微粒子基本上不含四聚物血红蛋白。可以使用人或牛或任何其它物种的 血红蛋白。
[0085] 血红蛋白微粒子的大小典型地为约Ιμπι-约5μηι的范围内，并且典型地在约2μηι-约4 μπι的范围内。由交联的血红蛋白形成的聚合物网络可以具有至少560kDa的分子量。所述血 液代用品典型地另外包括其中分散有微粒子的生理溶液。作为选择，包括交联的血红蛋白 的微粒子可以作为粉末提供，诸如冷冻干燥的粒子，用于分散在生理溶液中。
[0086]根据一个实施方案，提供了包括交联的血红蛋白微粒子的干燥粉末和生理溶液的 试剂盒。
[0087]除了血红蛋白之外，所述微粒子可以包括辅因子，诸如2,3_DPG，例如在使用人血 红蛋白的情况中。另外，血红蛋白微粒子还可以包括酶，诸如红细胞酶。实例是碳酸酐酶和 过氧化氢酶。
[0088] 为了生产血红蛋白微粒子，在沉淀和模板生长期间结合血红蛋白。血红蛋白还可 以吸附到提供的多孔性模板中。可选的辅因子和/或酶可以在模板的沉淀期间被结合到模 板中或者与血红蛋白一起被吸附。不言而喻，还可以将其它化合物结合到血红蛋白微粒子 中。血红蛋白和可选的另外的化合物(辅因子、酶和蛋白质）要进行交联。
[0089] 血红蛋白微粒子可以包括核心和至少一个壳。核心典型地包括交联的血红蛋白以 及可选的辅因子，而壳包括诸如白蛋白这样的蛋白质。所述可选的酶可以处于核心中和/或 处于壳中。
[0090] 另外，血红蛋白微粒子可以包括包封微粒子的涂层。所述涂层典型地在溶解所述 多孔性模板之前形成。适合的涂层材料是白蛋白或其它蛋白质、右旋糖酐、不同分子量的聚 氧乙烯和聚乙二醇、以及不同组成的脂质。
[0091] 为了生产交联的血红蛋白微粒子，可以使用本说明书中描述的任何方法。本领域 技术人员应该理解，可能需要一些调整，然而，所述调整可以从本说明书显而易见。为了完 成血液代用品，可以将交联的血红蛋白微粒子分散在生理溶液中，所述生理溶液可以包括 另外的添加剂。
[0092] 本质上，所述微粒子可以用作多种物质的载体，所述物质可以吸附或者以其它方 式结合于开孔或开放的多孔性聚合物网状结构。取决于所用的交联的化合物，可以在模板 溶解之后将亲水性或疏水性物质结合到微粒子中。
[0093]所述微粒子可以另外用作微量催化剂或化妆品。
[0094] 在一些实施方案中，所述微粒子包括核心和至少一个壳，其中核心和壳各自包括 不同的酶。这种微粒子可以形成酶-级联，使得物质逐步被相应的酶所酶促改变或修饰。包 括两个或更多个壳的微粒子允许将级联扩展到三个或者更多个步骤。
[0095] 下面结合附图描述具体的实施例。
[0096] 实施例1:形成白蛋白微粒子的方法
[0097] 实施例1是涉及微粒子形成的具体实施方案，所述微粒子包括在沉淀期间结合到 多孔性模板中的至少一种经过交联的化合物。
[0098]初始的溶液是CaCl2、Na2CO3和白蛋白（人、牛…）。Na 2CO3溶液在适当的罐子中提供。 将此处代表要被结合的化合物一白蛋白加入到CaCl2溶液中并在持续搅拌下将混合物加入 至IjNaAO 3溶液中。CaCl2和Na2CO3的最终浓度是相等的。该过程的产物是包含白蛋白的CaCO 3 粒子(模板)和NaCl。白蛋白/CaCO3粒子的大小可通过温度、盐溶液浓度、结晶化过程中的搅 拌速率和/或持续时间的变化来调节。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离 所形成的粒子(模板）。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的白 蛋白。
[0099] 对于交联，将充分混合的组装的粒子加入到最终浓度为2 %的戊二醛溶液中并在 室温下保温1小时。如果需要不同的交联率，保温时间可以变化。然后通过在1000 xg离心1分 钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的白蛋白/CaCO 3的粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤 三次，以便除去悬浮液介质中的过量的戊二醛。
[0100] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体溶解。这样，得到具有规定 大小的纯的经过交联的白蛋白微粒子(图IA和1B)。通过在2000xg离心10分钟并将上层清液 倾析掉来分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量 的EDTA。为了实现更好的微粒子观察并证明微粒子内部包括白蛋白，已经使用了 1%FITC标 记的白蛋白。图IA示出了在漂洗之前以低搅拌速度(在这个实施例中为约IiT1)持续1分钟制 备的经过交联的白蛋白粒子，而图IB示出了在漂洗之前以高搅拌速度(在这个实施例中为 约IOs+ 1)持续20秒制备的经过交联的白蛋白粒子。[0101 ]实施例2:形成血红蛋白微粒子的方法
[0102] 实施例2是涉及形成适合作为血液代用品的微粒子的具体实施方案。
[0103] 初始溶液为CaCl2、Na2C〇3和血红蛋白（分离自例如哺乳动物红细胞）
[0104] 对于交联，将充分混合的经组装的粒子(包含结合的血红蛋白的模板)加入到最终 浓度为2%的戊二醛溶液中并在室温下保温1小时。如果需要不同的交联率，保温时间可以 变化。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的血红蛋白/CaC〇3的 粒子。将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的戊二醛。
[0105] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体溶解。这样，得到具有规定 大小的纯的经过交联的血红蛋白微粒子（图2A和2B)。然后通过在2000xg离心10分钟并将上 层清液倾析掉来然后分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介 质中的过量的m)TA。
[0106] 经过交联的血红蛋白微粒子表现出可逆结合氧的能力，如图3中的吸收光谱所示， 其中1表示氧化的微粒子，2表示脱氧的微粒子。为了对比，示出了血红蛋白（4)和氧化血红 蛋白（3)的谱图。氧化的微粒子(p0 2 = 17kPa)显示出氧化血红蛋白的典型谱图。在暴露于 C02/N2气氛20分钟之后，达到5kPa的p0 2。并且血红蛋白微粒子悬浮液的吸收变为典型的脱 氧血红蛋白谱图（4)。
[0107] 使用分光光度计(Hitachi K2800)测量血红蛋白溶液和血红蛋白粒子的谱图。借 助血液气体分析器(Blood Gas Analyzer，ABL 700,Radiometer)测量p〇2和pC〇2值。
[0108] 图2A示出了在洗涤之前在低或极低搅拌速度(在这个实施例中为约Οϋ1)持续2 分钟制备的经过交联的血红蛋白微粒子的显微照片，而图2Β示出了在洗涤之前在中等搅拌 速度(在这个实施例中为约δίΓ1)持续30秒制备的经过交联的血红蛋白粒子的显微照片。
[0109] 实施例3:制备复合的血红蛋白/白蛋白微粒子的方法
[0110] 实施例3是涉及形成包括核心和壳的微粒子的具体实施方案，所述核心和壳各自 由不同的化合物构成。 初始溶液是CaCl2、Na2C03、血红蛋白（分离自哺乳动物红细胞)和白蛋白。CaCl 2溶 液在适当的罐子中提供。将血红蛋白加入到Na2CO3溶液中并在搅拌下将混合物加入到CaCl 2 溶液中。CaCl2和Na2CO3的最终浓度是相等的。该过程的产物是包含血红蛋白的CaCO 3粒子和 NaCl。血红蛋白/CaCO3粒子的大小可通过温度、盐溶液浓度、结晶化过程中的搅拌速率和持 续时间的变化来调节。然后通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离所形成的 粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的血红蛋白。
[0112] 然后再次将粒子再悬浮在包含白蛋白的CaCl2溶液中，并在搅拌下加入Na2CO3溶 液。所引发的新的CaCO 3沉淀部分地出现已有粒子的表面上，生成包含白蛋白的壳。基于显 著地较小的直径，通过逐步的密度离心或过滤分离仅包含白蛋白的粒子。
[0113] 对于交联，将充分混合的组装的粒子加入到最终浓度为2%的戊二醛溶液中并在 室温下保温1小时。如果需要不同的交联率，保温时间可以变化。然后通过在1000 xg离心1分 钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的血红蛋白/白蛋白/CaCO3粒子。将团粒用蒸馏水 洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的戊二醛。
[0114] 还可以在每个沉淀步骤之后进行交联反应。
[0115] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体溶解。这样，得到交联的血 红蛋白的微粒子，具有交联的白蛋白的壳。然后通过在2000xg离心10分钟并将上层清液倾 析掉来然后分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过 量的m)TA。
[0116] 图4示出了通过两步骤沉淀制备的所形成的这种经过交联的血红蛋白/白蛋白微 粒子的显微照片。在第二个沉淀步骤过程中，加入了 1%FITC标记的白蛋白（绿色），以便更 好地观察。从图4显而易见，微粒子包括发荧光的外壳，其归因于白蛋白壳。
[0117] 实施例4:制备复合的胰蛋白酶/白蛋白微粒子的方法
[0118] 实施例4是涉及包括两种不同化合物的核心和壳的微粒子的形成的具体实施方 案。
[0119] 初始溶液是CaCl2、Na2CO3、胰蛋白酶和白蛋白。Na2CO 3溶液在适当的罐子中提供。将 胰蛋白酶加入到CaCl2溶液中并在搅拌下将混合物加入到Na 2CO3溶液中。CaCl2和Na2CO3的最 终浓度是相等的。该过程的产物是包含胰蛋白酶的CaCO 3粒子和NaCl。胰蛋白酶/CaCO3粒子 的大小可通过温度、盐溶液浓度、结晶化过程中的搅拌速率和持续时间的变化来调节。然后 通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离所形成的粒子。然后将团粒用蒸馏水 洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的胰蛋白酶。
[0120] 然后再次将粒子再悬浮在包含白蛋白的CaCl2溶液中，并在搅拌下加入Na2CO3溶 液。所引发的新的CaCO 3沉淀部分地出现在已有粒子的表面上，生成包含白蛋白的壳。基于 显著地较小的直径，通过逐步的密度离心或过滤分离仅包含白蛋白的粒子。[0121 ]对于交联，将充分混合的组装的粒子加入到最终浓度为2 %的戊二醛溶液中并在 室温下保温1小时。如果需要不同的交联率，保温时间可以变化。然后通过在1000 xg离心1分 钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的胰蛋白酶/白蛋白/CaCO 3粒子。将团粒用蒸馏水 洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的戊二醛。
[0122] 还可以在每个沉淀步骤之后进行交联反应。
[0123] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体溶解。这样，得到交联的胰 蛋白酶的微粒子，具有交联的白蛋白的壳。然后通过在2000xg离心10分钟并将上层清液倾 析掉来然后分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过 量的m)TA。
[0124] 图5示出了通过两步骤沉淀制备的交联的胰蛋白酶/白蛋白微粒子的显微照片。在 第二个沉淀步骤过程中，加入了 1%FITC标记的白蛋白（绿色），以便更好地观察。从图5可 见，形成了包括不发焚光的核心和发焚光的壳的较大微粒子和仅包含发焚光的核心的较小 的微粒子。较小的微粒子是由白蛋白溶液中的CaCO 3的自发结晶化形成的，因此不像较大的 微粒子那样包括胰蛋白酶核心。可以通过任何适合的分离技术将核心/壳微粒子与较小的 微粒子分尚。
[0125] 实施例5:形成右旋糖酐粒子的方法
[0126] 实施例5是涉及形成包括至少一种经过交联的化合物的微粒子的另一个具体实施 方案。
[0127] 初始溶液是CaCl2、Na2C03和右旋糖酐(MW 4_2500kDa) Ja2CO3溶液在适当的罐子中 提供。将右旋糖酐加入到CaCl2溶液中（右旋糖酐浓度为2.5-10%)并在持续搅拌下将混合 物加入到Na 2CO3溶液中。CaCl2和Na2CO3的最终浓度是相等的。该过程的产物是包含右旋糖酐 的CaCO 3粒子和NaCl。右旋糖酐/CaCO3粒子的大小可通过温度、盐和右旋糖酐溶液的浓度、结 晶化过程中的搅拌速率和持续时间的变化来调节。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液 倾析掉来分离所形成的粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过 量的右旋糖酐。
[0128] 对于交联，将充分混合的组装的粒子再悬浮在0.1 M NaOH中并加入二乙烯基砜 (DVS)中以达到0.1 %-0.3% (v/v)的最终浓度并将样品在搅拌下在室温下保温2小时。
[0129] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体在室温下在20分钟内溶解。 这样，得到具有不同尺寸分布的纯的交联的右旋糖酐微粒子（图6A到6E)。通过在2000xg离 心10分钟并将上层清液倾析掉来分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除 去悬浮液介质中的过量的EDTA。对于2-10μπι大小的粒子的最佳DVS浓度是0.1 % (v/v)。 [0130]图6A;^;出了用分子量约64-约76kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋糖酐 微粒子的显微照片。图6B示出了用分子量约564kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的右旋 糖酐微粒子的显微照片。图6C示出了用分子量约64-67kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联 的右旋糖酐微粒子的显微照片。图6D示出了用分子量约464kDa的右旋糖酐制备交联的右旋 糖酐微粒子的显微照片。图6E示出了用分子量约464kDa的FITC标记的右旋糖酐制备交联的 右旋糖酐微粒子的显微照片。
[0131] 实施例6:形成白蛋白微粒子的方法
[0132] 实施例6是涉及通过将化合物结合到预先制备的多孔性模板中来形成包括至少一 种经过交联的化合物的微粒子的具体实施方案。
[0133] 初始的溶液是CaCl2、Na2CO3和白蛋白（人、牛…）。Na 2CO3溶液在适当的罐子中提供 并在持续搅拌下将加入CaCl2溶液。CaCl 2和Na2CO3的最终浓度是相等的。该过程的产物是多 孔性Ca⑶ 3粒子和NaCl。CaCO3粒子的大小可通过温度、盐溶液浓度、结晶化过程中的搅拌速 率和持续时间的变化来调节。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离所形成 的粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次。
[0134] 然后将经过洗涤的粒子再悬浮在白蛋白的水溶液并将悬浮液在搅拌下保温1小 时，以允许蛋白质吸附到粒子的小孔中。
[0135] 对于交联，将充分混合的组装的粒子加入到最终浓度为2%的戊二醛溶液中并在 室温下保温1小时。如果需要不同的交联率，保温时间可以变化。然后通过在1000 xg离心1分 钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的白蛋白/CaCO 3的粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤 三次，以便除去悬浮液介质中的过量的戊二醛。
[0136] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体溶解。这样，得到具有规定 大小的纯的交联的白蛋白微粒子。通过在2000xg离心10分钟并将上层清液倾析掉来分离所 述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的m)TA。
[0137] 实施例7:将肽和蛋白质连接在经过交联的聚合物微粒子表面上的方法
[0138] 实施例7描述了涉及微粒子表面的改性、官能化和/或涂覆的具体实施方案。
[0139] 已经使用抗生物素蛋白/生物素偶联而将蛋白质和肽连接于根据实施例1-6中任 一项制备的微粒子。为此，首先通过在室温下保温1小时使微粒子偶联于生物素(在PBS中的 Img磺基-NHS-LG-生物素/IO 8粒子）。然后将微粒子用PBS洗涤三次以除去过量的生物素。 [0140]然后将与生物素偶联的微粒子再悬浮在包含抗生物素蛋白的PBS中（50yg/10 8粒 子)并在搅拌下保温1小时（室温），最后在PBS中洗涤3次。随后将与生物素偶联的肽、蛋白 质、DNA等带有NH 3的分子连接到粒子表面上。使用FITC标记的抗生物素蛋白或生物素借助 于流式细胞计数测量法（图7)来量化分子的偶联(NK:阴性对照；I-MP:带有胰岛素的微粒 子)。
[0141] 实施例8:将聚乙二醇连接在经过交联的聚合物微粒子表面上的方法
[0142] 实施例8描述了涉及微粒子表面的改性、官能化和/或涂覆的另一个具体实施方 案。
[0143] 通过共价连接PEG(Mff 2-20 000)将根据实施例1-6中任一项制备的微粒子的表面 改性。为此，将微粒子再悬浮在含20mg/ml活化的甲氧基聚乙二醇(mPEG)的0.1M硼酸盐缓冲 液(pH 9)中并在搅拌下在室温下保温1小时。该过程以三个蒸馏水洗涤步骤结束。
[0144] PEG在微粒子上的结合通过ζ-电位测量来证实（Nanosizer 3000，Malvern，U.K.)， PEG改性的粒子具有显著的较低的ζ-电位。例如，在纯的蒸馏水(导电率0.(U-0.03mS/ Cm)中 测量的未改性Hb-粒子的ζ-电位值为-28±5mV JEG-改性的Hb-粒子在相似条件下测量时显 示出仅为9±3mV的电位。
[0145] 尽管已经在附图和前述说明书中举例说明和详细描述了优选实施方案，但是认为 只是说明性的而非限制性的，应该理解，仅示出和描述了优选实施方案，并且期望保护现在 和将来在本发明主旨范围内的所有变化和修饰。
[0146] 实施例9:通过氧交联形成聚合物/蛋白质微粒子的方法
[0147] 实施例9是涉及微粒子形成的具体实施方案，所述微粒子包括在沉淀期间结合到 多孔性模板中的至少一种经过交联的化合物。所述经过交联的化合物可以是蛋白质和/或 聚合物。在这个实施例中，在单个步骤中形成蛋白质/聚合物-粒子，其中随后进行交联。与 实施例1不同的是，在沉淀之前将化合物活化，并通过氧来交联。
[0148] 初始溶液是CaCl2、Na2C03和蛋白质、聚合物或单体溶液或蛋白质、聚合物和单体的 任何混合物。使此处代表要被结合的化合物的蛋白质、聚合物或单体活化。在蛋白质的情况 中，使用二硫苏糖醇(DTT)进行活化。DTT破坏二硫键。将经过活化的化合物加入到Na 2CO3和 CaCl2溶液中任一种中。然后，将这个混合物与Na 2CO3和CaCl2溶液的另一种混合。例如，可以 将Na2CO 3溶液与添加的经过活化的化合物提供在适当的罐子中，然后在持续搅拌下向其中 添加CaCl2溶液。CaCl 2和Na2CO3的最终浓度大体是基本相等的。在混合过程中，发生沉淀并 同时结合经过活化的化合物。该过程的产物是包含化合物(例如，白蛋白）的CaCO 3粒子(模 板)和NaCl。化合物/CaCO3粒子的大小可通过温度、盐溶液浓度、结晶化/沉淀过程中的搅拌 速率和/或持续时间的任一种的变化来调节。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉 来分离所形成的粒子(模板）。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过 量的化合物。
[0149] 作为选择或者随后，还可以在中等的混合情况下将团粒再悬浮在水中或再悬浮在 HCl溶液中。同时，可以将空气或氧气引入溶液，以便使经过活化的化合物交联。这个步骤的 持续时间和通过溶液的空气/氧气进给量决定交联度。
[0150]最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体在室温下在20分钟内溶解。 这样，得到经过交联的化合物的微粒子。通过在2000xg离心10分钟并将上层清液倾析掉来 分离所述粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的m)TA。在白 蛋白的情况中，形成经过交联的白蛋白微粒子。[0151 ]实施例10:通过氧交联形成白蛋白/血红蛋白微粒子的方法
[0152] 实施例10是涉及形成包括白蛋白和血红蛋白的微粒子的具体实施方案，其中在沉 淀之前是将所述白蛋白活化。所述活化和微粒子的形成可以如实施例9中所述进行。
[0153] 初始溶液是CaCl2、Na2CO3、白蛋白溶液、和血红蛋白溶液。如上所述使用二硫苏糖 醇(DTT)活化白蛋白。将经过活化的白蛋白加入到Na 2CO3和CaCl2溶液中任一种中。将血红蛋 白溶液加入到Na 2CO3和CaCl2溶液的另一种中并在持续搅拌下将这两种溶液混合。CaCl 2和 Na2CO3的最终浓度通常是相等的。在混合过程中，发生沉淀并伴随越来越多的血红蛋白和经 过活化的白蛋白结合。该过程的产物是包含白蛋白/血红蛋白的CaCO 3粒子和NaCl。通过在 1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离所形成的粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三 次，以便除去悬浮液介质中的过量的化合物。
[0154] 作为选择或者随后，还可以在中等的混合情况下将团粒再悬浮在水中或再悬浮在 HCl溶液中。同时，将空气或氧气引入到溶液中用于使经过活化的白蛋白交联，其中白蛋白 还与血红蛋白交联。这个步骤的持续时间和通过溶液的空气/氧气进给量决定交联度。
[0155] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3晶体在室温下在20分钟内溶解。 这样，得到经过交联的白蛋白/血红蛋白的粒子。通过在2000xg离心10分钟并将上层清液倾 析掉来分离所述粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的 EDTA。
[0156] 实施例11:形成交联的血浆微粒子的方法
[0157] 这个实施例与实施例1的不同之处在于使用血浆代替白蛋白，其中使用凝血酶使 血浆交联。因此，这个具体的实施例涉及形成包括经过交联的血浆的微粒子。
[0158] 初始的溶液是CaCl2、Na2CO3和血浆(人、牛…）。Na 2CO3溶液在适当的罐子中提供。将 此处代表要被结合的化合物的血浆加入到CaCl2溶液中并在持续搅拌下将混合物加入到 Na 2CO3溶液中。CaCl2和Na2CO3的最终浓度基本上是相等的。通过沉淀形成包含血浆的CaCO 3 粒子。通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离所形成的粒子(模板）。然后将团 粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的白蛋白。
[0159] 对于交联，向充分混合的粒子加入浓度为约8IU/ml的凝血酶并在室温下在37 °C保 温20分钟。IIU(国际单位)对应于约0.0583mg凝血酶;8IU对应于约0.4664mg凝血酶。凝血酶 引起血浆中所包含的纤维结合素的交联。如果需要不同的交联率，可以改变保温时间和/或 温度。通过选择温度和/或保温时间，可以调节所形成的粒子的特征，例如交联的密度。然后 通过在1000 xg离心1分钟并将上层清液倾析掉来分离经过交联的血浆/CaCO 3的粒子。然后 将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介质中的过量的凝血酶。
[0160] 最后，将粒子加入到0.2M EDTA溶液中，并使CaCO3粒子溶解。这样，得到具有规定 大小的经过交联的血浆的微粒子，如实施例1的图IA和IB中所示。通过在2000xg离心10分钟 并将上层清液倾析掉分离所述微粒子。然后将团粒用蒸馏水洗涤三次，以便除去悬浮液介 质中的过量的m)TA。
[0161] 通过这种方法，形成空心的或海绵状的血浆微粒子，如果在沉淀过程中添加或者 在任何盐溶液中包含其它化合物，则所述血浆微粒子可以包括所述其它化合物。例如，可以 加入肽，所述肽被截留在血浆微粒子中。
[0162] 实施例12:形成包括生物素化的化合物的微粒子的方法
[0163] 这个实施例涉及形成包括生物素化的化合物的微粒子的方法，所述化合物选自蛋 白质、DNA、RNA、肽、抗体、抗原(anti genes)、生物聚合物及其混合物。可以通过如上在任一 实施例中所述的沉淀将这些化合物结合到多孔性粒子中，包括吸附到所提供的多孔性粒子 中。
[0164] 与其它实施例不同，使用抗生物素蛋白进行交联，所述生物素蛋白与生物素化的 化合物的生物素交联。化合物可以以其生物素化的形式提供，或者可以在前述步骤中进行 生物素化。抗生物素蛋白和生物素的浓度以及之间的比例决定交联度。例如，生物素与抗生 物素蛋白之间的比例可为约5:1。具体的实例是生物素化的白蛋白。在使用生物素化的白蛋 白时，使用约16μπιο 1的生物素和约3μLΉ01的抗生物素蛋白。本领域技术人员理解，其它化合 物可能需要其它比例。
[0165] 在多孔性模板如上所述溶解之后，得到可以包括肽、DNA、RNA或其它化合物的微粒 子。
[0166] 本发明还包括下述具体实施方案：
[0167] 1.形成微粒子的方法，包括：
[0168] -提供包括至少阴离子的第一溶液；
[0169] -提供包括至少阳离子的第二溶液；
[0170] -在至少第一化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合来形成多孔性模板，其 中通过盐的沉淀形成所述多孔性模板，所述盐包括所述阴离子和阳离子，并且其中所述第 一化合物至少部分地被结合在多孔性模板中；和
[0171] -使在多孔性模板中的第一化合物至少部分地交联。
[0172] 2.具体实施方案1的方法，另外包括：
[0173]-提供包括至少阴离子的第三溶液；
[0174] -提供包括至少阳离子的第四溶液；
[0175] -在多孔性模板和至少第二化合物的存在下将第三溶液与第四溶液混合，使得所 述多孔性模板通过包括所述阴离子和所述阳离子的盐的沉淀而生长，其中所述第二化合物 至少部分地被结合到所述多孔性模板中；
[0176] -使在多孔性模板中的第二化合物至少部分地交联。
[0177] 3.具体实施方案2的方法，其中使所述第一和所述第二化合物交联的步骤在单个 步骤中进行。
[0178] 4.前述具体实施方案中任一项的方法，另外包括：
[0179] -将所述多孔性模板溶解，以形成至少包括所述交联的第一化合物或所述交联的 第一和第二化合物的微粒子。
[0180] 5.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述第一和第三溶液的阴离子选自包 括碳酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、及其混合物的组。
[0181] 6.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述第二和第四溶液的阳离子选自包 括Ca离子、Mn离子、Mg离子、Ba离子、及其混合物的组。
[0182] 7.前述具体实施方案中任一项的方法，另外包括：
[0183] -在将所述第一和/或第二化合物交联之前洗涤所述多孔性模板。
[0184] 8.前述具体实施方案中任一项的方法，另外包括：
[0185] -将抗体和/或抗原结合到微粒子。
[0186] 9.形成微粒子的方法，包括：
[0187] -提供多孔性模板的悬浮液和包括至少第一化合物的溶液；
[0188] -将溶液与悬浮液混合，以便使所述第一化合物至少部分地结合在所述多孔性模 板中；和
[0189] -在没有在单独的步骤中进一步结合另外的化合物的情况下，使在所述多孔性模 板中的至少第一化合物至少部分地交联。
[0190] 10.具体实施方案9的方法，另外包括：
[0191] -提供包括至少阴离子的第一溶液；
[0192] -提供包括至少阳离子的第二溶液；
[0193] -在所述多孔性模板和至少第二化合物的存在下将第一溶液与第二溶液混合，使 得所述多孔性模板通过由所述阴离子和所述阳离子所形成的盐的沉淀而生长，其中所述第 二化合物至少部分地被结合到所述多孔性模板中。
[0194] 11.具体实施方案9或10的方法，另外包括：
[0195] -将多孔性模板溶解，以形成包括至少交联的第一化合物和/或至少第二化合物的 微粒子。
[0196] 12.具体实施方案9-11中任一项的方法，其中多孔性模板由选自包括SiO2、碳酸盐 (诸如，CaCO 3和MnCO3)、磷酸盐(诸如，磷酸钙、磷酸氢钙、和磷酸二氢钙）、及其混合物的组的 材料组成。
[0197] 13.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述第一和/或第二化合物选自包括 聚合物、生物分子、蛋白质、酶、纳米粒子、药学活性化合物、营养增补剂、及其混合物的组。
[0198] 14.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述第一和/或第二化合物具有至少 20kDa的分子量。
[0199] 15.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述第一和/或第二化合物是能够结 合分子氧的分子。
[0200] 16.前述具体实施方案中任一项的方法，其中第一和/或第二化合物选自包括 haemeproteins、血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白、及其混合物的组。
[0201] 17.前述具体实施方案中任一项的方法，其中通过双官能物质使所述第一和/或第 二化合物交联。
[0202] 18.前述具体实施方案中任一项的方法，包括以下的一个或多个：
[0203]-将微粒子标记；
[0204]-将微粒子官能化;和
[0205]-将微粒子冷冻干燥。
[0206] 19.前述具体实施方案中任一项的方法，其中所述多孔性模板包括平均大小为约 2nm_约50nm的小孔。
[0207] 20.前述具体实施方案中任一项的方法，另外包括：
[0208] -将药学活性化合物结合到微粒子中。
[0209] 21.前述具体实施方案中任一项的方法，另外包括：
[0210] -在模板或微粒子上形成涂层。
[0211] 22.微粒子，包括：
[0212] -至少第一化合物，所述第一化合物为至少部分交联的；和
[0213] -至少由经过交联的第一化合物形成的多孔性或海绵状聚合物网状结构。
[0214] 23.具体实施方案22的微粒子，其中微粒子具有至少20nm、特别是至少100nm、更特 别地至少500nm的大小。
[0215] 24.具体实施方案22或23的微粒子，其中微粒子的大小为小于50μπι，特别是小于20 μπι，更特别是小于5μηι。
[0216] 25.具体实施方案22-24中任一项的微粒子，另外包括至少经过交联的第二化合 物。
[0217] 26.具体实施方案22-25中任一项的微粒子，其中所述第一和/或第二化合物选自 包括聚合物、蛋白质、纳米粒子、药学活性化合物、营养增补剂、及其混合物的组。
[0218] 27.具体实施方案22-26中任一项的微粒子，其中所述第一和/或第二化合物选自 包括haemeproteins、血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白、及其混合物的组。
[0219] 28.具体实施方案22-27中任一项的微粒子，另外包括包封核心的至少一种壳，其 中所述壳和核心包括不同的经过交联的化合物。
[0220] 29.具体实施方案28的微粒子，其中壳和核心包括不同的酶。[0221 ] 30.具体实施方案22-29中任一项的微粒子，另外包括外部涂层。
[0222] 31.血液代用品，包括：
[0223] -包括多孔性或海绵状的聚合物网络结构的微粒子，所述多孔性或海绵状的聚合 物网络结构至少由经过交联的血红蛋白形成。
[0224] 32.具体实施方案31的血液代用品，其中所述微粒子的平均大小为至少Ιμπι，并且 典型地为约I Ml-约5μηι。
[0225] 33.具体实施方案31或的血液代用品，其中由经过交联的血红蛋白形成的聚合物 网络具有至少560kDa的分子量。
[0226] 34.具体实施方案31-33中任一项的血液代用品，另外包括在其中分散微粒子的生 理溶液。
[0227] 35.血液代用品，包括根据具体实施方案1-21中任一项形成的微粒子。
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