通过抑制脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义转录物治疗BDNF相关疾病
阅读：340发布：2020-10-21
专利汇可以提供通过抑制脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义转录物治疗BDNF相关疾病专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及调节脑源神经营养因子(BDNF)的表达和/或功能的反义寡核苷酸，特别是通过靶向于脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义多核苷酸调节脑源神经营养因子(BDNF)的表达和/或功能。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定及其 治疗 与BDNF的表达相关的 疾病 和障碍的用途。，下面是通过抑制脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义转录物治疗BDNF相关疾病专利的具体信息内容。
1.一种调节生物系统中脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括：使所述生物系统与长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的天然反义序列的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，从而调节所述脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸。
2.根据权利要求1的调节生物系统中脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括：使所述生物系统与长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包含天然反义转录物SEQ ID NO:3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸
1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992内的
5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸，从而调节脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种体内或体外调节患者细胞或组织中脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括：使所述细胞或组织与长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％的序列同一性，从而体内或体外调节患者细胞或组织中脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸。
4.根据权利要求3的调节患者细胞或组织中脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括：使所述生物系统与长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包含天然反义转录物SEQ ID NO:3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992内的5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸，从而调节脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达。
5.一种调节生物系统中的脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括：使所述系统与靶向于脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触，从而调节脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸。
6.根据权利要求5的方法，其中所述脑源神经营养因子(BDNF)的功能和/或表达相对于对照在体内或体外提高。
7.根据权利要求5的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向于脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的天然反义序列。
8.根据权利要求5的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向于包含脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。
9.根据权利要求5的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向于脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。
10.根据权利要求5的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含选自以下的一种或多种修饰：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键、至少一种修饰的核苷酸及其组合。
11.根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分及其组合。
12.根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷间键：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
13.根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、其类似物、其衍生物及其组合。
14.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含如SEQ ID NO:12-49所示的至少一个寡核苷酸序列。
15.一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中脑源神经营养因子(BDNF)基因的功能和/或表达的方法，包括：使所述细胞或组织与长度5-30个核苷酸的至少一种短干扰RNA(siRNA)寡核苷酸接触，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸是对于脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义多核苷酸特异性的，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50％的序列同一性；和在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中脑源神经营养因子(BDNF)的功能和/或表达。
16.根据权利要求15的方法，其中所述寡核苷酸与至少约五个连续核酸的序列具有至少80％的序列同一性，所述至少约五个连续核酸的序列与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补。
17.一种长度5-30个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，该多核苷酸包含天然反义转录物SEQ ID NO:3的核苷酸
1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992内的5-30个连续核苷酸，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸，且任选地进一步包含至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键、至少一种修饰的核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸是与脑源神经营养因子(BDNF)基因杂交且与正常对照相比在体内或体外调节脑源神经营养因子(BDNF)基因的功能和/或表达的反义化合物。
18.根据权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为5-30个核苷酸且与BDNF基因的天然反义转录物内的5-30个连续核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性。
19.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括选自以下的核苷间键：
硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
20.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。
21.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键的骨架。
22.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自：肽核酸、锁核酸(LNA)、其类似物、其衍生物及其组合。
23.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多个修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸：硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
24.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多个修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的核苷酸：肽核酸、锁核酸(LNA)、其类似物、其衍生物及其组合。
25.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自以下的至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分及其组合。
26.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多个修饰，其中所述修饰包括选自以下的修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、
2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分及其组合。
27.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为至少约5-30个核苷酸且与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约60％的序列同一性。
28.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80％的序列同一性。
29.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与至少一个脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸杂交且与正常对照相比在体内或体外调节至少一个脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的表达和/或功能。
30.根据权利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQ ID NO:12-49所示的序列。
31.一种药物组合物，包含根据权利要求17的对于一种或多种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸特异性的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
32.根据权利要求31的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQ ID NO:12-49所示的任何一个核苷酸序列相比具有至少约40％的序列同一性。
33.根据权利要求31的组合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQ ID NO:12-49所示的核苷酸序列。
34.根据权利要求33的组合物，其中所述如SEQ ID NO:12-49所示的寡核苷酸包含一个或多个修饰或置换。
35.根据权利要求34的组合物，其中所述一个或多个修饰选自：硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、锁核酸(LNA)分子及其组合。
36.一种预防或治疗与至少一种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病的方法，包括：向患者施用治疗有效剂量的长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸，其中所述至少一种寡核苷酸与包含天然反义转录物SEQ ID NO:3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992内的5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸，并其结合所述至少一种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的天然反义序列和调节所述至少一种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的表达；从而预防或治疗与至少一种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病。
37.根据权利要求36的方法，其中与至少一种脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸相关的疾病选自：与BDNF的异常功能和/或表达相关的疾病或障碍、神经疾病或障碍、与神经发生缺陷相关的疾病或障碍、神经变性疾病或障碍(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化等)、神经精神障碍(抑郁症、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍、情感分裂性精神障碍和妄想性障碍、焦虑性障碍例如惊恐性障碍、恐怖症(包括广场恐怖症)、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、双相性精神障碍、神经性厌食、神经性贪食)、中枢神经系统的自身免疫性疾病(例如，多发性硬化)、记忆丧失、长期或短期记忆障碍、良性健忘、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、对病毒感染的神经元反应、脑损伤、发作性睡病、睡眠障碍(例如，昼夜节律障碍、失眠症和发作性睡病)；神经中断或神经损伤、脑脊髓神经索(CNS)中断和脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、神经痛(例如，三叉神经痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经性疼痛)、在诸如糖尿病、MS和运动神经元病的疾病中导致神经烦躁的不适当的神经元活性、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、颞下颚关节功能障碍、奖赏缺陷综合征(RDS)、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹、克-雅病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、癫痫、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病变、周围神经病、神经移植并发症、运动神经元病、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、癌症、哮喘、特应性疾病、炎症、过敏症、湿疹、神经肿瘤学疾病或病症、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症；以及与老化和衰老有关的疾病或病症。
38.靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物(“NAT”)的选自SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸用于调节所述BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID NO:3-11。
39.靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物(NAT)的选自SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸用于调节所述BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID NO:3、4、5、7、8、9、
10和11。
通过抑制脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义转录物治
疗BDNF相关疾病
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月15日提交的美国临时专利申请系列号61/611,225和2012年3月23日提交的美国临时专利申请系列号61/614,664的利益，这两者全文通过引用并
入本文。
发明领域
入本文。
发明领域
[0003] 本发明的实施方案包括调节BDNF和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。
背景技术
[0004] DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面(包括DNA复制、转录和翻译)而言为重要的。杂交对于探测特定核酸或者改变其表达的各种技术而言亦为主要的。反义
核苷酸例如通过与靶RNA杂交来扰乱基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反
义DNA具有DNA-RNA杂合体充当核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，该核糖核酸酶H消
化活性存在于大多数细胞类型中。可将反义分子递送到细胞中，这与寡脱氧核苷酸(ODN)
的情况一样，或者它们可作为RNA分子由内源基因表达。FDA最近批准了一种反义药物，
TM
VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，这反映了反义物具有治疗应用。
核苷酸例如通过与靶RNA杂交来扰乱基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反
义DNA具有DNA-RNA杂合体充当核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，该核糖核酸酶H消
化活性存在于大多数细胞类型中。可将反义分子递送到细胞中，这与寡脱氧核苷酸(ODN)
的情况一样，或者它们可作为RNA分子由内源基因表达。FDA最近批准了一种反义药物，
TM
VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，这反映了反义物具有治疗应用。
[0005] WO 2010/093904及其美国对应申请US/2011/0319475公开了BDNF作为使用本文所述的寡核苷酸调节的靶标。存在着针对天然反义靶标进行持续开发和与这种靶标互补并
调节BDNF蛋白表达以潜在地治疗BDNF相关疾病和病症或用于与治疗BDNF相关疾病和病
症有关的研究中的新开发寡核苷酸的需要。
调节BDNF蛋白表达以潜在地治疗BDNF相关疾病和病症或用于与治疗BDNF相关疾病和病
症有关的研究中的新开发寡核苷酸的需要。
[0006] 发明概述
[0008] 在一个实施方案中，本发明提供通过使用靶向于天然反义转录物的任何区域的反义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，从而引起哺乳动物生物体中相应BDNF有义基
因的上调的方法。本文也考虑本文所述的天然反义转录物的抑制可通过siRNA、核酶和小分
子来实现，其认为在本发明的范围之内。
因的上调的方法。本文也考虑本文所述的天然反义转录物的抑制可通过siRNA、核酶和小分
子来实现，其认为在本发明的范围之内。
[0009] 一个实施方案提供在体内或体外调节生物系统(包括，但不限于患者细胞或组织)中的BDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为约5-约30个核
苷酸的反义寡核苷酸接触所述生物系统或所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与以下多核
苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO：3的核
苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID
NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364
或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核
苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而在体内或体外调节所述生物系统包括所述患者
细胞或组织中BDNF多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核
苷酸。
苷酸的反义寡核苷酸接触所述生物系统或所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与以下多核
苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO：3的核
苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID
NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364
或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核
苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而在体内或体外调节所述生物系统包括所述患者
细胞或组织中BDNF多核苷酸的功能和/或表达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核
苷酸。
[0010] 在一个实施方案中，上述的寡核苷酸靶向于生物系统中存在的BDNF多核苷酸的天然反义序列，例如SEQ ID NO：3-11所示的核苷酸，以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。这类反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO：12-49所示。
[0011] 在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中BDNF多核苷酸的功能或表达的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物的至少一个反义寡核苷酸接触所
述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的
核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID
NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136
或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992之内的5-30个连续核
苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的
核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID
NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136
或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992之内的5-30个连续核
苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明包括调节生物系统中BDNF多核苷酸的功能或表达的方法，包括用靶向于BDNF多核苷酸的天然反义转录物的区域的至少一种反义寡核苷酸
接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核苷酸1-1279或SEQ ID
NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322
或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷
酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992之内的5-30
个连续核苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核苷酸1-1279或SEQ ID
NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID NO:6的核苷酸1-2322
或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364或SEQ ID NO:9的核苷
酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核苷酸1-992之内的5-30
个连续核苷酸，从而调节所述生物系统中BDNF多核苷酸的功能和/或表达。
[0013] 在一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID NO:1和2的BDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核
苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID
NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364
或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核
苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的功能
和/或表达。
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，所述天然反义转录物包含在SEQ ID NO：3的核
苷酸1-1279或SEQ ID NO:4的核苷酸1-1478或SEQ ID NO:5的核苷酸1-1437或SEQ ID
NO:6的核苷酸1-2322或SEQ ID NO:7的核苷酸1-2036或SEQ ID NO:8的核苷酸1-2364
或SEQ ID NO:9的核苷酸1-3136或SEQ ID NO:10的核苷酸1-906或SEQ ID NO:11的核
苷酸1-992之内的5-30个连续核苷酸，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的功能
和/或表达。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID NO:1和2的BDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的
功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID NO:3-11。
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的
功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID NO:3-11。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明包括提高生物系统中具有SEQ ID NO:1和2的BDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，包括用靶向于所述BDNF多核苷酸的天然反义转录物的
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的
功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID NO:3-11和其中所述反义寡核苷酸
选自SEQ ID NO:12-49的至少一种。
至少一种反义寡核苷酸接触所述生物系统，从而提高所述BDNF多核苷酸或其表达产物的
功能和/或表达，其中所述天然反义转录物选自SEQ ID NO:3-11和其中所述反义寡核苷酸
选自SEQ ID NO:12-49的至少一种。
[0016] 在一个实施方案中，组合物包含一种或多种与有义和/或反义BDNF多核苷酸结合的反义寡核苷酸。
[0017] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰或取代的核苷酸。
[0018] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的键。
[0019] 在又另一个实施方案中，所述修饰的核苷酸包含经修饰的碱基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟或碳、亚甲基或其他锁核酸(LNA)分子。优选地，所述修饰的核苷酸为锁核酸分子，包括α-L-LNA。
[0020] 在一个实施方案中，将所述寡核苷酸经皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。
[0022] 在一个实施方案中，将所述寡核苷酸封装到脂质体中或连接于载体分子(例如胆固醇、TAT肽)。
[0023] 在一个实施方案中，本发明包括SEQ ID NO:50-55作为靶向于天然反义转录物(NAT)的寡核苷酸调节BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID NO:3-11。
在另一个实施方案中，本发明包括SEQ ID NO:50-55作为靶向于天然反义转录物(NAT)的
寡核苷酸调节BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID NO:3、4、5、7、8、9、10和11。
在另一个实施方案中，本发明包括SEQ ID NO:50-55作为靶向于天然反义转录物(NAT)的
寡核苷酸调节BDNF多核苷酸的表达的用途，其中所述NAT选自SEQ ID NO:3、4、5、7、8、9、10和11。
[0024] 其它方面描述于下文。
[0026] 图1a-e显示有义mRNA和蛋白质的反义介导的调节。图1a显示，在用靶向于BDNF-AS转录物的非重叠区域的三种siRNA寡核苷酸转染几种人和小鼠细胞系后，发生
BDNF转录物的敲减和上调。图1b显示BDNF-AS靶向的siRNA施用后BDNF和BDNF-AS转录
物的内源表达的时程研究数据。数据显示随着时间过去，BDNF-AS下调，且然后BDNF表达
上调且是可逆的。图1c显示两种靶向于BDNF-AS转录物的siRNA显著增加通过ELISA测
量的BDNF蛋白，而乱序的siRNA或对照的非靶向siRNA不显著增加BDNF蛋白。图1d显示
施用各种siRNA后使用ELISA和/或蛋白质印迹测量的BDNF的蛋白质水平。图1e显示相
-12 -6
对于提高的寡核苷酸浓度(10 -10 M)与模拟对照相比的百分倍数变化。
BDNF转录物的敲减和上调。图1b显示BDNF-AS靶向的siRNA施用后BDNF和BDNF-AS转录
物的内源表达的时程研究数据。数据显示随着时间过去，BDNF-AS下调，且然后BDNF表达
上调且是可逆的。图1c显示两种靶向于BDNF-AS转录物的siRNA显著增加通过ELISA测
量的BDNF蛋白，而乱序的siRNA或对照的非靶向siRNA不显著增加BDNF蛋白。图1d显示
施用各种siRNA后使用ELISA和/或蛋白质印迹测量的BDNF的蛋白质水平。图1e显示相
-12 -6
对于提高的寡核苷酸浓度(10 -10 M)与模拟对照相比的百分倍数变化。
[0027] 图2显示Bdnf上调提高神经元突起生长(neuronal outgrowth)。
[0028] 图3显示Bdnf-AS在体内调节Bdnf mRNA和蛋白质。
[0029] 图4显示体内Bdnf-AS的阻断引起神经元存活和增殖的增加。
[0030] 图5显示BDNF-AS敲减导致BDNF mRNA上调。
[0031] 图6显示Bdnf表达的转录后调节。
[0032] 图7显示hBDNFAntagoNAT抑制人BDNF-AS转录物。
[0033] 图8显示AntagoNAT抑制N2a细胞中的小鼠Bdnf-AS转录物。
[0034] 图9显示BDNF-AS敲减既不改变TrkB的水平也不改变两个方向的BDNF相邻基因(Let7C和KIF18A)：LIN7C和KIF18A分别是位于BDNF3’下游和5’上游的基因。
[0035] 序列表的说明：SEQ ID NO:1：人脑源神经营养因子(BDNF)，转录物变体3，mRNA.(NCBI登录号：NM_170735)；SEQ ID NO:2：小鼠脑源神经营养因子(Bdnf)，转录物变体1，
mRNA(NCBI登录号：NM_007540)；SEQ ID NO:3：天然BDNF反义序列(转录物变体BT1A；
NR_033313.1)；SEQ ID NO:4：天然BDNF反义序列(转录物变体BT2A；NR_033314.1)；SEQ
ID NO:5：天然BDNF反义序列(转录物变体BT1B；NR_033315.1)；SEQ ID NO:6：天然BDNF
反义序列(转录物变体BT2B；NR_002832.2)；SEQ ID NO:7：天然BDNF反义序列(转录物变
体BT1C；NR_033312.1)；SEQ ID NO:8：天然BDNF反义序列(BDNF-AS变体)；SEQ ID NO:9：
天然BDNF反义序列；SEQ ID NO:10：小鼠天然BDNF反义序列(小鼠BDNF-AS变体1)；SEQ
ID NO:11：小鼠天然BDNF反义序列(小鼠BDNF-AS变体2)；SEQ ID NO:12-55：反义寡核
苷酸；SEQ ID NO:56-59：分别反义寡核苷酸12-15的反向互补序列；SEQ ID NO:60-64：分
别反义寡核苷酸42-46的反向互补序列；SEQ ID NO:65和66：分析序列。LNA(2’-O,4’-C
亚甲基锁核酸)：+A*或+T*或+C*或+G*；2’OM(2’-O-甲基)：mU*或mA*或mC*或mG*；
PS(硫代磷酸酯)：T*或A*或G*或c*；RNA：rU或rA或rG或rC。
mRNA(NCBI登录号：NM_007540)；SEQ ID NO:3：天然BDNF反义序列(转录物变体BT1A；
NR_033313.1)；SEQ ID NO:4：天然BDNF反义序列(转录物变体BT2A；NR_033314.1)；SEQ
ID NO:5：天然BDNF反义序列(转录物变体BT1B；NR_033315.1)；SEQ ID NO:6：天然BDNF
反义序列(转录物变体BT2B；NR_002832.2)；SEQ ID NO:7：天然BDNF反义序列(转录物变
体BT1C；NR_033312.1)；SEQ ID NO:8：天然BDNF反义序列(BDNF-AS变体)；SEQ ID NO:9：
天然BDNF反义序列；SEQ ID NO:10：小鼠天然BDNF反义序列(小鼠BDNF-AS变体1)；SEQ
ID NO:11：小鼠天然BDNF反义序列(小鼠BDNF-AS变体2)；SEQ ID NO:12-55：反义寡核
苷酸；SEQ ID NO:56-59：分别反义寡核苷酸12-15的反向互补序列；SEQ ID NO:60-64：分
别反义寡核苷酸42-46的反向互补序列；SEQ ID NO:65和66：分析序列。LNA(2’-O,4’-C
亚甲基锁核酸)：+A*或+T*或+C*或+G*；2’OM(2’-O-甲基)：mU*或mA*或mC*或mG*；
PS(硫代磷酸酯)：T*或A*或G*或c*；RNA：rU或rA或rG或rC。
[0036] 详细说明
[0037] 参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员
将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来
实施本发明。本发明不受行为或事件的排序限制，因为一些行为可以不同的顺序进行和/
或与其他行为或事件同时进行。此外，并非所有说明性的行为或事件对实施本发明的方法
都为必需的。
将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来
实施本发明。本发明不受行为或事件的排序限制，因为一些行为可以不同的顺序进行和/
或与其他行为或事件同时进行。此外，并非所有说明性的行为或事件对实施本发明的方法
都为必需的。
[0038] 本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意图对应来自任何物种的同源物，对该物种而言本文公开的组合物和方法为适用的。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠
的基因和基因产物。应当理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，意图此公开
仅为示范性的，并且除非其出现的上下文中明确指示，否则不应理解为限制。因此，例如，对于本文公开的在一些实施方案中有关哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因而言，意图包括来
自其他动物(包括，但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源和/
或直向同源基因和基因产物。在一个实施方案中，所述基因或核酸序列为人的基因或核酸
序列。定义
的基因和基因产物。应当理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，意图此公开
仅为示范性的，并且除非其出现的上下文中明确指示，否则不应理解为限制。因此，例如，对于本文公开的在一些实施方案中有关哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因而言，意图包括来
自其他动物(包括，但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源和/
或直向同源基因和基因产物。在一个实施方案中，所述基因或核酸序列为人的基因或核酸
序列。定义
[0039] 本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非上下文另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。
此外，就术语“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其变型在详述和/或权利要求中所用的程度而言，这类术语意图以类似于术语“包含”的方式是包涵性的。
此外，就术语“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其变型在详述和/或权利要求中所用的程度而言，这类术语意图以类似于术语“包含”的方式是包涵性的。
[0040] 术语“约”或“大约”意为在由本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受误差范围之内，这部分取决于该值是如何测定或确定的，即，测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可意为在1或大于1的标准偏差之内。或者，“约”可意为给定值的最多20％，优选10％，更优选5％，和还更优选1％的范围。或者，具体地关于生物系统或过程，该术语
可意为在值的一个数量级之内，优选在值的5倍之内，更优选在2倍之内。当本申请和权利
要求描述具体值时，除非另作说明，否则应假设术语“约”意为在具体值的可接受误差范围
之内。
可意为在值的一个数量级之内，优选在值的5倍之内，更优选在2倍之内。当本申请和权利
要求描述具体值时，除非另作说明，否则应假设术语“约”意为在具体值的可接受误差范围
之内。
[0041] 本文所用的术语“mRNA”意为目前已知的靶向于基因的mRNA转录物，以及任何可阐明的其它转录物。
[0042] “反义寡核苷酸”或“反义化合物”意为与另一个RNA或DNA(靶RNA、DNA)结合的RNA或DNA分子。例如，如果其为RNA寡核苷酸，则其通过RNA-RNA相互作用结合另一个RNA
靶标并改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。
该定义意在包括从治疗、诊断或其他观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这类分子
包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治
疗性编辑RNA(therapeutic editing RNA)以及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义
寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接物(alternate splicer)、引物、探针以
及其他与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，可将这些化合物以单链、双链、部
分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
靶标并改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。
该定义意在包括从治疗、诊断或其他观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这类分子
包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治
疗性编辑RNA(therapeutic editing RNA)以及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义
寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接物(alternate splicer)、引物、探针以
及其他与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，可将这些化合物以单链、双链、部
分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
[0043] 在本发明的情况中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸”，也包括天然和/或经修饰单体或键
(linkage)的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头物形
式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与
单体相互作用的规律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基配对、胡格斯腾型
或反向胡格斯腾型碱基配对等)特异地结合靶多核苷酸。
(linkage)的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头物形
式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与
单体相互作用的规律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基配对、胡格斯腾型
或反向胡格斯腾型碱基配对等)特异地结合靶多核苷酸。
[0044] 寡核苷酸可为“嵌合的”，即，由不同的区组成。在本发明的情况中，“嵌合的”化合物为寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区，例如，DNA区、RNA区、PNA区等。每个化学区由至少一个单体单元(即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸)组成。这些寡核苷酸典型地包含至少一个区，其中所述寡核苷酸为经修饰的以表现出一种或多种所需特性。寡核苷
酸的所需特性包括但不限于，例如增强的对核酸酶降解的抗性、增强的细胞摄取和/或增
强的对靶核酸的结合亲和力。因此寡核苷酸的不同区可具有不同的特性。本发明的嵌合寡
核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核
苷酸类似物的混合结构。
酸的所需特性包括但不限于，例如增强的对核酸酶降解的抗性、增强的细胞摄取和/或增
强的对靶核酸的结合亲和力。因此寡核苷酸的不同区可具有不同的特性。本发明的嵌合寡
核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核
苷酸类似物的混合结构。
[0045] 寡核苷酸可由可“全符合状态(in“register”)”地连接(即此时单体像在天然DNA一样连续地连接)或通过间隔物连接的区组成。所述间隔物意在构成区之间的共价
“桥”，并在优选的情况下具有不超过约100个碳原子的长度。所述间隔物可携带不同的功
能性，例如具有正或负电荷的、具有特殊的核酸结合特性(嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光团等)、为亲脂的、诱导特殊的二级结构如例如诱导α-螺旋的含丙氨酸的肽。
“桥”，并在优选的情况下具有不超过约100个碳原子的长度。所述间隔物可携带不同的功
能性，例如具有正或负电荷的、具有特殊的核酸结合特性(嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光团等)、为亲脂的、诱导特殊的二级结构如例如诱导α-螺旋的含丙氨酸的肽。
[0046] 本文所用的“BDNF”和“脑源神经营养因子”包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。
[0047] 本文所用的措词“脑源神经营养因子”、“脑来源的神经营养因子”和BDNF在文献中被认为是相同的且在本申请中可交换地使用。
[0048] 本文所用的术语“对......特异的寡核苷酸”或“靶向于......的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸：(i)能够与靶定基因的一部分形成稳定的复合体，或(ii)能
够与靶定基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。复合体和双链体的稳定性可通
过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定
法描述于下文实施例中。
够与靶定基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。复合体和双链体的稳定性可通
过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定
法描述于下文实施例中。
[0049] 本文所用的术语“靶核酸”包括DNA、从这类DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA)，以及从这类RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与
其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。这种通过特异地与靶核酸杂交的化合物对该
靶核酸的功能调节，一般称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的
RNA功能，包括所有的生命机能，例如，RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功
能的这类干扰的整体效果为对编码产物或寡核苷酸表达的调节。
其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。这种通过特异地与靶核酸杂交的化合物对该
靶核酸的功能调节，一般称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的
RNA功能，包括所有的生命机能，例如，RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功
能的这类干扰的整体效果为对编码产物或寡核苷酸表达的调节。
[0050] RNA干扰“RNAi”由双链RNA(dsRNA)分子介导，该分子具有与其“靶”核酸序列的序列特异性同源性。在本发明的某些实施方案中，介体为5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双
链体(siRNA)。siRNA通过称为切酶(Dicer)的RNA酶对dsRNA的加工得到。siRNA双链体
产物募集到叫做RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何
具体理论所约束，据认为随后RISC被引向靶核酸(适当地为mRNA)，其中siRNA双链体以
序列特异性的方式相互作用来介导催化方式的切割。可依照本发明使用的小干扰RNA可根
据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的程序来合成和使用。用于本发明的方法中的小干
扰RNA适当地包含约1-约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包
含约5-约40nt、约5-约30nt、约10-约30nt、约15-约25nt、或约20-25个核苷酸。
链体(siRNA)。siRNA通过称为切酶(Dicer)的RNA酶对dsRNA的加工得到。siRNA双链体
产物募集到叫做RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何
具体理论所约束，据认为随后RISC被引向靶核酸(适当地为mRNA)，其中siRNA双链体以
序列特异性的方式相互作用来介导催化方式的切割。可依照本发明使用的小干扰RNA可根
据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的程序来合成和使用。用于本发明的方法中的小干
扰RNA适当地包含约1-约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包
含约5-约40nt、约5-约30nt、约10-约30nt、约15-约25nt、或约20-25个核苷酸。
[0051] 适当寡核苷酸的挑选通过使用电脑程序来辅助，该程序自动比对核酸序列并指示具有同一性或同源性的区。将这类程序用于比较通过例如搜索诸如GenBank等的数据库或
通过测序PCR产物而获得的核酸序列。对来自一系列物种的核酸序列的比较，允许选择在
物种之间显示适度同一性的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹来确定在靶
物种和其他物种的基因之间的同一性程度。如本领域众所周知的，通过在不同的严格程度
下进行DNA印迹，可能获得同一性的近似衡量。这些程序允许选择对待控制的受试者中的
靶核酸序列表现出高度的互补性并且对其他物种中的相应核酸序列表现出较低程度的互
补性的寡核苷酸。本领域的技术人员将认识到，在挑选用于本发明的适当的基因区方面具
有相当大的自由。
通过测序PCR产物而获得的核酸序列。对来自一系列物种的核酸序列的比较，允许选择在
物种之间显示适度同一性的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹来确定在靶
物种和其他物种的基因之间的同一性程度。如本领域众所周知的，通过在不同的严格程度
下进行DNA印迹，可能获得同一性的近似衡量。这些程序允许选择对待控制的受试者中的
靶核酸序列表现出高度的互补性并且对其他物种中的相应核酸序列表现出较低程度的互
补性的寡核苷酸。本领域的技术人员将认识到，在挑选用于本发明的适当的基因区方面具
有相当大的自由。
[0052] “酶促RNA”意为具有酶活性的RNA分 子(Cech，(1988)J.American.Med.Assoc.260，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来起作用。这类结合通过
酶促核酸的靶结合部分进行，所述靶结合部分保持紧密靠近起到切割靶RNA分子的作用的
酶部分。因此，酶促核酸首先识别而后通过碱基配对结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点，即酶促切割靶RNA。
酶促核酸的靶结合部分进行，所述靶结合部分保持紧密靠近起到切割靶RNA分子的作用的
酶部分。因此，酶促核酸首先识别而后通过碱基配对结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点，即酶促切割靶RNA。
[0053] “诱饵RNA”意为模拟配体的天然结合域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合靶标竞争与特异性配体的结合。例如，已显示HIV反式激活应答(TAR)RNA的过表达可充当
“诱饵”并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合到在HIV RNA中编码的TAR序列。这
意指特定的实例。本领域的技术人员将认识到，这只是一个实例，而其他的实施方案可使用
本领域一般已知的技术容易地产生。
“诱饵”并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合到在HIV RNA中编码的TAR序列。这
意指特定的实例。本领域的技术人员将认识到，这只是一个实例，而其他的实施方案可使用
本领域一般已知的技术容易地产生。
[0054] 本文所用的术语“单体”通常指通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围从少量单体单元(例如从约3-4)到约数百个单体单元的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键的类
似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、
氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述的。
似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、
氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述的。
[0055] 术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本领域的技术人员应清楚的是，先前认为“非天然存在”的多种核苷酸后来已在自然中发现。因此，“核苷
酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其
他类型的核苷酸的说明性实例为以下分子，其含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌
呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6,N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲
基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲
基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Benner等的美国专利第5,432,272号中
描述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”意在涵盖这些实例以及其类似物和互变异
构体中的每一个和全部。尤其令人关注的核苷酸为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和
尿嘧啶的核苷酸，其被认为是有关人中的治疗和诊断应用的天然存在核苷酸。核苷酸包括
天然2’-脱氧和2’-羟基糖，例如，如Kornberg和Baker，DNA复制(DNA Replication)，
第2版(Freeman，San Francisco，1992)中所述的，以及其类似物。
酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其
他类型的核苷酸的说明性实例为以下分子，其含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌
呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6,N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲
基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲
基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Benner等的美国专利第5,432,272号中
描述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”意在涵盖这些实例以及其类似物和互变异
构体中的每一个和全部。尤其令人关注的核苷酸为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和
尿嘧啶的核苷酸，其被认为是有关人中的治疗和诊断应用的天然存在核苷酸。核苷酸包括
天然2’-脱氧和2’-羟基糖，例如，如Kornberg和Baker，DNA复制(DNA Replication)，
第2版(Freeman，San Francisco，1992)中所述的，以及其类似物。
[0056] 提及核苷酸的“类似物”包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸(参见例如，由Scheit，核苷酸类似物(Nucleotide Analogs)，John Wiley，
New York，1980；Freier和Altmann，(1997)Nucl.Acid.Res.，25(22)，4429-4443，Toulmé，J.J.，(2001)Nature Biotechnology 19：17-18；Manoharan M.，(1999)Biochemica et
Biophysica Acta 1489：117-139；Freier S.M.，(1997)Nucleic Acid Research，25：
4429-4443，Uhlman，E.，(2000)Drug Discovery&Development，3：203-213，Herdewin P.，(2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10：297-310一般描述的)；2’-O,3’-C-连接
的[3.2.0]二环阿糖核苷。这类类似物包括设计以增强结合特性的合成核苷酸，所述结合
特性为例如双链体或三链体稳定性、特异性等。
New York，1980；Freier和Altmann，(1997)Nucl.Acid.Res.，25(22)，4429-4443，Toulmé，J.J.，(2001)Nature Biotechnology 19：17-18；Manoharan M.，(1999)Biochemica et
Biophysica Acta 1489：117-139；Freier S.M.，(1997)Nucleic Acid Research，25：
4429-4443，Uhlman，E.，(2000)Drug Discovery&Development，3：203-213，Herdewin P.，(2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10：297-310一般描述的)；2’-O,3’-C-连接
的[3.2.0]二环阿糖核苷。这类类似物包括设计以增强结合特性的合成核苷酸，所述结合
特性为例如双链体或三链体稳定性、特异性等。
[0057] 本文所用的“杂交”意为寡聚化合物的基本上互补链的配对。一种配对的机理涉及寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可为沃森-克里
克、胡格斯腾型或反向胡格斯腾型氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核苷酸，其通
过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。
克、胡格斯腾型或反向胡格斯腾型氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核苷酸，其通
过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。
[0058] 如果反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而导致功能和/或活性的调节，并且在需要特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件
下，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件下)存在足够程度的互补性来避免所述反
义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，反义化合物为“可特异地杂交的”。
下，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件下)存在足够程度的互补性来避免所述反
义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，反义化合物为“可特异地杂交的”。
[0059] 本文所用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指以下条件：在该条件下本发明的化合物与其靶序列杂交，但与最少数量的其他序列杂交。严格条件为序列依赖的且在
不同环境下将不同，在本发明的情况中，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由
寡聚化合物的性质和组成以及正在其中研究它们的试验来确定。一般而言，严格杂交条件
包括低浓度(＜0.15M)的含有诸如Na+或K+等无机阳离子的盐(即，低离子强度)、高于
20℃-25℃而低于寡聚化合物:靶序列复合体的Tm的温度，以及变性剂的存在，例如甲酰
胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，杂交率对于每1％
甲酰胺降低1.1％。高严格杂交条件的实例为0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1％
(w/v)SDS、60℃下达30分钟。
不同环境下将不同，在本发明的情况中，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由
寡聚化合物的性质和组成以及正在其中研究它们的试验来确定。一般而言，严格杂交条件
包括低浓度(＜0.15M)的含有诸如Na+或K+等无机阳离子的盐(即，低离子强度)、高于
20℃-25℃而低于寡聚化合物:靶序列复合体的Tm的温度，以及变性剂的存在，例如甲酰
胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，杂交率对于每1％
甲酰胺降低1.1％。高严格杂交条件的实例为0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1％
(w/v)SDS、60℃下达30分钟。
[0060] 本文所用的“互补性”是指在一条或两条寡聚链上两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在反义化合物的某个位置上的核碱基能够与在靶核酸的某个位置上的核碱
基氢键键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为所述寡核苷酸和所述靶核酸
之间氢键键合的位置为互补位置。当可彼此氢键键合的核苷酸占据了每个分子中足够数量
的互补位置时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为彼此互补的。因此，“可特
异性杂交的”和“互补的”为用于表示在足够数量的核苷酸上有足够程度的精确配对或互补
性以使得稳定和特异的结合发生在寡聚化合物和靶核酸之间的术语。
基氢键键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为所述寡核苷酸和所述靶核酸
之间氢键键合的位置为互补位置。当可彼此氢键键合的核苷酸占据了每个分子中足够数量
的互补位置时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为彼此互补的。因此，“可特
异性杂交的”和“互补的”为用于表示在足够数量的核苷酸上有足够程度的精确配对或互补
性以使得稳定和特异的结合发生在寡聚化合物和靶核酸之间的术语。
[0061] 本领域中理解，寡聚化合物的序列不需要与其可特异杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，使得间插或邻近的区段不涉及杂交事
件(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包含与其靶向的靶核酸序列内
的靶区域至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至
少约95％、或至少约99％的序列互补。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中有18个与
靶区域互补且因而会特异地杂交的反义化合物，表示90％互补性。在此实例中，余下的非
互补核苷酸可与互补核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此邻接或邻接互补核苷酸。因此，
长度为18个核苷酸的反义化合物具有4(四)个非互补核苷酸，该非互补核苷酸位于与靶
核酸完全互补的两个区的侧翼，所述反义化合物会具有与靶核酸77.8％的总互补性，因此
落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区的互补性百分比可使用本领域已知的BLAST
程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定。百分同源性、序列同一
性或互补性可通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系统版本8，Genetics
Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)使用默认设置来确定，该程
序使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，(1981)2，482-489)。
件(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包含与其靶向的靶核酸序列内
的靶区域至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至
少约95％、或至少约99％的序列互补。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中有18个与
靶区域互补且因而会特异地杂交的反义化合物，表示90％互补性。在此实例中，余下的非
互补核苷酸可与互补核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此邻接或邻接互补核苷酸。因此，
长度为18个核苷酸的反义化合物具有4(四)个非互补核苷酸，该非互补核苷酸位于与靶
核酸完全互补的两个区的侧翼，所述反义化合物会具有与靶核酸77.8％的总互补性，因此
落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区的互补性百分比可使用本领域已知的BLAST
程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定。百分同源性、序列同一
性或互补性可通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系统版本8，Genetics
Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)使用默认设置来确定，该程
序使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，(1981)2，482-489)。
[0062] 本文所用的术语“解链温度(Tm)”是指在限定的离子强度、pH和核酸浓度下，平衡时50％与靶序列互补的寡核苷酸与靶序列杂交的温度。典型地，对于短的寡核苷酸(例如，
10-50个核苷酸)而言严格条件为以下条件，其中盐浓度至少为约0.01-1.0M Na离子浓度
(或其他盐)，pH 7.0-8.3且温度至少为约30℃。严格条件也可通过外加诸如甲酰胺等去
稳定剂来达到。
10-50个核苷酸)而言严格条件为以下条件，其中盐浓度至少为约0.01-1.0M Na离子浓度
(或其他盐)，pH 7.0-8.3且温度至少为约30℃。严格条件也可通过外加诸如甲酰胺等去
稳定剂来达到。
[0063] 本文所用的“调节”意为在基因表达方面的增加(刺激)或减少(抑制)。
[0064] 术语“变体”，当用于多核苷酸序列的情况下时，可包括与野生型基因相关的多核苷酸序列。此定义也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物种”或“多态性”变体。剪接变体可具有与参比分子显著的同一性，但因为在mRNA加工期间外显子的可变剪接而通常
具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加的功能域或域的缺失。物种变体
为在不同物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中尤其实用的是野生型基因产物的变体。
变体可由核酸序列中的至少一个突变产生并可导致产生改变的mRNA或者其结构或功能可
能改变或不变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有、或者具有一个或许多等位基
因形式。产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些变化
类型中的每一个可单独或与其他类型联合发生，在给定序列中发生一次或多次。
具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加的功能域或域的缺失。物种变体
为在不同物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中尤其实用的是野生型基因产物的变体。
变体可由核酸序列中的至少一个突变产生并可导致产生改变的mRNA或者其结构或功能可
能改变或不变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有、或者具有一个或许多等位基
因形式。产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些变化
类型中的每一个可单独或与其他类型联合发生，在给定序列中发生一次或多次。
[0065] 产生的多肽一般将具有相对于彼此的显著的氨基酸同一性。多态性变体为在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态性变体也可包括“单核苷酸多态
性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可指示例如具
有疾病状态倾向(即与抗性相对的易感性)的某个群体。
性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可指示例如具
有疾病状态倾向(即与抗性相对的易感性)的某个群体。
[0066] 衍生物多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置换氢。衍生物(例如，衍生物寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键。它们
中示例性的是硫代磷酸酯及本领域已知的其他含硫的物质。衍生物核酸也可含有标记，包
括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等等。
中示例性的是硫代磷酸酯及本领域已知的其他含硫的物质。衍生物核酸也可含有标记，包
括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等等。
[0067] “衍生物”多肽或肽为经修饰的多肽或肽，例如，通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸盐化作用、还原/烷基化、酰化、化学偶联或温和福尔马林处理。也可将衍生物修饰以含有可检测标记(直接地或间接地)，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。
[0070] “处理”或“治疗”涵盖对哺乳动物中疾病状态的处理，并包括：(a)防止疾病状态出现于哺乳动物中，特别是当这类哺乳动物倾向于疾病状态但尚未诊断为患有该疾病状态时；(b)抑制疾病状态，例如，阻止其发展；和/或(c)减轻疾病状态，例如，引起疾病状态的退行直到达到所需的终点。治疗也包括改善疾病的症状(例如，减少疼痛或不适)，其中这
类改善可直接或可非直接地影响疾病(例如，原因、传递、表达等)。
类改善可直接或可非直接地影响疾病(例如，原因、传递、表达等)。
[0071] 本文所用的术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或肿瘤或恶性肿瘤，包括，但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌瘤和肉瘤。癌症自身表现为包含癌症恶性细胞的“肿瘤”或组织。肿瘤的实例包括肉瘤或癌，例如但不限于：纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可以通过根据本发明的所公开组合物治疗的另外的癌症包括，但不限于例如何杰金氏病、非
何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺瘤(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌瘤、膀胱癌、胃癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺瘤(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌瘤、膀胱癌、胃癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
[0072] 如本文所用的，“神经疾病或障碍”是指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或障碍。“神经疾病或障碍”包括累及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包
括脑神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和外周神经系统两者中)的疾病或障碍。
神经疾病或障碍包括，但不限于获得性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、脑白质肾上
腺萎缩症、年龄相关性黄斑变性、胼胝体发育不全、认识不能、艾卡迪综合征、亚力山大病、阿尔佩斯病、交叉性肢体瘫痪、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、无脑畸
形、Angelman综合征、血管瘤病、缺氧症、失语症、精神性运动不能、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、Anronl-Chiari畸形、动静脉畸形、阿斯佩各综合征、毛细血管扩张性共济失调(ataxia
telegiectasia)、注意力缺乏多动症、孤独症、自主神经功能障碍、背痛、巴藤病、贝切特氏病、贝耳氏麻痹、良性自发性睑痉挛、良性局灶性、肌萎缩、良性颅内高血压、宾斯旺格氏病、睑痉挛、Bloch Sulzberger综合征、臂丛损伤、脑脓肿、脑损伤、脑肿瘤(包括多形性成胶
质细胞瘤)、脊髓肿瘤、布朗-塞卡尔综合征、卡纳万病、腕管综合征、灼痛、中枢性痛综合
征、脑桥中央髓鞘溶解、头部障碍、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、大脑性巨人症、大脑性麻痹、夏-马-图三氏病、化疗诱导的神经痛和神经性疼痛、Chiari畸形、舞蹈病、慢性炎性
脱髓鞘性多神经病、慢性痛、慢性区域性疼痛综合征、科-勒二氏综合征、昏迷，包括持续性植物状态、先天性面瘫、皮质基底核退化症、颅动脉炎、颅缝早闭、克雅氏病、累积性创伤失调、柯兴综合征、巨细胞性包涵体病、巨细胞病毒感染、眼足舞蹈综合征、丹-沃二氏综合
征、Dawson病、德摩西埃综合征、Dejerine-Klumke麻痹、痴呆、皮肌炎、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、家族性自主神经机能异常、书写困难、诵读困难、张力障碍、早期幼儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、欧勃(氏)麻痹、特发性震颤、法布里氏病、法尔氏综合征、晕厥、家族性痉挛性麻痹、热性惊厥、菲希尔综合征、弗里德赖希氏共济失调、额颞叶性痴呆和其它“tau蛋白病(tauopathies)”、高歇氏病、格斯特曼
氏综合征、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球样细胞脑白质营养不良、格-巴二氏综
合征、HTLV-1-相关脊髓病、哈-斯二氏病、颅脑损伤、头痛、半侧颜面痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性运动失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、Hirayama综合征、HIV相关痴呆和神经病(也即AIDS的神经表现)、前脑无裂畸形、亨廷顿氏舞蹈病和其它多聚谷氨酰胺
重复疾病(polyglutamine repeat disease)、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺
氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿型雷夫叙姆病(infantile refsum disease)、婴儿痉挛、炎症性肌病、颅内囊肿、颅内高血压、朱伯特综合征(Joubert syndrome)、卡恩斯塞尔综合征(Kearns-sayre syndrome)、肯尼迪病(Kennedy
disease)、金斯布林纳综合征(kinsbourne syndrome)、颈椎融合综合征(Klippel Feil
syndrome)、克拉伯病(Krabbe disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-welander
disease)、库鲁病(kuru)、拉福拉病(lafora disease)、朗-爱二氏肌无力综合
征(Lambert-eaton myasthenic syndrome)、获得性癫痫性失 语(Landau-Kleffner
syndrome)、延髓外侧(Wallenberg)综合征、学习无能、利氏病(leigh's disease)、
Lennox-Gastaut综合征(Lennox-gastaut syndrome)、莱施-尼汉综合征(Lesch-nyhan
syndrome)、脑白质营养不良、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合征(locked-in syndrome)、路格里克氏病(Lou Gehrig’s disease)(即运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)、腰椎间盘
病、莱姆病(lyme disease)-神经后遗症、马查多-约瑟夫病(machado-joseph disease)、
巨脑、巨脑畸形、梅尔克松-罗森塔尔综合征(Melkersson-rosenthal syndrome)、梅尼
埃病(Meniere's disease)、脑膜炎、门克斯病(Menkes disease)、异染性脑白质营养不
良、小头畸形、偏头痛、米勒-费雪综合征(Miller Fisher syndrome)、小中风、线粒体肌
病、默比乌斯综合征(mobius syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元病、烟雾病(moyamoya
disease)、粘多糖贮积病、多梗死性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化和其它脱髓鞘疾
病、多系统萎缩伴体位性低血压、肌肉萎缩症、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌阵挛脑病、肌阵挛、肌病、先天性肌强直、发作性睡病、神经纤维瘤病、抗精神病药恶性综合征、AIDS的神经表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元
移行异常、尼曼-匹克病(niemann-pick disease)、O'sullivan-Mcleod综合征、枕神经
痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征(Ohtahara syndrome)、橄榄体脑桥小
脑萎缩、视性眼阵挛-肌阵挛、视神经炎、直立性低血压、过劳综合征、感觉异常、神经变性疾病或障碍(帕金森氏症、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、
多发性硬化及其它与神经元细胞死亡相关的疾病和障碍)、先天性肌强直病、副肿瘤疾病、
阵发性发作(paroxysmal attacks)、帕罗综合征(Parry-Romberg syndrome)、佩-梅氏
病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、周期性麻痹、周围神经病变、疼痛性神经病和神经
性疼痛、持续性植物状态、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经挟捏、垂体瘤、多小脑回(pmg)、多肌炎、脑穿通畸形、脊髓灰质炎后综合征、带状疱疹后神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普-威二氏综合征(Prader-Willi syndrome)、
原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性面部单侧萎缩、进行性多灶性脑白质病、进行性硬化
性灰质萎缩、进行性核上麻痹、脑假瘤、拉姆齐-亨特综合征(I型和11型)、拉斯马森
(Rasmussen)脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、反复性运动障碍、反复
性应激损伤、多动腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、雷特综合征、雷耶氏综合征、圣维
特斯舞蹈病、桑德霍夫病、谢耳德病、脑裂、视隔发育不全(septo-optic dysplasia)、惊
吓婴儿综合征、带状疱疹、希-德综合征、斯耶格伦综合征、睡眠性呼吸暂停、索托斯综合
征(Soto’s syndrome)、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓瘤、脊髓性肌萎缩、僵人综合征(Stiff-Person syndrome)、中风、斯-韦综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性
脑病、西德纳姆舞蹈病、晕厥、脊髓空洞症、迟发性运动障碍、泰-萨病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征(tethered spinal cord syndrome)、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、三叉神经
痛、Todd麻痹、图雷特综合症、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、结节性硬化症、血管性痴呆(多发梗塞
性痴呆)、血管炎包括颞动脉炎、希-林二氏(Von Hippel-Lindau)病、瓦伦伯格综合征、
韦-霍(Werdnig-Hoffman)病、韦斯特综合征、颈部扭伤(whiplash)、威廉斯综合征、Wildon
病以及泽尔韦格综合征。
括脑神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和外周神经系统两者中)的疾病或障碍。
神经疾病或障碍包括，但不限于获得性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、脑白质肾上
腺萎缩症、年龄相关性黄斑变性、胼胝体发育不全、认识不能、艾卡迪综合征、亚力山大病、阿尔佩斯病、交叉性肢体瘫痪、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、无脑畸
形、Angelman综合征、血管瘤病、缺氧症、失语症、精神性运动不能、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、Anronl-Chiari畸形、动静脉畸形、阿斯佩各综合征、毛细血管扩张性共济失调(ataxia
telegiectasia)、注意力缺乏多动症、孤独症、自主神经功能障碍、背痛、巴藤病、贝切特氏病、贝耳氏麻痹、良性自发性睑痉挛、良性局灶性、肌萎缩、良性颅内高血压、宾斯旺格氏病、睑痉挛、Bloch Sulzberger综合征、臂丛损伤、脑脓肿、脑损伤、脑肿瘤(包括多形性成胶
质细胞瘤)、脊髓肿瘤、布朗-塞卡尔综合征、卡纳万病、腕管综合征、灼痛、中枢性痛综合
征、脑桥中央髓鞘溶解、头部障碍、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、大脑性巨人症、大脑性麻痹、夏-马-图三氏病、化疗诱导的神经痛和神经性疼痛、Chiari畸形、舞蹈病、慢性炎性
脱髓鞘性多神经病、慢性痛、慢性区域性疼痛综合征、科-勒二氏综合征、昏迷，包括持续性植物状态、先天性面瘫、皮质基底核退化症、颅动脉炎、颅缝早闭、克雅氏病、累积性创伤失调、柯兴综合征、巨细胞性包涵体病、巨细胞病毒感染、眼足舞蹈综合征、丹-沃二氏综合
征、Dawson病、德摩西埃综合征、Dejerine-Klumke麻痹、痴呆、皮肌炎、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、家族性自主神经机能异常、书写困难、诵读困难、张力障碍、早期幼儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、欧勃(氏)麻痹、特发性震颤、法布里氏病、法尔氏综合征、晕厥、家族性痉挛性麻痹、热性惊厥、菲希尔综合征、弗里德赖希氏共济失调、额颞叶性痴呆和其它“tau蛋白病(tauopathies)”、高歇氏病、格斯特曼
氏综合征、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球样细胞脑白质营养不良、格-巴二氏综
合征、HTLV-1-相关脊髓病、哈-斯二氏病、颅脑损伤、头痛、半侧颜面痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性运动失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、Hirayama综合征、HIV相关痴呆和神经病(也即AIDS的神经表现)、前脑无裂畸形、亨廷顿氏舞蹈病和其它多聚谷氨酰胺
重复疾病(polyglutamine repeat disease)、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺
氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿型雷夫叙姆病(infantile refsum disease)、婴儿痉挛、炎症性肌病、颅内囊肿、颅内高血压、朱伯特综合征(Joubert syndrome)、卡恩斯塞尔综合征(Kearns-sayre syndrome)、肯尼迪病(Kennedy
disease)、金斯布林纳综合征(kinsbourne syndrome)、颈椎融合综合征(Klippel Feil
syndrome)、克拉伯病(Krabbe disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-welander
disease)、库鲁病(kuru)、拉福拉病(lafora disease)、朗-爱二氏肌无力综合
征(Lambert-eaton myasthenic syndrome)、获得性癫痫性失 语(Landau-Kleffner
syndrome)、延髓外侧(Wallenberg)综合征、学习无能、利氏病(leigh's disease)、
Lennox-Gastaut综合征(Lennox-gastaut syndrome)、莱施-尼汉综合征(Lesch-nyhan
syndrome)、脑白质营养不良、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合征(locked-in syndrome)、路格里克氏病(Lou Gehrig’s disease)(即运动神经元病或肌萎缩性侧索硬化)、腰椎间盘
病、莱姆病(lyme disease)-神经后遗症、马查多-约瑟夫病(machado-joseph disease)、
巨脑、巨脑畸形、梅尔克松-罗森塔尔综合征(Melkersson-rosenthal syndrome)、梅尼
埃病(Meniere's disease)、脑膜炎、门克斯病(Menkes disease)、异染性脑白质营养不
良、小头畸形、偏头痛、米勒-费雪综合征(Miller Fisher syndrome)、小中风、线粒体肌
病、默比乌斯综合征(mobius syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元病、烟雾病(moyamoya
disease)、粘多糖贮积病、多梗死性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化和其它脱髓鞘疾
病、多系统萎缩伴体位性低血压、肌肉萎缩症、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌阵挛脑病、肌阵挛、肌病、先天性肌强直、发作性睡病、神经纤维瘤病、抗精神病药恶性综合征、AIDS的神经表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元
移行异常、尼曼-匹克病(niemann-pick disease)、O'sullivan-Mcleod综合征、枕神经
痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征(Ohtahara syndrome)、橄榄体脑桥小
脑萎缩、视性眼阵挛-肌阵挛、视神经炎、直立性低血压、过劳综合征、感觉异常、神经变性疾病或障碍(帕金森氏症、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、
多发性硬化及其它与神经元细胞死亡相关的疾病和障碍)、先天性肌强直病、副肿瘤疾病、
阵发性发作(paroxysmal attacks)、帕罗综合征(Parry-Romberg syndrome)、佩-梅氏
病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、周期性麻痹、周围神经病变、疼痛性神经病和神经
性疼痛、持续性植物状态、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经挟捏、垂体瘤、多小脑回(pmg)、多肌炎、脑穿通畸形、脊髓灰质炎后综合征、带状疱疹后神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普-威二氏综合征(Prader-Willi syndrome)、
原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性面部单侧萎缩、进行性多灶性脑白质病、进行性硬化
性灰质萎缩、进行性核上麻痹、脑假瘤、拉姆齐-亨特综合征(I型和11型)、拉斯马森
(Rasmussen)脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、反复性运动障碍、反复
性应激损伤、多动腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、雷特综合征、雷耶氏综合征、圣维
特斯舞蹈病、桑德霍夫病、谢耳德病、脑裂、视隔发育不全(septo-optic dysplasia)、惊
吓婴儿综合征、带状疱疹、希-德综合征、斯耶格伦综合征、睡眠性呼吸暂停、索托斯综合
征(Soto’s syndrome)、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓瘤、脊髓性肌萎缩、僵人综合征(Stiff-Person syndrome)、中风、斯-韦综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性
脑病、西德纳姆舞蹈病、晕厥、脊髓空洞症、迟发性运动障碍、泰-萨病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征(tethered spinal cord syndrome)、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、三叉神经
痛、Todd麻痹、图雷特综合症、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、结节性硬化症、血管性痴呆(多发梗塞
性痴呆)、血管炎包括颞动脉炎、希-林二氏(Von Hippel-Lindau)病、瓦伦伯格综合征、
韦-霍(Werdnig-Hoffman)病、韦斯特综合征、颈部扭伤(whiplash)、威廉斯综合征、Wildon
病以及泽尔韦格综合征。
[0073] “增殖性疾病或障碍”包括，但不限于由骨髓、淋巴或红细胞谱系或其前体细胞产生的涉及造血系统源的增生性/赘生性细胞的造血系统肿瘤性疾病。这些包括，但不限于
成红细胞白血病、急性前髓性细胞白血病(APML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴样恶性
肿瘤包括，但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(其包括B-谱系ALL和T-谱系ALL)、
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦尔
登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)。另外的恶性淋巴瘤形式包括，但不限于非霍杰金淋巴瘤及
其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、
大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、何杰金病和李特-斯顿伯格病(Reed-Sternberg disease)。
成红细胞白血病、急性前髓性细胞白血病(APML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴样恶性
肿瘤包括，但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(其包括B-谱系ALL和T-谱系ALL)、
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦尔
登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)。另外的恶性淋巴瘤形式包括，但不限于非霍杰金淋巴瘤及
其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、
大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、何杰金病和李特-斯顿伯格病(Reed-Sternberg disease)。
[0074] “炎症”是指全身性炎性病症以及局部地与单核细胞、白细胞和/或中性粒细胞的迁移和吸引有关的病症。炎症的实例包括，但不限于由致病生物体(包括革兰氏阳性菌、革
兰氏阴性菌、病毒、真菌以及寄生生物如原生动物和蠕虫)的感染、移植排斥(包括实质器
官如肾、肝、心、肺或角膜的排斥以及骨髓移植物的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))产
生的炎症，或者由局限性慢性或急性自身免疫反应或变态反应产生的炎症。自身免疫性疾
病包括急性肾小球肾炎；类风湿性或反应性关节炎；慢性肾小球肾炎；炎性肠病如克罗恩
氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；肝炎；脓毒症；酒精性肝病；非酒精性脂肪变性；
与粒细胞输注有关的综合征；炎性皮肤病如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；系统性红斑
狼疮(SLE)；自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化以及糖尿病的某些形式、或任何其它自身免
疫状态(其中受试者自身免疫系统的攻击导致病理性组织破坏)。变态反应包括变应性哮
喘、慢性支气管炎、急性和迟发型超敏反应。全身性炎性疾病状态包括与创伤、烧伤、缺血
事件(例如在心、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中风)后的再
灌注、脓毒症、ARDS或多器官功能障碍综合征相关的炎症。炎性细胞募集也在粥样硬化斑
块中发生。炎症包括，但不限于非何杰金淋巴瘤、韦格纳肉芽肿病、桥本甲状腺炎、肝细胞
癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宫内膜异位(adenomyosis)、子宫内膜异位症(endometriosis)、急性子宫颈炎、慢性子宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、继发于特发性血小板减少性紫癜的肥大、原发性IgA肾病、系统性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎以及慢性膀胱炎。
兰氏阴性菌、病毒、真菌以及寄生生物如原生动物和蠕虫)的感染、移植排斥(包括实质器
官如肾、肝、心、肺或角膜的排斥以及骨髓移植物的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))产
生的炎症，或者由局限性慢性或急性自身免疫反应或变态反应产生的炎症。自身免疫性疾
病包括急性肾小球肾炎；类风湿性或反应性关节炎；慢性肾小球肾炎；炎性肠病如克罗恩
氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；肝炎；脓毒症；酒精性肝病；非酒精性脂肪变性；
与粒细胞输注有关的综合征；炎性皮肤病如接触性皮炎、特应性皮炎、银屑病；系统性红斑
狼疮(SLE)；自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化以及糖尿病的某些形式、或任何其它自身免
疫状态(其中受试者自身免疫系统的攻击导致病理性组织破坏)。变态反应包括变应性哮
喘、慢性支气管炎、急性和迟发型超敏反应。全身性炎性疾病状态包括与创伤、烧伤、缺血
事件(例如在心、脑、肠或外周脉管系统中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中风)后的再
灌注、脓毒症、ARDS或多器官功能障碍综合征相关的炎症。炎性细胞募集也在粥样硬化斑
块中发生。炎症包括，但不限于非何杰金淋巴瘤、韦格纳肉芽肿病、桥本甲状腺炎、肝细胞
癌、胸腺萎缩、慢性胰腺炎、类风湿性关节炎、反应性淋巴样增生、骨关节炎、溃疡性结肠炎、乳头状癌、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宫内膜异位(adenomyosis)、子宫内膜异位症(endometriosis)、急性子宫颈炎、慢性子宫颈炎、淋巴样增生、多发性硬化、继发于特发性血小板减少性紫癜的肥大、原发性IgA肾病、系统性红斑狼疮、银屑病、肺气肿、慢性肾盂肾炎以及慢性膀胱炎。
[0075] 多核苷酸和寡核苷酸组成和分子
[0076] 靶标：在一个实施方案中，靶标包括脑源神经营养因子(BDNF)的核酸序列，包括但不限于与BDNF有关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。PCT公开号WO
2010/093904和美国专利申请公开号2011/0319475(两者名称均为“Treatment of Brain
Derived Neurotrophic Factor(BDNF)Related Diseases by Inhibition of Natural
Antisense Transcript to BDNF”并通过引用全文并入本文)公开了BDNF为使用如其中所
述的寡核苷酸调节的靶标。
2010/093904和美国专利申请公开号2011/0319475(两者名称均为“Treatment of Brain
Derived Neurotrophic Factor(BDNF)Related Diseases by Inhibition of Natural
Antisense Transcript to BDNF”并通过引用全文并入本文)公开了BDNF为使用如其中所
述的寡核苷酸调节的靶标。
[0077] 神经营养蛋白为一类结构上相关的生长因子，其促进神经生存和分化。它们刺激神经突生长，表明其可促进受损神经元的再生，并充当靶标-衍生神经营养因子以在产生
神经营养蛋白的靶组织中刺激侧支出芽。脑源神经营养因子(BDNF)最初表征为存在于脑
提取物中的碱性蛋白并能够增加背根神经节的存活。当与细胞体的轴突交流被损伤中断
时，许旺细胞产生神经营养因子，例如神经生长因子(NGF)和BDNF。神经营养蛋白从许旺细
胞中释放且在再生轴突周围以梯度形式扩散式地分布，再生轴突然后顺着神经营养蛋白的
密度梯度向远侧延伸。已显示局部施用BDNF至新生大鼠中的横断神经防止轴突切断术后
运动神经元的大量死亡。BDNF的mRNA效价在轴突切断术四天后增加到正常水平的数倍，并
在4周时达到其最大值。此外，已报道BDNF增强培养物中胆碱能神经元的生存。
神经营养蛋白的靶组织中刺激侧支出芽。脑源神经营养因子(BDNF)最初表征为存在于脑
提取物中的碱性蛋白并能够增加背根神经节的存活。当与细胞体的轴突交流被损伤中断
时，许旺细胞产生神经营养因子，例如神经生长因子(NGF)和BDNF。神经营养蛋白从许旺细
胞中释放且在再生轴突周围以梯度形式扩散式地分布，再生轴突然后顺着神经营养蛋白的
密度梯度向远侧延伸。已显示局部施用BDNF至新生大鼠中的横断神经防止轴突切断术后
运动神经元的大量死亡。BDNF的mRNA效价在轴突切断术四天后增加到正常水平的数倍，并
在4周时达到其最大值。此外，已报道BDNF增强培养物中胆碱能神经元的生存。
[0078] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸用于预防和治疗与BDNF家族成员相关的疾病或障碍。可用本发明的反义寡核苷酸和/或用由使用反义化合物获得的和/或具有反义
化合物的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性脑源神经营养因子(BDNF)介导疾病和障
碍包括：与BDNF的异常功能和/或表达相关的疾病或障碍；神经疾病或障碍；与缺陷性神
经发生有关的疾病或病症；神经变性疾病或障碍(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨
廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化等)；神经精神障碍(抑郁症、精神分裂症、精神分裂症样精
神障碍(schizofreniform disorder)、情感分裂性精神障碍和妄想性障碍；焦虑性障碍例
如惊恐性障碍、恐怖症(包括广场恐怖症)、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、双相性精神
障碍、神经性厌食、神经性贪食)、中枢神经系统的自身免疫性障碍(例如，多发性硬化)、
记忆丧失、长期或短期记忆障碍、良性健忘、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、对病毒感染的神经元反应、脑损伤、发作性睡病、睡眠障碍(例如，昼夜节律障碍、失眠症和发作性睡病)；神经中断或神经损伤、脑脊髓神经索(CNS)中断和脑或神经细胞损伤、
与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐(vocal tic)为特征的运动和抽搐
障碍(例如，图雷特精神障碍(Tourette′s disorder)、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时
抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用障碍(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/
依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘障碍)、外伤
性脑损伤、耳鸣、神经痛(例如，三叉神经痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性疼痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、背痛、与癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病性神经
病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损
伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经病性疼痛)、在诸如糖尿病、MS和运动神经元病的疾病中导致neurodysthesias的不适当的神经元活性、共济失调、肌
肉强直(痉挛状态)、颞下颚关节功能障碍、奖赏缺陷综合征(RDS)、由酒精或物质滥用(例
如，摇头丸(ecstacy)、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，
非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)、克-雅氏病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、癫痫、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病变、周围神经病、神经移植并发症、运动神经元病、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、癌症、哮喘、特应性疾病、炎症、过敏症、湿疹、神经肿瘤学疾病或障碍、神经免疫学疾病或障碍和神经耳科疾病或障碍；以及与老化和衰老有关的疾病或障碍。
化合物的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性脑源神经营养因子(BDNF)介导疾病和障
碍包括：与BDNF的异常功能和/或表达相关的疾病或障碍；神经疾病或障碍；与缺陷性神
经发生有关的疾病或病症；神经变性疾病或障碍(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨
廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化等)；神经精神障碍(抑郁症、精神分裂症、精神分裂症样精
神障碍(schizofreniform disorder)、情感分裂性精神障碍和妄想性障碍；焦虑性障碍例
如惊恐性障碍、恐怖症(包括广场恐怖症)、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、双相性精神
障碍、神经性厌食、神经性贪食)、中枢神经系统的自身免疫性障碍(例如，多发性硬化)、
记忆丧失、长期或短期记忆障碍、良性健忘、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、对病毒感染的神经元反应、脑损伤、发作性睡病、睡眠障碍(例如，昼夜节律障碍、失眠症和发作性睡病)；神经中断或神经损伤、脑脊髓神经索(CNS)中断和脑或神经细胞损伤、
与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐(vocal tic)为特征的运动和抽搐
障碍(例如，图雷特精神障碍(Tourette′s disorder)、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时
抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用障碍(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/
依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘障碍)、外伤
性脑损伤、耳鸣、神经痛(例如，三叉神经痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性疼痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、背痛、与癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病性神经
病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损
伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经病性疼痛)、在诸如糖尿病、MS和运动神经元病的疾病中导致neurodysthesias的不适当的神经元活性、共济失调、肌
肉强直(痉挛状态)、颞下颚关节功能障碍、奖赏缺陷综合征(RDS)、由酒精或物质滥用(例
如，摇头丸(ecstacy)、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，
非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)、克-雅氏病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR综合征、听力损失、雷特综合征、癫痫、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病变、周围神经病、神经移植并发症、运动神经元病、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、癌症、哮喘、特应性疾病、炎症、过敏症、湿疹、神经肿瘤学疾病或障碍、神经免疫学疾病或障碍和神经耳科疾病或障碍；以及与老化和衰老有关的疾病或障碍。
[0079] 本发明提供了内源NAT抑制其有义基因对应物的转录的机制。本发明提出内源基因表达可以通过去除或抑制从大多数转录单元转录的NAT以基因座特异性的方式上调。
[0080] 本发明的一个实施方案提供调节蛋白质输出(可适用于许多其它基因组基因座的现象)的功能性ncRNA的实例。
[0081] 脑源神经营养因子(BDNF)是对于神经元生长、成熟分化和维持必要的生长因子“神经营养因子”家族的成员。BDNF对于神经元可塑性也是必要的且显示为涉及学习和记忆
过程。BDNF基因座是在染色体11上且显示两条链的活跃转录，其导致非编码NAT的转录。
过程。BDNF基因座是在染色体11上且显示两条链的活跃转录，其导致非编码NAT的转录。
[0082] 本发明鉴定了在体外和体内对有义BDNF mRNA和蛋白质的表达发挥有力的相互和动态调节作用的这一反义RNA分子(BDNF-AS)的调控作用。
[0083] 本发明的一个实施方案提供了使用反义RNA转录物抑制分子(称为AntagoNAT)上调mRNA表达的策略。AntagoNAT描述于例如PCT公开号WO 2012/068340中，其通过引用
全文并入。
全文并入。
[0084] 真核生物基因组中ncRNA的数目已显示随发育复杂性而增加，且例如在神经系统中表达的ncRNA中存在显著的多样性。在过去几年中，已经有功能性NAT的报告且证明了
其潜在地涉及人类障碍，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和脆性X染色体综合征。此外，
已经报告CD97有义基因的上调可以通过敲减其反义转录物实现。孕酮受体(PR)的上调及
其它内源转录物在启动子衍生的非编码RNA靶向后报告。p21基因和Oct4启动子的转录激
活在NAT删除后报告。反义RNA诱导的染色质重建对于许多低拷贝数NAT似乎是一种可行
的和动态的作用模式。如果是这样，反义RNA可以显著地发挥局部效应以维持或改变染色
质结构，最终激活或抑制有义基因表达。
其潜在地涉及人类障碍，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和脆性X染色体综合征。此外，
已经报告CD97有义基因的上调可以通过敲减其反义转录物实现。孕酮受体(PR)的上调及
其它内源转录物在启动子衍生的非编码RNA靶向后报告。p21基因和Oct4启动子的转录激
活在NAT删除后报告。反义RNA诱导的染色质重建对于许多低拷贝数NAT似乎是一种可行
的和动态的作用模式。如果是这样，反义RNA可以显著地发挥局部效应以维持或改变染色
质结构，最终激活或抑制有义基因表达。
[0085] PCR2是由四个核心亚基组成的蛋白质复合体：Eed、Suz12、RbAp48和催化性Ezh2(其催化组蛋白H3-赖氨酸的三甲基化(H3K27met3))。最近的研究提供了Ezh2和许
多ncRNA转录物之间的直接RNA-蛋白质相互作用的证据。X灭活和HOX基因簇的其它研究
显示RNA转录物参与PRC2-介导的H3K27met3(抑制性染色质标志)的诱导。PRC2转录组
谱在胚胎干细胞中已经鉴定了超过9,000个PRC2-相互作用RNA，它们中的许多分类为反义
RNA转录物。p15和DM1基因的后生沉默报告为通过其反义RNA涉及异染色质形成。染色
质常规地二元分成异染色质和常染色质类别可能不是完全的，因为最近的工作证明存在五
种主要的染色质类型，其比先前认为的具有更高的动态性和灵活性。类似地应用于大量的
基因座，NAT可以进行操作以获得染色质修饰中的基因座特异性改变。作为例子，BDNF基因
的反义转录物的切割(通过siRNA)或抑制(通过AntagoNAT)证明导致相应mRNA的上调。
多ncRNA转录物之间的直接RNA-蛋白质相互作用的证据。X灭活和HOX基因簇的其它研究
显示RNA转录物参与PRC2-介导的H3K27met3(抑制性染色质标志)的诱导。PRC2转录组
谱在胚胎干细胞中已经鉴定了超过9,000个PRC2-相互作用RNA，它们中的许多分类为反义
RNA转录物。p15和DM1基因的后生沉默报告为通过其反义RNA涉及异染色质形成。染色
质常规地二元分成异染色质和常染色质类别可能不是完全的，因为最近的工作证明存在五
种主要的染色质类型，其比先前认为的具有更高的动态性和灵活性。类似地应用于大量的
基因座，NAT可以进行操作以获得染色质修饰中的基因座特异性改变。作为例子，BDNF基因
的反义转录物的切割(通过siRNA)或抑制(通过AntagoNAT)证明导致相应mRNA的上调。
[0086] 神经营养因子属于增强神经元的存活、发育、分化和功能的一类分泌型生长因子，且BDNF是突触可塑性的重要分子介质。BDNF表明使神经元和胶质细胞成熟同步，参与轴
突和树突分化及保护和增强神经元细胞存活。神经营养因子表达水平在神经变性障碍中和
在精神和神经发育障碍中受损。神经营养因子的上调据认为对于几种神经障碍具有有益
效果。AntagoNAT可以用作抑制BDNF-AS的治疗策略并因此增强多种疾病状态中的神经元
增殖和存活。不能排除上调内源BDNF分子(推测包含天然修饰和代表所有已知的剪接形
式)的合成的本文描述的途径将证明与施用合成BDNF分子不同且也许优于施用合成BDNF
分子。
突和树突分化及保护和增强神经元细胞存活。神经营养因子表达水平在神经变性障碍中和
在精神和神经发育障碍中受损。神经营养因子的上调据认为对于几种神经障碍具有有益
效果。AntagoNAT可以用作抑制BDNF-AS的治疗策略并因此增强多种疾病状态中的神经元
增殖和存活。不能排除上调内源BDNF分子(推测包含天然修饰和代表所有已知的剪接形
式)的合成的本文描述的途径将证明与施用合成BDNF分子不同且也许优于施用合成BDNF
分子。
[0087] 在一个实施方案中，一种或多种反义寡核苷酸对BDNF的调节施用于需要的患者以预防或治疗与相比于正常对照的BDNF异常表达、功能、活性相关的任何疾病或障碍。
[0088] 在一个实施方案中，寡核苷酸对于本文中所述的BDNF的天然反义转录物是特异性的，其包括，但不限于非编码区域。BDNF靶标包括BDNF的变体；BDNF的突变体，包括SNP；
BDNF的非编码序列；等位基因、片段等。优选所述寡核苷酸为反义RNA分子。
BDNF的非编码序列；等位基因、片段等。优选所述寡核苷酸为反义RNA分子。
[0089] 依照本发明的实施方案，靶核酸分子不限于单独BDNF多核苷酸，而是扩展到BDNF的任何同种型、受体、同源物、非编码区等。
[0090] 在一个实施方案中，寡核苷酸靶向于BDNF靶标的天然反义序列(针对编码和非编码区的天然反义物)，所述BDNF靶标包括但不限于其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义RNA或DNA分子。
[0091] 在一个实施方案中，本发明的寡聚化合物也包括变体，其中在所述化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。例如，如果第一个核苷酸为腺嘌呤，则可产生在此位
置含有胸苷、鸟苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的变体。这可在所述反义化合物的任何
位置上完成。然后使用本文所述的方法来检测这些化合物以确定其抑制靶核酸的表达的能
力。
置含有胸苷、鸟苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的变体。这可在所述反义化合物的任何
位置上完成。然后使用本文所述的方法来检测这些化合物以确定其抑制靶核酸的表达的能
力。
[0092] 在一些实施方案中，反义化合物与靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约50％-约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％-约70％。在
一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同
源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或
互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同
源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或
互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
[0093] 反义化合物在以下情况时为可特异性杂交的：所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性损失，并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性
以避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这类条件包括，即，在体内测定或
治疗性处理情况中的生理条件，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件。
以避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这类条件包括，即，在体内测定或
治疗性处理情况中的生理条件，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件。
[0094] 反义化合物，不论DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情况时为可特异性杂交的：所述化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而引起效用损失，
并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶序
列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件，以及在体外
测定情况下在其中进行测定的条件。
并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶序
列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件，以及在体外
测定情况下在其中进行测定的条件。
[0095] 在一个实施方案中，靶向于BDNF调节BDNF的表达或功能，BDNF包括但不限于使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列、一个或多个如SEQ ID NO：3-11所述的序列，等
等。在一个实施方案中，表达或功能与对照相比为上调的。在一个实施方案中，表达或功能
与对照相比为下调的。
等。在一个实施方案中，表达或功能与对照相比为上调的。在一个实施方案中，表达或功能
与对照相比为下调的。
[0096] 在一个实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO：12-49所述的核酸序列，包括使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷
酸、较短或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、
二硫代磷酸酯等。在一个实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰
寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)可为单磷酸酯、二磷酸
酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。
酸、较短或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、
二硫代磷酸酯等。在一个实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰
寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)可为单磷酸酯、二磷酸
酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。
[0097] 反义物的特异性和敏感性也被本领域的技术人员用于治疗用途。已将反义寡核苷酸用作在动物和人的疾病状态治疗中的治疗部分。已将反义寡核苷酸安全和有效地施用给
人，并且目前正在进行许多临床试验。因此已确定寡核苷酸可为有用的治疗形式，其可经配
置以在用于治疗细胞、组织和动物尤其人的治疗方案中有用。
人，并且目前正在进行许多临床试验。因此已确定寡核苷酸可为有用的治疗形式，其可经配
置以在用于治疗细胞、组织和动物尤其人的治疗方案中有用。
[0098] 在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物(具体地寡核苷酸)结合到靶核酸分子并调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。
待干扰的RNA功能包括所有的生命机能，例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA
的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。所
述功能可被上调或受抑制，这取决于所需的功能。
待干扰的RNA功能包括所有的生命机能，例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA
的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。所
述功能可被上调或受抑制，这取决于所需的功能。
[0099] 反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接物、引物、探针和与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡聚化合物。因此，这些化合
物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
[0100] 在本发明的情况下，将反义化合物靶向于特定的核酸分子可为多步过程。所述过程通常以鉴定待调节其功能的靶核酸开始。此靶核酸可为，例如其表达与特定病症或疾病
状态有关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)，或来自传染剂的核酸分子。在本发明中，所
述靶核酸编码脑源神经营养因子(BDNF)。
状态有关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)，或来自传染剂的核酸分子。在本发明中，所
述靶核酸编码脑源神经营养因子(BDNF)。
[0101] 靶向过程通常也包括确定靶核酸内的至少一个靶区域、区段或位点以用于发生反义相互作用，使得产生所需的效应，例如，表达的调节。在本发明的情况中，术语“区域”定义为具有至少一个可识别结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸区域内为区段。“区
段”定义为在靶核酸内区域的较小或亚部分。本发明所用的“位点”定义为靶核酸内的位
置。
段”定义为在靶核酸内区域的较小或亚部分。本发明所用的“位点”定义为靶核酸内的位
置。
[0102] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到脑源神经营养因子(BDNF)的天然反义序列并调节BDNF(SEQ ID NO：1和2)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID NO：
3-55。
3-55。
[0103] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到脑源营养因子(BDNF)多核苷酸的一个或多个区段并调节BDNF的表达和/或功能。所述区段包含BDNF有义或反义多核苷酸的至
少五个连续的核苷酸。
少五个连续的核苷酸。
[0104] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸对BDNF的天然反义序列而言为特异性的，其中所述寡核苷酸与BDNF的天然反义序列的结合调节BDNF的表达和/或功能。
[0105] 在一个实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO：12-49所述的序列、使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个修饰核苷酸、较短
或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷
酸酯等。在一个实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸
中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸
酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。
或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷
酸酯等。在一个实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸
中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸
酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。
[0106] 由于如本领域已知，翻译起始密码子通常为5′-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中为5′-ATG)，因而翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”
或“AUG起始密码子”。少数基因具有翻译起始密码子，其具有RNA序列5′-GUG、5′-UUG
或5′-CUG；且5′-AUA、5′-ACG和5′-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起
始密码子”和“起始密码子”可包括许多密码子序列，但在每个情况下起始氨基酸通常为甲
硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有两个
或更多个备选起始密码子，其中的任何一个可优先地用于在特定细胞类型或组织中或在特
定条件集下的翻译起始。在本发明的情况中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指这样的一个或多个密码子，其在体内用于起始由编码脑源神经营养因子(BDNF)的基因转录的
mRNA的翻译，与这类密码子的序列无关。基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具
有三个序列中的一个，即5′-UAA、5′-UAG和5′-UGA(对应的DNA序列分别为5′-TAA、
5′-TAG和5′-TGA)。
或“AUG起始密码子”。少数基因具有翻译起始密码子，其具有RNA序列5′-GUG、5′-UUG
或5′-CUG；且5′-AUA、5′-ACG和5′-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起
始密码子”和“起始密码子”可包括许多密码子序列，但在每个情况下起始氨基酸通常为甲
硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有两个
或更多个备选起始密码子，其中的任何一个可优先地用于在特定细胞类型或组织中或在特
定条件集下的翻译起始。在本发明的情况中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指这样的一个或多个密码子，其在体内用于起始由编码脑源神经营养因子(BDNF)的基因转录的
mRNA的翻译，与这类密码子的序列无关。基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具
有三个序列中的一个，即5′-UAA、5′-UAG和5′-UGA(对应的DNA序列分别为5′-TAA、
5′-TAG和5′-TGA)。
[0107] 术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指从翻译起始密码子开始在任一方向上(即，5’或3’)包含约25-约50个连续的核苷酸的这类mRNA或基因的部分。类似
地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指从翻译终止密码子开始在任一方向上(即，5’或3’)包含约25-约50个连续的核苷酸的这类mRNA或基因的部分。因此，“起始
密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)均为
可用本发明的反义化合物有效地靶向于的区域。
地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指从翻译终止密码子开始在任一方向上(即，5’或3’)包含约25-约50个连续的核苷酸的这类mRNA或基因的部分。因此，“起始
密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)均为
可用本发明的反义化合物有效地靶向于的区域。
[0108] 本领域已知的开放阅读框(ORF)或“编码区”是指在翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也为可有效地靶向于的区域。在本发明的内容内，靶向的区域为包含基
因开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区。
因开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区。
[0109] 另一种靶区域包括本领域已知的5’非翻译区(5’UTR)，是指在翻译起始密码子的5’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸
(或基因上对应的核苷酸)。再一种靶区域包括本领域已知的3’非翻译区(3′UTR)，是指
在翻译终止密码子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3’末
端之间的核苷酸(或基因上对应的核苷酸)。mRNA的5’加帽位点包含经由5’-5’三磷酸
酯键连接到mRNA的5’最末端残基的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区包括5’
帽结构本身以及邻近该帽位点的前50个核苷酸。用于本发明的另一种靶区域为5’帽区。
(或基因上对应的核苷酸)。再一种靶区域包括本领域已知的3’非翻译区(3′UTR)，是指
在翻译终止密码子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3’末
端之间的核苷酸(或基因上对应的核苷酸)。mRNA的5’加帽位点包含经由5’-5’三磷酸
酯键连接到mRNA的5’最末端残基的N7-甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区包括5’
帽结构本身以及邻近该帽位点的前50个核苷酸。用于本发明的另一种靶区域为5’帽区。
[0110] 尽管一些真核mRNA转录物为直接翻译的，但是许多包含一个或多个称为“内含子”的区域，其在翻译前被从转录物中切除。余下的(且因此翻译的)区称为“外显子”，并
将其剪接在一起形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位点(即，内含子-外
显子连接处或外显子-内含子连接处)在疾病牵涉到异常剪接或疾病牵涉特定剪接产物
过度产生的状况中特别有用。因重排或缺失所致的异常融合连接为靶位点的另一个实施方
案。经由来自不同基因来源的两个(或更多个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录物称为
“融合转录物”。内含子可使用靶向于例如DNA或前-mRNA的反义化合物来有效地靶向。
将其剪接在一起形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位点(即，内含子-外
显子连接处或外显子-内含子连接处)在疾病牵涉到异常剪接或疾病牵涉特定剪接产物
过度产生的状况中特别有用。因重排或缺失所致的异常融合连接为靶位点的另一个实施方
案。经由来自不同基因来源的两个(或更多个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录物称为
“融合转录物”。内含子可使用靶向于例如DNA或前-mRNA的反义化合物来有效地靶向。
[0111] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到靶多核苷酸的编码和/或非编码区并调节靶分子的表达和/或功能。
[0112] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到天然反义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。
[0113] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到有义多核苷酸并调节靶分子的表达和/或功能。
[0114] 可变RNA转录物可产生自DNA的相同基因组区。这些可变转录物一般称为“变体”。更具体地，“前mRNA变体”为产生自相同的基因组DNA的转录物，其与产生自相同的基因组
DNA的其他转录物在其起始或终止位置上不同且包含内含子和外显子序列二者。
DNA的其他转录物在其起始或终止位置上不同且包含内含子和外显子序列二者。
[0115] 当剪接期间切除了一个或多个外显子或内含子区或其部分时，前mRNA变体产生更小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体为经加工的前mRNA变体，并且由于剪接导致每种独
特的前mRNA变体必须总是产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。
如果未发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体完全相同。
特的前mRNA变体必须总是产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。
如果未发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体完全相同。
[0116] 变体可通过使用可变信号启动或终止转录来产生。前mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。起源于使用可变起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该
前mRNA或mRNA的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的转录物称为该前mRNA或mRNA
的“可变终止变体”。可变终止变体的一个具体类型为“聚腺苷酸变体”，其中所产生的多重转录物起因于转录机构对“聚腺苷酸终止信号”之一的可变选择，从而产生终止在独特的聚
腺苷酸位点上的转录物。在本发明的情况内，本文所述的变体类型也为靶核酸的实施方案。
前mRNA或mRNA的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的转录物称为该前mRNA或mRNA
的“可变终止变体”。可变终止变体的一个具体类型为“聚腺苷酸变体”，其中所产生的多重转录物起因于转录机构对“聚腺苷酸终止信号”之一的可变选择，从而产生终止在独特的聚
腺苷酸位点上的转录物。在本发明的情况内，本文所述的变体类型也为靶核酸的实施方案。
[0117] 将反义化合物与之杂交的靶核酸上的位置定义为活性反义化合物靶向于的靶区域的至少5个核甘酸长的部分。
[0118] 虽然将某些示例性靶区段的具体序列列举于此，但是本领域的技术人员会认识到，这些用于说明和描述在本发明范围内的具体实施方案。根据本公开内容，其他靶区段可
由本领域普通技术人员容易地鉴定。
由本领域普通技术人员容易地鉴定。
[0119] 长度为5-100个核苷酸并包含选自说明性优选靶区段之内的一段至少五(5)个连续的核苷酸的延伸的靶区段认为同样适合靶向。
[0120] 靶区段可包括DNA或RNA序列，其包含来自说明性优选靶区段之一的5’末端的至少5个连续核苷酸(余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续延伸，其开始于靶区段5’末端
的紧接上游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。类似优选的靶区段
由以下DNA或RNA序列表示，该序列包含来自说明性优选靶区段之一的3’末端的至少5个
连续核苷酸(余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续延伸，其开始于靶区段3’末端的紧接
下游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。本领域技术人员根据本文
所说明的靶区段，无需过度试验就能够鉴定进一步优选的靶区段。
的紧接上游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。类似优选的靶区段
由以下DNA或RNA序列表示，该序列包含来自说明性优选靶区段之一的3’末端的至少5个
连续核苷酸(余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续延伸，其开始于靶区段3’末端的紧接
下游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止)。本领域技术人员根据本文
所说明的靶区段，无需过度试验就能够鉴定进一步优选的靶区段。
[0121] 一旦鉴定一个或多个靶区域、区段或位点，就选出与该靶标充分互补的反义化合物，即充分良好地且以足够的特异性杂交以得到所需的效果。
[0122] 在本发明的实施方案中，寡核苷酸与特定靶标的反义链结合。所述寡核苷酸长度为至少5个核苷酸且可为合成的，使得每个寡核苷酸靶向于重叠的序列，由此将寡核苷酸
合成为覆盖靶多核苷酸的全长。靶标也包括编码区以及非编码区。
合成为覆盖靶多核苷酸的全长。靶标也包括编码区以及非编码区。
[0123] 在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸来靶向于特定核酸。将反义化合物靶向于特定核酸为多步过程。该过程通常开始于鉴定其功能待调节的核酸序列。这可为，例
如其表达与特定的病症或疾病状态有关的细胞基因(或从该基因转录的mRNA)，或非编码
多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。
如其表达与特定的病症或疾病状态有关的细胞基因(或从该基因转录的mRNA)，或非编码
多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。
[0124] 可将RNA归类为(1)信使RNA(mRNA)，其被翻译成蛋白，和(2)非蛋白质编码的RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和包含高密度的终止密码子并缺少任何广泛的
“开放阅读框”的其他转录单元(TU)。许多ncRNA似乎开始于蛋白编码基因座的3’非翻译
区(3′UTR)中的起始位点。ncRNA常常为罕见的且至少一半已由FANTOM协会测序的ncRNA
似乎未聚腺苷酸化。大多数研究者因为明显的原因而关注经加工并输出到细胞质的聚腺苷
酸化mRNA。近来，已显示非聚腺苷酸化核RNA的群体可能非常巨大，且许多这类转录物产生
于所谓的基因内区。ncRNA可调节基因表达的机制为通过与靶转录物的碱基配对。通过碱
基配对起作用的RNA可分组成(1)顺式编码RNA，其在相同的基因位置、但在与其所作用的
RNA相反的链上编码，因此显示对其靶标完美的互补性，和(2)反式编码RNA，其在与其所作
用的RNA不同的染色体位置上编码，一般不表现出与其靶标完美的碱基配对潜能。
“开放阅读框”的其他转录单元(TU)。许多ncRNA似乎开始于蛋白编码基因座的3’非翻译
区(3′UTR)中的起始位点。ncRNA常常为罕见的且至少一半已由FANTOM协会测序的ncRNA
似乎未聚腺苷酸化。大多数研究者因为明显的原因而关注经加工并输出到细胞质的聚腺苷
酸化mRNA。近来，已显示非聚腺苷酸化核RNA的群体可能非常巨大，且许多这类转录物产生
于所谓的基因内区。ncRNA可调节基因表达的机制为通过与靶转录物的碱基配对。通过碱
基配对起作用的RNA可分组成(1)顺式编码RNA，其在相同的基因位置、但在与其所作用的
RNA相反的链上编码，因此显示对其靶标完美的互补性，和(2)反式编码RNA，其在与其所作
用的RNA不同的染色体位置上编码，一般不表现出与其靶标完美的碱基配对潜能。
[0125] 不希望受到理论的约束，通过本文所述的反义寡核苷酸来扰乱反义多核苷酸可改变相应有义信使RNA的表达。然而，此调节可能为非调和的(反义敲减导致信使RNA上升)
或致的(反义敲减导致伴随的信使RNA下降)。在这些情况下，可将反义寡核苷酸靶向于反
义转录物的重叠或非重叠部分，引起其敲减或隔离。编码以及非编码反义物可以相同的方
式来靶向，并且任一种类别均能够调节相应有义转录物——以调和或非调和的方式。用于
鉴定针对靶标使用的新寡核苷酸的策略可基于通过反义寡核苷酸或任何其他调节所需靶
标的方法来敲减反义RNA转录物。
或致的(反义敲减导致伴随的信使RNA下降)。在这些情况下，可将反义寡核苷酸靶向于反
义转录物的重叠或非重叠部分，引起其敲减或隔离。编码以及非编码反义物可以相同的方
式来靶向，并且任一种类别均能够调节相应有义转录物——以调和或非调和的方式。用于
鉴定针对靶标使用的新寡核苷酸的策略可基于通过反义寡核苷酸或任何其他调节所需靶
标的方法来敲减反义RNA转录物。
[0126] 策略1：在非调和调节的情况下，敲减所述反义转录物提升常规(有义)基因的表达。若后者基因编码已知或假定的药物靶标，则其反义配对物的敲减可预想到地模拟受体
激动剂或酶刺激剂的作用。
激动剂或酶刺激剂的作用。
[0127] 策略2：在调和调节的情况下，可以伴随地敲减反义和有义转录物两者，从而达到常规(有义)基因表达的协同下降。如果例如将反义寡核苷酸用于进行敲减，则此策略可
用于将靶向的一种反义寡核苷酸应用于有义转录物和将另一种反义寡核苷酸应用于相应
的反义转录物，或应用同时靶向于重叠的有义和反义转录物的单个有力对称的反义寡核苷
酸。
用于将靶向的一种反义寡核苷酸应用于有义转录物和将另一种反义寡核苷酸应用于相应
的反义转录物，或应用同时靶向于重叠的有义和反义转录物的单个有力对称的反义寡核苷
酸。
[0128] 根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及与靶核
酸的至少一部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样、RNA
样、或其混合物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹寡聚化合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起(bulge)、错配或环。将反义化合
物常规地制备为线性的，但可被连接或者另外制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包
括构建体，例如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性以允
许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下游离的3’或
5’末端，或可将其连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5’或3’末端上包含突出
端，从而产生单链特征的延伸。所述双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修
饰可包括与末端之一、经挑选的核苷酸位置、糖位置或与核苷间键之一连接的缀合基团。或
者，所述两条链可经由非核酸部分或连接基团来连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈自
身互补的发夹型分子形式，其在其自身上对折形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部
分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来完成，
然而，在一些实施方案中，基因表达或功能为上调的。当由两条链或呈其自身对折以形成双
链体的自身互补发夹型分子形式的单链形成时，所述两条链(或单链的双链体形成区)为
以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
酸的至少一部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样、RNA
样、或其混合物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹寡聚化合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起(bulge)、错配或环。将反义化合
物常规地制备为线性的，但可被连接或者另外制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包
括构建体，例如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性以允
许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下游离的3’或
5’末端，或可将其连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5’或3’末端上包含突出
端，从而产生单链特征的延伸。所述双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修
饰可包括与末端之一、经挑选的核苷酸位置、糖位置或与核苷间键之一连接的缀合基团。或
者，所述两条链可经由非核酸部分或连接基团来连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈自
身互补的发夹型分子形式，其在其自身上对折形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部
分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来完成，
然而，在一些实施方案中，基因表达或功能为上调的。当由两条链或呈其自身对折以形成双
链体的自身互补发夹型分子形式的单链形成时，所述两条链(或单链的双链体形成区)为
以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
[0129] 一旦引入系统，本发明的化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可经由基于占据的机制来运作。一般而言，核酸(包括寡核苷
酸)可描述为“DNA样”(即，一般具有一个或多个2’脱氧糖和一般地具有T而不是U碱
基)或“RNA样”(即，一般具有一个或多个2’羟基或2’修饰的糖和一般具有U而不是T
碱基)。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最常见地A和B型。据认为，一般而言，具有
B型样结构的寡核苷酸为“DNA样”而具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌
合的)实施方案中，反义化合物可包含A型区和B型区两者。
酸)可描述为“DNA样”(即，一般具有一个或多个2’脱氧糖和一般地具有T而不是U碱
基)或“RNA样”(即，一般具有一个或多个2’羟基或2’修饰的糖和一般具有U而不是T
碱基)。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最常见地A和B型。据认为，一般而言，具有
B型样结构的寡核苷酸为“DNA样”而具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌
合的)实施方案中，反义化合物可包含A型区和B型区两者。
[0130] 在一个实施方案中，所需的寡核苷酸或反义化合物包括以下的至少一种：反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰的键的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱
导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其组合。
导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其组合。
[0131] dsRNA也可激活基因表达，这是已被称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa的机制。靶向于基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。RNAa在人细胞中使用合成
dsRNA(称为“小激活RNA”(saRNA))证实。目前未知RNAa在其他生物体中是否为保守的。
dsRNA(称为“小激活RNA”(saRNA))证实。目前未知RNAa在其他生物体中是否为保守的。
[0132] 已发现小双链RNA(dsRNA)(例如小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA))是称为RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi总是经由重构染色质来导致基因沉默，从而抑
制转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而，在下文实施例章节详述的例子中，显示寡核
苷酸增加脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA也可
充当小激活RNA(saRNA)。不希望受理论约束，通过靶向于基因启动子中的序列，saRNA在称
为dsRNA诱导的转录激活(RNAa)的现象中诱导靶基因表达。
制转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而，在下文实施例章节详述的例子中，显示寡核
苷酸增加脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA也可
充当小激活RNA(saRNA)。不希望受理论约束，通过靶向于基因启动子中的序列，saRNA在称
为dsRNA诱导的转录激活(RNAa)的现象中诱导靶基因表达。
[0133] 在另一个实施方案中，本文鉴定的“优选靶区段”可用于筛选调节脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸表达的另外的化合物。“调节剂”为减少或增加编码BDNF的核酸分子
的表达的化合物并包含与优选靶区段互补的至少5个核苷酸的部分。筛选方法包括以下步
骤：使编码BDNF的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选
调节剂接触，以及选择一种或多种减少或增加编码BDNF多核苷酸的核酸分子表达的候选
调节剂(例如SEQ ID NO：12-49)。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如减少
或增加)编码BDNF多核苷酸的核酸分子的表达，则可将所述调节剂用于BDNF多核苷酸功
能的进一步调查研究，或用作依照本发明的研究、诊断或治疗剂。
的表达的化合物并包含与优选靶区段互补的至少5个核苷酸的部分。筛选方法包括以下步
骤：使编码BDNF的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选
调节剂接触，以及选择一种或多种减少或增加编码BDNF多核苷酸的核酸分子表达的候选
调节剂(例如SEQ ID NO：12-49)。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节(例如减少
或增加)编码BDNF多核苷酸的核酸分子的表达，则可将所述调节剂用于BDNF多核苷酸功
能的进一步调查研究，或用作依照本发明的研究、诊断或治疗剂。
[0134] 靶向于天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，BDNF基因(例如登录号NM_170735和NM_007540)。在一个实施方案中，靶标为BDNF基因的反义多核苷酸。在一个
实施方案中，反义寡核苷酸靶向于BDNF多核苷酸(例如登录号NM_170735和NM_007540)
的有义和/或天然反义序列、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子且所述靶标包括反义和/或有义BDNF多核苷酸的
编码和非编码区。
实施方案中，反义寡核苷酸靶向于BDNF多核苷酸(例如登录号NM_170735和NM_007540)
的有义和/或天然反义序列、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子且所述靶标包括反义和/或有义BDNF多核苷酸的
编码和非编码区。
[0135] 本发明的优选靶区段也可与本发明的其相应互补反义化合物结合，以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。
[0136] 本领域中已显示这类双链寡核苷酸部分经由反义机制来调节靶表达和调节翻译以及RNA加工。此外，所述双链部分可经受化学修饰。例如，已显示这类双链部分通过所述
双链体的反义链与靶标的经典杂交来抑制该靶标，从而触发靶标的酶促降解。
双链体的反义链与靶标的经典杂交来抑制该靶标，从而触发靶标的酶促降解。
[0137] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向于脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸(例如登录号NM_170735和NM_007540)、其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子。
[0138] 依照本发明的实施方案，靶核酸分子不限于单独的BDNF而是延伸到其任何多核苷酸变体及产生、影响、作用或导致BDNF表达产物和或/其任何同种型或者与BDNF表达产
物和或/其任何同种型相关的任何多核苷酸。
物和或/其任何同种型相关的任何多核苷酸。
[0139] 在一个实施方案中，寡核苷酸靶向于BDNF多核苷酸的天然反义序列(例如，如SEQID NO：3-11所示的多核苷酸)，以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO：12-49所述。
[0140] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸与BDNF反义物的核酸序列互补或结合，并调节BDNF分子的表达和/或功能，所述核酸序列包括但不限于与BDNF多核苷酸有关的非编码有
义和/或反义序列。
义和/或反义序列。
[0141] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸与如SEQ ID NO：3-11所示的BDNF天然反义物的核酸序列互补或结合，并调节BDNF分子的表达和/或功能。
[0142] 在一个实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：12-49的至少5个连续核苷酸的序列且调节BDNF分子的表达和/或功能。
[0143] 多核苷酸靶标包括BDNF(包括其家族成员、BDNF的变体)；BDNF的突变体(包括SNP)；BDNF的非编码序列；BDNF的等位基因；物种变体、片段等等。优选所述寡核苷酸为反
义分子。
义分子。
[0144] 在一个实施方案中，靶向于BDNF多核苷酸的寡核苷酸包括：反义RNA、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹
RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；或小激活RNA(saRNA)。
RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；或小激活RNA(saRNA)。
[0145] 在一个实施方案中，脑源神经营养因子(BDNF)多核苷酸的靶向(例如SEQ ID NO：3-55)调节这些靶标的表达或功能。在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为上调的。
在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为下调的。
在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为下调的。
[0146] 在一个实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID NO：12-49所示的序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷酸、更短或更长的片段、经修饰的键等等。
[0147] 在一个实施方案中，SEQ ID NO：12-49包含一个或多个LNA核苷酸。表1显示可用于本发明的方法中的示例性反义寡核苷酸。
[0148] 表1:
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153] 所需靶核酸的调节可以本领域已知的数种方式来进行。例如，反义寡核苷酸、siRNA等。酶性核酸分子(例如，核酶)为能够催化一种或多种不同反应(包括以核苷酸碱
基序列特异的方式重复切割其他单独核酸分子的能力)的核酸分子。这类酶性核酸分子可
用于，例如，靶向于几乎任何RNA转录物。
基序列特异的方式重复切割其他单独核酸分子的能力)的核酸分子。这类酶性核酸分子可
用于，例如，靶向于几乎任何RNA转录物。
[0154] 由于反式切割酶性核酸分子的序列特异性，其有望作为用于人类疾病的治疗剂。可将酶性核酸分子设计成在细胞RNA背景下切割特定的RNA靶标。这类切割事件致使mRNA
无功能且终止从该RNA的蛋白质表达。以这种方式，可选择性地抑制与疾病状态有关的蛋
白质的合成。
无功能且终止从该RNA的蛋白质表达。以这种方式，可选择性地抑制与疾病状态有关的蛋
白质的合成。
[0155] 一般而言，带有RNA切割活性的酶性核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。这类结合通过酶性核酸的靶结合部分来进行，该酶性核酸的靶结合部分保持紧密靠近进行切割
靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶性核酸首先识别而后通过互补的碱基配对与靶RNA
结合，且一旦与正确的位点结合，即酶促地作用以切割靶RNA。这类靶RNA的策略性切割将
破坏其指导编码蛋白质合成的能力。在酶性核酸结合和切割其RNA靶标之后，其从该RNA
释放以寻找另一个靶标且可重复结合和切割新靶标。
靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶性核酸首先识别而后通过互补的碱基配对与靶RNA
结合，且一旦与正确的位点结合，即酶促地作用以切割靶RNA。这类靶RNA的策略性切割将
破坏其指导编码蛋白质合成的能力。在酶性核酸结合和切割其RNA靶标之后，其从该RNA
释放以寻找另一个靶标且可重复结合和切割新靶标。
[0156] 已使用诸如体外选择(进化)策略(Orgel，(1979)Proc.R.Soc.London，B 205，435)等数种途径来演化能够催化多种反应的新核酸催化剂，所述反应为例如磷酸二酯键和
酰胺键的切割和连接。
酰胺键的切割和连接。
[0157] 催化活性最佳的核酶的开发会显著地有助于以调节基因表达为目的而采用RNA-1
切割核酶的任何策略。例如锤头核酶在Mg2+辅因子的饱和(10mM)浓度存在下，以约1min
-1
的催化速率(kcat)起作用。已显示人造“RNA连接酶”核酶以约100min 的速率催化相应
的自身修饰反应。此外，已知具有由DNA组成的底物结合臂的某些经修饰的锤头核酶以接
-1
近100min 的多重转换速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最终，用某些核
苷酸类似物置换在锤头的催化核心内的特定残基产生显示出在催化速率上多达10倍改进
的修饰核酶。这些研究结果证实核酶可以以显著高于大多数天然自身切割核酶体外展示的
催化速率来促进化学转化。那么可能的是，可优化某些自身切割核酶的结构以产生最高的
催化活性，或者可制备展示出显著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA基序。
切割核酶的任何策略。例如锤头核酶在Mg2+辅因子的饱和(10mM)浓度存在下，以约1min
-1
的催化速率(kcat)起作用。已显示人造“RNA连接酶”核酶以约100min 的速率催化相应
的自身修饰反应。此外，已知具有由DNA组成的底物结合臂的某些经修饰的锤头核酶以接
-1
近100min 的多重转换速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最终，用某些核
苷酸类似物置换在锤头的催化核心内的特定残基产生显示出在催化速率上多达10倍改进
的修饰核酶。这些研究结果证实核酶可以以显著高于大多数天然自身切割核酶体外展示的
催化速率来促进化学转化。那么可能的是，可优化某些自身切割核酶的结构以产生最高的
催化活性，或者可制备展示出显著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA基序。
[0158] 符合“锤头”模型的RNA催化剂对RNA底物的分子间切割首先显示于1987年(Uhlenbeck，O.C.(1987)Nature，328：596-600)。将所述RNA催化剂回收且与多个RNA分子
反应，证实其为真正催化性的。
反应，证实其为真正催化性的。
[0159] 基于“锤头”基序设计的催化性RNA已通过在催化性RNA中作出适当的碱基改变以维持与靶序列的必要碱基配对，来用于切割特定靶序列。这允许使用催化性RNA来切割
特定靶序列，并表明根据“锤头”模型设计的催化性RNA可能在体内切割特定底物RNA。
特定靶序列，并表明根据“锤头”模型设计的催化性RNA可能在体内切割特定底物RNA。
[0160] RNA干扰(RNAi)已成为调节哺乳动物和哺乳动物细胞中基因表达的强大工具。此方法要求使用表达质粒或病毒以及加工成siRNA的小发夹RNA的编码序列，将小干扰
RNA(siRNA)作为RNA本身或作为DNA递送。此系统能够有效将前siRNA转运到它们在其中
活跃的细胞质中，并允许使用经调节的和组织特异的启动子用于基因表达。
RNA(siRNA)作为RNA本身或作为DNA递送。此系统能够有效将前siRNA转运到它们在其中
活跃的细胞质中，并允许使用经调节的和组织特异的启动子用于基因表达。
[0161] 在一个实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或多聚体、或其模拟物、嵌合体、类似物或同源物。此术语包括由天然
存在核苷酸、糖和共价核苷间(骨架)键组成的寡核苷酸以及类似地起作用的具有非天然
存在部分的寡核苷酸。由于所需性质，例如，增强的细胞摄取、对靶核酸增强的亲和力以及
在核酸酶存在时增大的稳定性，常常需要这类经修饰或取代的寡核苷酸超过天然形式。
存在核苷酸、糖和共价核苷间(骨架)键组成的寡核苷酸以及类似地起作用的具有非天然
存在部分的寡核苷酸。由于所需性质，例如，增强的细胞摄取、对靶核酸增强的亲和力以及
在核酸酶存在时增大的稳定性，常常需要这类经修饰或取代的寡核苷酸超过天然形式。
[0162] 根据本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同源物)、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA，以及与靶核酸的至少一部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。因此，它们可为DNA、RNA、DNA样、RNA样、或其混合
物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹寡聚化
合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起、错配或环。将反义化合物常规地线性制备，
但可以接合或者另外地制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包括构建体，例如杂交以
形成完全或部分双链化合物的两条链，或带有足够自身互补性以允许杂交并形成完全或部
分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下游离的3’或5’末端或可将其连接
形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5’或3’末端上包含突出端，从而产生单链特征
的延伸。双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修饰可包括与末端之一、经挑
选的核苷酸位置、糖位置或核苷间键之一连接的缀合基团。可选地，所述两条链可经由非核
酸部分或连接基团来连接。当形成自仅一条链时，dsRNA可采取自身互补的发夹型分子的
形式，其在其自身上对折以形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部分双链的。基因表
达的特异性调节可通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来完成。当形成自两条链
或采取在其自身上对折以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式的单链时，所述两条链
(或单链的双链体形成区域)为以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或发夹寡聚化
合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起、错配或环。将反义化合物常规地线性制备，
但可以接合或者另外地制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包括构建体，例如杂交以
形成完全或部分双链化合物的两条链，或带有足够自身互补性以允许杂交并形成完全或部
分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下游离的3’或5’末端或可将其连接
形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5’或3’末端上包含突出端，从而产生单链特征
的延伸。双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修饰可包括与末端之一、经挑
选的核苷酸位置、糖位置或核苷间键之一连接的缀合基团。可选地，所述两条链可经由非核
酸部分或连接基团来连接。当形成自仅一条链时，dsRNA可采取自身互补的发夹型分子的
形式，其在其自身上对折以形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部分双链的。基因表
达的特异性调节可通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来完成。当形成自两条链
或采取在其自身上对折以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式的单链时，所述两条链
(或单链的双链体形成区域)为以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
[0163] 一旦引入系统，本发明的化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可经由基于占据的机制来工作。一般而言，核酸(包括寡核苷
酸)可描述为“DNA样”(即，一般具有一个或多个2’脱氧糖和，一般地，T而不是U碱基)
或“RNA样”(即，一般具有一个或多个2’羟基或2’修饰的糖和，一般U而不是T碱基)。
核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最普通地A和B型。据认为，一般而言，具有B型样
结构的寡核苷酸为“DNA样”而具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌合的)
实施方案中，反义化合物可包含A型和B型区域两者。
酸)可描述为“DNA样”(即，一般具有一个或多个2’脱氧糖和，一般地，T而不是U碱基)
或“RNA样”(即，一般具有一个或多个2’羟基或2’修饰的糖和，一般U而不是T碱基)。
核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最普通地A和B型。据认为，一般而言，具有B型样
结构的寡核苷酸为“DNA样”而具有A型样结构的寡核苷酸为“RNA样”。在一些(嵌合的)
实施方案中，反义化合物可包含A型和B型区域两者。
[0164] 依照本发明的反义化合物可包含长度约5-约80个核苷酸(即约5-约80个连接的核苷)的反义部分。这是指反义化合物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链
反义化合物包含5-约80个核苷酸，而本发明的双链反义化合物(例如，dsRNA)包含5-约
80个核苷酸长度的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员将认识到，这包括5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分。
反义化合物包含5-约80个核苷酸，而本发明的双链反义化合物(例如，dsRNA)包含5-约
80个核苷酸长度的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员将认识到，这包括5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分。
[0165] 在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有10-50个核苷酸长度的反义部分。本领域普通技术人员将认识到，这包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49或50个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，
寡核苷酸长度为15个核苷酸。
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49或50个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，
寡核苷酸长度为15个核苷酸。
[0166] 在一个实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物具有12或13-30个核苷酸长度的反义部分。本领域普通技术人员将认识到，这包括具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分的反义化合物。
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度、或其之内任何范围的反义部分的反义化合物。
[0167] 在一个实施方案中，本发明的寡聚化合物也包括其中不同的碱基存在于化合物中的一个或多个核苷酸位置上的变体。例如，如果第一个核苷酸为腺苷，那么可产生在此位置
包含胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可在反义或dsRNA化合物的任何位置上进行。然后使用
本文所述的方法来测试这些化合物以确定其抑制靶核酸表达的能力。
包含胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可在反义或dsRNA化合物的任何位置上进行。然后使用
本文所述的方法来测试这些化合物以确定其抑制靶核酸表达的能力。
[0168] 在一些实施方案中，反义化合物与靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约40％-约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％-约70％。在
一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同
源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或
互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同
源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或
互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
[0169] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：12-49中所示的核酸分子)包含一个或多个取代或修饰。在一个实施方案中，将核苷酸用锁核酸(LNA)取代。
[0170] 在一个实施方案中，寡核苷酸靶向于与BDNF有关的编码和/或非编码序列以及如SEQ ID NO：1-11所示序列的有义和/或反义的核酸分子的一个或多个区域。也将寡核苷
酸靶向于SEQ ID NO：1-11的重叠区域。
酸靶向于SEQ ID NO：1-11的重叠区域。
[0171] 本发明的某些优选的寡核苷酸为嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”，在本发明的背景中，为包含两个或更多个化学上不同区域的寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸典型地包含赋予一种或多种有益特性(例如，对核酸酶的抗性
增强、细胞摄入增加、对靶标的结合亲和力增强)的修饰核苷酸的至少一个区域，以及作为
能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶底物的区域。作为实例，核糖核酸酶H为细胞核
酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。核糖核酸酶H的活化因此导致RNA靶标的切
割，从而大大地增强基因表达的反义调节效率。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，与杂交到相
同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，常常可用较短的寡核苷酸获得相当的结果。RNA
靶标的切割可通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规地检测。在一个
实施方案中，嵌合寡核苷酸包含修饰成增加靶结合亲和力的至少一个区域，并且通常包含
充当核糖核酸酶H的底物的区域。寡核苷酸对其靶标(在此情况下，编码ras的核酸)的
亲和力通过测量寡核苷酸/靶标对的Tm来常规地确定，Tm为寡核苷酸与靶标解离的温度；
解离以分光光度法检测。Tm越高，寡核苷酸对靶标的亲和力越大。
增强、细胞摄入增加、对靶标的结合亲和力增强)的修饰核苷酸的至少一个区域，以及作为
能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶底物的区域。作为实例，核糖核酸酶H为细胞核
酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。核糖核酸酶H的活化因此导致RNA靶标的切
割，从而大大地增强基因表达的反义调节效率。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，与杂交到相
同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，常常可用较短的寡核苷酸获得相当的结果。RNA
靶标的切割可通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规地检测。在一个
实施方案中，嵌合寡核苷酸包含修饰成增加靶结合亲和力的至少一个区域，并且通常包含
充当核糖核酸酶H的底物的区域。寡核苷酸对其靶标(在此情况下，编码ras的核酸)的
亲和力通过测量寡核苷酸/靶标对的Tm来常规地确定，Tm为寡核苷酸与靶标解离的温度；
解离以分光光度法检测。Tm越高，寡核苷酸对靶标的亲和力越大。
[0172] 本发明的嵌合反义化合物可作为如上所述的两个或更多个寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构而形成。本领域亦已将这类化合物称为
杂合体或间体(gapmer)。教导这类杂合结构制备的代表性美国专利包括但不限于，美国
专利第5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、
5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922号，每个通过引用结合于本文
中。
杂合体或间体(gapmer)。教导这类杂合结构制备的代表性美国专利包括但不限于，美国
专利第5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、
5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922号，每个通过引用结合于本文
中。
[0173] 在一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸区域包含在糖的2’位置上修饰的至少一个核苷酸，最优选2’-O烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟修饰的核苷酸。在其它的实施
方案中，RNA修饰包括在RNA 3’末端的嘧啶、脱碱基残基或反向碱基的核糖上的2’-氟、
2’-氨基和2’O-甲基修饰。将这类修饰常规地掺入到寡核苷酸中，且已显示这些寡核苷酸
针对给定靶标具有比2’-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。这种增加
的亲和力的效应大大地增强基因表达的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H为切割RNA:DNA
双链体的RNA链的细胞核酸内切酶；此酶的活化因此导致RNA靶标的切割，且因此可大大地
增强RNAi抑制效率。RNA靶标的切割可通过凝胶电泳来常规地证实。在一个实施方案中，
也修饰嵌合寡核苷酸以增强核酸酶抗性。细胞包含可降解核酸的各种核酸外切酶和核酸内
切酶。已显示许多核苷酸和核苷修饰使它们掺入的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶
消化有更高抗性。核酸酶抗性通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起孵育
并测定随时间推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通过凝胶电泳)来常规地测定。已
经修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰寡核苷酸保持完整更长时间。已证实多种
寡核苷酸修饰增强或赋予核酸酶抗性。包含至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸为目前更
优选的。在一些情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能够独立地增强核酸酶抗性。
方案中，RNA修饰包括在RNA 3’末端的嘧啶、脱碱基残基或反向碱基的核糖上的2’-氟、
2’-氨基和2’O-甲基修饰。将这类修饰常规地掺入到寡核苷酸中，且已显示这些寡核苷酸
针对给定靶标具有比2’-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。这种增加
的亲和力的效应大大地增强基因表达的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H为切割RNA:DNA
双链体的RNA链的细胞核酸内切酶；此酶的活化因此导致RNA靶标的切割，且因此可大大地
增强RNAi抑制效率。RNA靶标的切割可通过凝胶电泳来常规地证实。在一个实施方案中，
也修饰嵌合寡核苷酸以增强核酸酶抗性。细胞包含可降解核酸的各种核酸外切酶和核酸内
切酶。已显示许多核苷酸和核苷修饰使它们掺入的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶
消化有更高抗性。核酸酶抗性通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起孵育
并测定随时间推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通过凝胶电泳)来常规地测定。已
经修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰寡核苷酸保持完整更长时间。已证实多种
寡核苷酸修饰增强或赋予核酸酶抗性。包含至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸为目前更
优选的。在一些情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能够独立地增强核酸酶抗性。
[0174] 预想用于本发明的一些优选寡核苷酸的具体实例包括包含经修饰的骨架的那些，所述经修饰的骨架为例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或
者短链杂原子或杂环糖间键。最优选的为带有硫代磷酸酯骨架和带有杂原子骨架的寡核
苷酸，特别地CH2-NH-O-CH2、CH,-N(CH3)-O-CH2[称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架]、
CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH。由De Mesmaeker等，(1995)Acc.Chem.Res.28：366-374公开的酰胺骨
架也为优选的。同样优选的为具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸(Summerton和Weller，美国
专利第5,034,506号)。在其他的实施方案中，将寡核苷酸的例如肽核酸(PNA)骨架、磷酸
二酯骨架替换为聚酰胺骨架，核苷酸直接或间接地与聚酰胺骨架的氮杂氮原子结合。寡核
苷酸也可包含一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一种：
OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1-约10；C1-C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；改进寡核苷酸药代动力学特性的基团；或改进寡核苷酸药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代
基。优选的修饰包括2’-甲氧乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧乙基)]。
其他优选的修饰包括2’-甲氧基(2′-O-CH3)、2’-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)和2’-氟
(2′-F)。类似的修饰也可在寡核苷酸的其他位置上进行，具体地在3’末端核苷酸上糖的
3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模拟物例如取代戊呋喃糖基基团
的环丁基。
者短链杂原子或杂环糖间键。最优选的为带有硫代磷酸酯骨架和带有杂原子骨架的寡核
苷酸，特别地CH2-NH-O-CH2、CH,-N(CH3)-O-CH2[称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架]、
CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH。由De Mesmaeker等，(1995)Acc.Chem.Res.28：366-374公开的酰胺骨
架也为优选的。同样优选的为具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸(Summerton和Weller，美国
专利第5,034,506号)。在其他的实施方案中，将寡核苷酸的例如肽核酸(PNA)骨架、磷酸
二酯骨架替换为聚酰胺骨架，核苷酸直接或间接地与聚酰胺骨架的氮杂氮原子结合。寡核
苷酸也可包含一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一种：
OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1-约10；C1-C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；改进寡核苷酸药代动力学特性的基团；或改进寡核苷酸药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代
基。优选的修饰包括2’-甲氧乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧乙基)]。
其他优选的修饰包括2’-甲氧基(2′-O-CH3)、2’-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)和2’-氟
(2′-F)。类似的修饰也可在寡核苷酸的其他位置上进行，具体地在3’末端核苷酸上糖的
3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模拟物例如取代戊呋喃糖基基团
的环丁基。
[0175] 寡核苷酸也可另外地或替代地包含核碱基(本领域常常简称为“碱基”)修饰或取代。本文所用的“未修饰的”或“天然的”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶
(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷酸包括在天然核酸中仅稀少或短暂地存在的核
苷酸，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特别地5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’脱氧胞嘧啶且常常在本领域中称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖
基HMC，以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺
嘌呤、2-(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、
5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨己基)腺嘌呤
和2,6-二氨基嘌呤。可包括本领域已知的“通用的”碱基，例如，肌苷。已显示5-Me-C取
代增强核酸双链体的稳定性达0.6-1.2℃且为目前优选的碱基取代。
(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷酸包括在天然核酸中仅稀少或短暂地存在的核
苷酸，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特别地5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’脱氧胞嘧啶且常常在本领域中称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖
基HMC，以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺
嘌呤、2-(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、
5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨己基)腺嘌呤
和2,6-二氨基嘌呤。可包括本领域已知的“通用的”碱基，例如，肌苷。已显示5-Me-C取
代增强核酸双链体的稳定性达0.6-1.2℃且为目前优选的碱基取代。
[0176] 本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使一种或多种增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。这类部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇
部分、胆甾醇基部分，脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基，聚胺或聚乙二醇链，或者金
刚烷乙酸。包含亲脂性部分的寡核苷酸以及用于制备这类寡核苷酸的方法为本领域已知
的，例如美国专利第5,138,045、5,218,105和5,459,255号。
部分、胆甾醇基部分，脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基，聚胺或聚乙二醇链，或者金
刚烷乙酸。包含亲脂性部分的寡核苷酸以及用于制备这类寡核苷酸的方法为本领域已知
的，例如美国专利第5,138,045、5,218,105和5,459,255号。
[0177] 无需将给定寡核苷酸中的所有位置一致地修饰，且实际上多于一种的上述修饰可掺入到单个寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷内。本发明也包括作为如上文中定
义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。
义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。
[0178] 在另一个实施方案中，本发明的核酸分子与另一个部分缀合，所述部分包括但不限于脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质或聚碳氢化合物。本领域技术人员将认识到，可将这些分子在糖、碱基或磷酸基的数个位置上连接到构成核酸分子的任
何核苷酸中的一个或多个。
何核苷酸中的一个或多个。
[0179] 依照本发明使用的寡核苷酸可通过众所周知的固相合成技术来便利和常规地制备。用于这类合成的设备由包括Applied Biosystems在内的数个供应商销售。也可使用
用于这类合成的任何其他方法；寡核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的才能之
内。亦众所周知的是使用类似技术来制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
还众所周知的是使用类似技术和商购的经修饰的amidites和可控孔度玻璃(CPG)产品，
例如生物素、荧光素、吖啶、或补骨脂素修饰的amidites和/或CPG(可从Glen Research，
Sterling VA购买)，以合成荧光标记的、生物素化的或其他修饰的寡核苷酸，例如胆固醇修
饰的寡核苷酸。
用于这类合成的任何其他方法；寡核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的才能之
内。亦众所周知的是使用类似技术来制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
还众所周知的是使用类似技术和商购的经修饰的amidites和可控孔度玻璃(CPG)产品，
例如生物素、荧光素、吖啶、或补骨脂素修饰的amidites和/或CPG(可从Glen Research，
Sterling VA购买)，以合成荧光标记的、生物素化的或其他修饰的寡核苷酸，例如胆固醇修
饰的寡核苷酸。
[0180] 依照本发明，使用修饰(例如使用LNA单体)以增加寡核苷酸的效能、特异性和作用持续时间并拓宽其施用途径，所述寡核苷酸由诸如MOE、ANA、FANA、PS等当前的化学物质
组成。这可通过用LNA单体取代当前寡核苷酸中的一些单体来完成。LNA修饰的寡核苷酸
可具有类似于母体化合物的大小或者可更大或优选更小。优选这类LNA修饰寡核苷酸包含
少于约70％、更优选少于约60％、最优选少于约50％的LNA单体且其大小在约5-25个核苷
酸之间，更优选在约12-20个核苷酸之间。
组成。这可通过用LNA单体取代当前寡核苷酸中的一些单体来完成。LNA修饰的寡核苷酸
可具有类似于母体化合物的大小或者可更大或优选更小。优选这类LNA修饰寡核苷酸包含
少于约70％、更优选少于约60％、最优选少于约50％的LNA单体且其大小在约5-25个核苷
酸之间，更优选在约12-20个核苷酸之间。
[0181] 优选的修饰寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦
酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基
磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯
(boranophosphates)、这些的2’-5’连接类似物，以及具有反极性的那些，其中核苷单元的相邻对为3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接的。也包括各种盐、混合盐和游离酸形
式。
酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基
磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯
(boranophosphates)、这些的2’-5’连接类似物，以及具有反极性的那些，其中核苷单元的相邻对为3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接的。也包括各种盐、混合盐和游离酸形
式。
[0182] 教导制备上述含磷键的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、
5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、
5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、
5,571,799、5,587,361和5,625,050号，每个通过引用结合于本文中。
5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、
5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、
5,571,799、5,587,361和5,625,050号，每个通过引用结合于本文中。
[0183] 优选的修饰寡核苷酸骨架(其中不包含磷原子)，具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形
成的骨架。这些包括具有吗啉代键的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化
物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲
基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼
基骨架；磺酸酯或氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
成的骨架。这些包括具有吗啉代键的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化
物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲
基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼
基骨架；磺酸酯或氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
[0184] 教导制备上述寡聚核苷的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、
5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、
5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、
5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439号，每个通过引用
结合于本文中。
5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、
5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、
5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439号，每个通过引用
结合于本文中。
[0185] 在其他优选的寡核苷酸模拟物中，将核苷酸单元的糖和核苷间键(即骨架)均用新基团替换。维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这类寡聚化合物，即已显
示具有优秀的杂交特性的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸
的糖骨架替换为含酰胺的骨架，具体地氨乙基氨基乙酸骨架。将核碱基保留并直接或间接
地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但
不限于，美国专利第5,539,082、5,714,331和5,719,262号，每个通过引用结合于本文中。
PNA化合物的进一步教导可在Nielsen等，(1991)Science 254，1497-1500中找到。
示具有优秀的杂交特性的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸
的糖骨架替换为含酰胺的骨架，具体地氨乙基氨基乙酸骨架。将核碱基保留并直接或间接
地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但
不限于，美国专利第5,539,082、5,714,331和5,719,262号，每个通过引用结合于本文中。
PNA化合物的进一步教导可在Nielsen等，(1991)Science 254，1497-1500中找到。
[0186] 在本发明的一个实施方案中，带有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和带有杂原子骨架的寡聚核苷，具体地-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI
骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示为上文引用的美国专利第5,489,677号的-O-P-O-CH2-，以及上文引用的美国
专利第5,602,240号的酰胺骨架。同样优选的为具有上文引用的美国专利第5,034,506号
的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。
骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示为上文引用的美国专利第5,489,677号的-O-P-O-CH2-，以及上文引用的美国
专利第5,602,240号的酰胺骨架。同样优选的为具有上文引用的美国专利第5,034,506号
的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。
[0187] 修饰寡核苷酸也可包含一个或多个经取代的糖部分。优选的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一种：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C到CO烷基或C2到C10烯
基和炔基。特别优选的为O(CH2)nOmCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON(CH3)2，其中n和m可为1-约10。其他优选的寡核苷酸在2’位置上包含下列
中的一种：C到CO、低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸药代动力学特性的基团、或用于改进寡核苷酸药效学特性的基团，以及具有类似特性的
其他取代基。优选的修饰包括2’-甲氧乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧
乙基)或2′-MOE)，即，烷氧基烷氧基基团。进一步优选的修饰包括2’-二甲基氨基氧基
乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE(如下文实施例中所述)，以及2’-二
甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即
2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
基和炔基。特别优选的为O(CH2)nOmCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON(CH3)2，其中n和m可为1-约10。其他优选的寡核苷酸在2’位置上包含下列
中的一种：C到CO、低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸药代动力学特性的基团、或用于改进寡核苷酸药效学特性的基团，以及具有类似特性的
其他取代基。优选的修饰包括2’-甲氧乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧
乙基)或2′-MOE)，即，烷氧基烷氧基基团。进一步优选的修饰包括2’-二甲基氨基氧基
乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE(如下文实施例中所述)，以及2’-二
甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即
2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
[0188] 其他优选的修饰包括 2’-甲氧基 (2′-O CH 3)、2’-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2′-F)。类似的修饰也可在寡核苷酸的其他位置上进行，
具体地在3’末端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的
5’位置。寡核苷酸也可具有糖模拟物例如取代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导制备这
类经修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第4,981,957、5,118,800、
5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、
5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、
5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920号，每个通过引用结合于本文中。
具体地在3’末端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的
5’位置。寡核苷酸也可具有糖模拟物例如取代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导制备这
类经修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第4,981,957、5,118,800、
5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、
5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、
5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920号，每个通过引用结合于本文中。
[0189] 寡核苷酸也可包含核碱基(本领域常常简称为“碱基”)修饰或取代。本文所用的“未修饰的”或“天然的”核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基
胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如
5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟
嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧
啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、
6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、
8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代具体地5-溴、5-三
氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤(methylquanine)和7-甲基腺嘌
呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟
嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如
5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟
嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧
啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、
6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、
8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代具体地5-溴、5-三
氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤(methylquanine)和7-甲基腺嘌
呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟
嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
[0190] 此外，核苷酸包括公开于以下文献中的核苷酸：美国专利第3,687,808号、“高分子科学和工程的简明百科全书(The Concise Encyclopedia of Polymer Science And
Engineering)”，858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑，John Wiley&Sons，1990、Englisch 等，′Angewandle Chemie，International Edition′，1991，30，613页和Sanghvi，Y.S.，第
15章，“反义研究和应用(Antisense Research and Applications)”，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ea.，CRC Press，1993。这些核苷酸中的某些对于增加本发明的寡聚化
合物的结合亲和力特别地有用。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取
代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞
嘧啶取代增加核酸双链体的稳定性达0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，
B.，编辑，“反义研究和应用”，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278页)且为目前优选的碱基取代，更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
Engineering)”，858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑，John Wiley&Sons，1990、Englisch 等，′Angewandle Chemie，International Edition′，1991，30，613页和Sanghvi，Y.S.，第
15章，“反义研究和应用(Antisense Research and Applications)”，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ea.，CRC Press，1993。这些核苷酸中的某些对于增加本发明的寡聚化
合物的结合亲和力特别地有用。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取
代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞
嘧啶取代增加核酸双链体的稳定性达0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，
B.，编辑，“反义研究和应用”，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278页)且为目前优选的碱基取代，更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
[0191] 教导制备上述修饰核苷酸以及其他修饰核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第3,687,808、以及4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、
5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、
5,552,540、5,587,469、5,596,091、5,614,617、5,750,692和5,681,941号，每个通过引用
结合于本文中。
5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、
5,552,540、5,587,469、5,596,091、5,614,617、5,750,692和5,681,941号，每个通过引用
结合于本文中。
[0192] 本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使所述寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，其增强所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。
[0193] 这类部分包括但不限于，脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例
如，二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、
聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部
分。
如，二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、
聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部
分。
[0194] 教导制备这类寡核苷酸缀合物的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第 4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、
5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、
5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、
4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、
4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、
5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、
5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、
5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、
5,599,923、5,599,928和5,688,941号，每个通过引用结合于本文中。
5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、
5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、
4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、
4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、
5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、
5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、
5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、
5,599,923、5,599,928和5,688,941号，每个通过引用结合于本文中。
[0195] 药物开发：本发明的化合物也可应用于药物开发和靶标验证的领域。本发明包括本文所鉴定的化合物和优选的靶区段在药物开发努力中阐明存在于脑源神经营养因子
(BDNF)多核苷酸和疾病状态、表型或状况之间的关系的应用。这些方法包括检测或调节
BDNF多核苷酸，包括使本发明的化合物与样品、组织、细胞或生物体接触，在处理后的某个
时间测定BDNF多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相关的表型或化学终点，以及任选将该测
定值与未处理样品或与用本发明的另一种化合物处理的样品比较。这些方法也可与其他试
验平行或组合进行以确定未知基因的功能用于靶标验证过程，或确定特定基因产物作为用
于治疗或预防特定疾病、状况或表型的靶标的有效性。
(BDNF)多核苷酸和疾病状态、表型或状况之间的关系的应用。这些方法包括检测或调节
BDNF多核苷酸，包括使本发明的化合物与样品、组织、细胞或生物体接触，在处理后的某个
时间测定BDNF多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相关的表型或化学终点，以及任选将该测
定值与未处理样品或与用本发明的另一种化合物处理的样品比较。这些方法也可与其他试
验平行或组合进行以确定未知基因的功能用于靶标验证过程，或确定特定基因产物作为用
于治疗或预防特定疾病、状况或表型的靶标的有效性。
[0196] 评价基因表达的上调或抑制：
[0197] 外源核酸到宿主细胞或生物体中的转移可通过直接检测细胞或生物体中核酸的存在情况来评价。这类检测可通过本领域众所周知的数种方法来完成。例如，外源核酸的
存在情况可通过DNA印迹或通过聚合酶链式反应(PCR)技术使用特异地扩增与所述核酸相
关的核苷酸序列的引物来检测。外源核酸的表达也可使用包括基因表达分析在内的常规方
法来测定。例如，由外源核酸产生的mRNA可使用RNA印迹和反转录PCR(RT-PCR)来检测和
定量。
存在情况可通过DNA印迹或通过聚合酶链式反应(PCR)技术使用特异地扩增与所述核酸相
关的核苷酸序列的引物来检测。外源核酸的表达也可使用包括基因表达分析在内的常规方
法来测定。例如，由外源核酸产生的mRNA可使用RNA印迹和反转录PCR(RT-PCR)来检测和
定量。
[0198] 来自外源核酸的RNA的表达也可通过测定酶活性或报道蛋白活性来检测。例如，反义调节活性可根据靶核酸表达的减少或增加间接地测定，以作为外源核酸正在产生效应
物RNA的指示。基于序列保守性，可设计和使用引物来扩增靶基因的编码区。最初，可使用
来自每个基因的最高表达的编码区来建立模型控制基因，虽然任何编码或非编码区均可使
用。每个控制基因通过将每个编码区插入报道基因编码区和其聚腺苷酸信号之间来装配。
这些质粒可产生在基因的上游部分具有报道基因以及在3’非编码区中具有潜在RNAi靶
标的mRNA。单个反义寡核苷酸的有效性可通过报道基因的调节来测定。可用于本发明的
方法中的报道基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β
葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、
黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂
碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)，以及其衍生物。多重选择标记为可利用的，其赋予对氨
苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素和四环素的抗性。确定报道基因调节的方法为本领域众所
周知的，且包括但不限于，荧光测量法(例如荧光光谱法、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧
光显微法)、抗生素抗性测定。
物RNA的指示。基于序列保守性，可设计和使用引物来扩增靶基因的编码区。最初，可使用
来自每个基因的最高表达的编码区来建立模型控制基因，虽然任何编码或非编码区均可使
用。每个控制基因通过将每个编码区插入报道基因编码区和其聚腺苷酸信号之间来装配。
这些质粒可产生在基因的上游部分具有报道基因以及在3’非编码区中具有潜在RNAi靶
标的mRNA。单个反义寡核苷酸的有效性可通过报道基因的调节来测定。可用于本发明的
方法中的报道基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β
葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、
黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂
碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)，以及其衍生物。多重选择标记为可利用的，其赋予对氨
苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素和四环素的抗性。确定报道基因调节的方法为本领域众所
周知的，且包括但不限于，荧光测量法(例如荧光光谱法、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧
光显微法)、抗生素抗性测定。
[0199] BDNF蛋白和mRNA表达可使用本领域技术人员已知和本文别处所描述的方法测定。例如，免疫测定法(例如ELISA)可用来测定蛋白质水平。BDNF ELISA分析试剂盒可市
购，例如，从R&D Systems(Minneapolis，MN)。
购，例如，从R&D Systems(Minneapolis，MN)。
[0200] 在实施方案中，使用本发明反义寡核苷酸处理的样品(例如，体内或体外的细胞或组织)中的BDNF表达(例如，mRNA或蛋白质)通过与对照样品中的BDNF表达相比较来评
价。例如，蛋白质或核酸的表达可使用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样
品中的蛋白质或核酸表达相比较。或者，与用对照反义寡核苷酸(例如，具有已改变或不同
序列的反义寡核苷酸)处理的样品的比较可根据所需信息来进行。在另一个实施方案中，
可将已处理样品对比未处理样品在BDNF蛋白或核酸表达方面的差异与已处理样品对比未
处理样品在不同核酸(包括研究者认为适当的任何标准，例如，持家基因)的表达方面的差
异相比较。
价。例如，蛋白质或核酸的表达可使用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样
品中的蛋白质或核酸表达相比较。或者，与用对照反义寡核苷酸(例如，具有已改变或不同
序列的反义寡核苷酸)处理的样品的比较可根据所需信息来进行。在另一个实施方案中，
可将已处理样品对比未处理样品在BDNF蛋白或核酸表达方面的差异与已处理样品对比未
处理样品在不同核酸(包括研究者认为适当的任何标准，例如，持家基因)的表达方面的差
异相比较。
[0201] 可将观察到的差异根据需要例如以比率或分数的形式表达，用于与对照比较。在实施方案中，在用本发明反义寡核苷酸处理的样品中，BDNF mRNA或蛋白质水平相对于未处
理样品或用对照核酸处理的样品增加或者减少约1.25倍-约10倍或更多。在实施方案中，
BDNF mRNA或蛋白质水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约
1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3
倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少
约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5
倍、或至少约10倍或更多。
理样品或用对照核酸处理的样品增加或者减少约1.25倍-约10倍或更多。在实施方案中，
BDNF mRNA或蛋白质水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约
1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3
倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少
约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5
倍、或至少约10倍或更多。
[0203] 本发明的化合物可用于诊断、治疗和预防，并作为研究试剂和试剂盒的组分。此外，能够以精细的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸常常被普通技术人员用于阐明特定
基因的功能或区分生物途径的各个成员之间的功能。
基因的功能或区分生物途径的各个成员之间的功能。
[0204] 对于用于试剂盒和诊断及各种生物系统中的应用，本发明的化合物(单独地或与其他化合物或治疗剂组合)可用作差异和/或组合分析中的工具，以阐明在细胞和组织内
表达的基因的一部分或全部互补序列的表达模式。
表达的基因的一部分或全部互补序列的表达模式。
[0205] 本文所用的术语“生物系统”或“系统”定义为表达或使得有能力表达脑源神经营养因子(BDNF)基因的产物的任何生物体、细胞、细胞培养物或组织。这些包括但不限于人、
转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。
转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。
[0206] 作为一个非限制性实例，将在用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用反义化合物处理的对照细胞或组织相比较，并针对基因表达的差异水平分析
产生的模式，因为它们涉及，例如，所检测基因的疾病相关性、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可对刺激或未刺激的细胞以及在影响表达模式的其他
化合物存在或不存在时进行。
产生的模式，因为它们涉及，例如，所检测基因的疾病相关性、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可对刺激或未刺激的细胞以及在影响表达模式的其他
化合物存在或不存在时进行。
[0207] 本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列、SAGE(基因表达的系列分析)、READS(已消化cDNA的限制性酶扩增)、TOGA(总基因表达分析)、蛋白质阵
列和蛋白质组学、表达序列标签(EST)测序、消减(subtractive)RNA指纹法(SuRF)、消减克
隆、差异显示(DD)、比较基因组杂交、FISH(荧光原位杂交)技术和质谱分析法。
列和蛋白质组学、表达序列标签(EST)测序、消减(subtractive)RNA指纹法(SuRF)、消减克
隆、差异显示(DD)、比较基因组杂交、FISH(荧光原位杂交)技术和质谱分析法。
[0208] 本发明的化合物对于研究和诊断而言为有用的，因为这些化合物与编码脑源神经营养因子(BDNF)的核酸杂交。例如，作为有效的BDNF调节剂以本文公开的这类效率和在
这类条件下杂交的寡核苷酸在有利于基因扩增或检测的条件下分别为有效的引物或探针。
这些引物和探针可用于需要对编码BDNF的核酸分子特异检测的方法中，和可用于扩增所
述核酸分子以用于检测或用于进一步研究BDNF。本发明的反义寡核苷酸(具体地，引物和
探针)与编码BDNF的核酸的杂交可通过本领域已知的方法来检测。这类方法可包括使酶
与所述寡核苷酸缀合、放射性标记所述寡核苷酸或任何其他适当的检测方法。也可制备使
用这类检测方法来检测样品中BDNF水平的试剂盒。
这类条件下杂交的寡核苷酸在有利于基因扩增或检测的条件下分别为有效的引物或探针。
这些引物和探针可用于需要对编码BDNF的核酸分子特异检测的方法中，和可用于扩增所
述核酸分子以用于检测或用于进一步研究BDNF。本发明的反义寡核苷酸(具体地，引物和
探针)与编码BDNF的核酸的杂交可通过本领域已知的方法来检测。这类方法可包括使酶
与所述寡核苷酸缀合、放射性标记所述寡核苷酸或任何其他适当的检测方法。也可制备使
用这类检测方法来检测样品中BDNF水平的试剂盒。
[0209] 反义物的特异性和灵敏度也由本领域技术人员掌握用于治疗用途。已将反义化合物在动物(包括人)的疾病状态的治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸药物已安全和有效
地施用给人且许多临床试验目前正在进行。因此确认的是，反义化合物可为有用的治疗形
式，可将其配置以用于治疗细胞、组织和动物、尤其是人的治疗方案中。
地施用给人且许多临床试验目前正在进行。因此确认的是，反义化合物可为有用的治疗形
式，可将其配置以用于治疗细胞、组织和动物、尤其是人的治疗方案中。
[0210] 对于治疗而言，将怀疑具有可通过调节BDNF多核苷酸的表达来治疗的疾病或病症的动物(优选人)通过施用依照本发明的反义化合物来治疗。例如，在一个非限制性实
施方案中，所述方法包括给需要治疗的动物施用治疗有效量的BDNF调节剂的步骤。本发明
的BDNF调节剂有效地调节BDNF的活性或调节BDNF蛋白的表达。在一个实施方案中，动物
中BDNF的活性或表达与对照相比抑制了约10％。优选地，将动物中BDNF的活性或表达抑
制约30％。更优选地，将动物中BDNF的活性或表达抑制50％或更多。因此，与对照相比，
寡聚化合物将脑源神经营养因子(BDNF)mRNA的表达调节至少10％、至少50％、至少25％、
至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％。
施方案中，所述方法包括给需要治疗的动物施用治疗有效量的BDNF调节剂的步骤。本发明
的BDNF调节剂有效地调节BDNF的活性或调节BDNF蛋白的表达。在一个实施方案中，动物
中BDNF的活性或表达与对照相比抑制了约10％。优选地，将动物中BDNF的活性或表达抑
制约30％。更优选地，将动物中BDNF的活性或表达抑制50％或更多。因此，与对照相比，
寡聚化合物将脑源神经营养因子(BDNF)mRNA的表达调节至少10％、至少50％、至少25％、
至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％。
[0211] 在一个实施方案中，与对照相比，在动物中脑源神经营养因子(BDNF)的活性或表达增加约10％。优选地，在动物中BDNF的活性或表达增加约30％。更优选地，在动物中
BDNF的活性或表达增加50％或更多。因此，与对照比较，寡聚化合物调节BDNF mRNA的表
达至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
BDNF的活性或表达增加50％或更多。因此，与对照比较，寡聚化合物调节BDNF mRNA的表
达至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
[0212] 例如，脑源神经营养因子(BDNF)表达的提高或下降可在动物的血清、血液、脂肪组织、肝脏或任何其他体液、组织或器官中测定。优选地，包含于待分析的所述液体、组织或器官之内的细胞包含编码BDNF肽的核酸分子和/或BDNF蛋白本身。
[0213] 本发明的化合物可通过向合适的药学上可接受的稀释剂或载体中添加有效量的化合物来用于药物组合物中。本发明的化合物的应用和方法也可为预防上有用的。
[0214] 缀合物
[0215] 本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及将一种或多种增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。这些部分或缀合物可包含与官能团
(例如伯羟基或仲羟基)共价结合的缀合基团。本发明的缀合基团包括嵌入剂、报道分子、
聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体药效学特性的基团，以及增强寡聚体药代动力学特性的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学特性的基团，在本发明的背景中，包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学
特性的基团，在本发明的背景中，包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或分泌的基
团。代表性的缀合基团在提交于1992年10月23日的国际专利申请第PCT/US92/09196号
和美国专利第6,287,860号中公开，所述文献通过引用结合于本文中。缀合部分包括但不
限于，脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固
醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油
或1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷
乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。也可将本发明的寡核苷
酸与活性药物物质缀合，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂 吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗
糖尿病药、抗菌剂或抗生素。
(例如伯羟基或仲羟基)共价结合的缀合基团。本发明的缀合基团包括嵌入剂、报道分子、
聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体药效学特性的基团，以及增强寡聚体药代动力学特性的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学特性的基团，在本发明的背景中，包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学
特性的基团，在本发明的背景中，包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或分泌的基
团。代表性的缀合基团在提交于1992年10月23日的国际专利申请第PCT/US92/09196号
和美国专利第6,287,860号中公开，所述文献通过引用结合于本文中。缀合部分包括但不
限于，脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固
醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油
或1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵)、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷
乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。也可将本发明的寡核苷
酸与活性药物物质缀合，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂 吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗
糖尿病药、抗菌剂或抗生素。
[0216] 教导制备这类寡核苷酸缀合物的代表性的美国专利包括但不限于，美国专利第 4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、
5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、
5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、
4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、
4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、
5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、
5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、
5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、
5,599,923、5,599,928和5,688,941号。
5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、
5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、
4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、
4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、
5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、
5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、
5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、
5,599,923、5,599,928和5,688,941号。
[0217] 制剂
[0218] 本发明的化合物也可与其他分子、分子结构或化合物的混合物掺混、封装、缀合或以其他方式关联，作为例如，脂质体、受体靶向分子、口服的、直肠的、局部的或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导制备这类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的代表
性的美国专利包括但不限于，美国专利第5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、
5,521,291、5,543,165、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、
5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、
5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、
5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756号，每个通过引用结合于本文中。
性的美国专利包括但不限于，美国专利第5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、
5,521,291、5,543,165、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、
5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、
5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、
5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756号，每个通过引用结合于本文中。
[0219] 尽管，反义寡核苷酸不需要在载体的情况中施用以实现调节靶表达和/或功能的目的，但是本发明的实施方案涉及用于反义寡核苷酸表达的表达载体构建体，包括启动子、
杂合启动子基因序列，并且拥有强组成型启动子活性，或可在所需情况下诱导的启动子活
性。
杂合启动子基因序列，并且拥有强组成型启动子活性，或可在所需情况下诱导的启动子活
性。
[0220] 在一个实施方案中，本发明实施涉及用适合的核酸递送系统施用至少一种前述反义寡核苷酸。在一个实施方案中，该系统包含与多核苷酸可操作连接的非病毒载体。这类
非病毒载体的实例包括单独的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：12-49中的任何一个或多个)
或与适合的蛋白、多糖或脂质制剂组合的寡核苷酸。
非病毒载体的实例包括单独的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO：12-49中的任何一个或多个)
或与适合的蛋白、多糖或脂质制剂组合的寡核苷酸。
[0221] 其他适合的核酸递送系统包括病毒载体，典型地来自腺病毒、腺病毒伴随病毒(AAV)、依赖辅助病毒的腺病毒、逆转录病毒或仙台病毒-脂质体(HVJ)复合体中的至少一
种的序列。优选地，所述病毒载体包含与多核苷酸可操作连接的强真核启动子，例如，巨细
胞病毒(CMV)启动子。
种的序列。优选地，所述病毒载体包含与多核苷酸可操作连接的强真核启动子，例如，巨细
胞病毒(CMV)启动子。
[0222] 另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，
其中gag基因和pol基因来自HIV基因组而env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体为优
选的。这些载体包括痘病毒载体(例如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(例如单
纯疱疹I病毒(HSV)载体)、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
其中gag基因和pol基因来自HIV基因组而env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体为优
选的。这些载体包括痘病毒载体(例如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(例如单
纯疱疹I病毒(HSV)载体)、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
[0224] 术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理上和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性且不对其产生非所需的毒理学作用的盐。对于寡核苷酸而
言，药学上可接受的盐的优选实例和其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中，其
通过引用结合于本文中。
言，药学上可接受的盐的优选实例和其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中，其
通过引用结合于本文中。
[0225] 本发明也包括包含本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。本发明的药物组合物可以以若干方式来施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可
为局部的(包括眼的和至粘膜的包括阴道和直肠递送)、肺的(例如，通过吸入或吹入散剂
或气雾剂，包括通过喷雾器)、气管内的、鼻内的、表皮的和经皮的、口服的或胃肠外的。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内(例如，鞘内或脑室内)施用。
为局部的(包括眼的和至粘膜的包括阴道和直肠递送)、肺的(例如，通过吸入或吹入散剂
或气雾剂，包括通过喷雾器)、气管内的、鼻内的、表皮的和经皮的、口服的或胃肠外的。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内(例如，鞘内或脑室内)施用。
[0226] 对于治疗中枢神经系统中的组织而言，可通过例如注射或输注进入脑脊液进行施用。施用反义RNA进入脑脊液已在例如美国专利申请公开第2007/0117772号，“Methods
for slowing familial ALS disease progression(减缓家族性ALS疾病进展的方法)”中
描述，该申请通过引用以其整体结合于本文中。
for slowing familial ALS disease progression(减缓家族性ALS疾病进展的方法)”中
描述，该申请通过引用以其整体结合于本文中。
[0227] 如果意图将本发明的反义寡核苷酸施用给中枢神经系统中的细胞，可与一种或多种能够促进所述反义寡核苷酸渗透穿过血脑屏障的物质一起施用。注射可在例如内嗅皮质
或海马中进行。通过施用腺病毒载体至肌肉组织中的运动神经元而递送神经营养因子描述
于，例如，美国专利第6,632,427号，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons(腺病毒载体介导基因转移进入髓质运动神经元)”，其通过引用
结合于本文中。直接递送载体至脑(例如，纹状体、丘脑、海马或黑质)为本领域已知且描
述于例如美国专利第6,756,523号，“Adenovirus vectors for the transfer of foreign
genes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于转移
外源基因进入中枢神经系统细胞(具体地脑中)的腺病毒载体)”，其通过引用结合于本文
中。施用可快速进行，如通过注射，或在一段时间内进行，如通过缓慢输注或施用缓释制剂。
或海马中进行。通过施用腺病毒载体至肌肉组织中的运动神经元而递送神经营养因子描述
于，例如，美国专利第6,632,427号，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons(腺病毒载体介导基因转移进入髓质运动神经元)”，其通过引用
结合于本文中。直接递送载体至脑(例如，纹状体、丘脑、海马或黑质)为本领域已知且描
述于例如美国专利第6,756,523号，“Adenovirus vectors for the transfer of foreign
genes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于转移
外源基因进入中枢神经系统细胞(具体地脑中)的腺病毒载体)”，其通过引用结合于本文
中。施用可快速进行，如通过注射，或在一段时间内进行，如通过缓慢输注或施用缓释制剂。
[0228] 所述反义寡核苷酸也可与提供所需药学或药效学特性的物质连接或缀合。例如，反义寡核苷酸可与本领域已知的促进渗透或转运穿过血脑屏障的任何物质(例如转铁蛋
白受体的抗体)偶连，并通过静脉内注射施用。反义化合物可与病毒载体连接，例如，使反
义化合物更有效和/或增加反义化合物转运穿过血脑屏障的病毒载体。渗透性血脑屏障
破坏也可通过例如输注糖或氨基酸来完成，所述糖包括但不限于，内消旋赤藓醇、木糖醇、
D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、
D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)蜜三糖、L(+)鼠李糖、D(+)
蜜二糖、D(-)核糖、侧金盏花醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩
藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖，所述氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、赖氨
酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障渗透的方法和材料描述于，例如，美国专利第4,866,042号，“Method for the delivery of genetic
material across the blood brain barrier(用于递送遗传物质穿过血脑屏障的方法)”，
第6,294,520号，“Material for passage through the blood-brain barrier(用于通过
血脑屏障的材料)”，和第6,936,589号，“Parenteral delivery systems(胃肠外递送系
统)”，其全部通过引用以其整体结合于本文中。
白受体的抗体)偶连，并通过静脉内注射施用。反义化合物可与病毒载体连接，例如，使反
义化合物更有效和/或增加反义化合物转运穿过血脑屏障的病毒载体。渗透性血脑屏障
破坏也可通过例如输注糖或氨基酸来完成，所述糖包括但不限于，内消旋赤藓醇、木糖醇、
D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、
D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)蜜三糖、L(+)鼠李糖、D(+)
蜜二糖、D(-)核糖、侧金盏花醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩
藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖，所述氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、赖氨
酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障渗透的方法和材料描述于，例如，美国专利第4,866,042号，“Method for the delivery of genetic
material across the blood brain barrier(用于递送遗传物质穿过血脑屏障的方法)”，
第6,294,520号，“Material for passage through the blood-brain barrier(用于通过
血脑屏障的材料)”，和第6,936,589号，“Parenteral delivery systems(胃肠外递送系
统)”，其全部通过引用以其整体结合于本文中。
[0229] 所述反义化合物可与其他分子、分子结构或化合物的混合物掺混、封装、缀合或以其他方式关联，例如脂质体、受体靶向分子、口服的、直肠的、局部的或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。例如，阳离子脂质可包含在制剂中以促进寡核苷酸摄取。一种显示
出促进摄取的这类组合物为LIPOFECTIN(可从GIBCO-BRL，Bethesda，MD获得)。
出促进摄取的这类组合物为LIPOFECTIN(可从GIBCO-BRL，Bethesda，MD获得)。
[0230] 认为带有至少一个2’-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸对于口服施用而言为特别有用的。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶
剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也可为有用的。
剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也可为有用的。
[0231] 可适宜地以单位剂型存在的本发明药物制剂可根据药学工业中众所周知的常规技术来制备。这类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，制剂
如下制备：使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地结合，随后(在
需要时)使产物成形。
如下制备：使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地结合，随后(在
需要时)使产物成形。
[0232] 可将本发明的组合物制成许多可能剂型的任何一种，例如但不限于，片剂、胶囊剂、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。也可将本发明的组合物在水性、非水性或混合介质中制成混悬剂。水性混悬剂可进一步包含增加混悬剂粘度的物质，包括例如羧甲
基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。所述混悬剂也可包含稳定剂。
基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。所述混悬剂也可包含稳定剂。
[0234] 乳剂典型地为一种液体以通常直径超过0.1μm的液滴形式分散在另一种液体中的非均质体系。乳剂可包含除分散相之外的其他组分，以及可作为在水相、油相中的溶液或
其本身作为单独相存在的活性药物。微乳液包括为本发明的一个实施方案。乳剂及其使用
为本领域众所周知的且进一步描述于美国专利第6,287,860号中。
其本身作为单独相存在的活性药物。微乳液包括为本发明的一个实施方案。乳剂及其使用
为本领域众所周知的且进一步描述于美国专利第6,287,860号中。
[0235] 本发明的制剂包括脂质体制剂。本发明所用的术语“脂质体”意为由排列在一个或多个球形双层中的两亲脂质组成的囊泡。脂质体为具有由亲脂材料形成的膜和包含待递
送组合物的水性内部的单层或多层囊泡。阳离子脂质体为带正电的脂质体，其认为与带负
电的DNA分子相互作用以形成稳定的复合体。认为pH敏感的或带负电的脂质体诱捕DNA
而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体均已用来递送DNA到细胞。
送组合物的水性内部的单层或多层囊泡。阳离子脂质体为带正电的脂质体，其认为与带负
电的DNA分子相互作用以形成稳定的复合体。认为pH敏感的或带负电的脂质体诱捕DNA
而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体均已用来递送DNA到细胞。
[0236] 脂质体也包括“空间上稳定的”脂质体，该术语如本文所用是指包含一种或多种专门脂质的脂质体。当掺入到脂质体中时，这些专门脂质给脂质体带来相对于缺乏这类专门
脂质的脂质体延长的循环存在期。空间上稳定的脂质体的实例为其中脂质体的囊泡形成脂
质部分的部分包含一种或多种糖脂或衍生有一种或多种亲水聚合物(例如聚乙二醇(PEG)
部分)的脂质体。脂质体及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中。
脂质的脂质体延长的循环存在期。空间上稳定的脂质体的实例为其中脂质体的囊泡形成脂
质部分的部分包含一种或多种糖脂或衍生有一种或多种亲水聚合物(例如聚乙二醇(PEG)
部分)的脂质体。脂质体及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中。
[0237] 本发明的药物制剂和组合物也可包含表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的使用为本领域众所周知的。表面活性剂及其使用进一步描述于美国专利第
6,287,860号中，其通过引用结合于本文中。
6,287,860号中，其通过引用结合于本文中。
[0238] 在一个实施方案中，本发明使用各种渗透促进剂来实现核酸特别是寡核苷酸的有效递送。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散之外，渗透促进剂还增加亲脂性药物
的渗透性。可将渗透促进剂归类为属于五大类的一种，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁酸盐、
螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透促进剂及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860
号，其通过引用结合于本文中。
的渗透性。可将渗透促进剂归类为属于五大类的一种，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁酸盐、
螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透促进剂及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860
号，其通过引用结合于本文中。
[0239] 本领域的技术人员将认识到，制剂根据其预期用途(即给药途径)来常规地设计。
[0240] 用于局部给药的优选制剂包括其中本发明寡核苷酸与局部递送剂(例如，脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、甾类、螯合剂和表面活性剂)混合的制剂。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰基-磷脂酰乙醇胺DOPE、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂
酰基磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰
基四甲基氨丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰基乙醇胺DOTMA)。
酰基磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰
基四甲基氨丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰基乙醇胺DOTMA)。
[0241] 对于局部或其他给药而言，可将本发明的寡核苷酸封装在脂质体内或可与其(特别是与阳离子脂质体)形成复合体。或者，可将寡核苷酸与脂质(特别是阳离子脂质)复
合。优选的脂肪酸和酯类、其药学上可接受的盐，以及它们的使用进一步描述于美国专利第
6,287,860号中。
合。优选的脂肪酸和酯类、其药学上可接受的盐，以及它们的使用进一步描述于美国专利第
6,287,860号中。
[0242] 用于口服给药的组合物和制剂包括散剂或颗粒剂、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能为所需的。优选的口服制剂为其中将本发明的寡核苷酸
与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。优选的表面活性剂包括
脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及其使用进一步描
述于美国专利第6,287,860号中，其通过引用结合于本文中。还优选的为渗透促进剂的组
合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合为月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。
另外的渗透促进剂包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鲸蜡醚。本发明的寡核
苷酸可以以包括喷雾干燥颗粒的颗粒形式口服地递送，或复合以形成微米或纳米粒子。寡
核苷酸复合剂及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中，其通过引用结合于本文
中。
与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。优选的表面活性剂包括
脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及其使用进一步描
述于美国专利第6,287,860号中，其通过引用结合于本文中。还优选的为渗透促进剂的组
合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合为月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。
另外的渗透促进剂包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鲸蜡醚。本发明的寡核
苷酸可以以包括喷雾干燥颗粒的颗粒形式口服地递送，或复合以形成微米或纳米粒子。寡
核苷酸复合剂及其使用进一步描述于美国专利第6,287,860号中，其通过引用结合于本文
中。
[0243] 用于胃肠外、鞘内或室内给药的组合物和制剂可包括无菌水性溶液剂，其也可含有缓冲液、稀释剂和其他适合的添加剂，例如但不限于，渗透促进剂、载体化合物和其他药
学上可接受的载体或赋形剂。
学上可接受的载体或赋形剂。
[0244] 本发明的某些实施方案提供药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种通过非反义机制来起作用的其他化学治疗剂。这类化学治疗剂的实例
包括但不限于癌症化疗药物，例如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、双氯乙基-亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷
(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物一起使用时，这类化学治疗剂可单独地(例如，5-FU和寡核苷酸)、顺序地(例如，5-FU和寡
核苷酸持续一段时间，接着MTX和寡核苷酸)、或与一种或多种其他的这类化学治疗剂组合
(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射疗法和寡核苷酸)使用。抗炎药(包括但不
限于非甾体抗炎药和皮质类固醇)和抗病毒药物(包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔
洛韦和更昔洛韦)也可组合到本发明的组合物中。反义化合物和其他非反义药物的组合也
在本发明的范围之内。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序使用。
包括但不限于癌症化疗药物，例如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、双氯乙基-亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷
(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物一起使用时，这类化学治疗剂可单独地(例如，5-FU和寡核苷酸)、顺序地(例如，5-FU和寡
核苷酸持续一段时间，接着MTX和寡核苷酸)、或与一种或多种其他的这类化学治疗剂组合
(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射疗法和寡核苷酸)使用。抗炎药(包括但不
限于非甾体抗炎药和皮质类固醇)和抗病毒药物(包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔
洛韦和更昔洛韦)也可组合到本发明的组合物中。反义化合物和其他非反义药物的组合也
在本发明的范围之内。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序使用。
[0245] 在另一个相关的实施方案中，本发明的组合物可包含靶向于第一核酸的一种或多种反义化合物(特别是寡核苷酸)，以及靶向于第二核酸靶标的一种或多种其他反义化合
物。例如，第一靶标可为脑源神经营养因子(BDNF)的特定反义序列，和第二靶标可为来
自另一个核苷酸序列的区域。或者，本发明的组合物可包含靶向于相同脑源神经营养因子
(BDNF)核酸靶标的不同区域的两种或更多种反义化合物。本文举例说明了许多反义化合物
的实例而其他的可选自本领域已知的适合化合物。两种或更多种组合化合物可一起或顺序
使用。
物。例如，第一靶标可为脑源神经营养因子(BDNF)的特定反义序列，和第二靶标可为来
自另一个核苷酸序列的区域。或者，本发明的组合物可包含靶向于相同脑源神经营养因子
(BDNF)核酸靶标的不同区域的两种或更多种反义化合物。本文举例说明了许多反义化合物
的实例而其他的可选自本领域已知的适合化合物。两种或更多种组合化合物可一起或顺序
使用。
[0246] 给药：
[0247] 认为治疗组合物的制剂和其随后的施用(给药)在本领域技术人员的技术之内。给药取决于要治疗的疾病状态的严重性和反应性，而疗程从数天持续到数月，或直到实现
治愈或达到疾病状态的减轻。最佳给药方案可根据患者体内药物蓄积的测量来计算。普
通技术人员可容易地确定最适剂量、给药方法和重复率。最适剂量可根据单个寡核苷酸的
相对功效而不同，一般可基于在体外和动物模型中体内发现有效的EC50来估计。一般而
言，剂量为0.01μg-10mg/kg体重，且可每天、每周、每月或每年给药一次或多次，或甚至每
2-20年一次。本领域普通技术人员可基于测定体液或组织中药物的停留时间和浓度来容易
地估计给药的重复率。成功治疗之后，可能需要对患者进行维持疗法以预防疾病状态的复
发，其中所述寡核苷酸以维持剂量来施用，范围为0.01μg-10mg/kg体重，每天一次或多次
到每2-20年一次。
治愈或达到疾病状态的减轻。最佳给药方案可根据患者体内药物蓄积的测量来计算。普
通技术人员可容易地确定最适剂量、给药方法和重复率。最适剂量可根据单个寡核苷酸的
相对功效而不同，一般可基于在体外和动物模型中体内发现有效的EC50来估计。一般而
言，剂量为0.01μg-10mg/kg体重，且可每天、每周、每月或每年给药一次或多次，或甚至每
2-20年一次。本领域普通技术人员可基于测定体液或组织中药物的停留时间和浓度来容易
地估计给药的重复率。成功治疗之后，可能需要对患者进行维持疗法以预防疾病状态的复
发，其中所述寡核苷酸以维持剂量来施用，范围为0.01μg-10mg/kg体重，每天一次或多次
到每2-20年一次。
[0248] 在实施方案中，使用下列剂量的药物治疗患者，所述剂量为至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、或至少约100mg/kg体重。反义寡核苷酸的某些注射剂量描述
于，例如，美国专利第7,563,884号，“Antisense modulation of PTP1B expression(PTP1B表达的反义调节)”，通过引用以其整体结合于本文中。
于，例如，美国专利第7,563,884号，“Antisense modulation of PTP1B expression(PTP1B表达的反义调节)”，通过引用以其整体结合于本文中。
[0249] 虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背
离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
[0250] 本文提及的所有文件都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利文件都为所有目的而通过引用结合，其程度如同单独地指出各个出版物或专利文件通过引
用结合到本文中一样。至于在本文件中对不同参考文献的引用，申请人并不承认任何具体
参考文献对其发明而言为“现有技术”。本发明的组合物和方法的实施方案举例说明于下列
实施例中。
实施例
用结合到本文中一样。至于在本文件中对不同参考文献的引用，申请人并不承认任何具体
参考文献对其发明而言为“现有技术”。本发明的组合物和方法的实施方案举例说明于下列
实施例中。
实施例
[0251] 下列非限制性的实施例用于举例说明本发明的所选实施方案。应理解的是，所示组分的比例变化和要素替换对本领域的技术人员而言为显而易见的且在本发明的实施方
案的范围之内。
案的范围之内。
[0252] 实施例1：对脑源神经营养因子(BDNF)反义的核酸分子和/或BDNF多核苷酸有义链特异性的反义寡核苷酸的设计
[0253] 如上指出的术语“对......特异性的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶向于......”是指具有以下序列的寡核苷酸：(i)能够与靶向基因的一部分形成稳定的复合体，或(ii)能
够与靶向基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。
够与靶向基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。
[0254] 适当寡核苷酸的选择通过使用计算机程序(例如IDT AntiSense Design,IDTOligoAnalyzer)来促进，该计算机程序在各给定的序列中自动确定以所需的解链温度(通
常50-60℃)与靶多核苷酸序列形成杂合体且不形成自身二聚体或其它复杂二级结构的
19-25个核苷酸的子序列。
常50-60℃)与靶多核苷酸序列形成杂合体且不形成自身二聚体或其它复杂二级结构的
19-25个核苷酸的子序列。
[0255] 适当寡核苷酸的选择进一步通过使用计算机程序来促进，该计算机程序自动比对核酸序列并指出同一性或同源性区域。这类程序用于例如通过搜索诸如GenBank的数据库
或通过测序PCR产物而比较获得的核酸序列。来自给定基因组的一系列基因和基因间区域
的核酸序列的比较允许选择显示出对目标基因的适当特异性程度的核酸序列。这些程序允
许选择对靶核酸序列表现高度的互补性而对在给定基因组中的其它核酸序列表现较低程
度的互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明的适当的基因区域
上具有相当大的自由。
或通过测序PCR产物而比较获得的核酸序列。来自给定基因组的一系列基因和基因间区域
的核酸序列的比较允许选择显示出对目标基因的适当特异性程度的核酸序列。这些程序允
许选择对靶核酸序列表现高度的互补性而对在给定基因组中的其它核酸序列表现较低程
度的互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明的适当的基因区域
上具有相当大的自由。
[0256] 如果所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以导致功能和/或活性的调节，并且在要求特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗处理情况中的生理条件
下，以及在其中在体外分析情况中进行测定的条件下)具有足够程度的互补性以避免所述
反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，则反义化合物为“可特异杂交的”。
下，以及在其中在体外分析情况中进行测定的条件下)具有足够程度的互补性以避免所述
反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，则反义化合物为“可特异杂交的”。
[0257] 本文所述的寡核苷酸的杂交特性可通过本领域已知的一种或多种体外测定法来确定。例如，本文所述的寡核苷酸的特性可通过使用解链曲线测定法确定靶天然反义物和
潜在药物分子之间的结合强度来获得。
潜在药物分子之间的结合强度来获得。
[0258] 靶天然反义物和潜在药物分子(分子)之间的结合强度可使用任何已建立的测定分子间相互作用强度的方法例如解链曲线测定法来评估。
[0259] 解链曲线测定法确定天然反义物/分子复合体发生从双链构象到单链构象的迅速转变时的温度。此温度被广泛接受为两个分子之间相互作用强度的可靠衡量。
[0260] 解链曲线测定法可使用实际的天然反义RNA分子的cDNA拷贝或对应于分子的结合位点的合成DNA或RNA核苷酸来进行。包含进行此测定的所有必需试剂的多种试剂盒为
可得的(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor试剂盒)。这些试剂盒包含含有双链
DNA(dsDNA)结合染料(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO，等等)之一的适宜缓冲溶液。
dsDNA染料的特性为使得其在游离形式几乎不发射荧光，但当与dsDNA结合时为高度荧光
的。
可得的(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor试剂盒)。这些试剂盒包含含有双链
DNA(dsDNA)结合染料(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO，等等)之一的适宜缓冲溶液。
dsDNA染料的特性为使得其在游离形式几乎不发射荧光，但当与dsDNA结合时为高度荧光
的。
[0261] 为进行所述测定，将所述cDNA或相应寡核苷酸以由具体制造商的方案限定的浓度与分子混合。将所述混合物加热到95℃以解离所有预先形成的dsDNA复合体，然后缓慢
冷却到室温或由试剂盒制造商确定的其他较低温度以使DNA分子退火。随后将新形成的复
合体缓慢加热到95℃，同时连续地收集由反应产生的荧光量的数据。荧光强度反比于反应
中存在的dsDNA的量。数据可使用与所述试剂盒相容的实时PCR仪器(例如ABI’s StepOne
Plus Real Time PCR System或LightTyper仪器，Roche Diagnostics，Lewes，UK)来收集。
冷却到室温或由试剂盒制造商确定的其他较低温度以使DNA分子退火。随后将新形成的复
合体缓慢加热到95℃，同时连续地收集由反应产生的荧光量的数据。荧光强度反比于反应
中存在的dsDNA的量。数据可使用与所述试剂盒相容的实时PCR仪器(例如ABI’s StepOne
Plus Real Time PCR System或LightTyper仪器，Roche Diagnostics，Lewes，UK)来收集。
[0262] 熔融峰通过使用适当软件(例如LightTyper(Roche)或SDS DissociationCurve，ABI)对温度(x-轴)绘制荧光相对于温度的负导数(在y-轴上的-d(荧光)/dT)
的图形来构建。分析数据以确定从dsDNA复合体迅速转变到单链分子的温度。此温度称为
Tm且正比于两个分子之间的相互作用的强度。典型地，Tm将超过40℃。
的图形来构建。分析数据以确定从dsDNA复合体迅速转变到单链分子的温度。此温度称为
Tm且正比于两个分子之间的相互作用的强度。典型地，Tm将超过40℃。
[0263] 修饰的AntagoNAT分子的设计：
[0264] 设计和测试了多个基于DNA的反义寡核苷酸，称为AntagoNAT，其靶向非编码Bdnf-AS和其它反义转录物。设计了长度范围12-20个核苷酸的各种AntagoNAT，其具有或
没有完全硫代磷酸酯修饰+/-2-O’-甲基RNA或LNA修饰的核苷酸。最高的效力在各末端
具有三个LNA-修饰的核苷酸的16-核苷酸硫代磷酸酯间体(XXXnnnnnnnnnnXXX)的Bdnf
mRNA水平上观察到。为阻断人BDNF有义-反义转录物之间的相互作用，使用包含LNA和
2-O’-甲基RNA分子两者的14-核苷酸混合体(mixmer)。虽然这些2-O’-甲基RNA-修
饰的寡核苷酸表明为仅阻断RNA，但靶向RNA的边缘下调在该试验中观察到(图11)。各种
AntagoNAT的序列以及用于这些研究的所有其它siRNA、引物和探针列于表1中。
没有完全硫代磷酸酯修饰+/-2-O’-甲基RNA或LNA修饰的核苷酸。最高的效力在各末端
具有三个LNA-修饰的核苷酸的16-核苷酸硫代磷酸酯间体(XXXnnnnnnnnnnXXX)的Bdnf
mRNA水平上观察到。为阻断人BDNF有义-反义转录物之间的相互作用，使用包含LNA和
2-O’-甲基RNA分子两者的14-核苷酸混合体(mixmer)。虽然这些2-O’-甲基RNA-修
饰的寡核苷酸表明为仅阻断RNA，但靶向RNA的边缘下调在该试验中观察到(图11)。各种
AntagoNAT的序列以及用于这些研究的所有其它siRNA、引物和探针列于表1中。
[0265] 实施例2：BDNF多核苷酸的调节
[0266] 用于实施例2中的所有反义寡核苷酸如实施例1中描述的设计。制造商(Coralville,IA的IDT Inc.)指导制造设计的硫代磷酸酯键寡核苷酸并提供表1中所示
的设计的硫代磷酸酯类似物。核苷酸之间的星号标记指示硫代磷酸酯键的存在。实施例2
中的试验所需的寡核苷酸可以采用亚磷酰胺单体(所有活性基团用保护基保护的正常核
苷酸，例如糖上的三苯甲基、A和C上的苯甲酰基及G上的N-2-异丁酰基)使用任何合适
的现有技术方法(例如IDT使用的方法)在固体载体如5微米可控微孔玻璃珠(CPG)上合
成。保护基防止寡核苷酸合成过程中不希望的反应。保护基在合成过程结束时除去。初始
核苷酸通过3’碳连接到固体载体上且合成沿3’-5’方向进行。新碱基添加到生长的寡核
苷酸链上以四个步骤发生：1)保护基使用三氯乙酸从固定的核苷酸的5'氧上除去；2)固
定的核苷酸和序列中下一个核苷酸使用四唑偶联在一起；反应通过四唑基亚磷酰胺中间体
进行；3)洗掉未反应的游离核苷酸和反应副产物且未反应的固定寡核苷酸加帽以防止它
们参与下一轮的合成；加帽使用乙酸酐和N-甲基咪唑通过使游离的5’羟基乙酰化而实现；
4)为使核苷酸之间的键稳定，如果要产生磷酸二酯键，磷使用碘和水氧化，或者如果希望硫
代磷酸酯键，磷使用Beaucage试剂(3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物)氧化。
通过交替两种氧化剂，可以构建嵌合骨架。以上描述的四步骤循环对于序列中的每一核苷
酸重复。当合成完整的序列时，寡核苷酸从固体载体切除并在高温下使用氢氧化铵脱保护。
保护基通过脱盐洗掉且残留的寡核苷酸进行冻干。
的设计的硫代磷酸酯类似物。核苷酸之间的星号标记指示硫代磷酸酯键的存在。实施例2
中的试验所需的寡核苷酸可以采用亚磷酰胺单体(所有活性基团用保护基保护的正常核
苷酸，例如糖上的三苯甲基、A和C上的苯甲酰基及G上的N-2-异丁酰基)使用任何合适
的现有技术方法(例如IDT使用的方法)在固体载体如5微米可控微孔玻璃珠(CPG)上合
成。保护基防止寡核苷酸合成过程中不希望的反应。保护基在合成过程结束时除去。初始
核苷酸通过3’碳连接到固体载体上且合成沿3’-5’方向进行。新碱基添加到生长的寡核
苷酸链上以四个步骤发生：1)保护基使用三氯乙酸从固定的核苷酸的5'氧上除去；2)固
定的核苷酸和序列中下一个核苷酸使用四唑偶联在一起；反应通过四唑基亚磷酰胺中间体
进行；3)洗掉未反应的游离核苷酸和反应副产物且未反应的固定寡核苷酸加帽以防止它
们参与下一轮的合成；加帽使用乙酸酐和N-甲基咪唑通过使游离的5’羟基乙酰化而实现；
4)为使核苷酸之间的键稳定，如果要产生磷酸二酯键，磷使用碘和水氧化，或者如果希望硫
代磷酸酯键，磷使用Beaucage试剂(3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物)氧化。
通过交替两种氧化剂，可以构建嵌合骨架。以上描述的四步骤循环对于序列中的每一核苷
酸重复。当合成完整的序列时，寡核苷酸从固体载体切除并在高温下使用氢氧化铵脱保护。
保护基通过脱盐洗掉且残留的寡核苷酸进行冻干。
[0267] Hek293细胞用不同的siRNA处理以定量BDNF mRNA的量
[0268] 1.来自ATCC的Hek293细胞(cat#CRL-1573)在37℃和5％CO2下在MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024)+10％FBS+青霉素+链霉素中生长。试验前一天，细胞以
5
5x10/孔的密度重接种到6孔板中并在37℃和5％CO2下孵育。
5
5x10/孔的密度重接种到6孔板中并在37℃和5％CO2下孵育。
[0269] 2.在试验这一天，6孔板中的培养基更换为新鲜MEM/EBSS+10％FBS。
[0270] 3.所有BDNF-AntagoNAT(BDNF-AS的反义寡核苷酸)稀释到20uM的浓度且BDNF-AS siRNA(BDNF-AS互补的siRNA，10uM；两种寡核苷酸化合物通过IDT制造。为对一
个孔加药，2μl的这一溶液与400μl的Opti-MEM培养基(Gibco cat#31985-070)和4ul
的Lipofectamine 2000(Invitrogen cat#11668019)在室温下孵育20min并逐滴施加到具
有HepG2细胞的6孔板的一个孔。包括2μl的水而不是寡核苷酸溶液的类似混合物用于
模拟转染的对照。
个孔加药，2μl的这一溶液与400μl的Opti-MEM培养基(Gibco cat#31985-070)和4ul
的Lipofectamine 2000(Invitrogen cat#11668019)在室温下孵育20min并逐滴施加到具
有HepG2细胞的6孔板的一个孔。包括2μl的水而不是寡核苷酸溶液的类似混合物用于
模拟转染的对照。
[0271] 4.在37℃和5％CO2下孵育3-18h后，培养基更换为新鲜MEM/EBSS+10％FBS+青霉素+链霉素。
[0272] 5.48h后进行反义寡核苷酸的添加。培养基然后移除且RNA使用来自Promega的SVTotal RNA Isolation System(cat#Z3105)或来自Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation
试剂盒(cat#74181)按照制造商的说明从细胞提取。
试剂盒(cat#74181)按照制造商的说明从细胞提取。
[0273] 6.200-400ng的提取RNA添加到使用无规六聚体、2.5mM的dNTP混合物、MgCl2和适宜的缓冲液进行的反转录反应中。来自这一反转录反应的cDNA(20-40ng)用于使用ABI
Taqman Gene Expression Mix(cat#4369510)和300nM的正向和反向引物及15μl最终反
应体积中的200nM探针通过实时PCR监测基因表达。引物/探针使用FileBuilder软件
(Applied Biosystem)设计。引物是对有义-反义对特异性的链且探针覆盖外显子边界
以排除基因组DNA扩增的可能。用于人BDNF的ABI分析是Applied Biosystems Taqman
Gene Expression Assay：Applied Biosystems Inc.,Foster City CA 的 Hs00542425_
s1(BDNF)。使用以下的PCR循环：50℃下2min，95℃下10min，40个循环的(95℃下15秒，
60℃下1min)，使用GeneAmp 7900仪器(Applied Biosystems)。反义寡核苷酸处理后基因
表达的倍数变化基于处理的和模拟转染的样品之间18S-标准化的dCt值的差异计算。
Taqman Gene Expression Mix(cat#4369510)和300nM的正向和反向引物及15μl最终反
应体积中的200nM探针通过实时PCR监测基因表达。引物/探针使用FileBuilder软件
(Applied Biosystem)设计。引物是对有义-反义对特异性的链且探针覆盖外显子边界
以排除基因组DNA扩增的可能。用于人BDNF的ABI分析是Applied Biosystems Taqman
Gene Expression Assay：Applied Biosystems Inc.,Foster City CA 的 Hs00542425_
s1(BDNF)。使用以下的PCR循环：50℃下2min，95℃下10min，40个循环的(95℃下15秒，
60℃下1min)，使用GeneAmp 7900仪器(Applied Biosystems)。反义寡核苷酸处理后基因
表达的倍数变化基于处理的和模拟转染的样品之间18S-标准化的dCt值的差异计算。
[0274] 7.BDNF-AS的检测寡聚物：
[0275] ABI分析ID Hs00417345_m1
[0276] 背景序列GCACACCTGGAGATACTCTATTATA(SEQ ID No:65)
[0277] 8.BDNF的检测寡聚物：
[0278] ABI分析ID Hs00542425_s1
[0279] CCTGCAGAATGGCCTGGAATTACAA(SEQ ID No:66)
[0280] BDNF-AS的检测寡聚物：ABI分析ID Hs00417345_m1
[0281] 背景序列GCACACCTGGAGATACTCTATTATA(SEQ ID No:65)
[0282] BDNF的检测寡聚物：ABI分析ID Hs00542425_s1
[0283] CCTGCAGAATGGCCTGGAATTACAA(SEQ ID No:66)
[0284] 9.结果是基于循环阈(Ct)值。实验和参照基因(18S RNA)的Ct值之间的计算差异为ddCt且作为各RNA对校准样品的百分比作图。
[0285] 结果：几种人和小鼠细胞系(包括HEK293T细胞)用靶向BDNF-AS转录物的非重叠区域的不同siRNA转染在48h时显示BDNF转录物的2-6倍上调(图1a和图6)。BDNF的
上调与内源对照的选择不相关(图5a-b)。上调不影响其它BDNF相邻基因的调节(图9)。
上调与内源对照的选择不相关(图5a-b)。上调不影响其它BDNF相邻基因的调节(图9)。
[0286] 图5显示BDNF-AS敲减导致BDNF mRNA上调。BDNF-AS使用靶向BDNF-AS转录物的非重叠区域的siRNAs-1(10nM)敲减引起BDNF(有义)mRNA的6-倍上调(****＝
P<0.0001)。此处描述的结果使用β肌动蛋白(左图)或18S rRNA(右图)作为内源对照
和使用模拟转染作为参照样品从HEK293T细胞的试验获得。这一试验意在显示内源对照或
参照校准样品的选择不改变所观察的BDNF mRNA的上调。
P<0.0001)。此处描述的结果使用β肌动蛋白(左图)或18S rRNA(右图)作为内源对照
和使用模拟转染作为参照样品从HEK293T细胞的试验获得。这一试验意在显示内源对照或
参照校准样品的选择不改变所观察的BDNF mRNA的上调。
[0287] 图6显示Bdnf表达的转录后调节。N2a细胞用靶向小鼠Bdnf-AS转录物的mBdnf-AntagoNAT9和靶向Drosha蛋白(其参与微RNA(miRNA)处理)的Drosha siRNA的组
合转染。Bdnf mRNA上调在用mBdnf-ANtagoNAT9处理细胞后观察到(***＝p值<0.0001)。
添加Drosha siRNA相对于mBdnf-AntagoNAT9处理边缘地增加Bdnf转录物(*＝p值
<0.05)。这一试验可以表明其它转录后机制如miRNA参与Bdnf转录物的调节。
合转染。Bdnf mRNA上调在用mBdnf-ANtagoNAT9处理细胞后观察到(***＝p值<0.0001)。
添加Drosha siRNA相对于mBdnf-AntagoNAT9处理边缘地增加Bdnf转录物(*＝p值
<0.05)。这一试验可以表明其它转录后机制如miRNA参与Bdnf转录物的调节。
[0288] 图9显示BDNF-AS敲减不改变TrkB或沿两个方向的BDNF相邻基因(Let7C和KIF18A)的水平：LIN7C和KIF18A分别是位于BDNF的3’下游和5’上游的基因。神经营养
酪氨酸激酶受体2型(TrkB)编码BDNF的膜结合受体且作为BDNF位于不同染色体(Chr-9)
上。确定了这些基因是否在BDNF-AS转录物删除时改变。HEK293T细胞用对照siRNA或
BDNF-AS siRNA转染并测量几种转录物水平。观察到BDNF-AS转录物下调且BDNF mRNA如
这一手稿(manuscript)中其它地方所示的上调。据发现BDNF AS的敲减对TrkB表达或对
相邻基因Let7C和KIF18A没有影响。这些数据表明在BDNF-AS删除时，BDNF表达存在基
因座特异性的改变。
酪氨酸激酶受体2型(TrkB)编码BDNF的膜结合受体且作为BDNF位于不同染色体(Chr-9)
上。确定了这些基因是否在BDNF-AS转录物删除时改变。HEK293T细胞用对照siRNA或
BDNF-AS siRNA转染并测量几种转录物水平。观察到BDNF-AS转录物下调且BDNF mRNA如
这一手稿(manuscript)中其它地方所示的上调。据发现BDNF AS的敲减对TrkB表达或对
相邻基因Let7C和KIF18A没有影响。这些数据表明在BDNF-AS删除时，BDNF表达存在基
因座特异性的改变。
[0289] Hek293细胞在0-96h的时程中用一种siRNA处理以定量BDNF和BDNF-AS的量
[0290] 以下的方法与Hek293细胞用siRNA处理相同，但此次细胞在添加寡聚物后0-96h时收获。
[0291] 结果：BDNF和BDNF-AS表达的时程显示在48h时与BDNF-AS的最佳下调同时的由siRNA导致的BDNF的最佳上调(图1b)。
[0292] Hek293细胞用不同hBDNF-AntagoNAT处理以定量BDNF和BDNF-AS的量
[0293] 以下的方法与Hek293细胞用siRNA处理相同，但此次细胞用AntagoNAT处理。
[0294] 结果：BDNF-AS转录物包含225-核苷酸的重叠区域，其具有与BDNF mRNA的完全互补性。RNA-RNA相互作用可能通过其反义转录物负责BDNF的不调和调节。为确定BDNF-AS
对BDNF mRNA的调节作用，包含LNA和2’OMe RNA修饰两者的间体(AntagoNAT)用于阻断
有义和反义转录物之间的相互作用。重叠区域被铺砌的hBDNF-AatagoNAT覆盖。据发现
hBDNF-AntagoNAT的使用上调BDNF mRNA。观察到BDNF-AS转录物的边缘下调，其对于包含
阻断寡聚物的2’OMe-RNA未预料到。测试了16个hBDNF-AntagoNAT并发现阻断BDNF-AS
重叠区域的前一半对于BDNF mRNA的上调具有更大的作用。具体地，hBDNF-AntagoNAT1和
hBDNFAntagoNAT4引起BDNF mRNA的显著上调。与合成siRNA不同，反义寡核苷酸是单链的
且长度上可以更短；因此，降低了非特异性(脱靶)结合效应。单链的锁核酸(LNA)-修饰
的寡核苷酸与未修饰的siRNA相比在体内一般是更有效的(图7)。
对BDNF mRNA的调节作用，包含LNA和2’OMe RNA修饰两者的间体(AntagoNAT)用于阻断
有义和反义转录物之间的相互作用。重叠区域被铺砌的hBDNF-AatagoNAT覆盖。据发现
hBDNF-AntagoNAT的使用上调BDNF mRNA。观察到BDNF-AS转录物的边缘下调，其对于包含
阻断寡聚物的2’OMe-RNA未预料到。测试了16个hBDNF-AntagoNAT并发现阻断BDNF-AS
重叠区域的前一半对于BDNF mRNA的上调具有更大的作用。具体地，hBDNF-AntagoNAT1和
hBDNFAntagoNAT4引起BDNF mRNA的显著上调。与合成siRNA不同，反义寡核苷酸是单链的
且长度上可以更短；因此，降低了非特异性(脱靶)结合效应。单链的锁核酸(LNA)-修饰
的寡核苷酸与未修饰的siRNA相比在体内一般是更有效的(图7)。
[0295] 小鼠N2a细胞用不同mBDNF-AntagoNAT处理以定量BDNF和BDNF-AS的量
[0296] 以下的方法与用不同hBDNF-AntagoNAT处理Hek293细胞以定量BDNF和BDNF-AS的量相同，但这次细胞是N2a细胞。此外，使用以下PCR循环：50℃下2min，95℃下10min，
50个循环的(95℃下15秒，60℃下1min)，使用GeneAmp 7900仪器(Applied Biosystems)。
50个循环的(95℃下15秒，60℃下1min)，使用GeneAmp 7900仪器(Applied Biosystems)。
[0297] 结果：图8显示N2a细胞中小鼠Bdnf-AS转录物被AntagoNAT抑制：人BDNF有义和反义转录物之间重叠区域的阻断上调BDNF mRNA水平。然后确定是否相似的调控
机制存在于小鼠细胞系中且测试靶向于小鼠Bdnf-AS转录物的11个mBdnf-AntagoNAT。
mBdnf-AntagoNAT包含硫代磷酸酯骨架和在3’和5’两个末端处的三个LNA-修饰的核苷
酸。对照寡核苷酸具有相似的骨架和修饰，但不靶向哺乳动物基因组中的任何序列。两个
mBdnf-AntagoNAT(mBdnf-AntagoNA3和mBdnf-AntagoNAT-9)能够提高N2a细胞中的Bdnf
mRNA水平。总之，用单链AntagoNAT(16聚体)阻断小鼠Bdnf-AS转录物引起小鼠N2a细胞
中Bdnf mRNA水平的上调。这些数据表明Bdnf的反义转录物对Bdnf mRNA发挥抑制性作
用。
机制存在于小鼠细胞系中且测试靶向于小鼠Bdnf-AS转录物的11个mBdnf-AntagoNAT。
mBdnf-AntagoNAT包含硫代磷酸酯骨架和在3’和5’两个末端处的三个LNA-修饰的核苷
酸。对照寡核苷酸具有相似的骨架和修饰，但不靶向哺乳动物基因组中的任何序列。两个
mBdnf-AntagoNAT(mBdnf-AntagoNA3和mBdnf-AntagoNAT-9)能够提高N2a细胞中的Bdnf
mRNA水平。总之，用单链AntagoNAT(16聚体)阻断小鼠Bdnf-AS转录物引起小鼠N2a细胞
中Bdnf mRNA水平的上调。这些数据表明Bdnf的反义转录物对Bdnf mRNA发挥抑制性作
用。
[0298] Hek293细胞用不同siRNA处理以定量BDNF蛋白
[0299] 以下方法与用不同siRNA处理Hek293细胞以定量BDNF mRNA的量相同，除了在步骤5中48h后添加siRNA。然后移除培养基且破坏细胞和通过ELISA(图1c)和蛋白质印迹
(图1d)定量其BDNF蛋白的水平。
(图1d)定量其BDNF蛋白的水平。
[0300] 蛋白质印迹：HEK293T细胞用10nM的BDNF-AS或对照siRNA转染。在转染后48h用200μl的包含350mM DTT的Laemmli样品缓冲液(Biorad)破坏细胞。20μl的溶解产
物在10％SDS PAGE上分离并将其转移到硝基纤维素膜上过夜。然后膜与MecP2的初级抗
体(Abcam)、BDNF(Promega,目录号G164B)和与HRP偶联的二级抗体孵育。在添加HRP底
物后，化学发光信号用X-射线薄膜检测。剥离相同的膜且将其重新用于检测作为加样对照
的β-肌动蛋白。
物在10％SDS PAGE上分离并将其转移到硝基纤维素膜上过夜。然后膜与MecP2的初级抗
体(Abcam)、BDNF(Promega,目录号G164B)和与HRP偶联的二级抗体孵育。在添加HRP底
物后，化学发光信号用X-射线薄膜检测。剥离相同的膜且将其重新用于检测作为加样对照
的β-肌动蛋白。
[0301] ELISA：细胞用20nM的BDNF-AS siRNA或对照siRNA转染。收集细胞上清液用于ELISA实验。或者，从埋置在蛋白质提取缓冲液+蛋白酶抑制剂(BCA试剂盒,Fisher)
中并用生物破碎器(bioruptor)和金属珠匀浆的小鼠脑组织提取总蛋白质。总蛋白质使
用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce目录号23227)测量且样品加载量相对于总蛋白质浓度
标准化。ELISA试剂盒对于人BDNF从Promega(目录号G7611)购得或对于小鼠Bdnf从
Millipore(目录号CYT306)购得，且按照供应商的方案进行ELISA。从背景减去450nm下
三次重复的平均吸光度并使其相对于对照样品标准化。
中并用生物破碎器(bioruptor)和金属珠匀浆的小鼠脑组织提取总蛋白质。总蛋白质使
用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce目录号23227)测量且样品加载量相对于总蛋白质浓度
标准化。ELISA试剂盒对于人BDNF从Promega(目录号G7611)购得或对于小鼠Bdnf从
Millipore(目录号CYT306)购得，且按照供应商的方案进行ELISA。从背景减去450nm下
三次重复的平均吸光度并使其相对于对照样品标准化。
[0302] Hek293细胞(不确定)用不同浓度的mBDNF-AntagoNAT9处理以定量BDNF mRNA
[0303] 以下方法与Hek293细胞用不同siRNA处理以定量BDNF mRNA的量相同，除了步骤3中所有mBDNF-AntagoNAT9稀释到不同浓度，如最终的11个不同浓度使用与Hek293细胞
用不同siRNA处理以定量BDNF mRNA的量相同比例量的Lipofectamine 2000(Invitrogen
cat#11668019)施用于细胞(从300nM到5pM范围的1:3系列稀释)，在相同体积的
Opti-MEM培养基(Gibco cat#31985-070)中使用。这在室温下进行20min并逐滴施用于具
有HepG2细胞的6孔板的一个孔。包括水而不是寡核苷酸溶液的相似混合物用于模拟转染
的对照。
用不同siRNA处理以定量BDNF mRNA的量相同比例量的Lipofectamine 2000(Invitrogen
cat#11668019)施用于细胞(从300nM到5pM范围的1:3系列稀释)，在相同体积的
Opti-MEM培养基(Gibco cat#31985-070)中使用。这在室温下进行20min并逐滴施用于具
有HepG2细胞的6孔板的一个孔。包括水而不是寡核苷酸溶液的相似混合物用于模拟转染
的对照。
[0304] 结果：如图1e中所示，当BDNF-AS被mBDNF-AntagoNAT9靶向时，存在BDNF的剂量依赖性的上调。
[0305] 图1显示有义mRNA和蛋白质的反义介导的调节。(A)脑源神经营养因子(BDNF)天然反义转录物BDNF-AS在HEK293T细胞(每处理n＝12)用靶向于BDNF-AS转录物的非
重叠区域的三个独特siRNA中的各siRNA(10nM)敲减引起BDNF(有义)mRNA的2-6倍上调
(对于各数据点n＝6/处理，***＝P<0.001,**＝P<0.01)。类似的结果从使用人皮层神
经元(HCN)、成胶质细胞瘤(MK059)细胞、小鼠N2a细胞和神经球(数据未显示)的实验获
得。错配序列、模拟转染和对照siRNA用作对照。用于这一实验和其它实验的对照siRNA
是不靶向哺乳动物基因组中任何已知序列的惰性siRNA(CCUCUCCACGCGCAGUACATT)。所有测
量值相对于18S rRNA标准化并作为各mRNA相对于阴性siRNA对照样品的百分比作图。
重叠区域的三个独特siRNA中的各siRNA(10nM)敲减引起BDNF(有义)mRNA的2-6倍上调
(对于各数据点n＝6/处理，***＝P<0.001,**＝P<0.01)。类似的结果从使用人皮层神
经元(HCN)、成胶质细胞瘤(MK059)细胞、小鼠N2a细胞和神经球(数据未显示)的实验获
得。错配序列、模拟转染和对照siRNA用作对照。用于这一实验和其它实验的对照siRNA
是不靶向哺乳动物基因组中任何已知序列的惰性siRNA(CCUCUCCACGCGCAGUACATT)。所有测
量值相对于18S rRNA标准化并作为各mRNA相对于阴性siRNA对照样品的百分比作图。
[0306] (B)BDNF和BDNF-AS转录物的变化在BDNF-AS敲减后的一段时间内评估(对于各数据点n＝6/处理)。人BDNF-AS的siRNA敲减导致在6h时开始并持续到72h的有效和
一致的BDNF-AS下调。BDNF mRNA水平在18h时上升，保持高水平超过72h，96h时逆转到
处理前水平。注意到48h时的峰值是一致的和可再现的。虽然BDNF-AS敲减在6h后开始，
BDNF的上调在处理后18h开始。BDNF-AS的耗竭和BDNF mRNA的增加之间的这种时间延迟
显示事件的序列顺序，其指示细胞需要时间在上调BDNF之前适应于反义转录物的去除。
一致的BDNF-AS下调。BDNF mRNA水平在18h时上升，保持高水平超过72h，96h时逆转到
处理前水平。注意到48h时的峰值是一致的和可再现的。虽然BDNF-AS敲减在6h后开始，
BDNF的上调在处理后18h开始。BDNF-AS的耗竭和BDNF mRNA的增加之间的这种时间延迟
显示事件的序列顺序，其指示细胞需要时间在上调BDNF之前适应于反义转录物的去除。
[0307] (C)siRNA-介导的BDNF-AS转录物敲减引起通过ELISA测量的BDNF蛋白质水平的提高。细胞用10nM的两种BDNF-AS的活性siRNA、乱序siRNA或对照siRNA转染48小时。
这些细胞的上清液浓缩并使用商购可得的试剂盒通过ELISA分析BDNF蛋白。BDNF蛋白利用
靶向于BDNF-AS转录物的siRNA显著提高(n＝6/处理，***＝P<0.0001,**＝P<0.001)。
这些细胞的上清液浓缩并使用商购可得的试剂盒通过ELISA分析BDNF蛋白。BDNF蛋白利用
靶向于BDNF-AS转录物的siRNA显著提高(n＝6/处理，***＝P<0.0001,**＝P<0.001)。
[0308] (D)蛋白质印迹确认非蛋白质编码的BDNF-AS用BDNF-AS siRNA1敲减提高BDNF蛋白水平但不改变β-肌动蛋白的水平，但不是对照非靶向siRNA转录物。总起来说，这些
数据表明在有义和反义BDNF转录物之间存在不调和的关系，其中BDNF-AS抑制BDNF mRNA
和蛋白质的表达。通过BDNF-AS敲减去除这一负调控作用引起BDNF mRNA和蛋白质水平的
上调。
数据表明在有义和反义BDNF转录物之间存在不调和的关系，其中BDNF-AS抑制BDNF mRNA
和蛋白质的表达。通过BDNF-AS敲减去除这一负调控作用引起BDNF mRNA和蛋白质水平的
上调。
[0309] (E)Bdnf-AS删除后Bdnf的剂量依赖性提高：使用11种不同浓度(1:3系列稀释，范围300nM-5pM)的mBdnf-AntagoNAT9(n＝6/数据点/处理)进行剂量反应试验且在
1-300nM浓度下到观察到Bdnf mRNA水平的剂量依赖性的提高，EC50为6.6nM。
1-300nM浓度下到观察到Bdnf mRNA水平的剂量依赖性的提高，EC50为6.6nM。
[0310] 海马神经球用siRNA处理
[0311] 切开神经球中的小鼠海马神经干细胞：神经干细胞从小鼠幼仔(P0-P1)的海马分离。海马机械分离成单细胞，通过短时旋转收集并在DMEM和F12的混合物(包含谷氨酰
胺、抗生素、B27溶液及0.001mM浓度的EGF和FGF两者)中生长。3-4天后，形成漂浮神
经球。100,000个细胞接种在聚L-赖氨酸(PLL)涂覆的24-孔板中。神经球细胞接种到
PLL上将开始分化过程。在接种后第三天，从培养基移除生长因子并允许细胞再生长4天
(接种后7天)。此时，细胞培养物具有由星形胶质细胞、神经元、少突细胞及其祖细胞组成
的神经细胞谱系的混合物，使得其与成熟脑组织更相似。Bdnf和Bdnf-AS的表达在漂浮神
经球中以及在接种后3和7的培养物中测量。在接种后3或7天使用靶向Bdnf-AS转录物
的50nM siRNA或20nM反义寡核苷酸进行敲减实验。神经干细胞也接种在总体积80μl的
免疫细胞化学室中(18,000细胞/孔)。然后神经球使用相同的方案转染以评估Bdnf-AS
敲减对鼠原代细胞的功能效应。在48-72h后，细胞用低聚甲醛(4％)固定20min并用1X
PBS洗涤几次。在用FBS封闭后，神经球与1:2000浓度的一级抗体(单克隆兔β微管蛋
白III,TUJ1)孵育过夜。固定的细胞与Alexafluor 568标记的二级抗体(山羊抗兔IgG，
2mg/ml，浓度1:5000)孵育。细胞核用Hoechst染色剂染色。通过免疫荧光抗原检测显微
术获得图像。
胺、抗生素、B27溶液及0.001mM浓度的EGF和FGF两者)中生长。3-4天后，形成漂浮神
经球。100,000个细胞接种在聚L-赖氨酸(PLL)涂覆的24-孔板中。神经球细胞接种到
PLL上将开始分化过程。在接种后第三天，从培养基移除生长因子并允许细胞再生长4天
(接种后7天)。此时，细胞培养物具有由星形胶质细胞、神经元、少突细胞及其祖细胞组成
的神经细胞谱系的混合物，使得其与成熟脑组织更相似。Bdnf和Bdnf-AS的表达在漂浮神
经球中以及在接种后3和7的培养物中测量。在接种后3或7天使用靶向Bdnf-AS转录物
的50nM siRNA或20nM反义寡核苷酸进行敲减实验。神经干细胞也接种在总体积80μl的
免疫细胞化学室中(18,000细胞/孔)。然后神经球使用相同的方案转染以评估Bdnf-AS
敲减对鼠原代细胞的功能效应。在48-72h后，细胞用低聚甲醛(4％)固定20min并用1X
PBS洗涤几次。在用FBS封闭后，神经球与1:2000浓度的一级抗体(单克隆兔β微管蛋
白III,TUJ1)孵育过夜。固定的细胞与Alexafluor 568标记的二级抗体(山羊抗兔IgG，
2mg/ml，浓度1:5000)孵育。细胞核用Hoechst染色剂染色。通过免疫荧光抗原检测显微
术获得图像。
[0312] AntagoNAT靶向于BDNF-AS：
[0313] 术语AntagoNAT在本文中用于描述抑制有义-反义相互作用的单链寡核苷酸分子(具有不同修饰，参见补充方法)。设计了单链间体，寡核苷酸，长度14个核苷酸，具有
2’O-甲基RNA和/或锁核酸(LNA)修饰。采用这一策略，我们铺砌了人BDNF-AS和BDNF
转录物之间的整个重叠区域并鉴定了几种能够上调BDNF mRNA的有效AntagoNAT。靶向于
重叠区域的第一部分的hBDNF-AntagoNAT1和hBDNF-AntagoNAT4产生最大的反应。数据表
明BDNF反义RNA通过单链AntagoNAT阻断足以引起BDNF mRNA的增加。
2’O-甲基RNA和/或锁核酸(LNA)修饰。采用这一策略，我们铺砌了人BDNF-AS和BDNF
转录物之间的整个重叠区域并鉴定了几种能够上调BDNF mRNA的有效AntagoNAT。靶向于
重叠区域的第一部分的hBDNF-AntagoNAT1和hBDNF-AntagoNAT4产生最大的反应。数据表
明BDNF反义RNA通过单链AntagoNAT阻断足以引起BDNF mRNA的增加。
[0314] 然后设计单链间体，LNA-修饰的15个DNA寡核苷酸(AntagoNAT)，长度16核苷酸，具有硫代磷酸酯骨架，与小鼠Bdnf-AS互补。两种AntagoNAT(mBdnf-AntagoNAT3和
mBdnf-AntagoNAT9)始终显示在小鼠N2a细胞中Bdnf mRNA水平的统计学显著的提高(图
7)。
mBdnf-AntagoNAT9)始终显示在小鼠N2a细胞中Bdnf mRNA水平的统计学显著的提高(图
7)。
[0315] 图7显示hBDNFAntagoNAT对人BDNF-AS转录物的抑制：BDNF-AS转录物包含225-核苷酸的重叠区域，其具有与BDNF mRNA的完全互补性。RNA-RNA相互作用可能负责
其反义转录物对BDNF的不调和调节。为确定BDNF-AS对BDNF mRNA的调节作用，包含LNA
和2’OMe RNA修饰两者的间体(AntagoNAT)用于阻断有义和反义转录物之间的相互作用。
重叠区域通过铺砌hBDNF-AatagoNAT覆盖。据发现hBDNF-AntagoNAT的使用上调BDNF
mRNA。观察到BDNF-AS转录物的边缘下调，这对于含阻断寡聚物的2’OMe-RNA是没有预
期的。16个hBDNF-AntagoNAT(各具有以下提供的序列的14聚体)进行测试且发现阻断
BDNF-AS重叠区域的前一半对于BDNF mRNA上调具有更大作用。特别地，hBDNF-AntagoNAT1
和hBDNFAntagoNAT4导致BDNF mRNA的显著上调。与合成siRNA不同，反义寡核苷酸是单
链的且长度可以更短；因此，降低非特异性(脱靶)结合效应。单链的锁核酸(LNA)-修饰
的寡核苷酸与未修饰的siRNA相比在体内一般是更有效的。Bdnf上调增加神经元外生长。
其反义转录物对BDNF的不调和调节。为确定BDNF-AS对BDNF mRNA的调节作用，包含LNA
和2’OMe RNA修饰两者的间体(AntagoNAT)用于阻断有义和反义转录物之间的相互作用。
重叠区域通过铺砌hBDNF-AatagoNAT覆盖。据发现hBDNF-AntagoNAT的使用上调BDNF
mRNA。观察到BDNF-AS转录物的边缘下调，这对于含阻断寡聚物的2’OMe-RNA是没有预
期的。16个hBDNF-AntagoNAT(各具有以下提供的序列的14聚体)进行测试且发现阻断
BDNF-AS重叠区域的前一半对于BDNF mRNA上调具有更大作用。特别地，hBDNF-AntagoNAT1
和hBDNFAntagoNAT4导致BDNF mRNA的显著上调。与合成siRNA不同，反义寡核苷酸是单
链的且长度可以更短；因此，降低非特异性(脱靶)结合效应。单链的锁核酸(LNA)-修饰
的寡核苷酸与未修饰的siRNA相比在体内一般是更有效的。Bdnf上调增加神经元外生长。
[0316] Bdnf上调增加神经元外生长：
[0317] 与表明Bdnf对神经元外生长和成人神经发生的刺激作用的许多先前的报告16-17一致，发现由于Bdnf-AS转录物的敲减造成的内源Bdnf水平的提高导致提高的神经
元细胞数目及导致神经突外生长和神经球中接种后3和7天的成熟(图5a-d)。这些数据
表明由于反义RNA的抑制造成的内源Bdnf上调诱导神经元祖细胞的神经元分化且可以引
起新生神经元的成熟表型。
元细胞数目及导致神经突外生长和神经球中接种后3和7天的成熟(图5a-d)。这些数据
表明由于反义RNA的抑制造成的内源Bdnf上调诱导神经元祖细胞的神经元分化且可以引
起新生神经元的成熟表型。
[0318] 结果：图2显示Bdnf上调增加神经元外生长。(A-B)接种后3d用对照siRNA(A)或Bdnf-AS siRNA(B)处理的海马神经球的免疫细胞化学图像。(C-D)接种后7d用对照
siRNA(C)或Bdnf-AS siRNA(D)处理的海马神经球中神经元成熟和神经突外生长的免疫细
胞化学图像。细胞用靶向Bdnf-AS转录物的siRNA处理在接种后3d或7d神经球中都导致
提高的神经元细胞数目以及神经突外生长和成熟的增加。β-微管蛋白III染成红色，GFAP
染成绿色和DAPI染成蓝色。
siRNA(C)或Bdnf-AS siRNA(D)处理的海马神经球中神经元成熟和神经突外生长的免疫细
胞化学图像。细胞用靶向Bdnf-AS转录物的siRNA处理在接种后3d或7d神经球中都导致
提高的神经元细胞数目以及神经突外生长和成熟的增加。β-微管蛋白III染成红色，GFAP
染成绿色和DAPI染成蓝色。
[0320] 小鼠研究：10只八周龄雄性C57BL/6小鼠用于体内试验。小鼠用背侧第三室中的长期植入插管制备，皮下植入以1.5mg/kg/d的剂量连续输注(0.11微升/h)递送针对
Bdnf-AS的合成反义寡核苷酸(mBdnf-AntagoNAT9)或对照寡核苷酸(不存在于人或小鼠中
的惰性序列)4周的渗透压微型泵。管道与渗透压微型泵的出口连接并皮下通向植入的插
管，以使得治疗直接递送到脑中。在植入后5d，所有动物每日接受BrdU(80mg/kg)的腹膜
内(IP)注射，连续五天。在手术后第28天，处死动物并从各小鼠脑切除三种组织(海马、
额皮质和小脑)用于定量RNA测量。
Bdnf-AS的合成反义寡核苷酸(mBdnf-AntagoNAT9)或对照寡核苷酸(不存在于人或小鼠中
的惰性序列)4周的渗透压微型泵。管道与渗透压微型泵的出口连接并皮下通向植入的插
管，以使得治疗直接递送到脑中。在植入后5d，所有动物每日接受BrdU(80mg/kg)的腹膜
内(IP)注射，连续五天。在手术后第28天，处死动物并从各小鼠脑切除三种组织(海马、
额皮质和小脑)用于定量RNA测量。
[0321] Bdnf-AS的敲减在体内提高Bdnf：
[0322] 利用用于脑室内(ICV)递送mBdnf-AntagoNAT9到C57BL/6小鼠的渗透压微型泵。然后基于在体内增加Bdnf mRNA的高效力选择靶向于小鼠Bdnf-AS的非重叠区域的
mBdnf-AntagoNAT9，其优于其它活性AntagoNAT。在连续AntagoNAT输注的28天后，在用
mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中Bdnf mRNA水平与惰性对照寡核苷酸的未改变水平相比
在邻近第三脑室的前脑区域中提高(图3a,b)。Bdnf和Bdnf-AS转录物在下丘脑(不与
第三脑室直接相邻的结构)中未改变(图3c)。而且，发现AntagoNAT-介导的Bdnf-AS阻
断导致提高的Bdnf蛋白质水平(图3d,e)。这些发现与以上描述的体外数据对应且表明
Bdnf-AS的阻断导致体内Bdnf mRNA和蛋白质表达的增加。
mBdnf-AntagoNAT9，其优于其它活性AntagoNAT。在连续AntagoNAT输注的28天后，在用
mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中Bdnf mRNA水平与惰性对照寡核苷酸的未改变水平相比
在邻近第三脑室的前脑区域中提高(图3a,b)。Bdnf和Bdnf-AS转录物在下丘脑(不与
第三脑室直接相邻的结构)中未改变(图3c)。而且，发现AntagoNAT-介导的Bdnf-AS阻
断导致提高的Bdnf蛋白质水平(图3d,e)。这些发现与以上描述的体外数据对应且表明
Bdnf-AS的阻断导致体内Bdnf mRNA和蛋白质表达的增加。
[0323] 小鼠脑样品的RNA提取和RT-PCR：小鼠在28天后处死且切除脑。各小鼠的半个脑在4％甲醛中固定过夜用于组织学研究。另一半的脑切碎用于海马、额皮质和小脑的RNA
定量测量。RNA按照制造商的方案在Trizol试剂(Invitrogen,15596-026)中匀浆后提取。
分离水性相并在使样品通过Qiagen RNeasy柱(QIAGEN,74106)之前添加等体积的70％乙
醇，且这些RNA样品进行柱上DNA酶处理以除去DNA污染。400ng的各样品用于第一链cDNA
合成并进行RT-PCR测量。在各个图形中对于单个组织的RNA水平相对于对照小鼠的百分
变化作图。
定量测量。RNA按照制造商的方案在Trizol试剂(Invitrogen,15596-026)中匀浆后提取。
分离水性相并在使样品通过Qiagen RNeasy柱(QIAGEN,74106)之前添加等体积的70％乙
醇，且这些RNA样品进行柱上DNA酶处理以除去DNA污染。400ng的各样品用于第一链cDNA
合成并进行RT-PCR测量。在各个图形中对于单个组织的RNA水平相对于对照小鼠的百分
变化作图。
[0324] 结果：图3显示Bdnf-AS体内调节Bdnf mRNA和蛋白质；(A-C)使用渗透压微型泵，mBdnf-AntagoNAT9(CAACATATCAGGAGCC)或对照寡核苷酸(CCACGCGCAGTACATG)在28d的
时间内恒定地输注到小鼠脑的第三脑室中(n＝5/处理组，*＝P<0.05,**＝P<0.01,***
＝P<0.001)。针对Bdnf-AS的mBdnf-AntagoNAT9导致海马(A)和额皮质(B)中Bdnf
水平的提高，但对照寡核苷酸没有。在下丘脑(C)中，两种转录物未改变，如对于与脑的
第三脑室不直接连接的组织所预期的。(D-E)BDNF蛋白质水平通过ELISA评估且发现
mBdnf-AntagoNAT9处理导致在海马(D)和额皮质(E)中与对照寡核苷酸处理的小鼠相比
BDNF蛋白质的增加。
时间内恒定地输注到小鼠脑的第三脑室中(n＝5/处理组，*＝P<0.05,**＝P<0.01,***
＝P<0.001)。针对Bdnf-AS的mBdnf-AntagoNAT9导致海马(A)和额皮质(B)中Bdnf
水平的提高，但对照寡核苷酸没有。在下丘脑(C)中，两种转录物未改变，如对于与脑的
第三脑室不直接连接的组织所预期的。(D-E)BDNF蛋白质水平通过ELISA评估且发现
mBdnf-AntagoNAT9处理导致在海马(D)和额皮质(E)中与对照寡核苷酸处理的小鼠相比
BDNF蛋白质的增加。
[0325] 使用渗透压微型泵脑室内(ICV)递送mBDNF-AntagoNAT9敲减BDNF-AS和上调BDNF
[0326] BrdU在研究的第一周注射到用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，持续5天。在连续AntagoNAT输注的28天后，进行脑组织的组织学检验并分别使用Ki67和BrdU标志
物定量神经元的增殖和存活。在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照处理小鼠
相比观察到Ki67阳性(增殖)细胞的增加(图4a,b)。定量Ki67阳性细胞的数量且在
mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中发现与对照寡核苷酸相比的细胞增殖的显著增加(图
4c)。在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照寡核苷酸处理的小鼠相比存在BrdU掺
入(存活的细胞)的显著增加(图4d)。对照和mBdnf-AntagoNAT9处理小鼠之间没有海马
体积的差异(图4e)。这些发现表明Bdnf-AS在体内调节Bdnf水平。
物定量神经元的增殖和存活。在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照处理小鼠
相比观察到Ki67阳性(增殖)细胞的增加(图4a,b)。定量Ki67阳性细胞的数量且在
mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中发现与对照寡核苷酸相比的细胞增殖的显著增加(图
4c)。在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照寡核苷酸处理的小鼠相比存在BrdU掺
入(存活的细胞)的显著增加(图4d)。对照和mBdnf-AntagoNAT9处理小鼠之间没有海马
体积的差异(图4e)。这些发现表明Bdnf-AS在体内调节Bdnf水平。
[0327] 结果：图4显示Bdnf-AS体内阻断导致神经元存活和增殖的提高；(A-B)小鼠用mBdnf-AntagoNAT9或对照寡聚物处理。在mBdnf-AntagoNAT9输注的28d后，使用Ki67进行
脑组织的组织学检验。Ki67是海马中增殖细胞的标志物且与接受对照寡聚物的小鼠相比，
在接受Bdnf-AntagoNAT处理的小鼠中观察到增殖细胞数目的增加。在mBdnf-AntagoNAT9
处理的小鼠中(B)，与对照处理的小鼠(A)相比，存在Ki67阳性细胞(增殖细胞)的增加。
(C)用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠与对照处理的小鼠相比具有Ki67阳性细胞数目的显
著增加。(D)在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照寡核苷酸处理的小鼠相比，存
在存活细胞(BrdU阳性)数目的显著增加。(E)对照和mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠之
间没有海马体积的差异。这些数据(每处理组n＝5，*＝P<0.05,***＝P<0.001)一起证
明Bdnf-AS在体内调节Bdnf水平且阻断Bdnf有义-反义相互作用导致神经元谱系、增殖
和存活的增加。
脑组织的组织学检验。Ki67是海马中增殖细胞的标志物且与接受对照寡聚物的小鼠相比，
在接受Bdnf-AntagoNAT处理的小鼠中观察到增殖细胞数目的增加。在mBdnf-AntagoNAT9
处理的小鼠中(B)，与对照处理的小鼠(A)相比，存在Ki67阳性细胞(增殖细胞)的增加。
(C)用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠与对照处理的小鼠相比具有Ki67阳性细胞数目的显
著增加。(D)在用mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠中，与对照寡核苷酸处理的小鼠相比，存
在存活细胞(BrdU阳性)数目的显著增加。(E)对照和mBdnf-AntagoNAT9处理的小鼠之
间没有海马体积的差异。这些数据(每处理组n＝5，*＝P<0.05,***＝P<0.001)一起证
明Bdnf-AS在体内调节Bdnf水平且阻断Bdnf有义-反义相互作用导致神经元谱系、增殖
和存活的增加。
[0328] 尽管已就一个或多个实施方式举例说明并描述本发明，但在阅读和理解本说明书和附图后，本领域技术人员将会想到等价改变和修饰。此外，虽然本发明的具体特征可能
仅就几个实施方式中的一个公开，但这类特征可与其他实施方式的一个或多个其他特征组
合，如对于任何给定或具体应用而言可为所需和有利的。
仅就几个实施方式中的一个公开，但这类特征可与其他实施方式的一个或多个其他特征组
合，如对于任何给定或具体应用而言可为所需和有利的。
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