本发明涉及疫苗组合物，特别是用于抵抗犬传染性呼吸道疾病的疫苗 组合物。

犬传染性呼吸道疾病(CIRD)是在如救助中心(re-homing centre)和寄宿 场所或训练场所的稠密环境下饲养的犬类中的常见高传染性疾病。许多狗 仅是轻微的咳嗽，短时间后即痊愈，但是在某些场合就会发展成严重的支 气管炎(Appel和Binn，1987)。CIRD几乎不会致命，但是它会耽误救助中心 的狗返家，从而破坏训练场所安排，花费相当多的治疗费用。

CIRD病因认为是多因素的，包括多种病毒和细菌。认为是主要病因性 CIRD病原的传染物是犬副流感病毒(CPIV)(Binn等，1967)，2型犬腺病毒 (CAV-2)(Ditchfield等，1962)，和犬疱疹病毒(CHV)(Karpas等，1968a和 1986b)，犬呼吸道冠状病毒(CRCV)(WO 2004/011651(The Royal Veterinary College)和Erles等，2003)以及细菌支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)(Bemis等，1977a，Keil等，1998)。

这些病毒和细菌经常在爆发时被分离，并在实验性感染中表现出导致 呼吸道症状或肺病变(Appel和Percy 1970，Swango等，1970，Karpas等， 1986b)。

同时，还从有CIRD症状的狗中分离出人呼肠病毒和支原体物种(Lou 和Wenner 1963，Randolph等，1993)。其它因素如压力也是很重要的。

据报道，支气管炎博德特氏菌是呼吸道疾病“舍咳”(Kennel cough)的 原发性病原剂(Bemis等，1977b和Thompson等，1976)。这就使得狗易受其它 呼吸道制剂影响，并常与它们同时存在。可用急性支气管炎博德特氏菌攻 击而使舍咳再生。另外，环境因素如寒冷，气流和高湿度，犬舍的典型环 境，都会增加疾病的易感性(Ellis等，2001)。通常认为抗生素治疗该原发疾 病的效果不好(Ellis等，2001)。相反，接种免疫支气管炎博德特氏菌提供了 一种帮助控制疾病的相对有效手段。

支气管炎博德特氏菌感染的明显症状是粗厉的干咳，它会随着活动或 刺激而恶化。突发咳嗽，然后就恶心或作呕，试着从咽喉清出少量粘液。 当细菌二次侵入时体温上升。因为舍咳是高传染性的，所以该病很容易就 传染给易感狗，引发猛烈咳嗽。记录的最重症状是在感染后开始的第2到5 天，但可能会持续很长的一段时间。压力，特别是不利的环境条件，会导 致该病在后期又复发。

通常舍咳(kennel cough)是上呼吸道病症，特征是流鼻涕和咳嗽。鉴于 舍咳主要包括上呼吸道变化，CIRD症状说明它包括肺损伤，在某些情况下 支气管肺炎。舍咳比CIRD的综合症状轻，而且没有CIRD中所提到的大范 围症状。CIRD的显著之处还在于严重程度加重和死亡率增加。

CIRD是一种犬类综合症，它的呼吸道症状表现是从轻度到致命性疾 病。它的特征包括上和下呼吸道感染，从炎症进展到渗出，浮肿，有时还 有能在肺组织中广泛传播的出血性病理。CIRD也可在不存在支气管炎博德 特氏菌时发生，甚至在一些感染CIRD的狗中并没有可检出的支气管炎博德 特氏菌，这说明舍咳和CIRD是截然不同的传染病。

我们还可以肯定的是支气管炎博德特氏菌与呼吸道疾病相关，而且推 断其它制剂也参与了呼吸道疾病(Chalker等，2003)。

现在，我们显示马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi sub species zooepidemicus(参见实施例1)，狗支原体(Mycoplasma cynos)(参见实施例2)， 和嗜衣原体(Chlamydophila)(参见实施例3)与CIRD相关。当对我们研究的 所有狗群进行接种抵抗CPIV和CAV-2时，没有新数据支持这些病毒参与了 CIRD。同时，我们还发现狗中的犬疱疹病毒大量流行，呼吸道症状加重(参 见实施例4)。

马链球菌兽瘟亚种(S.zooepidemicus)是一种条件性致病菌，通常分离自 各种动物宿主，不只分离自马。经常发现它作为哺乳动物上呼吸道粘膜的 共生体(Timoney等，1988；Quinn等，1999)，并与多种疾病综合症相关，包括 下呼吸道疾病，驹肺炎和马子宫颈炎(Chanter，1997；Biberstein和Hirsh， 1999)，骆驼肺炎(Biberstein和Hirsh，1999)，败血病和猪关节炎(Timoney， 1987)，母牛和山羊乳腺炎(Timoney等，1988)，家禽败血病，羔羊心包炎和 肺炎(Timoney，1987)，豚鼠淋巴腺炎(Quinn等，1999)，血人管球性肾炎(Balter 等，2000)和人脑膜炎(Ural等，2003)。在狗中，马链球菌兽瘟亚种与伤口感 染和败血病(Quinn等，1999)和急性坏死性肺炎(Garnett等，1982)相关。

虽然出血性链球菌性肺炎晚期(HSP)狗与患CIRD的狗共有一些组织学 上的特性，但这并不是它早期的情形(参见Chalker等，2003)，HSP会出现脓 毒性血栓症(Garnett等，1982)。HSP迅速发作，没有临床症状而使大多数患 者致命。而我们会看到CIRD慢慢发作，有大量的临床症状，流鼻涕，咳嗽， 喷嚏，恶心，食欲不振，肺炎和支气管肺炎。

犬泌尿管感染与狗支原体(M.cynos)有关(Jang等，1984)。已从患犬瘟热 的犬肺中检出狗支原体(Rosendal，1978)，而且发现支气管内接种狗支原体可 促成狗肺炎(Rosendal & Vinther，1977)。

Rosendal(1978)所描述的犬瘟热是一种在感染犬瘟热病毒，各种支原体 物种和细菌假单胞菌属后的很复杂的疾病。这是一种有力的微生物攻击组 合，而且理所当然会导致肺炎。还不清楚由支原体属引发的病理学比例。 再次用狗支原体攻击的特点是狗无疾病症状，尽管在5只接种狗中有4只 狗有些局部的小块炎性损伤。Rosendal指出，在该综合症中狗支原体的意 义是“很难评价”。

通过比较23S rRNA基因中的218个氨基酸序列，与CIRD相关的嗜衣 原体物种与流产嗜衣原体(C.abortus)的关系非常近。此嗜衣原体物种中的此 区域核苷酸序列(SEQ ID NO：1)与流产嗜衣原体的核苷酸序列同一性超过 99％，与鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)的核苷酸序列同一性为 98.6％，与猫嗜衣原体(Chlamydophila felis)的核苷酸序列同一性为96.3％。

在患CIRD狗的气管和肺中检出嗜衣原体物种。比较而言，流产嗜衣原 体感染通常与生殖混乱有关，经常导致不必要的流产，特别是羊。以前， 并未描述过流产嗜衣原体在狗呼吸道感染中起作用。

现在几乎没有关于衣原体(Chlamydiae)物种侵染狗的出版物，这样也就 几乎不了解犬衣原体物种的生物多样性。最近，肺炎衣原体(C.pneumoniae) 与狗动脉硬化症相关(Sako等，2002)。从患脓毒性多发性关节炎的狗中检出 未鉴别的衣原体属(Lambrechts等，1999)。

先前，已从家养犬的粪便、脑、肝脏、脾、肾脏和肺组织中分离出了 鹦鹉热衣原体(C.Psittaci)(Arizmendi等，1992；Fraser等，1985和Gresham等， 1996)。研究表明德国20％的宠物犬，日本10％的宠物犬已接触过鹦鹉热衣 原体，并产生了抗体(Werth等，1987和Fukushi等，1985)。在英国，鹦鹉热 衣原体血清反应阳性犬的流行还未知(Gresham等，1996.)。感染了鹦鹉热衣 原体的犬可能会发展成亚临床慢性感染，动脉硬化，关节炎，结膜炎，甚 至呼吸道疾病(Gresham等，1996和Storz 1988)。Gresham等，(1996)从有呼 吸道疾病症状的犬中分离出了鹦鹉热衣原体，虽然其症状并不是CIRD症 状。这说明犬可能是潜在的储库，从而在人衣原体传染流行病学上具有重 要的意义(Gresham等，1996；Werth 1989)。只有一篇文献记载了从自然感染 犬中分离出细胞培养液形式的鹦鹉热衣原体的案例(Arizmendi等，1992)，还 有一篇文献记载了从实验性感染犬中分离出鹦鹉热衣原体的案例(Young等， 1972)。

目前已有一些抗CIRD相关感染因子即支气管炎博德特氏菌以及CPIV 和CAV-2的疫苗。但是，尽管使用了这些疫苗，CIRD仍在全世界犬舍中继 续流行，这可能是由于这些疫苗不能提供抵抗与CIRD相关的所有感染因子 的保护作用。

这样，本发明的第一个方面是提供了一种用于接种犬的疫苗组合物， 它包括任意一种或多种下述制剂：

a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂。

应理解，组合物可以包括上述任意制剂，例如(a)和(b)，(a)和(c)，或(b) 和(c)。组合物可包括所有这些制剂(a)，(b)和(c)。

能引发犬抵抗特定生物的免疫应答的制剂是指当对非免疫缺失或抑制 免疫的犬给药时，所述制剂能诱导该犬的免疫系统产生可与该生物特异地 结合的抗体。这样，所述制剂就能诱导抵抗所述特定生物的保护性免疫应 答。

优选，产生的特异地结合所述特定生物的抗体亲和力大于任何其它个 体分子。优选，结合所述特定生物的抗体亲和力比任何其它个体分子高至 少2，或至少5，或至少10或至少50倍。更优选，结合所述特定生物的抗 体亲和力比任何其它个体分子高至少100，或至少1,000，或至少10,000倍。

能引发犬抵抗特定生物的免疫应答的制剂还指当对非免疫缺失或抑制 免疫的犬给药时，所述制剂能诱导所述犬的免疫系统产生特异地结合高分 子诸如分泌自所述生物的蛋白的抗体。抗体会特异地结合此分泌性高分子， 如毒素或溶血素，并使其灭活，从而减缓宿主的病原变化和疾病严重性， 使宿主战胜感染。这样，能引发犬抵抗特定生物的免疫应答的制剂包括那 些能对部分生物如分泌性高分子引发免疫应答的制剂。

典型地，能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂，包含灭 活或减毒的马链球菌兽瘟亚种，或马链球菌兽瘟亚种的免疫原片段或其衍 生物，或编码所述片段或所述衍生物的核酸(其中在此情况下，所述片段或 所述衍生物包括多肽)。

马链球菌兽瘟亚种已保藏在NCTC(保藏编号4676.S34)，ATCC(保藏编 号43079)和国立乳品微生物保藏所(NCDO)(保藏编号1358)，并由Farrow等 描述(1984)。

疫苗的“灭活”成分是指用可消除其致病能力，而又仍保持其激发保 护性免疫能力的方式处理的特定疫苗成分，如细菌，支原体或病毒。“灭活” 疫苗成分包括灭活的生物。

用于将疫苗中使用的生物如细菌、支原体和病毒灭活或杀死的方法是 本领域已知的，而且已用于如制备下文所述犬疫苗的某些成分。

在此，有许多种作为制备疫苗的灭活微生物的方法。最简单的方法是 加热灭活(例如，将病毒加热至58℃，30分钟；将细菌煮5分钟，或加热至 65℃1小时)或与福尔马林混合灭活。还可以用其它化学品，或用紫外光处 理来灭活微生物。

疫苗的“减毒”成分是指，以大大减弱致病能力、而又仍保持激发保 护性免疫能力的方式筛选或处理的特定疫苗成分，如细菌，支原体或病毒。

用于将疫苗中使用的生物如细菌、支原体和病毒减毒的方法是本领域 已知的，而且已用于如制备下文所述犬疫苗的某些成分。

可通过下述办法来将微生物毒力减弱：延长在不同环境中即病毒或嗜 衣原体细胞培养物内，以及固体培养基上或者用于不同细菌的宿主内的传 代，直到观察到毒力下降。另外，你可以定点突变或删除细菌中的参与毒 力的特定基因，从而限制微生物的病原潜力，或将微生物突变成对不存在 于动物宿主中的化合物具有特殊需求，而使其不能在宿主中繁殖和存活。 还可以用化学处理和紫外光处理进行减毒，而在基因组中点突变。

马链球菌兽瘟亚种的免疫原片段可以是任何能引发犬保护性免疫应答 的马链球菌兽瘟亚种片段。这样，当将马链球菌兽瘟亚种免疫原片段施给 非免疫缺失或抑制免疫的犬时，它就能诱导所述犬的免疫系统产生可特异 地结合马链球菌兽瘟亚种的抗体。

典型地，特定微生物的免疫原片段是所述微生物的蛋白成分。微生物 的“蛋白成分”包括是指全部蛋白或部分蛋白。应该可以理解，所述蛋白 片段可以是糖基化的或者非糖基化的。因此，“蛋白”还包括糖蛋白。不考 虑其上所附糖的类型、数量、顺序和位置，糖蛋白的氨基酸序列是指糖蛋 白多肽骨架的氨基酸序列。

马链球菌兽瘟亚种蛋白包括细胞表面蛋白前体(Genbank登录号 AAA86832和BAD00711)，Cpn60(Genbank登录号AAM88472)，M-类蛋白 (Genbank登录号AAP33082，AAP33081，AAP33080，AAP33079，AAP22285， AAB92635，AAB92634，AAB92633，AAB92632，AAB92631，AAB92630， AAB92629，AAB92628，AAB92627，AAB92626，AAB92625，AAB92624， AAB92623，AAB92622，2111310A和BAD00712)，M-类蛋白前体(Genbank 登录号AAD37432)，M-类蛋白Szp2前体(Genbank登录号AAF75674)，M- 类蛋白Szp3前体(Genbank登录号AAF75675)，M-类蛋白Szp4前体(Genbank 登录号AAF75676)，与肺炎链球菌ORF5相似的蛋白(Genbank登录号 BAB 16041)，推测的金属结合/附着蛋白(Genbank登录号CAB56710)，zoocin A免疫因子(Genbank登录号AAC46073)和Walker等描述的Szp蛋白(1998， 2003；包括Genbank登录号AAQ08488-AAQ08510)。

优选，马链球菌兽瘟亚种的免疫原片段是马链球菌兽瘟亚种的结构蛋 白或其免疫原部分。更优选，马链球菌兽瘟亚种的免疫原片段是分泌性毒 素，或溶血素，或吸附因子/表面蛋白，或其免疫原部分。

可以通过本领域技术人员熟知的常规方法从细菌如马链球菌兽瘟亚种 中分离其它表面蛋白。Sambrook等(2001)“分子克隆，实验室手册”，第三版， Sambrook等(eds)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，USA，在此引入作 为参考，描述了可用于此目的的常规细菌克隆技术。

如果能引发犬免疫应答的制剂是一种微生物成分如蛋白，那么所述蛋 白就可以分离自所述微生物的培养物中。更优选，蛋白可以通过表达编码 所述蛋白的适合的DNA构建体，利用重组DNA技术。克隆、操纵、修饰 和表达核酸，以及纯化表达蛋白的适合的技术是本领域已知的，而且在如 Sambrook等(2001)中就有描述，在此引入以供参考。

另外，可利用蛋白质化学技术，如利用分离蛋白的部分蛋白水解(外部裂 解或内部裂解)，或通过从头合成来制备蛋白。可利用Lu等(1981)J.Org. Chem.46，3433和本文所述参考文献公开的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式 来进行肽合成。

生物的免疫原片段的“衍生物”是指改变了在所述生物内天然呈现的形 态，但同时保持着在犬内产生免疫应答的能力，如诱导产生特异地结合所述 生物的抗体的能力的蛋白，或蛋白的一部分。

例如，衍生物可以包括蛋白或其部分的序列变体，其能用于诱导产生特 异地结合所述生物的抗体。通常，可用氨基酸取代来提高疫苗的抗原性。优 选，序列变体与所述蛋白或其部分的天然序列具有至少90％，或至少91％， 或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％的同一性。更优选， 序列变体与所述蛋白或其部分的天然序列具有至少96％，或至少97％，或至 少98％，或至少99％，或至少99.5％的同一性。

两多肽间的百分比序列同一性可以利用适合的计算机程序，如Wisconsin 大学基因计算机小组的GAP程序来进行测定。两核苷酸或两氨基酸序列间 的百分同一性可以利用第10版GCG(遗传学计算机小组，(1991)，GCG软件 包程序指南，第7版，April 1991，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)来进行测定。使用的GCG参数可以是：DNA缺口产生罚分(Gap creation penalty)50，缺口延伸罚分(gap extension penalty)3，蛋白缺口产生罚 分8，缺口延伸罚分2。两核苷酸或两氨基酸序列间的百分同一性也可以利 用第34版FASTA(Pearson WR.(1990)“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”.Methods Enzymol.；183：63-98)来进行测 定。FASTA设置可以是缺口开放罚分(Gap open penalty)-16和缺口延伸罚分 -4。

应理解，百分同一性是对那些序列已经进行了最佳对比的多肽进行的 计算。

作为选择，可以利用Clustal W程序(Thompson等，(1994)Nucleic Acids Res 22，4673-80)来进行对比。使用的参数可以是下列：

快速逐对对比参数(fast pairwise alignment parament)：K-tuple(字串)大 小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，最高对角线数(number oftop diagonals)； 5。记分方法：x百分比。

多重对比参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。记分矩阵： BLOSUM。

通常，序列变体有少于100，或少于50，或少于40，或少于30，或少 于20个氨基酸残基异于蛋白或其部分的天然序列。更优选，序列变体有15 或14或13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2或只有1 个氨基酸残基异于蛋白或其部分的天然序列。

可以改变衍生物的序列来提高媒介物的免疫原性，或者改变衍生物序 列不会对其免疫原性有影响。例如，衍生物可以是去除了一个或多个免疫 原性所必需的氨基酸序列的。

“衍生物”还包括在人工合成肽之前或之后，其氨基酸残基中的一个 或多个进行了化学修饰的肽，条件是所述多肽，也就是体内特定抗体的产 物的功能基本保持不变。所述修饰包括与酸或碱形成盐，尤其是生理上可 接受的有机或无机酸和碱，形成末端羧基的酯或酰胺，并连着氨基酸保护 基团如N-叔丁氧基羰基。所述修饰可以使所述肽免于体内新陈代谢。所述 多肽可以是单拷贝或多拷贝，例如串联重复。充分进行所述串联或多拷贝 可以使抗原本身避免使用载体。肽的N-末端和C-末端相连形成环，或在肽 末端添加一个或多个Cys残基而增加抗原性和/或让形成二硫键是有利的。 如果所述多肽与载体，优选多肽共价连接，那么就优选让本发明的多肽形 成环。

根据现有的免疫学理论，载体功能应该存在于任何免疫原性配制剂中， 从而可以刺激免疫系统或促进对免疫系统的刺激。已知，最佳载体包括有(或 与抗原一起产生)T-细胞表位。多肽可以例如通过交联而连接到其它载体如 血清白蛋白，肌红蛋白，细菌类毒素和匙孔帽贝血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)。最近发现的诱导T-细胞辅助免疫应答的载体包括乙型肝炎核 心抗原(也称作核衣壳蛋白)，推测的T-细胞表位，β-半乳糖苷酶，以及白 细胞介素1的163-171肽。后一种化合物可以作为载体或佐剂或这两种。作 为选择，几个拷贝的相同或不同本发明多肽可以相互交联，在这种情况下， 不存在所述的不同载体，但是载体功能可以通过所述交联来获得。合适的 交联剂包括Sigma和Pierce目录所列的那些交联剂，例如戊二醛，碳化二 亚胺和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸酯，后面的交 联剂利用C-末端半胱氨酸残基上的-SH基团(如果存在)。

如果多肽是通过在合适的宿主中表达合适的核苷酸序列来制备的，那 么与作载体的多肽序列一起以融合产物方式表达多肽是有利的。Kabigen′s “Ecosec”体系是此种安排的实例。

通常，编码马链球菌兽瘟亚种的免疫原性片段的多核苷酸编码功能蛋 白，更优选马链球菌兽瘟亚种的表面蛋白或其免疫原性部分，或其衍生物。 编码各种马链球菌兽瘟亚种蛋白的多核苷酸序列可以很容易地通过参考上 述Genbank登记号来确定。而且，编码任何免疫原性马链球菌兽瘟亚种蛋 白的多核苷酸序列可以很容易地通过常规分子生物学技术来确定。

通常，能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂包括灭活或减毒的狗 支原体，或狗支原体或其衍生物的免疫原性片段，或编码所述片段或所述 衍生物的核酸。

狗支原体保藏在NCTC(保藏编号10142 H831)和ATCC(保藏编号 27544)，并如Rosendal(1972)所述。

优选，狗支原体的免疫原性片段是狗支原体或其免疫原性部分的功能 蛋白，更优选，狗支原体或其免疫原性部分或其衍生物的表面蛋白。可以 利用本领域技术人员已知的常规技术，从支原体如狗支原体分离表面蛋白。

通常，鉴定和分离支原体蛋白的方法与细菌相同，除某些基因可能需 要能识别支原体独特密码子使用的专门载体(参见Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology.Vol.1 Ed S.Razin & J.Tully.Academic Press Inc.1995中Genome Characterisation and Genetics内Section B中的所有章 节)。

最有效的支原体疫苗往往包括加热-或福尔马林灭活的全细胞或减毒活 疫苗，因此包括全部或至少大部分的蛋白。用作疫苗的潜在支原体成分包 括蛋白如主要吸附结构膜蛋白，认为约45kDA(等于获自肺炎支原体(M. pneumoniae)的P1 cytadhesin和获自生殖支原体(M.genitalium)的同系物如 MgPa，它们全都是一种三基因操纵子的一部分)，表面暴露的蛋白和其它吸 附蛋白，膜糖脂，膜多糖片段，脂多糖和那些提到的全部动物支原体疫苗 (Barile 1985和Barile等，1985)。

在一个实施方式中，能引发抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂包括灭活 或减毒的流产嗜衣原体，或流产嗜衣原体或其衍生物的免疫原性片段，或 编码所述片段或所述衍生物的核酸。

流产嗜衣原体(ATCC保藏编号VR-656)由Everett等作为绵羊嗜衣原体 流产症菌株B-577保藏。

在另一个实施方式中，能引发抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂包括灭 活或减毒的鹦鹉热嗜衣原体，或鹦鹉热嗜衣原体或其衍生物的免疫原性片 段，或编码所述片段或所述衍生物的核酸。

鹦鹉热嗜衣原体也就是通常所说的鹦鹉热衣原体，ATCC保藏编号 VR-125(Lillie(1930)第1968页，Int.J.Syst.Bacteriol.30：274(AL))。

在进一步的实施方式中，能引发抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂包括 灭活或减毒的猫嗜衣原体，或猫嗜衣原体或其衍生物的免疫原性片段，或 编码所述片段或所述衍生物的核酸。

猫嗜衣原体(ATCC保藏编号VR-120)由Everett等作为猫肺炎菌株No.1 保藏。

在另一个实施方式中，能引发抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂包括灭 活或减毒的鼠衣原体(Chlamydia muridarum)(ATCC VR 123，MoPn；Everett 等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.49：431)；猫心衣原体(Chlamydia pecorum) (ATCC VR 628，Bo/E58；Fukushi和Hirai 1992，Int.J.Syst.Bacteriol.42：307)； 肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(模式菌株：TW-183；Grayston等，1989， Int.J.Syst.Bacteriol.39：88)；猪衣原体(Chlamydia suis)(ATCC VR 1474，S45； Everett等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.49：431)；或砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(模式种)(ATCC VR 571；Busacca 1935 Rake 1957 amend.Everett 等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.30：274(AL)，或其免疫原性片段，或其衍生物， 或编码所述片段或所述衍生物的核酸。

流产衣原体，鹦鹉热衣原体或猫衣原体，或鼠衣原体，猫心衣原体， 肺炎衣原体，猪衣原体或砂眼衣原体的免疫原性片段可以是任何能引发犬 保护性免疫应答的片段。典型地，免疫原性片段是蛋白或其部分。优选， 免疫原性片段是结构蛋白或其免疫原性部分。更优选，免疫原性片段是表 面蛋白，或其免疫原性部分或其衍生物。如上所述，可以通过本领域技术 人员所已知的常规方法从细菌如嗜衣原体分离表面蛋白。

流产衣原体蛋白包括60kD热休克蛋白GroEL(Genbank登录号 AAD26144)，60kDa富含胱氨酸的膜复合蛋白(Genbank登录号 AAG60550)，90-kDa蛋白(Genbank登录号AAC44400，AAC44401)，富含胱 氨酸外膜蛋白Omp-2(Genbank登录号AAD09597)，DnaK(Genbank登录号 AAN77259)，延伸因子P(Genbank登录号AAK72389)，GrpE(Genbank登录 号AAN77258)，HrcA(Genbank登录号AAN77257)，主要外膜蛋白(Genbank Accession Nos.AAK00237，CAA36152，CAD29327)，主要外膜蛋白前体 (GenbankAccession Nos.AAD29103，AAD29102，AAG53881，P16567)，MutS (Genbank登录号AAD25864)，Omp1(Genbank Accession Nos.CAA06182， CAA06620，CAA06621，CAA06622，CAA06624，CAA06625，CAA06183， CAA06184)，外膜蛋白(Genbank登录号AAB02850)，外膜蛋白2(Genbank 登录号AAD20336)，POMP90A前体(Genbank登录号AAC15922)，POMP90B 前体(Genbank登录号AAC15924)，POMP91A(Genbank登录号AAC15921)， POMP91B前体(Genbank登录号AAC15923)，推测的98 kDa外膜蛋白 (Genbank登录号AAB18188)，推测的外膜蛋白(Genbank登录号AAB18187)， 小型富含半胱氨酸的外膜脂蛋白(Genbank登录号AAG60549)，富含硫的蛋 白(Genbank登录号AAG60551)，和OmpA(Genbank Accession Nos. AAT36355和AAT36356)。

鹦鹉热衣原体蛋白包括60K富含半胱氨酸的外膜蛋白前体(Genbank Accession Nos.P23701，B39439，JC5204和P27606)；60K富含半胱氨酸的蛋 白(Genbank Accession Nos.CAA37592和CAA37591)；chaperonin同系物 (Genbank登录号AAB22560)；早期上游开放阅读框(EUO)(Genbank Accession Nos.AAA23124，Q06566和C36909)；EUO蛋白同系物(Genbank 登录号JC5207)；母羊流产蛋白(Genbank登录号1601347A)；属特异性蛋白 (Genbank登录号AAB22559)；高分子量富含半胱氨酸的包膜蛋白(Genbank 登录号AAB61619)；组蛋白H1-类蛋白(Genbank Accession Nos.AAA23132， JH0658，Q46204)；hypA蛋白(Genbank登录号JL0116)；hypB蛋白(Genbank 登录号JL0117)；假设蛋白(Genbank Accession Nos.JC5206，NP_052329， NP_052332，NP_052331，NP_052330，NP_052328，NP_052327，NP_052326， NP_052325，NP_052323，CAA44340，CAA44339，CAA44334，CAA44341， CAA44338，CAA44337，CAA44336，CAA44335，CAA44332，A39999， NP_052324，CAA44333，S61492，S18143，C39999，D39999，E39999，F39999， S18148，G39999，H39999和I39999)；包涵体膜蛋白(Genbank Accession Nos. 2108371A，S61491)，低分子量富含半胱氨酸的包膜蛋白(Genbank登录号 AAB61618)；富含赖氨酸的假设蛋白LRO(Genbank登录号B36909)；主要 外膜蛋白和前体(Genbank Accession Nos.CAA3 1177，2006276A1616229A， AAA23148，AAA23147，AAA17396，I40864，I40740，AAA23146，CAA40300， AAK00262，AAK00250，AAK00249，AAK00248，AAK00247，AAK00246， AAK00245，AAK00244，AAK00243，AAK00242，AAK00241，AAK00240， CAC84081，A60341，A40371，B60109，A60109，MMCWPM，MMCWP3， Q00087，P10332和AAQ91209)；主要sigma因子(Genbank登录号 AAA50747)；MutS(Genbank Accession Nos.AAD25866和AAD25863)；未 知功能蛋白的N-末端部分(Genbank登录号CAA90624)；ORF2(Genbank登 录号2108371B)；外膜蛋白1(Genbank Accession Nos.CAA76286和 CAB96859)；外膜蛋白3前体(Genbank登录号JC5203)；未知功能蛋白 (Genbank登录号CAA90623)；假设的多晶型膜蛋白(Genbank Accession Nos. AAL36963，AAL36962，AAL36961，AAL36960，AAL36959，AAL36958， AAL36957，AAL36956和AAL36955)；小型富含半胱氨酸的包膜蛋白envA 前体(Genbank登录号A39439)；富含硫的蛋白(Genbank Accession Nos. P28164，AAB61620和JC5205)；未知蛋白(Genbank Accession Nos.AAB22561 和AAB22558)；毒质粒parA家族蛋白pGP5-D(Genbank登录号Q46263)； 毒质粒蛋白pGP2-D(Genbank登录号Q46260)；毒质粒蛋白pGP3-D (Genbank登录号Q46261)；毒质粒蛋白pGP4-D(Genbank登录号Q46262)； 毒质粒蛋白pGP6-D(Genbank登录号Q46264)，OmpA(Genbank Accession Nos.AAT3 6351和AAT36354)和60kDa chaperonin蛋白(Genbank登录号 AAT38208)。

猫衣原体蛋白包括热休克蛋白GroEL(Genbank Accession Nos. AAL38954和AAO24106)；主要外膜蛋白(Genbank Accession Nos.AAK00238， AAK00239，AAO24108和CAA43409)；MutS(Genbank登录号AAD25865)； 和外膜蛋白2(Genbank Accession Nos.AAK38113，AAK38114，AAK38115， AAL89722，AAO24107，AAQ19779)。

在优选的实施方式中，所用的嗜衣原体蛋白是外膜蛋白如主要外膜蛋 白(MOMP)。其它合适的嗜衣原体蛋白包括LPS或OmcB蛋白。

通常，编码流产衣原体，鹦鹉热衣原体或猫衣原体免疫原性片段的多 核苷酸编码结构蛋白，更优选表面蛋白，或其免疫原性部分，或其衍生物。 编码各种蛋白的核酸序列可以参考上述Genbank登记号来很容易地确定， 而且可以很容易地利用常规分子生物学技术来测定。

在一个实施方式中，能引发抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂包括灭活 或减毒的嗜衣原体，其具有SEQ ID NO：1序列的23S rRNA基因的218个 核苷酸部分序列，或其免疫原性片段或其衍生物，或编码所述片段或衍生 物的核酸。具有SEQ ID NO：1序列的23S rRNA基因的218个核苷酸部分 序列的嗜衣原体可在患CIRD犬的气管和肺中发现，或者从中分离，通常患 CIRD的犬来自救助中心和寄宿场所或训练场所。

嗜衣原体可以分离自犬，在存在或缺少环己酰亚胺的条件下，通过将 组织提取物接种到McCoy细胞系上，在37℃，5％CO2将细胞培养到10 天，然后通过冻裂细胞提取嗜衣原体。常用该方法从鸟、猫、人和其它宿 主分离嗜衣原体。23S rRNA基因片段可通过实施例3所描述的PCR条件从 嗜衣原体扩增出来，所得序列通过与图5或8的序列比较来证实。

对于疫苗应用，可以用各种复制(如重组腺病毒疫苗)或非复制(DNA疫 苗)载体来输送多核苷酸制剂。

疫苗的典型剂量是含有约5-10μg的重组蛋白。细菌疫苗的典型剂量是 形成108个菌落单位/ml。

通常，疫苗组合物进一步包含生理上可接受的载体，稀释剂或佐剂。

某些载体和佐剂如上所述。其它合适的佐剂包括弗氏完全佐剂或不完 全佐剂，胞壁酰二肽，EP 109 942、EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”，氢 氧化铝，皂苷，DEAE-葡聚糖，中性油(如miglyol)，植物油(如花生油)，脂 质体，Pluronic多元醇或Ribi辅助系统(参见如GB-A-2 189 141)。

所述载体必须是“可接受的”的意思是与本发明的制剂相容，并且不 能对其受体有害。典型的载体是水或盐，它们是无菌且无致热原的。

通常，疫苗经口服、肌肉、皮下、静脉内、腹腔内或鼻内途径给药。

适于肠胃外给药的疫苗组合物包括水性或非水性的无菌注射液，其可 以包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、与目标受体血液达到等渗的溶质；和/ 或包含悬浮剂和增稠剂的水性或非水性的无菌悬浮液。

疫苗组合物可以装入单位剂量的或多剂量的容器内，例如，封密的安 瓿和小管，可以贮存于冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前，仅需加入无菌液 态载体，如加入水来用于注射。即用注射液和悬浮液可用无菌粉末，颗粒 和片剂来制成。

疫苗组合物可通过鼻内给药，可方便地以气溶胶喷雾剂的形式由加压容 器、泵或喷雾器使用适宜的挥发剂给药，适宜的挥发剂是例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3或 1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)，二氧化碳或其它适宜的气体。在加压 气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供的阀所释放计量的量而确定。加压容 器、泵或喷雾器可含有制剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和挥发剂作为溶 剂的混合物，它们可另外含有润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。

对于兽药用途，疫苗以正常兽药实践中可接受的制剂制备，并且兽医会 确定对于特定动物最适合的给药方案和给药途径。

适合犬给药的疫苗剂型是本领域所熟知的，包括下述犬疫苗中所用的 剂型。

如上所讨论的，许多病毒和细菌制剂都已知与犬呼吸道疾病相关，包 括犬呼吸道冠状病毒(CRCV)，犬副流感病毒(CPIV)，2型犬腺病毒(CAV-2)， 犬疱疹病毒(CHV)和支气管炎博德特氏菌。

因此，在一个实施方式中，疫苗组合物进一步含有任一种或多种：

d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，可选地，疫苗组合物还含有任两种，或任三种，或任四种，或 所有五种此其它制剂。

通常，能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂包括灭活或减毒的 CRCV，或CRCV的免疫原性片段，或编码所述免疫原性片段的核酸。

CRCV的适合免疫原性片段描述在WO 2004/011651(The Royal Veterinary College)和Erles等，2003中。CRCV的适合免疫原性片段包括刺 突蛋白(S)和血凝素-酯酶(HE)表面蛋白，膜糖蛋白(M)，和核壳蛋白(N)，或 其免疫原性部分。WO 2004/011651中所描述的CRCV-类刺突蛋白和HE蛋 白也很适合作为引发抵抗CRCV免疫应答的制剂。关系非常近的冠状病毒， 如牛冠状病毒和人冠状病毒，和其免疫原性片段也很适合作为引发抵抗 CRCV免疫应答的制剂。与用作抵抗CRCV的疫苗成分的制剂相关的 wO 2004/011651的全部内容在此引入作为参考。

通常，能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂包括灭活或减毒的CPIV， 或其免疫原性片段，或编码所述免疫原性片段的核酸。

通常，能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂包括灭活或减毒的 CAV-2，或其免疫原性片段，或编码所述免疫原性片段的核酸。

1型犬腺病毒引起传染性肝炎；2型犬腺病毒引起呼吸道疾病。已经证 实CAV-1提供抵抗CAV-2的交叉保护，反之亦然。因此，引发犬抵抗CAV-2 的免疫应答的制剂可以包括CAV-1或CAV-2，或其免疫原性片段。除 EURICANDHPPi之外，下列疫苗包含CAV-2，其并未指明所用的病毒类 型。

引发犬抵抗CPIV和CAV-2的免疫应答的适合制剂是本领域技术人员 所已知的。例如，下述犬疫苗在英国是得到许可的。

Fort Dodge Animal Health的KAVAKDA2PiP69是冻干活疫苗，包含在 组织培养物上生长的犬瘟热病毒，2型犬腺病毒，2型犬副流感病毒和犬细 小病毒减毒株。

Fort Dodge Animal Health的KAVAK副流感病毒包含在确定同源的细 胞系上培养的衍生自2型犬副流感病毒减毒株的冻干活疫苗。

Intervet UK Limited的NOBIVACDHPPi是冻干活疫苗，病毒疫苗包 含在细胞系组织培养物上生长的犬瘟热病毒，2型犬腺病毒，犬细小病毒和 犬副流感病毒。

Intervet UK Limited的NOBIVACKC是修饰的冻干活疫苗，包含支气 管炎博德特氏菌菌株B-C2和犬副流感病毒菌株Cornell(此为鼻内疫苗)。管 理授权号Vm 06376/4026。

Merial Animal Health Ltd.的EURICANDHPPi是抵抗犬瘟热病毒，传 染性犬肝炎，犬细小病毒和2型犬副流感病毒的重组冻干活疫苗。

Pfizer Ltd.的VANGUARD7包含在确定细胞系上传代的减毒活犬瘟热 病毒(Snyder Hill菌株)，腺病毒(CAV-2 Manhattan菌株)，副流感病毒 (NL-CPI-5菌株)，犬细小病毒(NL-35-D)，以及犬型钩端螺旋体(Leptospira canicola)和出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)的灭活 培养物。

Schering-Plough Animal Health的QUANTUMDOG 7包含犬瘟热病毒， 2型腺病毒，细小病毒，2型副流感病毒疫苗(活)以及灭活的犬型钩端螺旋 体和出血性黄疸钩端螺旋体疫苗。

Virbac Ltd.的CANIGEN DHPPi是冻干的减毒活病毒疫苗，包含在细胞 系组织培养物上生长的犬瘟热病毒，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒和犬副 流感病毒。

Virbac Ltd.的CANIGEN Ppi是冻干的减毒活病毒疫苗，包含在细胞系 组织培养物上生长的犬瘟热病毒，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒和犬副流 感病毒。

通常，能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂包括灭活或减毒的CHV， 或其免疫原性片段，或编码所述免疫原性片段的核酸。

引发犬抵抗CHV的免疫应答的适合制剂对本领域技术人员来说是已知 的。例如，Merial的EURICAN Herpes 205是抵抗CHV的纯化亚单位疫苗， 其指示怀孕母犬防死亡率的主动免疫，由于生命早期获得性CHV感染而引 起的临床症状和狗仔损害。成年犬不能接种该疫苗用于防治呼吸道疾病。

通常，能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂包括灭活 或减毒的支气管炎博德特氏菌，或其免疫原性片段，或编码所述免疫原性 片段的核酸。

引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的适合制剂是本领域技术 人员所已知的。例如，下述犬疫苗是许可使用的。

Pfizer Animal Health(U.S.Vet.Lic.No.：189)的COUGHGUARD-B包含 灭活的支气管炎博德特氏菌培养物。它用于免疫健康犬抵抗由支气管炎博 德特氏菌引起的疾病，尤其是舍咳。COUGHGUARD-B制备自支气管炎博 德特氏菌的高抗原性菌株，所述菌株已经灭活，并且在施给犬时是无毒的。 所报道的制备方法是保留支气管炎博德特氏菌完整的免疫原特性。

Pfizer Animal Health (U.S.Vet.Lic.No.：189)的VANGUARD5/B包含在 确定犬细胞系上传代的犬瘟热病毒(CDV)，CAV-2，CPIV和犬细小病毒(CPV) 的减毒菌株。CPV抗原通过在犬细胞系上低传代来减毒，在此传代水平上， CPV抗原具备压倒母体抗体的免疫原特性。在真空中，将所述疫苗用惰性 气体以冻干形式包装。含支气管炎博德特氏菌灭活全培养物的疫苗成分作 为稀释剂使用。VANGUARD5/B中的支气管炎博德特氏菌细菌成分制自已 经灭活并且在施给犬时无毒的高抗原性菌株。

Pfizer Animal Health(U.S.Vet.Lic.No.：112)的NASAGUARD-BTM由支 气管炎博德特氏菌的无毒活培养物组成。

Intervet的PROGARD-KC是修饰的鼻内活疫苗，包含减毒犬副流感病 毒和支气管炎博德特氏菌无毒活培养物。PROGARD-KC和无菌稀释剂以 干燥形式存在，用于再构成。PROGARD-KC用于接种健康、易染幼犬和 犬，预防由犬副流感病毒和支气管炎博德特氏菌引起的犬传染性气管支气 管炎(″舍咳″)。

Intervet的PROGARD-KC PLUS包含支气管炎博德特氏菌无毒菌株的 活培养物，减毒的2型犬腺病毒和副流感病毒，用于鼻内给药。接种 PROGARD-KC Plus，刺激呼吸道内的快速局部免疫，从而抑制入口处感染 并且预防临床症状。除局部免疫之外，在鼻内给药3周内还可刺激全身免 疫。接种少量(0.4ml)和1鼻量的PROGARD-KC Plus用来缓解病症，尤其 是小仔和幼犬。PROGARD-KC Plus和无菌稀释剂以干燥形式存在，用于 再构成。PROGARD-KC Plus用于接种健康犬和三周龄幼犬或者更大的犬， 预防由2型犬腺病毒，副流感病毒和支气管炎博德特氏菌引起的犬传染性 气管支气管炎(″舍咳″)。

Intervet的Intrac是冻干的修饰活疫苗，包括支气管炎博德特氏菌菌株S 55，用于鼻内给药。产品许可号PL 0201/4011。

NobivacKC，如上所述，还包括支气管炎博德特氏菌。

在一个实施方式中，疫苗组合物包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和/或

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂，

和任选，任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在优选的实施方式中，疫苗组合物包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂。

在另一个优选的实施方式中，疫苗组合物包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(b)和(d)，组合物可以包括制剂(c)，(e)，(f)，(g) 和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三种或 任意四种。

在另一个优选的实施方式中，疫苗组合物包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(a)，(b)和(d)，组合物可以包括制剂(c)，(e)，(f)， (g)和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三种 或任意四种。

本发明的第二方面提供了免疫接种犬抵抗CIRD的方法，包括对犬施用 本发明第一方面的疫苗组合物。

本发明的第三方面提供了治疗犬CIRD的方法，包括对犬施用本发明第 一方面的疫苗组合物。

因此，可以看出本发明第一方面的疫苗组合物可用于预防性或治疗性 地对抗CIRD。

本发明的第四方面提供了任意一种或多种下述制剂制备预防或治疗犬 CIRD的药物的用途：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂。

在一个实施方式中，所述药物进一步包括任意一种或多种下述制剂：

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在本发明的此方面和随后的方面中，优选(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)， (g)和(h)是如本发明第一方面所述的。

本发明的第五方面提供了刺激犬抵抗马链球菌兽瘟亚种、狗支原体和 嗜衣原体中任意一种或多种微生物的免疫应答的方法，该方法包括分别对 犬施用任意一种或多种下述制剂：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂。

在一个实施方式中，该方法进一步包括施用任意一种或多种下述制剂：

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

本发明的第六方面提供了任意一种或多种下述制剂的用途：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

所述用途是制备药物用于刺激犬抵抗马链球菌兽瘟亚种、狗支原体和 嗜衣原体中相应的任意一种或多种微生物的免疫应答。

在一个实施方式中，该药物进一步包括任意一种或多种下述制剂：

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

本发明的第七方面提供了用于医学、且包括任意一种或多种下述制剂 的组合物，该组合物因此被包装成便于医学应用的形式：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂。

应理解，该组合物可以包括任意两种所述制剂，例如(a)和(b)，(a)和(c)， 或(b)和(c)。组合物可以包括所有三种所述制剂(a)，(b)和(c)。

在一个实施方式中，该组合物是用于兽医学的组合物。所述组合物因 此被包装成便于兽医学应用的形式。

通常，该组合物是用于犬兽医学的组合物。所述组合物因此被包装成 便于犬兽医学应用的形式，即所述组合物被包装成适于在犬中使用。

在一个实施方式中，该组合物进一步包括任意一种或多种下述制剂：

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在此方面的实施方式中，该组合物包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和/或

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂，

和任选，任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在此方面的优选实施方式中，该组合物包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂。

在此方面的另一个优选实施方式中，该组合物包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(b)和(d)，该组合物可以包括制剂(c)，(e)，(f)， (g)和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三种 或任意四种。

在此方面的另一个优选实施方式中，该组合物包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(a)，(b)和(d)，该组合物可以包括制剂(c)，(e)， (f)，(g)和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意 三种或任意四种。

本发明的第八方面提供了本发明第一方面的疫苗组合物的成套试剂盒 (kit of parts)，它包括任意一种或多种下述制剂：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂，

和任选地药学上可接受的载体，稀释剂或佐剂。

应理解，该成套试剂盒可以包括任意两种所述制剂，例如(a)和(b)，(a) 和(c)或(b)和(c)。该试剂盒可以包括这所有三种制剂(a)，(b)和(c)。

在一个实施方式中，该试剂盒进一步包括一种或多种：

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在此方面的实施方式中，该试剂盒包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和/或

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂，

和任选地一种或多种：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

在此方面的优选实施方式中，该试剂盒包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂。

在此方面的另一个优选实施方式中，该试剂盒包括：

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(b)和(d)，该试剂盒可以包括制剂(c)，(e)，(f)， (g)和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三种 或任意四种。

在此方面的另一个优选实施方式中，该试剂盒包括：

(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答的制剂；和

(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和

(d)能引发犬抵抗CRCV的免疫应答的制剂；

和任意一种或多种下述制剂：

(c)能引发犬抵抗嗜衣原体的免疫应答的制剂；

(e)能引发犬抵抗CPIV的免疫应答的制剂；

(f)能引发犬抵抗CAV-2的免疫应答的制剂；

(g)能引发犬抵抗CHV的免疫应答的制剂；和

(h)能引发犬抵抗支气管炎博德特氏菌的免疫应答的制剂。

因此，应理解，除制剂(a)，(b)和(d)，该试剂盒可以包括制剂(c)，(e)， (f)，(g)和(h)中的任意两种，或全部五种制剂(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意 三种或任意四种。

在第九方面，本发明提供了制备抗马链球菌兽瘟亚种、狗支原体或嗜 衣原体中任意一种或多种微生物的抗体的方法，包括引发动物对马链球菌 兽瘟亚种、狗支原体或嗜衣原体中相应的任意一种或多种微生物或者其免 疫原性片段的免疫应答，从所述动物或其衍生的无限增殖细胞制备抗体。

制备单克隆抗体的方法和技术是本领域技术人员所熟知的，例如公开 于“Monoclonal Antibodies：A manual of techniques”，H Zola(CRC Press， 1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications”，J G R Hurrell(CRC Press，1982)中的方法和技术，引入以供参考。

本发明的第十方面提供了获得抗马链球菌兽瘟亚种、狗支原体或嗜衣 原体中任意一种或多种微生物的抗体的方法，包括利用马链球菌兽瘟亚种、 狗支原体或嗜衣原体中相应的任意一种或多种微生物或其免疫原性片段， 从抗体展示库中选出抗体。嗜衣原体是流产嗜衣原体或鹦鹉热嗜衣原体或 猫嗜衣原体。在其它实施方式中，嗜衣原体是鼠嗜衣原体，猫心嗜衣原体， 肺炎嗜衣原体，猪嗜衣原体或砂眼嗜衣原体。

本发明的第十一方面提供了特异地结合马链球菌兽瘟亚种、狗支原体 或嗜衣原体的抗体。所述抗体可以通过本发明第九和第十方面的方法来制 备。

在一个实施方式中，特异地结合嗜衣原体的抗体与流产嗜衣原体或鹦 鹉热嗜衣原体或猫嗜衣原体结合。在其它实施方式中，特异地结合嗜衣原 体的抗体与鼠嗜衣原体，猫心嗜衣原体，肺炎嗜衣原体，猪嗜衣原体或砂 眼嗜衣原体结合。

在本发明的此方面和随后方面的内容中，“抗体”不但包括完整免疫球 蛋白分子，而且包括其片段，如Fab，F(ab’)2，Fv和其保留抗原结合位点 的其它片段。与此情况相似，术语“抗体”包括抗体的基因工程衍生物， 如单链Fv分子(scFv)和功能域抗体(dAbs)。该术语还包括抗体样分子，它利 用噬菌体展示技术或其它随机选择技术来制备结合特定生物或该生物的区 域的分子。因此，在此文中，术语抗体包括含天然抗体中作为识别位点(即 与表位或抗原结合的抗体部分)的结构(优选肽结构)的所有分子。

抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)参与抗原识别，这一事实最初 由早期蛋白酶消化实验所鉴定。通过啮齿类抗体的“人源化”进一步地证实 该事实。啮齿类来源的可变区可与人来源的恒定区融合，所得抗体保留了啮 齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81，6851-6855)。

这种抗原特异性由可变区赋予，并且不依赖于恒定区，这可通过抗体 片段(均包含一个或多个可变区)的细菌表达实验得知。这些分子包括Fab样 分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science 240， 1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶体结构域通过一个柔性寡肽 相连接(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)和包含分离的V结构域的单结构域抗体 (dAbs)(Ward等(1989)Nature 341，544)。Winter和Milstein(1991)Nature 349， 293-299中有在保留其特异性结合位点的抗体片段的合成中所涉及技术的 一般性综述。

“ScFv分子”是指其中VH和VL配偶体结构域通过柔性寡肽连接的那 些分子。工程抗体，如ScFv抗体可以利用J.Huston等(1988)“Protein engineering of antibody binding sites：recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain FV analogue produced in E.coli”，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，85，pp.5879-5883，和A.Pluckthun，(June 1991)“Antibody engineering； Advances from use of E.coli expression systems”，Bio/technology vol 9(引入供 参考)中所描述的技术和方法来制备。

使用抗体片段而非整个抗体的好处是多方面的。小体积片段可能会改 善药理学特性，如更利于渗透到靶位点。完整抗体的效应子功能，如补体 结合被除去。Fab，Fv，ScFv和dAb抗体片段可由大肠杆菌表达并分泌， 从而可以容易地生产大量的所述片段。

完整抗体，以及F(ab’)2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和 F(ab’)2片段有两个抗原结合位点。相反，Fab，Fv，ScFv和dAb片段是单 价的，仅有一个抗原结合位点。

虽然所述抗体可以是多克隆抗体，但优选是单克隆抗体。在某些情况 下，特别是如果要对犬重复施用所述抗体时，优选所述单克隆抗体是犬单 克隆抗体或“犬化”抗体。

多克隆抗体可以制备成多特异性或单特异性的。优选它们是单特异性 的。Neuberger等(1998，8th International Biotechnology Symposium Part 2， 792-799)讨论了嵌合抗体。

优选所述抗体是“犬化”抗体。适当制备的非犬抗体可用已知方法进 行“犬化”，如通过将小鼠抗体的CDR区插入犬抗体的框架内。犬化抗体 可以利用M.Verhoeyen，C.Milstein和G.Winter(1988)“Reshaping human antibodies：Grafting an antilysozyme activity”，Science，239，1534-1536，和C. Kettleborough等，(1991)“Humanisation of a mouse monoclonal antibody by CDR grafting；The importance of framework residues in loop conformation”， Protein Engineering，14(7)，773-783(引入以供参考)中所描述的相应人源化抗 体技术和方法来制备。

应理解，通过施用与参与此疾病的制剂反应的抗体，犬可以被动获得 抵抗CIRD的免疫性。

因此，本发明的第十二方面提供了被动地免疫犬而抵抗CIRD的方法， 包括给所述犬施用一种或多种特异地结合马链球菌兽瘟亚种、狗支原体和 嗜衣原体中相应的一种或多种微生物的抗体。

特异地结合马链球菌兽瘟亚种、狗支原体和嗜衣原体的抗体可以利用 常规技术如上面所述的技术来制备或获得。

应理解，犬CIRD可通过施用与该疾病相关制剂反应的抗体来治愈。

在第十三方面，本发明提供了治疗犬CIRD的方法，包括对所述犬施用 一种或多种特异地结合马链球菌兽瘟亚种、狗支原体和嗜衣原体中相应的 一种或多种微生物的抗体。

在第十二或第十三方面的实施方式中，特异地结合嗜衣原体的抗体与 流产嗜衣原体，或鹦鹉热嗜衣原体或猫嗜衣原体结合。在另一个实施方式 中，特异地结合嗜衣原体的抗体与鼠嗜衣原体，猫心嗜衣原体，肺炎嗜衣 原体，猪嗜衣原体或砂眼嗜衣原体结合。

在第十二或第十三方面的实施方式中，所述方法进一步包含施用特异 地结合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支气管炎博德特氏菌中任意一种或 多种微生物的抗体。

特异地结合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支气管炎博德特氏菌的抗 体可以利用常规技术，如上所述的技术来制备。

本发明的第十四方面提供了一种或多种特异地结合马链球菌兽瘟亚 种、狗支原体和嗜衣原体中相应的一种或多种微生物的抗体用于制备使犬 被动免疫抵抗CIRD的药物的用途。

本发明的第十五方面提供了一种或多种特异地结合马链球菌兽瘟亚 种、狗支原体和嗜衣原体中相应的一种或多种微生物的抗体用于制备治疗 犬CIRD的药物的用途。

在第十四或第十五方面的实施方式中，特异地结合嗜衣原体的抗体与 流产嗜衣原体，或鹦鹉热嗜衣原体或猫嗜衣原体结合。在另一个实施方式 中，特异地结合嗜衣原体的抗体与鼠嗜衣原体，猫心嗜衣原体，肺炎嗜衣 原体，猪嗜衣原体或砂眼嗜衣原体结合。

在第十四或第十五方面的实施方式中，所述药物进一步包含特异地结 合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支气管炎博德特氏菌中任意一种或多种 微生物的抗体。

本发明的第十六方面提供了包含特异地结合马链球菌兽瘟亚种的抗 体，特异地结合狗支原体的抗体，和特异地结合嗜衣原体的抗体中的任意 两种或多种抗体的组合物。

在一个实施方式中，特异地结合嗜衣原体的抗体与流产嗜衣原体，或 鹦鹉热嗜衣原体或猫嗜衣原体结合。在另一个实施方式中，特异地结合嗜 衣原体的抗体与鼠嗜衣原体，猫心嗜衣原体，肺炎嗜衣原体，猪嗜衣原体 或砂眼嗜衣原体结合。

在一个实施方式中，所述组合物进一步包含特异地结合CRCV，CPIV， CAV-2，CHV和支气管炎博德特氏菌中的任意一种或多种的抗体。

还应理解，本发明包括治诊断方法和测定。因此，本发明提供了确定 是否犬接触过与CIRD相关的嗜衣原体物种的方法，该方法包括：

(a)获得来自犬的合适的样品；和

(b)鉴定该样品中与CIRD相关的嗜衣原体物种，或者其中的抗体。

通常，嗜衣原体物种具有包含SEQ ID Nos：1-8任一序列(当以RNA显 示时)的23S RNA(参见显示部分23S RNA序列的图5和8，及实施例3)。

本发明还提供了确定犬是否患有或易染CIRD的方法，该方法包括：

(a)获得来自犬的合适的样品；和

(b)鉴定该样品中的马链球菌兽瘟亚种或狗支原体或嗜衣原体中的任 意一种或多种微生物，或者其任何抗体。

应理解，在一个实施方式中，所述方法例如通过对样品中的生物本身 或其片段(如蛋白或核酸)进行检测，可以检测出当前接触的生物。所述方法 还可以通过检测样品中的抗体来检测出过去接触过的生物。

通常，所述样品是任何含有体的合适样品，包括样品如血清、唾液、 气管洗液和支气管肺泡灌洗液(bronchiolar lavage)。

因此，通过对样品中生物或其成分的存在进行分析，可以确定样品所 来源犬中的生物存在情况。例如，对于含23S RNA的核酸成分来说，可以 如利用高严格条件下杂交，特异性扩增，核苷酸测序技术和本领域技术人 员所熟知的其它方法(Sambrook等(2001)见上)来提取核酸或者如果需要，将 核酸复制到DNA内并检测。“在高严格条件下杂交”是指该多核苷酸和它 杂交的核酸具有足够的核苷酸序列相似性，从而它们能在高严格条件下杂 交。如本领域所知，核酸杂交的严格性依赖于诸如发生杂交的核酸长度， 杂交序列的同一性程度的因素，以及如温度，离子强度和该序列的CG或 AT含量的因素。

在高严格条件下，能与该生物的核酸分子杂交的核酸包括：与该生物 的至少部分核酸有＞90％的序列同一性的核酸，优选＞95％或＞96％或＞97％或 ＞98％，更优选＞99％的序列同一性的核酸。

常见的导致选择性杂交的高严格杂交条件是本领域已知的，例如 Sambrook等2001(见上)(引入供参考)中所述的条件。

当核酸固定在尼龙膜上并且探针核酸≥500个碱基时，一个常用的杂交 溶液的实例是：

6x SSC(柠檬酸钠盐)

0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)

100μg/ml变性的，断裂的鲑精DNA

该杂交在68℃下进行。该固定有核酸的尼龙膜于68％下用0.1×SSC洗 涤。

20×SSC可以下述方式制备。将175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠溶于 800ml H2O中。用几滴10N NaOH溶液调节其pH至7.0。用H2O将其体积 调至1升。分成若干等份。高压灭菌。

当核酸固定于尼龙膜上并且探针为15-50个碱基的寡核苷酸时，一个常 用的杂交溶液的实例是：

3.0M氯化三甲铵(TMACl)

0.01M磷酸钠(pH 6.8)

1mm EDTA(pH 7.6)

0.5％SDS

100μg/ml变性的，断裂的鲑精DNA

0.1％脱脂奶粉

最佳的杂交温度通常选为比给定链长的Ti低5℃。Ti是探针和其靶序列 间所成的杂交体的不可逆解链温度。Jacobs等(1988)，Nucl.Acids Res.16， 4637讨论了Ti的测定。对在3M TMACl中的1 7基体的建议杂交温度为48-50 ℃；对19基体的为55-57℃；而对20基体则为58-66℃。

可使用任何已知的方法来分析获自犬样品的该生物的蛋白成分。通常， 所述方法是基于抗体和与该生物或其成分结合的抗体的技术。

例如，可用经典的免疫组织方法来研究该生物的蛋白表达。其中，第 一抗体(多克隆或单克隆)提供特异性识别，而第二级检测系统可应用荧光、 酶或其它偶联的第二抗体。结果，获得用于病理检查的组织切片的免疫组 织染色。也可使用如尿素和中性去污剂提取组织，使蛋白释放，用于Western 印迹或斑点/印迹(dot/slot)测定(Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.101：976-985 (1985)；Jalkanen，M.等，J. Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。在基于应用阳 离子固相的此技术中，使用分离的蛋白作为标准完成蛋白的定量。此技术 也能用于体液样品。

对检测蛋白表达有利的其它基于抗体的方法包括免疫分析法，如酶联 免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。例如，反应性的单克隆抗体既 可用作免疫吸附剂又可用作酶标记探针，以检测和定量蛋白。可利用线性 回归计算机算法参照标准制剂中存在的量计算样品中存在的蛋白量。检测 肿瘤抗原的ELISA描述在Iacobelli等，Breast Cancer Research and Treatment 11：19-30(1988)中。在另一种ELISA测定法中，可使用两种独特的特异单 克隆抗体检测体液中的蛋白。在此测定法中，一种抗体用作免疫吸附剂， 而另一种用作酶标记探针。

以上技术基本可按“一步”或“两步”测定法进行。“一步”测定法包 括用固定的抗体接触蛋白，不必洗涤，将混合物与标记抗体接触。“两步” 测定法包括用标记抗体接触混合物之前洗涤。如果合适也可使用其它常规 方法。通常希望将测定系统的一种成分固定于支持物上，由此允许系统的 其它成分进入并接触此成分，并且易于从样品中去除这些成分。

合适的酶标记物包括，例如，通过与底物反应催化过氧化氢产生的氧 化酶。葡萄糖氧化酶是特别优选的，因为它具有良好的稳定性并且它的底 物(葡萄糖)易于得到。可通过测定经酶-标记抗体/底物反应形成的过氧化氢 的浓度来测定氧化酶标记物的活性。除酶之外，其它合适的标记物包括放 射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)， 以及荧光标记物，如荧光素和罗丹明，和生物素。

可利用例如免疫吸附试验的已知技术来检测生物或其成分抗体，如酶 联免疫吸附试验(ELISA)。

因此，本发明进一步的方面提供了检测与CIRD相关的抗体的免疫吸附 试验，该试验包括：包被有(a)能引发犬抵抗马链球菌兽瘟亚种的免疫应答 的制剂；(b)能引发犬抵抗狗支原体的免疫应答的制剂；和(c)能引发犬抵抗 嗜衣原体的免疫应答的制剂中的一种或多种的固相；和会与结合到该固相 的抗体结合的可测标记偶联物。

优选，固相是微量孔。此外优选，偶联物包含抗-犬抗体抗体。优选， 偶联物包含酶，例如辣根过氧物酶。此外优选，免疫吸附试验还包含该酶 的底物。本发明包括含该免疫吸附试验成分的成套试剂盒。这样，该成套 试剂盒就包括固相如微量滴定板，包被该固相的获自一种生物或多种生物 的蛋白，将会与结合到固相的抗-生物(或其成分)抗体结合的可测标记偶联 物，如抗-犬抗体。如果可测标记偶联物是酶，那么该成套试剂盒就还包括 该酶的底物。该试剂盒还可以包括阳性对照样品，它包括与固相基底上的 抗原反应的已知抗体，以及阴性对照样品。

本发明还包括包被有上面和本发明第一方面所述的全部三种(a)，(b)和 (c)中任意一种或两种的固相基底。常规能引发免疫应答的制剂也能与抗体 结合。常规的制剂是抗原蛋白。通常，取决于抗原的稳定性，于4℃-37℃， 在微量滴定板上包被蛋白过夜。用洗涤缓冲液，如磷酸缓冲盐水或Tris缓 冲盐水将非结合蛋白洗去。通常于37℃，在平板上孵育血清或其它样品1- 数小时。洗去非结合物质，于37℃用酶标记(如辣根过氧物酶)的抗体，如对 于血清样品用抗-犬IgG或IgM，对于肺洗液用IgA孵育平板1-数小时。洗 去非结合抗体，用底物如OPD孵育平板约10分钟，在光度计下测量光密 度。

优选，固相基底是微量孔。

本文提到的所有文献以其整体全部引入本文供参考。在本说明书中对 现有公布文献的列举或者讨论并不应当看成是承认所述文献是现有技术的 一部分，或者是普通的一般知识。

现在，本发明将在下述附图和实施例的帮助下进行更详细的描述。

图1：从209只犬舍犬中分离的狗链球菌(S.Canis)和马链球菌兽瘟亚种 的呼吸道症状临床评分(n＝各组犬总数)。误差条代表置信区间(95％)。

图2：随着在犬舍的时间，患CIRD，狗链球菌或马链球菌兽瘟亚种的 犬的百分数(n＝总共209只犬分在各组的犬总数)。误差条代表置信区间 (95％)。

图3：随着CIRD严重度水平增加，气管和肺感染狗支原体的犬的百分 数。

图4：随着在犬舍的时间延长，气管和肺感染狗支原体的犬的百分数。

图5：从CIRD犬分离的嗜衣原体获得的23S rRNA基因的218个核苷 酸的部分序列(SEQ ID NO：1)(DHB10)。

图6：随着CIRD严重度水平增加，气管和肺感染嗜衣原体的犬的百分 数。

图7：部分23S rRNA犬序列(DHB)与衣原体和嗜衣原体已知物种(Cabor -C.abortus，Cpsit-C.psittaci，Cfel-C.felis，Ccavi-C.caviae，Cpne-C. pneumoniae，Cpec-C.pecorum，Csuis-C.suis，Ctrac-C.trachomatis，Wad- Waddlia，Sim-Simkania)的23S rRNA进行比对。

图8：从CIRD犬分离的嗜衣原体物种获得的另外7种分离物，它们的 23S rRNA基因中218个核苷酸的部分序列(SEQ ID NO：2-8)(DHB2，4，5， 6，7，8和9)。

图9：随着CIRD严重度水平增加，气管和肺感染犬疱疹病毒的犬的百 分数。

实施例1：马链球菌兽瘟亚种与犬传染性呼吸道疾病的关系

概述

尽管大范围的使用疫苗，犬传染性呼吸道疾病(CIRD)仍然是感染许多 犬舍犬的多因素传染病。现在的疫苗目标是保护防御病毒性制剂和单一细 菌制剂，支气管炎博德特氏菌。我们研究了链球菌物种在CIRD中的作用。 对临床健康犬和患CIRD犬下呼吸道中链球菌的分离和鉴定，可以证明在呼 吸道疾病中存在有特定的链球菌物种。我们证明了在患地方性CIRD的犬舍 犬中，马链球菌兽瘟亚种(S.zooepidemicus)与疾病的严重度增加有关。

说明

CIRD是一种传染各年龄犬的传染病，而且当大量犬饲养在密封环境下 时经常爆发。该病发病率高，早期出现喉炎的干咳症状，流鼻涕和/或眼泪， 和可变的厌食，并能发展成气管支气管炎，肺炎，甚至更严重的死亡。历 史上认为该病是复杂感染，它组合或相继用病毒(CPIV和CAV-2)和细菌制 剂攻击，使得临床评分协同增强(Appel和Binn，1987)。从该病检出的最常 见细菌制剂是支气管炎博德特氏菌(McCandlish等，1978)，但其它制剂物种 如巴斯德菌属，支原体菌属和β-溶血性链球菌(βhS)也与该病有关 (McCandlish等，1978；Rosendal，1978；Thrusfield等，1991)。

从病犬和健康犬的上(口和鼻腔)和下呼吸道(气管和肺)分离细菌的许多 研究都提到了存在βhS(Smith，1967；McCandlish等，1978；McKiernan等， 1982；Azetaka和Konishi，1988)。然而，尽管在犬上呼吸道内发现了许多βhS 物种，但仅有少数研究关注于参与下呼吸道疾病的βhS物种(Garnett等，1982； Angus等，1997)。虽然Biberstein等(1980)注意到了犬呼吸道中的βhS物种， 但是该研究忽略了上下呼吸道间的运输差异。另外，即使分离物是获自兽 医院患者，但忽略了治疗安排原因和与特定临床条件的任何联系。在犬中 最流行的βhS，狗链球菌，Lancefield G组Streptococcus是一种常见的生殖 和呼吸道的黏膜以及皮肤共栖物(Timoney，1987；Quinn等,1999)。已经从 60-73％的健康犬扁桃腺中分离出了狗链球菌(Streptococcus canis)(S. canis)(Smith，1967；Sadatsune和Moreno，1975；Biberstein和Hirsh，1999)。狗 链球菌在犬中引起各种偶发和随机感染，包括肺炎，败血病，脓肿，乳腺 炎，子宫积脓，直肠炎，中毒性休克综合症和坏死性肌膜炎(Biberstein和 Hirsh，1999；Quinn等，1999)。

除了狗链球菌之外，还从犬中分离出了其它Lancefield组，如A，C和 E组狗链球菌βhS。(Biberstein等，1980)。发现马链球菌兽瘟亚种，Lancefield C组，是哺乳动物上呼吸道黏膜的共栖物(Timoney等，1988；Quinn等，1999)。 它与许多中疾病综合症有关，包括下呼吸道疾病，驹肺炎和马的子宫颈炎 (Chanter，1997；Biberstein和Hirsh，1999)，骆驼肺炎(Biberstein和Hirsh， 1999)，猪败血症和关节炎(Timoney，1987)，母牛和山羊乳腺炎(Timoney等， 1988)，家禽败血症，羔羊心包炎和肺炎(Timoney，1987)，豚鼠淋巴腺炎(Quinn 等，1999)和人血管球性肾炎(Balter等，2000)。在犬中，马链球菌兽瘟亚种与 伤口传染病有关，败血病(Quinn等，1999)和急性坏死性出血性肺炎(Garnett 等，1982)。在此项研究中，我们想要确定哪种βhS都在健康犬和患CIRD犬 的呼吸道中存在。

材料和方法

研究群体和取样

主要研究群体(n＝209，支气管肺泡灌洗液，BAL)包括来自有地方性 CIRD历史的已确认救助舍动物(～600只犬)。一旦进入犬舍，所有犬都要接 种KAVAK DA2 PiP69(Forr Dodge)，一种用于瘟病毒，CAV-2，CPIV和犬细 小病毒的减毒活疫苗，和抵抗钩端螺旋体病的KAVAKL。已经证实在该中 心患CIRD犬中存在犬冠状病毒(CRCV)和支气管炎博德特氏菌(Chalker等， 2003；Erles等，2003)。由于福利原因，该犬舍每周都要献出一些犬，从这些 犬中任意选取2-3只作为样本。通过以下方法，从1999-2001两年间，总数 209只犬个体中取集BAL样品。在2小时安乐死内，在分叉处上方夹住气 管，避免取样过程中的任何肺气管污染物。然后，用无菌导管将50ml Hanks Balanced Salt solution放入肺叶顶部。然后用手按摩此肺叶30秒，回收BAL。 在安乐死时，还将犬的临床呼吸道评分严重度归为下述等级：(1)无呼吸道 症状，n＝71(2)中度咳嗽，n＝37(3)咳嗽和流鼻涕，n＝76(4)咳嗽、流鼻涕和 精神抑郁和/或食欲不振，n＝9(5)脓性支气管肺炎，n＝16。

在BAL取样后，从右肺叶末梢取肺组织切片，进行组织分析。将用福 尔马林固定的(10％福尔马林盐水)组织块嵌入石蜡内，在光学显微镜(X40， X100，X400)下观察标准苏木素伊红染色切片。对存在或缺少肺泡内嗜中性 粒细胞进行记录。

记录下每只犬在犬舍中所呆的总天数，然后以周计算在犬舍的时间。 记下每只动物进入犬舍时的年龄和临床情况，而且基于营养状况，皮毛， 举止，胃口和常规临床检查(温度，脉搏数，呼吸数)的临床情况混和评分分 为以下等级：良好(1)，劣(2)，极劣(3)。

将另一犬群作为对照组，对照组由在RVC下参照诊断细菌学，于 1998-2000两年间有临床呼吸症状的家养宠物犬组成(n＝71，BAL)。用 Cocoran(1998)所述的内镜操纵技术从对照组采集样品。将研究的全部样品 保存于4℃，直到细菌学上的检测，除了在冷冻的BAL上进行CFU/ml计 算之外，在取样24小时内进行检测。

细菌分离和鉴定

将50μl体积的BAL一式两份铺在含5％无菌羊血的哥伦比亚血琼脂 (Oxoid Ltd.，Hampshire，UK)平板上，于37℃有氧和厌氧孵育24小时。鉴定 β-溶血性菌落，并纯化单菌落。通过菌落和细胞形态将革兰氏阳性过氧化氢 酶阴性菌鉴定为链球菌，通过乳胶珠玻片凝集(Oxoid Ltd.，Hampshire，UK) 鉴定血清群为Lancefield组。然后用API20STREP手工鉴定试剂盒 (bioMérieux UK Ltd.，Basingstoke，UK)通过生物化学应用和酶反应鉴定分离 物的物种水平。

为了鉴定混和感染，用乳胶珠玻片凝集和API20STREP对来自研究的 最初12只犬的3种菌落进行检测。将用磷酸缓冲盐水(Sigma-Aldrich Co.Ltd.， Dorset，UK)连续稀释的BAL铺板三份，如上所述进行孵育，计算CFU/ml BAL。βhS的生长分为以下等级：无(0)，＜100CFU/ml(1)，100-1000CFU/ml (2)，和＞1000CFU/ml(3)。

统计分析

将所有分析的I型误差(α)显著性水平或可能性假定为0.05。用Prism (version 3.0，GraphPad Software Inc，San Diego，USA)统计分析软件x2测验对 进入犬舍时的马链球菌兽瘟亚种存在，年龄，临床情况，犬舍内周数，肺 泡内嗜中性粒细胞和临床呼吸评分进行分析。细菌生长和呼吸评分的关系 使用各呼吸评分和马链球菌兽瘟亚种生长的组合平均得分，用Prism one way ANOVA(非参数的)测验进行分析来确定。还随时间周数，计算取样的犬 舍犬内狗链球菌，马链球菌兽瘟亚种和呼吸道疾病的存在。

结果

β-溶血性链球菌分离自两个研究群体，而且从家养宠物BAL分离同犬 舍犬有明显地不同(1.4％家养，23.9％犬舍，x2分析***p＝0.000)。发现所有 hS分离物都是狗链球菌或马链球菌兽瘟亚种。未发现不同Lancefield组或 物种的混和感染，而且所有独立平板都产生了形态一致的菌落。狗链球菌 和马链球菌兽瘟亚种都分离自犬舍犬，但从家养宠物中只分离到了唯一的 马链球菌兽瘟亚种，而没有狗链球菌。发现在犬舍犬中马链球菌兽瘟亚种 是主要的hS物种(92.0％)。对临床呼吸评分各等级内(图1)的犬舍犬进行狗 链球菌和马链球菌兽瘟亚种的携带情况检测。在有和无临床评分的犬内都 存在狗链球菌，分离物并不会使疾病严重性加剧。相反，相比于患病动物， 健康犬更不可能在下呼吸道内含有马链球菌兽瘟亚种(x2分析，**p＝0.004)， 随着临床呼吸评分增加，马链球菌兽瘟亚种分离物显著地增加，从无症状 犬内的9.7％到脓性支气管肺炎犬内的87.5％(x2分析，***p＝0.000)。呼吸道 评分更高的犬比临床健康犬也更可能平均马链球菌兽瘟亚种细菌生长评分 更高(one way ANOVA分析***p＝0.000.R squared＝0.194，F＝22.265)。进入 犬舍时的动物年龄和临床情况对分离马链球菌兽瘟亚种没有影响(x2分析， 年龄p＝0.341，进入时的临床情况p＝0.295)。

犬舍内患CIRD犬的百分数从第一周的21.1％显著增加到第二周的 70.1％，直到第四周CIRD数也没有减少(图2)。虽然未检测到明显差异，肺 内有马链球菌兽瘟亚种的犬数增加了20.6％，在犬舍第一周的16.7％到第三 周的34.4％(图2)，但是对狗链球菌就没有此趋势。

组织学分析揭示含马链球菌兽瘟亚种的犬相比不含马链球菌兽瘟亚种 的犬更有可能含肺泡内嗜中性粒细胞(x2分析，**p＝0.006)。细菌评分更高 的犬经常会得中度到明显巨噬细胞凝集的急性的脓性或坏死性肺炎，与 Garnett等(1982)所发现的相似，含马链球菌兽瘟亚种的犬会引发出血性链球 菌肺炎(HSP)。在H和E染色的切片内未发现细菌细胞。

讨论

在本研究中，我们关注于存在于患和未患呼吸道疾病的家养和犬舍犬 下呼吸道的βhS物种。虽然，狗链球菌是犬呼吸道内的主要βhS(Biberstein 等，1980)，而且在本研究中从某些犬舍犬的下呼吸道内分离得到该菌，但是 它并不与犬舍犬的CIRD有关系。相反，马链球菌兽瘟亚种分离物增加与 CIRD严重度增加有关。相比于犬舍中的更健康动物，有任何呼吸道症状的 犬在下呼吸道内更可能含有马链球菌兽瘟亚种，在家养宠物中的马链球菌 兽瘟亚种比例比犬舍犬中的低。

先前，已经报道马链球菌兽瘟亚种与犬内的HSP有关(Garnett等，1982)。 HSP综合症是在小猎犬亲密群体内的一种重症传染病，该病相继发生突然 死亡而没有任何临床先兆。验尸发现在气管和支气管树内存在大量的出血 性分泌物，肺扩散为深红色。此外，在其它组织范围内还出现斑状出血。 在犬内通过导管内接种马链球菌兽瘟亚种而使该病再生。有意思的是，在 此项研究中，相比于那些低生长评分的犬，有更高马链球菌兽瘟亚种生长 评分的犬更有可能会有肺泡内嗜中性粒细胞，并且分享Garnett等(1982)所 述的HSP内肺组织学特征。

历史上认为CIRD是复杂疾病，包括细菌和病毒制剂。事实上，许多其 它制剂都在此犬的犬舍群体中描述过了，包括CRCV(Erles等，2003)和支气 管炎博德特氏菌(Chalker等，2003)。虽然并不清楚CRCV的病原潜力，但 是Erles等(2003)提供的数据显示CRCV在那些有轻微呼吸道疾病的犬(评分 2)中占优势，相似地，Chalker等(2003)发现有支气管炎博德特氏菌的犬在中 度疾病的犬(评分3)中占优势。

我们发现，马链球菌兽瘟亚种更常与更重CIRD病例(评分4-5)相关， 这说明它可能作为次生侵入菌。事实上，以前已经将βhS物种描述为CIRD “复合病”中的次生侵入菌(McCandlish等，1978)。但是，仍然不清楚马链 球菌兽瘟亚种是否在这些动物的呼吸道疾病中起主要作用，或者仅仅是侵 入呼吸道，而随后被其它病原体破坏。流行病学上的证据表明在马中，马 链球菌兽瘟亚种可能是呼吸道疾病的主要病原体(Wood等，1993；Chanter， 1997)，但是通常认为它是条件性病原体(Walker和Timoney 1998；Anzai等， 2000)。即使马链球菌兽瘟亚种不是导致这些犬CIRD的主要原因，从脓化 支气管肺炎犬的高分离率(87.5％)还是支持下述假说，认为马链球菌兽瘟亚 种是造成在此犬舍内所见的更重临床症状的原因。从患呼吸道疾病的家养 宠物的低分离率(1.4％)说明此制剂并不是常见的呼吸道传染源，而很可能是 针对此犬舍的特殊问题。虽然并未考虑过任何在先的放入犬舍，但本研究 中的某些家养宠物犬很可能曾经放入过犬舍。还未确定马链球菌兽瘟亚种 在犬舍犬内CIRD其它病例中所起的作用。

随着在犬舍的时间，而从这些犬分离的马链球菌兽瘟亚种增加说明这 些犬的肺在渐渐被这些细菌感染。所述感染也可能由上呼吸道的亚临床感 染或者单一病原菌菌株引起。用于可变M-类SzP蛋白基因的PCR分型系统 能将马链球菌兽瘟亚种的15种已知血清型分为5个不同组，HV1-5(Walker 和Timoney，1998)。Anzai等，(2000)用该分型系统进行分析，在患肺炎的马 肺内发现马链球菌兽瘟亚种的单克隆变体，并在健康马的扁桃腺内发现了 几个类型。若感兴趣的话，对参与此CIRD爆发的马链球菌兽瘟亚种分离物 进行亚型分析，确定单克隆变体是否存在于患病群体内，并检查其关系， 若有的话，犬马链球菌兽瘟亚种分离物就不得不是导致马和其它动物内呼 吸道疾病的那些物种。与肺炎有关的马链球菌兽瘟亚种在各年龄和急性出 血性肺炎马内，以及被运输压迫的年长马内出现(Anzai等，2000)。在此次 CIRD爆发中，年轻犬和在进入犬舍时临床情况差的犬与年长犬和进入时健 康的犬一样，都易受马链球菌兽瘟亚种感染。

在此犬舍内，感染范围内采用抗生素疗法，而且除了重症支气管肺炎 病例外，不对患CIRD犬进行常规治疗。治疗很可能会影响此研究中所提到 的细菌谱。但是，对自然爆发的呼吸道疾病进行研究，能够提供其它手段 所不能获得的有价值信息。

已知CIRD是包括多种制剂的多因素疾病，所述制剂包括CAV-2，CPIV， 支气管炎博德特氏菌和支原体菌属。在大量各地犬聚集到一起并饲养的犬 舍内存在有许多病原体，而且疾病严重程度就可以作为反应。

实施例2：狗支原体与犬传染性呼吸道疾病的关系

研究生物培养物内狗支原体的存在，并用PCR分析加以鉴定。在184 只犬舍犬的调查中，我们发现在气管或肺内含狗支原体的犬的百分数随着 呼吸道疾病症状而增加，从健康犬的10％到病犬的31％(图3)。

我们还注意到随着在犬舍的时间，呼吸道疾病增加，第一周，在犬舍 犬气管内没有可检测的狗支原体，而第二周，184只犬中有24％气管内狗支 原体呈阳性一说明24％的犬感染了该细菌。肺菌落定居(colonisation)中也观 察到更小但相似的增长(从15％到23％)(参见图4)。

实施例3：嗜衣原体与犬传染性呼吸道疾病的关系

我们通过PCR分析对210只犬的嗜衣原体存在进行了测定。

用下述PCR，从嗜衣原体扩增出23S rRNA基因的218bp片段。反应 条件，95℃ 5分钟(x1个循环)，95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分钟(x40 个循环)和72℃5分钟。总量50μl的PCR反应混合物包括5.0μl 10x无镁缓 冲液(Promega)，1.5mM MgCl2(Promega)，0.5μl(0.5单位)Taq DNA聚合酶 (Promega)，0.2mM PCR核苷酸混合物(Promega)，0.025μg上游引物Cl (5’-GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAG GA-3’，SEQ ID NO：9)和下游 引物C2(5’-TGGCTCATCATGCAAAAGGCA-3’，SEQ ID NO：10)，40μl水和 2μl样品组织DNA。

通过序列分析并利用Fasta分析对PCR产物与GenBank的可得序列进 行比较，确定从8只犬获得的PCR产物是嗜衣原体。一个所述序列的23S rRNA基因的部分序列(DHBC10)示于图5(SEQ ID NO：1)。此218bp序列与 流产嗜衣原体的相同区域有99.08％同一性，与鹦鹉热嗜衣原体有98.6％同 一性，与猫嗜衣原体有96.3％同一性，而且大多数序列簇在初步的亲缘分析 上(用Megalign的clustal法)位于明显的进化枝内(图7)。7种其它嗜衣原体 分离物的23S rRNA部分序列示于图(SEQ ID NOs：2-8)。

在此项研究中，我们发现随着气管和肺内的呼吸道疾病严重度的增加， 检测的嗜衣原体也增加。在气管样品中发现了10％的微小检测增加(从25％ 到34％)。在肺内嗜衣原体检测中发现了更鲜明的差异，从健康犬中的0％ 增加到患CIRD犬中的37.5％(图6)。另外，在PCR检测的嗜衣原体阳性犬 总数中，从健康犬中的25％增加到患重症疾病犬的50％(图6)。

实施例4：犬疱疹病毒与犬传染性呼吸道疾病的关系

我们发现，在呼吸道症状更重的犬内犬疱疹病毒的流行增加(图9)。在 对抗体应答CHV进行整整一年的监测时，时常爆发呼吸道疾病的犬舍内犬 比无爆发的对照犬舍内犬(8.3％)血清转化为CHV更频繁(58.3％)。

参考文献

Angus，J.C.，Jang，S.S.，Hirsh.D.C.，(1997).Microbiological study of transtracheal aspirates from dogs with suspected lower respiratory tract disease：264 cases(1989-1995).J. Am.Vet.Med.Assoc.210，55-58.

Anzai，T.，Walker，J.A.，Blair，M.B.，Chambers，T.M.，Timoney，J.F.，(2000).Comparison of the phenotypes of Streptococcus zooepidemicus isolated from tonsils of healthy horses and specimens obtained from foals and donkeys with pneumonia.Am.J.Vet.Res.61，162-166.

Appel MJ，Percy DH.SV-5-like parainfluenza virus in dogs.(1970)J Am Vet Med Assoc. 1970 Jun 15；156(12)：1778-81.

Appel，M.，Binn，L.N.，1987.Canine Infectious Tracheobronchitis Short review：Kennel Cough.In：Appel M.(Ed.)，Virus Infections of Carnivores.Elsevier.Oxford.pp.201-211.

Arizmendi F，Grimes JE，Relford RL.(1992).Isolation of Chlamydia psittaci from pleural effusion in a dog.J Vet Diagn Invest.4(4)：460-3.

Azetaka，M.，Konishi，S.，(1988).Kennel cough complex：confirmation and analysis of the outbreak in Japan.Jap.J.Vet.Sci.50，851-858.

Balter，S.，Benin，A.，Pinto，S.W.L.，Teixeira，L.M.，Alvim，G.G，Luna，E.，Jackson，D.， LaClaire，L.，Elliot，J.，Facklam，R.，Schuchat，A.，(2000).Epidemic nephritis in Nova Serrana， Brazil.Lancet.355，1776-1780.

Barile，M.F.(1985)Immunization against mycoplasma infectiohs p 451-492.In S.Razin and M.F.Barile(Ed.)The Mycoplasamas，vol 4.Mycoplasma pathogenicity.Academic Ptess， Inc，Orlando，Florida.

Barile M.F.等，(1985).Current status on the controls of mycoplasma diseases of man， animals，plants and insects.Bull.Inst.Pasteur.83：339-373.

Bemis，D.A.，Carmichael，L.E.和Appel，M.J.(1977a).Naturally occurring respiratory disease in a kennel caused by Bordetella bronchiseptica.Cornell Vet.67，282-93.

Bemis DA，Greisen HA和Appel MJ.(1977b).  Pathogenesis of canine bordetellosis.J. Infect Dis 135:753-762.

Biberstein，E.L.，Brown，C.，Smith，T.，(1980).Serogroups and Biostypes among beta-hemolytic streptococci of canine origin.J.Clin.Microbiol.11，558-561.

Biberstein，E.L.，Hirsh，D.C.，(1999).Streptococci.In：Hirsh，D.C.，Zee，Y.C.，(Eds.) Veterinary Microbiology.Blackwell Science.Oxford.pp 120-126.

Binn，L.N.，Eddy，G.A.，Lazar，E.C.，Helms，J.和Murnane，T.(1967).Viruses recovered from laboratory dogs with respiratory disease.Proc Soc Exp Biol Med 126，140-5.

Chalker VJ，Toomey C，Opperman S，Brooks HW.Ibuoye MA，Brownlie J，Rycroft AN. Respiratory Disease in Kennelled Dogs：Serological Responses to Bordetella bronchiseptica Lipopolysaccharide Do Not Correlate with Bacterial Isolation or Clinical Respiratory Symptoms.Clin Diagn Lab Immunol.10(3)：352-6.2003.

Chanter，N.，(1997)Streptococci and enterococci as animal pathogens.J.Appl.Microbiol. Symp.Suppl.83，100S-109S.

Cocoran，B.(1998).Cytological collection techniques.In：Luis Fuentes，V.Swift，S.， (Eds.)，Manual of small animal cardiorespiratory medicine and surgery.British Small Anim.Vet. Assoc.Cheltenham.pp.75-79.

Ditchfield，J.，Macpherson，L.W.和Zbitnew，A.(1962).Association of a canine adenovirus(Toronto A 26/61)with an outbreak of laryngotracheitis(“kennel cough”).Can.Vet. Jour.3.238-247.

Ellis JA，Haines DM，West KH，Burr JH，Dayton A，Townsend HG，Kanara EW，Konoby C，Crichlow A，Martin K，Headrick G.(2001)Effect of vaccination on experimental infection with Bordetella bronchiseptica in dogs.J.Am Vet Med Assoc.218(3)：367-75.2001.

Erles，K.，Toomey，C.，Brooks，H.W.，Brownlie，J.(2003).Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease.Virology.In press.

Farrow JA等.(1984).“Taxonomic studies on Streptococci of serological groups C，G and L and possibly related taxa”.Syst.Appl.Microbiol.5：483-493.

Fraser G，Norval J，Withers AR，Gregor WW.(1985)A case history of psittacosis in the dog.Vet Rec.1969 85(3)：54-8.

Fukushi H，Ogawa H，Minamoto N，Hashimoto A，Yagami K，Tamura H，Shimakura S， Hirai K.(1985)Seroepidemiological surveillance of Chlamydia psittaci in cats and dogs in Japan.Vet Rec.117(19)：503-4.

Garnett，N.L.，Eydelloth，R.S.，Swindle，M.M.，Vonderfecht，S.L.，Strandberg，J.D.， Luzarraga，M.B.，(1982).Hemorrhagic streptococcal pneumonia in newly procured research dogs.J.Am.Vet.Med.Assoc.181，1371-1374.

Gresham AC，Dixon CE，Bevan BJ.(1996)Domiciliary outbreak of psittacosis in dogs： potential for zoornotic infection.Vet.Rec.138(25)：622-3.

Jang SS，Ling GV，Yamamoto R，Wolf AM.(1984)Mycoplasma as a cause of canine urinary tract infection.J Am Vet Med Assoc 185(1)：45-7.

Karpas，A.，King，N.W，Garcia，F.G.，Calvo，F.和Cross，R.E.(1968a).Canine tracheobronchitis：Isolation and characterization of the agent with experimental reproduction of the disease.Proc Soc Exp Biol Med.127，45-52.

Karpas A，Garcia FG，Calvo F，Cross RE.(1968b)Experimental production of canine tracheobronchitis(kennel cough)with canine herpesvirus isolated from naturally infected dogs. Am J Vet Res.29(6)：1251-7.

Keil，D.J.和Fenwick，B.(1998).Role of Bordetella bronchiseptica in infectious tracheobronchitis in dogs.J Am Vet Med Assoc.15，200-7.

Lambrechts N，Picard J，Tustin RC.(1999)Chlamydia-induced septic polyarthritis in a dog.J.S Afr Vet Assoc.70(1)：40-2).

Lou，T.Y.和Wenner，H.A.(1963).Natural and experimental infection of dogs with reovirus，typel：pathogenicity of the strain for other animals.Am.J.Hyg.77，293-304.

McCandlish，I.A.P.，Thompson，H.，Cornwell，H.J.C.，Wright，N.G.，1978.A study of dogs with kennel cough.Vet.Rec.102，298-301.

McKiernan，B.C.，Smith，A.R.，Kissil，M.，1982.Bacterial Isolates from the lower trachea of clinically healthy dogs.J.Am.Anim.Hospl.Assoc.20，139-142.

Quinn，P.J.，Carter，M.E.，Markey，B.K.，Carter，G.R.，(Eds.)，1999.Clinical Veterinary Microbiology.Mosby.pp.129-130.

Randolph JF，Moise NS，Scarlett JM，Shin SJ，Blue JT，Bookbinder PR.(1993). Prevalence of mycoplasmal and ureaplasmal recovery from tracheobronchial lavages and prevalence of mycoplasmal recovery from pharyngeal swab specimens in dogs with or without pulmonary disease.Am J Vet Res.Mar；54(3)：387-91.

Rosendal，S.(1972).Acta Vet.Scand.13：137.

Rosendal & Vinther(1977).Experimental mycoplasmal pneumonia in dogs：electron microscopy of infected tissue.Acta Pathol Microbiol Scand[B] 85B(6)：462-5.

Rosendal，S.(1978).Canine Mycoplasmas：Pathogenicity of Mycoplasmas associated with distemper pneumonia.J.Infect.Dis.138(2)，203-210.

Sadatsune，T.，Moreno，G.，1975.Contribution to the study of b-haemolytic streptococci isolated from dogs.Ara.Inst.Biol.Sao.Paulo.42，257-264.

Sako T，Takahashi T，Takehana K，Uchida E，Nakade T，Umemura T，Taniyama H.(2002) Chlamydiaal infection in canine atherosclerotic lesions.Atherosclerosis.162(2)：253-9.

Smith J.E.，1967.The aerobic bacteria of the nose and tonsils of healthy dogs.J.Comp. Path.71，428-433.

Storz，J.(1988)Microbiology of Chlamydia.p.168 Ed A.L.Barron，Boca Raton，CRC Press.

Swango LJ，Wooding WL Jr，Binn LN.1970.A comparison of the pathogenesis and antigenicity of infectious canine hepatitis virus and the A26-61 virus strain(Toronto).J Am Vet Med Assoc.1970 Jun 15；156(12)：1687-96.

Thompson H，McCandlish IAP，Wright NG：(1976)Experimental respiratory disease in dogs due to Bordetella bronchiseptica.Res Vet Sci 20：16-23.

Thrusfield，M.V.，Aitken，C.G.G.，Murihead，R.H.，(1991).A field investigation of kennel cough：incubation period and clinical signs.J.Small Anim.Pract.32，215-220.

Timoney，J.F.(1987).The Streptococci.In：Gyles，C.L.，Thoen C.O.，(Eds.)Pathogenesis of bacterial infections in animals.Iowa State University Press.pp.12-13.

Timoney，J.F.，Gillespie，J.H.，Scott，F.W.，Barlough，J.E.，(Eds)，1988.The Genus Streptococcus.In：Hagan and Bruner’s Microbiology and Infectious Diseases of Domestic Animals.Comstock Publishing Associates，London.pp.181-187.

Ural O，Tuncer I，Dikici N，& Aridogan B.(2003).Streptococcus zooepidemicus meningitis and bacteraemia.Scand J Infect Dis.35(3)：206-207.

Walker，J.A.，Timoney，J.F.，(1998).Molecular basis of variation in protective SzP proteins of Streptococcus zooepidemicus.Am.J.Vet.Res.59，1129-1133.

Walker RL & Runyan CA(2003).Identification of variations in SzP proteins of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus and the relationship between protein variants and clinical signs of infection in horses.Am J Vet Res.64(8)：976-81.

Werth D，Schmeer N，Muller HP，Karo M，Krauss H.(1987).Demonstration of antibodies against Chlamydia psittaci and Coxiella burnetii in dogs and cats：comparison of the enzyme immunoassay，immunoperoxidase technic，complement fixation test and agar gel precipitation test Zentralbl Veterinarmed B.34(3)：165-76.

Wood，J.L.N.，Burrell，M.H.，Roberts，C.A.，Chanter，N.，Shaw，Y.，(1993).Streptococoi and Pasteurella spp.associated with disease of the equine lower respiratory tract.Equine Vet.J. 25，314-318.

Young S，Storz J，Maierhofer CA.(1972)Pathologic features of experimentally induced chlamydial infection in dogs.Am J Vet Rse.33(2)：377-83.