[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2013年7月8日提交的美国临时专利申请第61/843,702号和于2013年11月12日提交的美国临时专利申请第61/902,935号的优先权权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

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发明领域

[0005] 本发明涉及用于在脊椎动物和人中治疗神经精神病症的组合物和方法。更具体地，本发明提供了内皮素-B受体激动剂作为神经保护剂和神经再生剂的用途。

[0006] 发明背景

[0007] 内皮素(ET)是一种内源性肽，其已示出在体内参与许多生理和病理现象。ET作用于两种不同的受体ETA和ETB，影响从血压到神经递质和激素调节的一系列过程(Kojima等，1992；Levin，1995；Schiffrin等，1997；Schneider等，2007)。尽管最广泛的研究是针对其对心血管系统的作用，但ET受体遍布全身，包括脑。具体而言，ETB受体大量位于神经元和神经胶质细胞以及脑脉管系统的内皮衬里(Schinelli，2006)。脑内这些受体的确切功能(特别是在其发育期间)还不是很清楚。

[0008] 中枢神经系统的发育

[0009] 已证实，出生时ETB受体缺乏导致大鼠的出生后齿状回和小脑中的神经元祖细胞减少及凋亡增加(Ehrenreich等，2000；Vidovic等，2008)。此外，大鼠ETB敲除模型导致肠道内先天性无神经节细胞症(aganglionosis)和相关的CNS紊乱(Dembowski等，2000)。这些出后生死亡率为4周的ETB敲除大鼠被用作人先天性巨结肠疾病(human Hirschsprung disease)的模型。此前的研究表明，脑ETB受体表达在出生后即刻特别高，但到出生后第21天下降到较低水平(Briyal等，2012b)。这些受体的位置或其缺乏及其在这些关键的发育阶段期间与CNS生长因子的关系仍有待确定。

[0010] 虽然清楚ETB受体为CNS正常发育所需，但仍不确定其对哪些细胞或途径产生保护性或增殖性影响。此前的研究表明，在遭受脑缺血的成年大鼠脑中选择性刺激ETB受体产生针对氧化应激的神经保护并且梗塞体积显著减小(Leonard等，2011；2012)。还发现，梗塞并用ETB受体激动剂IRL-1620治疗后7天内保护免受缺血状态和从缺血状态恢复至少部分是由于血管生成和神经发生的增加(Leonard和Gulati，2013)。经IRL-1620治疗的梗塞动物的脑内血管和神经生长因子的增加与ETB受体水平的增加相一致。

[0011] 血管内皮生长因子(VEGF)通常在新生儿和成人二者的脑微血管和神经元组织中表达(Hoehn等，2002)。胎儿人脑中的VEGF位于神经上皮细胞、成神经细胞、放射状神经胶质细胞和内皮细胞上，其表达似乎是发育调节的并且与血管生成相关(Virgintino等，2003)。同时众所周知，VEGF对于血管生长是必需的，最近的研究表明，它在促进神经发生、神经元图式形成(neuronal patterning)和神经元迁移中也起着重要作用(Rosenstein等，2010)。
已证实，在发育中的脑中，VEGF、神经生长因子(NGF)和ETB受体之间有关联。ETB受体可通过施用ETB受体激动剂例如IRL-1620来刺激，并且在CNS受损或未合适生长时可以促进CNS治疗疾病的发展。

[0012] 神经退行性疾病

[0013] 神经退行是神经元的结构或功能进行性丧失(包括神经元死亡)的术语。包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病的许多神经退行性疾病作为神经退行过程的结果而发生。随着研究的进展，似乎有许多相似性将这些疾病彼此在亚细胞水平相关联。发现这些相似性为可同时缓解许多疾病的治疗进展提供了希望。不同的神经退行病症之间有许多相似之处(parallel)，包括非典型蛋白质装配以及诱导的细胞死亡(Bredesen等，2006；Rubinsztein，2006)。

[0014] 阿尔茨海默氏病(AD)是一种神经退行性病症，其特征是脑血管和神经元功能障碍导致认知功能进行性衰退。AD的神经病理学标志包括β淀粉样(Aβ)斑和神经原纤维缠结(Johnson等，2008)。长期以来，推测脑血管功能障碍促成AD。Aβ已示出减少肌原应答、脑血流量(CBF)和血管舒张应答(Han等，2008；Niwa等，2000；Paris等，2004；Shin等，2007)。CBF调节倾向于在具有高脑内Aβ水平的转基因小鼠中受损(Niwa等，2002)。合成的Aβ已示出在体内和体外削弱内皮素(ET)依赖性舒张并增强血管收缩(Niwa等，2000；Niwa等，2001)。

[0015] 一些研究已表明ET参与AD。ET是一种内源性血管调节肽，其靶向两个主要受体-ETA和ETB。ETA受体主要位于血管平滑肌细胞并介导血管收缩，而ETB受体主要位于血管内皮细胞并介导血管舒张(Goto等，1989；Tsukahara等，1994)。ET已被证明存在于脑中并在脑和全身血液循环的调节中起重要作用(Gulati等，1997；Gulati等，1996；Gulati等，1995；Rebello等，1995a)。最初证实，与对照相比，AD患者的脑脊液中ET-1的浓度较低(Yoshizawa等，1992)，然而，随后的研究表明，与对照脑相比，AD患者大脑皮质(额叶和枕叶)中的ET-1样免疫反应性显著增加(Minami等，1995)。AD患者尸体解剖后获得的脑样品示出星形胶质细胞中ET-1的免疫反应性表达增加(Zhang等，1994)。已提出，从星形胶质细胞释放的ET-1可能到达血管平滑肌细胞，并诱导血管收缩。发现患AD的人脑中ET结合位点减少，这可能是由于皮质中神经元的损失(Kohzuki等，1995)。

[0016] 可溶性Aβ干扰血管功能的机制并不完全清楚。可溶性Aβ干扰血管功能的一种可能机制可能是通过在心血管功能和局部血流量调节中起着主要作用的ET-1介导(Gulati等，1997；Gulati等，1996；Gulati等，1995)。此前发现，特异性ETA受体拮抗剂(BMS182874和BQ123)防止Aβ诱导的氧化应激和认知缺陷(Briyal等，2011)。特异性ETA受体拮抗剂减少逃避潜伏期(escape latency)，并且还增加对目标象限的偏好。另一方面，非特异性ETA/ETB受体拮抗剂(TAK-044)在空间记忆缺陷或对目标象限偏好的损失方面未产生任何改善(Briyal等，2011)。该非特异性ETA/ETB拮抗剂改善的缺乏提示我们ETB受体在AD中的特异性参与。

[0017] 脑中的ET结合位点主要是ETB受体，并且ETB受体激动剂已示出对抗Aβ神经毒性的抗凋亡(Yagami等，2002)。ETB受体的完全缺乏或阻断导致缺血性脑损伤加重，这可能是由于ET血管舒缩平衡的改变(Chuquet等，2002；Ehrenreich等，1999)。已证实，用静脉内IRL-1620(一种高选择性ETB激动剂)活化ETB受体导致正常大鼠中CBF显著提高和中风大鼠的神经缺陷和梗塞体积减小(Leonard等，2011；Leonard和Gulati，2009)。还发现，中风大鼠模型中IRL-1620的效力完全被BQ788拮抗，表明ETB受体的参与(Leonard等，2011；2012)。

[0018] 中风和脑血管病症

[0019] 中风是脑功能因血液到脑的供给受到干扰而快速丧失，这可能是由于缺血或出血(Sims和Muyderman，2009)。在世界范围内，其为第二大死亡原因和第四大残疾原因(Mathers等，2009；Strong等，2007)。它也是癫痫、跌倒(falls)和抑郁症的诱发因素(Fisher和Norrving，2011)，并且是功能受损的一个最重要的原因，3个月后有20％的幸存者需要机构护理，15％至30％永久残疾(Steinwachs等，2000)。

[0020] 中风分为两类：缺血性中风，由供应脑的动脉突然闭塞导致，或者由于闭塞部位或形成在循环的另一部分的血栓导致。根据美国心脏协会公布的最新数据，87％的中风被归类为缺血性(Deb等，2010；Feigin等，2009；Roger等，2012)。出血性中风由从脑动脉之一出血进入脑组织(蛛网膜下出血)或脑膜之间的空间中的动脉出血(脑内出血)导致。

[0021] 中风后的结果取决于脑损伤的部位和严重程度。非常严重的中风可导致猝死。受中风影响的脑区域不能行使功能，这可能会导致无法将一个或更多个肢体移动到身体的一侧、不能理解或用语言表达(formulate speech)或者不能看到视野的一侧(Bath和Lees，2000；Donnan等，2008)。为了加快诊断测试和治疗，中风的早期识别最重要。

[0022] 尽管缺血性中风有如此严重程度，目前可用的经FDA批准的药物治疗剂只有重组组织纤维溶酶原活化物(rtPA)，其溶解凝块并恢复至脑的血流量。这种治疗因梗塞与治疗之间较短的时间窗(3至4个小时)和增加的蛛网膜下出血风险而复杂化(Micieli等，2009)。大量的其他试剂，大致归类为神经保护性并且旨在减缓或停止与中风后的缺血级联相关的二次伤害，在研究的初始阶段示出前景，但迄今未能在临床试验中示出效力(Ly等，2006)。
因此，需要一种有潜力解决血流量的恢复和减弱对半影区的二次伤害这两者的新方法。

[0023] 在缺血性中风和蛛网膜下出血之后，血液中的ET水平和组织中的ET免疫反应性提高(Asano等，1990；Rebello等，1995b；Viossat等，1993)。实验性中风之后脑缺血区中ET水平的提高与局部血流量的减少相一致的证明致使对局灶性缺血性中风的治疗中几种ET拮抗剂的研究(Patel等，1995)。虽然一些ETA特异性和ETA/B非特异性拮抗剂已在实验性中风模型中示出前景，但另一些则没有(Barone等，2000；Barone等，1995；Briyal和Gulati，2010；Briyal等，2007；Briyal等，2012a；Gupta等，2005；Kaundal等，2012；Zhang等，2008；
Zhang等，2005)。总的来说，该方法还没有用。已证明，增加脑中VEGF和NGF的ETB受体在出生时过表达并且其表达随着脑成熟而降低(Briyal等，2012b)。大量存在于CNS中的ETB受体似乎在其发育中起着关键作用。这一基本信息表明ETB受体可能参与大脑发育，以使在脑缺血后受损的脑产生神经血管塑性。发现在正常大鼠中用静脉内IRL-1620(一种高度选择性的ETB激动剂)刺激ETB受体导致脑血流量显著升高(Leonard和Gulati，2009)。此外，功能性ETB受体已示出增强齿状回、嗅上皮和皮质神经元中神经元祖细胞的增殖并保护免受凋亡(Ehrenreich等，1999；Laziz等，2011；Lee等，2003；Yagami等，2005)。脑缺血后ETB受体的缺乏导致较差后果(Chuquet等，2002)和ETB受体完全缺乏或阻断导致缺血性脑损伤加重(Ehrenreich等，1999)的证据致使对ETB受体在缺血性中风模型中的作用进行研究。当迄今大多数针对ET和中风的研究集中在选择性地或非选择性地拮抗ETA受体以防止过度的血管收缩时，对在局灶性中风模型中选择性地活化ETB受体的影响进行了研究(Leonard等，
2011；2012；Leonard和Gulati，2013)。

[0024] 在目前的临床实践中，有两种基本的治疗，长期使用抗血小板剂或抗凝剂来降低中风风险的预防性治疗，或用纤维蛋白溶解剂进行的急性治疗。但是，少于2％的患者能够接受纤维蛋白溶解剂(Font等，2010)。正在进行广泛的研究以寻找可能用于中风急性期的神经保护剂和可在中风后期用于神经修复的试剂。

[0025] 发明概述

[0026] 本发明涉及用于在脊椎动物和人中治疗神经精神病症的组合物和方法。更具体地，本发明提供了合适剂量的内皮素-B受体激动剂IRL-1620作为神经保护剂和神经再生剂的用途。

[0027] 因此，在一方面，本公开提供了一种治疗神经精神病症的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的内皮素-B受体激动剂以治疗神经精神病症。

[0028] 在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂与用于治疗神经精神病症的其他试剂共同施用。在一些实施方案中，所述其他试剂选自由以下组成的组：抗抑郁剂、抗炎剂、CNS刺激剂、神经安定剂和抗增殖剂。

[0029] 在另一些实施方案中，内皮素-B受体激动剂选自由以下组成的组：IRL-1620、BQ-3020、[Ala1,3,11,15]-内皮素、角蝰毒素S6c、内皮素-3及其混合物。

[0030] 本公开内容在其他实施方案中涵盖所述神经精神病症选自由以下组成的组：脑血管疾病、中风、脑缺血、脑出血、头部外伤、脑损伤、脑肿瘤、多发性硬化症和脱髓鞘疾病、痴呆、血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、共济失调、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化症、药物中毒、酒精中毒、慢性脑感染、脑脓肿、脑白质病、宾斯旺格病、烟雾病、产期缺氧、脑窒息、颅内产伤、脑先天畸形、情感障碍和抑郁。

[0031] 在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以0.0001至0.5mg/kg范围的剂量施用。在另一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂在每2至5天后以1至6小时的间隔重复施用。

[0032] 在本公开的任意实施方案中，涵盖所述患者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

[0033] 在另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含(a)内皮素-B受体激动剂，(b)用于治疗神经精神病症的试剂和任选地(c)赋形剂。

[0034] 在另一方面，本公开还提供了一种制品，其包含：(a)包装的组合物，其包含内皮素-B受体激动剂和用于神经精神病症的试剂；(b)插页，其为同时或相继施用所述内皮素-B受体激动剂和用于神经精神病症的所述试剂以治疗有此需要的患者提供说明书；和(c)用于(a)和(b)的容器。在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂是IRL-1620。

[0035] 附图简述

[0036] 图1.IRL-1620的结构(Suc-Asp-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp；SEQ ID NO:1)。

[0037] 图2.出生后大鼠脑的脉管系统中血管内皮生长因子和内皮素B受体的表达。A)在出生后第1、7、14和28天，大鼠皮质中血管的代表性图像，针对VEGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝10μm。B)在出生后第1、7、14和28天，大鼠脑脉管系统中VEGF的强度。C)在出生后第1、7、14和28天，每20μm-厚大鼠脑切片中VEGF-阳性血管的数目。D)在出生后第1、7、14和28天，大鼠脑脉管系统中ETB受体的强度。*P<0.05对比第1天；#P<0.01对比第7天；值表示为平均值±SEM。将30只雄性幼崽分为以下组：第1天(N＝10)；第7天(N＝10)；第14天(N＝
5)；第28天(N＝5)。

[0038] 图3.出生后大鼠脑的皮质和室下区(subventricular zone)中神经生长因子和内皮素B受体的表达。A)在出生后第1、7、14和28天，大鼠皮质的代表性图像，针对NGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝100μm。B)在出生后第1、7、14和28天，大鼠SVZ的代表性图像，针对NGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝100μm。C)在出生后第1、7、14和28天，大鼠脑的皮质和SVZ中NGF的强度。D)在出生后第1、7、14和28天，大鼠脑的皮质和SVZ中每100μm2的NGF阳性细胞数目。E)在出生后第1、7、14和28天，大鼠脑的皮质和SVZ中ETB受体的强度。*P<0.001对比第1天；#P<0.01对比第7天；值表示为平均值±SEM。将30只雄性幼崽分为以下组：第1天(N＝10)；第7天(N＝10)；第14天(N＝5)；第28天(N＝5)。

[0039] 图4.ETB受体激动剂IRL-1620对出生后大鼠脑中血管内皮生长因子和ETB表达的影响。在出生后第21天向大鼠幼崽施用盐水(对照；N＝5)或IRL-1620(5μg/kg，IV；N＝5)。然后在出生后第28天处死幼崽并移出脑用于分析。A)在出生后第28天，对照和经IRL-1620治疗的大鼠皮质中血管的代表性图像，针对VEGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝10μm。B)在出生后第28天，大鼠脑脉管系统中VEGF的强度。C)在出生后第28天，每20μm-厚大鼠脑切片中VEGF-阳性血管的数目。D)在出生后第28天，大鼠脑脉管系统中ETB受体的强度。*P<
0.05对比对照。值表示为平均值±SEM。

[0040] 图5.ETB受体激动剂IRL-1620对出生后大鼠脑中神经生长因子和ETB表达的影响。在出生后第21天向大鼠幼崽施用盐水(对照；N＝5)或IRL-1620(5μg/kg，IV；N＝5)。然后在出生后第28天处死幼崽并移出脑用于分析。A)在出生后第28天，对照和经IRL-1620治疗的大鼠脑中皮质的代表性图像，针对NGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝100μm。B)在出生后第28天，对照和经IRL-1620治疗的大鼠脑中SVZ的代表性图像，针对NGF(红色)和ETB受体(绿色)染色。比例尺＝100μm。C)在出生后第28天，大鼠脑的皮质和SVZ中NGF的强度。D)在出生后第28天，大鼠脑的皮质和SVZ中每100μm2的NGF阳性细胞数目。E)在出生后第28天，大鼠脑的皮质和SVZ中ETB受体的强度。*P<0.05对比对照。值表示为平均值±SEM。

[0041] 图6.ETB受体激动剂IRL-1620对出生后大鼠脑中血管生长因子、神经生长因子和ETB受体的蛋白质水平的影响。在出生后第21天向大鼠幼崽施用盐水(对照；N＝5)或IRL-1620(5μg/kg，IV；N＝5)。然后在出生后第28天处死幼崽并移出脑用于分析。A)在出生后第
28天，对照和经IRL-1620治疗的大鼠脑中VEGF、ETB和NGF蛋白质表达的代表性印迹，使用β-微管蛋白或β-肌动蛋白作为蛋白质加样对照。泳道1＝对照；泳道2＝IRL-1620。B)在出生后第28天，大鼠脑中VEGF表达的倍数变化。C)在出生后第28天，大鼠脑中ETB受体表达的倍数变化。D)在出生后第28天，大鼠脑中NGF表达的倍数变化。*P<0.05对比对照。值表示为平均值±SEM。

[0042] 图7.在存在和不存在ETB受体拮抗剂BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对大鼠脑中Aβ诱导的氧化应激中丙二醛(MDA)(A)、还原型谷胱甘肽(GSH)(B)和过氧化物歧化酶(SOD)(C)水平的影响。值表示为平均值±SEM。与假操作(sham)相比，*p<0.0001；与Aβ+媒介物(N＝6)相比，#p<0.001。

[0043] 图8.在存在和不存在ETB受体拮抗剂BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对非糖尿病大鼠水迷宫任务每日训练中的逃避潜伏期(A)和路径长度(B)的影响。对动物进行每日4次试验以寻找隐藏平台，持续4个训练日。值表示为平均值±S.E.M。与假操作相比，*p<0.001；与Aβ+媒介物(N＝6)相比，#p<0.001。

[0044] 图9.在存在和不存在ETB受体拮抗剂BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对水迷宫探查试验任务的影响。非糖尿病大鼠的探查试验中每个象限所花费的时间(A)。水迷宫任务的探查试验期间每组的代表性轨迹(B)。值表示为平均值±S.E.M。与假操作相比，*p<#0.001；与Aβ+媒介物(N＝6)相比，p<0.001。

[0045] 图10.在存在和不存在ETB受体拮抗剂BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对糖尿病大鼠水迷宫任务每日训练中的逃避潜伏期(A)和路径长度(B)的影响。对动物进行每日4次试验以寻找隐藏平台，持续4个训练日。值表示为平均值±S.E.M。与假操作相比，*p<#0.001；与Aβ+媒介物(N＝6)相比，p<0.001。

[0046] 图11.在存在和不存在ETB受体拮抗剂BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对水迷宫探查试验任务的影响。糖尿病大鼠的探查试验中每个象限所花费的时间(A)。水迷宫任务的探查试验期间每组的代表性轨迹(B)。值表示为平均值±S.E.M。与假操作相比，*p<#0.001；与Aβ+媒介物(N＝6)相比，p<0.001。

[0047] 图12：大脑中动脉闭塞后7天用TTC染色的脑的2mm冠状切面(coronal section)以使梗塞区可视化(红色表示正常组织，白色表示梗塞组织)。示出了组中的代表性切片。在MCAO后2、4和6小时注射IRL-1620(5μg/kg，IV)或等渗盐水(1ml/kg，IV)。在第一次注射IRL-1620或媒介物前15分钟施用一次BQ-788(1mg/kg，IV)。

[0048] 图13：在存在和不存在BQ788的条件下，ETB受体激动剂IRL-1620对经历假手术或大脑中动脉闭塞的大鼠的7天存活率的影响。

[0049] 图14：MCAO之后(A)24小时和(B)7天雄性Sprague Dawley大鼠的左脑半球和右脑半球中ETB受体的结合亲和力(Kd)和受体密度(Bmax)。值表示为平均值±S.E.M.，N＝4/每组。假操作组(对照)和中风(MCAO)组二者的左半球和右半球之间未观察到Kd或Bmax的显著变化。

[0050] 图15：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)的影响。A.针对ETB受体(绿色)和GFAP(红色)染色的代表性30μm厚的缺血脑切片。比例尺＝2000μm。下图示出梗塞后24小时大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区中每100μm2的反应性星形细胞(GFAP+细胞)数目。*P<0.001对比假操作。#P<0.0001对比MCAO+媒介物。@P<0.01对比MCAO+IRL-1620；和梗塞后1周大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区中每
2
100μm的反应性星形细胞(GFAP+细胞)数目。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.001对比假操作。

[0051] 图16：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，三个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后神经元核(NeuN)的影响。(A)MCAO后1周，经IRL-1620治疗的动物的皮质的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和NeuN(红色)染色。比例尺＝100μm。(B)MCAO后1周，经IRL-1620治疗的动物的纹状体的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和NeuN(红色)染色。比例尺＝10μm。(C)梗塞后24小时大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区中每100μm2的神经元核数目。*P<0.05对比假操作。#P<0.01对比MCAO+媒介物。@P<0.0001对比MCAO+IRL-1620。(D)梗塞后1周大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区中每100μm2的神经元核数目。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.0001对比假操作。#P<0.0001对比MCAO+媒介物。@P<0.0001对比MCAO+IRL-1620。

[0052] 图17：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后增殖细胞的影响。示出脑血管的MACO后1周，经IRL-1620治疗的动物的皮质的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和BrdU(红色)染色。
比例尺＝100μm。下图示出梗塞后1周大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区中每100μm2的增殖细胞(BrdU+)数目。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.01对比假操作。#P<
0.0001对比MCAO+媒介物。@P<0.0001对比MCAO+IRL-1620。

[0053] 图18：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后血管内皮生长因子(VEGF)的影响。A.MCAO后24小时，大鼠皮质中血管的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和VEGF(红色)染色。
行：1.假操作；2.MCAO+媒介物；3.MCAO+IRL-1620；4.MCAO+BQ788+媒介物；5.MCAO+BQ788+IRL-1620；比例尺＝10μm。B.MCAO后1周，大鼠皮质中血管的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和VEGF(红色)染色。行与(A24小时)相同。比例尺＝10μm。

[0054] 图19：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后血管内皮生长因子(VEGF)的影响。上图示出梗塞后24小时大脑中动脉闭塞大鼠的脑切片每30μm中VEGF+血管的数目。*P<0.05对比假操作。#P<0.01对比MCAO+媒介物。@P<0.05对比MCAO+IRL-1620。下图示出梗塞后1周大脑中动脉闭塞大鼠的脑切片每30μm中VEGF+血管的数目。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.01对比假操作。#P<0.01对比MCAO+媒介物。@P<0.05对比MCAO+IRL-1620。

[0055] 图20：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白质水平的影响。A.MCAO后24小时，大鼠脑中VEGF蛋白质水平的代表性印迹，使用β-微管蛋白作为加样对照。泳道1–假操作(LH)，泳道2–假操作(RH)，泳道3–MCAO+媒介物(LH)，泳道4–MCAO+媒介物(RH)，泳道5–MCAO+IRL-1620(LH)，泳道6–MCAO+IRL-1620(RH)。LH＝左半球，RH＝右半球。B.MCAO后1周，大鼠脑中VEGF蛋白质水平的代表性印迹，使用β-微管蛋白作为加样对照，泳道分布与(A)相同。
C.MCAO后24小时，大鼠脑中VEGF蛋白质的表达水平。D.MCAO后1周，大鼠脑中VEGF蛋白质的表达水平。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.001对比假操作。#P<0.01对比MCAO+媒介物。

[0056] 图21：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)和拮抗剂BQ788(1mg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后神经生长因子(NGF)的影响。A.MCAO后1周，经IRL-1620治疗的动物的皮质的代表性图像，针对ETB受体(绿色)和NGF(红色)染色。比例尺＝10μm。B.梗塞后1周大脑中动脉闭塞大鼠的皮质、纹状体和室下区的每100μm2中NGF+细胞的数目。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。#P<0.0001对比MCAO+媒介物。@P<0.0001对比MCAO+IRL-1620。

[0057] 图22：ETB受体激动剂IRL-1620(缺血后2、4和6小时，3个剂量的5μg/kg，静脉内)对大脑中动脉闭塞后神经生长因子(NGF)的蛋白质水平的影响。A.MCAO后24小时，大鼠脑中NGF蛋白质水平的代表性印迹，使用β-微管蛋白作为加样对照。泳道1–假操作(LH)，泳道2–假操作(RH)，泳道3–MCAO+媒介物(LH)，泳道4–MCAO+媒介物(RH)，泳道5–MCAO+IRL-1620(LH)，泳道6–MCAO+IRL-1620(RH)。LH＝左半球，RH＝右半球。B.MCAO后1周，大鼠脑中NGF蛋白质水平的代表性印迹，使用β-微管蛋白作为加样对照，泳道分布与(A)相同。C.MCAO后24小时，大鼠脑中NGF蛋白质的表达水平。D.MCAO后1周，大鼠脑中NGF蛋白质的表达水平。值表示为平均值±SEM(n＝5/组)。*P<0.01对比假操作。

[0058] 发明详述

[0059] 本公开提供了用于治疗神经精神病症的组合物和方法。本文公开了内皮素-B受体激动剂用作神经保护剂和神经再生剂。本公开的组合物和方法一般性涉及向有此需要的患者施用内皮素-B受体激动剂以治疗神经精神病症。

[0060] 因此，在一方面，本公开提供了一种治疗神经精神病症的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的内皮素-B受体激动剂以治疗神经精神病症。

[0061] 在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂选自由以下组成的组：IRL-1620、BQ-3020、[Ala1,3,11,15]-内皮素、角蝰毒素S6c、内皮素-3及其混合物。

[0062] 在一些实施方案中，本公开涵盖ETB受体激动剂，例如IRL-1620(图1)可用于治疗多种神经精神病症，例如脑血管疾病、中风、脑缺血、脑出血、头部外伤、脑损伤、脑肿瘤、多发性硬化症和脱髓鞘疾病、痴呆、血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、共济失调、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化症、药物中毒、酒精中毒、慢性脑感染、脑脓肿、脑白质病、宾斯旺格病、烟雾病、产期缺氧、脑窒息、颅内产伤、脑先天畸形、情感障碍和抑郁。

[0063] 在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂与用于治疗神经精神病症的其他试剂共同施用。在一些实施方案中，所述其他试剂选自由以下组成的组：抗抑郁剂、抗炎剂、CNS刺激剂、神经安定剂和抗增殖剂。

[0064] 一般添加剂

[0065] 可在本公开的方法和组合物中使用的抗抑郁剂、CNS刺激剂和神经安定剂的实例包括但不限于：阿立哌唑(Abilify)、多虑平(Adapin)、阿德拉(Adderall)、Alepam、Alertec、氟哌啶醇(Aloperidin)、Alplax、Alprax、阿普唑仑(Alprazolam)、Alviz、Alzolam、金刚烷胺(Amantadine)、安必恩(Ambien)、氨磺必利(Amisulpride)、阿米替林(Amitriptyline)、阿莫沙平(Amoxapine)、安非他酮(Amfebutamone)、安拿芬尼(Anafranil)、氟奋乃静(Anatensol)、Ansial、Ansiced、Antabus、安塔布司(Antabuse)、丙咪嗪(Antideprin)、Anxiron、Apo-Alpraz、Apo-扑米酮(Apo-Primidone)、Apo-Sertral、多塞平(Aponal)、Apozepam、阿立哌唑(Aripiprazole)、Aropax、安坦(Artane)、阿莫沙平(Asendin)、Asendis、Asentra、劳拉西泮(Ativan)、阿托西汀(Atomoxetine)、吗氯贝胺(Aurorix)、Aventyl、Axoren、巴氯芬(Baclofen)、Beneficat、苯哌唑酮(Benperidol)、Bimaran、Bioperidolo、Biston、氟哌啶醇(Brotopon)、Bespar、安非他酮(Bupropion)、布斯帕(Buspar)、Buspimen、Buspinol、丁螺环酮(Buspirone)、Buspisal、Cabaser、卡麦角林(Cabergoline)、Calepsin、碳酸钙、氰氨化钙(Calcium carbimide)、眠尔通(Calmax)、卡马西平(Carbamazepine)、Carbatrol、硫酸锂(Carbolith)、Celexa、水合氯醛(Chloraldurat)、Chloralhydrat、利眠宁(Chlordiazepoxide)、氯丙嗪(Chlorpromazine)、Cibalith-S、Cipralex、西酞普兰(Citalopram)、氯米帕明(Clomipramine)、氯硝西泮(Clonazepam)、氯氮平(Clozapine)、氯氮平(Clozaril)、哌甲酯制剂(Concerta)、Constan、Convulex、苯异妥英(Cylert)、Cymbalta、氟奋乃静(Dapotum)、Daquiran、Daytrana、Defanyl、氟西泮(Dalmane)、Damixane、阿莫沙平(Demolox)、Depad、二丙基醋酸钠(Depakene)、双丙戊酸钠(Depakote)、氟哌噻吨(Depixol)、曲唑酮(Desyrel)、卡麦角林(Dostinex)、右旋安非他命(dextroamphetamine)、硫酸右苯丙胺(Dexedrine)、地西泮(Diazepam)、盐酸苄非他明(Didrex)、双丙戊酸钠(Divalproex)、硫苯酰胺(Dogmatyl)、美沙酮(Dolophine)、氟哌利多(Droperidol)、诺罗丁(Desoxyn)、瑞波西汀(Edronax)、比托特罗(Effectin)、怡诺思(Efexor)、舒必利(Eglonyl)、Einalon S、阿米替林(Elavil)、Elontril、阿米替林(Endep)、苯妥英(Epanutin)、卡马西平片剂(Epitol)、Equetro、艾司西酞普兰(Escitalopram)、Eskalith、三氟比拉嗪(Eskazinyl)、三氟拉嗪(Eskazine)、依曲方(Etrafon)、Eukystol、Eunerpan、Faverin、Fazaclo、氟伏沙明(Fevarin)、卡马西平(Finlepsin)、Fludecate、Flunanthate、氟西汀(Fluoxetine)、氟非那嗪(Fluphenazine)、氟西泮(Flurazepam)、氟司必林(Fluspirilene)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、Focalin、加巴喷丁(Gabapentin)、Geodon、Gladem、达哌啶醇(Glianimon)、胍法辛(Guanfacine)、酣乐欣(Halcion)、Halomonth、氟哌啶醇(Haldol)、氟哌啶醇(Haloperidol)、氟哌啶醇(Halosten)、Imap、丙咪嗪(Imipramine)、忆梦返(Imovane)、盐酸丙咪嗪(Janimine)、三氟拉嗪(Jatroneural)、卡尔马(Kalma)、氟哌啶醇(Keselan)、克诺平(Klonopin)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、氯丙嗪(Largactil)、左美丙嗪(Levomepromazine)、左美丙嗪(Levoprome)、氯氮平(Leponex)、Lexapro、Libotryp Libritabs、利眠宁(Librium)、氟哌啶醇(Linton)、去氧苯巴比妥(Liskantin)、硫酸锂(Lithane)、锂、硫酸锂(Lithizine)、碳酸锂(Lithobid)、碳酸锂(Lithonate)、碳酸锂片剂(Lithotabs)、劳拉西泮(Lorazepam)、洛沙平(Loxapac)、洛沙平(Loxapine)、洛沙平(Loxitane)、路滴美(Ludiomil)、舒乐安定(Lunesta)、舍曲林(Lustral)、兰释(Luvox)、Lyrica、氟奋乃静(Lyogen)、曲唑酮(Manegan)、吗氯贝胺(Manerix)、麦普替林(Maprotiline)、硫利达嗪(Mellaril)、甲硫哒嗪(Melleretten)、美立廉(Melleril)、Melneurin、美哌隆(Melperone)、Meresa、美索达嗪(Mesoridazine)、Metadate、甲基苯丙胺(Methamphetamine)、左美丙嗪(Methotrimeprazine)、Methylin、哌醋甲酯(Methylphenidate)、Minitran、普拉克索(Mirapex)、Mirapexine、吗氯贝胺(Moclobemide)、莫达非尼(Modafinil)、三氟拉嗪(Modalina)、保利神(Modecate)、Moditen、曲唑酮(Molipaxin)、阿莫沙平(Moxadil)、奥沙西泮(Murelax)、Myidone、Mylepsinum、麦苏林(Mysoline)、苯乙肼(Nardil)、Narol、替沃噻吨(Navane)、奈法唑酮(Nefazodone)、Neoperidol、加巴喷丁(Neurontin)、Nipolept、Norebox、Normison、地昔帕明(Norpramine)、去甲替林(Nortriptyline)、Novodorm、硝基安定(Nitrazepam)、奥氮平(Olanzapine)、Omca、Oprymea、Orap、奥沙西泮(Oxazepam)、去甲替林(Pamelor)、反苯环丙胺(Parnate)、帕罗西汀(Paroxetine)、帕罗西汀(Paxil)、氟哌啶醇(Peluces)、匹莫林(Pemoline)、培高利特(Pergolide)、培高利特(Permax)、氟奋乃静(Permitil)、奋乃静(Perphenazine)、Pertofrane、苯乙肼(Phenelzine)、苯妥英(Phenytoin)、匹莫齐特(Pimozide)、哌泊噻嗪棕榈酸酯(Piportil)、哌泊噻嗪(Pipotiazine)、Pragmarel、普拉克索(Pramipexole)、普瑞巴林、扑米酮、Prolift、氟奋乃静(Prolixin)、异丙嗪、丙硫喷地(Prothipendyl)、普罗替林(Pregabalin)、Provigil、百忧解(Prozac)、密苏林(Prysoline)、Psymion、喹硫平(Quetiapine)、Ralozam、瑞波西汀(Reboxetine)、氟司必林(Redeptin)、扑米酮(Resimatil)、替马西泮(Restoril)、Restyl、Rhotrimine、利鲁唑(riluzole)、维思通(Risperdal)、利培酮(Risperidone)、Rispolept、利他林(Ritalin)、氯硝西泮(Rivotril)、Rubifen、Rozerem、Sediten、地西泮(Seduxen)、Selecten、奥沙西泮(Serax)、氟哌啶醇(Serenace)、去甲羟基安定(Serepax)、氟哌啶醇(Serenase)、美索达嗪(Serentil)、氯羟氧二氮卓(Seresta)、Serlain、Serlift、思瑞康(Seroquel)、赛乐特(Seroxat)、扑米酮(Sertan)、舍曲林(Sertraline)、奈法唑酮(Serzone)、氟奋乃静(Sevinol)、Sideril、Sifrol、氟哌啶醇(Sigaperidol)、多虑平(Sinequan)、Sinqualone、多塞平(Sinquan)、Sirtal、Solanax、Solian、Solvex、三唑仑(Songar)、Stazepin、三氟拉嗪(Stelazine)、思诺思(Stilnox)、Stimuloton、Strattera、舒必利(Sulpiride)、Sulpiride Ratiopharm、Sulpiride Neurazpharm、曲米帕明(Surmontil)、Symbyax、金刚烷胺(Symmetrel)、Tafil、氯羟去甲安定(Tavor)、Taxagon、痛痉宁(Tegretol)、Telesmin、替马西泮(Temazepam)、氯羟安定(Temesta)、柠檬酸氰氨化钙(Temposil)、三氟拉嗪(Terfluzine)、硫利达嗪(Thioridazine)、替沃噻吨(Thiothixene)、曲唑酮(Thombran)、氯丙嗪(Thorazine)、卡马西平(Timonil)、组织纤维溶酶原活化剂(tPA)、丙咪嗪(Tofranil)、苯异妥英(Tradon)、曲马多(Tramadol)、舒敏(Tramal)、氟非那嗪(Trancin)、Tranax、Trankimazin、Tranquinal、反苯环丙胺(Tranylcypromine)、Trazalon、曲唑酮(Trazodone)、Trazonil、Trialodine、Trevilor、三唑仑(Triazolam)、三氟拉嗪(Trifluoperazine)、苯海索片(Trihexane)、三己芬迪(Trihexyphenidyl)、奋乃静(Trilafon)、曲米帕明(Trimipramine)、Triptil、曲唑酮(Trittico)、Troxal、阿米替林(Tryptanol)、Tryptomer、盐酸曲马多片剂(Ultram)、安定(Valium)、丙戊酸钠(Valproate)、丙戊酸(Valproic acid)、安定制剂(Valrelease)、Vasiprax、文拉法辛(Venlafaxine)、Vestra、Vigicer、普罗替林(Vivactil)、安非他酮(Wellbutrin)、阿普唑仑(Xanax)、Xanor、Xydep、扎来普隆(Zaleplon)、Zamhexal、ZEldox、佐匹克隆(Zimovane)、Zispin、齐拉西酮(Ziprasidone)、Zolarem、Zoldac、左洛复(Zoloft)、唑吡坦(Zolpidem)、Zonalon、佐匹克隆(Zopiclone)、佐替平(Zotepine)、Zydis和再普乐(Zyprexa)。

[0066] 抗炎剂

[0067] 任何具有抗炎性作用的试剂均可用于本发明。所述抗炎剂可以是甾族抗炎剂、非甾族抗炎剂或其组合。在一些实施方案中，抗炎剂包括但不限于：阿氯芬酸(alclofenac)、阿氯米松二丙酸酯(alclometasone dipropionate)、阿孕奈德(algestone acetonide)、α淀粉酶、安西法尔(amcinafal)、安西非特(amcinonide)、甲芬那酸钠(amfenac sodium)、阿米勃雷糖盐酸盐(amiprilose hydrochloride)、阿那白滞(anakinra)、阿尼罗酸(anirolac)、阿尼扎芬(anitrazafen)、阿扎丙宗(apazone)、巴柳氮二钠(balsalazide disodium)、苄达(bendazac)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、盐酸苄达明(benzydamine hydrochloride)、菠萝蛋白酶(bromelains)、溴哌莫(broperamole)、布地奈德(budesonide)、卡洛芬(carprofen)、环洛芬(cicloprofen)、辛喷他酮(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、氯倍他索丙酸酯(clobetasol propionate)、氯倍他松丁酸(clobetasone butyrate)、氯吡酸(clopirac)、丙酸氯硫卡松(cloticasone propionate)、乙酸可米松(cormethasoneacetate)、可托多松(cortodoxone)、地夫可特(deflazacort)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoximetasone)、地塞米松丙酸酯(dexamethasone dipropionate)、双氯芬酸钾(diclofenac potassium)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、二氟拉松二醋酸(diflorasone diacetate)、二氟米酮钠(diflumidone sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、二氟泼尼酯(difluprednate)、地弗他酮(diftalone)、二甲基亚砜、羟西奈德(drocinonide)、恩甲羟松(endrysone)、恩莫单抗(enlimomab)、依诺利康钠(enolicam sodium)、依匹唑(epirizole)、依托度酸(etodolac)、依托芬那酯(etofenamate)、联苯乙酸(felbinac)、非那莫(fenamole)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、芬克洛酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、苯吡噁二酮(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、夫拉扎酮(flazalone)、氟扎可特(fluazacort)、氟灭酸(flufenamic acid)、氟咪唑(flumizole)、氟尼缩松乙酸盐(flunisolide acetate)、氟尼辛(flunixin)、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、氟考丁酯(fluocortin butyl)、氟甲孕松醋酸酯(fluorometholone acetate)、氟喹宗(fluquazone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟瑞托芬(fluretofen)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、呋喃洛芬(furaprofen)、呋罗布芬(furobufen)、哈西奈德(halcinonide)、丙酸卤倍他索(halobetasol propionate)、醋酸卤泼尼松(halopredone acetate)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬铝(ibuprofen aluminum)、布洛芬吡啶甲醇(ibuprofen piconol)、伊洛达普(ilonidap)、茚甲新(indomethacin)、茚甲新钠(indomethacin sodium)、吲哚洛芬(indoprofen)、吲哚克索(indoxole)、吲四唑(intrazole)、isoflupredoneacetate、伊索克酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮洛芬(ketoprofen)、罗非咪唑盐酸盐(lofemizole hydrochloride)、氯诺昔康(lomoxicam)、氯替泼诺(loteprednol etabonate)、甲氯芬那酸钠(meclofenamate sodium)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲氯松二丁酸酯(meclorisone dibutyrate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美沙拉秦(mesalamine)、美西拉宗(meseclazone)、磺庚甲泼尼龙(methylprednisolone suleptanate)、莫尼氟酯(morniflumate)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxen sodium)、萘普索(naproxol)、尼马宗(nimazone)、奥沙拉秦钠(olsalazine sodium)、奥古蛋白(orgotein)、奥帕诺辛(orpanoxin)、奥沙普秦(oxaprozin)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、paranyline hydrochloride、戊聚糖多硫酸钠(pentosan polysulfate sodium)、甘油酸保泰松钠(phenbutazone sodium glycerate)、吡非尼酮(pirfenidone)、吡罗昔康(piroxicam)、piroxicam cinnamate、吡罗昔康乙醇胺(piroxicam olamine)、吡洛芬(pirprofen)、泼那扎特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、普罗度酸(prodolic acid)、普罗喹宗(proquazone)、普罗沙唑(proxazole)、枸橼酸普罗沙唑(proxazole citrate)、利美索龙(rimexolone)、氯马扎利(romazarit)、柳胆来司(salcolex)、沙那西定(salnacedin)、双水杨酯(salsalate)、血根氯铵(sanguinarium chloride)、司克拉宗(seclazone)、丝美辛(sermetacin)、舒多昔康(sudoxicam)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、他美辛(talmetacin)、他尼氟酯(talniflumate)、他洛柳酯(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼达普(tenidap)、替尼达普钠(tenidap sodium)、替诺昔康(tenoxicam)、替昔康(tesicam)、苄叉异喹酮(tesimide)、四氢甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、替可的松匹伐酯(tixocortol pivalate)、托美丁(tolmetin)、托美丁钠(tolmetin sodium)、三氯奈德(triclonide)、三氟氨酯(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)、佐美酸钠(zomepirac sodium)、阿司匹林(乙酰水杨酸)、水杨酸、皮质类固醇、糖皮质激素、他克莫司(tacrolimus)、pimecorlimus、其前药、联合药物(co-drug)及其组合。

[0068] 抗增殖剂

[0069] 本发明可以使用任何具有抗增殖作用的试剂。所述抗增殖剂可以是天然蛋白剂例如细胞毒素或合成分子。在一些实施方案中，所述活性剂包括抗增殖物质例如更生霉素D或其衍生物和类似物(更生霉素D的同义词包括更生霉素、放线菌素IV、放线菌素I1、放线菌素X1和放线菌素CO，所有紫杉烷类例如紫杉酚、多西他赛和紫杉醇、紫杉醇衍生物、所有奥林巴斯药物例如大环内酯类抗生素、雷帕霉素、依维莫司、雷帕霉素的结构衍生物和功能类似物、依维莫司的结构衍生物和功能类似物、FKBP-12介导的mTOR抑制剂、biolimus、其前药、其联合药物及其组合)。代表性雷帕霉素衍生物包括40-O-(3-羟基)丙基-雷帕霉素、40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素、或40-O-四唑-雷帕霉素、40-表-(N-1-四唑基)-雷帕霉素(Abbot Laboratories,Abbot Park,Ill.制备的ABT-578)、其前药、其联合药物及其组合。

[0070] 本公开在其他实施方案中涵盖所述神经精神病症选自由以下组成的组：脑血管疾病、中风、脑缺血、脑出血、头部外伤、脑损伤、脑肿瘤、多发性硬化症和脱髓鞘疾病、痴呆、血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、共济失调、运动神经元病、肌萎缩性侧索硬化症、药物中毒、酒精中毒、慢性脑感染、脑脓肿、脑白质病、宾斯旺格病、烟雾病、产期缺氧、脑窒息、颅内产伤、脑先天畸形、情感障碍和抑郁。

[0071] 根据本公开，所述内皮素-B受体激动剂可以以0.0001至0.5mg/kg范围的剂量施用。在另一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以如下范围的剂量施用：约0.0001至约0.5mg/kg、或约0.0001至约0.4mg/kg、或约0.0001至约0.3mg/kg、或约0.0001至约0.2mg/kg、或约0.0001至约0.1mg/kg、或约0.001至约0.5mg/kg、或约0.001至约0.4mg/kg、或约
0.001至约0.3mg/kg、或约0.001至约0.2mg/kg、或约0.001至约0.1mg/kg、或约0.01至约
0.5mg/kg、或约0.01至约0.4mg/kg、或约0.01至约0.3mg/kg、或约0.01至约0.2mg/kg、或约
0.01至约0.1mg/kg、或约0.0005至约0.5mg/kg、或约0.0005至约0.4mg/kg、或约0.0005至约
0.3mg/kg、或约0.0005至约0.2mg/kg、或约0.0005至约0.1mg/kg。在另一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以如下剂量施用：至少约0.0001mg/kg、或至少约0.0002mg/kg、或至少约0.0005mg/kg、或至少约0.001mg/kg、或至少约0.002mg/kg、或至少约0.005mg/kg、或至少约0.007mg/kg、或至少约0.01mg/kg、或至少约0.02mg/kg、或至少约0.03mg/kg、或至少约
0.04mg/kg、或至少约0.05mg/kg、或至少约0.06mg/kg、或至少约0.07mg/kg、或至少约
0.08mg/kg、或至少约0.09mg/kg、或至少约0.1mg/kg、或至少约0.2mg/kg、或至少约0.3mg/kg、或至少约0.4mg/kg。在另一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以如下剂量施用：
低于约0.0001mg/kg、或低于约0.0002mg/kg、或低于约0.0005mg/kg、或低于约0.001mg/kg、或低于约0.002mg/kg、或低于约0.005mg/kg、或低于约0.007mg/kg、或低于约0.01mg/kg、或低于约0.02mg/kg、或低于约0.03mg/kg、或低于约0.04mg/kg、或低于约0.05mg/kg、或低于约0.06mg/kg、或低于约0.07mg/kg、或低于约0.08mg/kg、或低于约0.09mg/kg、或低于约
0.1mg/kg、或低于约0.2mg/kg、或低于约0.3mg/kg、或低于约0.4mg/kg、或低于约0.5mg/kg。

[0072] 在多个实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以1至6小时的间隔重复施用给患者。在一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以如下施用给患者：每1至5小时、或每1至4小时、或每1至2小时、或每小时、或每2小时、或每3小时、或每4小时、或每5小时、或每6小时。在另一些实施方案中，所述内皮素-B受体激动剂以如下施用给患者：每二至五天、或每三至五天、或每两天、或每三天、或每四天、或每五天。

[0073] 出生后大鼠脑中内皮素B受体个体发生

[0074] 已报道如使用免疫印迹技术测量到出生后第28天大鼠幼崽脑中ETB受体表达下降(Briyal等，2012b)。为了确定这些受体的位置及其与发育中的脑中血管生长因子和神经生长因子的潜在关系，在出生后第1、7、14和28天，用针对ETB受体、VEGF和NGF的抗体对大鼠幼崽的脑进行免疫荧光标记。与产后龄第1天和第7天相比，在第14天脉管系统中ETB受体染色强度显著较高(图2)。相比之下，与第1天和第7天相比(P<0.0001；图3)，在产后龄的第14天，发育中的大鼠脑的皮质和室下区中ETB染色的强度显著下降。发现产后龄第14天和第28天的ETB强度相似。这些结果表明，事实上，发育中大鼠脑的神经组织内ETB受体的表达下降，但神经血管中并非如此。

[0075] 出生后大鼠脑中血管内皮生长因子个体发生

[0076] 在产后龄第1、7、14和28天，通过免疫荧光标记对出生后大鼠脑的脉管系统中的VEGF进行评价。如图2所示，从出生后第1至14天，神经脉管系统的VEGF染色强度稳定增加。类似地，每20μm-厚大脑切片中VEGF-阳性血管的数目从产后龄第1天的2.22±0.36显著增加至第14天的5.69±0.74(P<0.0001)(图2)。虽然发育中大鼠脑的脑脉管系统中VEGF和ETB二者的强度和表达均随年龄增加，但二者之间没有显著关联(r2＝0.8279；P＝0.0901)。

[0077] 出生后大鼠脑中神经生长因子个体发生

[0078] 在第1、7、14和28天，采用免疫荧光标记确定出生后大鼠脑中NGF的表达和分布。针对发育中大鼠脑的皮质中的NGF染色的强度从产后龄的第1天至第7天(P<0.001)并再从第7天至第14天(P<0.01)显著下降。从出生后第14天至第28天，NGF强度没有显著差异(图3)。出生后大鼠脑的室下区中NGF的强度在第7天至第14天之间下降(P<0.01)，而在产后龄第14天至第28天之间没有进一步下降(图3)。有意思的是，在皮质或SVZ实验期间，针对NGF染色呈阳性的细胞的平均数目未显著改变。然而，发育中大鼠脑的皮质中ETB受体和NGF下降与年龄之间有明显关联(r2＝0.9742；P＝0.0130)这些结果表明，随着大鼠脑的成熟，NGF的总体表达下降。该下降可能与神经组织中ETB受体的下降相关。

[0079] IRL-1620对出生后大鼠脑中内皮素B受体的影响

[0080] 在出生后第21天施用ETB受体激动剂IRL-1620导致在28天龄的大鼠脑中ETB受体与对照组相比显著增加。总之，如使用免疫印迹技术所测量，在接受过IRL-1620的动物中ETB受体的蛋白质表达增加(图6)。基于对脑切片的免疫荧光标记，发现与对照相比，经IRL-1620治疗的动物的脑脉管系统(图2)和皮质(图3)二者中ETB受体染色强度显著较高(P<
0.05)。这些结果表明，在新生发育期间选择性刺激ETB受体可导致这些受体的上调。

[0081] IRL-1620对出生后大鼠脑中血管内皮生长因子的影响

[0082] 如图2所见，大鼠发育过程中脑脉管系统中的VEGF增加。使用激动剂IRL-1620选择性刺激ETB受体导致与相同年龄的对照动物相比，出生后大鼠脑中VEGF染色的强度和VEGF阳性血管的数目二者进一步增加(P<0.05；图4)。这些结果采用免疫印迹技术来确认，表明用IRL-1620治疗的出生后大鼠脑中VEGF总体表达显著增加(P<0.05；图6)。这些发现表明，在发育期间选择性刺激ETB受体增强脑血管生成。

[0083] IRL-1620对出生后大鼠脑中神经生长因子的影响

[0084] 在大鼠脑中，对NGF的免疫荧光标记到出生后第14天显著减少。与对照相比，在出生后第21天施用ETB受体激动剂IRL-1620未改变大鼠皮质或室下区中NGF染色的强度和NGF阳性细胞的数目(图5)。类似地，通过免疫印迹技术测量到出生后大鼠脑中NGF的总体表达在对照组和经治疗组中是相当的(图6)。在出生后发育期间，选择性ETB受体刺激似乎对大鼠脑中的NGF水平不具有任何显著影响。

[0085] 实验规程

[0086] 动物

[0087] 将定期怀孕雌性Sprague-Dawley大鼠(Harlan,Indianapolis,IN)单独笼养于控制为环境温度(23±1℃)、湿度(50±10％)和12小时光/暗循环(6:00am–6:00pm)的室中。食物和水随意可得。所有动物护理和使用规程均经中西部大学(Midwestern University)的动物保护和利用委员会(IACUC)批准。为了避免因荷尔蒙改变引起的变动，只分离雄性幼崽并用于该研究。在出生后第1、7、14和28天，通过断头术对幼崽实施安乐死。无菌地移出大脑，并处理以用于ETB受体、VEGF和NGF的免疫荧光标记或免疫印迹分析。

[0088] 研究设计和试剂施用

[0089] 怀孕21天后，10只怀孕的雌性大鼠生育了70只雄性幼崽和65只雌性幼崽。随机选择30只雄性幼崽用于研究I，并按如下分为4组：组1＝雄性幼崽，在出生后第1天处死(N＝10)；组2＝雄性幼崽，在出生后第7天处死(N＝10)；组3＝雄性幼崽，在出生后第14天处死(N＝5)；组4＝雄性幼崽，在出生后第28天处死(N＝5)。随机选择另外20只雄性幼崽用于研究II，并分为2组：对照组(N＝10)和经IRL-1620治疗组(N＝10)。在出生后第21天，研究II中的幼崽接受3剂量的等渗盐水(1ml/kg)或ETB受体激动剂IRL-1620(5μg/kg；American Peptide Co,Inc.,Sunnyvale,CA)。以2小时的间隔静脉内给予所述剂量。在出生后第1、7、
14和28天，对所有幼崽称重并评价发育和行为特征。发育和行为特征包括积极对比迟缓行为、健康对比毛皮脱落、舔、梳理、进攻行为、排便、撒尿和湿狗样抖动。

[0090] 免疫荧光标记

[0091] 使用免疫荧光标记抗体确定发育中大鼠脑中ETB受体、VEGF和NGF的表达。在出生后第1、7、14和28天，通过断头术对雄性大鼠幼崽实施安乐死，并移出脑。在等渗盐水中清洗脑并转移到4％多聚甲醛(PFA)/NaPO4缓冲液中2小时以固定组织，接着在4℃下于20％蔗糖/4％PFA溶液中悬浮48小时。然后，在-30℃下，使用低温保持器(Microtome cryostat HM 505E；Walldorf,Germany)将脑切成20μm厚的冠状切面。按照Loo等(Loo等，2002)处理切片用于免疫荧光染色，稍作改动。ETB受体的第一抗体是羊中产生的针对大鼠ETB受体的羧基端肽的抗-ETB受体抗体(1:200；ab50658；Abcam，Cambridge，MA)。使用针对VEGF的抗体(抗-VEGF；1:500；ab46154；Abcam)和针对神经生长因子的抗体(抗-NGF；ab6199；Abcam)确定血管生成标志物和神经性标志物。在PBS中洗涤切片，然后用含0.3％Triton X-100的PBS中的
10％v/v血清封闭1小时。然后在4℃下用第一抗体孵育切片过夜，用PBS再次洗涤，并在室温下用合适的第二抗体孵育2小时。依次进行用于共定位的双重标记。用PBS冲洗切片，并用Vectashield(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)固定在载玻片上。使用倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse TiE，Melville，NY)检测荧光。使用NIS Elements BR成像软件(Nikon Instruments,Inc.,Melville,NY)，采用相同的曝光(VEGF和NGF为300毫秒；ETB为
800毫秒)和物镜(Plan Fluor 10x Ph1DL)设置以多通道ND获取来摄取所有用于分析的图像。

[0092] 免疫荧光分析

[0093] 具体地在大鼠脑的皮质和SVZ中进行对NGF的分析。在每个图像上覆盖100×100μm2的网格，在每个区域的每个脑切片的6个随机选择的非全等100μm2切片中测定对NGF染色2
呈阳性的细胞的数目。对所有至少50％落在100μm区域内的细胞进行计数。就血管生成的评价而言，确定每个脑切片中VEGF阳性血管的总数。采用NIS Elements BR成像软件(Nikon Instruments,Inc.,Melville,NY)用未改变的图像测量每个标志物的荧光密度。

[0094] 免疫印迹

[0095] 采用免疫印迹技术评价研究II中动物的出生后大鼠脑中VEGF、NGF和ETB受体的蛋白质水平。在出生后第28天将动物断头并移出脑，该天为施用盐水或ETB受体激动剂IRL-1620之后7天。将组织在10x(w/v)RIPA裂解缓冲液中均质化，根据Lowry法使用牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白质浓度(Lowry等，1951)。在Laemmli样品缓冲液中将蛋白质(60μg)变性，并溶解于10％SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上。封闭之后，在4℃用兔多克隆抗-VEGF(1:1000；Abcam,Cambridge,MA)、抗-NGF(1:500；Abcam,Cambridge,MA)或抗-ETB(1:1000；Sigma-Aldrich)抗体孵育膜过夜，接着在室温下用HRP缀合的第二抗体(1:2000；
Cell Signaling Technology,Inc.,MA)孵育1.5小时。使用β-微管蛋白(1:2000；Cell SignalingTechnology,Inc.MA)或β-肌动蛋白(1:10000；Sigma-Aldrich)作为加样对照。采用Kodak Gel Logic 1500成像系统(Carestream Health Inc.,New Haven,CT)用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)对标记的蛋白质进行可视化。采用Image J(NIH)软件分析蛋白质表达。

[0096] 统计分析

[0097] 使用GraphPad Instat-2.00进行功效分析。将功效设置为80％(β＝0.8)，所用显著性水平(α)为0.05。功效分析表明，5只每组的样品大小足以获得期望的功效。数据表示为平均值±S.E.M。采用单因素方差分析(ANOVA)接着Tukey事后比较检验进行组间比较。采用非配对t-检验对出生后28天对照组对比IRL-1620组进行比较。认为P值低于0.05具有显著性。采用GraphPad Prism 6.02(GraphPad,San Diego,CA)处理统计分析。

[0098] 本研究的目的是确定出生后大鼠脑中ETB受体、VEGF和NGF的个体发生，以及研究在出生后发育期间ETB受体的选择性刺激是否会导致受体或生长因子表达改变。在确定此前的研究(Briyal等，2012b)时，发现产后龄神经元组织中的ETB受体似乎减少。有趣的是，从出生后第1天至第14天，脑脉管系统中ETB受体和VEGF强度二者均增加。另一方面，从出生后第1天至第14天，大鼠脑的皮质和SVZ中NGF和ETB受体同时减少。在出生后第21天，通过静脉内施用IRL-1620选择性刺激ETB受体导致ETB受体和VEGF显著增加，但NGF未增加。这些结果表明，虽然ETB受体的个体发生可能与发育中脑内的血管生长因子和神经元生长因子二者相关，但在出生后发育期间刺激ETB受体相对于神经发生而言对血管生成发挥更大的影响。

[0099] 虽然大鼠模型通常用于本体论研究中，但重要的是认识到啮齿类动物与人在怀孕和发育(尤其是对于脑而言)方面不同。据报道，大鼠的16.7天相当于人的1年(Quinn,2005)。将该信息推演到本研究的时间线提供了以下信息：出生后1天＝人21天；出生后7天＝人5个月；出生后14天＝人10个月；以及出生后28天＝人20个月。这是显著的，因为人脑的快速生长始于第2个三个月末期，在出生时达到顶峰，然后在接下来的几年中降低。然而，妊娠期只有21天的大鼠在第一个出生后10天内经历脑生长和发育的最快增加(Gil-Mohapel等，2010)。该时期大约等同于人脑发育的第3个三个月。

[0100] 本研究所评价的该时间段，大鼠出生后第1至28天与等同人脑发育的头两年一致。如所预期的，在出生后第一天注意到皮质和SVZ中神经元生长因子与ETB受体的最高水平。
从第1天至第14天，这些水平随着脑成熟度增加而显著降低。第14天与第28天之间未注意到显著变化。据报道，至出生后第21天，整个大鼠脑的ETB受体蛋白质表达降低(Briyal等，
2012b)。本数据阐明了ETB缺陷大鼠幼崽中低水平的神经元祖细胞和增加的CNS紊乱的早期报道(Ehrenreich等，2000；Riechers等，2004；Vidovic等，2008)。发现发育中脑的脑皮质中NGF和ETB受体染色强度下降之间的显著相关性；然而，当在出生后第21天施用IRL-1620以刺激ETB受体时，该相关性丧失，脑皮质中ETB受体染色的增加未伴随NGF染色的增加。可能存在这样的调节机制，随着脑成熟启动了ETB受体和NGF染色的减少，并且该调节机制不允许IRL-1620产生任何药理学诱导的接近成熟的脑中ETB受体和NGF染色增加。

[0101] 因此，在CNS发育的晚期阶段期间，ETB受体刺激似乎不会增加神经发生，但已示出在成体神经血管修复过程期间增强该过程(Leonard和Gulati，2013)，表明脑缺血后失去调节机制。然而，选择性刺激ETB受体确实增加如通过免疫印迹技术测量的整个脑中ETB的总体表达以及发育中大鼠脑的脑脉管系统的ETB受体染色的强度，表明这样的刺激确实增强出生后晚期的血管生成。

[0102] 总之，脑脉管系统中VEGF和ETB强度二者在整个研究期间增加。VEGF是为CNS血管形成、发育和修复所必需的有力血管生成因子。此前的研究表明，VEGF主要在发育早期受限于皮质神经元，但之后随着血管床开始稳定转到血管周围的成熟神经胶质细胞(Ogunshola等，2000)。虽然未具体确定神经元组织中的VEGF表达，但结果表明脉管系统周围的VEGF随脑的发育而增加。在CNS发育的早期阶段，当NGF水平高时，VEGF可用作神经发生、神经元迁移和神经保护的启动子(Rosenstein等，2010)。在缺血损伤后的成体脑中见到了类似的效应，增加水平的VEGF促进脑血管修复(Gora-Kupilas和Josko，2005；Nowacka和Obuchowicz，2012)。事实上，此前的研究已示出在永久脑缺血后选择性刺激ETB受体导致VEGF和ETB二者的表达增加，与神经保护和脑血管修复相一致(Leonard和Gulati，2013)。在本研究中，在出生后第21天选择性刺激ETB受体导致脑脉管系统和整个脑二者中VEGF和ETB表达增加。这些结果用于确定ETB受体与VEGF的关系和强调其在发育脑中的重要性。

[0103] 新生阶段期间的低氧-缺血脑损伤是脑功能障碍的主要因素之一(Li等，2008)。特别地，早产儿常常经历低氧-缺血发作，其可导致减弱的皮质生长和发育。这些修复可持续整个童年和青春期，并且可引起神经微循环功能障碍，导致癫痫症、神经发育病症和精神病(Malik等，2013)。已知脑中的低氧-缺血发作增加低氧可诱导转录因子-1，其进而上调VEGF(Trollmann等，2008)。已示出，在遭受脑局部缺血的正常新生儿和成年大鼠的脑中，选择性ETB受体刺激上调ETB受体和VEGF的表达。可能早期用选择性ETB受体激动剂治疗可增强VEGF和神经保护，从而使得遭受低氧损伤的婴儿的脑能够修复该神经损伤。

[0104] 本研究表明，选择性刺激ETB受体增加发育中大鼠脑中的VEGF。虽然本研究中未注意到NGF的类似显著上调，但在出生后大鼠幼崽的皮质和SVZ中观察到了ETB受体和NGF个体发生之间的关联。似乎ETB受体和NGF二者在CNS发育早期是重要的。因为研究表明选择性ETB受体刺激能够增强缺血后成体脑中脑血管修复，令人感兴趣的是确定类似的治疗是否可显著改善遭受缺血的发育中的脑的修复机制。

[0105] 阿尔茨海默氏病的动物模型研究

[0106] 使重量为280至310g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)在使用前适应新环境至少4天。将动物放置于具有受控温度(23±1℃)、湿度(50±10％)和光(6:00A.M.至6:00P.M.)的室中。食物和水连续可得。用于实验规程的动物护理和使用经中西部大学的动物保护和利用委员会(IACUC)批准。所有麻醉和手术规程均依从由中西部大学的IACUC建立的指南。

[0107] 试剂和实验设计

[0108] 将淀粉样蛋白-β(1-40)(Tocris Bioscience,Ellisville,MO,USA)、IRL-1620[N-琥珀酰基-[Glu9,Ala11,15]内皮素1](American Peptide Co,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)和BQ788(AmericanPeptide Co,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)溶解于无菌盐水中，并且所有溶液均在注射前新鲜制备。氯胺酮(Butler Animal Health Supply,Dublin,OH,USA)以100mg/kg的剂量腹腔内(i.p.)施用，而甲苯噻嗪(Lloyd Laboratories,Shenandoah,IA,USA)以10mg/kg的剂量腹腔内(i.p.)施用。用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉大鼠，通过将大鼠放置于立体定位仪(David KopfInstruments,Tujunga,California,USA)中并固定插管(定位:距前囟侧1.0mm,后1.5mm，距骨4.0mm深)。用牙科用丙烯酸树脂(dental acrylic)将插管(Plastics One,Roanoke,VA,USA)锚定至置于头骨中的三颗螺钉。使动物从手术中恢复至少7天。7天后，使用植入的插管在侧脑室中用媒介物、Aβ(1-40)、ETB受体激动剂和/或拮抗剂治疗大鼠。媒介物、Aβ或ETB受体激动剂和拮抗剂经5分钟的时间以5μl的体积注射。使用Aβ(1-40)是因为其与Aβ(1-42)相比高度可溶，并且除记忆缺陷外还诱导脑和全身血管中内皮功能障碍((Nitta等，1994；Niwa等，2000；Smith等，2004；Weller等，
1998)。使用10μl Hamilton注射器递送试剂，并且单独使用10μl注射器分别实施试剂治疗。
在Aβ注射后1小时施用IRL-1620，而BQ788在IRL-1620注射前15分钟施用。在实验结束时，通过注射亚甲基蓝染料(5μl)并观察染色的位置和程度来确认插管的放置。所有实验均在第
15天进行(Briyal等，2011)。从第15天至第19天进行水迷宫测试，之后对动物实施安乐死。
在第15天对用于氧化应激测量的动物实施安乐死，而无需进行任何行为测试。通过以45mg/kg的剂量腹腔内施用新鲜制备的链脲霉素在属于糖尿病组的大鼠中诱导2型糖尿病。将链脲霉素溶解于pH为4.3的0.01M柠檬酸钠缓冲液中。在第3天，利用SureStep全血葡萄糖监测试剂盒从大鼠尾获取血糖，并测试高血糖症。认为血糖水平高于11.1mM的大鼠患有糖尿病。
将糖尿病和非糖尿病动物随机分为5组(每组6只大鼠)：(i)假操作；(ii)Aβ+媒介物；(iii)Aβ+IRL-1620；(iv)Aβ+BQ788；(v)Aβ+BQ788+IRL-1620。在第1、7和14天，经脑室内(i.c.v.)施用Aβ(1-40)(将20μg剂量等分成3个剂量(即，6.67μg)，3次注射，总计20μg)。从第1天Aβ注射开始，经脑室内每日施用特异性ETB受体激动剂IRL-1620(3μg)和特异性ETB受体拮抗剂BQ788(10μg)，持续14天。IRL-1620和BQ788的剂量基于本实验室进行的前期研究来选择(Leonard等，2011)。

[0109] 氧化应激标志物的评估

[0110] 在第15天，于大鼠脑中评估丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和过氧化物歧化酶(SOD)。将大鼠断头，快速移出脑，用冷冻盐水清洗并储存于-80℃。在48小时内进行生物化学分析。

[0111] 脂质过氧化的测量

[0112] 通过分光光度法测量脂质过氧化的标志物MDA(Ohkawa等，1979)。简言之，分别将每只动物的整个脑移出，并以10倍(w/v)在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中进行均质化。向0.1ml经处理的组织样品中添加乙酸1.5ml(20％，pH 3.5)、1.5ml硫代巴比妥酸(0.8％)和
0.2ml十二烷基磺酸钠(8.1％)。然后在100℃将该混合物加热60分钟。冷却该混合物，并添加5ml的丁醇：吡啶(15:1％v/v)和1ml的蒸馏水。以4,000rpm离心10分钟，取出有机层，使用分光光度计测量532nm处的吸光度。

[0113] 谷胱甘肽的测量

[0114] 通过分光光度法测量谷胱甘肽(Ellman，1959)。简言之，以10倍(w/v)在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中对整个脑进行均质化。然后用5％三氯乙酸离心该匀浆以分离蛋白质。向0.1ml上清液中添加2ml的磷酸缓冲液(pH 8.4)、0.5ml的5’5二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和0.4ml的双蒸水。涡旋该混合物并在15分钟内于412nm处读取吸光度。

[0115] 过氧化物歧化酶的测量

[0116] 按照Kakkar等(Kakkar等，1984)所述评估SOD。简言之，以10倍(w/v)0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)对整个脑进行均质化。向0.1ml经处理的组织样品中添加试剂焦磷酸钠缓冲液1.2ml(0.052M，pH 8.3)、0.1ml吩嗪硫酸甲酯(186μM)、0.3ml氮蓝四唑(300μM)和0.2ml NADH(780μM)。然后在30℃将该混合物孵育90分钟。之后添加4ml的正丁醇和1ml的乙酸。有力晃动该混合物。以4,000rpm离心10分钟后，取出有机层，使用分光光度测量560nm处的吸光度。使用Lowry法评估蛋白质(Lowry等，1951)。

[0117] 针对认知损伤的Morris水迷宫(MWM)测试

[0118] 在MWM中测试动物的空间学习和记忆(Morris，1984)。向圆形水箱(直径132cm，高60cm，涂白)中添加水(25±2℃)至40cm深，通过添加脱脂乳使水不透明。将池分为四个相等象限，标记为北、南、东和西。圆形白色的逃避平台(直径10cm)在水面下淹没约2厘米，距箱边缘10cm，处于指定为第II象限(目标象限)的位置。摄像机安装在池中央的上限(ceiling)。用Videomex跟踪系统监视逃避潜伏期和游泳路径长度，并用Videomix水迷宫软件(Columbus Instruments，Ohio，USA)收集数据。

[0119] 平台在整个获得性阶段实验期间保持在同一象限并在探查试验中移除。获得性试验(每天4个试验，持续4天)通过将大鼠放置于面对箱壁的池中从不同随机选择的开始位置而开始，记录找到不可见平台所需的时间。试验一直持续到大鼠发现平台或直到已经过去60秒以及约30秒的试验间隔。如果大鼠在60秒内没有发现平台，将其引导到平台，并在其上放置60秒。测量到达平台的时间(潜伏期以秒计)并测量游泳路径长度(以厘米计)。完成每天的第四个试验后，将大鼠干燥并放回其家笼。最终获得性试验后二十四小时，将平台从池中取出，并进行持续60秒的探查试验；记录在目标象限所花费的时间。在目标象限所花费时间表明学习后发生的记忆巩固程度。

[0120] 统计分析

[0121] 结果表示为平均值±S.E.M。在Morris水迷宫获得性试验中记录以下参数：逃避潜伏期(从释放点到达平台所需的时间，以秒计)和路径长度(大鼠从释放点到平台所经过的距离，以厘米计)。基于这些数据进行方差分析(ANOVA)，组为对象间因素，进行重复测量，例如试验和天数作为对象因素。采用事后分析(Tukey检验)来确定组间显著性。就探查试验数据而言，记录在第二象限所花费时间并通过单因素ANOVA分析以及通过Bonferroni检验进行事后分析。通过单因素ANOVA分析然后使用Bonferroni检验通过事后分析来分析氧化应激测量。所有分析均采用GraphPad Prism统计学软件，5.00版(GraphPad,San Diego,CA,USA)来进行。P<0.05代表显著性水平。

[0122] 2型糖尿病对大鼠的影响

[0123] 糖尿病大鼠行动迟缓并且与非糖尿病大鼠相比运动减少。然而，糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠在Morris水迷宫测试中具有相似的表现(图8至11)。图7说明糖尿病大鼠与非糖尿病大鼠之间的氧化应激参数没有差异。

[0124] 在经Aβ治疗的非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠中ETB受体激动剂和拮抗剂对氧化应激参数的影响

[0125] 为了确定ETB受体参与Aβ诱导的氧化应激参数变化，施用媒介物、IRL-1620或Q788+IRL-1620之后，测量假操作和经Aβ治疗的大鼠的脑中丙二醛、还原型谷胱甘肽和过氧化物歧化酶的水平(图1)。

[0126] 对脑丙二醛水平的影响

[0127] 测量脑中丙二醛(MDA)的水平以确定Aβ治疗后ETB受体刺激对脂质过氧化的影响(图7A)。如所预期的，与假操作组相比，非糖尿病组和糖尿病组的经Aβ治疗大鼠中MDA水平显著(P<0.0001)较高。经Aβ治疗的非糖尿病动物的MDA水平为516.13±14.02nmol/g湿组织，与假操作(112.1±1.84nmol/g湿组织)动物相比较高。在糖尿病大鼠中，经Aβ治疗动物的MDA水平为531.58±9.02nmol/g湿组织，而假操作动物中为114.32±2.05nmol/g湿组织。对于非糖尿病(278.47±8.55nmol/g湿组织)动物和糖尿病(315.09±5.25nmol/g湿组织)动物二者而言，与经媒介物治疗Aβ大鼠相比，经IRL-1620治疗的大鼠中MDA水平显著(P<
0.001)降低。在IRL-1620之前施用BQ788，阻断IRL-1620诱导的MDA水平变化，并且该水平与经媒介物治疗大鼠中所见相似。

[0128] 对脑还原型谷胱甘肽水平的影响

[0129] 经Aβ治疗的非糖尿病动物和糖尿病动物中的还原型谷胱甘肽(GSH)水平显著(P<0.0001)低于假操作动物的所述水平。经Aβ治疗的非糖尿病组和糖尿病组的平均GSH水平分别为102.5±5.96和81.2±4.33μg/g湿组织，而在假操作组大鼠中，其为239.1±8.0μg/g湿组织。用IRL-1620治疗显著(P<0.001)增加经Aβ治疗非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠(分别为
192.74±6.26和166.42±6.63μg/g湿组织)的脑中GSH水平(图7B)。用BQ788预治疗阻断了IRL-1620治疗对GSH水平(81.2±5.49μg/g湿组织；P<0.001)的正效应。

[0130] 对脑超氧岐化酶水平的影响

[0131] 经媒介物治疗的非糖尿病(13.23±0.53U/mg蛋白质)和糖尿病(11.07±.54U/mg蛋白质)Aβ大鼠的脑中超氧化物歧化酶(SOD)的水平显著(P<0.0001)低于假操作组的所述水平(35.22±1.43U/mg蛋白质)。施用IRL-1620显著提高非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠中的SOD水平(分别为22.26±1.16和21.4±1.65U/mg蛋白质)(图7C)。与GSH相似，但在施用IRL-1620之前用BQ788对非糖尿病和糖尿病Aβ动物进行预治疗时，SOD水平显著(P<0.001)较低(分别为15.32±0.44和16.52±0.45U/mg蛋白质)。

[0132] ETB受体激动剂和拮抗剂对经Aβ治疗的非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠的记忆缺陷的影响

[0133] 在水迷宫获取(图8和10)和探查试验测试(图9和11)中，非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠之间未见显著差异。用Aβ治疗的大鼠花费显著(p<0.0001)更长的时间(逃避潜伏期)来寻找平台。如由在连续几天中逃避潜伏期较少所表明的，假操作组在隐藏平台测试中表现得到改善(天数效应，F(3,100)＝3.968，p<0.001)。与假操作组相比，用媒介物治疗的Aβ大鼠在第1、2、3和4天的逃避潜伏期具有显著性差异(F(3,59)＝8.273，p<0.0001)。然而，当将ETB受体激动剂IRL-1620施用给经Aβ治疗的大鼠时，在训练第3天和第4天逃避潜伏期与经媒介物治疗的Aβ大鼠相比显著减少(F(4,59)＝19.602，p<0.001)。IRL-1620显著改善了大鼠中Aβ治疗引起的认知损伤。另一方面，施用ETB受体拮抗剂BQ788阻断了Aβ大鼠中由IRL-1620产生的逃避潜伏期改善(图8和10)。在水迷宫任务的获取性试验期间，逃避潜伏期差异还示于每组的代表性轨迹中(图8和10)。经数天，大鼠到达平台(路径长度)所经过的距离减少(F(3,51)＝76.3，p<0.0001)，而且存在显著的第x天组相互作用(F(12,100)＝8.88，p<0.0001)，表明试验的每天内的组间差异。假操作、用媒介物治疗的Aβ大鼠和用IRL-1620治疗的Aβ大鼠之间存在显著性差异(F(2,57)＝24.2，p<0.01)；事后分析表明，与假操作组相比，用媒介物治疗的Aβ大鼠组游过更长的路径长度(p<0.001)。与媒介物组相比，用IRL-1620治疗的Aβ大鼠组游过显著(p<0.001)较短的路径长度，表明IRL-1620治疗的正效应(图8和10)。Aβ在大鼠中产生了显著的认知功能损伤，其可用ETB受体激动剂来改善，并用特异性ETB受体拮抗剂来阻断。

[0134] 从目标象限(第II象限)移出平台导致与其他象限相比优先游进目标象限的一般趋势(探查试验)。因此，将第II象限所花费时间与所有组进行比较以观察试剂对记忆保持的影响。特别地，在其他象限花费的时间未反映记忆巩固程度，并因此未对其进行分析。在探查试验中，与假操作治疗大鼠相比，用Aβ治疗的大鼠花费在目标象限的时间显著较少，表明经Aβ治疗大鼠的记忆缺陷。与用媒介物治疗的Aβ大鼠相比，施用ETB受体激动剂IRL1620显著(p<0.0001)增加花费在目标象限的时间(图9和11)。向经Aβ治疗的大鼠施用ETB受体拮抗剂BQ788对目标象限所花费时间未产生任何改善。花费在目标象限的时间差异示于水迷宫任务的探查试验期间每组的代表性轨迹中(图9和11)。Aβ在大鼠中产生了显著的记忆缺陷，其可用ETB受体激动剂治疗来改善，并用特异性ETB受体拮抗剂来阻断。

[0135] 本研究的目的是确定在成年糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠中脑室内注射Aβ实验诱导认知损伤之后，通过IRL-1620选择性ETB受体刺激对功能恢复的影响。目前的研究表明，IRL-1620在糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠中对Aβ诱导的认知损伤产生了显著的预防性作用。为了确认IRL-1620的影响对ETB受体刺激的特异性，使用选择性ETB受体拮抗剂BQ788来阻断IRL-1620的作用。在非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠中，Aβ治疗产生氧化应激标志物的显著增加，并且用选择性ETB受体激动剂IRL-1620治疗显著减少氧化应激标志物。在Aβ非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠中，用特异性ETB受体拮抗剂BQ788预治疗来阻断由IRL-1620诱导的氧化应激标志物减少。

[0136] 糖尿病和AD的发病率随着年龄增加而增加，而AD的发病率在患有糖尿病的患者中显著较高(Janson等，2004)。在病理学上，二者与改变的葡萄糖体内平衡及淀粉样蛋白质的细胞外积累有关。这表明存在一般根本机制，例如淀粉样蛋白质的交叉引晶(cross-seeding)。因此，在用Aβ治疗的非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠中研究了IRL-1620的效应。

[0137] 痴呆(特别是AD型痴呆)的流行正在增加，并且其为老年人最重要的神经退行性病症之一。最近的研究支持代谢和血管功能障碍与AD的病理和发展有关。血管改变及葡萄糖利用受损和血流改变在AD诊断一起发生和在其之前发生(Baquer等，2009；Casadesus等，2007；Meier-Ruge等，1994)。这些改变在认知受损之前并使潜在的AD病变加剧。血管功能障碍的发现和预防可导致预防或停止AD发展的新策略。在AD中与血管变化密切相关的是Aβ(AD脑老年斑中的主要蛋白质组分)。脑中升高水平的Aβ是AD的突出特征之一(Hardy和Selkoe,2002)。产生最多Aβ的组织是脑和骨骼肌，其二者均具有高代谢和良好发育的血管网络(Cirrito等，2005；Ethell，2010)。血管损伤和反应性神经胶质增生在AD脑中与淀粉样蛋白质沉积物共定位，表明脉管系统可以是AD病理学的重要临床部位(Suo等，1998)。

[0138] 长期以来已知ET系统在脑血管循环中扮演着重要角色。一些研究表明ET参与AD。由于由ET-1通过ETA受体引起的高度有效的血管收缩，假设施用ET拮抗剂会降低与AD相关的损伤。ETA受体拮抗剂BQ123和BMS182874在大鼠Aβ治疗之后示出降低的氧化应激并改善学习和记忆缺陷。然而，组合的ETA/B受体拮抗剂没有有益作用(Briyal等，2011)。这致使我们研究ETB受体在AD中的参与。事实上，脑中的ET结合位点主要是ETB受体，并且ETB受体激动剂用作针对Aβ神经毒性的抗凋亡因子(Yagami等，2002)。血管病理学中直接示出Aβ的升高，并且AD中的血管功能障碍的特征在于血管结构的破坏，包括下部毛细管密度和降低的血流量(Bell和Zlokovic，2009；de la Torre，1994；Iadecola等，2009；Zlokovic，2008)。相反，已知活化内皮ETB受体引发血管舒张，而且我们实验室以前的研究表明，这导致正常大鼠中CBF增加(Leonard和Gulati，2009)，表明ETB激动剂在治疗和预防AD中的可能作用。

[0139] 在本研究中，经Aβ治疗的大鼠接受媒介物或IRL-1620 14天。在第15天，评价动物的认知功能障碍并移出脑以分析氧化应激标志物。如通过降低水平的丙二醛(MDA)和增加水平的还原型谷胱甘肽(GSH)及过氧化物歧化酶(SOD)所测量，与媒介物治疗组相比，用IRL-1620治疗有效减少氧化应激。在另一方面，用BQ788阻断ETB受体导致氧化应激增加。增加水平的MDA和降低水平的抗氧化剂GSH和SOD为作为AD病理学早期事件发生的氧自由基产生的所有标志(Cutler等，2004；Nunomura等，2001)。认为AD的病因是复杂的，并起始各种生化反应，导致过量的细胞内Ca2+、谷氨酸兴奋毒性、活性氧簇的产生和最终的细胞凋亡。将靶向这些事件以减缓或阻止不可逆损伤的试剂标记为神经保护剂。氧化应激和Aβ彼此相关(Hensley等，1994；Mark等，1997)。氧化应激也有助于血管功能障碍。据报道，AD发病期间的氧化损伤可能直接由Aβ导致(Murray等，2007；Murray等，2005)。在本文中公开了ETB受体激动剂IRL-1620降低因Aβ增加的氧化应激标志物。似乎Aβ可以产生血管收缩和增加氧化应激，这两者可通过ET介导。已知内皮ETB受体的刺激引发血管舒张，而且我们实验室以前的研究表明，这导致CBF增加。因此，ETB受体激动剂可能相当有效地预防AD中由于Aβ引起的损伤。

[0140] 因此，在本文中公开了Aβ治疗之后ETB受体的刺激导致功能恢复。采用MWM进行行为研究以确定ETB受体激动剂是否能够改善由Aβ引起的学习和记忆损伤。发现如由在探查试验中显著更长的逃逸潜伏期和对之前含有平台的象限无优选示出Aβ在部分记忆中产生显著损伤。其他研究示出由于Aβ引起的学习和记忆缺陷(Ahmed等，2010；Lopes等，2010；Tsukuda等，2009)。在本文示出特异性ETB受体激动剂IRL-1620显著提高由Aβ治疗引起的空间记忆缺陷。另一方面，用BQ788(在媒介物或IRL-1620之前给予)拮抗ETB受体导致与媒介物组所见的那些相似的学习和记忆缺陷。这些结果表明，IRL-1620所见的改进是由于ETB受体的选择性刺激。观察到的功能缺陷与氧化应激标志物所观察到的变化相符。

[0141] 已知用IRL-1620活化ETB受体通过一氧化氮(NO)释放引起脑血管舒张和血流增加(Kitazono等，1995；Leonard和Gulati，2009；Tirapelli等，2005)。以前的研究结果披露，与内皮细胞NO形成的NO生物利用度相关的脑神经血管功能障碍有助于AD中认知减退和神经退行性病变(de la Torre等，2003)。NO还在AD的CBF调节和细胞活力和神经细胞保护调节中起到强制性作用(Toda等，2009)。最近的研究表明，内皮NO刺激和经由药理学手段增加的CBF增强血管生成(Chen等，2007；Ding等，2008)。沿着这些线，ETB受体已示出通过eNOS增强新血管形成(Goligorsky等，1999)。使用ETB受体缺陷模型的此前报告表明，该受体促进神经元存活并减少海马、齿状回和嗅上皮中的细胞凋亡(Ehrenreich，1999；Laziz等，2011；Riechers等，2004)。eNOS的诱导和ETB受体活化的直接抗凋亡神经元影响可在减少氧化应激和改善AD后行为恢复中发挥作用。

[0142] 总之，在目前的研究中在ETB受体激动剂IRL-1620之后氧化应激的减少和认知损伤的改善及通过特异性ETB受体拮抗剂BQ788这些效应的减弱表明，ETB受体可以是在AD中用于神经保护的新治疗靶标。

[0143] 中风动物模型的研究

[0144] IRL-1620对大脑中动脉闭塞大鼠中脑内皮素受体水平的影响：ETB受体大量存在于CNS中并且似乎在其发育中起到关键作用。已证明，脑中的ETB受体在出生时过表达，并且其表达随着脑的成熟而降低(Briyal等，2012b)。还已表明，急性缺血阶段之后是神经元和毛细管的密集出芽(Carmichael，2006；Murphy和Corbett，2009)以及神经胶质细胞的活化，来为神经元生长和可塑性创建环境(Hermann和Zechariah，2009；Zhang和Chopp,2009)。通过刺激ETB受体，再生应答将在缺血脑中病理学上活化。通过IRL-1620刺激ETB受体已示出在MCAO大鼠中提供神经保护作用(Leonard等，2011；2012；Leonard和Gulati，2013)。ETA受体在缺血后24小时在梗塞半球中增加并随后经一周恢复到正常水平，另一方面，ETB受体表达的显著增加在1周后只发生在用IRL-1620治疗的大鼠的梗塞半球(Leonard等，2012)。可以设想，IRL-1620不仅刺激ETB受体，而且在更长的时间增加这些受体的数目和亲和力。

[0145] IRL-1620对局灶性脑缺血后的神经缺陷的影响：在初步研究中，确定了在大鼠永久大脑中动脉闭塞之后用IRL-1620选择性活化ETB受体的影响。在大脑中动脉闭塞后24小时，与假操作大鼠相比存在显著(P<0.001)较高的神经缺陷和不良运动功能，表明脑缺血诱导之后的神经损伤。与经媒介物治疗的动物相比，用IRL-1620治疗的动物在所有神经和运动功能测试中示出显著的改善。在更长期的研究中，脑缺血导致如在梗塞后1、4和7天通过脚步犯规错误和转棒测试(rotarodtest)测量的运动协调的明显损失。而经媒介物治疗的闭塞大鼠在每个评估中表现更差，用ETB受体激动剂IRL-1620治疗的动物在梗塞后第1天示出最小缺陷，并经7天时间改善。用ETB受体拮抗剂BQ-788预治疗，接着用媒介物或IRL-1620治疗导致与假操作(P<0.001)治疗或IRL-1620(P<0.05)治疗相比显著更多的缺陷，表明用IRL-1620观察到的改善对ETB受体的刺激具有特异性(Leonard等，2011；2012)。

[0146] 在局灶性脑缺血之后IRL-1620对ETB受体的结合特征的影响：在MCAO之后1天和7天，确定脑中ETB受体结合特征的改变。MCAO在大鼠中产生并使用[125I]-IRL-1620(特异性活性2200Ci/mmol)作为放射性配体以及冷IRL-1620(0-32nM)作为置换剂来进行结合研究。使用1μM浓度的IRL-1620确定非特异性结合。使用用于Windows的GraphPad Prism 5.00版(GraphPad Software,San Diego)计算Kd和Bmax值。结合特征(Kd和Bmax)在MCAO后24小时未改变。然而，在MCAO后7天观察到左半球和右半球中ETB受体结合的Kd值显著降低。右(缺血)半球中Kd的降低显著(P<0.001)大于左(非缺血)半球。Bmax在左半球和右半球中均增加，与左半球相比，右半球示出显著(P<0.001)较大的增加(图14)。可得出结论，在脑缺血第7天，ETB受体密度和亲和力的增加是为缺血脑提供神经保护的尝试。

[0147] IRL-1620对大脑中动脉闭塞大鼠的梗塞体积的影响：大脑中动脉梗塞7天导致经媒介物治疗大鼠中177.06±13.21mm3的梗塞体积。与媒介物相比，施用IRL-1620显著减少3
梗塞体积(54.06±14.12mm ；P<0.05)。当ETB受体拮抗剂BQ-788与媒介物或IRL-1620一起给予时，梗塞体积未降低(图12)。在经媒介物治疗的动物中注意到大量水肿，梗塞半球比对侧的半球大9.73±1.26％，而经IRL-1620治疗的动物没有表现出显著水肿，梗塞半球仅比非梗塞半球大1.51±1.81％。相反，用BQ-788阻断ETB受体接着用媒介物或IRL-1620治疗显著增加水肿(17.02±3.17和17.97±5.17％，分别为P<0.01)(Leonard等，2012)。

[0148] IRL-1620对大鼠局灶性脑缺血后7天存活的影响：还进行了研究以确定在大脑中动脉闭塞(MCAO)的大鼠中使用选择性激动剂IRL-1620刺激ETB受体的影响。发现在整个7天观察期内，经假操作治疗的大鼠没有死亡。然而，媒介物治疗组的MCAO大鼠到第7天示出38％的死亡率。另一方面，用IRL-1620治疗的MCAO大鼠在整个7天期间未示出死亡。然而，用ETB受体拮抗剂、BQ-788+媒介物或BQ-788+IRL-1620治疗的MCAO大鼠在7天的观察期示出
25％的死亡率(图13)(Leonard等，2012)。初步结果及支持文献促进对于在脑缺血的大鼠中刺激ETB受体的神经保护和神经恢复作用相关的机制的研究。

[0149] IRL-1620对大鼠脑缺血后血管生成和神经发生的影响：血管生成和神经发生是对于中风后恢复正常脑功能必不可少的神经血管重塑的驱动力(Hawkins和Davis，2005)。VEGF是以其促进血管生成和增强血管通透性力的能力著称的内源性蛋白。在缺氧条件例如脑缺血下，在神经元、星形胶质细胞和内皮细胞中通过低氧诱导因子-1(HIF-1)诱导VEGF的表达(Breier和Risau，1996)。一旦表达，VEGF起始直接和间接神经保护活动，抑制细胞凋亡，刺激神经发生和血管生成，增加葡萄糖摄取并活化抗氧化剂(Gora-Kupilas和Josko，
2005)。已证实，正常大鼠中ETB受体激动剂的脑室内(i.c.v.)施用刺激脑中VEGF产生，并活化VEGF受体，而在培养的星形胶质细胞中，该激动剂提高VEGF-AmRNA以及BrdU掺入(Koyama等，2012；Koyama等，2011)。在我们之前的研究中，ETB受体激动剂IRL-1620已示出在永久脑缺血后24小时和1周提供显著的神经保护。因此，对脑缺血大鼠中ETB受体刺激后的神经保护和神经恢复作用进行了研究(Leonard和Gulati,，2013)。在闭塞后24小时，发现IRL-1620治疗增加了缺血大鼠脑中ETB受体表达和皮质、纹状体和室下区(SVZ)中保留的神经元数目(图15至22)。与媒介物治疗相比，IRL-1620还增加了用血管内皮生长因子(VEGF)标记的血管数目(图1至20)。MCAO后1周，每30μm脑切片中VEGF-阳性血管的数目在IRL-1620组为
11.33±2.13，相比之下，媒介物组中为4.19±0.79(P<0.01)，表明血管生成的增加。此外，接受IRL-1620的动物示出增加数目的增殖细胞(P<0.0001)，并且在梗塞脑中细胞针对NGF染色呈阳性(P<0.0001)。经IRL-1620治疗的皮质、纹状体和SVZ中NGF阳性细胞每100μm2的数目分别为2.29±0.31、2.08±0.26和3.05±0.38，表明与媒介物组相比，神经发生的显著增加，其平均为每100μm2小于1的NGF阳性细胞(图21和22)。用ETB拮抗剂BQ-788预治疗阻断了IRL-1620治疗的影响，证实了ETB受体在IRL-1620的神经血管重塑活动中的作用。本研究的结果表明，在梗塞当天施用的IRL-1620是神经保护性的并且在脑缺血后增强血管和神经重塑(Leonard和Gulati，2013)。

[0150] ETB受体激动剂IRL-1620在缺血性中风的治疗中：本文公开了特异性ETA受体拮抗剂预防Aβ诱导的ETA受体表达、氧化应激和认知缺陷的增加。然而，观察到当使用组合的ETA/B受体拮抗剂时，有益的影响丧失(Briyal等，2011)。这些发现导致对ETB受体在CNS病症中的作用的研究。ETB受体大量存在于CNS中并似乎在其发育中发挥关键作用。已经证明，脑中的ETB受体在出生时过表达，并且其表达随着脑的成熟降低(Briyal等，2012b)。还表明，受损的脑表现出童年组织模式重新出现，让人联想到个体发育状态并引起恢复。然而，CNS的内源性重塑不足以恢复神经功能。已发现，ETB受体激动剂IRL-1620[Suc-[Glu9,Ala11,15]-内皮素-1(8-12)]可以增加ETB受体在CNS中的表达。ETB受体的增加会产生凋亡减少，并促进血管生成和神经发生。已证实，缺血后神经元、神经胶质细胞和巨噬细胞中ETB受体的表达增加。此外，研究表明，ETB受体活化增强神经元的增殖并抑制细胞凋亡。通过刺激ETB受体药理学上活化了受损脑中的再生应答。在大鼠缺血后，通过选择性ETB激动剂IRL-1620进行ETB受体刺激显著改善了神经缺陷、运动功能和氧化应激标志物和减少梗塞体积(Leonard等，2011；2012)。在永久脑缺血后24小时(Leonard等，2011)和1周(Leonard等，2012)，ETB受体激动剂IRL-1620提供了显著的神经保护和减小的梗塞体积83.66％(在急性研究中)和69.49％(在慢性研究中)。IRL-1620治疗增加了缺血大鼠脑ETB受体表达和皮质、纹状体及脑室下区(SVZ)中保留的神经数目。与媒介物治疗相比，IRL-1620还提高标记有血管内皮生长因子(VEGF)的血管的数目(Leonard和Gulati，2013)。因此，发现静脉内施用IRL-1620在通过血管生成和神经发生预防中风后损伤及辅助缺血脑的神经血管重塑中非常有效(Leonard和Gulati，2013)。研究进一步表明通过IRL-1620刺激ETB受体提供了神经保护(Leonard等，2011；2012)，并且它可以用作阿尔茨海默氏病的治疗剂(Briyal等，2011)。已证明，IRL-1620预防由Aβ诱导的认知损伤和氧化应激(Briyal等，2011)。预期通过用IRL-1620刺激ETB受体增强可能的存活机制导致更好的脑缺血后恢复。大多数中风患者示出实质性神经改善(Dimyan和Cohen，2011)，表明内源性修复机制。因此，存在开发可刺激和增强这些机制的药物制剂的可能性。可用于治疗脑缺血的两种主要方法是神经保护和神经恢复，其中神经保护需要急性干预，而神经恢复可在中风恢复阶段启动(Andres等，2011；
Bacigaluppi等，2009；Liu等，2008)。已经使用诸如以下的药剂进行几次试验或者这些试验正在进行中：安非他明(amphetamine)、哌甲酯(methylphenidate)、左旋多巴(levodopa)、西地那非(sildenafil)、血清素摄取抑制剂(serotonin uptake inhibitor)、促红细胞生成素(erythropoietin)、他汀类(statin)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)，但这些均未涉及ETB受体的刺激。在本文中预期ETB受体的刺激在许多实施方案中产生神经保护、神经恢复或两者。

[0151] 参考文献：

[0152] Ahmed T，Enam SA and Gilani AH(2010)Curcuminoids enhance memory in an amyloid-infused rat model of Alzheimer′s disease.Neuroscience 169：1296-1306.[0153] Andres RH，Horie N，Slikker W，Keren-Gill H，Zhan K，Sun G，Manley NC，Pereira MP，Sheikh LA，McMillan EL，Schaar BT，Svendsen CN，Bliss TM and Steinberg GK(2011)Human neural stem cells enhance structural plasticity and axonal transport in the ischaemic brain.Brain：a journal of neurology 134：1777-1789.[0154] Asano T，Ikegaki I，Satoh S，Suzuki Y，Shibuya M，Sugita K and Hidaka H(1990)Endothelin：a potential modulator of cerebral vasospasm.European journal of pharmacology 190：365-372.

[0155] Bacigaluppi M，Pluchino S，Peruzzotti-Jametti L，Kilic E，Kilic U，Salani G，Brambilla E，West MJ，Comi G，Martino G and Hermann DM(2009)Delaycd post-ischaemic neuroprotection following systemic neural stem cell transplantation involves multiple mechanisms.Brain：a journal of neurology 132：2239-2251.[0156] Baquer NZ，Taha A，Kumar P，McLean P，Cowsik SM，Kale RK，Singh R and Sharma D(2009)A metabolic and functional overview of brain aging linked to neurological disorders.Biogerontology10：377-413.

[0157] Barone FC，Ohlstein EH，Hunter AJ，Campbell CA，Hadingham SH，Parsons AA，Yang Y and Shohami E(2000)Selective antagonism of endothelin-A-receptors improves outcome in both head trauma and focal stroke in rat.Journal of cardiovascular pharmacology 36：S357-361.

[0158] Barone FC，White RF，Elliott JD，Feuerstein GZ and Ohlstein EH(1995)The endothelin receptor antagonist SB 217242reduces cerebral focal ischemic brain injury.Journal of cardiovascular pharmacology 26Suppl 3：S404-407.

[0159] Bath PM and lees KR(2000)ABC of arterial and venous disease.Acute stroke.BMJ320：920-923.

[0160] Bell RD and Zlokovic BV(2009)Neurovascular mechanisms and blood-brain barrier disorder in Alzheimer′s disease.Acta neuropathologica 118：103-113.[0161] Bredesen DE，Rao RV and Mehlen P(2006)Cell death in the nervous system.Nature 443：796-802.

[0162] Breier G and Risau W(1996)The role of vascular endothelial growth factor in blood vessel formation.Trends in cell biology 6：454-456.[0163] Briyal S and Gulati A(2010)Endothelin-A receptor antagonist BQ123potentiates acetaminophen induced hypothermia and reduces infarction following focal cerebral ischemia in rats.European journal of pharmacology 644：73-79.

[0164] Briyal S，Gulati A and Gupta YK(2007)Effect of combination of endothelin receptor anlagonist(TAK-044)and aspirin in middle cerebral artery occlusion model of acute ischemic stroke in rats.Methods Find Exp Clin Pharmacol29：257-263.

[0165] Briyal S，Gulati K and Gulati A(2012a)Repeated administration of exendin-4reduces focal cerebral ischemia-induced infarction in rats.Brain research 1427：23-34.

[0166] Briyal S，Lavhale MS and Gulati A(2012b)Repeated administration of centhaquin to pregnant rats did not affect postnatal development and expression of endothelin receptors in thc brain，heart or kidney of pups.Arzneimittel-Forschung 62：670-676.

[0167] Briyal S，Philip T and Gulati A(2011)Endothelin-A receptor antagonists prevent amyloid-beta-induced increase in ETA receptor expression，oxidative stress，and cognitive impairment.Journal of Alzheimer′s disease：JAD 23：491-503.

[0168] Carmichael ST(2006)Cellular and molecular mechanisms of neural rcpair after stroke：making waves.Annals of neurology 59：735-742.

[0169] Casadesus G，Moreira PI，Nunomura A，Siedlak SL，Bligh-Glover W，Balraj E，Petot G，Smith MA and Perry G(2007)Indices of metabolic dysfunction and oxidative stress.Neurochemical research32：717-722.

[0170] Chen J，Cui X，Zacharek A，Jiang H，Roberts C，Zhang C，Lu M，Kapke A，Feldkamp CS and Chopp M(2007)Niaspan increzses angiogenesis and improves functional recovery after stroke.Annals of neurology 62：49-58.

[0171] Chuquet J，Benchenane K，Toutain J，MacKenzie ET，Roussel S and Touzani O(2002)Selective blockane of endothelin-B receptors exacerbates ischemic brain damage in the rat.Stroke；a journal of cerebral circulation 33：3019-3025.[0172] Cirrito JR，Yamada KA，Finn MB，Sloviter RS，Bales KR，May PC，Schoepp DD，Paul SM，Mennerick S and Holtzman DM(2005)Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.Neuron 48：913-922.

[0173] Cutler RG，Kelly J，Storie K，Pedersen WA，Tammara A，Hatanpaa K，Troncoso JC and Mattson MP(2004)Invplvement of oxidative stress-induced abnormalities in ceramide and cholesterol metabolism in brain aging and Alzheimer′s disease，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101：2070-2075.

[0174] de la Torre JC(1994)Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer′s disease.Neuroscience and biobehavioral reviews 18：397-401.[0175] de la Torre JC，Pappas BA，Prevot V，Emmerling MR，Mantione K，Fortin T，Watson MD and Stefano GB(2003)Hippocampal nitric oxide upregulation precedes memory loss and A beta 1-40accumulation after chronic brain hypoperfusion in rats.Neurological research 25：635-641.

[0176] Deb P，Sharma S and Hassan KM(2010)Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke：An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis.Pathophysiology 17：197-218.

[0177] Dembowski C，Hofmann P，Koch T，Kamrowski-Kruck H，Riedesel H，Krammer HJ，Kaup FJ and Ehrenreich H(2000)Phenotype，intestinal morphology，and survival of Iomozygous and heterozygous endothelin B receptor--deficient(spotting lethal)rats.J Pediatr Surg 35：480-488.

[0178] Dimyan MA and Cohen LG(2011)Neuroplasticity in the context of motor rehabilitation after stroke.Nature reviews Neurology 7：76-85.

[0179] Ding G，Jiang Q，Li L，Zhang L，Zhang ZG，Ledbetter KA，Panda S，Davarani SP，Athiraman H，Li Q，Ewing JR and Chopp M(2008)Magnetic resonance imaging investigation of axonal remodeling and angiogenesis after embolic stroke in sildenafil-treated rats.Journal of cerebral bhood flow and metabolism：official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism28：1440-1448.

[0180] Donnan GA，Fisher M，Macleod M and Davis SM(2008)Stroke.Lancet 371：1612-1623.

[0181] Ehrenreich H(1999)The astrocytic endothelin system：toward solving a mystery focus on″distinct pharmacological properties of ET-1 and ET-3 on astroglial gap junctions and Ca(2+)signaling″.The American journal of physiology 277：C614-615.

[0182] Ehrenreich H，Nau TR，Dembowski C，Hasselblatt M，Barth M，Hahn A，Schilling L，Siren AL amd Bruck W(2000)Endothelin b receptor deficiency is associated with an increased rate of neuronal apoptosis in the dentate gyrus.Neuroscience 95：993-1001.

[0183] Ehrenreich H，Oldenburg J，Hasselblatt M，Herms J，Dembowski C，Loffler BM，Brock W，Kamrowski-Kruck H，Gall S，Siren AL and Schilling L(1999)Endothelin B receptor-deficient rats as a subtraction model to study the cerebral endothelin system.Neuroscience 91：1067-1075.

[0184] Ellman GL(1959)Tissue sulfhydryl groups.Archives of biochemistry and biophysics 82：70-77.

[0185] Ethell DW(2010)An amyloid-notch hypothesis for Alzheimer′s disease.The Neuroscientist：a review journal bringing neurobiology，neurology and psychiatry 16：614-617.

[0186] Feigin VL，Lawes CM，Bennett DA，Barker-Collo SL and Parag V(2009)Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies：a systematic review.Lancet Neurol 8：355-369.

[0187] Fisher M and Norrving B(2011)The International Agenda for Stroke，in 1st Global Conference on Healthy Lifstyles and Noncommunicable Diseases Control(Association AH ed)，American Heart Association，Moscow.

[0188] Font MA，Arboix A and Krupinski J(2010)Angiogenesis，neurogenesis and neuroplasticity in ischemic stroke.Current cardiology reviews 6：238-244.[0189] Gil-Mohapel J，Boehme F，Kainer L and Christie BR(2010)Hippocampal cell loss and neurogenesis after fetal alcohol exposure：insights from different rodent models.Brain Res Rev 64：283-303.

[0190] Goligorsky MS，Budzikowski AS，Tsukahara H and Noiri E(1999)Co-operation between endothelin and nitric oxide in promoting endothelial cell migration and angiogenesis.Clinical and experimental pharmacology&physiology 26：269-271.

[0191] Gora-Kupilas K and Josko J(2005)The neuroprotective function of vascular endothelial growth factor(VEGF).Folia neuropathologica/Association of Polish Neuropathologists and Medical Research Centre，Polish Academy of Sciences 43：31-39.

[0192] Goto K，Kasuya Y，Matsuki N，Takuwa Y，Kurihara H，Ishikawa T，Kimura S，Yanagisawa M and Masaki T(1989)Endothelin activates the dihydropyridine-sensitive，voltage-dependent Ca2+channel in vascular smooth muscle.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86：3915-3918.

[0193] Gulati A，Kumar A，Morrison S and Shahani BT(1997)Effect of centrally administered endothelin agonists on systemic and regional blood circulation in the rat：role of sympathetic nervous system.Neuropeptides 31：301-309.[0194] Gulati A，Kumar A and Shahani BT(1996)Cardiovascular effects of centrally administered endothelin-1 and its relationship to changes in cerebral blood flow.Life sciences 58：437-445.

[0195] Gulati A，Rebello S，Roy S and Saxena PR(1995)Cardiovascular effects of centrally administered endothelin-1 in rats.Journal of cardiovascular pharmacology 26 Suppl 3：S244-246.

[0196] Gupta YK，Briyal S，Sharma U，Jagannathan NR and Gulati A(2005)Effect of endothelin antagonist(TAK-044)on cerebral ischemic volume，oxidative stress markers and neurobehavioral parameters in thc middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats.Life sciences 77：15-27.

[0197] Han BH，Zhou ML，Abousaleh F，Brendza RP，Dietrich HH，Koenigsknecht-Talboo J，Cirrito JR，Milner E，Holtzman DM and Zipfel GJ(2008)Cerebrovascular dysfunction in amyloid precursor protein transgenic mice：contribution of soluble and insoluble amyloid-beta peptide，partial restoration via gamma-secretase inhibition.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 28：13542-13550.

[0198] Hardy J and Selkoe DJ(2002)The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics.Science 297：353-356.

[0199] Hawkins BT and Davis TP(2005)The blood-brain barrier/neurovascular unit in hcalth and disease.Pharmacological reviews 57：173-185.

[0200] Hensley K，Carney JM，Mattson MP，Akscnova M，Harris M，Wu JF，Floyd RA and Butterfield DA(1994)A model for beta-amyloid aggregation and neurotoxicity based on free radical generation by the peptide：relevance to Alzheimer disease.Proceedings of the National Academy of Scieaces of the United States of America 91：3270-3274.

[0201] Hermann DM and Zechariah A(2009)Implications of vascular endothelial growth factor for postischemic neurovascular remodeling.Journal of cerebral blood flow and metabolism：official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 29：1620-1643.

[0202] Hoehn BD，Harik SI and Hudetz AG(2002)VEGF mRNA expressed in microvessels of neonatal and adult rat cerebral cortex.Brain Res Mol Brain Res 101：103-108.

[0203] Iadecola C，Park L and Capone C(2009)Threats to the mind：aging，amyloidand hypertension.Stroke；a journal of cerebral circulation 40：S40-44.[0204] Janson J，Laedtke T，Parisi JE，O′Brien P，Petersen RC and Butler PC(2004)Increased risk of type 2diabetes in Alzheimer disease.Diabetes 53：474-481.

[0205] Johnson DK，Storandt M，Morris JC，Langford ZD and Galvin JE(2008)Cognitive profiles in dementia：Alzheimer disease vs healthy brain aging.Neurology 71：1783-1789.

[0206] Kakkar P，Das B and Viswanathan PN(1984)A modified speetrophotometrie assay of superoxide dismutase，Indian journal of biochemistry & biophysics 21：130-132.

[0207] Kaundal RK，Deshpande TA，Gulati A and Sharma SS(2012)Targeting endothelin receptors for pharmacotherapy of ischemic stroke：current scenario and future perspectives.Drug Discov Today17：793-804.

[0208] Kitazono T，Heistad DD and Faraci FM(1995)Enhanced responses of the basilar artery to activation of endothelin-B receptors in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.Hypertension 25：490-494.

[0209] Kohzuki M，Onodera H，Yasujima M，Itoyama Y，Kanazawa M，Sato T and Abe K(1995)Endothelin receptors in ischemic rat brain and Alzheimcr brain.Journal of cardiovascular pharmacology 26Suppl 3：S329-331.

[0210] Kojima T，Isozaki-Fukuda Y，Takedatsu M，Hirata Y and Kobayashi Y(1992)Circulating levels of cndothelin and atrial natriuretic factor during postnatal life.Acta Paediatr 81：676-677.

[0211] Koyama Y，Macbara Y，Hayashi M，Nagae R，Tokuyama S and Michinaga S(2012)Endothelins reciprocally regulate VEGF-A and angiopoietin-1 proeuction in cultured rat astrocytes：implications on astrocytic proliferation.Glia 60：1954-1963.

[0212] Koyama Y，Nagae R，Tokuyama S and Tanaka K(2011)I.c.v administration of an endothelin ET(B)receptor agonist stimulates vascular endothelial growth factor-A production and activates vascular endothelial growth factor receptors in rat brain.Neuroscience 192：689-698.

[0213] Laziz I，Larbi A，Grebert D，Sautel M，Congar P，Lacroix MC，Salesse R and Meunier N(2011)Endothelin as a neuroprotective factor in the olfactory epithelium.Neuroscience 172：20-29.

[0214] Lee HO，Levorse JM and Shin MK(2003)The endothelin receptor-B is required for the migration of neural crest-derived melanocyte and enteric neuron precursors.Der Biol 259：162-175.

[0215] Leonard MG，Briyal S and Gulati A(2011)Endothelin B receptor agonist，IRL-1620，reduces neurological damage following permanent middle cerebral artery occlusion in rats.Brain research1420：48-58.

[0216] Leonard MG，Briyal S and Gulati A(2012)Endothelin B receptor agonist，IRL-1620，provides long-term neuroprotection in cerebral ischemia in rats.Brain research 1464：14-23.

[0217] Leonard MG and Gulati A(2009)Repeated administration of ET(B)receptor agonist，IRL-1620，pnoduces tachyphylaxis only to its hypotensive effect.Pharmacological research：the official journal of the Italian Pharmacological Society 60：402-410.

[0218] Leonard MG and Gulati A(2013)Endothelin B receptor agonist，IRL-1620，enhances angiogenesis and neurogenesis following cerebral ischemia in rats.Brain research 1528：28-41.

[0219] Levin ER(1995)Endothelins.The New England journal of medicine 333：356-363.

[0220] Li L，Xiong Y，Qu Y，Mao M，Mu W，Wang H and Mu D(2008)The requirement of extracellular signal-related protein kinase pathway in the activation of hypoxia inducible factor 1 alpha in the developing rat brain after hypoxia-ischemia.Acta neuropathologica 115：297-303.

[0221] Liu Z，Li Y，Zhang X，Savant-Bhonsale S and Chopp M(2008)Contralesional axonal remodeling of the corticospinal system in adult rats after stroke and bone marrow stromal cell treatment.Stroke；a journal of cerebral circulation 39：2571-2577.

[0222] Loo LS，Ng YK，Zhu YZ，Lee HS and Wong PT(2002)Cortical expression of endothelin receptor subtypes A and B following middle cerebral artery occlusion in rats.Neuroscience 112：993-1000.

[0223] Lopes JP，Oliveira CR and Agostinho P(2010)Neurodegeneration in an Abeta-induced model of Alzheimer′s disease：the role of Cdk5.Aging cell 9：64-77.

[0224] Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL and Randall RJ(1951)Protein measurement with the Folin phenol reagent，The Journal of biological chemistry 193：265-275.

[0225] Ly JV，Zavala JA and Donnan GA(2006)Neuroprotection and thrombolysis：combination therapy in acute ischaemic stroke，Expert Opin Pharmacother 7：
1571-1581.

[0226] Malik S，Vinukonda G，Vose LR，Diamond D，Bhimavarapu BB，Hu F，Zia MT，Hevner R，Zecevic N and Ballabh P(2013)Neurogenesis continues in the third trimester of pregnancy and is suppressed by premature birth.The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 33：411-423.[0227] Mark RJ，Lovell MA，Markesbery WR，Uchida K and Mattson MP(1997)A role for 4-hydroxynonenal，an aldehydic product of lipid peroxidation，in disruption of ion homeostasis and neuronal death induced by amyloid beta-peptide.Journal of neurochemisty 68：255-264.

[0228] Mathers CD，Boerma T and Ma Fat D(2009)Global and regional causes of death.Br Med Bull92：7-32.

[0229] Meier-Ruge W，Bertoni-Freddari C and Iwangoff P(1994)Changes in brain glucose metabolism as a key to the pathogenesis of Alzheimer′s disease.Gerontology 40：246-252.

[0230] Micieli G，Marcheselli S and Tosi PA(2009)Safety and efficacy of alteplase in the treatment of acute ischemic stroke.Vasc Health Risk Manag 5：397-409.

[0231] Minami M，Kimura M，Iwamoto N and Arai H(1995)Endothelin-1-likc immunoreactivity in cerebral cortex of Alzheimer-type dementia.Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry19：509-513.

[0232] Morris R(1984)Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.Journal of neuroscience methods 11：47-60.[0233] Murphy TH and Corbett D(2009)Plasticity during stroke recovery：from synapse to behaviour.Nature reviews Neuroscience 10：861-872.

[0234] Murray IV，Liu L，Komatsu H，Uryu K，Xiao G，Lawson JA and Axelsen PH(2007)Membrane-mediated amyloidogenesis and the promotion of oxidative lipid damage by amyloid beta proteins.The Journal of biological chemistry 282：9335-9345.

[0235] Murray IV，Sindoni ME and Axelsen PH(2005)Promotion of oxidative lipid membrane damage by amyloid beta proteins.Biochemistry 44：12606-12613.[0236] Nitta A，Itoh A，Hasegawa T and Nabeshima T(l994)beta-Amyloid protein-induced Alzheimer′s disease animal model.Neuroscience letters 170：63-66.[0237] Niwa K，Carlson GA and ladecola C(2000)Exogenous A betal-40 reproduces cerebrovascular alterations rcsulting from amyloid precursor protein overexpression in mice.Journal of cerebral blood flow and metabolism：official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 20：1659-1668.

[0238] Niwa K，Kazama K，Younkin L，Younkin SG，Carlson GA and Iadecola C(2002)Cerebrovascular autoregulation is profoundly impaired in mice overexpressing amyloid precursor protein.American journal of physiology Heart and circulatory physiology 283：H315-323.

[0239] Niwa K，Porter VA，Kazama K，Cornfield D，Carlson GA and ladecola C(2001)A beta-peptides enhance vasoconstriction in cerebral circulation.American journal of physiology Heart and circulatory physiology 281：H2417-2424.[0240] Nowacka MM and Obuchowicz E(2012)Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its role in the central nervous system：a new element in the neurotrophic hypothesis of antidepressant drug action.Neuropeptides 46：1-10.[0241] Nunomura A，Perry G，Aliev G，Hirai K，Takeda A，Balraj EK，Jones PK，Ghanbari H，Wataya T，Shimohama S，Chiba S，Atwood CS，Petersen RB and Smith MA(2001)Oxidative damage is the earliest event in Alzheimer disease.Journal of neuropathology and experimental neurology 60：759-767.

[0242] Ogunshola OO，Stewart WB，Mihalcik V，Solli T，Madri JA and Ment LR(2000)Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain.Brain research Developmental brain research 119：139-153.[0243] Ohkawa H，Ohishi N and Yagi K(1979)Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.Analytical biochemistry 95：351-358.[0244] Paris D，Quadros A，Humphrey J，Patel N，Crescentini R，Crawford F and Mullah M(2004)Nilvadipine antagonizes both Abeta vasoactivity in isolaled arteries，and the reduced cerebral blood flow in APPsw transgenic mice.Brain research 999：53-61.

[0245] Patel TR，Galbraith SL，McAuley MA，Doherty AM，Graham DI and McCulloch J(1995)Therapeutic potential of endothelin receptor antagonists in experimental stroke.Journal of cardiovascular pharmacology 26 Suppl 3：S412-
415.

[0246] Quinn R(2005)Comparing rat′s to human’s age：how old is my rat in people years？Nutrition 21：775-777.

[0247] Rebello S，Roy S，Saxena PR and Gulati A(1995a)Systemic hemodynamic and regional circulatory effeets of centrally administered endothelin-1 are mediated through ETA receptors.Brain research676：141-150.

[0248] Rebello S，Singh G and Gulati A(1995b)Elevated levels of endothelin-1 following unilateral cerebral-ischemia in rats.Faseb Journal 9：A937-A.[0249] Riechers CC，Knabe W，Siren AL，Gariepy CE，Yanagisawa M and Ehrenreich H(2004)Endothelin B receptor deficient transgenic rescue rats：a rescue phenomenon in the brain.Neuroscience 124：719-723.

[0250] Roger VL，Go AS，Lloyd-Jones DM，Benjamin EJ，Berry JD，Borden WB，Bravata DM，Dai S，FordES，Fox CS，Fullerton HJ，Gillespie C，Hailpern SM，Heit JA，Howard VJ，Kissela BM，Kittner SJ，Lackland DT，Lichtman JH，Lisabeth LD，Makuc DM，Marcus GM，Marelli A，Matchar DB，Moy CS，Mozaffarian D，Mussolino ME，Nichol G，Paynter NP，Soliman EZ，Sorlie PD，Sotoodehnia N，Turan TN，Virani SS，Wong ND，WooD and Turner MB(2012)Heart disease and stroke statisties--2012update：a report from the American Heart Association.Circulation 125：e2-e220.

[0251] Rosenstein J M，Krum J M and Ruhrberg C(2010)VEGF in the nervous system.Organogenesis6：107-114.

[0252] Rubinsztein DC(2006)The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.Nature 443：780-786.

[0253] Schiffrin EL，Intengan HD，Thibault G and Touyz RM(1997)Clinical significance of endothelin in cardiovascular disease.Curr Opin Cardiol 12：354-367.

[0254] Schinelli S(2006)Pharmacology and physiopathology of the brain endothelin system：an overview.Curr Med Chem 13：627-638.

[0255] Schneider MP，Boesen EI and Pollock DM(2007)Contrasting actions of endothelin ET(A)and ET(B)receptors in cardiovascular disease.Annu Rev Pharmacol Toxicol 47：731-759.

[0256] Shin HK，Jones PB，Garcia-Alloza M，Borrelli L，Greenberg SM，Bacskai BJ，Frosch MP，Hyman BT，Moskowitz MA and Ayata C(2007)Age-dependent cerebrovascular dysfunction in a transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy.Brain：a journal of neurology 130：2310-2319.

[0257] Sims NR and Muyderman H(2009)Mitochondria，oxidative metabolism and cell death in stroke，in Biochimica et biophysica acta pp 80-91.

[0258] Smith CC，Stanyer L and Betteridge DJ(2004)Soluble beta-amyloid(A beta)40 causes attenuation or potentiation of noradrenaline-induced vasoconstriction in rats depending upon the concentration employed.Neuroscience letters 367：129-132.

[0259] Steinwachs DM，Collins-Nakai RL，Cohn LH，Garson A.Jr.and Wolk MJ(2000)The future of cardiology：utilization and costs of care.J Am Coll Cardiol 35：91B-98B.

[0260] Strong K，Mathers C and Bonita R(2007)Preventing stroke：saving lives around thc world.Lancet Neurol 6：182-187.

[0261] Suo Z，Humphrey J，Kundtz A，Sethi F，Placzek A，Crawford F and Mullan M(1998)Soluble Alzheimers beta-amyloid constricts the cerebral vasculature in vivo.Neuroscience letters 257：77-80.

[0262] Tirapelli CR，Casolari DA，Yogi A，Montezano AC，Tostes RC，Legros E，D′Orleans-Juste P and de Oliveira AM(2005)Functional characterization and expression of endothelin receptors in rat carotid artery：involvement of nitric oxide，a vasodilator prostanoid and the opening of K+channels in ETB-induced relaxation.British journal of pharmacology 146：903-912.

[0263] Toda N，Ayajiki K and Okamura T(2009)Cerebral blood flow regulation by nitric oxide：recent advances.Pharmacological reviews 61：62-97.

[0264] Trollmann R，Schneider J，Keller S，Strasser K，Wenzel D，Rascher W，Ogunshola OO and Gassmann M(2008)HIF-1-regulated vasoactive systems are differentially involved in acute hypoxic stress responses of the developing brain of newborn mice and are not affected by levetiracetam.Brain research 1199：27-36.

[0265] Tsukahara H，Ende H，Magazine HI，Bahou WF and Goligorsky MS(1994)Molecular and functional characterization of the non-isopeptide-selective ETB receptor in endothelial cells.Receptor coupling to nitric oxide synthase.The Journal of biological chemistry 269：21778-21785.

[0266] Tsukuda K，Mogi M，Iwanami J，Min LJ，Sakata A，Jing F，Iwai M and Horiuchi M(2009)Cognitive deficit in amyloid-beta-injected mice was improved by pretreatment with a low dose of telmisartan partly because of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activation.Hypertension 54：782-787.[0267] Vidovic M，Chen MM，Lu QY，Kalloniatis KF，Martin BM，Tan AH，Lynch C，Croaker GD，Cass DT and Song ZM(2008)Deficiency in endothelin receptor B reduces proliferation of neuronal progenitors and increases apoptosis in postnatal rat cerehellum.Cellular and molecular neurobiology28：1129-1138.[0268] Viossat I，Duverger D，Chapelat M，Pirotzky E，Chabrier PE and Braquet P(1993)Elevated tissue endothelin content during focal cerebral ischemia in the rat.Journal of cardiovascular pharmacology22 Suppl 8：S306-309.[0269] Virgintino D，Errede M，Robertson D，Girolamo F，Masciandaro A and Bertossi M(2003)VEGF expression is developmentally regulated during human brain angiogenesis.Histochem Cell Biol 119：227-232.

[0270] Weller RO，Massey A，Newman TA，Hutchings M，Kuo YM and Roher AE(1998)Cerebral amyloid angiopathy：amyloid beta accumulates in putative interstitial fluid drainage pathways in Alzheimer′s disease，The American journal of pathology 153：725-733.

[0271] Yagami T，Ueda K，Asakura K，Kuroda T，Hata S，Sakaeda T，Kambayashi Y and Fujimoto M(2002)Effects of endothelin B receptor agonists on amyloid beta protein(25-35)-induced neuronal cell death.Brain research 948：72-81.[0272] Yagami T，Ueda K，Sakaeda T，Okamura N，Nakazato H，Kuroda T，Hata S，Sakaguchi G，Itoh N，Hashimoto Y and Fujimoto M(2005)Effects of an endothelin B receptor agonist on secretory phospholipasc A2-HA-induced apoptosis in corteal neurons.Neuropharmacology 48：291-300.

[0273] Yoshizawa T，Iwamoto H，Mizusawa H，Suzuki N，Matsumoto H and Kanazawa I(1992)Cerebrospinal fluid eddothelin-1 in Alzheimer′s disease and senile dementia of Alzheimer type.Neuropeptides 22：85-88.

[0274] Zhang RL，Zhang C，Zhang L，Roberts C，Lu M，Kapke A，Cui Y，Ninomiya M，Nagafuji T，Albala B，Zhang ZG and Chopp M(2008)Synergistic effect of an endothelin type A receptor antagonist，S-0139，with rtPA on the neuroprotection after embolic stroke.Stroke；a journal of cerebral circulation39：2830-2836.[0275] Zhang WW，Badonic T，Hoog A，jiang MH，Ma KC，Nie XJ and Olsson Y(1994)Astrocytes in Alzheimer′s disease express immunoreactivity to the vaso-constrictor endothelin-1.Journal of the neurological sciences 122：90-96.[0276] Zhang Y，Belayev L，Zhao W，Irving EA，Busto R and Ginsberg MD(2005)A selective endothelin ET(A)receptor antagonist，SB 234551，improves cerebral perfusion following permanent focal cerebral ischemia in rats.Brain research 1045：150-156.

[0277] Zhang ZG and Chopp M(2009)Neurorestorative therpies for stroke：underlying mechanisms and translation to the clinic.Lancet Neurol 8：491-500.[0278] Zlokovic BV(2008)New therapeutic targets in the neurovascular pathway in Alzheimer′s disease.Neurotherapeutics：the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 5：409-414.

[0279] 表1：ETB受体激动剂IRL-1620和拮抗剂BQ788对大脑中动脉闭塞后的神经缺陷和运动功能的影响。在MCAO后2、4和6小时注射IRL-1620(5μg/kg,静脉内)或等渗盐水(1ml/kg,静脉内)。在第一次注射IRL-1620或媒介物之前15分钟施用BQ788(1mg/kg,静脉内)。值表示为平均值±SEM(n＝5-8/组)。*P<0.05对比假操作。#P<0.05对比MCAO+媒介物。@P<0.05对比MCAO+IRL-1620。

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