铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列
阅读：922发布：2020-08-15
专利汇可以提供铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及检测 铜 绿假单胞菌的方法、 试剂 盒 和寡核苷酸。本发明以种特异性和血清型特异性的方式，快速、灵敏并可靠地检测铜绿假单胞菌。特别是，本发明提供了血清型特异性检测铜绿假单胞菌的方法、铜绿假单胞菌血清型特异性检测试剂盒，以及所述方法和试剂盒中所用的寡核苷酸。本发明还涉及铜绿假单胞菌血清型特异性 抗体 在用本发明的方法或试剂盒确定为特定铜绿假单胞菌血清型的铜绿假单胞菌感染的患者的血清性特异性 治疗 中的用途。，下面是铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列专利的具体信息内容。
1.检测样本中铜绿假单胞菌血清型特异性的方法，包括以下步骤：
a)退火至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物到样本的靶标核苷酸上，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物选自以下构成的组：
(i)含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
(ii)含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
(iii)含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及(iv)含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ IDNo.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
b)扩增靶标核苷酸，并且
c)检测扩增的所述假单胞菌的靶核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中检测步骤包括将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与选自权利要求1所述的至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针选自以下构成的组：
(i)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸，
(ii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸，
(iii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸，以及(iv)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸，
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针被检测标签所标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测标签选自以下构成的组：发光标记物、荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。
6.根据权利要求2至5任一所述的方法，其中铜绿假单胞菌血清型检测通过定量分析、扩增曲线检测或熔解曲线分析的方法进行。
7.根据权利要求1～6任一所述的方法，可同时检测两种或更多种铜绿假单胞菌血清型。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所检测的血清型指铜绿假单胞菌血清型IATS-01、IATS-06、IATS-011和血清组2，其中血清组2包括血清型IATS-02、IATS-05和IATS-016。
9.根据权利要求1～8任一所述的方法，其中所述样本选自以下构成的组：体液如唾液、支气管肺泡灌洗液、气管内吸入物、血液、尿、组织和从细菌培养物中分离的DNA。
10.根据权利要求1～8任一所述的方法，其中所述样本选自食物、土壤和水。
11.根据权利要求1～10任一所述的方法，其中所述样本可被检测的细菌含量在
9
10cfu/ml～10cfu/ml的范围内。
12.根据权利要求1～11任一所述的方法,其中所述方法是种特异性的。
13.一对寡核苷酸，选自以下构成的组：
a.含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
b.含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，，
c.含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
d.含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
e.含有SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
f.含有SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
g.含有SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，和h.含有SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物。
14.一种铜绿假单胞菌血清型特异性检测试剂盒，包括选自以下组中至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物：
a.含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
b.含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，，
c.含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，和
d.含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及
退火所需的试剂，以及可选择的扩增试剂和铜绿假单胞菌血清型特异性检测的指示剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，还包括至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针，该探针可与选自权利要求14所述的至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针选自以下构成的组：
a.包括SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和包括SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，
b.包括SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和包括SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，
c.包括SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和包括SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，,和d.包括SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和包括SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，所述铜绿假单胞菌血清型特异性探针标记有可检测标记。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述的可检测标记选自发光标记物、荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。
19.一种可同时检测铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2的试剂盒，其中血清组2包括血清型IATS-02、IATS-05和IATS-016，所述试剂盒包括权利要求
14中a至d所定义的血清型特异性引物对。
20.如权利要求1或3中所定义寡核苷酸引物或探针在检测铜绿假单胞菌血清型特异性中的用途。
铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法
和试剂盒的寡核苷酸序列
技术领域
[0001] 本发明涉及检测铜绿假单胞菌血清型特异性的方法，铜绿假单胞菌血清型特异性的试剂盒，以及在上述方法或试剂盒中所用的寡核苷酸。本发明进一步涉及用于患有由特定的铜绿假单胞菌血清型导致的疾病的患者的铜绿假单胞菌感染的血清型特异性治疗的铜绿假单胞菌血清型特异性抗体。
[0002] 发明背景
[0003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种在水和土壤中发现的普遍存在的革兰氏阴性环境细菌。它是一种典型的机会致病菌，通常不会对免疫活性宿主构成威胁，免疫活性宿主通过调节抗体和吞噬作用清除它。然而，囊胞性纤维症患者和免疫功能低下的个体-包括烧伤患者、在重症监护病房的气管插管的患者，癌症和艾滋病患者以及接受器官移植的病人，感染医源性感染如感染铜绿假单胞菌的风险特别高。这些患者中严重的感染能迅速致命，由铜绿假单胞菌感染造成的“呼吸机相关性肺炎”的死亡率达33-50%。更重要的是，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性显著提高。例如，抗第三代头孢菌素头孢他啶的铜绿假单胞菌菌株的比例已经从1995年的12％增加到2001年的29％。再加上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)，铜绿假单胞菌在医源性感染中占34％，该感染已经从1975年7.2／1000患者日感染量增加到9.8／1000患者日感染量。
其中最常见的医源性感染形式为血流感染和肺炎。
其中最常见的医源性感染形式为血流感染和肺炎。
[0004] 在抗生素耐药性增加的背景下，用于被动免疫以抗铜绿假单胞菌感染的人类单克隆抗体的运用是一个新的可期待的途径。已经证明，针对革兰氏阴性细菌表面的主要成分-O-抗原特异性碳水化合物的抗体在特异的防止由铜绿假单胞菌引起感染中，是重要的介质。由于O-抗原外部碳水化合物层具有不同的血清型，因此需要有多种血清型特异性抗体，以提供广泛的防止铜绿假单胞菌感染的保护。
[0005] 目前有很多用于区分不同铜绿假单胞菌血清型的方案。通常可接受的国际抗原分型方案(IATS)是基于O-抗原特异性脂多糖(LPS)相关碳水化合物的血清学特性。目前至少已经描述了20种不同的O-抗原血清型。已经证明大多数医源性铜绿假单胞菌感染与特定血清型相关。虽然不同国家之间血清型发病率不同，但流行病学调查表明，血清型IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2(IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16)是最常见的，占铜绿假单胞菌临床分离株的70%。
[0006] 为了采用O-抗原特异的以及类似的血清型特异性抗体治疗铜绿假单胞菌感染的患者，一个基本的要求是：在抗体治疗之前确定感染的铜绿假单胞菌菌株的血清型。为了检测铜绿假单胞菌感染，诊断培养被认为是黄金标准。但是，用传统的细菌培养方法检测假单胞菌需要长达2天时间。不幸的是，培养后的菌落的形状，大小和形态都不能进行血清型识别。血清学方法对于清楚的血清型识别存在较高的错误率。例如，玻片凝聚血清型测定方法不仅耗时，所得的结果在很大程度上依赖于操作者的经验和表述，并且还受到自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制。
[0007] 市场上最可靠的血清分型试剂盒存在约30%的失败率，这些铜绿假单胞菌株由于自凝聚或非凝聚而被归为“不可分类”菌株。这种标准的微生物分析方法在合理的时间范围内可靠识别铜绿假单胞菌以及相关血清型的能力很有限。假如一个患者遭受了由耐抗生素型铜绿假单胞菌引起的感染，用于血清型鉴定的时间非常关键，因为随着持续感染，死亡率会急剧上升。
[0008] 因此，医疗中迫切需要有快速的血清型鉴定方法，以减少诊断与血清型特异性抗体治疗之间的时间。
[0009] 目前，通过生物芯片、微阵列或PCR技术的分子检测已经成为快速鉴定铜绿假单胞菌以及其他导致医源性感染的细菌种类的常规方法。在这些方法的步骤中采用了包含独一无二的、种特异性的标记序列的基因。迄今为止，许多PCR方法通过采用能与例如16S rRNA或23S rRNA的部分区域特异性退火的寡核苷酸序列来靶定系统发育基因和功能基因。然而，采用这些种特异性分析进行特定血清型鉴定是不可能的。
[0010] US20080026370公开了寡核苷酸探针，其用于在一个生物芯片或微阵列上杂交分析铜绿假单胞菌的致病型和基因型，但未公开血清型分型方法。
[0011] WO9741234公开了属于铜绿假单胞菌的LPS O-抗原基因簇的不同基因的特性。提供的是一个通过PCR检测样品中的血清型O1至O20的方法，包括采用一个能够扩增包括编码PsbM(WbpM),或PsbN(WbpN)的核苷酸序列的核苷酸分子的探针来处理样品。未公开用于可靠区分不同铜绿假单胞菌血清型的特异性寡核苷酸序列。
[0012] 因此，现有技术中所知的用于鉴定特定铜绿假单胞菌血清型的方法具有严重的缺点：
[0013] 铜绿假单胞菌的微生物分析方法耗时而且受自凝聚或非凝聚铜绿假单胞菌菌株的限制。已知的用于常规细菌菌株基因型或血清型分析的分子方法不能在细菌种内进行可靠的鉴定和区分。尽管一些基因例如核糖体基因(16S rDNA,23S rDNA)，在不同种之间具有同源性，但是利用代表这些基因的保守寡核苷酸序列进行一个细菌种内的这些血清型分型和鉴定也是不可能的。
[0014] 因此，急需快速可靠的专用于细菌种类以及最常见的铜绿假单胞菌血清型的铜绿3-6 6
假单胞菌血清型检测方法。为了区分细菌定殖(≤10 cfu/ml)和感染(>10cfu/ml)，需要在至少六个数量级的范围内确定铜绿假单胞菌的细菌含量。因此，还需要在一个宽的模板浓度范围内能进行可靠的铜绿假单胞菌的检测分析。
假单胞菌血清型检测方法。为了区分细菌定殖(≤10 cfu/ml)和感染(>10cfu/ml)，需要在至少六个数量级的范围内确定铜绿假单胞菌的细菌含量。因此，还需要在一个宽的模板浓度范围内能进行可靠的铜绿假单胞菌的检测分析。
[0015] 在 单 个 反 应 中 同 时 进 行 几 种 铜 绿 假 单 胞 菌 血 清 型(尤 其 是IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2)的检测在技术上难度很高，由于每种血清型检测的引物对和探针对之间会相互影响，经常导致不能达到临床所需的检测精度。
[0016] 令人惊喜的是，根据本发明已经发现的寡核苷酸，并利用该寡核苷酸的方法和试剂盒，采用血清型特异性引物能够可靠快速地进行铜绿假单胞菌的种及血清型鉴定。
发明内容
[0017] 因此，本发明的技术问题是提供一种快速的、准确的、灵敏的和可靠的特异性检测临床上最常见的铜绿假单胞菌血清型的方法。
[0018] 该技术问题通过提供以下寡核苷酸，以及采用如下定义的寡核苷酸的检测方法和试剂盒来解决：
[0019] 根据本发明，提供一种用于样本铜绿假单胞菌血清型特异性检测的方法，包括如下步骤：
[0020] a)使至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物与样本的一个靶标核苷酸退火，其[0021] 中所述至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性引物选自由以下构成的组：
[0022] (i)含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0023] (ii)含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0024] (iii)含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及[0025] (iv)含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0026] b)扩增靶标核苷酸，并且
[0027] c)检测扩增的所述假单胞菌的靶核苷酸。
[0028] 本文中所用的术语“铜绿假单胞菌血清型”指铜绿假单胞菌外层碳水化合物脂多糖(LPS)中存在的一种特异性O-抗原成分作为血清型特征。在不同的铜绿假单胞菌之间，其外碳水化合物层，特别是O-抗原株明显不同。基于O-抗原的差别，至少有20种不同血清型被报道(Rivera et al.,1992)。最常见的铜绿假单胞菌血清型是血清型IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2(IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16)。
[0029] 本文中所用的术语“血清型特异性检测”指一个或多个上述最常见的铜绿假单胞菌血清型的检测和鉴定。根据本发明，检测是通过扩增技术分析感兴趣的样品。现有技术中描述过很多此类扩增技术，包括聚合酶链反应(PCR)技术或连接酶链反应(LCR)技术。对于本领域技术人员而言，使用该类扩增技术是常规工作，并且在本文中表示与扩增有关的技术。优选的基因扩增技术是PCR,更优选的是实时定量PCR(real-time PCR)，最优选的是多重实时定量PCR(real-time PCR)或基于LightCycle的实时定量(多重)PCR。
[0030] 本文中所用的术语“引物”、“寡核苷酸引物”或“引物对”指用于前文提及的扩增技术以扩增DNA靶标序列的短寡核甘酸(典型的10-50bp,优选15-35bp)。本发明的引物指SEQ ID Nos 1～8任一所示的核苷酸序列的分子中至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个连续核苷酸。.本文所定义的引物或寡核苷酸引物采用现有技术合成而得，例如磷酸三酯法或磷酸二酯法(Gait et al.,1980)，或自动合成法(Conolly，1987)。
[0031] 本文所用的术语“铜绿假单胞菌血清型特异性引物”指在被置于允许核苷酸序列扩增的条件时能够作为合成起始位点的引物，其与编码血清型特异性靶点(如O-抗原位点)的DNA对应或者互补。允许引物延伸产物合成的条件包括存在核苷酸底物、聚合剂(如DNA聚合酶)和适合的温度、pH。优选的引物不会与引物的其它拷贝发生碱基配对，并且不会形成发卡结构的那些引物。所述引物的长度约10-50个核苷酸，优选15–35个核苷酸。
[0032] 本发明提供如上所述的一种方法，其中所述检测步骤还包括将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与所述至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤。所述退火步骤选自本文定义的方法中的退火步骤a)。杂交技术是现有技术，例如在Sambrook J,Fritsch EF，Maniatis T.in:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,1989(Nolan C,Ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.中有实例的描述。
[0033] 根据一个优选实施例，所述“将至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针与所述至少一对退火的铜绿假单胞菌血清型特异性引物的序列杂交的步骤。所述退火步骤选自本文定义的方法中的退火步骤a)”中，所述杂交探针选自以下构成的组：
[0034] (i)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸，
[0035] (ii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸，
[0036] (iii)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸，以及[0037] (iv)第一寡核苷酸探针包括SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸，且第二寡核苷酸探针包括SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸。
[0038] 本文中所用的术语“探针”，“寡核苷酸探针”，“杂交探针”指用于通过杂交检测扩增的靶标核苷酸序列的任何核苷酸序列。本发明所述的探针指短寡核苷酸(典型的为10-50bp,最好是15-35bp)。此处所用的所述探针是具有SEQ ID Nos 9～16中任一所示的核苷酸序列中至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个连续核苷酸的分子。所述探针或寡核苷酸探针可通过现有技术合成而得。所述探针可以连接，最好是共价连接入至少一个用于检测扩增产物的检测标签。
如果对一种血清型具有特异性，并且能够杂交到第一引物退火序列上，这样的“寡核苷酸探针”代表合适的杂交探针。
如果对一种血清型具有特异性，并且能够杂交到第一引物退火序列上，这样的“寡核苷酸探针”代表合适的杂交探针。
[0039] 本文所用的术语“可检测标签”不存在任何特殊限制。所述可检测标签可以选自包括放射性标记、发光标记、荧光染料、具有酶活性的化合物、磁性标签、抗原，以及与可检测标签具有高亲和力的化合物。适合的放射性标记有P-32,S-35,I-125,和H-3；适合的发光标记物有化学发光化合物、优选鲁米诺；适合的荧光标记物优选丹磺酰氯、fluorcein-5-异硫氰酸酯4-氟-7-硝基苯基-2-氮杂-1,3二唑(4-fluor-7-nitrobenz-2-aza-1,3diazole)；适合的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、α-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶或生物素。
[0040] “实时定量PCR”,涉及到一个适合自动设置和数据分析的单一步骤的密闭管方法，根据本发明的一个优选的实施例，采用了基于LightCycler的实时定量PCR。以实时定量PCR为基础的程序可同时具有初步诊断和目标定量的能力。
[0041] 在一个优选实施例中，用于扩增步骤的一套特定的寡核苷酸序列(“寡核苷酸引物”)与一套特定的寡核苷酸序列(“寡核苷酸探针”)联合使用，以进一步提高特异性。在一个最优选的实施例中，所述引物对和所述探针对选自以下寡核苷酸引物对和探针对序列中的一个或多个：
[0042] (i)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO:1和2所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO:9和10所示的序列；
[0043] (ii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO:3和4所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO:11和12所示的序列；
[0044] (iii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO:5和6所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO:13和14所示的序列；和
[0045] (iv)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO:7和8所示的序列，并且所述寡核苷酸探针序列具有如SEQ ID NO:15和16所示的序列.。
[0046] 在本发明一个优选的实施例中，检测铜绿假单胞菌血清型的步骤按以下操作：
[0047] ·定量分析，其中细菌含量通过与已知细菌浓度的标准曲线进行对比而得出；
[0049] ·和／或熔解曲线分析，其中PCR扩增而合成的每个产物具有各自的熔解温度。
[0050] 本发明的杂交探针提供最高水平的特异性并且允许a)通过对比标准曲线对细菌含量进行定量；b)在线观察血清型特异性扩增；或者c)通过分析熔解曲线鉴定血清型。
[0051] 本发明的方法具有多种实际应用。例如，所述方法可对任何疑似含有较宽拷贝数量范围的铜绿假单胞菌，如来自医疗的，兽医的或环境的样本单独或同时检测最常见的铜绿假单胞菌血清型IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2(IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16)。对于感兴趣的样本中的一种血清型特异性的检测，采用两套寡核苷酸序列：2个引物(正向的=fwd和反向的=rev)和2个探针。在本发明的一个实施例中，提供一种检测方法，其中可同时检测两个或更多铜绿假单胞菌血清型，也称为多价或多重检测。对于例如上述提到的4种最常见的铜绿假单胞菌血清型的特异性检测，在一个检测(四价检测)中采用了4对引物和4对探针。优选地，检测的铜绿假单胞菌血清型是最常见的血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016。引物(正向的=fwd，反向的=rev)和探针可同时用在一个步骤中，或连续用在两个单独步骤中。
[0052] 最优选的是本文定义的寡核苷酸序列在“四价LightCycler检测(4-valent LightCycler assay)”中的用途。术语“四价LightCycler检测”指允许同时进行4种铜绿假单胞菌血清型检测的检测，尤其是允许平行检测四种最常见的血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和铜绿假单胞菌血清组2。此方法在单个反应中显示出非常高的特异性和敏感性。但是用四价LightCycler检测可以降低不可分类菌株的量，并且所述四价检测的效果已经通过直接测定来自临床支气管肺泡(broncho-alveolar lavage，BAL)灌洗液的样本的菌株量得到了验证。在基于LightCycler的实时PCR中，扩增和检测在一个封闭的玻璃毛细管中进行，避免扩增产物交叉污染。所述LightCycler达到高速热循环是通过风扇驱动空气而不是用加热块传导方式。这样，约一个小时内就可获得四价铜绿假单胞菌血清型测验的结果。
[0053] 根据本发明的铜绿假单胞菌的检测方法，特别是采用上述四价血清分型测验可以用于分离的细菌DNA，或直接检测来自临床的样品如唾液、支气管肺泡灌洗液或气管内吸入物，通常用超纯水稀释后再检测。样本优选从人(例如患肺疾病的人)的肺灌洗物中直接获得。临床样本也可以包括取自人体的物质如血液、尿、组织等。典型地，样本可取自伤口、烧伤、肺和人或动物感染的泌尿道。铜绿假单胞菌也可在食物、土壤或水样本中检测出。
[0054] 在铜绿假单胞菌感染的肺炎患者中，用常规方法可检测到10cfu/ml～109cfu/ml的细菌含量。在临床常规中，根据获得呼吸道分泌物的方法(如肺泡灌洗物、气管样本等)，已经对铜绿假单胞菌寄定殖或急性感染的临界点的定义有不同的说明。临界点规定为，小3-6 6
于等于10 cfu/ml是细菌定殖，大于10cfu/ml是感染(比如是肺炎)，因此需要测定的细菌含量至少要超过6个数量级的范围。所以需要提供一种诊断方法，可以可靠地鉴定较宽的模板浓度范围内的铜绿假单胞菌血清型。
于等于10 cfu/ml是细菌定殖，大于10cfu/ml是感染(比如是肺炎)，因此需要测定的细菌含量至少要超过6个数量级的范围。所以需要提供一种诊断方法，可以可靠地鉴定较宽的模板浓度范围内的铜绿假单胞菌血清型。
[0055] 出人意料地，根据本发明，可以在模板浓度宽范围的样本中进行铜绿假单胞菌血9
清型检测。在本发明的一个实施例中，样本中的细菌含量在10cfu/ml到10cfu/ml范围内
2 8 3 8 4
是可检测的，或在10cfu/ml到10cfu/ml的范围内，或10cfu/ml到10cfu/ml，10cfu/ml
8
到10cfu/ml。
清型检测。在本发明的一个实施例中，样本中的细菌含量在10cfu/ml到10cfu/ml范围内
2 8 3 8 4
是可检测的，或在10cfu/ml到10cfu/ml的范围内，或10cfu/ml到10cfu/ml，10cfu/ml
8
到10cfu/ml。
[0056] 根据本发明另一实施例，所述检测是种特异性的。除另外指出，本文所用的术语“种特异性”指铜绿假单胞菌种的特异性。尤其是，“种特异性检测”指经常发生的微生物(细菌，真菌或病毒)，而不是铜绿假单胞菌时，例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),大肠埃希氏菌(Chlamydophila pneumonia),肺炎衣原体(Enterobacter aerogenes),产气肠杆菌(Enterobacter cloacae),阴沟肠杆菌(Escherichia coli),产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans),嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia),松脆厌气杆菌(Bacterioides fragilis),巴尔通体(Bartonella henselae),百日咳杆菌(Bordetella pertussis),伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，人心杆菌(Cardiobacterium hominis),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza),嗜肺军团菌(Legionella pneumophila),单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes),卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis),摩氏摩根菌(Morganella morganii),脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides),成团泛菌(Pantoea agglomerans),牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis),普氏菌齿垢(Prevotella denticola),普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，肠粪球菌(Enterococcus faecalis)，肠屎球菌(Enterococcus faecium),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus),肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia),无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes),缓症链球菌(Streptococcus mitis),蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens),杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium),溶血孪生球菌(Gemella haemolysans),组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum),偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum),结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),肺炎分枝杆菌(Mycoplasma pneumonia),大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus),痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes),烟曲霉(Aspergillus fumigatus),白色念珠菌(Candida albicans),光滑念珠菌(Candida glabrata),克柔念珠菌(Candida krusei),近平滑念珠菌(Candida parapsilosis),热带念珠菌(Candida tropicalis),新型隐球菌(Cryptococcus neoformans),腺病毒(Adenoviruses),疱疹病毒(Herpesviruses),正粘病毒(Orthomyxoviruses),Paramycxoviruses和小核糖核算病毒(Picornaviruses)用本发明的检测方法、试剂盒以及寡核苷酸检测不出来。
[0057] 本发明还提供了一对能够从上述IATS 01,S2(血清组2包括IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16),IATSO6,和IATS O11中特异性检测一种或多种铜绿假单胞菌血清型的寡核苷酸。其中，所述成对的第一和第二寡核苷酸是SEQ ID Nos：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、
11和12、13和14，或15和16所示的核苷酸序列中至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个连续核苷酸如。特别地，本发明提供的寡核苷酸对选自以下组成的组：
11和12、13和14，或15和16所示的核苷酸序列中至少10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34或35个连续核苷酸如。特别地，本发明提供的寡核苷酸对选自以下组成的组：
[0058] a)含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0059] b)含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0060] c)含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0061] d)含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0062] e)含有SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0063] f)含有SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，
[0064] g)含有SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸，和
[0065] h)含有SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸和含有SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸。
[0066] 本发明的寡核苷酸具有以下表1中所示的技术特征：
[0067] 表1
[0068]SEQ ID NO 温度值(°C)*1 GC含量(%)
1 60.0 42.9
2 56.0 55.6
3 54.0 58.8
4 54.0 58.8
5 56.0 47.4
6 60.0 50.0
7 52.0 52.9
8 60.0 42.9
9 64.0 60.0
10 95.0 44.1
11 50.0 66.7
12 95.0 42.9
13 52.0 62.5
14 52.0 62.5
15 66.0 57.1
16 86.0 43.3
17 95.0 44.1
1 60.0 42.9
2 56.0 55.6
3 54.0 58.8
4 54.0 58.8
5 56.0 47.4
6 60.0 50.0
7 52.0 52.9
8 60.0 42.9
9 64.0 60.0
10 95.0 44.1
11 50.0 66.7
12 95.0 42.9
13 52.0 62.5
14 52.0 62.5
15 66.0 57.1
16 86.0 43.3
17 95.0 44.1
[0069] *1根据"2+4规则"(A/T核苷酸=2°C,G/C核苷酸=4°C)计算熔点
[0070] 根据本发明的核苷酸序列能够特异地确定假单胞菌血清型IATS 01、S2(包括IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16的血清组2)、IATS O6,、IATS O11。本发明方法所用优选的寡核苷酸为下述表2所示的引物和探针：
[0071] 表2
[0072]
[0073] 本文定义的引物的联合作用能够使适合的靶标基因的血清型特异性扩增，随后或同时通过相应的杂交探针进行血清型特异性检测。
[0074] 本发明采用的用于血清型特异性引物／探针对设计的所述靶标基因属于所述铜绿假单胞菌脂多糖O-抗原基因簇，是命名为wzz和GtGr4的基因。血清型IATS 01,S2(包括IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16的血清组2),IATS O6,IATS O11wzz和GtGr4的靶标基因的序列如序列表中SEQ ID NO:18到21所示。
[0075] 铜绿假单胞菌血清型IATS-O1的靶标基因如SEQ ID NO:18所示:并且能够通过NCBI AccessionAF498400;版本AF498400.1;阅读框_4;区域:1284-2321阅读框_4;wzz查到，相同链长度确定蛋白。
[0076] 血清组2(铜绿假单胞菌血清型IATS-O2,IATS-O5,和IATS-O16;三种血清型序列相同)的靶标基因如SEQ ID NO:19所示，并可通过NCBIAccessionAF498412、版本AF498412.1;阅读框_19;区域:18769至19788阅读框_19；GtGr4查到;与糖基转移酶4组相似；潜在的复合跨膜结构域。
[0077] 铜绿假单胞菌血清型IATS-O6的靶标基因如SEQ ID NO:20所示。并且可通过NCBI AccessionAF498417;版本AF498417.1;阅读框_14;区域:12654-13694,阅读框_14;GtGr4查到;与糖基转移酶4组相似；潜在的复合跨膜结构域。
[0078] 铜绿假单胞菌血清型IATS-O11的靶标基因如SEQ ID NO:21所示并且可通过NCBI AccessionAF498402;版本AF498402.1;阅读框_13;区域:11073-12098,阅读框_13;GtGr4;与糖基转移酶4组相似；潜在的复合跨膜结构域查到。
[0079] 已经确定，所述脂多糖-O-抗原簇为具有高度遗传变异性的区域，并且推测所鉴定和决定的序列提供了机会：可以开发基于PCR方法的DNA序列，用以区分铜绿假单胞菌血清型(Raymond等,2002)。Raymond与其合作者一共从20种铜绿假单胞菌血清型中鉴定出11组O-抗原基因决定簇。尽管该作者声称，每个基因簇在DNA序列的水平上都显示了与另一个基因簇之间有高度差异，但是本发明人却发现，大多数潜在靶标基因的DNA差异太小以至不能进行血清型特异型寡核苷酸设计。而且经证实，由于缺少血清型特异性、灵敏度低，低信号强度或使用的模版浓度的强烈的信号变化等原因，即使在少数最高度变异的基因所设计的大多数寡核苷酸也不能使用。
[0080] 适于本发明检测使用的试剂可包装在方便的试剂盒中，用合适的容器装入必需的材料。
[0081] 这样的试剂盒可包括所有的检测铜绿假单胞菌血清型所需的试剂，优选的试剂是IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2(IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16)，本发明方法所述的检测样品，以及任何适合进行本发明操作方法的有用试剂。优选地，本发明的试剂盒也包括合适的阳性和／或内参靶标核苷酸序列，以及用作阴性对照的核苷酸序列或水。
[0082] 本发明的方法和试剂盒具有很多实际的用途。例如，本发明的方法和试剂盒可用于在任何疑似含有铜绿假单胞菌的医疗的、兽医的或环境的样本中，同时检测铜绿假单胞菌血清型IATS-O1,IATS-O6,IATS-O11和血清组2(IATS-O2,IATS-O5,IATS-O16)。
[0083] 所述试剂盒中还包括毒力和抗性标记的试剂和对照物。
[0084] 根据另一个优选的实施例，本发明提供了一个进行所定义的铜绿假单胞菌血清型特异性检测的试剂盒。所述试剂盒包括至少一个铜绿假单胞菌血清型特异性引物对，引物对选自以下构成的组：
[0085] i.含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0086] ii.含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物,
[0087] iii.含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，和[0088] iv.含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，以及[0089] 退火所需的试剂，以及可选择的扩增试剂和／或铜绿假单胞菌血清型特异性检测的指示剂。
[0090] 用于此试剂盒 的试剂有含DAN或RNA扩增 酶的酶溶液，含净化 酶2+
(decontamination enzyme)的酶溶液，含Mg 、dNTP混合物，和/或所述引物和杂交探针混合物的缓冲溶液，适合的阳性和／或内参，以及作为阴性对照的核苷酸序列或水。
(decontamination enzyme)的酶溶液，含Mg 、dNTP混合物，和/或所述引物和杂交探针混合物的缓冲溶液，适合的阳性和／或内参，以及作为阴性对照的核苷酸序列或水。
[0091] 在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒还包括至少一对铜绿假单胞菌血清型特异性探针，该探针杂交到所述至少一对血清型特异性引物退火上去的序列。
[0092] 优选地，所述至少一对所述铜绿假单胞菌血清型特异性杂交探针选自以下构成的组：
[0093] (i)含有SEQ ID No.9所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和含有SEQ ID No.10所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，
[0094] (ii)含有SEQ ID No.11所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和含有SEQ ID No.12所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，
[0095] (iii)含有SEQ ID No.13所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和含有SEQ ID No.14所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针，和[0096] (iv)含有SEQ ID No.15所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸探针和含有SEQ ID No.16所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸探针。
[0097] 最优选的，本发明的试剂盒包含一个或多个选自以下寡核苷酸序列对的引物和探针对：
[0098] (i)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列，并且所述寡核苷酸探针具有如SEQ ID NO：9和10所示的核苷酸序列；
[0099] (ii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO：3和4所示的核苷酸序列，并且所述寡核苷酸探针具有如SEQ ID NO：11和12所示的核苷酸序列；
[0100] (iii)所述寡核苷酸引物具有如SEQ IDNO：5和6所示的核苷酸序列，并且所述寡核苷酸探针具有如SEQ ID NO：13和14所示的核苷酸序列；和
[0101] (iv)所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列，并且所述寡核苷酸探针具有如SEQ ID NO：15和16所示的核苷酸序列。
[0102] 本发明的试剂盒还可包括在PCR中扩增核苷酸分子或预设的片段所需的试剂，以及扩增序列所用的工具。
[0103] 本发明的试剂盒中所含的血清型特异性探针用可检测标签标记。优选地，可检测标签选自：发光标记、荧光标记、放射性标记物和酶标记物。
[0104] 在一个优选的实施例中，本发明提供一个同时检测铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2的试剂盒，其中血清组2包括血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016，该试剂盒中具有本文上述定义的血清型特异性引物对，优选的引物对选自如下构成的组：
[0105] a.含有SEQ ID No.1所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.2所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0106] b.含有SEQ ID No.3所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.4所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物，
[0107] c.含有SEQ ID No.5所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.6所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物,以及
[0108] d.含有SEQ ID No.7所示序列中至少10个连续核苷酸的第一寡核苷酸引物和含有SEQ ID No.8所示序列中至少10个连续核苷酸的第二寡核苷酸引物。
[0109] 在一个优选实施例中，本发明的试剂盒能够同时特异地检测铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016。
[0110] 本发明还包括血清型特异性抗体在更有效的治疗铜绿假单胞菌感染中的用途，所治疗的患者是被诊断为被所述特定的铜绿假单胞菌血清型感染的。
[0111] 本发明提供特异性抗体的用途，针对铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2的中一种或多种，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016，该用途是用于制备治疗铜绿假单胞菌感染的药物。
[0112] 因此，本发明的一个优选的实施例中提供了特异针对一个或多个铜绿假单胞菌血清型抗体的用途：制备治疗铜绿假单胞菌感染的药物，治疗对象是是根据本发明的方法检测出的特定的铜绿假单胞菌血清型的患者；所述血清型包括IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2的，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016。
[0113] 在另一实施例中，本发明提供了用于治疗铜绿假单胞菌感染的抗体，特异针对铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2中的一种或多种，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016。
[0114] 在一个优选实施例中，本发明提供了一个特异性抗体，针对铜绿假单胞菌血清型IATS-01,IATS-06,IATS-011和血清组2中的一种或多种，其中血清组2包含血清型IATS-02,IATS-05和IATS-016，用于治疗根据本发明的方法检测出的特定的铜绿假单胞菌血清型的患者的铜绿假单胞菌感染。
[0115] 本发明进一步提供了上述定义的寡核苷酸引物或探针的用途，用于铜绿假单胞菌血清型特异性检测。
[0117] 图1经LightCycler熔解曲线分析对阳性血清型检测后，所得的4价绿脓假单胞菌血清分型测验结果的示意图。
[0118] 图2表明检测到的Tm值具有再现性。
[0119] 图3显示了非功能性引物或探针组合的典型Tm值。
具体实施方式
[0120] 材料和方法
[0121] 基于LightCycler的4价铜绿假单胞菌血清型分型试验
[0122] 4价铜绿假单胞菌血清型分型试验通过一种称为熔解曲线分析的函数，能够提供扩增产物的血清型特异序列的确认。在每个PCR循环最后，加热室的温度缓慢上升。在这个过程中，频繁地测定每个毛细管中的荧光，可以密切监控扩增DNA的溶解作用。温度一升高荧光就减弱，因为当其中一个探针释放时FRET(荧光能量共振转移)终止。为说明溶解曲线分析，绘制了样品荧光的一阶负导数对比温度图，并呈现出每个样品的熔解温度峰。替换探针的温度可以变化很大，取决于它们的序列、长度和GC含量，甚至一个核苷酸不同就可以改变熔解温度。因此，熔解温度曲线图可以用于鉴定特异的DNA产物。用本发明的引物和探针进行4价铜绿假单胞菌血清型分型试验后进行熔解曲线分析，通过将该样品熔解温度(Tm)与阳性对照扩增产物的熔解温度进行比较，可以确定来自未知的临床样品的PCR产物的铜绿假单胞菌血清型。在图1所示的举例中，描述了在典型的检测通道中铜绿假单胞菌血清型IATS-O1、IATS-O6、IATS-O11及血清组2的血清型特异的Tm值。
[0123] 当然，不易控制PCR的大量倍增，并且查找多基因靶标需要多重反应。在基于LightCycler的实时PCR中，一种光学装置解决了这个问题。该装置能够同时测量不同通道中的荧光，因此可以对一个样品中多于一个的靶标序列进行分析。为了能够在一个反应中同时检测多个铜绿假单胞菌血清型(优选IATS-O1、IATS-O6、IATS-O11及血清组2)，在4价铜绿假单胞菌血清型分型试验中可以使用多个分别标记上独特颜色的探针及多个引物。
[0124] 这样的反应复杂程度更高，因此为获得特异的和可靠的结果，确定适宜的反应条件十分关键。然而，这种多元分析只有在周密选择反应参数的情况下才会特异和灵敏。试验设计的标准例如：
[0125] ·引物设计
[0126] ·(杂交)探针设计
[0127] ·靶标浓度
[0128] ·待测样品中非特异的残留DNA(污染)
[0129] ·来自不同生物基质的样品准备(例如，来自支气管肺泡的灌洗物)[0130] 靶标基因识别
[0131] 为了识别靶标基因，从genebank网站上下载了不同铜绿假单胞菌血清型的组成O抗原基因位点的开放阅读框(ORF)，并用Clustal似然法(Chenna et al.,2003)进行比较。在第一轮的筛选过程中，排除不存在于指定血清型的O抗原基因位点的ORF或多次出现的ORF。在第二步中，排除不具有足够序列多样性的ORF以及对于引物/探针设计的试验来说序列太短的ORF。采用这样的选择标准，在28个ORF中似乎只有4个适合于引物/探针设计。基于genebank的铜绿假单胞菌O抗原基因簇数据，在剩下的这4个ORF中(天冬酰胺酸合酶及氧化还原酶家族烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合的罗斯曼折叠蛋白)，有两个ORF被认为仅存在于有限数量的血清型中。然而，设计引物/探针后，结果是从两个基因中都出现与血清型无关的PCR扩增。推断出的结论是，这些基因的拷贝都在各个血清型的O抗原基因位点之外，因此这些基因不适合于血清型的分型。
[0132] 引物/探针设计
[0133] 为特异性检测铜绿假单胞菌分离物的血清型，需要特异的引物/探针寡核苷酸。为设计这样的序列，使用了LightCycler Probe Design Software 2.0(Roche Applied Science)设计软件。首先，将两个剩下的靶标基因(wzz，与链长度决定蛋白相似；GtGr4，与糖基转移酶4相似)的序列数据输入此软件，然后进行自动分析，按照选择的设计参数，软件对产生的引物/探针序列进行评价。关于本发明中所述引物对/探针对，使用了几种预先安排的设计：用于定量PCR的引物/探针集、用于溶解曲线分析的引物/探针集，以及用于多重PCR检测的引物/探针集。在接下来的一个步骤中，设计的引物/探针对将被直接提交到NCBI网站上检验可能存在的交叉互补。
[0134] 在完成设计过程后，产生的核苷酸序列最初只经过数量非常有限的细菌分离物检验。结果表明对于选取的引物/探针对初次评估，测量不同稀释度的铜绿假单胞菌参考株系是最有意义的实验。在这些条件下，设计的试验大多数既不产生可靠的血清型检测信号，也不能使检测足够灵敏。然而，在大范围模板浓度中可靠的和稳定的血清型检测具有很高的临床实用性，是成功设计诊断试验的必要的先决条件。
[0135] 因此，要立即排除不能满足这些要求的引物/探针对。
[0136] 汇总这些软件程序设计的引物/探针时，可得到许多能满足好的引物和探针设计一般性要求的寡核苷酸序列(例如，不具有分子内序列同源性、模板上单一的退火位点、扩增子大小、理想的熔解温度，等等)。但得到的引物/探针对中许多不能用作可靠的血清型鉴定，因为检测信号太多变化、缺乏血清型特异性或不够灵敏。
[0137] 为了提供一种能够同时检测四种铜绿假单胞菌血清型的多元试验方法，将满足相同反应条件、血清型和物种特异性及分析灵敏度所有这些条件的四个独立的血清型分型试验(IATS-O1、IATS-O6、IATS-O11及血清组2检测)的引物/探针对结合在一个反应中。在这个阶段，几个试验的引物/探针对必须在基于软件设计的基础上进行改良(例如，通过在探针对之间获得间距而优化血清组2的特异性探针，提高信号的强度；通过缩短和扰乱其中一个探针而改良IATS-O11的特异性探针，防止不同检测通道之间信号相互干扰)。
[0138] 经过最终改良后，4价形式的铜绿假单胞菌血清型分型试验能够在每个反应中重2 9
复地检测到10至107个特异的基因拷贝(相当于每毫升10 至10 个基因拷贝)。如此特异的血清型鉴定同样可以在两个不相关的铜绿假单胞菌血清型或其它物种DNA(例如，细
6 8
菌、真菌和病毒)中进行，每个反应中检测到多达10 个基因拷贝(相当于每毫升10 个基因拷贝)。
复地检测到10至107个特异的基因拷贝(相当于每毫升10 至10 个基因拷贝)。如此特异的血清型鉴定同样可以在两个不相关的铜绿假单胞菌血清型或其它物种DNA(例如，细
6 8
菌、真菌和病毒)中进行，每个反应中检测到多达10 个基因拷贝(相当于每毫升10 个基因拷贝)。
[0139] 要意识到这些引物/探针可能包含非互补序列，条件是有足够量的引物/探针含有与分析样品中的待扩增核酸分子或其寡核苷酸片段互补的序列。引物中也可以包含限制性位点接头，可以使用合适的限制酶酶切扩增产物，便于扩增产物的克隆和测序。
[0140] 通常，PCR(实时)的反应条件取决于引物长度和构成、模板浓度、待扩增的DNA片2+
段长度、热稳定DNA聚合酶的性质以及镁(Mg )浓度。本领域中每个普通技术人员用常用技术都能容易确定以上每一个参数。
段长度、热稳定DNA聚合酶的性质以及镁(Mg )浓度。本领域中每个普通技术人员用常用技术都能容易确定以上每一个参数。
[0141] 在大多数情况下，扩增的DNA用琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色和UV照射进行检测。为提高PCR反应的灵敏性或提供更快地结果，可以对一个或两个寡核苷酸引物和探针如上述一样标记，或者可以在扩增的DNA聚合反应中加入标签。标记的DNA产物可以在扩增时在线分析，由此不需要进行凝胶电泳结果分析。
[0142] 实施例1：微生物学样品
[0143] 为改良4价铜绿假单胞菌血清型分型试验，使用了16个参考株系和94份临床分离物。参考株系从巴斯德研究所(法国巴黎)或比利时细菌保藏中心BCCM(Belgium bacteria collection BCCM，根特，比利时)获得。临床分离物从瑞士的巴塞尔、伯尔尼、苏黎世或德国的耶拿的大学医院以及多国对囊胞性纤维症的临床研究中获得。
[0144] 为了对改良的4价铜绿假单胞菌血清型分型试验和商用凝集试验进行比较，用了将近五百份从美国、德国、希腊和比利时大约20家医院收集的呼吸道铜绿假单胞菌分离物。
[0145] 实施例2：样品准备
[0146] 2.1测量纯化的细菌DNA
[0147] 每个参考株系和临床分离物在5ml脑心浸液培养基BHI(自BD Bioscience)中37°C培养过夜。利用高纯度PCR模板制备试剂盒(自Roche Diagnostics)将细菌的DNA从细菌细胞颗粒中分离出来。在用于PCR之前，将所有DNA样品的DNA贮存液制备成20ng/μl标准液。用超纯水(自Roche Diagnostics)将DNA贮存液按1:10连续稀释为工作液。
每份DNA工作液取5μl作为模板溶液。
每份DNA工作液取5μl作为模板溶液。
[0148] 2.2从细菌培养物测量
[0149] 将参考株系和临床分离物平铺在BHI琼脂平板上(自BD Bioscience)。37°C过夜培养后，将一个接种环的细菌溶于500μl超纯水(自Roche Diagnostics)中。每份细菌稀释液取8μl作为模板溶液。
[0150] 2.3从支气管肺泡的灌洗(BAL)样品中测量
[0151] 在处理的BAL样品中纯化的细菌DNA呈絮状，浓度为每个反应中103和106个基因拷贝。BAL样品从伯尔尼大学医院获得。在用于PCR之前，将絮状BAL样品以1:3用痰消化液(Sputasol，Oxiod)稀释，然后在36°C孵育30min使其溶解。最后用超纯水(自Roche Diagnostics)以1:100稀释絮状的和溶解的BAL样品。每份处理后的BAL样品取8μl作为模板溶液。
[0152] 实施例3：引物和试验设计
[0153] 3.1靶标基因的筛选
[0154] 表3：用于设计血清型特异性的引物/探针对的靶标基因
[0155]
[0156] 3.2引物和探针序列设计
[0157] 用软件LightCycler Probe Design Software 2.0(自Roche Applied Science)设计引物/探针寡核苷酸。在软件设计的基础上，通过在探针对之间获得间距从而优化血清组2的特异性探针，通过缩短和扰乱传感探针从而改良血清型O11的特异性探针。
[0158] 表4：4价铜绿假单胞菌血清型分型试验-引物和探针序列
[0159] 为了在一份待测样品中特异性检测一种血清型，用两组寡核苷酸序列：2个引物和2个探针。为特异性检测例如上述4种最流行的铜绿假单胞菌血清型，在一次实验中用了多个引物和探针。
[0160]
[0161] 实施例4：PCR条件、试验组分和试验对照
[0162] 表5a 4价铜绿假单胞菌血清型分型试验-PCR条件
[0163]
[0164] 表5b 4价铜绿假单胞菌血清型分型试验-试验材料
[0165] 用本发明所述试验对铜绿假单胞菌进行血清型特异性检测，可以使用引物、探针寡核苷酸以及内部对照和阳性对照，结合通用的试剂盒LightCycler FastStart DNA Master HybProbe Kit(Roche Diagnostics；目录号03 003248 001)及去污染酶LightCycler尿嘧啶-DNA转葡糖基酶(Roche Diagnostics;Cat.No.03539806 001)。
[0166]
[0167]
[0168] 表6 4价铜绿假单胞菌血清型分型试验-PCR阳性对照和内部对照
[0169] 为构建内部对照和阳性对照质粒，将由4价LightCycler试验检测到的所有扩增子从参考菌株或临床分离物中PCR扩增出来。PCR扩增后，纯化得到的DNA片段并在限制性位点BamHI/SacI克隆进质粒pT3T7BM(自Roche Diagnostics)中。最后通过DNA测序鉴定成功克隆的对照质粒。
[0170]
[0171] 实施例5:
[0172] 根据本发明引物和探针适合临床流行的铜绿假单胞菌血清型(IATS-O1、血清组2(IATS-O2、IATS-O5、IATS-O16)、IATS-O6及IATS-O11的特异性检测。
[0173] 表7.铜绿假单胞菌血清型分型试验
[0174] 用4价铜绿假单胞菌血清型分型试验检测分别代表4种特异的铜绿假单胞菌血清型IATS-O1、血清组2(IATS-O2、IATS-O5、IATS-O16)、IATS-O6及IATS-O11的六种参考菌株和72份临床分离物，具有100%的灵敏性和准确性。基于4价铜绿假单胞菌血清型分型试验设计，属于任何一种可检测的血清型的菌株总是会产生一种特异的(阳性)血清型检测信号。但在多元分析的4价试验中，其它血清型分型试验则产生3个阴性信号。任何阴性血清型分型试验的内部对照检测均为阳性，并且可以排除任何PCR方法的不足。所有的786
个DNA样品在大约10 个拷贝/反应的浓度下检测。
个DNA样品在大约10 个拷贝/反应的浓度下检测。
[0175]
[0176]
[0177]
[0178] 1：灵敏性：检测到的分离物数量/试验的分离物数量
[0179] 2：准确性：准确检测到的分离物数量/检测到的分离物数量
[0180] 实施例6：本发明中与其它血清型的铜绿假单胞菌菌株没有表现出交叉反应性的引物/探针
[0181] 表8：铜绿假单胞菌血清型分型试验
[0182] 铜绿假单胞菌血清型分型试验表明：不与参考菌株和另外10种铜绿假单胞菌血清型IATS-O3、IATS-O4、IATS-O7、IATS-O8、IATS-O9、IATS-O10、IATS-O12、IATS-O13、IATS-O14及IATS-O15临床分离物表现出交叉反应性。所有的DNA样品在大约106拷贝/反应的浓度下检测。为了排除样品中含有的潜在PCR抑制剂导致的阴性血清型分型结果的可能性，在每个进行的反应中加入了内部对照溶液。由于内部对照在所有的32个研究的血清型样品中都成功检测到，因此可以排除任何PCR抑制。
[0183]
[0184]
[0185] 实施例7:本发明的引物是物种特异的
[0186] 表9：铜绿假单胞菌血清型分型试验
[0187] 铜绿假单胞菌血清型分型试验的物种特异性通过对58种细菌、真菌和病毒微生物的测量而得到证明。微生物样品从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)及比利时微生物保藏中心(Belgian Co-ordinated collections of Microorganisms，BCCM)获得。所有评估的DNA样品与4价铜绿假单胞菌血清型分型试6
验均未表现出交叉反应性。所有DNA样品在大约10 拷贝/反应的浓度下测验。为了排除样品中含有的潜在PCR抑制剂导致的阴性血清型分型结果的可能性，在每个进行的反应中加入了内部对照溶液。由于内部对照在所有的58个用于调查的血清型样品中都成功检测到，因此可以排除任何PCR抑制。
验均未表现出交叉反应性。所有DNA样品在大约10 拷贝/反应的浓度下测验。为了排除样品中含有的潜在PCR抑制剂导致的阴性血清型分型结果的可能性，在每个进行的反应中加入了内部对照溶液。由于内部对照在所有的58个用于调查的血清型样品中都成功检测到，因此可以排除任何PCR抑制。
[0188]
[0189]
[0190] 实施例8：本方法的可重现性/稳健性(Robustness)
[0191] 在血清型IATS-O6试验中，在不同试验装置中，血清型检测表现出高度的重现性，图2中显示，以下情况均获得相同的Tm值：
[0192] (A)参考菌株和19份临床分离物的测定；
[0193] (B)不受使用的模板浓度(102~107基因组/反应)影响；
[0194] (C)测量30份临床样品(支气管肺泡灌洗物)之后
[0195] 实施例9：分析的灵敏度
[0196] 用七种目标阳性样品的8倍量的纯化DNA进行试验，分析铜绿假单胞菌IATS-O1，血清组2(IATS-O2，IATS-O5和IATS O-16)、IATS-O6及IATS-O11参考菌株的命中率，从而确定铜绿假单胞菌血清型分型试验的分析灵敏度。对每一份测定的微生物DNA，用概率分析法计算95%截止值，从而确定检测低限(LOD)。因为4价铜绿假单胞菌血清型分型试验的多元形式可能影响四个测定中每一个的检测低限。可以假设为，在分别测验时，四个试验中的每一试验有一个较低的检测低限。
[0197] 表10：4价铜绿假单胞菌血清型分型试验-分析灵敏度
[0198]
[0199]
[0200] 实施例10：4价铜绿假单胞菌血清型分型试验和玻片凝集法对临床分离物进行血清型分型对比
[0201] 在美国、德国、希腊和比利时大约20个医院收集呼吸道铜绿假单胞菌分离物。将菌株置于BHI琼脂平板上(自BD Bioscience)，37°C过夜培养后进行测定。每个菌株取一个接种环用于凝集和在超纯水中稀释，随后进行LightCycler分析。
[0202] 当比较两种血清型分型方法获得的结果时，很明显，使用4价铜绿假单胞菌血清型分型试验可以显著提高可靠识别的临床分离物的数量。如果用绝对数量表示，观察到500种研究菌株提高了15%(血清型测定率从54.3%提高至69.2%)。在此实验中，这15%的差别对应着75个潜在的可能成为适合血清型特异性抗体治疗的患者。
[0203] 表11:
[0204]
[0205]
[0206] 实施例11：4价铜绿假单胞菌血清型分型试验——无功能的引物/探针对。
[0207] 铜绿假单胞菌分离物的血清型特异性检测需要特异的引物/探针寡核苷酸。用软件LightCycler Probe Design Software 2.0(Roche Applied Science)设计这样的序列。虽然软件能提供许多满足好的引物和探针设计的一般性要求的寡核苷酸序列(例如，不具有分子内序列同源性、模板上单一的退火位点、扩增子大小、理想的熔解温度，等等)，但是，按本方法的排除标准，软件设计的引物/探针对中许多核苷酸序列不能用于可靠的血清型鉴定。
[0208] 表12：列出了用LightCycler Probe Design Software 2.0(Roche Applied Science)设计的25个引物/探针寡核苷酸序列。这些引物/探针对中没有一个可以用于在广泛的模板浓度中产生可靠的血清型特异的检测信号。
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214] 图3显示了用LightCycler探针设计软件产生的三个无功能的引物/探针组合。
[0215] 扩增-特异的Tm值一旦出现强烈偏差，相应的引物/探针就不能用于可靠的血清型鉴定。图3显示了依赖使用模板浓度时Tm强烈变化的3个例子。在所有的3个试验中，使用参考菌株IATS-O11(A)、IATS-O2(B)、IATS-O1(C)测量10e6~10e2基因组/反应。所述样品与表12中的引物/探针组合#19(A)、#9(B)和#1(C)相符。
[0216] 参考文献：
[0217] Chenna R,Sugawara H,Koike T,Lopez R,Gibson TJ,Higgins D G，Thompson JD.(2003).Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs.Nucleic Acids Res.,31,3497-3500.
[0218] Connolly BA.(1987)The synthesis of oligonucleotides containing a primary amino groupat the 5'-terminus Nucleic Acids Res.,10,3131-3139.[0219] Gait MJ,Sigh M,Sheppard RC(1980)Rapid synthesis ofoligodeoxyribonucleotides IV.Improved solid phase synthesis of
oligodeoxyribonucleotides through phosphotriester intermediates Nucl.Acid Res 8:1081Raymond CK,Sims EH,Kas A,Spencer DH,Kutyavin TV，Ivey RG，Zhou Y，Kaul R,Clendenning JB,Olson MV.(2002).Genetic variation at the O-antigen biosynthetic locus in Pseudomonas aeruginosa.J Bacteriol.;184,3614-3622.[0220] Rivera,M.,T.R.Chivers,J.S.Lam,and E.J.McGroarty.(1992).Common antigen lipopolysaccharide from Pseudomonns aeruginosa Auk 1401 as a receptor for bacteriophage A7.J.Bacteriol.174:2407-2411.
oligodeoxyribonucleotides through phosphotriester intermediates Nucl.Acid Res 8:1081Raymond CK,Sims EH,Kas A,Spencer DH,Kutyavin TV，Ivey RG，Zhou Y，Kaul R,Clendenning JB,Olson MV.(2002).Genetic variation at the O-antigen biosynthetic locus in Pseudomonas aeruginosa.J Bacteriol.;184,3614-3622.[0220] Rivera,M.,T.R.Chivers,J.S.Lam,and E.J.McGroarty.(1992).Common antigen lipopolysaccharide from Pseudomonns aeruginosa Auk 1401 as a receptor for bacteriophage A7.J.Bacteriol.174:2407-2411.
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