晚期糖化终末产物(AGE)是蛋白非酶糖化和氧化的结果。它们出现在包括自身免疫病相关性组织疾病在内的压力相关的环境下；并且可能在由氧化或髓过氧化物酶途径所产生的炎症组织中形成。AGE与许多糖尿病相关的并发症有关。例如，糖尿病性肾病、肾小球基膜增厚和肾小球系膜扩张的特征结构改变伴有AGE的积聚，这会导致肾小球硬化症和间质纤维化。长期输注AGE给非糖尿病大鼠会导致类似的形态改变和显著的蛋白尿的发展。已经显示诸如氨基胍等AGE抑制剂能够在糖尿病动物模型中防止糖尿病性肾病，最近显示其在一个临床试验中对糖尿病患者会产生相同作用。而且，AGE是经充分验证的糖尿病性视网膜病的治疗靶标。大量糖尿病小鼠和大鼠研究已经证明了抑制AGE形成在治疗此疾病中的有益效果。
动脉粥样硬化在糖尿病患者中显著加速，其与心血管和脑血管死亡率的更高风险相关。动物和人的研究已经表明AGE在动脉硬化病变的形成和发展中起着重要的作用。糖尿病血管组织中AGE积累的增加与内皮细胞、巨噬细胞、和平滑肌细胞功能的改变相关。
AGE与单核细胞、巨噬细胞、微血管内皮细胞、平滑肌细胞、间质细胞和神经元上的细胞表面受体相互作用。晚期糖化终末产物受体(RAGE)是细胞表面受体免疫球蛋白超家族的成员。RAGE由三个胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和参与信号传导的胞质结构域构成。除AGE外，RAGE还结合多种配体，包括S100/钙粒蛋白、两性素(amphoterin)/HMGB1和淀粉样纤维(amyloid fibril)。RAGE通过包括NF-κB的信号级联起作用。RAGE表达在RAGE配体存在下上调并且在患有类风湿性关节炎(RA)的患者的关节中升高。
RAGE具有缺乏跨膜结构域的分泌型异构体，其称为可溶性RAGE(sRAGE)。已经显示sRAGE的给药能修复创伤愈合(Goova等人(2001)Am.J.Pathol.159，513-525)并且抑制糖尿病性动脉粥样硬化(Park等人(1998)Nat Med.4(9)：1025-31)。在WO 2004/016229A2(Wyeth，Madison，NJ)和美国专利申请公布2006/0057679A1(O’Keefe，T.等人)中公开了由RAGE配体结合元件和免疫球蛋白元件构成的融合蛋白。
仍然需要治疗AGE介导的疾病(如与AGE的量增加相关的疾病)的新方法。本发明满足了这种需求和其他的需求。

本发明提供用于治疗与AGE的量增加相关的疾病的材料和方法。在一个实施方式中，本发明提供包含至少一个多肽的融合蛋白，所述多肽包含：(a)第一氨基酸序列，其与晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物受体至少95％相同，该第一氨基酸序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构域或其片段至少95％相同；其中所述第一氨基酸序列包含至少一个相对于野生型RAGE配体结合结构域的突变。在本发明的一个实施方式中，本发明的融合蛋白可以进一步包含在所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列之间的连接子序列。在一些实施方式中，所述RAGE配体结合结构域可以来自哺乳动物RAGE，例如人RAGE。适宜的哺乳动物RAGE配体结合结构域可以包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-344或SEQ ID NO：6的氨基酸24-344。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白可以包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8。在一个实施方式中，本发明的分离的融合蛋白包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8。在另一个实施方式中，本发明的分离的融合蛋白由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8组成。在本发明的一些实施方式中，本发明的融合蛋白还可以包含在RAGE氨基酸序列和IgG4氨基酸序列之间的连接子。本发明还构思了编码本发明融合蛋白的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)以及表达编码本发明融合蛋白的核酸分子的宿主细胞。
本发明还提供包含本发明融合蛋白和药物上可接受的赋形剂或稀释剂的药物组合物。
本发明提供治疗AGE介导的疾病的方法。此类疾病包括特征在于患者(例如，诸如人等哺乳动物)中AGE量增加的任何疾病。治疗AGE介导的疾病的方法包括给予患有AGE介导的疾病的患者治疗有效量的包含本发明融合蛋白的药物组合物。可以通过本发明方法治疗的疾病的实例包括但不限于：糖尿病性肾病；类风湿性关节炎；和自身免疫疾病，如皮炎、肾小球肾炎、多发性硬化、葡萄膜炎性眼炎(uveitis ophthalmia)、自身免疫性肺炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性炎眼、系统性红斑狼疮、胰岛素耐受、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和硬皮病。本发明的任何融合蛋白都可以用于实施本发明的方法。在一个实施方式中，本发明的方法可以使用包含SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8的融合蛋白来实施。在另一个实施方式中，本发明的方法可以使用由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8组成的融合蛋白来实施。
在本发明的另一个实施方式中，本发明提供在有需要的哺乳动物(例如，人)中降低RAGE结合的配体水平的方法。此类方法可以包括给予哺乳动物RAGE配体降低量的本发明的融合蛋白。
在其他实施方式中，本发明提供包含本发明DNA序列的重组表达载体；用载体转化、转导或转染的宿主细胞；以及制备融合蛋白的方法，其包括在适于有效表达融合蛋白的条件下培养用编码本发明融合蛋白的核酸转化、转导或转染的宿主细胞。
本发明还提供包含本发明融合蛋白或其片段的组合物。在一些实施方式中，本发明包括包含本发明融合蛋白或其片段的组合物，所述融合蛋白或其片段直接或间接与放射性同位素、螯合剂、毒素、荧光染料、生物素、肽表位，如his-标签、myc-标签或糖连接。本发明的其他实施方式包括为了改变融合蛋白的生物半衰期或功能和糖基化变体而与另一蛋白融合的本发明融合蛋白。
本发明的这些和其他方面将参考下列详细说明而显而易见。
附图简述
图1是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对白细胞淤滞的影响的柱形图。
图2A-2D是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对各视网膜层视网膜血管透性的影响的柱形图。
图3是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对视网膜蛋白硝化的影响的柱形图。
图4是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对ICAM视网膜表达的影响的柱形图。
图5A是显示在患糖尿病10个月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白对每平方毫米视网膜组织所观察到的无细胞毛细血管数的影响的柱形图。图5B是显示在患糖尿病10个月后示例性RAGE-Ig融合蛋白对糖尿病小鼠中所观察到的每1000个毛细血管细胞中的周影细胞(pericyte ghost)数的影响的柱形图。
图6是显示在患糖尿病10个月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白对50％响应的接触阈值的影响的柱形图。
图7提供显示实施例3的实验方案的流程图。
图8是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对测试动物体重的影响的线形图。
图9是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节炎发病率的影响的柱形图。
图10是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节炎发作的影响的柱形图。
图11是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节炎发病率与时间的函数的影响的线形图。
图12是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节炎严重程度与时间的函数的影响的线形图。
图13是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对所观察到的关节炎爪子数与时间的函数的影响的线形图。
图14A-14D是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节形态随融合蛋白量增加的变化的影响的显微照片。
图15是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对滑膜炎(黑柱)和关节翳(灰柱)的影响的柱形图。
图16是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对边缘糜烂(marginal erosion)(黑柱)和结构改变(architectural change)(灰柱)的影响的柱形图。
图17是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对整体组织学关节炎评分的影响的柱形图。
图18是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节基质蛋白丢失的影响的柱形图。
图19A-19D是甲苯胺蓝染色切片的显微照片，其显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节基质蛋白丢失的影响。
实施方式
定义
如本文所用的术语“晚期糖化终末产物受体”或RAGE是指氨基酸序列基本上类似于天然哺乳动物RAGE氨基酸序列且以配体-受体特异性方式结合一种或多种RAGE配体的蛋白。术语“晚期糖化终末产物”和“AGE”是指还原糖与蛋白的游离氨基、脂和上述核酸的非酶反应而形成的异源分子群。
如本文所用“RAGE配体结合结构域”或“RAGE-LBD”是指保持着以配体-受体特异性方式结合RAGE配体的能力的任何哺乳动物RAGE蛋白或哺乳动物RAGE蛋白的任何部分。具体地，不受限制，RAGE配体结合结构域包括具有一个或多个跨膜RAGE蛋白胞外结构域的多肽。参见表6，适宜的RAGE-LBD可以包含至少SEQ IDNO：6的氨基酸1-99、或氨基酸24-99、或氨基酸1-208、或氨基酸24-208、或氨基酸1-301、或氨基酸24-301、或氨基酸1-344、或氨基酸24-344。
如本说明书内容中用于定义融合蛋白纯度的术语“分离的”是指所述蛋白基本上不含在制备期间与其相关的其他蛋白，包括但不限于基本上没有在细胞培养基中融合蛋白表达期间存在的其他蛋白。例如，本发明的分离的蛋白可以含有1-25％、20-25％、15-20％、10-15％、5-10％、1-5％或少于约2％质量的制备过程的蛋白污染物残余物。然而，包含本发明的分离的蛋白的组合物可以含有作为稳定剂、载体、赋形剂或联合治疗剂添加的其他蛋白。
如本文所用，“蛋白”和“多肽”可互换。
如本文所用“治疗”疾病或病症是指改善患者疾病或病症的至少一个体症或症状。
术语“核酸”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和(适当时)核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括：如由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的等同物、类似物；和如所述实施方式所应用的单链(正义和反义)和双链多核苷酸。
本文所用的术语“或”意思可以与术语“和/或”互换使用，除非上下文中清楚指明并非如此。
术语“％相同”是指两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的序列同一性。％同一性可以通过比较为比较的目的而进行比对的各序列中的位置来确定。百分比同一性的表示是指所比较的序列共有位置的相同氨基酸或核酸数目的函数。可以使用多种比对算法和/或程序，包括：FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST作为GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分而获得，其可以例如默认设置使用。ENTREZ可以通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)、美国国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美国国立健康研究院(National Institutes of Health，Bethesda，Md)获得。在一个实施方式中，两个序列之间的％同一性可以通过用空格重为1的GCG程序(例如，称重各氨基酸空格如同其为单一氨基酸一样)或两个序列之间的核苷酸错配确定。
序列同一性可以通过比较参考序列或参考序列的亚序列与测试序列(例如，核苷酸序列、氨基酸序列等)来确定。最佳地，在任意数目残基所限定的比较窗口内比对参考序列和测试序列。为了获得最佳的比对，可以将增加或缺失(如空格)引入测试序列。本发明的％序列同一性通过如下方法来测定：测定两个序列上存在相同残基的位置数，用匹配位置的数除以比较窗口内序列的总长度，再乘以100得出百分数。除了匹配位置数之外，在计算百分比序列同一性时还要考虑空格数和大小。
序列同一性通常使用计算机程序来确定。代表性程序是可在美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))程序。此程序比较测试序列链段与数据库中的序列以测定匹配的统计学显著性，然后鉴别并仅报告显著性高于阈值的那些匹配。适宜的BLAST程序版本是容许空格的版本，例如2.X版(Altschul等人，Nucleic Acids Res 25(17)：3389-402，1997)。鉴别与本发明蛋白具有序列同一性的蛋白的其他适宜程序包括但不限于：PHI-BLAST(Pattern Hit Initiated BLAST，Zhang等人，Nucleic Acids Res 26(17)：3986-90，1998)和PSI-BLAST(位置特异性叠加BLAST(Position-Specific IteratedBLAST)，Altschul等人，Nucleic Acids Res 25(17)：3389-402，1997)。这些程序可以在上述NCBI网站公开获得，可以默认设置使用以确定根据本发明的序列同一性。
融合蛋白
本发明提供一种分离的融合蛋白，该分离的融合蛋白包含至少一种多肽，所述多肽包含：(a)第一氨基酸序列，其与晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物受体至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，该第一氨基酸序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构域或其片段至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同；其中所述第一氨基酸序列包含相对于野生型RAGE配体结合结构域的至少一个突变、或至少两个突变、或至少三个突变、或1至4个突变、或1至10个突变。可以在第一氨基酸序列中发生的突变的实例是通过(例如)使RAGE配体结合结构域更加耐受蛋白水解降解来增加融合蛋白稳定性的那些突变，如使融合蛋白更加耐受弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶的那些。适宜的第二氨基酸序列片段包括保持着增加融合蛋白血清半衰期的能力的片段，其与相同的仅第一氨基酸序列的血清半衰期部分相关。优选地，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列衍生自人RAGE配体结合结构域和人IgG4。
本发明的融合蛋白还可以包含除RAGE配体结合结构域和IgG4恒定结构域或其片段之外的一个或多个氨基酸序列。例如，本发明的融合蛋白可以包含连接子序列，该连接子序列可插入RAGE配体结合结构域和IgG序列之间。本发明的融合蛋白可以包含一种或多种标签序列，例如，诸如6-组氨酸等纯化标签序列。本发明的融合蛋白可以包含一个或多个市售抗体所识别的表位，例如，c-myc(EQKLISEEDL，SEQ ID NO：9)和自流感血细胞凝集素蛋白的表位标签衍生的血细胞凝集素(YPYDVPDYA，SEQ ID NO：10)。
可以使用本领域的那些技术人员所熟知的任何哺乳动物RAGE蛋白来实施本发明。优选地，使用RAGE蛋白的胞外结构域来鉴别可以突变并用作融合蛋白第一氨基酸序列的配体结合结构域。哺乳动物RAGE蛋白的适宜实例包括但不限于：灵长类、人(例如，GenBank登录号NP_001127和NP_751947)、鼠(例如，GenBank登录号NP_031451)、犬(例如，GenBank登录号AAQ81297)、大鼠(例如，GenBank登录号NP_445788)、猫、牛(例如，GenBank登录号AAI20128)、羊、马和猪(例如，GenBank登录号AAQ73283)RAGE结构域。
包含对野生型序列的一种或多种改变或修饰的RAGE氨基酸序列可以用于本发明。这种改变或修饰包括但不限于：点突变、自N末端的缺失、自C末端的缺失、内部缺失、以及它们的组合。可以将任何改变或修饰引入RAGE序列来用于本发明，只要所得蛋白保留生物活性即可，例如，保留结合一个或多个RAGE配体的能力。本发明的融合蛋白还包括具有或不具有内源糖基化模式的那些，包括但不限于其中第一氨基酸序列衍生自哺乳动物RAGE配体结合结构域的融合蛋白，该哺乳动物RAGE配体结合结构域伴有或不伴有相关的结合结构域的天然模式糖基化。
可以使用任何适宜的IgG Fc区域来实施本发明，优选地，该区域来自IgG4分子，例如GenBank登录号AAH25985的氨基酸残基149-473。用于本发明的IgG区域可以是IgG4Fc区域，并且可以包含IgG4分子的一个或多个CH2和CH3区域。
适宜的融合蛋白实例在下列表中提供。
表1提供人RAGE-IgG4Fc融合蛋白基因序列的核苷酸序列。
表1：人RAGE-IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO：1)。

CAAAACATCACAGCCCGGATTG
GCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCC
CAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAA
GGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGT
CCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAG
GGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAA
GTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAAT
TGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGG
GACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCA
CTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGA
AGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAG
TCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACC
TTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCA
CAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGG
TCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGA
ACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATC
CACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTG
CTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGT
GTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGC
ATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGT
GGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCCGCTTCCACCAAGG
GCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGA
GCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG
TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT
TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGT
AGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCA
AATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGG
GACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGA
TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGG
AAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTG
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTA
CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGG
CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGG
TGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC
AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC
TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCLAACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGT
GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCT
GTCTCTCGGGAAATGA
黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE的编码序列，下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。
表2：人RAGE-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
QNITARI    GEPLVLKCKG    APKKPPQRLE    50
WKLNTGRTEA    WKVLSPQGGG    PWDSVARVLP    NGSLFLPAVG    IQDEGIFRCQ    100
AMNRNGKETK    SNYRVRVYQI    PGKPEIVDSA    SELTAGVPNK    VGTCVSEGSY    150
PAGTLSWHLD    GKPLVPNEKG    VSVKEQTRRH    PETGLFTLQS    ELMVTPARGG    200
DPRPTFSCSF    SPGLPRHRAL    RTAPIQPRVW    EPVPLEEVQL    VVEPEGGAVA    250
PGGTVTLTCE    VPAQPSPQIH    WMKDGVPLPL    PPSPVLILPE    IGPQDQGTYS    300
CVATHSSHGP    QESRAVSISI    IEPGEEGPTA    GSVGGSGLGT    LALAASTKGP    350
SVFPLAPCSR    STSESTAALG    CLVKDYFPEP    VTVSWNSGAL    TSGVHTFPAV    400
LQSSGLYSLS    SVVTVPSSSL    GTKTYTCNVD    HKPSNTKVDK    RVESKYGPPC    450
PSCPAPEFLG    GPSVFLFPPK    PKDTLMISRT    PEVTCVVVDV    SQEDPEVQFN    500
WYVDGVEVHN    AKTKPREEQF    NSTYRVVSVL    TVLHQDWLNG    KEYKCKVSNK    550
GLPSSIEKTI    SKAKGQPREP    QVYTLPPSQE    EMTKNQVSLT    CLVKGFYPSD    600
IAVEWESNGQ    PENNYKTTPP    VLDSDGSFFL    YSRLTVDKSR    WQEGNVFSCS    650
VMHEALHNHY    TQKSLSLSLG    K                                         671
黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE的氨基酸序列，下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
表3：人RAGE-连接子-IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO：3)。

CAAAACATCACAGCCCGGATTG
GCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCC
CAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAA
GGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGT
CCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAG
GGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAA
GTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAAT
TGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGG
GACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCA
CTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGA
AGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAG
TCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACC
TTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCA
CAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGG
TCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGA
ACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATC
CACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTG
CTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGT
GTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGC
ATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGT
GGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC
GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCT
GCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCA
AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCC
TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA
CGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG
GTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGC
CCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA
AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC
GTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG
GTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC
AACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA
GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT
TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC
TTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAG
GGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC
TACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA
黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE的编码序列，双下划线文本为肽连接子的编码序列，单下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。
表4：人RAGE-连接子-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE 50
WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ 100
AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY 150
PAGTLSWHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG 200
DPRPTFSCSF SPGLPRHRAL RTAPIQPRVW EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA 250
PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS 300
CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALA350
ASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG 400
VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE 450
SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE 500
DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 550
KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV 600
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE 650
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK                         678
黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE的氨基酸序列，双下划线文本为肽连接子的氨基酸序列，单下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
表5：人RAGE变体-IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO：5)。

CAAAACATCACAGCCCGG
ATTGGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAA
CCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAA
GCTTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTG
TGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGG
ATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAAT
GGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTC
CTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGG
TGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCT
GCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGA
ATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTG
AGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGC
CCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCA
GGCCTTCCCCGACGCCGGGCCTTGCACACAGCCCCCATCCAGCCCC
GTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGA
GCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGAC
CTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAG
GATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCC
TGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCAC
CCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGC
ATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGA
GGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCCGCTTCCACCAAGGGCC
CATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG
CACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA
CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC
GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCT
GCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAG
TTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGA
GTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAG
GACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGG
TGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGT
GGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA
GCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC
AACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA
AAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCA
GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA
AGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC
GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCA
GGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
TCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGG
AAATGA
黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常内容为人RAGE变体的编码序列，黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。
表6：人RAGE变体-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
1QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE
51  WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ
101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY
151 PAGTLSWHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG
201 DPRPTFSCSF SPGLPRRALTAPIQPRVW EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA
251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS
301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALAASTKGP
351 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
401 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC
451 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN
501 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK
551 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD
601 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS
651 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K
黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE变体的氨基酸序列，黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
表7：人RAGE变体-连接子-IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO：7)。

CAAAACATCACAGCCCGG
ATTGGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAA
CCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAA
GCTTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTG
TGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGG
ATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAAT
GGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTC
CTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGG
TGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCT
GCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGA
ATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTG
AGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGC
CCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCA
GGCCTTCCCCGACGCCGGGCCTTGCACACAGCCCCCATCCAGCCCC
GTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGA
GCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGAC
CTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAG
GATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCC
TGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCAC
CCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGC
ATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGA
GGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC
GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCT
GCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT
CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC
GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCT
CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG
CTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC
AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCA
TGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCT
TCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGAC
CCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCC
CGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAAT
GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGT
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACA
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG
ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG
CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAG
AAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA
黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE变体的编码序列，黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，双下划线文本为编码肽连接子的序列，下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。
表8：人RAGE变体-连接子-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)。
1QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE
51  WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ
101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY
151 PAGTLSWHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG
201 DPRPTFSCSF SPGLPRRALTAPIQPRVW EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA
251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS
301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALA
351ASTKGPSVF PLAPCSRSTS  ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG
401 VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE
451 SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE
501 DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
551 KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV
601 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE
651 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK
黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE变体的氨基酸序列，黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE中的点突变位点，双下划线文本为肽连接子的氨基酸序列，下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
RAGE融合蛋白的表达
本发明的融合蛋白可以通过本领域的那些技术人员所已知的任何蛋白表达系统来制备，例如，真核表达系统、细菌表达系统和病毒表达系统。可以使用多种宿主表达载体系统来表达本发明的融合蛋白。这类宿主系统代表了本发明融合蛋白可以在其中制备的溶媒，随后融合蛋白可以从其中纯化。此类系统包括但不限于诸如细菌、酵母等微生物、昆虫细胞或植物细胞。视表达系统而定，酵母或哺乳动物表达系统(例如，COS-7细胞)中表达的RAGE可与天然分子的分子量和糖基化模式类似或轻微不同。细菌(如大肠杆菌(E.coli))中RAGE DNA表达提供非糖基化的分子。可以使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中获得不同的糖基化模式。具有灭活的N-糖基化位点的哺乳动物RAGE功能突变体类似物可以通过寡核苷酸合成和连接或通过定点突变技术来制备。可以使用酵母表达系统以均匀的还原碳水化合物形式以好的产率制备这些类似蛋白。
可以通过本领域内任何已知的方法获得编码本发明融合蛋白的核酸分子，并测定多核苷酸的核苷酸序列。根据本文的教导和已知的RAGE多肽序列及其鉴别的或可鉴别的配体结合元件、以及重链IgG恒定结构域的已知序列，可以使用本领域内熟知的方法确定编码这些多肽的核苷酸序列，即，可以将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以能够产生编码本发明融合蛋白的核酸的方式组装。可以根据所用的表达系统来选择核苷酸密码子，例如通过选择对应于表达系统中所存在的较高丰度tRNA分子的密码子，则可以表达较高水平的融合蛋白。编码融合蛋白的这种多核苷酸可以由化学合成的多核苷酸组装(例如，如Kutmeier等人，Biotechniques 17：242(1994)中所述)，简言之，其包括：合成含有编码融合蛋白的序列部分的重叠寡核苷酸；退火和连接这些寡核苷酸；然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增经连接的寡核苷酸。
本发明融合蛋白(包括含有融合蛋白片段或其变体或者由融合蛋白片段或其变体组成的其他分子)的重组表达可能需要构建含有编码融合蛋白的多核苷酸的表达载体。一旦得到了编码本发明融合蛋白的多核苷酸，便可以通过重组DNA技术使用该领域内所熟知的技术来制备产生融合蛋白的载体。这类含有RAGE-Fc编码序列的表达载体还可以含有适当的转录和翻译控制信号/序列，例如核糖体结合位点(即，Kozak序列)、内部核糖体进入位点(IRES)、和多腺苷酸化位点等。
编码本发明融合蛋白的核酸分子可以如下转移到哺乳动物细胞中：使用复制缺陷型逆转录病毒载体(例如，源自莫洛尼鼠类白血病病毒(MLV)或HIV的载体)和水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV-G)制成假性病毒以稳定插入到编码本发明融合蛋白的单拷贝核酸分子中进入分裂的细胞。逆转录病毒以RNA形式传递编码的基因，进入细胞后将其反转录成DNA，稳定整合到宿主细胞基因组中。在单个细胞中多个基因的插入可能增加融合蛋白的表达和分泌。多次感染也可以增加整合的基因拷贝数从而增加表达的融合蛋白量。编码融合蛋白的整合的基因由于它们存在于基因组中而通过细胞分裂保持在细胞中。
在一些实施方式中，本发明提供表达本发明融合蛋白的稳定细胞系。快速制备稳定的蛋白高度表达的哺乳动物细胞系的一个适宜的方法是使用GPExTM表达系统(Gala Biotech，a business unit of Catalent Pharma Solutions，Middleton，WI.，Bleck，Gregory T.，Bioprocessingjournal.com 9月/10月2005第1-7页)。此方法可能必须制备基于MMLV的复制缺陷型的假型逆转录病毒载体并用载体转导哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。该载体可以整合到细胞的基因组中，从而产生稳定的细胞系。
分离的融合蛋白的纯化
本发明的分离的融合蛋白可以如下制备：培养适宜的宿主/载体系统以表达本发明DNA序列的重组翻译产物，然后使用本领域内熟知的技术将其从培养基或细胞提取物中纯化。
例如，首先可以使用市售蛋白浓缩过滤器(例如，Amicon或MilliporePellicon超纯过滤单元)浓缩上清液，该上清液来自将重组蛋白分泌到培养基的系统。浓缩步骤之后，将浓缩物应用到适宜的纯化基质上。例如，适宜的亲和基质可以包含：例如，结合在适宜支架上的AGE或凝集素或蛋白A或蛋白G或抗体分子。或者，可以采用阴离子交换树脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)侧基的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其他类型。或者，可以采用阳离子交换步骤。适宜的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不溶性基质。优选磺丙基。
细菌培养所制备的重组蛋白通常如下分离：首先从细胞团提取，然后是一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻层析步骤。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。重组哺乳动物RAGE表达中所采用的微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎，其包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞裂解剂。
以分泌蛋白形式表达本发明融合蛋白的酵母发酵很大程度上简化了纯化。得自大规模发酵的分泌的重组蛋白可以通过由Urdal等人(J.Chromatog.296：171，1984)所公开的那些类似的方法进行纯化。此参考文献描述了在制备性HPLC柱子上纯化重组人GMCSF的两个连续的、反相HPLC步骤。
药物组合物
本发明的融合蛋白可以适于给予有需要的患者的方式配制，例如可以配制成药物组合物。本发明的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理上适应的溶剂、分散介质、涂剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方式中，所述载体适于肠胃外给药。载体可适合于给药到中枢神经系统(例如，以脊柱内或脑内方式)。或者，所述载体可适合于静脉内、皮下、腹腔或肌内给药。在另一实施方式中，所述载体适于口服给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散剂(dispersion)和无菌可注射溶液或或分散剂的临时制剂的无菌粉末。药学上活性物质的这类介质和药剂的用途在本领域中是熟知的。任何常规的介质或药剂除非与本发明的融合蛋白不相容，否则其在本发明药物组合物中的用途也涵盖在本发明内。还可以将辅助活性化合物掺入组合物中。
适宜的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。通常本发明药物组合物的制备必须将本发明融合蛋白与下列物质的一种或多种混合：缓冲剂、抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(如，EDTA)、谷胱甘肽以及其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐或与同种血清白蛋白混合的盐水是示例性的合适稀释剂。
本发明融合蛋白的治疗性给药
本发明包括将本发明融合蛋白以药物组合物形式给予有需要的患者(例如，哺乳动物，尤其是人)，所述药物组合物包含本发明的融合蛋白和药物上可接受的稀释剂或载体。本发明还提供用此类组合物治疗人类疾病的方法。
通常，本发明的方法包括给予包含药学上有效量的本发明融合蛋白的药物组合物。所采用的药学上的有效量可以根据诸如个体的疾病状况、年龄、性别和体重等因素而改变。
本发明融合蛋白的药学上的有效量可以为：约1μg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约10μg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约100μg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约1mg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约10mg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约100mg融合蛋白/1kg患者体重至约500mg融合蛋白/1kg患者体重、或约100μg融合蛋白/1kg患者体重至约25mg融合蛋白/1kg患者体重、或约1mg融合蛋白/1kg患者体重至约25mg融合蛋白/1kg患者体重、或约5mg融合蛋白/1kg患者体重至约25mg融合蛋白/1kg患者体重、或约10mg融合蛋白/1kg患者体重至约25mg融合蛋白/1kg患者体重、或约15mg融合蛋白/1kg患者体重至约25mg融合蛋白/1kg患者体重、或约100μg融合蛋白/1kg患者体重至约10mg融合蛋白/1kg患者体重、或约1mg融合蛋白/1kg患者体重至约10mg融合蛋白/1kg患者体重、或约2.5mg融合蛋白/1kg患者体重至约10mg融合蛋白/1kg患者体重、或约5mg融合蛋白/1kg患者体重至约10mg融合蛋白/1kg患者体重、或约7.5mg融合蛋白/1kg患者体重至约10mg融合蛋白/1kg患者体重。
在一些实施方式中，本发明融合蛋白的药学上的有效量可以为：0.5mg融合蛋白/1kg患者体重、1mg融合蛋白/1kg患者体重、2mg融合蛋白/1kg患者体重、3mg融合蛋白/1kg患者体重、4mg融合蛋白/1kg患者体重、5mg融合蛋白/1kg患者体重、6mg融合蛋白/1kg患者体重、7mg融合蛋白/1kg患者体重、8mg融合蛋白/1kg患者体重、9mg融合蛋白/1kg患者体重、或10mg融合蛋白/1kg患者体重。
单位剂型是指适合用作待治疗的哺乳动物患者的单位剂量的物质离散单位；每个单位含有预定量的本发明融合蛋白，该预定量经计算能与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。本发明融合蛋白的单位剂型可以为：约1mg至约1000mg、约25mg至约1000mg、约50mg至约1000mg、约100mg至约1000mg、约250mg至约1000mg、约500mg至约1000mg、约100mg至约500mg、约200mg至约500mg、约300至约500mg、或约400mg至约500mg。本发明融合蛋白的单位剂量可以为约100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg或700mg。
本发明组合物可以以下水平包含本发明融合蛋白：组合物总重量的约0.1重量％至约20重量％、约0.1重量％至约18重量％、约0.1重量％至约16重量％、约0.1重量％至约14重量％、约0.1重量％至约12重量％、约0.1重量％至约10重量％、约0.1重量％至约8重量％、约0.1重量％至约6重量％、约0.1重量％至约4重量％、约0.1重量％至约2重量％、约0.1重量％至约1重量％、约0.1重量％至约0.9重量％、约0.1重量％至约0.8重量％、约0.1重量％至约0.7重量％、约0.1重量％至约0.6重量％、约0.1重量％至约0.5重量％、约0.1重量％至约0.4重量％、约0.1重量％至约0.3重量％、或约0.1重量％至约0.2重量％。
本发明的药物组合物可以以下水平包含一种或多种本发明融合蛋白：组合物总重量的约1重量％至约20重量％、约1重量％至约18重量％、约1重量％至约16重量％、约1重量％至约14重量％、约1重量％至约12重量％、约1重量％至约10重量％、约1重量％至约9重量％、约1重量％至约8重量％、约1重量％至约7重量％、约1重量％至约6重量％、约1重量％至约5重量％、约1重量％至约4重量％、约1重量％至约3重量％、或约1重量％至约2重量％。本发明药物组合物可以以下水平包含一种或多种本发明融合蛋白：以组合物的总重量计约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、或约9重量％。
可以调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以给予单次推注，可以随时间分几次给予剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性按比例减少或增加剂量。特别有利的是以单位剂型配制肠胃外组合物以方便药剂的给药和均一性。可以配制本发明的组合物，并通过静脉内、肌内或皮下注射方式给予。在一些实施方式中，本发明的组合物可以皮下或肌内方式给予。
在一些实施方式中，剂量方案可能要求给予重复剂量，例如，给予每周一次的剂量。治疗方案可能要求一段时间(例如，四周)的每周剂量，然后进行次数较少的“维持”剂量方案(例如，一月一次或两月一次)。可以调节剂量方案以取得期望的治疗结果。
本发明方法包括抑制人的AGE依赖性炎症反应的方法，该方法包括给予有效量的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本发明的融合蛋白。
本发明的方法包括抑制AGE介导的生物活性的方法，该方法包括给予包含一种或多种本发明的融合蛋白的药物组合物。如上文所讨论，AGE参与了多种疾病或病况，如自身免疫病。可以使用本发明的融合蛋白治疗、改善、检测、诊断、预测或监控的自身免疫紊乱疾病或病况包括但不限于：皮炎、肾小球肾炎、多发性硬化、葡萄膜炎性眼炎、自身免疫性肺炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性炎眼、系统性红斑狼疮、胰岛素耐受、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和硬皮病。
可以使用本发明方法治疗或预防的其他病症一般可以具有如下的特征：包括其中受影响的细胞显示RAGE或一种或多种RAGE配体表达升高的任何病症；或者可以通过降低RAGE功能治疗(即，可以消除或改善一个或多个症状)的任何病症。例如，RAGE功能可以通过给予破坏RAGE和RAGE配体之间相互作用的药剂来降低。
RAGE表达的增加与几种病理状态有关：如糖尿病性血管病变、肾病、视网膜病、神经病、以及其他病症，包括阿尔茨海默氏(Alzheimer)病和血管壁的免疫/炎性反应。RAGE配体在受包括关节炎(如类风湿性关节炎)在内的许多炎性病症影响的组织中产生。淀粉状蛋白在组织中的沉积引起对细胞的多种毒性效应，其是被称为淀粉样病变的疾病的特征。RAGE与β折叠纤维状材料结合，如在β淀粉样肽、Abeta、支链淀粉、血清淀粉样蛋白A和朊病毒源肽中所发现的。RAGE还以升高的水平在具有淀粉样蛋白结构的组织中表达。因此，RAGE参与了淀粉样蛋白病症。RAGE-淀粉样蛋白相互作用被认为能导致氧化应激，该氧化应激会导致神经元退化。
多种RAGE配体，尤其是S100/钙粒蛋白、两性素(HMGB1)家族的那些在发炎的组织中产生。这种观察现象在急性炎症(如对脂多糖刺激(如在脓毒中)的反应中所看到的)和慢性炎症(如在各种形式的关节炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病等中所看到的)中都是确定的。心血管疾病，且尤其是从动脉粥样硬化斑块产生的那些也被认为是具有实质的炎性组分。此类疾病包括闭塞性疾病、血栓性疾病和栓塞性疾病，分别如咽峡炎、脆性斑块病症(fragile plaquedisorder)和脑栓塞。肿瘤细胞还显示出RAGE配体(尤其是两性素)的表达增高，这表明癌症也是RAGE相关的病症。此外，慢性炎症的氧化作用和其他方面可能对某些肿瘤的发生起作用。
AGE是类风湿性关节炎和其他炎性疾病的治疗靶标。
因此，可以用本发明组合物治疗的RAGE相关病症除了上述自身免疫性疾病之外还包括：淀粉样病变(例如阿尔茨海默氏病)、克隆氏(Crohn)病、急性炎性疾病(例如，脓毒)、休克(例如，败血性休克、出血性休克)、心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、中风、脆性斑块病症、咽峡炎和再狭窄)、糖尿病(尤其是糖尿病中的心血管疾病)、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、癌症、血管炎和其他血管炎综合征，如坏死性血管炎(necrotizing vasculitide)、肾病、视网膜病和神经病。
下列实例仅为示例目的提供，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
下列实施例中，小鼠实验使用融合蛋白进行，该融合蛋白包含与铰链区融合的小鼠RAGE的胞外结构域(氨基酸残基1-342)、小鼠IgG2a重链FC区域的CH2和CH3结构域。构建体使用GPExTM表达系统在CHO细胞中表达。所用的小鼠RAGE序列在下表中提供。
表9(SEQ ID NO：11)小鼠RAGE序列
MPAGTAARAW VLVLALWGAV AGGQNITARI GEPLVLSCKG APKKPPQQLE WKLNTGRTEA
WKVLSPQGGP WDSVARILPN GSLLLPATGI VDEGTFRCRA TNRRGKEVKS NYRVRVYQIP
GKPEIVDPAS ELTASVPNKV GTCVSEGSYP AGTLSWHLDG KLLIPDGKET LVKEETRRHP
ETGLFTLRSE LTVIPTQGGT HPTFSCSFSL GLPRRRPLNT APIQLRVREP GPPEGIQLLV
EPEGGIVAPG GTVTLTCAIS AQPPPQVHWI KDGAPLPLAP SPVLLLPEVG HEDEGTYSCV
ATHPSHGPQE SPPVSIRVTE TGDEGPAEGS VGESGLGTLA

GS VRAPQVYVLP
PPEEEMTKKQ VTLTCMVTDF MPEDIYVEWT NNGKTELNYK NTEPVLDSDG SYFMYSKLRV
EKKNWVERNS YSCSVVHEGL HNHHTTKSFS RTPGK
其中RAGE信号肽＝下划直线；RAGE胞外结构域＝无下划线；和小鼠IgG2aCH3区域＝下划曲线。
实施例1：
在小鼠中本发明的RAGE融合蛋白对链脲佐菌素诱导的糖尿病的影响。
小鼠中链脲佐菌素诱导的糖尿病是本领域内公认的用于糖尿病诱导的视网膜改变的模型(参见IG，Drel VR，Kumagai AK，Szabo C，Pacher P，Stevens MJ.Early diabetes-induced biochemical changes in the retina：comparison of ratand mouse models.Diabetologia.2006 Oct：49(10)：2525-33.)。
本实验包括5个处理组，每组有15只C57BL/6小鼠：1)非糖尿病对照；2)含有糖尿病对照的小鼠，在研究前连续5天以45mg/kg的链脲佐菌素处理开始诱导糖尿病；3)还接受10μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；4)还接受100μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；以及5)还接受300μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周。
在研究期间，评估小鼠的体重、血糖、糖血红蛋白(GHb)、蛋白尿和触觉敏感性(作为感觉神经功能的量度)。在研究最后将小鼠处死，使用荧光探针评估视网膜血管透性、白细胞对视网膜毛细血管的粘附和NF-κB-调节的蛋白表达(COX、ICAM、iNOS)。
来自历时两个月的研究的结果
研究了在C57BL/6J小鼠中RAGE-Ig融合蛋白对糖尿病诱导的视网膜生理和代谢改变的发展的影响。以3种不同的浓度(10μg、100μg和300μg)腹腔给予融合蛋白，每周3次。没有看到任何剂量的药物对糖尿病小鼠的体重增益或总体健康有不利影响。在非糖尿病对照、糖尿病对照、糖尿病+10μgRAGE-Ig融合蛋白、糖尿病+100μg RAGE-Ig融合蛋白和糖尿病+300μgRAGE-Ig融合蛋白组中的非禁食血糖水平分别为155±24mg/dl(均值±SD)、358±38、417±36、376±36和370±55。
在短期研究中测量的视网膜病相关的参数为(1)白细胞淤滞、(2)视网膜血管对内源性白蛋白的透性、(3)视网膜蛋白的硝化、以及(4)视网膜ICAM和COX-2的表达。
1.白细胞淤滞
方法：在糖尿病2个月时，通过经由心脏导管完全灌注PBS从麻醉的动物的脉管系统去除血液。然后按之前所述用荧光素偶联的伴刀豆球蛋白A凝集素(20μg/ml，在PBS中；Vector Laboratories，Burlingame，CA)灌注动物(参见Joussen等人，FASEB J.2004 Sep；18(12)：1450-2)。通过荧光显微镜使平铺视网膜成像，对粘附到血管壁的白细胞数进行计数。
结果：在糖尿病2个月的小鼠中显示出与非糖尿病小鼠相比显著增加的白细胞淤滞(P＜0.05)。白细胞淤滞在用RAGE-Ig融合蛋白处理的任何组织都没有受到抑制(参见图1)。
2.血管透性
方法：在糖尿病2个月时，将眼睛进行冰冻切片(10μm)，在甲醇中固定10分钟，在PBS中洗涤4次。将各切片在山羊抗小鼠血清白蛋白(Abcam，Cambridge MA；AB8940；1∶2000稀释)中孵育2小时。洗涤，然后将切片在FITC标记的二抗(AB 6743；1∶1000稀释)中孵育90分钟。在荧光显微镜下，测定4个视网膜层(内网层、内核层、外网层、外核层)中的每层在3个不同位置的平均荧光量。各位置的荧光量是10次随机测量的平均值，各视网膜层的荧光量是该层内3个不同位置的荧光平均值。
结果：
在所研究的4个视网膜层的每个中糖尿病都引起非血管性视网膜中荧光强度显著增加(即，由于白蛋白泄漏到血管外)。该结果显示在图2中(2A内网层、2B内核层、2C外网层、2D外核层)。为了评估内核层和外核层中的白蛋白，我们有意地测量了核之间的薄间距，所以这些数字可能不如来自网层的那些有力，在网层中没有核破坏我们的测量。
3.视网膜蛋白的硝化
方法：在糖尿病2个月时，分离视网膜并将其匀浆化。进行斑点印迹，将来自每只动物的50μg蛋白匀浆点印到硝酸纤维素膜上。将膜用牛奶(5％)封闭、洗涤、用抗硝基酪氨酸(Upstate Biotechnology，Inc.#05-233；1∶500稀释)免疫染色2小时，然后用二抗(Bio-Rad山羊抗小鼠IgG-HRP结合物；1∶1000稀释)染色1小时。充分洗涤，然后通过增强化学发光法(ECL，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)使通过抗体检测的免疫染色显像。免疫染色依赖性的化学发光记录在膜上，对免疫染色的点的密度进行定量。结果表示为非糖尿病对照中检测的值的百分比。
结果：
结果显示在图3中。来自糖尿病小鼠的视网膜匀浆显示了预期的蛋白硝化增加。治疗以剂量依赖方式抑制了这种翻译后修饰。蛋白的硝化被认为是氧化应激和硝化应激的参数。
4.视网膜ICAM和COX-2的表达
方法：分离视网膜并对其进行超声处理，将上清液用作全视网膜提取物。通过SDS-PAGE将样品(50μg)分馏，电转染到硝酸纤维素膜上，在含有0.02％吐温20和5％脱脂牛奶的Tris缓冲盐中封闭膜。使用ICAM-1抗体(1∶200稀释；Santa Cruz Biotechnology)和COX-2抗体，然后用二抗1小时。洗涤，然后通过增强化学发光法使结果可视化。
结果：
结果显示在图4中，由于ICAM-1在内皮细胞上的表达在白细胞向血管壁的粘附(白细胞淤滞)中起着关键的作用，我们测量了糖尿病和治疗对视网膜中ICAM-1表达的影响。两个月的糖尿病确实引起了视网膜ICAM-1表达的显著增加。RAGE-Ig融合蛋白的给药导致了ICAM表达剂量依赖性的降低，最高剂量显著抑制了这种表达。
与COX-2分子量一致的免疫染色条带的表达在糖尿病中没有增加，在得到治疗的动物中也没有改变(未显示)。
在RAGE-Ig融合蛋白作用的这种短期研究中选择了终点用途，因为发现所有都与早期(退行)糖尿病性视网膜病的发展有关，即，已发现抑制糖尿病诱导的视网膜毛细血管退化的各种治疗也抑制这些缺陷。
RAGE的抑制并不抑制与视网膜中血管透性和硝化应激相关的异常现象。硝化应激还被认为是氧化应激的标记。然而，RAGE抑制剂不抑制与白细胞淤滞相关的异常现象。
实施例2：
在小鼠中本发明的RAGE融合蛋白对长期链脲佐菌素诱导的糖尿病的影响。
小鼠中链脲佐菌素诱导的糖尿病是本领域内公认的用于糖尿病诱导的视网膜改变的模型(参见IG，Drel VR，Kumagai AK，Szabo C，Pacher P，StevensMJ)。Early diabetes-induced biochemical changes in the retina：comparison ofrat and mouse models.Diabetologia.2006 Oct：49(10)：2525-33.)
本长期实验包括5个处理组，每组有25只C57BL/6小鼠：1)非糖尿病对照；2)含有糖尿病对照的小鼠，研究前连续5天以45mg/kg的链脲佐菌素处理开始诱导糖尿病；3)还接受10μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；4)还接受100μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；以及5)还接受300μg/天的mRAGE-IgG2aFc腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周。
在研究期间，评估小鼠的体重、血糖、糖血红蛋白(GHb)、蛋白尿和触觉敏感性(作为感觉神经功能的量度)。在研究最后将小鼠处死，定量评估视网膜中的组织病理和神经退行性变。
在长期研究中测量的视网膜病相关的参数为(1)无细胞毛细血管、(2)周影细胞和(3)神经节细胞。还在长期研究中测量了作为外周神经病变标记的爪子对轻触的敏感性。
糖尿病诱导的视网膜组织病理
在糖尿病10个月后，将眼睛固定在福尔马林中，从每只动物中分离一个视网膜，在流动的自来水中洗涤过夜，在粗制胰岛素溶液中消化2小时，如我们之前所报道的那样。通过用单根头发制成的“刷子”轻轻移去神经细胞分离视网膜脉管系统。当神经细胞全部清除后，将所分离的脉管系统展放在显微镜载玻片上，干燥过夜，用苏木精和高碘酸-希夫(Schiff)染色，脱水并盖上盖玻片。退行性(无细胞)毛细血管在对应于遮蔽形式的中间视网膜(200×放大倍率)的6-7个视野里定量。无细胞毛细血管鉴定为在沿其长度上任何地方都没有核的毛细血管大小的血管，以每平方毫米视网膜面积的值报告。周影细胞由周细胞消失的毛细血管基膜中伸出的“肿块”的普遍性来估计。至少检测了遮蔽形式的中间视网膜(400×放大倍率)的5个视野内的1,000个毛细血管细胞(内皮细胞和周细胞)。排除任何已经是无细胞血管的影细胞。
为了研究糖尿病对视网膜神经退行性变的影响，对神经节细胞层的细胞进行计数。将经福尔马林固定的眼睛包埋在石蜡中，通过视网膜穿过视神经纵向切片，用苏木精-伊红染色。神经节细胞层中的细胞数在视神经两侧的两个区域内(中间视网膜和临近视神经的后部视网膜)进行计数。对视神经两侧的相当的区域取平均值，表示为每单位长度的数。
结果：如根据前面的工作所预期的，长期糖尿病导致了视网膜中退行性无细胞毛细血管数显著增加(图5A)。RAGE-Ig融合蛋白的所有剂量都显著地抑制这种毛细血管退行，而对高血糖的严重程度没有任何影响。糖尿病还倾向于增加周细胞退化(周影细胞)，但是其结果没有达到统计学显著性的程度(图5B)。我们之前发现在糖尿病C57BL/6小鼠中检测周细胞丢失比糖尿病大鼠或更大的物种中要难得多，我们现在认为它在此模型中是血管疾病的不可靠参数。可能结果在对照糖尿病中没有检测到显著的周细胞丢失，我们在这些小鼠中没有检测到RAGE-Ig融合蛋白对周细胞丢失的任何影响。
在这些C57BI/6小鼠中糖尿病并不诱导视网膜神经节细胞层中细胞数目的减少(即，神经退行性变)。此结果与此小鼠模型之前的研究一致。在不存在糖尿病对视网膜神经退行性变影响的情况下，我们不能估计抑制剂是否会对神经退行性变有影响。
对轻触的敏感性(外周神经病的标记)
患有糖尿病性神经病的患者可能表现出多种异常的感觉，包括自发疼痛，轻触引起的疼痛以及感觉过敏。不断增加的数据表明糖尿病啮齿动物会再现这种感觉过敏并发展触觉异常痛敏(tactile allodynia)。在啮齿动物中，将这测量成爪子触觉反应阈值。
方法：将小鼠(糖尿病8个月)转移到钢丝网底的测试笼中，使其适应10至15分钟。使用测痛丝(Von Frey filaments)测定缩足反射的50％机械缩足反射阈值。将一系列硬度呈对数增加的细丝(以屈曲重为0.6g的那根开始)以能引起细丝屈曲的压力顺次施加到右后爪的脚底面上。将爪子抬起记录为阳性反应，选择较轻的细丝用于下一个测量。如果5秒后没有反应，则在之后选择接下来最重的细丝使用。继续此方法，直到在最初的行为改变后进行了4次测量或直到发生了5次连续的阴性(6g)或4次连续阳性(0.4g)反应。使用所得的阳性和阴性评分顺序计算50％缩足反应阈值。
结果：糖尿病显著增加了爪子对轻触的敏感性，这表明糖尿病动物与非糖尿病动物相比需要较低量的压力来缩回它们的爪子(图6)。这种糖尿病诱导的缺陷能被各剂量的sRAGE-Ig融合蛋白显著抑制。
视网膜病：使用RAGE-Ig融合蛋白的研究采用2种持续时间的糖尿病进行。(1)长期(10个月)研究以评估治疗对小鼠中发展的糖尿病性视网膜病的长期组织病理的影响；以及(2)2-3个月的研究以评估可能对长期组织病理产生影响的治疗的生理和分子效应。选择了关于RAGE-Ig融合蛋白影响的生理和分子终点研究是因为在其他研究中发现它们均与早期(退行)糖尿病性视网膜病的发展有关(很可能有原因地相关)。所有三个剂量的治疗均清楚且显著地抑制糖尿病诱导的视网膜脉管系统退化。同样，所有三个剂量的药剂似乎也都抑制这些小鼠中糖尿病诱导的视网膜透性增加。这些结果具有重要的临床意义，因为早期(非增殖阶段)糖尿病性视网膜病仍然是基于血管病理(血管阻塞和退化以及透性增加)定义的。
治疗对来自糖尿病小鼠的视网膜中测量的分子和生理终点的影响是混合的。RAGE的抑制确实抑制与硝化应激相关的异常现象，硝化应激是视网膜中氧化应激的标记。然而，RAGE抑制剂不抑制与白细胞淤滞相关的异常现象。所述治疗缺乏对白细胞淤滞的影响是令人吃惊的，因为另一研究小组最近报导了他们的sRAGE确实能抑制糖尿病中白细胞淤滞的增加。然而我们使用RAGE-Ig融合蛋白开始研究时产生的证据(Diabetes 57：1387-93，2008)表明药物治疗对糖尿病中视网膜白细胞淤滞的效应并不预示所述治疗对糖尿病中视网膜毛细血管退化的效应。因此，所述治疗缺乏对视网膜白细胞淤滞的效应也决不会削弱所观察到的药物效应的意义。
令人惊奇地，药物对糖尿病动物视网膜中ICAM-1的表达和蛋白的硝化的影响似乎具有剂量效应，然而此剂量效应对于视网膜毛细血管透性和退化则不明显。这似乎表明ICAM和硝化均不参与糖尿病中视网膜血管的缺陷，尽管我们使用ICAM-1敲除动物的数据与此结论矛盾。
很清楚的是所述药物确实到达了视网膜，确实施加了生物效应，并且确实显示了至少抑制糖尿病性视网膜病的早期血管病变的显著药物能力。
感觉神经病：其他人员已经假定晚期糖化终末产物(AGE)和这些AGE与RAGE的相互作用能诱导氧化应激，上调神经中的NF-kB和各种NF-kB介导的促炎基因，并促进神经功能障碍，包括改变的痛觉。本发明的数据与RAGE介导的信号传导促进糖尿病性神经病至少一些方面的发展的证据相一致，并且提供了sRAGE-Ig融合蛋白在长期研究中抑制此过程的证据。
实施例3：
使用II型胶原诱导的关节炎小鼠模型的RAGE-Ig融合蛋白评定
用II型胶原免疫敏感性小鼠品系，II型胶原是关节软骨的主要组分，其诱导进行性炎性关节炎(Wooley等人Journal of Experimental Medicine 1981；154：688-700)。胶原诱导的关节炎(CIA)在临床上的表征为红斑和水肿，受影响的爪子宽度增加通常为100％。已经开发出一种临床评分指数来评估关节变形和脊椎炎的疾病进展(Wooley，Methods In Enzymology 1988；162：361-373)。受影响的关节的组织病理表现出滑膜炎、关节翳形成、以及软骨和骨质糜烂，它们还可以用指数来表示。免疫实验室的结果包括高的II型胶原抗体水平和高丙球蛋白血症。现在已经很好地建立了此模型以测试关节疾病的免疫治疗方法(Staines等人British Journal of Rheumatology 1994；33(9)：798-807)，并且已经将其成功地用于生物和药理学药剂治疗类风湿性关节炎(RA)的研究(Wooley等人Arthritis Rheum 1993；36：1305-1314；Wooley等人Journal ofImmunology 1993；151：6602-6607)。
gAGE受体的拮抗被认为是RA的潜在治疗靶标。在患有胶原诱导的关节炎的小鼠中阻断gAGE会导致关节炎的临床和组织学迹象降低，疾病改善与关节炎爪子组织中TNFα、IL-6和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13水平降低有关(Hofmann等人。Genes Immun 2002；3(3)：123-135)。这表明胶原诱导的关节炎对RAGE靶向的治疗是敏感的。
此试验将评估在用II型胶原免疫时开始给予的三个剂量的RAGE-Ig融合蛋白对CIA的影响。实验设计显示在图7中。
自Jackson实验室获得40只8-10周龄的DBA/1LacJ小鼠，实验之前让它们在实验室中适应至少10天。在实验开始时所有动物重量均大于16克。将小鼠分在以下4个处理组之一中：1)每天腹腔注射100μl无菌PBS；2)每天腹腔注射100μl含有10μg RAGE-Ig融合蛋白的无菌PBS；3)每天腹腔注射100μl含有100μg RAGE-Ig融合蛋白的无菌PBS；和4)每天腹腔注射100μl含有300μg RAGE-Ig融合蛋白的无菌PBS。
初次给药3天后，在所有小鼠尾巴基部皮内注射在弗氏(Freund)完全佐剂(FCA)中的100μg牛II型胶原。通过每天检测疾病的发作(其被记录下来)来监控小鼠。每周称重小鼠，并记录总体健康状况。对受关节炎影响的动物进行临床估计，每周5次直到免疫后10周，爪子测量每周进行3次。在免疫后10周没有关节炎体症的小鼠被认为是疾病阴性的。
结果
总体健康和毒性在试验期间没有急性中毒事件发生，实验持续期间所有动物都存活。治疗耐受良好，没有观察到不利的体症，如毛发缠结或刺激。小鼠重量(图8)表明在试验过程中重量轻微改变，其通常由于各动物对应于疾病发作的短暂重量损失。这些变化在组间都没有达到统计学显著的程度。
关节炎的发病率和发作试验中胶原关节炎的最终发病率显示在图9中。对照小组达到100％发作，这在经典的胶原关节炎模型中是不常见的，经典的胶原关节炎模型中通常发病率介于80％-100％。用10μg/天RAGE处理小鼠达到了80％的发病率，发病率没有显著降低。用100μg/天RAGE处理的小鼠显示出60％的关节炎发病率，该发病率显著低于对照组(p＜0.05)。令人惊奇的是用300μgRAGE处理的小鼠中关节炎发病率为100％，因此与对照发病率类似。
疾病发作的天数的平均值(和SEM)显示在图10中。疾病发作在对照组中是典型的，第一次出现关节炎的平均天数是38.6。用10μg或100μg RAGE处理的小鼠中疾病发作表面上延迟到42.5，其并没有达到统计学显著的程度。然而，疾病发作在用300μg RAGE处理的小鼠中则显著延迟(p＜0.05)。因此，尽管高剂量的小鼠不显示疾病发病率的降低，但是临床上明显的关节炎发展的时间则明显增加。
通过RAGE处理对疾病发作的调控可以容易地通过疾病发病率与时间的曲线来估计(图11)。对照组中观察到了典型的CIA的快速疾病发作特征，用10μg或100μg RAGE处理的小鼠的结果是疾病发作延迟，关节炎最终发病率降低。约8周后，用300μg RAGE处理的小鼠以类似的模式发展疾病，但是一系列晚期的关节炎动物导致疾病发病率高但疾病发作延缓。
疾病严重程度和进展处理动物和对照动物中累积关节评分的分析表现出RAGE治疗对胶原诱导的关节炎严重程度的显著影响(图12)。对照小鼠发展为典型的慢性进行性疾病，累积的关节炎指数显著增加。相反，用任何剂量的RAGE处理的小鼠都显示出显著的关节炎评分降低。自免疫后43天开始对照和处理组之间的差异达到了统计学显著(p＜0.001)的高水平，而且这种差异在整个试验中都保持着。尽管100μg/天的RAGE治疗取得最低的关节炎累积评分，但是在RAGE组之间的关节炎评分没有显著差异，这表明取得了阈值”效应，而不是经典的剂量依赖效应。
对RAGE治疗对关节炎爪子数的影响的分析(图13)显示出对疾病进展的显著影响。再次，从43天开始观察到了对所涉及的爪子数目的显著影响。显著性水平在p＜0.001至p＜0.025内变化，这可能反映了RAGE对疾病严重程度的影响比对关节炎进展的影响更为显著；然而，所涉及的爪子的最大数量(40)则比最大的累积疾病评分(120)更为有限。同样，在RAGE处理组之间没有显著变化，尽管100μg RAGE组显示出最高水平的关节炎延迟。
结果表明RAGE蛋白的给药在使用预防性方案给予时对胶原诱导的关节炎产生了明显的影响。任何剂量的RAGE注射都没有明显的毒性作用，并且处理似乎是良好耐受的。在每天接受100μg的小鼠中总体疾病发病率显著降低，在用300μg/天处理的小鼠中观察到疾病发作的延迟。然而，临床活性最明显的指征是在疾病评分和关节炎爪子计数的降低中所观察到的，其中自免疫后43天开始检测到了RAGE处理的小鼠与对照动物之间的明显区别。在此方面，对照小鼠经受了典型的重度关节炎进展，而所有剂量的RAGE处理都会延迟疾病进展。
组织病理学评估在完成临床评估研究时取出所有小鼠的四肢，储存在福尔马林中性缓冲溶液中。在10％甲酸中将关节脱钙18天，脱水，包埋在石蜡块中。沿纵轴切片，固定，并用苏木精和伊红或甲苯胺蓝染色。将样本切至约中线，然后固定径向中心的样品进行评定。这使得能够进行一致的形貌评定。固定5至10个样品(通常为每个载玻片4至6个样品)。染色后，用盖玻片永久性地粘合载玻片。以盲态方式评定至少每个样本的3个独立切片，评定者不知道组的分配。在前肢，对所有肘、腕和掌关节进行评分，而所有的膝、踝、跖关节则用后瓜评分。不评价趾，因为切片步骤除去了大部分的PIP关节。对载玻片进行滑膜炎、关节翳形成、边缘糜烂和结构改变(大部分是半脱位)和破坏的存在的评定。然后将基于这些收集点的总体评分赋值给各切片。评分系统基于如下：
滑膜炎通过滑膜厚度来判断，如下评分：小于3个细胞厚为0；3至5个细胞厚为1；6至10个细胞厚为2；10-20个细胞厚为3；20-30个细胞厚为4。
关节翳形成如下评分：无关节翳为0；存在微绒毛为1；清楚的关节翳附着为2；明显的关节翳附着为3；关节空间被关节翳填充为4。
边缘糜烂如下评分：无可见的糜烂为0；囊连接区域内微小的凹痕为1；清楚的软骨糜烂为2；糜烂延伸到软骨下骨为3；骨和软骨严重糜烂为4。
结构改变如下评分：正常关节结构为0；水肿性改变为1；关节面轻微半脱位为2；关节面严重半脱位为3；完全纤维化和胶原桥连为4。
总体评分反映如下：经典的正常关节外观为0；微小变化为1，与缓解期一致，可为临床正常；确定的炎性关节炎为2；严重的炎性糜烂性疾病为3；损坏的糜烂性关节炎为4。
软骨和骨基质降解使用甲苯胺蓝组织化学染色对连续切片进行软骨基质组分染色。评定了甲苯胺蓝切片的蛋白聚糖丢失。将关节面的染色与生长板染色相比较，如下评分：无蛋白聚糖丢失为0，正常甲苯胺蓝染色；微量蛋白聚糖丢失为1，表面软骨染色有些丢失；中度蛋白聚糖丢失为2，表面软骨有弱染色；显著的蛋白聚糖丢失为3，表面软骨无甲苯胺蓝染色；严重蛋白聚糖丢失为4，软骨深处无甲苯胺蓝染色。
结果
胶原诱导的关节炎的组织病理学结果。评估切片的疾病炎性参数和糜烂参数。关节炎的外观(图14)表明了在对照(PBS处理)组中此时间点有典型的炎性糜烂性病理学，具有滑膜肥大和滑膜增生的典型关节炎特征，具有显著的关节翳附着和边缘糜烂。
10μg/ml RAGE-Ig融合蛋白的处理(图14B)导致了炎性参数和糜烂性参数的适度改变，糜烂和受损软骨表面的外观总体改善。用100μg/ml RAGE-Ig融合蛋白的处理(图14C)导致关节翳形成和糜烂与对照相比较减少，并且总体差异相当明显。然而，300μg/ml RAGE-Ig融合蛋白的给药(图14D)则导致了比盐水对照中所看到的病理状况严重程度似乎略低的关节炎，但是还相当严重，具有滑膜肥大和滑膜增生，具有显著的关节翳附着和边缘糜烂。
炎性评分的分析(图15)表明所有剂量的RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠与对照(盐水处理)动物相比炎症减少。然而，仅在100μg/ml组中滑膜炎显著减少p＜0.05)，关节翳形成显示出与评分中类似的减少(p＜0.03)。使用10μg/ml或300μg/ml的RAGE-Ig融合蛋白观察到的炎性疾病参数的减少没有达到统计学显著的程度。
胶原诱导的关节炎的糜烂性特征(关节结构中的糜烂和改变)改变的评估显示了类似的影响模式。观察到用100μg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的组与对照(盐水处理)的动物相比关节糜烂显著减少(p＜0.01)(图16)，而在用10μg/ml和300μg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠中观察到的减少则没有达到显著程度。
组织病理学参数与总体组织学关节炎评分的组合(图17)反映了个体病理参数的结果。对照(盐水)处理的动物与100μg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠之间观察到了的显著的差异(p＜0.02)，10μg/ml处理的小鼠中总体评分刚达到显著程度(p＝0.05)，而使用300μg/ml RAGE-Ig融合蛋白则没有观察到总体疾病评分的显著减少。
检测甲苯胺蓝染色的切片以测定RAGE-Ig融合蛋白是否对关节炎性关节的基质蛋白丢失有影响。数据(显示在图18和19中)表明RAGE-Ig融合蛋白确实能防止蛋白聚糖丢失，但是这种影响仅在100μg/ml剂量下是统计学显著的(p＜0.05)。PBS对照组显示了严重的软骨基质(蛋白聚糖和胶原)丢失，在用300μg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠中看到了在近侧关节面染色的显著丢失。相反，给予10μg/ml或100μg/ml RAGE-Ig融合蛋白则很好地保存了基质蛋白。
组织学结果证明了表明下列现象的临床数据：用RAGE-Ig融合蛋白处理胶原诱导的关节炎导致了对疾病发病率和严重程度的影响。组织学参数在100μg/ml处理的小鼠中达到了统计学上显著的高水平，并且在用10μg/ml处理的小鼠中总体的病理情况达到了统计学显著的程度。根据评定，100μg/ml的RAGE-Ig融合蛋白良好保持了关节结构，并且所有关节炎参数显著降低。总体印象是RAGE-Ig融合蛋白阻断了关节炎的糜烂期，因为炎症改变程度所受的影响比次级疾病参数要小。用300μg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠没有受到与低剂量相同程度的保护，再次得出了对此水平蛋白给药的抑制性反应的可能性。总体上，这些结果与研究中进行的临床观察一致，证明了RAGE-Ig融合蛋白可以起到抗关节炎的作用。
尽管本发明参考其具体实施方式进行了详细描述，但是对本领域的普通技术人员显而易见的是可以在不背离本文的精神和范围的情况下对本文进行各种修改和变型，这些修改和变型可以在随附权利要求书的范围内进行。本文所有的专利和公开物都以引用方式并入本文，引用的程度如同各单独的公开物全文特别且单独地以引用方式并入一般。
本申请要求2007年6月14日提交的专利号为60/943,994的美国临时申请的优先权，其全部内容具体并入本文作为参考。
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序列表
<110>卡拉狄加制药公司
 
<120>RAGE融合蛋白
 
<130>14895-00001-WO
 
<150>60/943,994
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<170>PatentIn 3.4版
 
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acacagaaga gcctctccct gtctctcggg aaatga                            2016
 
<210>2
<211>671
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>2
 
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn
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Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp
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Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys
    130                 135                 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
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Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln
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Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu
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Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro
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Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr
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Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met
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Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu
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Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr
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His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile
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Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
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Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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<210>3
<211>2037
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>3
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gtggggacat gtgtgtcaga gggaagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat    480
gggaagcccc tggtgccgaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac    540
cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga    600
gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg    660
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accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc    1800
aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac    1860
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<210>4
<211>678
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>4
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
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Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn
            100                 105                 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp
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Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys
    130                 135                 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
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Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln
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Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu
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Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys
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Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro
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Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu
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Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr
                245                 250                 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met
            260                 265                 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu
        275                 280                 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr
    290                 295                 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile
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Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
                325                 330                 335
Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala
            340                 345                 350
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
        355                 360                 365
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
    370                 375                 380
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
385                 390                 395                 400
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
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Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
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Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
        435                 440                 445
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Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465                 470                 475                 480
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                485                 490                 495
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            500                 505                 510
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        515                 520                 525
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    530                 535                 540
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
545                 550                 555                 560
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                565                 570                 575
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
            580                 585                 590
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        595                 600                 605
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    610                 615                 620
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
               645                 650                 655
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        675
 
<210>5
<211>2016
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>5
atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta  60
gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg  120
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gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt  360
cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag  420
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gggaagcccc tggtgccgaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac  540
cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga  600
gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgacg ccgggccttg  660
cacacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg  720
gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctggtggaa ccgtaaccct gacctgtgaa  780
gtccctgccc agccctctcc tcaaatccac tggatgaagg atggtgtgcc cttgcccctt  840
ccccccagcc ctgtgctgat cctccctgag atagggcctc aggaccaggg aacctacagc  900
tgtgtggcca cccattccag ccacgggccc caggaaagcc gtgctgtcag catcagcatc  960
atcgaaccag gcgaggaggg gccaactgca ggctctgtgg gaggatcagg gctgggaact  1020
ctagccctgg ccgcttccac caagggccca tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg  1080
agcacctccg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg  1140
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc  1200
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg  1260
ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag  1320
agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg  1380
ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc  1440
cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac  1500
tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc  1560
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc  1620
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc  1680
tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag  1740
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac  1800
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc  1860
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg  1920
tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac  1980
acacagaaga gcctctccct gtctctcggg aaatga                            2016
 
<210>6
<211>671
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>6
 
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn
            100                 105                 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp
        115                 120                 125
Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys
    130                 135                 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
145                 150                 155                 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln
                165                 170                 175
Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu
            180                 185                 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Leu His Thr Ala Pro
    210                 215                 220
Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu
225                 230                 235                 240
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr
                245                 250                 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met
            260                 265                 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu
        275                 280                 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr
    290                 295                 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
                325                 330                 335
Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
            340                 345                 350
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
        355                 360                 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
    370                 375                 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385                 390                 395                 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
                405                 410                 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
            420                 425                 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
        435                 440                 445
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
    450                 455                 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465                 470                 475                 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
                485                 490                 495
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
            500                 505                 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
        515                 520                 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
    530                 535                 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
545                 550                 555                 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
            580                 585                 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
        595                 600                 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
    610                 615                 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625                 630                 635                 640
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
                645                 650                 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660         665                 670
 
<210>7
<211>2037
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>7
atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta  60
gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg  120
gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct  180
tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc  240
aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag  300
gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt  360
cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag  420
gtggggacat gtgtgtcaga gggaagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat  480
gggaagcccc tggtgccgaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac  540
cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga  600
gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgacg ccgggccttg  660
cacacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg  720
gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctggtggaa ccgtaaccct gacctgtgaa  780
gtccctgccc agccctctcc tcaaatccac tggatgaagg atggtgtgcc cttgcccctt  840
ccccccagcc ctgtgctgat cctccctgag atagggcctc aggaccaggg aacctacagc  900
tgtgtggcca cccattccag ccacgggccc caggaaagcc gtgctgtcag catcagcatc  960
atcgaaccag gcgaggaggg gccaactgca ggctctgtgg gaggatcagg gctgggaact  1020
ctagccctgg ccggtagcgg ctccggaagt ggggcttcca ccaagggccc atccgtcttc  1080
cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc  1140
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc  1200
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg  1260
accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc  1320
agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc  1380
ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac  1440
actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa  1500
gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca  1560
aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg  1620
caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg  1680
tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac  1740
accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc  1800
aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac  1860
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg  1920
ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat  1980
gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctcgg gaaatga     2037
 
<210>8
<211>678
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>8
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn
            100                 105                 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp
        115                 120                 125
Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys
    130                 135                 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
145                 150                 155                 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln
                165                 170                 175
Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu
            180                 185                 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Leu His Thr Ala Pro
     210                 215                 220
Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu
225                 230                 235                 240
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr
                245                 250                 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met
            260                 265                 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu
        275                 280                 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr
    290                 295                 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
                325                 330                 335
Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala
            340                 345                 350
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
        355                 360                 365
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
    370                 375                 380
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
385                 390                 395                 400
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
                405                 410                 415
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
            420                 425                 430
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
        435                 440                 445
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
    450                 455                 460
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465                 470                 475                 480
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                485                 490                 495
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            500                 505                 510
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        515                 520                 525
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    530                 535                 540
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
545                 550                 555                 560
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                565                 570                 575
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
            580                 585                 590
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        595                 600                 605
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    610                 615                 620
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
625                 630                 635                 640
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
                645                 650                 655
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        675
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>9
 
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1               5                   10
 
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>合成肽
 
<400>10
 
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1               5
 
<210>11
<211>575
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>11
 
Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Ile Leu Pro Asn
65                  70                  75                  80
Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe
                85                  90                  95
Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr
            100                 105                 110
Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro
    115                 120                 125
Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val
    130                 135                 140
Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly
145                 150                 155                 160
Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr
                165                 170                 175
Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr
            180                 185                 190
Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe
        195                 200                 205
Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile Gln
    210                 215                 220
Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu Val
225                 230                 235                 240
Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
                245                 250                 255
Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys Asp
            260                 265                 270
Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu
        275                 280                 285
Val Gly His Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro
    290                 295                 300
Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr Glu
305                 310                 315                 320
Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly Leu
                325                 330                 335
Gly Thr Leu Ala Leu Ala Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
            340                 345                 350
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
        355                 360                 365
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
    370                 375                 380
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
385                 390                 395                 400
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
                405                 410                 415
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
            420                 425                 430
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
        435                 440                 445
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
    450                 455                 460
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
465                 470                 475                 480
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
                485                 490                 495
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
            500                 505                 510
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
        515                 520                 525
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
    530                 535                 540
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
545                 550                 555                 560
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
                565                 570                 575