本发明涉及用作雌激素药物的取代的苯并唑的前药衍生物。

已很好地证明哺乳动物组织内雌激素的多效作用，现在意识到 雌激素可影响许多器官系统[Mendelsohn和Karas，New England Journal of Medicine 340：1801-1811(1999)，Epperson，等， Psychosomatic Medicine 61：676-697(1999)，Crandall，Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8：1155-1166(1999)，Monk和 Brodaty，Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11：1-10(2000)， Hurn和Macrae，Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20：631- 652(2000)，Calvin，Maturitas 34：195-210(2000)，Finking，等，Zeitschrift fur Kardiologie 89：442-453(2000)，Brincat，Maturitas 35：107-117 (2000)，Al-Azzawi，Postgraduate Medical Journal 77：292-304(2001)]。 雌激素能够以几种方式对组织发挥作用，并且最具优良特征的作用 机制为它们与导致基因转录变化的雌激素受体相互作用。雌激素受 体为配体-激活的转录因子并且属于核激素受体超家族。这一家族的 其它的成员包括孕酮、雄激素、糖皮质激素和盐皮质激素受体。一 旦与配体结合，这些受体二聚化并且或者通过直接结合于DNA的特 异性序列(称作应答元素)或者通过与其它的转录因子(诸如AP1)相互 作用，然后它直接结合于特异性DNA序列，可激活基因转录。[Moggs 和Orphanides，EMBO Reports 2：775-781(2001)，Hall，等，Journalof Biological Chemistry 276：36869-36872(2001)，McDonnell，Principles Of Molecular Regulation 351-361(2000)]。一类“共调节”蛋白也可以 与配体-结合的受体相互作用并且进一步调节它的转录活性[McKenna， 等，Endocrine Reviews 20：321-344(1999)]。它也显示雌激素受体能够 以配体-依赖的和独立的方式抑制NFκB-介导的转录[Quaedackers，等， Endocrinology 142：1156-1166(2001)，Bhat，等，Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67：233-240(1998)，Pelzer，等， Biochemical & Biophysical Research Communications 286：1153-7 (2001)]。

通过磷酸化也可激活雌激素受体。通过生长因子诸如EGF介导 这种磷酸化并在配体不存在下，引起基因转录变化[Moggs和 Orphanides，EMBO Reports 2：775-781(2001)，Hall，等，Journal of Biological Chemistry 276：36869-36872(2001)]。

雌激素借以影响细胞颇具特点的方法是通过所谓的膜受体。这 样受体的存在是有争论的，但它很好证实雌激素可非常迅速引起得 自细胞的非基因组应答。担负传导这些作用的分子实体尚未明确分 离，但有证据提示它至少与雌激素受体的核形成相关[Levin，Journal of Applied Physiology 91：1860-1867(2001)，Levin，Trendsin Endocrinology & Metabolism 10：374-377(1999)]。

迄今已发现两种雌激素受体。约15年前已克隆第一种雌激素受 体且现在称为ERα[Green，等，Nature 320：134-9(1986)]。最近才发现 第二种形式的雌激素受体且称为ERβ[Kuiper，等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93：5925- 5930(1996)]。ERβ的最初研究集中在对多种配体定义它的亲合性， 并且确实观察到与ERα的某些差异。在啮齿动物上良好绘制ERβ的 组织分布且不与ERα相一致。组织诸如小鼠和大鼠子宫主要表达 ERα，而小鼠和大鼠肺主要表达ERβ[Couse，等，Endocrinology 138： 4613-4621(1997)，Kuiper，等，Endocrinology 138：863-870(1997)]。甚 至在相同器官内，ERα和ERβ的分布可以被划分区域。例如在小鼠 卵巢中，ERβ在颗粒细胞中高度表达，并且ERα被限制于卵泡膜和 基质细胞[Sar和Welsch，Endocrinology 140：963-971(1999)，Fitzpatrick， 等，Endocrinology 140：2581-2591(1999)]。然而，存在受体共同表达 的实例和有来自体外实验的证据表明，ERα和ERβ能够形成杂化二 聚体[Cowley，等，Journal of Biological Chemistry 272：19858-19862 (1997)]。

已描述大量化合物或者模拟或者阻断17β-雌二醇的活性。具有 与17β-雌二醇大致相同生物作用的化合物，最有效的内源性雌激素， 被称作“雌激素受体激动剂”。那些当与17β-雌二醇组合给予时阻 断其作用的化合物被称作“雌激素受体拮抗剂”。事实上，存在雌 激素受体激动剂与雌激素受体拮抗剂活性之间的统一体并且在某些 组织中确实有某些化合物作为雌激素受体激动剂起作用而在其它组 织中作为雌激素受体拮抗剂起作用。这些具有混合活性的化合物被 称作选择性雌激素受体调节剂(SERMS)并且在治疗上是有用的药物 (例如EVISTA)[McDonnell，Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7：S10-S15(2000)，Goldstein，等，Human Reproduction Update 6：212-224(2000)]。相同化合物可具有细胞-特异性作用的准 确的原因未予阐明，但受体构象和/或共调节蛋白的环境的差异已被 提示。

曾经一段时期已知当结合配体时，雌激素受体采取不同的构象。 然而，仅在最近才揭示这些变化的连续性和微细区别。通过与各种 配体共结晶已解决ERα和ERβ的三维结构并且清晰显示当立体阻碍 受体-共调节蛋白相互作用所需要的蛋白序列时，在雌激素受体拮抗 剂存在下双螺旋12的改变[Pike，等，Embo 18：4608-4618(1999)，Shiau， 等，Cell 95：927-937(1998)]。另外，噬菌体展示技术已用于在不同配 体存在下鉴定与雌激素受体相互作用的肽[Paige，等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96： 3999-4004(1999)]。例如肽被鉴定以区分结合于全长雌激素受体激动 剂17β-雌二醇和二乙基己烯雌酚的ERα。不同的肽显示结合于ERα 和ERβ的氯芪酚之间的区别。这些数据指明每一配体潜在地以独一 无二的和意想不到的可能具有独特生物活性的构象装配受体。

如上所述，雌激素影响全部生物过程。另外，描述性别差异时(例 如发病率、攻击应答等)，解释包括男性和女性之间的雌激素水平上 的差异是可能的。

具有雌激素活性的化合物在2002年12月4日提交的美国专利 申请系列号为10/309,699，现在为美国专利号6,794,403和WO 03/050095中公开，这些文献的全文通过引用结合到本文中。

本发明描述

本发明提供用作雌激素药物的具有下面结构的式I的雌激素化 合物，或其药学上可接受的盐：

其中：

Q1和Q2独立为H、糖残基或S(O)t-OH，条件是Q1和Q2不都为H；

t为0、1或2；

R1为氢、羟基、卤素、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的三氟烷 基、3-8个碳原子的环烷基、1-6个碳原子的烷氧基、1-6个碳 原子的三氟烷氧基、1-6个碳原子的硫代烷基、1-6个碳原子的 磺酰烷基(sulfoxoalkyl)、1-6个碳原子的亚磺酰烷基 (sulfonoalkyl)、6-10个碳原子的芳基、具有1-4个选自O、N 或S的杂原子的5或6-元杂环、-NO2、-NR5R6、-N(R5)COR6、 -CN、-CHFCN、-CF2CN、2-7个碳原子的炔基或2-7个碳原子 的链烯基；其中烷所述基或者链烯基部分由羟基、-CN、卤素、 三氟烷基、三氟烷氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、 NR5R6或N(R5)COR6任选取代；

R2和R2a每个独立为氢、羟基、卤素、1-6个碳原子的烷基、1-4个碳 原子的烷氧基、2-7个碳原子的链烯基、2-7个碳原子的炔基、 1-6个碳原子的三氟烷基或1-6个碳原子的三氟烷氧基；其中 所述烷基、链烯基，或炔基部分由羟基、-CN、卤素、三氟烷 基、三氟烷氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6 或N(R5)COR6任选取代；

R3和R3a每个独立为氢、1-6个碳原子的烷基、2-7个碳原子的链烯基、 2-7个碳原子的炔基、卤素、1-4个碳原子的烷氧基、1-6个碳 原子的三氟烷基或1-6个碳原子的三氟烷氧基；其中所述烷基、 链烯基，或炔基部分由羟基、-CN、卤素、三氟烷基、三氟烷 氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6或N(R5)COR6 任选取代；

R5、R6每个独立为氢、1-6个碳原子的烷基、6-10个碳原子的芳基；

X为O、S或NR7；

R7为氢、1-6个碳原子的烷基、6-10个碳原子的芳基、-COR5、-CO2R5 或-SO2R5。

当本发明化合物含碱性部分时，自有机酸和无机酸可形成药学 上可接受的盐，例如所述酸为：乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石 酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、苹果酸、苯二甲 酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、 甲苯磺酸、樟脑磺酸和类似的已知可接受的酸。当本发明的化合物 含酸性部分时，自有机碱和无机碱也可形成盐，例如碱金属(例如钠、 锂或钾)盐、碱土金属盐、铵盐、在每一烷基中含1-6个碳原子的烷 基铵盐或在每一烷基中含1-6个碳原子的二烷基铵盐，和在每一烷基 中含1-6个碳原子的三烷基铵盐。

术语“烷基”、“链烯基”和“链炔基”包括分支和直链两者 的部分。实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、仲丁基、叔 丁基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、1-甲基乙烯基等。当烷基或者链烯 基部分被取代时，它们通常可为单-、二-、三-或者全-取代。卤素取 代基的实例包括1-溴代乙烯基、1-氟代乙烯基、1，2-二氟乙烯基、2，2- 二氟乙烯基、1，2，2-三氟乙烯基、1，2-二溴乙烷、1，2-二氟乙烷、1-氟- 2-溴乙烷、CF2CF3、CF2CF2CF3等。术语“卤素”包括溴、氯、氟和 碘。术语“芳基”包括6-10个碳原子的芳基，例如苯基、1-萘基或2- 萘基。优选的5-6元杂环包括呋喃、噻吩、吡咯、异吡咯、吡唑、咪 唑、三唑、二硫杂环戊二烯、氧硫杂环戊二烯、异唑、唑、噻唑、 异噻唑、二唑、呋咱、三唑、二唑、噻唑、四唑、吡喃、吡 啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、嗪、噻嗪或二嗪。更优选杂环 为呋喃、噻吩或噻唑。

在式I化合物的一些实施方案中，R1为2-7个碳原子的链烯基； 其中链烯基部分由羟基、-CN、卤素、三氟烷基、三氟烷氧基、-COR5、 -CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6或N(R5)COR6任选取代。

在本发明的化合物中，优选式I的化合物或者其药学上可接受 的盐具有以下结构：

其中：

Q1和Q2独立为H、经修饰的或未经修饰的己糖残基或S(O)t-OH，条 件是Q1和Q2不都为H；

t为2；

R1为2-7个碳原子的链烯基；其中所述链烯基部分由羟基、-CN、卤 素、三氟烷基、三氟烷氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、 NR5R6或N(R5)COR6任选取代；

R2和R2a每个独立为氢、羟基、卤素、1-6个碳原子的烷基、1-4个碳 原子的烷氧基、2-7个碳原子的链烯基、2-7个碳原子的炔基、 1-6个碳原子的三氟烷基或1-6个碳原子的三氟烷氧基；其中 所述烷基、链烯基，或炔基部分由羟基、-CN、卤素、三氟烷 基、三氟烷氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6 或N(R5)COR6任选取代；

R3和R3a每个独立为氢、1-6个碳原子的烷基、2-7个碳原子的链烯基、 2-7个碳原子的炔基、卤素、1-4个碳原子的烷氧基、1-6个碳 原子的三氟烷基或1-6个碳原子的三氟烷氧基；其中所述烷基、 链烯基，或炔基部分由羟基、-CN、卤素、三氟烷基、三氟烷 氧基、-COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6或N(R5)COR6 任选取代；

R5、R6每个独立为氢、1-6个碳原子的烷基、6-10个碳原子的芳基；

X为O、S或NR7；

R7为氢、1-6个碳原子的烷基、6-10个碳原子的芳基、-COR5、-CO2R5 或-SO2R5。

更优选X为O，且仍然更优选X为O，而R1为2-3个碳原子的 链烯基，所述链烯基由羟基、-CN、卤素、三氟烷基、三氟烷氧基、 -COR5、-CO2R5、-NO2、CONR5R6、NR5R6或N(R5)COR6任选取代。

更优选Q1和Q2选自-SO3H和葡糖苷酸残基。

在一些特别优选的实施方案中，所述化合物为2-(3’-氟-4’-羟基苯 基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇的单-或二硫酸酯衍生物、单-或二葡 糖苷酸衍生物或葡糖苷酸-硫酸酯衍生物，或其药学上可接受的盐。 在一些实施方案中，所述化合物为2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯 基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基(sulfate phenyl))-7-乙 烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并 唑-5-葡糖苷酸；2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸 酯；2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸； 2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(3’-氟- 4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(3’-氟-4’-硫 酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(2’-氟-4’-葡糖苷酸 苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(2’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯 基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(2’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5- 葡糖苷酸；2-(2’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯； 2-(2’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(2’- 氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(2’-氟-4’-硫 酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(2’-氟-4’-硫酸酯 基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(2’，3’-二氟-4’-葡糖苷酸 苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(2’，3’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-7- 乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(2’，3’-二氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3- 苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(2’，3’-二氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并 唑-5-硫酸酯；2-(2’，3’-二氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并 唑-5-葡糖苷酸；2-(2’，3’-二氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并 唑-5-硫酸酯；2-(2’，3’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑- 5-葡糖苷酸；2-(2’，3’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5- 硫酸酯；4-溴-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇； 4-溴-2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；4-溴-2- (3’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4-溴-2-(3’-氟 -4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；4-溴-2-(3’-氟-4’-葡糖 苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4-溴-2-(3’-氟-4’-葡糖 苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；4-溴-2-(3’-氟-4’-硫酸酯 基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4-溴-2-(3’-氟-4’-硫酸酯 基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-葡糖 苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-硫酸酯 基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-羟基苯基)- 7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7- 乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7- 乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯 基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-硫酸酯基 苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；4，6-二溴-2-(3’-氟-4’-硫酸 酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’- 氟-4’-葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’- 硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-羟基 苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-羟基苯 基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-葡糖苷酸苯 基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-葡糖苷酸 苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-硫酸酯基 苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’-氟-4’-硫酸酯 基苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’-葡 糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’-硫 酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’-羟 基苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’- 羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’- 葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙烯基)-2-(2’，3’- 二氟-4’-葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-(1-溴代乙烯基)-2- (2’，3’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-(1-溴代乙 烯基)-2-(2’，3’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；7-烯丙 基-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-烯丙基-2-(3’-氟-4’- 硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-烯丙基-2-(3’-氟-4’-羟基苯基)- 1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-烯丙基-2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-1，3-苯并 唑-5-硫酸酯；7-烯丙基-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-葡 糖苷酸；7-烯丙基-2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯； 7-烯丙基-2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；7-烯 丙基-2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(3’，5’-二氟 -4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3’，5’-二氟-4’-硫酸 酯基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3’，5’-二氟-4’-羟基苯基)-7- 乙烯基-1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(3’，5’-二氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯 基-1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(3’，5’-二氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基- 1，3-苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(3’，5’-二氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-乙烯基- 1，3-苯并唑-5-硫酸酯；2-(3’，5’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3- 苯并唑-5-葡糖苷酸；2-(3’，5’-二氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-乙烯基-1，3- 苯并唑-5-硫酸酯；2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3- 苯并唑-5-醇；2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并 唑-5-醇；2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-葡 糖苷酸；2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-硫酸 酯；2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-葡糖 苷酸；2-(3’-氟-4’-葡糖苷酸苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-硫 酸酯；2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-葡 糖苷酸或2-(3’-氟-4’-硫酸酯基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5- 硫酸酯。在另外的实施方案中，所述化合物为以下化合物的葡糖苷 酸衍生物、硫酸酯衍生物或葡糖苷酸-硫酸酯衍生物：2-(5-羟基-1，3- 苯并唑-2-基)苯-1，4-二酚；3-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，2-二酚； 2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3-氯-4-羟基苯基)-1，3-苯并 唑-5-醇；2-(2-氯-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3-氟-4-羟基苯 基)-1，3-苯并唑-6-醇；2-(3-叔丁基-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇； 2-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，4-二酚；3-(6-羟基-1，3-苯并唑-2- 基)苯-1，2-二酚；4-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，2-二酚；2-(3-氯-4- 羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇；4-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，3-二 酚；4-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，3-二酚；6-氯-2-(3-氟-4-羟基苯 基)-1，3-苯并唑-5-醇；6-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇； 6-氯-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；5-氯-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并 唑-6-醇；7-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-溴-2-(2-氟 -4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-溴-2-(2，3-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯 并唑-5-醇；2-(4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1，2-二 溴乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(1-溴代乙烯基)-2-(4-羟 基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-乙炔基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5- 醇；2-(4-羟基苯基)-7-丙基-1，3-苯并唑-5-醇；7-丁基-2-(4-羟基苯 基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-环戊基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇； 5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-羧酸乙酯；2-(4-羟基苯基)-7-苯 基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-1，3-苯并唑-5-醇；7- 乙基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-乙基-2-(2-乙基-4-羟基苯 基)-1，3-苯并唑-5-醇；5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛； 7-(羟基甲基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；7-(溴甲基)-2-(4-羟基 苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；[5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-基] 乙腈；7-(1-羟基-1-甲基乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇]；2-(4- 羟基苯基)-7-异丙烯基-1，3-苯并唑-5-醇；2-(4-羟基苯基)-7-异丙基- 1，3-苯并唑-5-醇]；7-溴-2-(4-羟基-3-(三氟甲基)苯基)-1，3-苯并唑-5- 醇；7-(2-呋喃基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇；2-(3-氟-4-羟基 苯基)-7-(2-呋喃基)-1，3-苯并唑-5-醇；2-(4-羟基苯基)-7-噻吩-2-基- 1，3-苯并唑-5-醇；2-(4-羟基苯基)-7-(1，3-噻唑-2-基)-1，3-苯并唑-5- 醇；2-(3-氟-4-羟基苯基)-5-羟基-1，3-苯并唑-7-腈；4-溴-2-(4-羟基苯 基)-7-甲氧基-1，3-苯并唑-5-醇；4，6-二溴-2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基- 1，3-苯并唑-5-醇或7-溴-2-(3，5-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5- 醇。

本发明提供用作雌激素药物的取代的苯并唑的前药衍生物。 在一些实施方案中，本发明化合物为具有一个或多个附加的硫酸酯(即 -O-S(＝O)2-O-H)、未经修饰的或经修饰的己糖(例如葡糖苷酸)或两者 的衍生物。可衍生形成本发明化合物的适合的化合物，可在2002年 12月4日提交的美国专利申请系列号10/309,699中找到，该文献全 文通过引用结合到本文中。

如在本文中所使用的，“糖”指的是至少一个含5-6个碳原子 的单糖诸如戊糖，例如核糖，以及己糖，例如葡萄糖、半乳糖或果 糖。糖还包括双糖，即含两个单糖的糖，诸如蔗糖、乳糖和麦芽糖。 糖残基可为天然地或经合成修饰的形式，包括，例如磷酸酯、酸和 内酯。

如在本文中所使用的，术语“己糖”意指含六个碳原子的糖。 适合的己糖包括但不限于为直链和吡喃糖两种形式的葡萄糖、甘露 糖、半乳糖和果糖。经修饰的己糖包括包括天然形成的己糖衍生物， 例如磷酸酯和相应的酸和内酯形式。例如，术语“经修饰的己糖” 包括葡糖酸、葡糖酸内酯、葡糖醛酸、包括N-乙酰基衍生物、磷酸 酯衍生物的氨基衍生物等。

如在本文中所使用的，如用于特定化合物的术语“葡糖苷酸衍 生物”，指的是这样的化合物的衍生物，其中所述化合物的一个或 多个羟基被式XX的部分置换：

如在本文中所使用的，如用于特定化合物的术语“硫酸酯衍生 物”，指的是这样的化合物的衍生物，其中所述化合物的一个或多 个羟基被式-O-S(＝O)2-O-H的部分置换。

如用于特定化合物的术语“葡糖苷酸-硫酸酯衍生物”，指的是 这样的化合物的衍生物，其中所述化合物的至少一个羟基被式XX的 部分置换和该化合物的至少一个羟基被式O-S(＝O)2-O-H的部分置 换。

本发明化合物为取代的苯并唑雌激素药物，其被衍生为具有 一个或多个附加的部分。在给予所述衍生的化合物时，附加的部分 由内源性的酶去除而提供非衍生的化合物。本文将这样的化合物称 为本发明化合物的代谢物。

如依据本发明所使用的，关于提供本发明所涵盖的化合物或物 质的术语“提供”，意指或者直接给予这样的化合物或物质或给予 将在体内形成有效量的化合物或物质的前药、衍生物或类似物。

如依据本发明所使用的，术语“ERβ选择性配体”意指在测量 对ERα和ERβ结合亲合力的标准药理学实验方法中配体对ERβ的结 合亲合力(如通过IC50测量的，其中17β-雌二醇的IC50在ERα与ERβ 之间相差不大于3倍)比其对ERα的结合亲和力至少大约10倍。优 选ERβ选择性配体对ERβ具有结合亲和力，它比其对ERα的结合亲 和力至少大约20倍。更优选ERβ选择性配体对ERβ具有结合亲和 力，它比其对ERα的结合亲和力至少大约50倍。另外优选的是ERβ 选择性配体为非-亲子宫和非-激乳腺的。

如依据本发明所使用的，术语“非-亲子宫的”意指在标准药理 学实验方法中产生的湿子宫重量增加小于在相同方法中对最大有效 剂量的17β-雌二醇或17α-乙炔基-17β-雌二醇所观察到的子宫重量增 加的50％。优选增加湿子宫重量小于对雌二醇所观察到的湿子宫重 量增加的25％，并且更优选湿子宫重量增加小于对雌二醇所观察到 的湿子宫重量增加的10％。最优选与避免亲子宫活性的对照组(例如 媒介组)相比较非-亲子宫的ERβ选择性配体将不显著(p＞0.05)增加湿 子宫重量。

如依据本发明所使用的，术语“非-激乳腺的”意指具有在组织 学检查评估时，如17β-雌二醇在促进小叶-蜂窝状终蕾(lobular-alveolar end buds)发育上的有效性＜10％的活性。这样的组织学检查进行测定 的实例为本领域所熟悉。见，例如Harris，H.A.，等，Endocrinology 144(10)4241-4249(2003)；Mulac-Jericevic，B.，等，Proc.Natl.Acad.Sci. 100(17)9744-9749(2003)；Bocchinfuso，W.P.，等，Endocrinology 141(8) 2982-2994(2002)和Lewis，B.C.，等，Toxicological Sciences 62，46-53 (2001)，其中的每一项的全文通过引用结合到本文中。

本发明也提供公开的衍生的ERβ选择性配体在治疗或抑制关节 炎、炎性肠道疾病和子宫内膜异位中的用途。更具体地说，衍生的ERβ 选择性配体用于治疗或抑制类风湿性关节炎、骨关节炎或椎关节病； 和克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、不确定的结肠炎、感染性结肠炎或 溃疡性直肠炎。本发明还提供衍生的ERβ选择性配体在治疗或抑制 关节肿胀或糜烂；或在治疗或抑制继发于关节镜或外科手术的关节 损伤中的用途。优选ERβ选择性配体为非-亲子宫和非-激乳腺的。

本发明也提供公开的衍生的ERβ选择性配体在有需要的哺乳动 物中用于降低胆固醇、甘油三酯、Lp(a)或LDL水平；抑制或治疗高 胆固醇血症、高脂血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、外 周血管疾病、再狭窄或血管痉挛；或抑制因导致免疫介导的血管损 伤的细胞过程引起的血管壁损伤。

另外，公开的衍生的ERβ选择性配体用于在有需要的哺乳动物 中提供认知增强或神经保护；或治疗或抑制老年性痴呆、阿尔茨海 默氏病、认知衰退、中风、焦虑症或神经退化性疾病。

本发明还提供公开的ERβ配体在有需要的哺乳动物中治疗和抑 制自由基诱导的疾病状态、阴道或阴门萎缩、萎缩性阴道炎、阴道 干燥、瘙痒症、交媾困难、排尿困难、尿频、尿失禁、尿道感染、 血管舒缩症、牛皮癣或皮炎、局部缺血、再灌注损伤、哮喘、胸膜 炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、脓毒症、出血性 休克或II型糖尿病中的用途。

式I的本发明的ERβ选择性配体也用于在有需要的哺乳动物中 抑制受孕。

在一些实施方案中，哺乳动物为人，例如女人。

本发明还提供包含如在上文中描述的式I化合物和药用载体的 药用组合物。

在制备本发明化合物中所使用的试剂或者可从商业上获得或者 可通过文献中描述的标准方法制备。

可通过添加一个或多个选自硫酸酯部分和经修饰的和未经修饰 的己糖部分衍生的式I化合物的一般制备，可依据以下的合成流程(I- VIII)制备。

流程I

在流程I中，在三乙胺存在下，用商业上可获得的苯甲酰氯(2) 处理商业上可获得的二甲氧基苯胺(1)，产生酰胺(3)。在亚硫酰氯存 在下回流，自商业上可获得的苯甲酸(4)也可制备所需的苯甲酰氯(2)。 于高温(200℃)下，用吡啶盐酸盐处理，酰胺(3)转变为酚基(phenolic) 苯并唑(5)。

流程II

在流程II中，用乙酸中的Br2/NaOAc溴化商业上可获得的硝基- 酚(6)，产生溴代苯酚(7)。用EtOAc中的Ra-Ni催化氢化(7)，得到苯 胺(8)。在吡啶存在下，使(8)与苯甲酰氯(9)(商业上可获得的或自相 应的苯甲酸和亚硫酰氯制备)偶合，产生酰胺-酯(10)。于高温(150℃) 下，于酸性条件下(对-甲苯磺酸)，实现(10)至苯并唑(11)的转化。 在二氯甲烷中的三溴化硼使(11)脱甲基，得到酚基苯并唑(12)。

流程III

在流程III中，于高温(150℃)下，用在对-二甲苯中的苯甲酸(13) 和硼酸处理，使苯胺(8)转变为苯并唑(14)。用在二氯甲烷中的三溴 化硼使(14)脱甲基，得到酚基苯并唑(15)。

流程IV

在流程IV中，用乙酸中的硝酸使(16)硝化，产生(17)，后者在 Ra-Ni存在下用氢还原，得到苯胺(18)。以在流程II中描述的类似的 方法，免除在高温(200℃)下用吡啶盐酸盐实现脱甲基步骤，把苯胺(18) 转变为苯并唑(19)。

流程V

在流程V中，或者用在N，N-二甲基甲酰胺中的叔丁基二甲基甲 硅烷基氯化物/咪唑/4-二甲基氨基吡啶把苯并唑(20)的羟基保护为甲 硅烷基醚(21)(R3＝Me3C(CH3)2Si)，或者用二氯甲烷中的乙酸酐/4-二 甲基氨基吡啶保护为酯(21)(R3＝CH3CO)。在20℃-150℃的温度范 围内，伴随用于硼酸偶合反应的碱(即Na2CO3)存在下，在对-二甲苯、 甲苯、四氢呋喃、二甲氧基甲烷或1，2-二甲氧基乙烷中，在钯催化剂 [即二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯(II)或四重(三苯基膦)钯(0)]存在下，苯 并唑(20)和(21)与各种试剂(即三丁基(乙烯基)锡、三丁基(烯丙基) 锡、三丁基(2-呋喃基)锡、硼酸或者氯化锌)偶合，产生苯并唑(22) 和(23)。

用氢氟酸酸(48wt.％在水中)或四丁基氟化铵使(22)(R3＝ Me3C(CH3)2Si)的甲硅烷基醚脱保护，产生苯并唑(24)。用在二氧六 环中的碳酸钾使(22)(R3＝CH3CO)皂化，产生苯并唑(24)。于高温(200 ℃)下，用二氯甲烷或吡啶盐酸盐中的三溴化硼将苯并唑(23)(R＝ CH3)脱甲基，得到苯并唑(24)。

流程VI

在流程VI中，于低温(-78℃)下，用正丁基锂处理苯并唑(24)， 随后加入亲电试剂(即CNCO2Et、Ph(CH3)NCHO、EtI等)，产生化合 物(25)。用三溴化硼(R＝CH3)或四丁基氟化铵(R＝Me3C(CH3)2Si)将(25) 脱保护，得到苯并唑(26)[R＝CHO、CO2Et、CH2CH3、C(CH3)2OH]。

于高温(200℃)下，用吡啶盐酸盐处理叔醇(25)(R＝C(CH3)OH)， 产生1-甲基-乙烯基苯并唑(27)。用H2/Pd-C还原(27)，得到异丙基 类似物(28)。

流程VII

在流程VII中，用甲醇中的硼氢化钠还原苯并唑(29)，产生醇 (30)。用CH2Cl2中的三溴化硼处理1个小时，得到苯并唑(31)，延 长(18个小时)处理得到溴化物(32)。在N，N-二甲基甲酰胺中的氰化钾 和18-冠-6醚处理下，使溴化物(32)转变为乙腈(33)。

流程VIII

在流程VIII中，首先用DMF中的氰化铜(I)处理溴代并唑(35)(R ＝CH3)，产生相应的芳基-腈，后者经用三溴化硼处理，得到苯并 唑(36)。自第二种合成途径也可制备苯并唑(36)，其中在钯催化剂[即 四重(三苯基膦)钯(0)]的存在下，用氰化锌处理溴代并唑(35)，得到 相应的芳基-腈，后者经用三溴化硼脱甲基，产生苯并唑(36)。用溴 化铜(I)和在DMF中的新鲜制备甲醇钠处理苯并唑(35)(R＝H)，产 生甲氧基-苯并唑(37)。用乙腈中的N-溴代琥珀酰亚胺将(37)溴化， 得到单溴代苯并唑(38)(主要产物)和二溴代苯并唑(39)(小量产 物)。

由流程I-VIII的方法制备的化合物的葡糖苷酸、硫酸酯和葡糖苷 酸-硫酸酯衍生物，可依据流程IX和X制备：

                       流程IX

            UDPGA：尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸

                    流程X

         PAPS＝3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸酯

此外，本发明的葡糖苷酸、硫酸酯和葡糖苷酸-硫酸酯衍生物， 可依据标准有机化学合成技术制备。例如依据流程I-VIII制备的本化 合物的官能团(例如一个或多个羟基)，可用标准的技术保护，然后游 离的羟基可与未经修饰的或经修饰的己糖(例如葡糖苷酸)或磺酸基偶 合，得到本发明化合物。用于这样的合成的适合的保护基，可在例 如Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis， 第2版，New York：John Wiley & Sons，N.Y.1991中找到。

药理实验方法

标准药理实验方法易于测定所给出的试验化合物的活性分布。以 下简短概述几种有代表性的实验方法并且可以包括本发明代表性化 合物的数据。所有试验，除放射配体结合试验以外，可用于检测化 合物的雌激素受体激动剂或者拮抗剂活性。通常，通过比较化合物 对参比物雌激素(例如17β-雌二醇、17α-乙炔基、17β-雌二醇、雌酮、 二乙基己烯雌酚等)的活性可测量雌激素受体激动剂活性。通常，通 过用参比物雌激素共处理试验化合物并比较单独用参比物雌激素得 到的结果，可测量雌激素受体拮抗剂活性。在美国专利4,418,068和 5,998,402中也提供SERMs的标准药理实验方法，其通过引用结合到 本文中。

对ERα和ERβ结合亲和力的评价

在常规放射配体结合试验中，评价本发明化合物的代谢物的代表 性实施例与17β-雌二醇竞争ERα和ERβ两者的能力。该实验方法为 测定对ERα或ERβ受体的相对结合亲和力提供方法学。下面简短 描述所采用的方法。

结合选择性特征的受体提取物的制备。采用作为模板的全长 cDNA和含当保持用于表达的合适的读框时亚克隆的合适的限制位点 的引物，通过PCR得到配体结合区，在此便利定义为DNA结合区 的全序列的下游。这些模板含人ERα的氨基酸M250-V595[Green，等， Nature 320：134-9(1986)]和人ERβ的M214-Q530[Ogawa，等， Biochemical & Biophysical Research Communications 243：122-6 (1998)]。把人ERβ克隆到带有C-末端Flag标记物的Ncol-BamH1片 段的pET15b(Novagen，Madison，WI)中。除加入N-末端His标记物 以外，按照人ERβ克隆人ERα。通过两条谱带的完整测序，检定采 用的所有构造的序列。

BL21(DE3)细胞用于表达人蛋白质。一般10mL过夜培养基被用 于接种1L含100μg/mL的阿莫西林的Luria-Bertani(LB)媒介物的培 养基。在37℃孵育过夜后，把异丙基-β-D-thiogulactoside(IPTG)加 入到最终浓度为1mM并在25℃下孵育2个小时。经离心(1500xg) 收集细胞，细胞小球经冲洗并重悬浮于100mL的50mM Tris-Cl(pH 7.4)、150mM NaCl中。在12000psi下，通过弗氏压碎器两次，裂 解细胞。通过在4℃下，于12,000xg下使溶解产物离心30分钟并 在-70℃下储备。

用于特异性[3H]-雌二醇结合的的提取物评价。用1mM乙二胺四 乙酸(EDTA)补充的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(1x最终浓度 Gibco；氮，Carlsbad，CA)作为试验缓冲液。为使用于试验中的受体 的量最佳化，把[3H]-17β-雌二醇(最终浓度＝2nM；New England Nuclear(NEN)；Perkin Elmer，Shelton，CT)±0.6μM二乙基己烯雌酚 和100μL大肠杆菌溶胞产物的各种稀释液加至高亲和掩蔽微滴板 (EG&G Wallac)上的每孔中。最终试验体积为120μL和且DMSO浓 度≤1％。室温下孵育5-18个小时后，吸出未结合的材料且用约300μL 的试验缓冲液把板冲洗3次。冲洗后，将135μL液体闪烁混合剂 (Optiphase Supermix，EG&G Wallac)加至每孔中，把板密封并且搅拌 至少5分钟以使闪烁物与残余冲洗缓冲液混合。通过液体闪烁计数 (Plus EG&G Wallac，Microbeta)评价结合的放射活性。

测定提供最大特异性结合的每一受体制备液的稀释液后，采用受 体制备液的各种稀释液，通过估计未标记17β-雌二醇的IC50进一步 使试验最佳化。对未标记的17β-雌二醇的IC50，选择每一受体制备液 的最终工作稀释液为2-4nM。

配体结合竞争试验方法。最初将试验化合物溶于二甲亚砜(DMSO) 中并且DMSO在结合试验中的最终浓度≤1％。每一试验化合物的8 个稀释液被用作[3H]-17β-雌二醇的未标记的竞争剂。通常，一系列化 合物稀释液应在人ERα和ERβ上同时试验。结果作为测量的每分钟 裂解数(disintegrated)(DPM)对试验化合物的的浓度做图。对剂量-应 答曲线拟合，把转化的、称重的数据的四参数对数模型拟合并且IC50 定义为化合物减少最大[3H]-雌二醇结合达50％的浓度。

本发明的代表性实施例对ERα和ERβ(通过IC50测量)的结合亲 合力显示在表(1)中。

表1：本发明化合物的代表性代谢物的ER结合亲和力   实施例 ER-βIC50(nM)   ER-αIC50     (nM)     1     140     720     2     963     5110     3     66     1570     4     239     5280     5     59     139     6     39     843     7     1600     5000     8     181     2353     9     440     1500     10     105     2040     11     703     ＞5000     12     49     1227     13     25     190     14     50     902     15     3     82     16     64     1813     17     42     1210     18     16     464     19     157     2765     20     2     155     21     3     260     22     1     47     23     3     113

    24     6     1217     25     2     227     26     4     474     27     4     409     28     25     1036     29     155     803     30     134     3080     31     31     352     32     16     196     33     31     352     34     14     1101     35     15     481     36     11     390     37     79     498     38     102     1010     39     190     7827     40     235     1300     41     6     411     42     95     9620     43     59     2557     44     13     537     45     84     655     46     59     2638     47     1340     未测定     48     40     2975     49     1042     5230     50     399     ＞5000     51     142     775     52     82     1200     53     166     1870     54     135     809

    55     313     1980     56     97     1030     57     366     1340     58     26     1435     59     52     2668     60     64     559     61     93     1180     62     201     ＞10000     63     1     44     64     3     376

在以上描述的标准药理学实验方法中得到的结果证实，测试的 化合物结合雌激素受体的两种亚型。对ERβ的IC50s一般比较低，指 明这些化合物优选为ERβ选择性配体，但仍被认为对ERα有活性。 基于，至少部份基于它们的受体亲合力选择性概况，本发明的化合 物会呈现一定范围内的活性。因为本发明化合物的代谢物结合ERβ 比结合ERα具有更高的亲合力，本发明化合物将用于治疗或者抑制 可通过ERβ调节的疾病。另外，因为每一受体配体复合物是独一无 二的，并且因此它与各种共调节蛋白的相互作用是独一无二的，依 细胞内容物而定本发明的化合物应呈现不同的和不可预见的活性。 例如，在某些细胞类型中，化合物作为雌激素受体激动剂起作用， 而在其它的组织中作为雌激素受体拮抗剂起作用是可能的。具有这 样活性的化合物有时被称为SERMs(选择性雌激素受体调节剂)。然 而，不像许多雌激素那样，许多SERMs不引起子宫湿重增加。这些 化合物在子宫是抗雌激素的且可在子宫组织中完全拮抗雌激素受体 激动剂的营养作用。然而，这些化合物在骨、心血管和中枢神经系 统中作为雌激素受体激动剂起作用。由于这些化合物的这种组织选 择性性质，它们在治疗或者抑制其引起或者与雌激素缺乏(在某些组 织例如骨或者心血管中)或雌激素过量(在子宫或者乳腺中)有关的哺 乳动物疾病症状或综合征上是有用的。另外，本发明的化合物的代 谢物具有对一种受体类型作为雌激素受体激动剂起作用而对另一种 受体类型作为雌激素受体拮抗剂起作用的潜在性。例如，已证实化 合物通过ERβ可拮抗17β-雌二醇的作用而呈现具有ERα的雌激素受 体激动剂活性[Sun，等，Endocrinology 140：800-804(1999)]。这样的 ERSAA(雌激素受体选择性激动剂拮抗剂)活性在这一系列化合物中 提供药理学上独特的雌激素活性。

金属硫蛋白II mRNA的调节

按照Harris[Endocrinology 142：645-652(2001)]描述，通过ERβ而 非ERα起作用的雌激素可向上调节在Saos-2细胞中的金属硫蛋白II mRNA水平。自这一试验方法得到的结果可与自下面描述的试验方 法(ERE报道基因试验方法)得到的结果相结合，以产生本发明化合物 的代谢物的选择性分布(也参见WO 00/37681)。本发明化合物的代表 性代谢物的数据显示在表(2)中。

表2：在Saos-2细胞中的金属硫蛋白-II mRNA的调节   化合物   调节倍数(Fold regulation)   实施例12   9.6   实施例14   12.4   实施例13   9.7

在MCF-7乳腺癌细胞中采用ERE-报道试验方法评价试验化合物

在DMSO中制备试验化合物的储备液(通常0.1M)，然后用DMSO 稀释10-100倍以制备1或10mM的工作溶液。在4℃(0.1M)或-20℃ (＜0.1M)下储备DMSO储备液。每周用生长培养基[含10％(v/v)热灭 活胎牛血清、1％(v/v)青霉素-链霉素和2mM glutaMax-1的D- MEM/F-12培养基]将MCF-7细胞传代两次。在37℃下，在5％CO2 /95％湿润的空气孵育箱中，于通气烧瓶中维持细胞。处理前一天， 在25,000细胞/孔下，用生长培养基将细胞铺展在96孔板上并在37℃ 下孵育过夜。

在37℃下，于实验培养基[含10％(v/v)热灭活活性炭剥离的胎 牛血清、1％(v/v)青霉素-链霉素、2mM glutaMax-1和1mM丙酮酸 钠的无酚红的D-MEM/F-12培养基]中，用50μl/孔的腺病毒5-ERE- tk-5-ERE-tk-荧光素酶的1∶10稀释液把细胞转染2个小时。然后，用 150μl的实验培养基把孔洗涤一次。最后，在37℃下，以8孔/复制 用150μl/孔的媒介物(≤0.1％v/v DMSO)或试验化合物处理所述细胞 24个小时，后者稀释≥1000倍成为实验培养基。

单独试验(雌激素受体激动剂模型)或与0.1nM 17β-雌二醇 (EC80；雌激素受体拮抗剂模型)组合，在单次剂量1μM下初步筛选 试验化合物。每个96孔板也包含媒介物对照组(0.1％v/v DMSO)和雌 激素受体激动剂对照组(或者0.1或者1nM 17β-雌二醇)。在活性化合 物以log自10-14增至10-5M，或者在雌激素受体激动剂上和/或者在 雌激素受体拮抗剂模型上进行剂量-应答实验。自这些剂量-应答曲 线，分别生成EC50和IC50值。每一治疗组中最后一孔含作为雌激素 受体拮抗剂对照组的5μl的3×10-5M ICI-182，780(10-6M最后浓度)。

处理后，用25μl/孔的1X细胞培养基溶胞试剂(Promega Corporation，Madison，WI)将所述细胞于摇床上溶胞15分钟。把细胞 溶胞产物(20μl)转移至96孔发光计板，采用100μl孔的萤光素酶底 物(Promega Corporation)，在MicroLumat LB 96P发光计(EG & G Berthold；Perkin Elmer，Shelton，CT)中测量萤光素酶活性。注射底物 前，对每孔进行1秒背景测量。注射底物后，1秒延迟后测量萤光素 酶活性10秒。自发光计把数据传递至Macintosh个人微机并采用JMP 软件(SAS研究所，Cary，NC)分析；此程序自每孔萤光素酶测量值减 去背景读数然后测定每处理组的平均值和标准差。

通过对数换算萤光素酶数据，并且Huber M-估算法被用于使外 围转换的观察重量下降。JMP软件用于分析单向ANOVA(Dunnett’s 试验)的转化的和称重的数据。在雌激素受体激动剂模型中，化合物 处理组与媒介物对照组结果相比较，或者在雌激素受体拮抗剂模型 中与阳性雌激素受体激动剂对照组结果(0.1nM 17β-雌二醇)相比较。 对最初的单次剂量实验，如果化合物处理结果显著区别于合适的对 照组(p＜0.05)，那么结果以相对于17β-雌二醇对照组的百分率报道[即 ((化合物-媒介物对照组)/(17β-雌二醇对照组-媒介物对照组))×100]。 JMP软件也用于自非线性剂量-应答曲线测定EC50和/或IC50值。

亲子宫活性的评价

按下面的标准药理学实验方法，可测量试验化合物的亲子宫活 性。

方法1：自Taconic(Germantown，NY)获得性未成熟(18天龄) Sprague-Dawley大鼠并提供未加以限制的酪蛋白基质饮食(Purina Mills5K96C，Purina Mills，LLC，St.Louis，MO)和水。在第19、20和 21天，用17α-乙炔基-17β-雌二醇(0.06μg/大鼠/天)、试验化合物或媒 介物(50％DMSO/50％Dulbecco’s PBS)皮下给予大鼠。为评价雌激素 受体拮抗剂活性，化合物和17α-乙炔基-17β-雌二醇(0.06μg/大鼠/天) 一同给药。每组六只大鼠并且最后一次注射后约24小时通过CO2窒 息和气胸对它们施行安乐死。摘除子宫并去除有关脂肪且排出任何 内流体后称重。组织样品也可被速冻用于分析基因表达(例如补体因 子3mRNA)。自本发明化合物的代表性代谢物得到的结果显示在表(3) 中。

      表3：所选择的化合物在大鼠亲子宫试验方法中的评价   化合物     平均子宫重量(mg)     ±SEM   媒介物     21.4±1.59   17α-乙炔基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     85.5±3.1   实施例12(2mg/大鼠)+17α-乙炔   基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     60.2±4.0   实施例41(2mg/大鼠)     30.3±1.5   实施例41(2mg/大鼠)+17α-乙炔   基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     76.6±3.0   实施例24(2mg/大鼠)     14.18±1.1   实施例24(2mg/大鼠)+17α-乙炔   基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     80.7±5.3   媒介物     30.5±3.2   17α-乙炔基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     104.7±5.4   实施例20(2mg/大鼠)     39.2±0.7   实施例20(2mg/大鼠)+17α-乙炔   基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     95.9±5.5   实施例21(2mg/大鼠)     38.8±1.7   实施例21(2mg/大鼠)+17α-乙炔   基，17β-雌二醇(0.06μg/大鼠)     93.9±5.9

方法2：自Taconic得到性未成熟(18天龄)129SvE小鼠并提供 未加以限制的酪蛋白基质饮食(Purina Mills5K96C)和水。在第22、 23、24和25天，用化合物或者媒介物(玉米油)皮下给予小鼠。每组 6只小鼠并且最后一次注射后约6小时通过CO2窒息和气胸对它们施 行安乐死。摘除子宫并去除有关脂肪且排出任何内流体后称重。自 本发明化合物的代表性代谢物得到以下结果(表4)。

表4：所选择的化合物在小鼠亲子宫试验方法中的评价的评价   化合物     平均子宫重量(mg)     ±SEM   媒介物     10.2±2.1   17β-雌二醇(50mg/kg)     41.7±3.6   实施例21(20mg/kg)     12.1±1.7   媒介物     11.7±0.5   17β-雌二醇(50mg/kg)     41.9±2.9   实施例24(50mg/kg)     10.7±0.9   媒介物     9.6±0.4   17β-雌二醇(50mg/kg)     40.0±2.0   实施例34(50mg/kg)     10.3±0.7   媒介物     9.4±0.4   17β-雌二醇(50mg/kg)     35.6±4.4   实施例25(50mg/kg)     9.7±1.0   媒介物     13.7±2.0   17β-雌二醇(50mg/kg)     40.5±5.84   实施例12(50mg/kg)     13.7±0.82   实施例20(50mg/kg)     13.1±0.86   媒介物     9.6±0.36   17β-雌二醇(50mg/kg)     40.0±2.0   实施例34(50mg/kg)     10.3±0.69     媒介物     9.8±1.2     17β-雌二醇(50mg/kg)     42.9±4.8     实施例26(50mg/kg)     9.0±0.3     实施例42(50mg/kg)     9.5±0.6     实施例64(50mg/kg)     9.8±0.7

骨质疏松和类脂调节(心脏保护)的评价

术后1天自Taconic得到切除卵巢或者假手术的雌性Sprague- Dawley大鼠(重量范围240-275g)。在一个室中按12/12(白天/昼夜) 时间表将它们按3或4只大鼠/笼饲养并且任意提供食物(Purina Mills 5K96C)和水。到达后1天对所有研究组开始治疗并且大鼠每周给药 7天，连续6周。一组不接受任何治疗的年龄相当的假手术大鼠用作 每项研究的完整的雌激素饱满对照组。

在50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1xDulbecco’s磷酸 盐水(GibcoBRL，Grand Island，NY)的媒介物中，在定义的以致于治疗 体积为0.1mL/100g体重的浓度下，制备所有的试验化合物。把17β- 雌二醇溶于玉米油(20μg/mL)中并以0.1mL/大鼠皮下给药。按照组 平均体重测量值，所有剂量在三周间隔内调整，并且皮下给药。

开始治疗5周后和研究终止1周前，评价每只大鼠的骨矿物质 密度(BMD)。在麻醉的大鼠上采用XCT-960M外周定量计算机处理 的X线断层摄影术(pQCT，Stratec Medizintechnik，Pforzheim，Germany) 评价近端胫骨的总的和小梁的密度。如下进行测量：扫描前15分钟， 腹膜内注射45mg/kg氯胺酮、8.5mg/kg赛拉嗪和1.5mg/kg乙酰丙 嗪麻醉每只大鼠。

把右后爪通过25mm直径的聚碳酸酯管并粘贴于丙烯酸框，使 踝关节在90°角和膝关节在180°角。聚碳酸酯管被附着于活动的 平台以保持它垂直于pQCT的孔径。调整平台以致于股骨的远端和 胫骨的近端处于扫描区。运行二维搜索图象10mm长和0.2mm的线 性分辨率。在监测器上展示搜索图象后，胫骨的近端被固定。自这 一点3.4mm远开始pQCT扫描。pQCT扫描为1mm厚，具有0.140mm 的轴(三维像素)径，并由145个贯穿切片的投射物组成。

在pQCT扫描完成后，在监测器上展示图象。包括胫骨但不包 括腓骨的研究区域被概述。采用迭代算法，数学上去除软组织。以 mg/cm3报道剩余的骨密度(总密度)。以同心螺旋数学上揭去骨外部 55％。以mg/cm3报道其余的骨密度(小梁密度)。

BMD评价一周后，通过CO2窒息和气胸使大鼠安乐死并采集血 液用于胆固醇测定。摘除子宫并去除有关脂肪和排出任何内流体后 称重。采用Cholesterol/HP试剂盒，用Boehringer-Mannheim Hitachi 911 临床分析仪(Roche，Alameda，CA)测定总胆固醇。采用Dunnet’s试验 的单向方差分析，比较统计学意义。

用本发明化合物的代表性代谢物得到下面的结果(表5)。

表5：给予选择的本发明化合物的代谢物后切除卵巢的大鼠体内 骨矿物质密度的评价   化合物   总骨矿物质密度   (平均值mg/cm3±   SEM)   小梁骨矿物质密度   (平均值mg/cm3±   SEM)   媒介物   543.49±14.24   353.96±13.46   17β-雌二醇(2μg/大鼠)   639.49±14.47   453.28±24.93   实施例24(10mg/kg)   517.56±9.67   321.16±9.04   实施例21(10mg/kg)   501.40±11.97   312.34±19.73   实施例20(10mg/kg)   525.51±7.93   287.56±17.56   实施例20(10mg/kg)+17β-   雌二醇(2μg/大鼠)   682.41±24.01   491.43±36.43   假手术   (非操作)   685.28±15.68   510.96±16.99

抗氧化活性的评价

自屠宰场得到猪主动脉，冲洗，迁移到冷却的PBS中，并收获 主动脉内皮细胞。为收获细胞，将主动脉的肋间血管打结且把主动 脉的一端夹紧。将新鲜、灭菌过滤的0.2％胶原酶(Sigma Type I)放入 血管中，然后夹紧血管的另一端以形成密闭的系统。把主动脉于37℃ 下孵育15-20分钟，之后收集胶原酶溶液并于2000xg下离心5分钟。 将每份沉淀悬浮于7mL由用活性炭剥离的FBS(5％)、NuSerum (5％)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素-链霉素(1000U/ml，100μg/ml)和庆 大霉素(75μg/ml)补充的无酚红DMEM/Ham’s F12培养基组成的内皮 细胞培养基中，在100mm培养皿上接种并在5％CO2中于37℃孵 育。20分钟后，用PBS冲洗细胞并加入新鲜的培养基，24小时再次 重复这一操作。约1周后，使细胞汇合。内皮细胞一周定期喂饲两 次，当汇合时，胰蛋白酶消化并以1∶7的比率接种。在待评价化合物 (5μM)存在下，将细胞介导的12.5μg/mL LDL氧化于37℃下进行4 个小时。按照通过分析游离醛的TBARS(硫代巴比妥酸活性物质)方 法[Yagi，Biochemical Medicine 15：212-6(1976)]测量，其结果表达成 氧化过程的百分比抑制率。

黄体酮受体mRNA调节标准药理学实验方法

这个实验方法可用于评价本发明的化合物的雌激素或抗雌激素 活性[Shughrue，等，Endocrinology 138：5476-5484(1997)]。本发明化 合物的代表性代谢物的数据示于表6中。

表6.本发明化合物的代表性代谢物对调节大鼠脑的视前区中黄体酮

                          mRNA的作用

    化合物     (10mg/kg)     黄体酮受体mRNA     (任意单位；平均值±stdev)     媒介物     22.0±10.1     实施例21     110.5±19.3     实施例20     238.6±36.3     实施例12     256.2±42.3     媒介物     189.2±27.2     实施例34     511.5±23.7     实施例25     447.0±60.7     实施例26     467.8±66.7     实施例64     431.3±65.6

大鼠热潮红实验方法

以标准药理学实验方法可评价试验化合物对热潮红的作用，这 个方法测量试验化合物减弱尾巴皮肤温度增加的(反应)能力，该能力 在采用纳洛酮使吗啡成瘾的大鼠毒品急剧戒断时产生[Merchenthaler， 等，Maturitas 30：307-16(1998)]。通过试验化合物与参照雌激素一同 给药，它也可用于检测雌激素受体拮抗剂活性。自本发明化合物的 代表性代谢物得到下列数据(表7)。

表7：所选择的本发明化合物的代谢物在大鼠热潮红模型中的作用     化合物   注射纳洛酮15分钟后的温度   变化(平均值±SEM)     媒介物   4.63±0.79     17α-乙炔基，17β-雌二醇(0.3mg/kg)   2.12±1.14     实施例20(15mg/kg)   5.28±0.71     实施例41(15mg/kg)   5.25±0.72

在离体大鼠主动脉环上血管舒缩功能的评价

Sprague-Dawley大鼠(240-260克)分成4组：

1.正常未切除卵巢组(完整)

2.切除卵巢(ovex)媒介物治疗组

3.切除卵巢17β-雌二醇治疗组(1mg/kg/天)

4.用试验化合物治疗切除卵巢的动物(各种剂量)

治疗前约3周切除动物卵巢。每只动物通过胃管接受悬浮在含1％ 吐温-80的蒸馏后的去离子水中的17-β雌二醇硫酸酯(1mg/kg/天)或 试验化合物。媒介物治疗的动物接受与在药物治疗组使用的体积相 当的媒介物。

通过吸入CO2使动物安乐死并放血。迅速摘除主动脉并放入含 有下面组合(mM)的37℃的生理溶液中：NaCl(54.7)、KCl(5.0)、 NaHCO3(25.0)、MgCl2 2H2O(2.5)、D-葡萄糖(11.8)和CaCl2(0.2)， 通入CO2/O2，95％/5％气体使最终pH为7.4。自外表面除去血管外膜 并把血管切成2-3mm宽的环。将环悬浮于一端连接于浴的底部且另 一端连接于力量传感器的10mL组织浴中。将1克静止的张力负荷 于环上。使环平衡1个小时，获得并分析信号。

平衡后，把环暴露于逐渐增加浓度的苯肾上腺素(10-8-10-4M)中 并且记录张力。然后用新鲜的缓冲液冲洗浴3次。洗净后，将200mM 硝基-L-精氨酸-甲基酯(L-NAME)加入到组织浴中并平衡30分钟。然 后重复苯肾上腺素浓度应答曲线。

心脏保护活性的评价

自Taconic得到载脂蛋白E-缺乏的C57/B1J(apo E KO)小鼠。严 格按照Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)指南下实 施所有动物方法。将4-7周龄的切除卵巢的雌性apo E KO小鼠饲养 于鞋盒笼中，并允许随意进食和饮水。动物根据重量随机分组(每组 n＝12-15只小鼠)。采用精细给药方案(Precise-dosing Protocol)将饮食 中的试验化合物或者雌激素(在1mg/kg/天下的17β-雌二醇硫酸酯)给 予动物，其中每周测量所消耗的饮食的量，基于动物重量相应调整 剂量。所采用的饮食为Western-款式餐(57U5)，它由Purina制备并 包含0.50％胆固醇、20％猪油和25IU/KG维生素E。采用12周一个 疗程的这一方案给予/喂饲动物。对照组动物喂饲Western-款式餐但 不接受化合物。研究期间结束时，对动物行安乐死并得到血浆样品。 首先用盐水，然后用中性缓冲的10％福尔马林溶液在位灌注心脏。

为测定血脂和脂蛋白，采用酶促方法，分别用商业上可获得的 来自Boehringer Mannheim(Roche，Alameda，CA)和Wako Biochemicals (Osaka，Japan)的试剂盒，测定总胆固醇和甘油三酯，并采用Boehringer Mannheim Hitachii 911分析仪分析。采用FPLC体积分级分离，进行 血浆脂蛋白的分离和定量。简言之，过滤50-100mL血清并把它注 射到串连的Superose12和Superose6柱中，在恒定流速下，用1mM EDTA钠和0.15M NaCl洗脱。采用Waters MillenniumTM软件，对表 示极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL) 的每条曲线的面积积分，通过每对应的色谱峰的相对百分比面积， 经总胆固醇值放大使每一脂蛋白馏分定量。

为对主动脉粥样硬化进行定量分析，小心分离主动脉且在操作 前于福尔马林固定剂中放置48-72小时。采用Oil Red O染色剂，鉴 定动脉粥样硬化的损伤。把血管短暂去染色，然后采用配备与作为 图像捕集软件的IMAQ Configuration Utility(National Instrument， Austin，TX)相谐的Sony 3CCD视频摄像系统的Nikon SMU800显微 镜成像。采用常规阈值用途软件包(Coleman Technologies，Surrey，BC， Canada)，正面(en face)沿着主动脉弓定量损伤。采用程序的阈值功能， 在血管上，具体地说，在含主动脉弓的区域，从头臂干的近边至左 锁骨下动脉的远边，进行自动化损伤评估。按照严格地在定义的内 腔区域内包含的损伤百分率表达主动脉粥样硬化数据。

认知增强的评价

在每连续5天中，把摘除卵巢的大鼠(n＝50)置于8-臂的放射状 臂迷宫(八臂迷宫，radial arm maze)中驯化10分钟。驯化和试验前使 动物禁水。将100μL等分试样的水放在每臂的末端用作补偿 (reinforcement)。通过使动物进入一个饵诱的臂，完成在放射状臂迷 宫中的获胜-转换的习得任务。饮水后，动物退出此臂并重新进入中 心室，在那里它可以进入先前访问过的臂或者进入新的臂。当动物 选择进入新的臂时，记录正确的应答。每只动物每天给出5次试验， 连续3天。最后一次习得试验后，将动物安排至下面4组中的一组：

1.阴性对照组：注射10％DMSO/芝麻油媒介物，一天一次， 连续6天(1mL/kg，SC)

2.阳性对照组：注射用17β-雌二醇苯甲酸酯注射2天并且第2 次注射后试验4天(以10μg/0.1mL给每只大鼠注射17β-雌二醇苯 甲酸酯)

3.雌二醇：应每天注射17β-雌二醇，连续6天(20μg/kg，SC)

4.试验化合物：每天注射，连续6天(剂量变化)。

所有注射应在习得实验的最后一天开始。第1、3和4组的最后 一次注射应在工作记忆试验前2个小时发生。

工作记忆试验为延迟的与样品非匹配的任务(DNMS)，采用15、 30或者60秒的延迟。这个任务为习得实验的变体，其中大鼠被放置 于中心室并且使之进入前面的一个臂。一旦大鼠半途旅行经过第一 个臂，第二个臂就会开启，并且大鼠再次需要选择这个臂。当它半 途旅行经过第二个臂时，两扇门关闭并且延迟开始。一旦延迟终止， 最初的两扇门和第三个新门同时开启。当动物半途旅行经过第三个、 新的臂时，记录正确的应答。当动物半途旅行经过第一个或者第二 个臂时，记录不正确的应答。在每三次延迟间隔中的一个，每只动 物应接受5次试验，每只动物总共15次试验。

对胸膜炎作用的评价

依据Cuzzocrea S.等[Endocrinology 141(4)：1455-63(2000)]的方 法，可评价减少实验性诱导大鼠胸膜炎的症状的能力。

对谷氨酸诱导细胞毒性(神经保护)的保护作用的评价

在体外标准药理试验方法中，采用谷氨酸攻击[Zaulyanov，等， Cellular & Molecular Neurobiology 19：705-18(1999)；Prokai，等， Journal of Medicinal Chemistry 44：110-4(2001)]，可评价本发明化合 物或其代谢物的神经保护活性。

在由组织学检查的乳房终蕾试验方法中的评价

全导管伸长和乳房导管分支，及在黄体酮影响下的小叶-蜂窝状 终蕾的后续发育需要雌激素。化合物的非催乳活性可通过它们促进 小叶-蜂窝状终蕾的能力的组织学评估测定。这样的由组织学检查的 测定实例为本领域所熟悉。参见，例如Harris，H.A.，等，Endocrinology 144(10)：4241-4249(2003)；Mulac-Jericevic，B.，等，Proc.Natl.Acad. Sci.100(17)：9744-9749(2003)；Bocchinfuso，W.P.，等，Endocrinology 141(8)：2982-2994(2002)和Lewis，B.C.，等，Toxicological Sciences 62： 46-53(2001)，上述每篇文献的全文通过引用结合到本文中。在本发 明的上下文中，如果化合物的活性＜10％的如由组织学评估的如17β- 雌二醇促进小叶-蜂窝状终蕾的发育有效性，则它被认为“非催乳活 性”。

用HLA大鼠标准药理实验方法评价炎性肠道疾病

以模拟人炎性肠道疾病的HLA大鼠标准药理实验方法，评价本 发明化合物的代表性代谢物。下面简短描述所采用的方法和得到的 结果。自Taconic得到雄性HLA-B27大鼠并不限制进食(PMILab Diet5001，Purina Mills，Inc.，St.Louis)和水。每天观察大鼠粪便质量 并按照以下标准分级：腹泻＝3；软便＝2；正常粪便＝1。研究结束时， 收集血清并在-70℃下贮存。制备结肠切片以用于组织学分析并对 另外的部分分析髓过氧化物酶活性。

在研究A中，用下面列出的方案之一皮下给予大鼠(22-26周龄)， 每天一次，连续7天。每组5只大鼠，并且安乐死之前两个小时给 予最后剂量。

·媒介物(50％DMSO/50％Dulbecco’s PBS)

·实施例24(50mg/kg)

得自研究A的结果显示在表8中。给予媒介物的大鼠在整个研 究过程中继续腹泻。用实施例24治疗的大鼠粪便质量得到改善。

表8：用本发明代表性化合物皮下治疗5天的HLA大鼠的粪便特性

                         的评价   天     媒介物     粪便特性*     实施例24(50mg/kg)   1     3     2.8   2     3     2   3     3     1.8   4     3     1.6   5     3     1.6   6     3     1.4

*报道的值为组的平均分数。

3＝腹泻；2＝软便；1＝正常粪便

在研究B中，如下口服给予大鼠(8-10周龄)，连续26天：

·媒介物(2％吐温-80/0.5％甲基纤维素)

·实施例25(第1-14天10mg/kg；然后在第15天增加至 20mg/kg)

·实施例34(10mg/kg)

得到下面的结果(表9)并在用本发明化合物的代表性代谢物治疗 所有大鼠中显示改善的粪便特性。

表9：用媒介物或本发明化合物的代表性代谢物口服治疗的HLA大

                 鼠的粪便特性的评价

    天     媒介物          粪便特性*     实施例25   实施例34     1     1     1   1     2     1     1   1     3     1     1.25   1     4     1.25     1.25   1.25     5     2.5     1.75   2     6     2.75     1.5   1.75     7     2.75     2   1.75     8     2.75     2   1.5     9     3     1.75   1.5     10     3     1.5   1.25     11     2.75     2   1.5     12     2.75     1.75   1.5     13     2.75     2.25   1.25     14     2.75     2   1.25     15     2.75     2   1.25     16     3     1.5   1     17     2.75     1.5   1     18     2.75     1.5   1.25     19     2.75     1.25   1     20     ND     ND   ND     21     ND     ND   ND     22     3     1.25   1     23     3     1.25   1     24     3     1.25   1     25     3     1.25   1     26     3     1.25   1

*报道的值为组的平均分数。

ND：未测定

3＝腹泻；2＝软便；1＝正常粪便

在研究C中，每天一次，用下列制剂之一口服给予大鼠(8-10周 龄)，连续46天。每组4只大鼠，并且安乐死之前两个小时给予最后 剂量。

·媒介物(2％吐温-80/0.5％甲基纤维素)

·实施例21(第1-18天10mg/kg；然后在第19天增加至20mg/kg)

·实施例24(第1-24天10mg/kg；然后在第25天增加至20mg/kg)

得到下面的结果(表10)并显示给予所有的ERβ选择性化合物(治 疗后)改善的粪便特性。

表10：用媒介物或本发明化合物的代表性代谢物口服治疗的HLA大

                   鼠的粪便特性     天     媒介物        粪便特性*   实施例24   实施例21     1     2.75   2.75   2.75     2     3   2.75   3     3     3   2.75   2.75     4     3   2.5   2.75     5     3   2   2.75     6     3   2.5   2.5     7     3   2.25   2.5     8     3   2.25   2.75     9     3   2.25   2.5     10     3   2.25   2.75     11     3   2.25   2.5     12     3   1.75   2.5     13     3   2.25   2.5     14     3   2   2.5     15     3   1.75   2.5     16     3   1.75   2.5

    17     3     1.75     2.5     18     3     1.75     2.5     19     3     1.75     2.75     20     3     1.75     2.5     21     3     1.75     2.75     22     3     1.75     2.5     23     3     1.75     2.25     24     3     2     1.75     25     3     2     2     26     2.75     2.25     2     27     3     1.75     2     28     3     1.75     2     29     3     1.5     2     30     2.75     1.5     2.25     31     3     1.5     2.25     32     3     1.5     2     33     3     1.75     1.5     34     3     1.75     1.75     35     3     1.5     1.5     36     3     1.5     1.75     37     3     1.25     1.5     38     3     1.75     1.5     39     3     1.75     2     40     3     1.5     1.75     41     3     1.75     2     42     3     1.5     2     43     3     1.5     2     44     3     1.5     2     45     3     1.25     2     46     3     1.25     2     3＝腹泻；2＝软便；1＝正常粪便

*报道的值为组的平均分数。

3＝腹泻；2＝软便；1＝正常粪便

组织学分析。把结肠组织浸泡在10％中性缓冲的福尔马林中。 将每片结肠分割为4个样品用于评价。在Tissue-Tek真空浸润加工 器(Miles，Inc；West Haven，Connecticut)中将福尔马林固定的组织加工 以用于石蜡埋植。将样品切成5μm，然后用苏木精和伊红(H&E)染 色用于采用在Boughton-Smith后改进的计分法的双盲组织学评价。 完成评分后，样品为非盲的，并且以数据作表且通过带有多项平均 值比较的(multiple mean comparisons)ANOVA线性模型分析。结肠组 织的切片被用于评价几种疾病适应症和所给出的相关分数。如在表 (11)(两种皮下给药研究的组合，包括研究A)中显示的，在减少组织 损伤的几种测量中实施例24是有效的。

表11：在HLA-B27大鼠模型中的疾病严重性的组织学评分：采用皮

               下给药5天的两个研究的组合。   组别   溃疡   (0-2)     炎症     (0-3)     损伤深度     (0-2)   纤维样变性   (0-2)   总分数   媒介物   1.38     2.69     1.19   0.88   6.13   实施例24   (50mg/kg)   0.25*#     1.05*#     0.2#   0*   1.5*#   实施例24   (10mg/kg)a   0.81*     1.63*     0.69*   0.50*   3.6*   实施例24   (1mg/kg)a   1.25     1.63*     0.88*   0.75   4.4*

a得自第二项研究的数据

*显著性＜媒介物或EE+ICI

#显著性＜EE

得自研究B的肠组织也经组织学检测(参见上面)。如下显示(表 12)，两个化合物显著减少总疾病分数。

表12：用本发明化合物的代表性代谢物口服治疗4周的动物结肠的

                 疾病严重性的组织学评分。   组别   溃疡   (0-2)**   炎症   (0-3)   损伤深度   (0-2)   纤维样变性   (0-2)   总分数   媒介物   1.44±0.66   2.88±0.14   1.56±0.63   1.06±0.32   6.94±1.51   实施例   25   0.44±0.24*   1.50±0.35*   0.44±0.24*   0.31±0.13*   2.69±0.52*   实施例   34   0.75±0.46*   1.81±0.13*   0.63±0.32*   0.31±0.32*   3.50±1.10*

*显著性＜媒介物；**报告值为平均值±SD

得自研究C的肠组织也经组织学检测(参见上面)。如下显示(表 13)，实施例24显著减少总疾病分数。尽管在统计上没有显著性意义， 实施例21在所有疾病参数上的分数低于媒介物-治疗的大鼠的相应的 分数。

表13：用本发明化合物的代表性代谢物口服治疗7周的动物结肠的

                疾病严重性的组织评分。   组别   溃疡   (0-2)**   炎症   (0-3)   损伤深度   (0-2)   纤维样变性   (0-2)   总分数   媒介物   1.19±0.69   2.38±0.32   1.0±0.54   0.94±0.75   5.50±2.1   实施例   21   0.81±0.47   2.06±0.43   0.75±0.50   0.56±0.32   4.19±1.74   实施例   24   0*   0.69±0.24*   0*   0*   0.69±0.24*

*显著性＜媒介物；**报告值为平均值±SD

两种模型关节炎的评价

佐剂诱发关节炎的Lewis大鼠试验。按照标准便利操作方法， 饲养60只雌性，12周龄，Lewis大鼠。它们任意接受标准方案的食 物和水。通过标明项目组和动物编号的笼卡区别每只动物。通过不 易涂抹的墨水记号笔在尾巴上标记每只动物编号。研究前至少10-21 天，使它们麻醉并且通过标准无菌外科技术切除卵巢。

弗氏完全佐剂(Sigma Immuno Chemicals，St.Louis，MO)被用于诱 发关节炎，每mL含热杀和干燥的1mg结核分支杆菌、0.85mL矿 物油和0.15mL单油酸甘露糖醇酯(批号084H8800)。

以下为两个实验方法的实施例。

抑制实验方法：30只大鼠于尾根部皮内注射0.1mL的弗氏完全 佐剂。把动物随机分为4组，每组6只大鼠。每天，各组接受媒介 物(50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1xDulbecco’s磷酸盐缓冲 盐水(GibcoBRL，Grand Island，NY)或试验化合物(皮下给予)。所有 大鼠第1天开始治疗。本发明化合物的代表性代谢物的数据显示在 表14中。

治疗实验方法：30只大鼠于尾根部皮内注射0.1mL的弗氏完全 佐剂。把动物随机分为4组，每组包括6只大鼠。每天，各组接受 媒介物(50％DMSO(JT Baker，Phillipsburg，NJ)/1xDulbecco’s磷酸缓 冲盐水(GibcoBRL，Grand Island，NY)或者试验化合物(皮下给予)。 所有大鼠在佐剂注射后第8天开始治疗。本发明化合物的代表性代 谢物的数据显示在下文的表15、16和17中。

采用Abacus Concepts Super ANOVA(Abacus Concepts公司， Berkeley，CA)进行统计学分析。研究的所有参数经历组间Duncan’s 新的多元回归试验的(多元事后随机测试，multiple range post hoc testing)方差分析。数据被表达为平均值±标准差(SD)，如果p＜0.05， 认为差异显著。

按照下面的疾病指数：后足爪红斑、后足爪肿胀、关节触痛和 运动及体姿，每天监测关节炎严重性的程度。将0-3的整数分数用于 定量红斑(0＝正常足爪，1＝稍微红斑，2＝中度红斑，3＝严重红斑)和 肿胀(0＝正常足爪，1＝稍微肿胀，2＝中度肿胀，3＝严重肿胀的后足 爪)的水平。每天最大分数为12。

在研究结束时，用CO2使大鼠安乐死，尸体剖检时切除下肢并 在10％缓冲的福尔马林中固定，并且跗关节脱钙并包埋在石蜡中。 用苏木精和伊红或者番红O-坚牢绿染色液将组织切片染色。

将玻片编码以致于检验者不知道哪一组为治疗组。在滑膜增殖、 炎性细胞浸润和血管翳形成的基础上评价得自跗关节的滑膜组织 [Poole和Coombs，International Archives of Allergy & Applied Immunology 54：97-113(1977)]，阐述如下。   类目   等级   1.滑膜衬细胞   a.无变化   0   b.细胞增大，稍微增厚   1   c.细胞增大，数目增加，中度增厚。无绒毛存在   2   d.细胞增大，增厚，存在绒毛   3   2.纤维组织形成   a.无变化   0   b.纤维组织形成存在于衬细胞下   1   c.小区域的疏松结缔组织由纤维组织替代   2   d.疏松结缔组织由纤维组织替代   3   3.炎性细胞   a.偶尔可以观察到，散落在贯穿所选择的区域   0   b.细胞以小数目存在或者存在于衬细胞层中或者恰好处   于衬细胞层下和/或在血管周围。   1   c.少量粘着采集的细胞可以存在   2   d.大量的细胞存在于囊中并且存在于衬细胞层中或者恰   好处于衬细胞层下。   3   4.血管翳

  a.不可检测   0   b.可检测   1

另外，采用下面显示的Mankin氏组织学分级系统[Mankin等， Journal of Bone & Joint Surgery-American Volume 53：523-37(1971)] 评价关节软骨和骨。   类目     类目   1.结构   a.正常     0   b.表面不规则     1   c.血管翳和表面不规则     2   d.裂开到过渡带     3   e.裂开到边缘带     4   f.裂开到钙化带     5   g.结构完全破坏     6   2.细胞   a.正常     0   b.弥散性细胞过多     1   c.细胞集落     2   d.细胞过多     3   3.细胞过多   a.正常     0   b.稍微减少     1   c.中度减少     2   d.中度减少     3   e.未见到染色     4   4.潮标完整性   a.接触     0

  b.经血管穿透     1

表14：Lewis大鼠关节炎的评价：抑制方法     天     媒介物     实施例24     1     0.00     0.00     2     0.00     1.00     3     4.50     4.50     4     5.50     4.83     5     9.33     5.83     6     10.50     6.16     7     10.60     6.16     8     11.00     5.33     9     11.50     5.66     10     11.33     4.33     11     10.83     3.16     12     10.83     3.16     13     11.00     2.16     14     11.00     3.33     15     11.00     3.00     16     11.00     1.66     17     10.50     1.50

         表15：Lewis大鼠关节炎的评价：治疗方法   天   媒介物   实施例24   实施例27   实施例32   1   10.83   11.33   11.33   11.33   2   11.00   11.15   11.15   10.83   3   10.83   11.33   11.33   9.33   4   11.33   9.50   9.83   8.00   5   11.50   8.00   8.83   5.83   6   11.50   7.00   7.83   3.33

  7     11.50     5.83     6.16     3.00   8     11.50     4.83     5.00     2.50   9     11.00     3.50     4.33     2.50   10     11.00     3.83     2.66     2.50   11     10.66     3.83     1.83     2.50   12     10.66     3.83     1.83     2.50   13     10.50     3.16     2.66     2.50   14     9.83     3.16     2.66     2.50   15     8.10     2.83     2.00     2.00   16     7.35     2.83     2.00     1.33   17     6.50     2.00     1.50     1.00

表16：Lewis大鼠跗关节滑膜炎的组织学评分(平均值±SD)：治疗

                           方法   组别   滑膜结构   (0-3)**   纤维组织形   成   (0-3)   炎性细胞   (0-3)   血管翳   (0-1)   总滑膜炎分   数   (0-10)   媒介物   2.58±0.38   1.75±0.42   2.92±0.20   1.00±0.89   8.25±1.57   实施例   24   50mg/kg   1.42±0.49*   0.42±0.80*   1.33±0.41*   0.08±0.20*   3.25±1.54*

*显著性＜媒介物；**报告值为平均值±SD

表17：Lewis大鼠跗关节中软骨变化(Mankin评价)的组织学评分(平

                  均值±SD)：治疗方法

  组别   软骨结构   (0-6)**   软骨细胞   (0-3)   番红-O/坚牢   绿染色   (0-4)     潮标完     整性     (0-1)   总Mankin   分数   (0-14)   媒介物   2.83±0.26   2.58±0.38   2.50±0.32     0   7.92±0.74   实施例24   50mg/kg   1.58±0.49*   0.83±0.75*   1.25±0.69*     0   3.67±     1.86*

*显著性＜媒介物；**报告值为平均值±SD

对HLA-B27大鼠关节炎模型的评价。在模拟人关节炎的HLA-B27 大鼠标准药理实验方法中评价本发明化合物的代表性代谢物。下面 简短描述所采用的方法和得到的结果。雄性HLA-B27大鼠得自 Taconic并提供未加以禁止食物(PMILabDiet 5001)和水。如以上对 佐剂诱导的关节炎的Lewis大鼠模型描述，评价关节分数和组织学。

研究1：每天用下列制剂之一口服给予大鼠(8-10周龄)一次，连 续46天。每组4只大鼠，并且安乐死之前两个小时给予最后剂量。

·媒介物(2％吐温-80/0.5％甲基纤维素)

·实施例21(第1-18天10mg/kg；然后在第19天增加至20mg/kg)

·实施例24(第1-24天10mg/kg；然后在第25天增加至20mg/kg)

对本发明化合物的代表性代谢物得到以下结果(表18和19)。

      表18：得自研究1的关节炎的评价   天   媒介物   实施例24   实施例21   29   2.5   1.5   0.75   30   6   0.5   1.75   31   5   0.5   1.25   32   6.75   1.25   0.75   33   8   2   1   34   8   2.25   1.25

    35     8     2     2.25     36     6     2.25     1     37     7.5     2     4     38     6.5     2.75     1.5     39     7.5     2.25     1.5     40     7.5     1.75     2.25     41     6.5     2     2.25     42     6.5     2.5     1.5     43     6     4.75     1.25     44     6.75     3     1     45     5.5     2.75     2.5     46     6     3.25     2

          表19：得自研究1的关节组织学评价。   化合物   滑膜炎分数(平均值±     SD)   Mankin分数(平均值±     SD)   媒介物   7.75±2.6   6.75±1.0   实施例24   3.17±0.3*   3.5±1.8**   实施例21   6.1±0.75   4.6±0.9

*显著性＜媒介物，p＜0.07

**显著性＜媒介物，p＜0.05

研究2：每天用下列制剂之一口服给予大鼠(8-10周龄)一次，连 续26天。每组4只大鼠，并且安乐死之前两个小时给予最后剂量。

·媒介物(2％吐温-80/0.5％甲基纤维素)

·实施例25(第1-14天10mg/kg；然后在第15天增加至20mg/kg)

·实施例34(10mg/kg)

对本发明化合物的代表性代谢物得到以下结果(表20)。

           表20：得自研究2的HLA大鼠关节炎的评价   天     媒介物   实施例25 实施例34   1     0   0     0   2     0   0     0   3     0   0     0   4     0   0     0   5     0   0     0   6     0   0     0   7     0   0     0   8     2.5   1     0.25   9     3.75   2     0.75   10     2.75   2.25     0.5   11     3.5   2.25     0.5   12     1.25   2     0.25   13     1.25   2     0.5   14     1.25   2     0   15     5.25   3.75     0.5   16     4.5   3     0.5   17     3.5   2.75     0.25   18     3.75   2     0.75   19     5.5   1.5     1   22     3.25   1.25     1   23     6.5   2.5     1.75   24     6.5   2     1.75   25     6.25   2     2   26     7   1.75     3

体内致癌模型的评价

以文献中易于得到的包括下面的两个方法的标准药理学实验方 法，可评价本发明化合物及其代谢物治疗和抑制各种恶性肿瘤或者过 度增殖疾病的能力。

乳腺癌。自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)得到切 除卵巢的无胸腺nu/nu(裸)小鼠。于肿瘤细胞注射前一天，用含0.36- 1.7mg 17β-雌二醇(60或90天释放，Innovative Research of America， Sarasota，FL)的时辰释放小丸或安慰剂植入动物。采用10-刻度精确 转子，把小丸经皮下导入内雕纹区。接着，用1×107MCF-7细胞或 1×107BG-1细胞皮下注射到小鼠乳腺组织中。将细胞与等体积的基 底胶(matrigel)混合，后者为一种为增强肿瘤建立的基底膜基质制备 液。在肿瘤细胞植入(抑制方案)后一天或者肿瘤已达到某一体积(治 疗方案)后，通过给药可评价试验化合物。每天经腹膜内或者口服给 予在盐水中的1％吐温-80媒介物中的化合物。每3或7天评价肿瘤 体积。

结肠癌。以Smirnoff P.，等[Oncology Research 11：255-64(1999)] 的实验方法可评价治疗或抑制结肠癌的能力。

以两种体内实验方法评价神经保护作用

蒙古沙土鼠的瞬时总体缺血。采用下面的实验方法，可测量试 验化合物预防或治疗应答于氧剥夺/再灌注脑损伤的作用。

雌性蒙古沙土鼠(60-80g；Charles River Laboratories，Kingston， NY)在Wyeth-Ayerst动物护理中心(获Association for Assessment和 Acreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)认证)饲养，伴随12 小时光照，12小时黑暗光周期并且自由进食自来水和低雌激素酪蛋 白膳食(Purina；Richmond，IN)。顺应(3-5天)后，用异氟烷(2-3％与O2 的混合物)麻醉沙土鼠，摘除卵巢(第0天)。第二天(第1天)早晨开始， 每天用媒介物(10％ETOH/玉米油)、17β-雌二醇(1mg/kg，sc)或实验化 合物皮下治疗沙土鼠。第6天，用异氟烷麻醉沙土鼠(n＝4-5/组)，通 过中线颈切口使常见颈动脉主动脉肉眼可视并用非创伤显微动脉瘤 夹钳同时闭合两条主动脉5分钟。闭合后，移去夹钳以使脑再灌注 并且用创伤夹钳封闭颈切口。在沙土鼠局部缺血手术之前，所有动 物禁食过夜，这个步骤利于始终如一的局部缺血损伤。第12天，沙 土鼠暴露于致死剂量的CO2中，在干冰上冷冻脑且在-80℃下贮存。 用于这些研究的动物方法被综述并且得到于Wyeth-Ayerst Research 的Radnor/Collegeville Animal Care and Use Committee (RACUC/CACUC)批准。

通过神经颗粒素(neurogranin)mRNA的在位杂交分析，评价神 经元保护的程度。简言之，在凝胶包衣的载玻片上收集20μm的冠 状恒冷箱切片，干燥并在-80℃下贮存。加工时，把干燥的载玻片箱 温热至室温，将载玻片后固定在4％低聚甲醛中，用乙酸酐处理，然 后用氯仿和乙醇脱脂和脱水。之后用200μl(6×106DPM/载玻片)在 50％甲酰胺杂交混合液中的用于神经颗粒素(35S-UTP标记的NG- 241，基质99-340)的反义或者意义(对照组)核糖探针把所加工的切片- 计数载玻片杂交，并且在55℃下于湿润的载玻片室中孵育过夜而不 必盖玻片。第二天上午，收集支架上的载玻片，把它们浸泡在2×SSC (0.3M NaCl，0.03M枸橼酸钠，pH 7.0)/10mM DTT中，用RNase A(20 μg/ml)处理并在67℃下于0.1×SSC中冲洗(2×30分钟)以除去非特 异性标记物。脱水后，将载玻片暴露于BioMax(BMR-1，Kodak， Rochester，NY)X-射线胶片中过夜。

神经颗粒素杂交信号水平被用于定量评价损伤后在CA1区神经 元缺失的程度并评价17β-雌二醇和实验化合物的效力。选择神经颗 粒素mRNA用于这些研究，因为它在包括CA1的海马神经元中高度 表达，但是在存在于这个脑区的神经胶质和其它细胞类型中缺乏。 因此，存在的神经颗粒素mRNA的量的测量值表示存活的神经元。 神经颗粒素杂交信号的相对光密度测量值得自带有基于图像分析系 统(C-Imaging Inc.，Pittsburgh，PA)的计算机的胶片放射自显影图。使 得自每只动物的6个切片(相隔40μm)的结果求平均值并做统计学评 价。各种数值以平均值±SEM报告。单向方差分析被用于检验神经 颗粒素mRNA的水平差异并且在结果部分中的非-差异的所有陈述意 味着p＞0.05。

自本发明化合物的代表性代谢物得到下面的结果(表21)。

表21：本发明化合物的代表性代谢物保护沙土鼠海马神经元的作用     化合物     神经颗粒素mRNA     (任意单位，平均值±stdev)     媒介物     0.0     实施例24     0.0     实施例41     43.0±21.8

小鼠中脑主动脉闭合。按照由Dubal[参见Dubal等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98： 1952-1957(2001)和Dubal等，Journal of Neuroscience 19：6385-6393 (1999)]描述的实验方法，可评价神经保护作用。

排卵抑制标准药理学实验方法

本实验方法用于测定试验化合物能否抑制或改变排卵的时间。 它也可用于测定排卵的卵母细胞的数量[Lundeen，等，J Steroid Biochem Mol Biol 78：137-143(2001)]。自本发明化合物的代表性代谢 物得到以下数据(表22)。

 表22：本发明化合物的代表性代谢物抑制排卵的作用     化合物 卵母细胞的数量(平均值±SEM)     媒介物     13.00±0.72     实施例20(50mg/kg)     14.13±0.79     实施例24(50mg/kg)     13.86±0.77

子宫内膜异位标准药理学实验方法的评价

自出版的方法[Bruner-Tran.等，Journal of Clinical Investigation 99： 2851-2857(1997)]对这个方法稍加改进。简言之，体外用10nM 17β- 雌二醇处理正常人子宫内膜组织(周期天数～12)过夜，然后植入切除 卵巢的无胸腺裸小鼠。为这些研究的目的，如在本文中描述的，小 鼠不接受雌激素/安慰剂植入剂。使损伤建立至少10天，然后开始每 天口服给药并持续至少15天。值得一提的是所有小鼠在给药开始时 具有肉眼可见的损伤。在尸体剖检下，测定带有损伤的小鼠的数目 以及每只小鼠的损伤。

在10mg/kg剂量下，以该方法对实施例24的化合物评价三次。 在每个实验方法中，在尸体剖检下，给予实施例24化合物的小鼠比 那些给予媒介物的小鼠具有更少的损伤。例如，在研究1中，媒介 物组中的4只小鼠中每一只具有至少1处损伤并且在这一组中总共 有10处损伤。相反，实施例24治疗的6只小鼠中仅有2只具有任 何损伤并且每只动物仅发现1处损伤。因此，由于所有的小鼠在治 疗开始时具有损伤，实施例24的化合物在6只小鼠中有4只引起损 伤。

基于在标准药理试验方法中得到的结果，本发明的前药化合物 为期望得到作为雌激素受体调节剂的化合物，所述化合物用于治疗 或抑制至少部分由雌激素缺乏或者过量介导的，或者可通过采用雌 激素药物治疗或抑制的症状、紊乱或者疾病状态。这样的化合物特 别用于治疗其中所产生的内源性雌激素水平被大大减少的绝经前后 (peri-menopausal)、绝经或经绝后的患者。经绝一般定义为最后的自 然月经期且特征为卵巢功能的停止，导致血流中循环中的雌激素显 著减少。当在此所使用时，经绝也可包括由手术的、化学的，或者 导致卵巢功能过早降低或停止的疾病症状引起的雌激素产生减少的 情况。

本发明的前药化合物也用于抑制或治疗雌激素缺乏的其它结 果，包括：热潮红、阴道或阴门萎缩、萎缩性阴道炎、阴道干燥、 瘙痒症、交媾困难、排尿困难、尿频、尿失禁、尿道感染。其它的 生殖道用途包括治疗或抑制功能性子宫出血。化合物也用于治疗或 抑制子宫内膜异位症。

本发明的前药化合物在脑中也有活性，且因此用于抑制或治疗 阿尔茨海默氏病、认知衰退、性欲减退、老年性痴呆、神经退化性 疾病、抑郁症、焦虑症、失眠症、精神分裂症和不育症。本发明化 合物还用于治疗或抑制良性或恶性异常组织生长，包括肾小球硬化 症、前列腺肥大、子宫平滑肌瘤、乳腺癌、硬皮病、纤维瘤病、子 宫内膜癌、多囊卵巢综合征、子宫内膜息肉、良性乳房疾病、子宫 内膜异位、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、CNS癌症，诸如 神经胶质瘤或星母细胞瘤(astioblastomia)。

本发明的前药化合物具有心脏保护作用且为抗氧化剂，并用于 降低胆固醇、甘油三酯、Lp(a)和LDL水平；抑制或者治疗高胆固醇 血症、高脂血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周血管疾病、再 狭窄和血管痉挛，并且抑制由于导致免疫介导的血管损伤的细胞过 程引起的血管壁损伤。

本发明的前药化合物也用于治疗与炎症或者自动免疫疾病有关 的疾病，包括炎性肠道疾病(克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、不确定的结 肠炎)、关节炎(类风湿性关节炎、椎关节病、骨关节炎)、胸膜炎、 局部缺血/再灌注损伤(例如卒中、移植性排斥、心肌缺血等)、哮喘、 巨细胞性动脉炎、前列腺炎、葡萄膜炎、牛皮癣、多发硬化症、系 统性红斑狼疮和脓毒症。

本发明的前药化合物也用于治疗或抑制眼疾病，包括白内障、 葡萄膜炎和黄斑变性，并用于治疗皮肤疾病例如衰老、脱发和痤疮。

本发明的前药化合物也用于治疗或抑制代谢疾病诸如II型糖尿 病、脂质代谢(异常)、食欲(异常)(例如神经性厌食症和贪食症)。

本发明的前药化合物也用于治疗或抑制出血性疾病诸如遗传出 血性毛细管扩张、功能性子宫出血和格斗出血性休克。

本发明的前药化合物用于治疗其中闭经是有利的疾病状态，例 如白血病、子宫内膜切除、慢性肾病或肝病或者血凝固疾病或紊乱。

本发明的前药化合物可用作避孕药，特别是当与孕激素合并使 用时。

当给药用于治疗或抑制具体的疾病状态或者紊乱时，应理解有 效剂量可依使用的具体化合物、给药模式、所治疗的疾病和疾病的 严重性以及与所治疗的个体相关的多种身体因素而定。可在约0.1mg/ 天-约1000mg/天的口服剂量下有效给予本发明的化合物。优选以单 剂量或以两次或更多次分开的计量给予约10mg/天-约600mg/天，更 优选给予约50mg/天-约600mg/天。预期设想的每天剂量随着给药途 径而变化。

这样的剂量可以任何用于使本文的活性化合物向着接受者的血 流的方式给药，包括口服、经由植入、非肠道(包括静脉内、腹膜内、 关节内和皮下注射)、直肠、鼻内、局部、眼(借助眼滴剂)、阴道和 经皮。

含有本发明的活性化合物的口服制剂可包含任何常规使用的口 服形式，包括片剂、胶囊、颊下含片制剂、锭剂、糖锭剂和口服液 体、悬浮液或溶液剂。胶囊可含有活性化合物与惰性填充剂和/或稀 释剂的混合物，所述填充剂和/或稀释剂诸如药学上可接受的淀粉(例 如玉米、马铃薯或木薯淀粉)、蔗糖、人工甜味剂、粉末纤维素，诸 如结晶和微晶纤维素、矫味剂、明胶、树胶等。通过常规压制、湿 法制粒或干法制粒方法并使用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润 滑剂、崩解剂、表面修饰剂(包括表面活性剂)、助悬剂或者稳定剂， 包括(但不限于)硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微晶 纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、藻酸、阿拉伯 胶、黄原胶、枸橼酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗 糖、山梨醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露醇、氯化钠、 滑石粉、干燥淀粉和粉末化蔗糖可制备有用的片剂。优选的表面修 饰剂包括非离子和阴离子表面修饰剂。表面修饰剂的代表性实例包 括(但不限于)羟聚体188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六醇十八醇混合 物、聚西托醇乳化蜡、山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二 烷基硫酸钠、硅酸铝镁和三乙醇胺。在此的口服制剂可使用标准延 迟或定时释放制剂，以改变活性化合物的吸收。口服制剂也可包括 给予在水或果汁中的活性组分，如果需要，包含合适的稳定剂或者 乳化剂。

在某些情况中，将所述化合物以气溶胶的形式直接给予气道是 合乎需要的。

本发明的前药化合物也可以非肠道或腹膜内给药。也可以在水 中与适宜的表面活性剂诸如羟基丙基纤维素混合制备作为游离碱或 药理学上可接受的盐的这些活性化合物的溶液剂或悬浮剂。也可以 用甘油、液体聚乙二醇和它们在油中的混合物制备分散剂。在常规 的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以抑制微生物的生长。

适合于注射使用的药用形式包括灭菌水溶液剂或分散剂并用于 临时制备灭菌可注射水溶液剂或分散剂的灭菌粉末。在所有情况中， 所述制剂必须是灭菌的和必须是流体以达到易于注射的程度。在制 备和贮存的条件下它必须是稳定的并且必须在抗微生物例如细菌和 真菌的污染作用下保存。载体可以为溶剂或分散介质，包含例如水、 乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、它们合适的混合 物和植物油。

为了本公开的目的，经皮给药被理解为包括所有的穿过身体表 面和身体通道的内衬包括上皮和粘膜组织的给药。使用本化合物或 其药学上可接受的盐，以洗剂、霜剂、泡沫剂、贴剂、悬浮剂、溶 液剂和栓剂(直肠和阴道)，可实施这样的给药。

通过使用含有所述活性化合物和对所述活性化合物惰性的载体 的经皮贴剂可实现经皮给药，所述该载体对皮肤无毒，并使得药物 经皮肤传递全身吸收进入血流。所述载体可采取任何数目的形式， 例如霜剂和软膏剂、糊剂、凝胶剂和封堵器(occlusive devices)。霜剂 和软膏剂可为水包油或油包水型的粘稠液体或半固体乳剂。由分散 于含有活性组分的石油或亲水石油中的可吸收粉末组成的糊剂也可 以是合适的。多种封堵器可用于把活性组分释放进入血流，例如包 含贮库的半透膜，后者含有含或不含载体的活性成分，或者含有活 性成分的基质。在文献中已知其它的封堵器。

从传统材料，包括可可脂，伴随加入或不加入蜡以改变栓剂的 熔点，和甘油，可制备栓剂。也可使用水溶性栓剂基质，例如不同 分子量的聚乙二醇。

                       实施例

可衍生形成本发明化合物的化合物，其代表性实施例的制备描 述如下。

                       实施例1

     2-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，4-二酚

步骤a)n-(2，5-二甲氧基苯基)-2，5-二甲氧基苯甲酰胺

将2，5-二甲氧基苯甲酸(5.0g，27.5mmol)和亚硫酰氯(15mL)的混 合物回流1个小时。然后真空除去挥发物。把残余物溶于THF(20mL) 中并加入到2，5-二甲氧基苯胺(4.6g，30.2mmol)、三乙胺(5mL，35.9 mmol)和THF(40mL)的冷的(0℃)溶液中。使反应混合物搅拌30分 钟，倾到入水中，用HCl(2N)酸化并用EtOAc提取。有机提取液经 MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 2/1)纯化，得到白色 固体(8.1g，93％收率，m.p.121-123℃)；MS m/e 318(M+H)+。

对C17H19NO5分析：

理论值：C，64.34；H，6.03；N，4.41

实测值：C，64.29；H，5.95；N，4.44

步骤b)2-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，4-二酚。

于200℃下，将N-(2，5-二甲氧基苯基)-2，5-二甲氧基苯甲酰胺(1.0 g，3.1mmol)和吡啶盐酸盐(2.0g，17.3mmol)的混合物搅拌1个小时。 使反应混合物冷却至室温并加入HCl(10mL，2N)。然后用EtOAc提 取反应混合物且有机提取液经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己 烷/EtOAc 2/1)纯化，得到白色固体(0.8g，76％收率，m.p.309-311℃)； MS m/e 242(M-H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.98；H，3.71；N，5.62

                         实施例2

        3-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，2-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和2，3-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物。得到为褐色固体的产物， m.p.239-241℃；MS m/e 244(M+H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.86；H，3.90；N，5.74

                         实施例3

           2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和3-氟-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产 物，m.p.262-268℃；MS m/e 244(M-H)+。

对C13H8FNO3分析：

理论值：C，63.68；H，3.29；N，5.71

实测值：C，64.01；H，3.25；N，5.63

                         实施例4

           2-(3-氯-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和3-氯-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产 物，m.p.254-256℃；MS m/e 260(M-H)+。

对C13H8ClNO3分析：

理论值：C，59.67；H，3.08；N，5.35

实测值：C，59.59；H，3.02；N，5.25

                       实施例5

        2-(2-氯-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和2-氯-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产 物，m.p.253-255℃；MS m/e 262(M+H)+。

对C13H8ClNO3分析：

理论值：C，59.67；H，3.08；N，5.35

实测值：C，59.79；H，2.87；N，5.36

                       实施例6

         2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和3-氟-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产 物，m.p.269-271℃；MS m/e 244(M-H)+。

对C17H17NO3分析：

理论值：C，63.68；H，3.29；N，5.71

实测值：C，63.53；H，3.71；N，5.38

                       实施例7

       2-(3-叔丁基-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和3-叔丁基-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的 产物，m.p.220-222℃；MS m/e 284(M+H)+。

对C17H17NO3分析：

理论值：C，72.07；H，6.05；N，4.94

实测值：C，72.03；H，6.43；N，4.72

                        实施例8

        2-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，4-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和2，5-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为褐色固体的产物， m.p.278-280℃；MS m/e 244(M+H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，64.09；H，3.14；N，5.65

                        实施例9

        3-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，2-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和2，3-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为褐色固体的产物， m.p.256-258℃；MS m/e 244(M+H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.91；H，3.98；N，5.72

                        实施例10

        4-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，2-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和3，4-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产物， m.p.282-284℃；MS m/e 242(M-H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.57；H，3.68；N，5.63

                        实施例11

          2-(3-氯-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和3-氯-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到灰白色固体的产 物，m.p.254-256℃；MS m/e 262(M+H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.57；H，3.68；N，5.63

                        实施例12

            2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和4-甲氧基苯甲酰氯制备标题化合物并得到浅黄色固体的产物， m.p.264-267℃；MS m/e 228(M+H)+。

对C13H9NO3分析：

理论值：C，68.72；H，3.99；N，6.16

实测值：C，67.87；H，4.05；N，6.23

                        实施例13

        4-(5-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，3-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，5-二甲氧基苯 胺和2，4-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产物， m.p.大于300℃；MS m/e 242(M-H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，63.92；H，3.74；N，5.56

                      实施例14

           2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和4-甲氧基苯甲酰氯制备标题化合物并得到为白色固体的产物， m.p.大于300 ℃；MS m/e 226(M-H)+。

对C13H9NO3分析：

理论值：C，68.72；H，3.99；N，6.16

实测值：C，68.09；H，4.01；N，6.05

                        实施例15

        4-(6-羟基-1，3-苯并唑-2-基)苯-1，3-二酚

以与在实施例1中描述的基本相同的方法，从2，4-二甲氧基苯 胺和2，4-二甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产物， m.p.293-296℃；MS m/e 242(M-H)+。

对C13H9NO4分析：

理论值：C，64.20；H，3.73；N，5.76

实测值：C，64.43；H，3.77；N，5.74

                        实施例16

        6-氯-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤A)N-(4-氯-2，5-二甲氧基苯基)-3-氟-4-甲氧基苯甲酰胺。

以与在实施例1的步骤a中描述的基本相同的方法，从4-氯-2，5- 二甲氧基苯胺和3-氟-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色 固体的产物，m.p.197-199℃；MS m/e 340(M+H)+。

对C16H15ClFNO4分析：

理论值：C，56.56；H，4.45；N，4.12

实测值：C，56.33；H，4.35；N，4.05

步骤b)N-(4-氯-2，5-二羟基苯基)-3-氟-4-羟基苯甲酰胺。

将三氟化硼二甲硫复合物(70mL)加入到N-(4-氯-2，5-二甲氧基苯 基)-3-氟-4-甲氧基苯甲酰胺(1.75g，5.15mmol)和CH2Cl2(35mL)的混 合物。搅拌20个小时后，在氮气流下，在防护罩中蒸发溶剂和过量 的试剂。用冰和HCl(1N)的混合物吸收残余物并用EtOAc提取。有 机层以HCl(1N)洗涤和经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(CH2Cl2/ 己烷/EtOAc 5/3/2和AcOH 10mL每1升的洗脱溶剂)纯化，得到为白 色固体的产物(1.4g，91％收率，m.p.254-256℃)；MS m/e 296(M-H)+。

对C13H9ClFNO4分析：

理论值：C，52.46；H，3.05；N，4.7 1

实测值：C，51.98；H，2.98；N，4.56

步骤c)6-氯-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例1的步骤b中描述的基本相同的方法，从N-(4-氯- 2，5-二羟基苯基)-3-氟-4-羟基苯甲酰胺和吡啶盐酸盐并得到为白色固 体的产物，m.p.258-260℃；MS m/e 278(M-H)+。

对C13H17ClFNO3分析：

理论值：C，55.83；H，2.52；N，5.01

实测值：C，55.35；H，2.59；N，4.91

                        实施例17

       6-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例16中描述的基本相同的方法，从4-溴-2，5-二甲氧 基苯胺和3-氟-4-甲氧基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的 产物，m.p.224-226℃；MS m/e 322(M-H)+。

对C13H17BrFNO3分析：

理论值：C，48.18；H，2.18；N，4.32

实测值：C，48.69；H，2.36；N，4.59

                        实施例18

         6-氯-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例16中描述的基本相同的方法，从4-氯-2，5-二甲氧 基苯胺和4-甲氧基苯甲酰氯制备标题化合物并得到灰白色固体的产 物，m.p.260-262 ℃；MS m/e 260(M-H)+。

对C13H8ClNO3分析：

理论值：C，59.67；H，3.08；N，5.35

实测值：C，59.09；H，3.06；N，5.11

                       实施例19

         5-氯-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-6-醇

以与在实施例16中描述的基本相同的方法，从5-氯-2，4-二甲氧 基苯胺和4-甲氧基苯甲酰氯制备标题化合物并得到灰白色固体的产 物，m.p.254-256℃；MS m/e 262(M+H)+。

对C13H8ClNO3分析：

理论值：C，59.67；H，3.08；N，5.35

实测值：C，59.40；H，2.97；N，5.22

                       实施例20

        7-溴-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2-溴-4-甲氧基-6-硝基苯酚。

将乙酸(20mL)中的溴(16.0g，100mmol)加入到4-甲氧基-2-硝基 苯酚(16.9g，100mmol)、乙酸钠(16.4g，200mmol)和乙酸(100mL)的 混合物中。于室温下把反应混合物搅拌30分钟，然后于70℃下搅 拌2个小时，倾到入含浓缩硫酸(10mL)的水(1.51)中。过滤沉淀的 固体和从氯仿/己烷中结晶，得到棕色的固体，m.p.116-118℃；MS m/e 246(M-H)+。

对C7H6BrNO4分析：

理论值：C，33.90；H，2.44；N，5.65

实测值：C，34.64；H，2.16；N，5.43

步骤b)2-氨基-6-溴-4-甲氧基苯酚。

将阮内镍(2.5g)加入到2-溴-4-甲氧基-6-硝基苯酚(8.8g，35.5 mmol)的EtOAc(100mL)溶液中。在帕尔装置中，于25磅/平方英寸 的氢气压下，把混合物振摇2.5个小时。通过硅藻土(Celite)过滤反 应混合物并真空浓缩，得到灰色固体(7.4g，96％收率；95-97℃)；MS m/e 218(M+H)+。

对C7H8BrNO2分析：

理论值：C，38.56；H，3.70；N，6.42

实测值：C，38.32；H，3.77；N，6.24

步骤c)2-溴-4-甲氧基-6-[(4-甲氧基苯甲酰基)氨基]苯基-4-甲氧基苯甲 酸酯

将无水吡啶(37.0mL，468.5mmol)逐滴加入到2-氨基-6-溴-4-甲氧 基苯酚(20.0g，91.7mmol)、4-甲氧基苯甲酰氯(38.9g，229.0mmol)和 CH2Cl2(250mL)的冷的(0℃)混合物(机械搅拌的)中。在加入吡啶期 间形成沉淀。把反应混合物搅拌30分钟，然后加入乙醚(250mL)。 滤出沉淀的固体并用乙醚洗涤。用水吸收固体并搅拌20分钟。然后 滤出固体并干燥，得到灰白色固体(42.5g，95％收率，m.p.73-75℃)； MS m/e 484(M-H)+。

对C23H20BrNO6分析：

理论值：C，56.80；H，4.15；N，2.88

实测值：C，56.50；H，3.78；N，2.83

步骤d)7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑。

途径a)

伴随连续除去水(迪安-斯达克榻分水器)，将2-溴-4-甲氧基-6-[(4- 甲氧基苯甲酰基)氨基]苯基4-甲氧基苯甲酸酯(42.0g，86.4mmol)、 对-甲苯磺酸单水合物(32.8g，172.8mmol)和无水对-二甲苯(800mL) 的悬浮液回流1个小时。在回流温度下，最初的悬浮液变为棕色溶 液。把反应混合物冷却至室温并用NaOH(2N)洗涤。经MgSO4干燥 有机层。蒸发并从丙酮/乙醚中结晶，得到灰白色固体(23.5g，82％收 率，m.p.139-141℃)；MS m/e 334(M+H)+。

对C15H12BrNO3分析：

理论值：C，53.91；H，3.62；N，4.19

实测值：C，53.83；H，3.37；N，4.01

途径b)

使用迪安-斯达克榻分水器，将2-氨基-6-溴-甲氧基苯酚(100mg， 0.46mmol)、4-甲氧基-苯甲酸(77mg，0.5mmol)和硼酸(31mg，0.5 mmol)在对-二甲苯(9mL)中的混合物回流24个小时。把反应混合物 冷却至室温并真空浓缩。经快速层析法(30％EtOAc/石油醚)纯化残余 物，得到浅桃红色固体(99mg，65％收率，m.p.136-138℃)；MS m/e 334 (M+H)+。

对C15H12BrNO3分析：

理论值：C，53.91；H，3.62；N，4.19

实测值：C，53.78；H，3.55；N，4.01.

步骤e)7-溴-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇。

途径a)

将三溴化硼(1M，89.9mL，89.8mmol)逐滴加入到7-溴-5-甲氧基- 2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(10.0g，29.94mmol)和CH2Cl2(50mL) 的冷的(-70℃)悬浮液在中。使反应混合物温热至室温。在温热期间， 悬浮液变为深色溶液。于室温下，把反应混合物搅拌2天，然后缓 慢倾到入冷的(0℃)乙醚(1000mL)中。于20分钟内，将甲醇(200mL) 缓慢加入到新的反应混合物。然后把反应混合物倾到入水(1.51)中。 用水把有机层洗涤三次，经MgSO4干燥。蒸发并从丙酮/乙醚/己烷中 结晶，得到灰白色固体(8.4g，92％收率，m.p.298-299℃)；MS m/e 306 (M+H)+。

对C13H8BrNO3分析：

理论值：C，51.01；H，2.63；N，4.58

实测值：C，50.96；H，2.30；N；4.42

途径b)

将三溴化硼(0.25mL，2.7mmol)逐滴加入到7-溴-5-甲氧基-2-(4- 甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(130mg，0.39mmol)和二氯甲烷(1.5mL)的 冷的(-78℃)混合物中。使反应混合物逐渐恢复到室温并搅拌1个小 时。将反应混合物倾到入冰中并用EtOAc提取。用盐水洗涤有机提 取液并经MgSO4干燥。蒸发和经快速层析法(30％-40％EtOAc/石油 醚)，得到为浅桃红色固体的产物(102mg，86％收率)，m.p.295-298 ℃；MS m/e 304(M-H)+。

对C13H8BrNO3分析：

理论值：C，51.01；H，2.63；N，4.58

实测值：C，51.06；H，2.77；N，4.36.

                            实施例21

           7-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2-溴-6-[(3-氟-4-甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-甲氧基苯基3-氟-4- 甲氧基苯甲酸酯。

将3-氟-4-甲氧基苯甲酸(39.0g，229mmol)、亚硫酰氯(100mL)和 N，N-二甲基甲酰胺(0.5mL)的混合物回流1个小时。真空除去挥发物。 用苯吸收固体(两次)和真空除去挥发物。把残余物溶于CH2Cl2(100mL) 中并加入到2-氨基-6-溴-4-甲氧基苯酚(20.0g，91.7mmol)和CH2Cl2 (150mL)的冷的(0℃)混合物中(机械搅拌的)。将无水吡啶(37.0mL， 468.5mmol)逐滴加入到新的反应混合物。在加入吡啶期间形成沉淀。 把反应混合物搅拌30分钟，然后加入乙醚(250mL)。滤出沉淀的固 体并用乙醚洗涤。用水吸收固体并搅拌20分钟。然后滤出固体并干 燥，得到灰白色固体(46.5g，97％收率，m.p.184-186℃)；MS m/e 520 (M-H)+。

对C23H18BrF2NO6分析：

理论值：C，52.89；H，3.47；N，2.68

实测值：C，52.79；H，3.23；N，2.63

步骤b)7-溴-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-甲氧基-1，3-苯并唑。

伴随连续除去水(迪安-斯达克榻分水器)，将2-溴-6-[(3-氟-4-甲 氧基苯甲酰基)氨基]-4-甲氧基苯基3-氟-4-甲氧基苯甲酸酯(46.0g， 88.1mmol)、对-甲苯磺酸单水合物(33.5g，177.2mmol)和无水对-二甲 苯(11)的悬浮液回流3个小时。在回流温度下，最初的悬浮液变为棕 色溶液。滤出固体并用乙醚洗涤。把固体悬浮于乙醚(200mL)中，搅 拌10分钟，滤出并干燥，得到褐色固体(25.1g，m.p.175-177℃)。将 乙醚层浓缩至20mL，得到2.5g另外的产物(90％总收率)。MS m/e 352 (M+H)+。

对C15H11BrFNO3分析：

理论值：C，51.16；H，3.15；N，3.98

实测值：C，51.10；H，2.92；N，3.89

步骤c)7-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例20的步骤e中描述的基本相同的方法，制备标题 化合物并得到为白色固体的产物，m.p.265-267℃；MS m/e 332(M- H)+。

对C13H7BrFNO3分析：

理论值：C，48.18；H，2.18；N，4.32

实测值：C，48.19；H，2.29；N，4.19

                         实施例22

        7-溴-2-(2-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2-氟-4-甲氧基苯甲酸。

向Ag2O(13.5g，58.4mmol)、NaOH(19.5g，487mmol)和水(200 mL)的温热(55℃)的混合物中加入2-氟-4-甲氧基苯甲醛(15g，97.4 mmol)。把反应混合物搅拌1个小时，滤出并用热水(10mL)洗涤沉 淀的固体。伴随剧烈搅拌下，把滤液缓慢加入到冷的(0℃)HCl(5N) 中。过滤沉淀的固体，用水洗涤并干燥，得到白色固体(13.6g，82％ 得率，m.p.194-196℃)；MS m/e 169(M-H)+。

对C8H7FO3分析：

理论值：C，56.48；H，4.15

实测值：C，56.12；H，4.12

步骤b)7-溴-2-(2-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例21中描述的基本相同的方法，自2-氟-4-甲氧基苯 甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产物，m.p.248-250℃；MS m/e 324(M+H)+。

对C13H7BrFNO3分析：

理论值：C，48.18；H，2.18；N，4.32

实测值：C，47.89；H，1.95；N，4.18

                          实施例23

      7-溴-2-(2，3-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2，3-二氟-4-甲氧基苯甲酸甲基酯

将碘甲烷(10.7mL，172.5mmol)加入到2，3-二氟-4-羟基苯甲酸 (10.0g，57.5mmol)、碳酸锂(12.7g，172.5mmol)和N，N-二甲基甲酰胺 (100mL)的混合物中。把反应混合物于40℃下搅拌12h，然后倾到 入水并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干燥。蒸发并经快速层 析法(己烷/EtOAc 5/1)纯化，得到为白色固体的产物(10.2g，88％收 率，m.p.66-68℃)；MS m/e 203(M+H)+。

对C9H8F2O3分析：

理论值：C，53.47；H，3.99

实测值：C，53.15；H，3.83

步骤b)2，3-二氟-4-甲氧基苯甲酸。

将氢氧化钠(2N，50mL)加入到2，3-二氟-4-甲氧基苯甲酸甲酯 (10.0g，49.5mmol)、THF(100mL)和MeOH(100mL)的混合物中。 把反应混合物于室温下搅拌6个小时，并用HCl(2N)酸化。滤出沉 淀的固体，用水洗涤和干燥，得到白色固体(8.9g，96％收率，m.p. 194-196℃)；MS m/e 187(M-H)+。

对C8H6F2O3分析：

理论值：C，51.08；H，3.21

实测值：C，50.83；H，2.92

步骤c)7-溴-2-(2，3-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例21中描述的基本相同的方法，自2，3-二氟-4-甲氧 基苯甲酸制备标题化合物并得到为白色固体的产物，m.p.258-260 ℃；MS m/e 342(M+H)+。

对C13H6BrF2NO3分析：

理论值：C，45.64；H，1.77；N，4.09

实测值：C，45.33；H，1.62；N，4.02

                           实施例24

        2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

途径a)

步骤a)7-溴-5-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基) 甲硅烷基]氧基}-3-氟苯基)-1，3-苯并唑。

将叔丁基(氯代)二甲基硅烷(23.2g，154mmol)分批加入到7-溴-2- (3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(16.6g，51.4mmol)、咪唑(17.5g， 257mmol)，N，N-二甲基吡啶-4-胺(1.0g，8.1mmol)和DMF(300mL)的 混合物中。把反应混合物搅拌3个小时，倾到入水并用乙醚提取。 有机提取液经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 50/1) 纯化，得到白色固体(27.5g，97％收率，m.p.98-99℃)；MS m/e 552 (M+H)+。

对C25H35BrFNO3Si2分析：

理论值：C，54.34；H，6.38；N，2.53

实测值：C，54.06；H，6.52；N，2.24

步骤b)5-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基)甲 硅烷基]氧基}-3-氟苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑。

二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯(II)(0.63g，0.79mmol)加入到7-溴-5- {[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧 基}-3-氟苯基)-1，3-苯并唑(14.7g，26.6mmol)、三丁基(乙烯基)锡 (10.5g，33.25mmol)和对-二甲苯(85mL)的混合物中。把反应混合物 于90℃下搅拌24个小时，冷却至室温，用乙醚(100mL)稀释并用 活性炭处理。将反应混合物通过MgSO4过滤并浓缩。经快速层析法(己 烷/EtOAc 50/1)纯化，得到白色固体(11.8g，89％收率，m.p.93-95℃)； MS m/e 500(M+H)+。

对C27H38FNO3Si2分析：

理论值：C，64.89；H，7.66；N，2.80

实测值：C，64.59；H，7.70；N，2.73

步骤c)2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇。

将氢氟酸(48wt.％in水，1mL)加入到5-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷 基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-3-氟苯基)-7-乙烯基- 1，3-苯并唑(1.5g，3.0mmol)、THF(6mL)和乙腈(3mL)的溶液中。 把反应混合物于65℃下搅拌8个小时，然后倾到入水中。滤出沉淀 的固体并干燥。从丙酮/乙醚结晶该产物，得到白色固体(0.72g，81％ 收率，m.p.249-251℃)；MS m/e 272(M+H)+。

对C15H10FNO3分析：

理论值：C，66.42；H，3.72；N，5.16

实测值：C，66.31；H，3.85；N，4.96

途径b)

2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇。

将二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯(II)(0.87g，1.1mmol)加入到7-溴-2- (3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(7.16g，22.1mmol)、三丁基(乙烯 基)锡(10.5g，33.25mmol)和乙二醇二乙醚(65mL)的混合物中。把反 应混合物于115℃下搅拌48个小时，冷却至室温并用活性炭处理。 通过MgSO4过滤反应混合物并浓缩。经酸性硅胶上的快速层析法(己 烷/EtOAc/CH2Cl2 1/1/1)纯化，得到白色固体(4.35g，72％收率，m.p. 250-252℃)；MS m/e 272(M+H)+。

对C15H10FNO3分析：

理论值：C，66.42；H，3.72；N，5.16

实测值：C，66.03；H，3.68；N，5.09

途径c)

步骤a)4-[5-(乙酰氧基)-7-溴-1，3-苯并唑-2-基]-2-氟苯基乙酸酯。

将乙酸酐(1.0mL，9.95mmol)加入到7-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)- 1，3-苯并唑-5-醇(1.24g，3.8mmol)、N，N-二甲基吡啶-4-胺(1.1g，9.18 mmol)和1，4-二氧六环(13mL)的冷的(0℃)溶液中。使反应混合物温 热至室温并搅拌20个小时。向反应混合物中加入水(50mL)，用EtOAc 提取和经MgSO4干燥。蒸发并从EtOAc/己烷中结晶，得到灰白色固 体(0.87g，56％收率)；MS m/e 408(M+H)+。

对C17H11BrFNO5分析：

理论值：C，50.02；H，2.72；N，3.43

实测值：C，49.58；H，2.59；N，3.37

步骤b)2-[4-(乙酰氧基)-3-氟苯基]-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-基乙酸 酯。

二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯(II)(46mg，0.06mmol)加入到4-[5-(乙 酰氧基)-7-溴-1，3-苯并唑-2-基]-2-氟苯基乙酸酯(0.8g，1.98mmol)、 三丁基(乙烯基)锡(0.9g，2.8mmol)和对-二甲苯(9mL)的混合物中。把 反应混合物于130℃下搅拌5个小时，冷却至室温，用乙醚(10mL) 稀释并用活性炭处理。通过MgSO4过滤反应混合物并浓缩。经快速 层析法(己烷/EtOAc 5/1)纯化，得到白色固体(0.4g，56％收率，m.p. 154-156℃)；MS m/e 356(M+H)+。

对C19H14FNO5分析：

理论值：C，64.23；H，3.97；N，3.94

实测值：C，63.94；H，3.78；N，3.76

步骤c)2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇。

将碳酸钾(55mg)加入到2-[4-(乙酰氧基)-3-氟苯基]-7-乙烯基-1，3- 苯并唑-5-基乙酸酯(0.14g，0.39mmol)和1，4-二氧六环(3mL)的溶液 中。把反应混合物于90℃下搅拌1个小时，倾到入水，用HCl(2N) 酸化并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干燥。蒸发并从EtOAc/ 己烷中结晶，得到白色固体(0.06g，46％收率，m.p.250-252℃)；MS m/e 272(M+H)+。

对C15H10FNO3分析：

理论值：C，66.42；H，3.72；N，5.16

实测值：C，66.32；H，3.47；N，5.18

                       实施例25

    2-(2-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例24途径a)中描述的基本相同的方法，从7-溴-2-(2- 氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇制备标题化合物，得到为白色固体 的产物，m.p.274-275℃；MS m/e 272(M+H)+。

对C15H10FNO3分析：

理论值：C，66.42；H，3.72；N，5.16

实测值：C，66.18；H，3.47；N，4.97

                         实施例26

    2-(2，3-二氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例24途径b)中描述的基本相同的方法，从7-溴-2-(2，3- 二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇制备标题化合物，得到为灰白色 固体的产物，m.p.276-278℃；MS m/e 290(M+H)+。

对C15H9F2NO3分析：

理论值：C，62.29；H，3.14；N，4.84

实测值：C，61.90；H，3.05；N，4.52

                      实施例27

       2-(4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例24途径b)中描述的基本相同的方法，从7-溴-2-(4- 羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇制备标题化合物，得到为白色固体的产 物，m.p.249-250℃；MS m/e 254(M+H)+。

对C15H11NO3分析：

理论值：C，70.99；H，4.39；N，5.52

实测值：C，70.75；H，4.34；N，5.46

                     实施例28和29

4-溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇(EX.28)和4，6- 二溴-2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇(EX.29)。

将N-溴代琥珀酰亚胺(0.49g，2.77mmol)加入到2-(3-氟-4-羟基苯 基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇(0.75g，2.77mmol)和乙腈(30mL)的混 合物中。把反应混合物于室温下搅拌16个小时，倾到入水并用EtOAc 提取。有经MgSO4干燥机提取液。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc /CH2Cl2 2/1/1)纯化，得到为白色固体的Ex.28(0.45g，m.p.226-228 ℃)；MS m/e 349(M+H)+。

对C15H9BrNO3分析：

理论值：C，51.45；H，2.59；N，4.00

实测值：C，51.08；H，2.40；N，3.90；

和为白色固体的Ex.29(0.18g，m.p.272-274℃)；MS m/e 428 (M+H)+。

对C15H8Br2NO3分析：

理论值：C，41.99；H，1.88；N，3.26

实测值：C，42.25；H，1.90；N，3.14

                        实施例30

    7-(1，2-二溴乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑。

以与在实施例24途径b)中描述的基本相同的方法，从7-溴-5- 甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑制备标题化合物并得到为白色 固体的产物，MS m/e 282(M+H)+。

对C17H15NO3分析：

理论值：C，72.58；H，5.37；N，4.98

实测值：C，72.33；H，5.26；N，4.72

步骤b)7-(1，2-二溴乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇。

将三溴化硼(0.85mL，8.95mmol)逐滴加入到5-甲氧基-2-(4-甲氧 基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑(0.31g，1.12mmol)和CH2Cl2(4mL)的 冷的(-78℃)混合物中。使反应混合物温热至室温。于室温下搅拌18 个小时后，把反应混合物缓慢倾到入冷的(0℃)乙醚(20mL)中。然 后将甲醇(10mL)缓慢加入到反应混合物中。新的反应混合物以水洗 涤(三次)并经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 3/1)纯 化，得到浅黄色固体(0.27g，59％收率，m.p.175-177℃)；MS m/e 412 (M+H)+。

对C15H11Br2NO3分析：

理论值：C，43.62；H，2.68；N，3.39

实测值：C，43.85；H，2.44；N，3.33

                       实施例31

    7-(1-溴代乙烯基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

将1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.25g，1.65mmol)加入到7- (1，2-二溴乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(0.4g，0.96mmol)和 乙腈(4mL)的溶液中。把反应混合物搅拌24个小时，倾到入冷的(0℃) HCl(1N，10mL)中并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干燥。蒸 发并经快速层析法(CH2Cl2/己烷/异丙醇15/5/1)纯化，得到白色固体 (185mg，58％收率，m.p.228-230℃)；MS m/e 332(M+H)+。

对C15H10BrNO3分析：

理论值：C，54.24；H，3.03；N，4.22

实测值：C，54.27；H，2.94；N，4.20

                      实施例32

7-(1-溴代乙烯基)-2-(2-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例29-30中描述的基本相同的方法，从7-溴-2-(2-氟- 4-甲氧基苯基)-5-甲氧基-1，3-苯并唑制备标题化合物并得到灰白色 固体的产物，m.p.235-237℃；MS m/e 350(M+H)+。

对C15H9BrFNO3分析：

理论值：C，51.45；H，2.59；N，4.00

实测值：C，51.63；H，2.38；N，3.98

                      实施例33

7-(1-溴代乙烯基)-2-(2，3-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例29-30中描述的基本相同的方法，从7-溴-2-(2，3- 二氟-4-甲氧基苯基)-5-甲氧基-1，3-苯并唑制备标题化合物并得到灰 白色固体的产物，m.p.240-242℃；MS m/e 366(M-H)+。

对C15H8BrF2NO3分析：

理论值：C，48.94；H，2.19；N，3.80

实测值：C，49.63；H，2.33；N，3.61

                       实施例34

    7-烯丙基-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例24的途径c、步骤b中描述的基本相同的方法， 从7-溴-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-甲氧基-1，3-苯并唑、烯丙基三丁基 锡和二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯，随后按照实施例20的步骤e脱甲基 化，制备标题化合物。得到浅桃红色固体的要求的产物，m.p.169-171 ℃；MS m/e 284(M-H)+。

对C16H12FNO3分析：

理论值：C，67.37；H，4.24；N，4.91

实测值：C，67.37；H，4.16；N，4.66

                       实施例35

       7-乙炔基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

将四重(三苯基膦)钯(0)(52mg，0.045mmol)加入到7-溴-5-甲氧 基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(0.3g，0.9mmol)、碘化铜(I)(17.1mg， 0.09mmol)、乙炔基(三甲基)硅烷(0.2g mg，2mmol)和三乙胺(12mL) 的混合物中。把反应混合物于110℃下搅拌4个小时，倾到入氯化 铵水溶液中并用EtOAc/THF(1/1)提取。有机提取液经MgSO4干燥。 蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 6/1)纯化，得到灰白色固体(0.27g， 85％收率)。将该产物溶于CH2Cl2(2mL)中，冷却至-78℃并逐滴加 入三溴化硼(0.6mL)。使反应混合物温热至室温。于室温下搅拌18 个小时后，将混合物缓慢倾到入冷的(0℃)乙醚(10mL)中。然后将 甲醇(3mL)缓慢加入到反应混合物中。新的反应混合物以水洗涤(三 次)并经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 3/1)纯化， 得到黄色固体(86mg，38％收率，m.p.229-231℃)；MS m/e 252 (M+H)+。

对C15H9NO3分析：

理论值：C，71.71；H，3.61；N，5.58

实测值：C，71.39；H，3.49；N，5.32

                        实施例36

         2-(4-羟基苯基)-7-丙基-1，3-苯并唑-5-醇

将四重(三苯基膦)钯(0)(70mg，0.06mmol)加入到7-溴-5-甲氧基- 2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(0.4g，1.2mmol)、溴(丙基)锌(0.5M在 THF中，3.6mL，1.8mmol)和THF(4mL)。把反应混合物于室温下搅 拌48个小时，倾到入HCl(1N)中并用EtOAc提取。有机提取液经 MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/EtOAc 6/1)纯化，得到灰白 色固体(0.14g)。将该产物溶于CH2Cl2(2mL)，冷却至-78℃并逐滴 加入三溴化硼(0.35mL)。使反应混合物温热至室温。于室温下搅拌18 个小时后，将反应混合物缓慢倾到入冷的(0℃)乙醚(10mL)中。然后 将甲醇(3mL)缓慢加入到反应混合物中。新的反应混合物以水反应混 合物以水洗涤(三次)和经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/ EtOAc 4/1)纯化，得到白色固体(90mg，27％收率，m.p.110-112℃)； MS m/e 270(M+H)+。

对C16H15NO3分析：

理论值：C，71.36；H，5.61；N，5.20

实测值：C，71.02；H，5.58；N，4.94

                      实施例37

       7-丁基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

                      实施例38

       7-环戊基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例35中描述的基本相同的方法，自7-溴-5-甲氧基- 2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑和溴(环戊基)锌制备标题化合物。得到 为白色固体的要求的产物，m.p.220-222℃；MS m/e 296(M+H)+。

对C18H17NO3分析：

理论值：C，73.20；H，5.80；N，4.74

实测值：C，73.05；H，5.74；N，4.59

                        实施例39

      5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-羧酸乙酯

步骤a)7-溴-5-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基) 甲硅烷基]氧基}苯基)-1，3-苯并唑。

以与在实施例24的途径a步骤a中描述的基本相同的方法，自 7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑和叔丁基(氯代)二甲基 硅烷制备标题化合物。得到为白色固体的要求的产物，m.p.90-91℃； MS m/e 534(M+H)+。

对C25H36BrNO3Si2分析：

理论值：C，56.16；H，6.79；N，2.62

实测值：C，55.66；H，6.86；N，2.68

步骤b)5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-羧酸乙酯。

将正丁基锂(2.5M，0.3mL，0.75mmol)逐滴加入到7-溴-5-{[叔丁 基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}苯 基)-1，3-苯并唑(0.4g，0.75mmol)和THF(4mL)的冷的(0℃)溶液 中。使反应混合物温热至40℃，然后搅拌2个小时。将THF(1ML) 中的[(氰基羰基)氧基]乙烷(84mg)加入到反应混合物中，使反应混合 物温热至0℃并搅拌1个小时。用氯化铵水溶液猝灭该反应，用EtOAc 提取并经MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(己烷/CH2Cl2/异丙醇 18/2/1)纯化，得到无色油(340mg)。将该产物溶于THF(3.5mL)中并 用四丁基氟化铵(1M在THF中，1.4mL)处理。把反应混合物搅拌30 分钟，倾到入HCl(1N)并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干燥。 蒸发并经快速层析法(己烷/CH2Cl2/异丙醇5/2/1)纯化，得到白色固体 (119mg，53％收率，m.p.305-307℃)；MS m/e 300(M+H)+。

对C16H13NO5分析：

理论值：C，64.21；H，4.38；N，4.68

实测值：C，64.04；H，4.43；N，4.40

                      实施例40

       2-(4-羟基苯基)-7-苯基-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-苯基-1，3-苯并唑

使7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(200mg，0.60 mmol)和四重(三苯基膦)钯(0)(63mg，0.03mmol)溶于甲苯(5mL)中并 在氮气氛下，于室温搅拌10分钟。加入苯硼酸(110mg，0.90mmol)， 随后加入碳酸钠水溶液(2M，1.5mL)和乙醇(2mL)。使反应混合物回 流12个小时，用水稀释并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干 燥。蒸发并经快速层析法(20％-40％EtOAc/石油醚)纯化，得到为浅 桃红色固体的标题化合物，mp 92℃；MS m/e 332(M+H)+。

对C21H17NO3分析：

理论值：C，76.12；H，5.17；N，4.23

实测值：C，75.86；H，5.08；N，4.07

步骤b)2-(4-羟基苯基)-7-苯基-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例20的步骤e(途径b)中的方法，制备标题化合物， 得到为紫色固体的产物，m.p.255-258℃；MS m/e 302(M-H)+。

对C19H13NO3x0.25H2O分析：

理论值：C，74.14；H，4.42；N，4.55

实测值：C，73.81；H，4.40；N，4.35

                        实施例41

        5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-腈

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-腈。

在干燥氮气下，将7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑 (200mg，0.60mmol)在无水N，N二甲基甲酰胺(1.5mL)中的溶液与氰 化铜(I)(80mg，0.90mmol)搅拌并加热回流4个小时。使反应混合物 冷却并倾到入过量的乙二胺四乙酸水溶液中。分离粗品产物，从30％ EtOAc/石油醚中得到为褐色针晶的腈(164mg，98％收率)；m.p.180- 183℃；MS m/e 281(M+H)+。

对C16H12N2O3x0.2H2O分析：

理论值：C，66.84；H，4.48；N，9.74

实测值：C，66.63；H，4.33；N，9.60

步骤b)5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-腈

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法制备标题化合物，得到 为浅桃红色固体的产物，mp 297-303℃；MS m/e 253(M+H)+。

对C14H8N2O3x0.5H2O分析：

理论值：C，64.37；H，3.47；N，10.72

实测值：C，64.44；H，3.49；N，9.92

                       实施例42

      5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲酰胺

从实施例40步骤b的反应物分离为作为浅褐色固体的小量产物 的标题化合物，m.p.325℃；MS m/e 271(M+H)+。

对C14H10N2O4x0.5H2O分析：

理论值：C，60.22；H，3.97；N，10.03

实测值：C，59.71；H，3.91；N，9.84

                       实施例43

        2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-1，3-苯并唑-5-醇

将7-溴-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(100mg，0.33mmol)和 溴化铜(I)(56mg，0.39mmol)在无水N，N二甲基甲酰胺(1.5mL)中的 混合物与新鲜制备甲醇钠(15wt％在甲醇中，1ml)搅拌并加热至120 ℃4个小时。使反应混合物冷却并用HCl(1N，5ml)稀释。用乙酸乙 酯分离粗品产物，随后经快速层析法(40％-50％EtOAc/石油醚)，得 到为灰白色固体的标题化合物(50mg，60％收率，mp 225-228℃)； MS m/e 258(M+H)+。

对C14H11NO4x0.75H2O分析：

理论值：C，62.11；H，4.65；N，5.17

实测值：C，62.53；H，4.73；N，5.02。

                      实施例44

        7-乙基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)7-乙基-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑。

将正丁基锂(2.5N，0.43mL，1.08mmol)逐滴加入到7-溴-5-甲氧 基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(300mg，0.90mmol)和THF(2mL) 的到冷的(-78℃)混合物中。使反应混合物搅拌0.5个小时。将碘乙 烷(0.14mL，1.8mmol)逐滴加入到反应混合物中。使反应混合物温热 至室温并搅拌2个小时。用氯化铵水溶液猝灭该反应，将其倾到入 水并用EtOAc提取。有机提取液用盐水洗涤并经MgSO4干燥。蒸发 并经快速层析法(20％EtOAc/石油醚)，得到浅棕色固体样产物(231mg， 91％收率)：m.p.85℃；MS m/e 284(M+H)+。

对C17H17NO3x0.2H2O分析：

理论值：C，70.28；H，6.17；N，4.94。

实测值：C，70.12；H，5.74；N，4.82。

步骤b)7-乙基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法制备标题化合物，得到 为浅棕色固体的产物(98％收率)，m.p.110-115℃；MS m/e 256 (M+H)+。

                        实施例45

      7-乙基-2-(2-乙基-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)7-乙基-5-甲氧基-2-(2-乙基-4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑

按照实施例43的步骤a的方法，使用两个当量的正丁基锂制备 标题化合物，并且将粗品产物直接用于下一步骤。

步骤b)7-乙基-2-(2-乙基-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法，从7-乙基-5-甲氧基-2-(2- 乙基-4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为灰色固体 的产物(87％收率)；MS m/e 284(M+H)+。

                        实施例46

        5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛。

按照实施例43步骤a的方法，使用N-甲基甲酰苯胺作为亲电试 剂制备标题化合物，得到浅橙色固体(94％，m.p.153-155℃)；MS m/e 284(M+H)+。

对C16H13NO4分析：

理论值：C，67.84；H，4.63；N，4.94

实测值：C，67.58；H，4.53；N，4.75

步骤b)5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法，从5-甲氧基-2-(4-甲氧 基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛制备标题化合物，得到为深黄色固体的 产物(99％收率，m.p.273-275℃)；MS m/e 256(M+H)+。

对C14H9NO4x0.25H2O分析：

理论值：C，64.74；H，3.69；N，5.39

实测值：C，64.32；H，3.59；N，5.18。

                          实施例47

        7-(羟基甲基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)5-甲氧基-7-(羟基甲基)-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑

于0℃下，将硼氢化钠(66.8mg，1.76mmol)加入到5-甲氧基-2-(4- 甲氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-甲醛(250mg，0.88mmol)的无水MeOH(8 mL)溶液中。把反应混合物搅拌30分钟，然后真空蒸发。将残余物 溶于二乙醚并用水和盐水洗涤，经MgSO4干燥并过滤。蒸发和经快 速层析法(50％EtOAc/石油醚)，得到产物(210mg，83％)，其直接用于 下一反应。

步骤b)7-(羟基甲基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇。

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法，从5-甲氧基-7-(羟基甲 基)-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为浅棕色固 体的产物，m.p.282℃(分解)；MS m/e 258(M+H)+。

对C14H11NO4x0.5H2O分析：

理论值：C，63.16；H，4.54；N，5.26

实测值：C，63.33；H，4.36；N，5.04

                       实施例48

      7-(溴甲基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法，从5-甲氧基-7-(羟基甲 基)-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑，同时在三溴化硼的存在下延长搅 拌，制备标题化合物，得到为浅棕色固体的产物，m.p.250-260℃(分 解)；MS m/e 321(M+H)+。

对C14H10BrNO3分析：

理论值：C，52.52；H，3.15；N，4.38

实测值：C，52.26；H，3.17；N，4.07

                       实施例49

      [5-羟基-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-7-基]乙腈

向7-(溴甲基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(122mg，0.40 mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)溶液中加入18-冠-6-醚(202mg， 0.80mmol)和氰化钾(131mg，2mmol)。使反应混合物搅拌2个小时， 然后将其倾到入水并用EtOAc提取。有机提取液用盐水洗涤并经 MgSO4干燥。蒸发和经快速层析法(50％-60％EtOAc/石油醚)，得到 灰色固体样产物(80mg，75％收率)，m.p.170-180℃；MS m/e 265 (M-H)+。

对C15H10N2O3x1.5H2O分析：

理论值：C，61.43；H，4.47；N，9.55

实测值：C，61.41；H，4.21；N，9.19

                      实施例50

  7-(1-羟基-1-甲基乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇]

步骤a)2-[5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-基]丙烷-2-醇

按照实施例43的步骤a的方法，从7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基 苯基)-1，3-苯并唑，使用丙酮作为亲电试剂制备标题化合物，得到 白色固体(78％收率，m.p.149℃)；MS m/e 314(M+H)+。

对C18H19NO4分析：

理论值：C，68.99；H，6.11；N，4.47。

实测值：C，68.78；H，6.13；N，4.35。

步骤b)7-(1-羟基-1-甲基乙基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇]

按照实施例20的步骤e(途径b)的方法，从2-[5-甲氧基-2-(4-甲 氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-基]丙烷-2-醇制备标题化合物，得到为深棕 色固体的产物(90％收率，m.p.180-185℃)；MS m/e 286(M+H)+。

对C16H15NO4x0.5H2O分析：

理论值：C，65.30；H，5.48；N，4.76

实测值：C，65.03；H，5.20；N，4.72

                          实施例51

      2-(4-羟基苯基)-7-异丙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

使吡啶盐酸盐(400mg)加热至190℃。向该融化物中加入2-[5- 甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑-7-基]丙烷-2-醇(114mg，0.36 mmol)且搅拌反应物2个小时。把反应混合物冷却至室温，溶于水并 用EtOAc提取。合并有机层并用HCl(1N)、水然后用盐水洗涤，经 MgSO4干燥。蒸发并经快速层析法(50％-60％EtOAc/石油醚)纯化， 得到浅红棕色固体样产物(40mg，41％收率)，m.p.225-228℃；MS m/e 268(M+H)+。

对C16H13NO3x0.5H2O分析：

理论值：C，69.56；H，5.11；N，5.06

实测值：C，69.46；H，5.22；N，4.56

                       实施例52

       2-(4-羟基苯基)-7-异丙基-1，3-苯并唑-5-醇]

使2-(4-羟基苯基)-7-异丙烯基-1，3-苯并唑-5-醇(64mg，0.24 mmol)溶于EtOAc(5mL)和无水乙醇(5mL)的混合物中并在含有氩 气的惰性气氛下放置。向该溶液中加入10％Pd-C(25mg)。将溶液在 帕尔装置中于25磅/平方英寸下氢化3个小时。使该溶液通过硅藻土 Celite过滤和用乙醇冲洗。浓缩滤液且残余物经快速层析法(50％ EtOAc/石油醚)纯化，得到为褐色固体的产物(58mg，90％收率)，m.p. 200℃；MS m/e 270(M+H)+。

                       实施例53

    7-溴-2-(4-羟基-3-(三氟甲基)苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2-溴-4-甲氧基-6-{[4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯甲酰基]氨基}苯基 4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯甲酸酯。

以与在实施例20步骤c中描述的基本相同的方法，从2-氨基-6- 溴-4-甲氧基苯酚和4-甲氧基-3-三氟甲基苯甲酰氯制备标题化合物， 得到为灰白色固体的产物，m.p.205-208℃；MS m/e 622(M+H)+。

对C25H18BrF6NO6分析：

理论值：C，48.25；H，2.92；N，2.25

实测值：C，48.47；H，2.76；N，2.16

步骤b)7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯基]-1，3-苯并唑

以与在实施例20的步骤d(途径a)中描述的基本相同的方法， 从2-溴-4-甲氧基-6-{[4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯甲酰基]氨基}苯基4- 甲氧基-3-(三氟甲基)苯甲酸酯和对-甲苯磺酸单水合物制备标题化合 物，得到为灰白色固体的产物，m.p.183-185℃；MS m/e 402(M+H)+。

对C16H11BrF3NO3分析：

理论值：C，47.79；H，2.76；N，3.48

实测值：C，47.60；H，2.50；N，3.37

步骤c)7-溴-2-(4-羟基-3-(三氟甲基)苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例20的步骤e(途径b)中描述的基本相同的方法， 从7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯基]-1，3-苯并唑制备标 题化合物，得到为浅黄色固体的产物(50％收率，m.p.200-210℃)； MS m/e 372(M-H)+。

对C14H7BrF3NO3x0.5H2O分析：

理论值：C，43.89；H，2.10；N，3.65

实测值：C，43.59；H，2.04；N，3.6

                           实施例54

         7-(2-呋喃基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)7-(2-呋喃基)-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑

将7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3-苯并唑(300mg，0.90 mmol)和二氯双(三-邻-甲苯基膦)钯(II)(71mg，0.09mmol)溶于对-二甲 苯(3mL)中并在氮气氛下，于室温下搅拌10分钟。加入2-(三丁基甲 锡烷基)呋喃(449mg，1.26mmol)且反应混合物回流4个小时。使反应 混合物冷却至室温，用饱和氯化铵溶液稀释并用EtOAc提取。有机 提取液用水然后用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩。经快速层析法 (20％-30％EtOAc/石油醚)纯化，得到为白色固体的标题化合物(99％ 收率，m.p.120-121℃)；MS m/e 322(M+H)+。

对C19H15NO4分析：

理论值：C，71.02；H，4.71；N，4.36

实测值：C，70.23；H，4.7；N，4.19

步骤b)7-(2-呋喃基)-2-(4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例50的方法制备标题化合物，得到为浅桃红色固体的 产物(64％收率，m.p.283-287℃)；MS m/e 294(M+H+)。

对分析：C17H11NO4

理论值：C，69.62；H，3.78；N，4.78

实测值：C，69.11；H，3.6；N，4.64

                        实施例55

    2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-(2-呋喃基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-7-(2-呋喃基)-5-甲氧基-1，3-苯并唑。

按照实施例53的步骤a的方法，从7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基- 3-(三氟甲基)苯基]-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为琥珀色结晶 的产物(73％收率，m.p.155℃)；MS m/e 340(M+H)+。

对C19H14FNO4分析：

理论值：C，67.25；H，4.16；N，4.13

实测值：C，66.88；H，3.97；N，4.04

步骤b)2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-(2-呋喃基)-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例50的方法，从2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-7-(2-呋喃基)-5- 甲氧基-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为灰色固体的产物(81％收 率，m.p.245-250℃)；MS m/e 312(M+H)+。

对C17H10FNO4x0.7C3H6O分析：

理论值：C，65.04；H，4.37；N，3.79

实测值：C，64.84；H，4.29；N，3.70

                       实施例56

      2-(4-羟基苯基)-7-噻吩-2-基-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-噻吩-2-基)-1，3-苯并唑

按照实施例53的方法，从7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1，3- 苯并唑和2-(三丁基甲锡烷基)噻吩制备标题化合物，得到为白色固 体的产物(95％收率)，m.p.95-100℃)；MS m/e 338(M+H)+。

步骤b)2-(4-羟基苯基)-7-噻吩-2-基-1，3-苯并唑-5-醇

按照实施例50的方法，从5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-噻吩-2- 基)-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为灰色固体的产物(80％收率， m.p.278-280℃)；MS m/e 310(M+H)+。

对C17H11NO3Sx0.25H2O分析：

理论值：C，65.06；H，3.69；N，4.46

实测值：C，64.93；H，3.84；N，4.21

                          实施例57

    2-(4-羟基苯基)-7-(1，3-噻唑-2-基)-1，3-苯并唑-5-醇

步骤a)5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-(1，3-噻唑-2-基)-1，3-苯并唑。

按照实施例53的步骤a的方法，从7-溴-5-甲氧基-2-(4-甲氧基 苯基)-1，3-苯并唑和2-(三丁基甲锡烷基)噻唑制备标题化合物，得 到为灰白色固体的产物(93％收率，m.p.132-136℃)；MS m/e 339 (M+H)+。

对C18H14N2O3S分析：

理论值：C，63.89；H，4.17；N，8.28

实测值：C，63.53；H，3.94；N，8.15

步骤b)2-(4-羟基苯基)-7-(1，3-噻唑-2-基)-1，3-苯并唑-5-醇。

按照实施例50的方法，从5-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-7-(1，3-噻 唑-2-基)-1，3-苯并唑制备标题化合物，得到为黄色固体的产物(55％ 收率，m.p.245-255℃)；MS m/e 311(M+H)+。

对C16H10N2O3Sx1.5H2O分析：

理论值：C，56.97；H，3.88；N，8.30

实测值：C，57.24；H，3.95；N，7.50

                       实施例58

      2-(3-氟-4-羟基苯基)-5-羟基-1，3-苯并唑-7-腈

按照实施例35的方法，从7-溴-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-甲氧基 -1，3-苯并唑和氰化锌制备标题化合物，得到为白色固体的产物，m.p. 308-310℃，MS m/e 269(M-H)+。

对C14H7FN2O3x1.5H2O分析：

理论值：C，61.01；H，2.77；N，10.16

实测值：C，60.68；H，2.46；N，9.77

                    实施例59和60

4-溴-2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-1，3-苯并唑-5-醇(EX.59)

4，6-二溴-2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-1，3-苯并唑-5-醇(EX.60)

按照实施例28的方法，从2-(4-羟基苯基)-7-甲氧基-1，3-苯并 唑-5-醇和N-溴代琥珀酰亚胺制备标题化合物，得到为白色固体的产 物(Ex.59)，m.p.246-248℃，MS m/e 336(M+H)+。

对C14H10BrNO4x.1H2O分析：

理论值：C，49.49；H，3.08；N，4.12

实测值：C，49.28；H，2.89；N，3.87.

得到为白色固体的产物(Ex.60)，m.p.260-262℃，MS m/e 414 (M+H)+。

对C14H9Br2NO4分析：

理论值：C，40.52；H，2.19；N，3.37

实测值：C，40.21；H，2.00；N，3.3

                        实施例61

    7-溴-2-(3，5-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例21中描述的基本相同的方法，从3，5-二氟-4-甲氧 基苯甲酸和2-氨基-6-溴-4-甲氧基苯酚制备标题化合物，得到为白色 固体的产物，m.p.270-272℃；MS m/e 340(M-H)+。

对C13H6BrF2NO3分析：

理论值：C，45.64；H，1.77；N，4.09

实测值：C，45.81；H，1.73；N，3.89

                        实施例62

  2-(3，5-二氟-4-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例24的途径b中描述的基本相同的方法，从7-溴-2- (3，5-二氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇制备标题化合物，得到为白 色固体的产物，m.p.160-262℃；MS m/e 288(M-H)+。

对C15H9F2NO3x0.1H2O分析：

理论值：C，61.52；H，3.23；N，4.78

实测值：C，61.53；H，3.10；N，4.72

                        实施例63

      7-溴-2-(4-羟基-2-甲基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇

以与在实施例21中描述的基本相同的方法，从4-甲氧基-2-甲基 苯甲酸和2-氨基-6-溴-4-甲氧基苯酚制备标题化合物，得到为浅紫色 固体的产物，m.p.120-135℃；MS m/e 320(M+H)+。

对C14H10BrNO3分析：

理论值：C，52.52；H，3.15；N，4.38

实测值：C，52.24；H，2.97；N，4.15

                       实施例64

 2-(3-氟-4-羟基苯基)-7-(1-氟代乙烯基)-1，3-苯并唑-5-醇

将氟化氢吡啶(1.14mL)逐滴加入到2-[4-(乙酰氧基)-3-氟苯基]-7- 乙烯基-1，3-苯并唑-5-基乙酸酯(0.25g，0.7mmol)在环丁砜(3mL)中 的冷的(0℃)溶液中。将反应混合物搅拌5分钟，然后一批加入1，3- 二溴-5，5-二甲基咪唑烷-2，4-二酮(120mg)。反应混合物于室温下搅拌 24个小时，用HCl(1N)稀释并用EtOAc提取。有机层经MgSO4干燥。 蒸发并经快速层析法(CH2Cl2/异丙醇0.3％)纯化，得到为白色固体的 7-(2-溴-1-氟乙基)-2-(3-氟-4-羟基苯基)-1，3-苯并唑-5-醇(0.25g，m.p. 185-186℃)。用乙腈(2mL)吸收该产物并加入1，8-二氮杂双环[54.0] 十一碳-7-烯(150mg)。将反应混合物搅拌24个小时，倾到入冷的(0℃) HCl(1N，10mL)中并用EtOAc提取。有机提取液经MgSO4干燥。蒸 发并经快速层析法(20％EtOAc/己烷)纯化，得到为白色固体的产物 (160mg，m.p.213-214℃)；MS m/e 290(M+H)+。

对C15H9BrF2NO3x0.3H2O分析：

理论值：C，61.15；H，3.28；N，4.75

实测值：C，60.84；H，3.41；N，4.57

                             实施例65

2-(3’-氟-4’-羟基苯基)-7-乙烯基-1，3-苯并唑-5-醇(ERB-041)的代谢物

                           的制备和分析。

实施ERB-041在大鼠肝脏微粒体和细胞溶质中的大规模孵育， 以分离葡糖苷酸(在本文称为M5和M6)和硫酸酯(在本文称为M9和 M9A)用于NMR分析。基于1H-和19F-NMR分析的结果，M5和M6 的结构被清楚地被指定为ERB-041-4’-葡糖苷酸(M5)和ERB-041-5-葡 糖苷酸(M6)。M9和M9A的结构被分别确定为ERB-041-4’-硫酸酯和 ERB-041-5-硫酸酯。

M5、M6、M9和M9A的结构示于如下：

SD大鼠的肝微粒体(雄性，批号VJF，20mg/mL)和细胞溶质(雄 性，批号100007，20mg/mL)得自In Vitro Technologies，Inc.， Baltimore，MD。使用得自BD Gentest，Woburn，MA的细胞溶质进行 另外的大鼠肝脏孵育。辅因子尿苷5’-二磷酸葡糖醛酸(UDPGA)和3’- 磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸酯(PAPS)购自Sigma Chemical Co，St Louis， MO。所有其它试剂为分析级。

在UDPGA的存在下的ERB-041的微粒体孵育

在UDPGA的存在下，在含1mg/mL大鼠肝脏微粒体蛋白质及 最终浓度5mM氯化镁和4mM UDPGA的磷酸盐缓冲液(0.1M， pH 7.4)中，将伴有雄性SD大鼠肝脏微粒体的ERB-041进行分析规 模的孵育。使用100μM的底物浓度于37℃孵育60分钟进行小规模 的孵育(pilot incubation)(1.0mL孵育体积)。通过加入等体积的冷冻 的乙腈终止过程。

随后如上所述，将用于阐明结构的产生足量葡糖苷酸代谢物的 大规模孵育(共37批孵育@5.0mL孵育体积)于37℃进行60分钟。 也进行合适的底物对照和未加入UDPGA的孵育。

在PAPS存在下的ERB-041的细胞溶质的孵育

在PAPS的存在下，在含1mg/mL肝细胞溶质、0.114mg/mL PAPS 0.1mg/mL BSA、5mM二硫苏糖醇和5mM MgCl2的tris缓冲 液(50mM，pH 7.4)中，将伴有雄性SD大鼠和人肝细胞溶质部分的 ERB-041进行分析规模的孵育。于37℃，使用100μM ERB-041的 底物浓度，进行这些小规模的孵育(1.0mL孵育体积)60分钟，通过 加入等体积的冷冻的乙腈终止孵育。

随后如上所述，将用于阐明结构的产生足量硫酸酯代谢物的大 规模孵育(总60批孵育@1.0mL孵育体积)于37℃进行60分钟。进 行合适的底物对照和未加入PAPS的孵育。以相同的方法也进行另外 的孵育(总120@2.0mL孵育体积、50μM ERB-041)以分离足量的 ERB-041-硫酸酯，以使全部结构鉴定成为可能。

样品制备

终止孵育后，使反应混合物离心(3000rpm，10-15分钟)，然后上 清液用于随后的制备型HPLC分离。

高效液相色谱

反相-HPLC用于所有代谢物的分析。为了确认在小规模孵育中 的ERB-041的葡糖苷酸和硫酸酯共轭物的形成，使用装备二极管阵 列检测器的Agilent 1100 LC系统(Agilent Technologies，Wilmington， DE)进行HPLC分析。将二极管阵列检测器的波长设置为254nm。 使用Phenomenex Prodigy，5ODS[4.6×250mm]柱(Phenomenex，Inc. Torrance，CA)和使用梯度系统A1.0 mL/min流速实现分离。

梯度(A)   时间   (分钟)   A％   (10mM乙酸铵，pH 4.5)     B％     (乙腈)   0   5   28   33   42     43   48   95   95   35   5   5     95   95     5     5     65     95     95       5     5

在孵育提取物的大规模分析期间，在以下条件下实现分析检测：

使用带有UV检测(254和280nm)的Waters 2690 Alliance LC系 统(Waters Corp.，Milford，MA)，并采用Phenomenox LUNA-苯基/己 基柱[4.6×250mm，5μ]使用梯度系统B(葡糖苷酸)和梯度系统C(硫 酸酯)，实现分离。

梯度(B)   时间   (分钟)   A％   (5mM乙酸铵，pH 4.5)   B％   (乙腈)   流速   (mL/分钟)   0   2     35   92   92     55   8   8     45   0.8   0.8     0.8

  37   45   47     10     10     92     90     90     8     1.0     1.0     1.0

梯度(C)   时间   (分钟)   A％   (5mM乙酸铵，pH 4.5)   B％   (乙腈)   流速   (mL/min)   0   2   35   37   45   47   85   85   55   10   10   85   15   15   45   90   90   15   0.8   0.8   0.8   1.0   1.0   0.8

在以下条件下实现共轭代谢物的制备型HPLC分离：

使用带UV检测(254和280nm)的Waters Delta Prep 4000系统， 并使用ZorbaxRX-C18柱[21.1×250mm，10μ](Agilent Technologies， Wilmington，DE)柱采用梯度系统D(葡糖苷酸)和E(硫酸酯)，实现分 离。

梯度(D)   时间   (分钟)   A％   (5mM乙酸铵，pH 4.5)   B％   (乙腈)   流速   (mL/min)   0   2   60   62   70   72   95   95   60   20   20   95   5   5   40   80   80   5   20   20   20   22   22   20

梯度(E)   时间   (分钟)   A％   (5mM乙酸铵，pH 4.5)   B％   (乙腈)   流速   (mL/min)   0   2   60   62   70   72   90   90   55   40   20   90   10   10   45   60   80   10   20   20   20   22   22   20

共扼代谢物的分离和纯化

对于葡糖苷酸，使得自UDPGA存在下的大鼠肝脏微粒体孵育 的合并提取物经历用水和甲醇连续洗脱的反相快速层析。含ERB-041 同分异构的葡糖苷酸(M5和M6)流分合并和浓缩后，进一步用制备型 HPLC分离。采用梯度D于ZorbaxRX-C18柱[21.1×250mm，10μ] 上使用Waters Delta Prep 4000系统，在制备型HPLC上分离共扼代 谢物。通过于254和280nm的UV检测下监控分离，且收集含需要 的代谢物(Rt＝26.8-27.3分钟，M5和Rt＝28.0-28.5分钟，M6)的峰。 真空蒸发有机溶剂后，冻干残余物得到纯的葡糖苷酸(M5和M6)，用 于随后的1H-和19F-NMR分析。

对于硫酸酯，通过在ZorbaxRX C-18柱上的制备型HPLC分 离合并的粗品孵育产物。使用梯度溶剂E于280nm和250nm的UV 监测下实现制备型HPLC分离。且收集需要的M9A(Rt＝28.5-29分 钟)和M9(Rt＝29.3-29.8分钟)的峰。真空蒸发有机溶剂后，冻干残 余物得到纯的硫酸酯共扼物(M9A和M9)，用于随后的19F-NMR分 析。

在制备型HPLC过程中分析检测，以及如以上所描述的分别使 用梯度B和C用于葡糖苷酸和硫酸酯，进行纯化的葡糖苷酸和硫酸 酯的分析。

LC-MS分析

使用与HP 1100 MSD质谱仪偶联的Agilent 1100 HPLC系统对 分离的代谢物的LC-MS特征进行鉴定。在单位分辨率上得到全扫描 的电喷雾电离(ESI)质谱。ESI正电离模式应用于葡糖苷酸的质谱记 录，而ESI负模式被选择用于硫酸酯的质谱记录。采用XTerraC18 柱(2.1×250mm，5μ；Waters Corp.)并用梯度F(低)作为溶剂系统。

梯度(F)   时间   (分钟)   A％   (5mM乙酸铵，pH 4.5)   B％   (乙腈)   流速   (mL/min)   0   2   35   37   45   47   82   82   50   10   10   82   18   18   50   90   90   18   0.22   0.22   0.22   0.22   0.22   0.22

用于LC-MS分析以确定葡糖苷酸共扼物形成的HPLC条件在之 前已描述。使用如以上描述的相同的LC-MS条件(梯度A)，不同的 是采用2×250mm柱和0.35mL/min的流速，证实硫酸酯代谢物的 大规模产生。所用的HPLC系统为Waters Alliance 2690 HPLC泵系 统。所用的质谱仪为装备电喷雾电离(ESI)源的Finnigan TSQ Quantum (Thermo Finnigan，San Jose，CA)并在负电离模式下运行。单位质量分 辨率用于所有分析。

NMR分析

为了比较葡糖苷酸的1H-NMR波谱与ERB-041的波谱，基于 1H-NMR、13C-NMR、HMBC和HMQC实验，使ERB-041的化学位 移明确地归属(assigned)。使用Bruker 400 AMX波谱仪(Bruker， Billerica，MA)获得所有NMR分析。

对于葡糖苷酸，CD3CN/DMSO-d6混合物作为溶剂用于1H-NMR 和CD3OD用于19F-NMR分析。对于硫酸酯共扼物，含0.005％TFA 的CD3OD用于19F-NMR分析和氟-苯标准(δF-113.12ppm)被用于在 获得硫酸酯共扼物之前调节仪器设置。

数据分析

针对LC 3D的ChemStation的版本为Rev.A.09.01的Agilent色 谱软件(Agilent Technologies Inc.，Wilmington，DE)用于检测代谢物 峰。Xcalibur版本1.3软件用于LC-MS仪器的对照和记录自LC-MS 分析的数据。

大鼠肝脏微粒体中的葡萄糖醛酸化作用(glucuronidation)

在UDPGA存在下，将ERB-041与得自大鼠肝脏微粒体的微粒 体蛋白一起进行孵育时，检测两种主要的代谢物，M5和M6。M5和 M6的LC-MS分析(ESI，正电离)显示，这些峰为ERB-041的在4’- OH(苯基)和5-OH(苯并唑)位的酚基葡糖苷酸。在大规模孵育中形 成M5和M6的进一步确认可通过LC-MS分析(ESI，正电离)证实。 使用如以上所描述的梯度溶剂系统B，实现两种代谢物的分离。

大鼠肝脏细胞溶质中的硫酸化作用(sulfation)

在PAPS的存在下，将ERB-041与得自大鼠和人肝部分的细胞 溶质一起进行孵育时，通过HPLC和LC-MS分析检测两种代谢物 (M9A和M9)。大鼠肝脏和人肝细胞溶质孵育产生相似的结果。两种 代谢物M9A和M9在m/z 350均产生与人和大鼠细胞溶质孵育中的 ERB-041-硫酸酯一致的[M-H]-。使用LC-MS分析(ESI，负电离)获得 对得自大规模孵育的分离代谢物M9A和M9的鉴定的进一步证实。 在大规模孵育中，约23％的ERB-041转变为两种硫酸酯共扼物。通 过使用如上所述的梯度溶剂系统C实现该两种硫酸酯代谢物的分离。

ERB-041共扼代谢物的结构说明

得到针对ERB-041葡糖苷酸(代谢物M5和M6)和硫酸酯(代谢物 M9和M9A)的质谱并且证实它们存在于大规模孵育提取物中。LC-MS 数据显示两个环(苯基和苯并唑)的酚基葡萄糖醛酸化和/或硫酸化。 基于19F-和1H-NMR分析测定共扼的位点。下面讨论各代谢物的详细 质谱和NMR数据。

代谢物M5(ERB-041-4’-葡糖苷酸)

代谢物M5显示在m/z 448的[M+H]+；因此，证实代谢物M5为 之前报告的或者苯基(C-4’)的酚基或者苯并唑(C-5)环的ERB-041-葡 糖苷酸。此由存在m/z 470(+22质量单位，Na加合物)和m/z 272(失 去葡糖苷酸部分)的[M+Na]+得到进一步支持。然而，缺失任何特征的 质谱片段使得无法区分基于LC-MS数据的葡萄糖醛酸化的各位点。

由19F-和1H-NMR数据还获得对该结构的进一步解释。ERB-041 的19F-NMR分析显示为伴有δF-138ppm的化学位移的信号(3’-F)。 得自代谢物M5和M6的19F-NMR分析结果显示，M5中的3’-F信号 移向δF-134ppm，而M6的信号维持在δF-138ppm不受影响。这些 结果还明显地与对于M5葡萄糖醛酸化的位点为C4’-位(苯环)相一 致。在C4’-OH位的葡萄糖醛酸化还通过1H-NMR分析证实。这个代 谢物的质子NMR波谱与ERB-041的相似，不同的是H-5’的显著的 低场位移(downfield shift)(从ERB-041中的δ7.19ppm移向M5中的δ 7.45ppm)。另外，与端基异构(anomeric)质子一致的在δ5.2ppm上的 信号在代谢物波谱中也是明显的，进一步表示为葡糖苷酸结构。所 有其它质子化学位移保持不变。H-5’信号为经历与维持不受影响的苯 并唑环的所有质子低场位移的仅有信号，进一步确定葡萄糖醛酸化 的位点为苯环的4’-酚基。需要注意的是，双重信号在与葡糖醛酸的 β和α差向异构体一致的M5的1H-NMR波谱中是明显的。观察到的 葡糖醛酸部分的端基异构质子与M5的ROSEY波谱中的H-5’的NOEs 一致，进一步支持归属结构为4’-O-葡糖苷酸。

代谢物M6(ERB-041-5-葡糖苷酸)

与代谢物M5相似，M6的质谱分析显示出m/z 448的[M+H]-，确 认其为ERB-041单葡糖苷酸。如上所述，通过m/z 470([M+Na]+)和 m/z 272(失去葡糖苷酸部分)的存在，进一步支持这一确认。再有， 由于缺失任何特征的质谱片段，仅基于LC-MS数据，不能区分葡萄 糖醛酸化作用的各位点。如上讨论的，M6的19F-NMR分析表示，M6 中的3’-F信号不受通过葡萄糖醛酸化的影响并且显示出δF-138ppm 的化学位移，与其母体ERB-041(δF-138ppm)的相同。这些结果明 显与葡萄糖醛酸化的位点为M6的C5-OH(苯并唑环)位置相一致。 通过1H-NMR分析，在C-5的葡萄糖醛酸化被进一步证实，与其母 体ERB-041比较，相应于H-4和H-6的质子信号明显显示出向低场 的位移。1H-NMR的结果是一致的并且进一步证实葡萄糖醛酸化的位 点为苯并唑环的C5-酚基。

代谢物M9(ERB-041-4’-硫酸酯)

由于失去硫酸酯部分，代谢物M9在m/z 350显示出分子离子[M- H]-，及在m/z 270的片段；因此，证实M9为ERB-041-硫酸酯。可 在任一酚基(C-4’，苯基或C-5，苯并唑环)发生硫酸化。然而，缺失 任何特征的质谱片段，使得无法区分基于LC-MS数据的硫酸化的各 个位点。基于附加的19F-NMR分析，作出明了无误的硫酸酯代谢物 结构归属(assignment)。因此，M9的19F-NMR分析显示出伴有δF-130 ppm的化学位移的信号(3’-F)，该信号可与ERB-041的δF-138ppm 比较。如以上针对葡糖苷酸M5和M6的讨论，在此观察到的显著低 场位移明显表示在C-4’位的硫酸酯结合。当观察到的针对M9A中的 3’-F的化学位移于δF-138ppm维持不变时，进一步证实该归属。 代谢物M9A(ERB-041-5-硫酸酯)

代谢物M9A在m/z 350显示出与在m/z 270的片段相同的分子离 子[M-H]-，该片段相当于M9所见的失去硫酸酯；因此，也可断定代 谢物M9A为直接的ERB-041-硫酸酯共扼物。与M9的类似，或者C4’ (苯基)或者C5(苯并唑)为可用的硫酸化位点。此外，缺失任何特征 的质谱片段，使得无法区分基于LC-MS数据的硫酸化的各个位点。 基于19F-NMR分析作出明了无误的的M9A结构归属。将M9A的δF 与ERB-041比较，没有观察到化学位移变化。在两种情况下，观察 到的δF为-138ppm，与远端C5-苯并唑OH基团硫酸化的结果一致。

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正如本领域的技术人员将会理解的那样，在不脱离本发明精神实 质的情况下，可对于优选的本发明实施方案进行大量的改变和修饰。 期望所有这样的改变都落入本发明的范围内。

发明背景