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用于治疗和诊断5‑羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素‑相关医学病况的微RNA和包含所述微RNA的组合物

阅读：985发布：2020-10-19

专利汇可以提供用于治疗和诊断5‑羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素‑相关医学病况的微RNA和包含所述微RNA的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了 治疗 有需要的受试者的双相型障碍的方法。所述方法包括给予受试者 治疗有效量 的miR‑135、其前体或编码所述miR‑135或其所述前体的核酸分子，从而治疗双相型障碍。还公开了诊断人类受试者的心境障碍和监测抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物的治疗的方法。，下面是用于治疗和诊断5‑羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素‑相关医学病况的微RNA和包含所述微RNA的组合物专利的具体信息内容。

1.一种治疗有需要的受试者的双相型障碍的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的miR-135、其前体或编码所述miR-135或其所述前体的核酸分子，从而治疗双相型障碍。
2.治疗有效量的miR-135、其前体或编码所述miR-135或其所述前体的核酸分子用于制备经鉴定用于治疗有需要的受试者的双相型疾病的药物的用途。
3.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述miR-135选自miR-135a和miR-135b。
4. 权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述miR-135如SEQ ID NO: 58-62所示。
5. 权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述miR-135包含SEQ ID NO: 192-193所示的miR-135*。
6.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述miR-135包含选自修饰的糖-磷酸骨架和修饰的碱基的修饰。
7.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述miR-135包含糖和核苷间键两者中的修饰。
8.权利要求6或7的方法或用途，其中所述修饰选自硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼羰磷酸酯、磷酸二酯、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-氟、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)。
9. 权利要求6或7的方法或用途，其中所述miR-135如SEQ ID NO: 194-209所示。
10.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述双相型障碍选自双相I型、双相II型、快速循环双相型障碍、循环性气质和未分类双相型障碍(BD-NOS)。
11.一种制造品，其包含包装选自miR-135、其前体和编码所述miR-135或其所述前体的核酸分子的作用剂和用于双相型障碍治疗的药物的包装材料。
12. 权利要求11的制造品，其中所述miR-135选自SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61和SEQ ID NO: 62。
13. 权利要求11的制造品，其中所述miR-135包含选自SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 
193的miR-135*。
14.权利要求11的制造品，其中所述miR-135包含选自修饰的糖-磷酸骨架和修饰的碱基的修饰。
15.权利要求11的制造品，其中所述miR-135包含糖和核苷间键两者中的修饰。
16.权利要求14或15的制造品，其中所述修饰选自硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼羰磷酸酯、磷酸二酯、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-氟、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)。
17. 权利要求14或15的制造品，其中所述miR-135选自SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 
195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 
200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 
205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208和SEQ ID NO: 209。
18.权利要求11的制造品，其中所述用于双相型障碍治疗的药物选自锂、抗精神病药物和情绪稳定药物。
19. 一种监测抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物的治疗的方法，所述方法包括：
(a) 用抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗有需要的人类受试者；和
(b) 在所述治疗之前和之后测量所述人类受试者生物样品中的miR-135的表达水平，其中与在通过所述抗抑郁药物或用于所述治疗所述心境障碍的所述药物的所述治疗之前所述miR-135的所述表达水平相比，在通过所述抗抑郁药物或用于所述心境障碍的所述治疗的所述药物的所述治疗后所述miR-135的较高表达水平表明有效的治疗。
20.权利要求19的方法，所述方法进一步包括(c)当在步骤(b)中观察到较高表达水平的所述miR-135时，对人类受试者进行治疗。
21.权利要求19的方法，所述方法进一步包括在所述治疗之前从所述人类受试者中获得生物样品。
22.权利要求19的方法，其中所述心境障碍包括双相型障碍。
23.权利要求19的方法，其中所述抗抑郁药物选自选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)。
24.权利要求19的方法，其中用于所述心境障碍的所述治疗的所述药物选自锂、抗精神病药物和情绪稳定药物。
25.一种诊断有需要的人类受试者的心境障碍的方法，所述方法包括测量人类受试者的生物样品中miR-135的表达水平，其中与健康人类受试者的生物样品中的相比，所述miR-
135的较低表达水平表明有心境障碍。
26.权利要求19、21或25的方法，其中所述生物样品选自全血、血清、血浆和白细胞。
27.权利要求25的方法，其中所述心境障碍选自双相型障碍、抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍和进食障碍。
28.权利要求25的方法，其中所述miR-135选自miR-135a或miR-135b。
29.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述受试者是人类受试者。
30.一种包含miR-135的分离的多核苷酸，其中所述miR-135包含选自锁定核酸(LNA)和
2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修饰。
31. 一种包含选自以下修饰的miR135的分离的多核苷酸：SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208和SEQ ID NO: 209。
32.一种包含选自miR-335、miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-15和miR-19的微RNA的分离的多核苷酸，其中所述微RNA包含选自锁定核酸(LNA)和2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修饰。
33.一种药物组合物，其包含权利要求30、31或32的分离的多核苷酸和药学上可接受的载体。
34. 一种增量调节神经胶质细胞中的选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α
2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1 (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3) (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，所述方法包括：
(a) 减量调节所述神经胶质细胞中miR-135或其前体的活性或表达；和
(b) 测量所述神经胶质细胞中所述基因的表达，
从而增量调节基因的表达。
35. 一种减量调节神经胶质细胞中的选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α
2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1 (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3) (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，所述方法包括：
(a) 增量调节所述神经胶质细胞中的miR-135或其前体的活性或表达；和
(b) 测量所述神经胶质细胞中所述基因的表达，
从而减量调节基因的表达。
36. 一种治疗其中5-羟色胺水平的升高在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括给予受试者能够减量调节选自以下miR-135靶标的活性或表达的作用剂：腺苷酸环化酶激活多肽1  (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6  (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1  (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；
核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；
核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，其中所述作用剂不是miR-135，从而治疗所述医学病况。
37.权利要求36的方法，其中所述医学病况选自双相型障碍、抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍、进食障碍、生长障碍和生殖障碍。

说明书全文

用于治疗和诊断5-羟色胺-、肾上腺素-、去甲肾上腺素-、谷氨

酸-和促肾上腺皮质素释放激素-相关医学病况的微RNA和包

含所述微RNA的组合物

[0001] 发明领域和背景本发明在其一些实施方案中涉及微RNA，更具体但并非唯一地讲涉及所述微RNA用于疾病诊断、治疗和监测治疗的用途。
[0002] 心境障碍，例如重性抑郁症和焦虑障碍代表了影响约10%人口的某些全球最常见和激增的健康问题。尽管几十年的研究，但仅仅部分了解抑郁发作背后的机制、易感性和可获得的疗法。目前只有约三分之一的患者对可获得的治疗起反应，因此，极需要更好地认识病理学。
[0003] 有关抑郁症病因学现有的见解是环境因素和遗传诱因之间的复杂的相互作用，表明了外遗传过程的机制性作用。
[0004] 5-羟色胺(5HT)是一种在脑中通过中缝核(RN)产生的单胺神经递质，其在整个脑中广泛发射以调节各种认知、情绪和生理功能。5-羟色胺能活性失调和抑郁之间的联系已被充分证实[Michelsen KA.等, Brain Res Rev (2007) 55(2):329-42]。5HT的水平以及负责其产生、分泌、重摄取和失效的遗传回路在抑郁时失调。此外，大多数目前可获得的抗抑郁药物靶向5HT系统相关蛋白质的功能，导致突触中5HT水平升高[Krishnan V和Nestler EJ，Nature (2008) 455：894-902]。需要长期给予可获得的疗法后，才观察到症状缓解。
[0005] 微RNA (MicroRNA，miR)是一类转录后抑制基因表达的内源非编码小(约22个核苷酸) RNA分子。miR作为初级miR分子转录，初级miR在细胞核中加工成具有茎环结构的前体miR，其输出到胞质中，在其中进一步加工成有活性的成熟miR。成熟miR随后掺入RNA诱导的沉默复合物中，主要通过与特定mRNA分子的3’非翻译区(3’UTR)结合起作用。结合通过种子序列(一种在miR 5′端的6-8个核苷酸序列)产生，该碱基与目标mRNA 3' UTR的互补种子匹配(seed match)序列配对。miR的结合导致直接的mRNA不稳定或翻译抑制，最终导致靶基因的蛋白质水平降低。
[0006] 神经系统中有大量的miR，最初的研究主要集中在发育、癌症和神经变性病症和正常过程(例如可塑性)的情况下的神经元中[Kosik KS. Nat Rev Neurosci (2006) 7:911-20]。若干miR筛选研究报告了不同的成年啮齿动物或人脑结构的miR水平受各种行为和药理学操纵影响[O'Connor R. M.等, Mol Psychiatry (2012) 17: 359-376]。另外，已表明miR在人和小鼠模型两者的精神障碍例如精神分裂症、孤独症还有抑郁症和焦虑症中起作用[Miller BH和Wahlestedt C, Brain Res (2010) 1338: 89-99]。若干研究最近表明miR参与调节5HT相关基因[Millan MJ. Curr Opin Pharmacol (2011) 11(1):11-22]，显示了miR在5HT系统调节中的新兴作用及其与抑郁相关病症的可能关系。
[0007] 美国专利申请号20100222413 (Stoffel M.等人)公开了用于调节微RNA表达的化学修饰的寡核苷酸。U.S. 20100222413另公开了用于使微RNA (例如miR-122、miR-16、miR-192和miR-194)沉默以治疗中枢神经系统疾病的方法。
[0008] 发明概述根据本发明一些实施方案的方面，提供治疗有需要的受试者的双相型障碍的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的miR-135、其前体或编码miR-135或其前体的核酸分子，从而治疗双相型障碍。
[0009] 根据本发明一些实施方案的方面，提供治疗有效量的miR-135、其前体或编码miR-135或其前体的核酸分子用于制备经鉴定用于治疗有需要的受试者的双相型疾病的药物的用途。
[0010] 根据本发明一些实施方案的方面，提供包含包装选自miR-135、其前体和编码miR-135或其前体的核酸分子的作用剂和用于治疗双相型障碍的药物的包装材料的制造品。
[0011] 根据本发明一些实施方案的方面，提供监测抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物的治疗的方法，所述方法包括：(a)用抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗有需要的人类受试者；和(b)在治疗之前和之后测量人类受试者的生物样品中miR-135的表达水平，其中与在通过抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗之前miR-135的表达水平相比，在通过抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗之后miR-135的较高表达水平表明有效的治疗。
[0012] 根据本发明一些实施方案的方面，提供诊断有需要的人类受试者的心境障碍的方法，所述方法包括测量人类受试者的生物样品中miR-135的表达水平，其中与健康人类受试者的生物样品中的相比，较低的miR-135表达水平表明有心境障碍。
[0013] 根据本发明一些实施方案的方面，提供包含miR-135的分离的多核苷酸，其中miR-135包含选自锁定核酸(LNA)和2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修饰。
[0014] 根据本发明一些实施方案的方面，提供包含选自以下修饰的miR135的分离的多核苷酸：SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 
203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 
208和SEQ ID NO: 209。
[0015] 根据本发明一些实施方案的方面，提供包含选自miR-335、miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-15和miR-19的微RNA的分离的多核苷酸，其中微RNA包含选自锁定核酸(LNA)和2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修饰。
[0016] 根据本发明一些实施方案的方面，提供包含本发明的一些实施方案的分离的多核苷酸和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0017] 根据本发明一些实施方案的方面，提供增量调节神经胶质细胞的选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6  (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1  (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)、超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)、5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；
核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，所述方法包括：(a)减量调节神经胶质细胞中的miR-135或其前体的活性或表达；和(b)测量神经胶质细胞中基因的表达，从而增量调节基因的表达。
[0018] 根据本发明一些实施方案的方面，提供减量调节神经胶质细胞中的选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1  (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；
核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶
1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a  (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，所述方法包括：(a)增量调节神经胶质细胞中的miR-135或其前体的活性或表达；和(b)测量神经胶质细胞中基因的表达，从而减量调节基因的表达。
[0019] 根据本发明一些实施方案的方面，提供治疗其中5-羟色胺水平的升高在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括给予受试者能够减量调节选自以下的miR-135靶标的活性或表达的作用剂：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1 (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9  (α(1,3)岩藻糖基转移酶)  (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3  (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3) (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；
核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；
cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5  (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，其中所述作用剂不是miR-135，从而治疗所述医学病况。
[0020] 按照本发明的一些实施方案，医学病况选自双相型障碍、抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍、进食障碍、生长障碍和生殖障碍。
[0021] 按照本发明的一些实施方案，miR-135选自miR-135a和miR-135b。
[0022] 按照本发明的一些实施方案，miR-135如SEQ ID NO: 58-62所示。
[0023] 按照本发明的一些实施方案，miR-135包含SEQ ID NO: 192-193所示的miR-135*。
[0024] 按照本发明的一些实施方案，miR-135包含选自修饰的糖-磷酸骨架和修饰的碱基的修饰。
[0025] 按照本发明的一些实施方案，miR-135包含糖和核苷间键两者中的修饰。
[0026] 按照本发明的一些实施方案，修饰选自硫代磷酸酯(phosphorothioate)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼羰磷酸酯
(boranophosphate)、磷酸二酯、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-氟、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)。
[0027] 按照本发明的一些实施方案，miR-135如SEQ ID NO: 194-209所示。
[0028] 按照本发明的一些实施方案，双相型障碍选自双相I型、双相II型、快速循环双相型障碍、循环性气质和未分类双相型障碍(BD-NOS)。
[0029] 按照本发明的一些实施方案，miR-135选自SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61和SEQ ID NO: 62。
[0030] 按照本发明的一些实施方案，miR-135包含选自SEQ ID NO: 192和SEQ ID NO: 193的miR-135*。
[0031] 按照本发明的一些实施方案，miR-135选自SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208和SEQ ID NO: 209。
[0032] 按照本发明的一些实施方案，用于双相型障碍治疗的药物选自锂、抗精神病药物和情绪稳定药物。
[0033] 按照本发明的一些实施方案，所述方法另包括(c)当在步骤(b)中观察到较高miR-135表达水平时，则对人类受试者进行治疗。
[0034] 按照本发明的一些实施方案，所述方法另包括在治疗前从人类受试者中获得生物样品。
[0035] 按照本发明的一些实施方案，心境障碍包含双相型障碍。
[0036] 按照本发明的一些实施方案，抗抑郁药物选自选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)。
[0037] 按照本发明的一些实施方案，治疗心境障碍的药物选自锂、抗精神病药物和情绪稳定药物。
[0038] 按照本发明的一些实施方案，生物样品选自全血、血清、血浆和白细胞。
[0039] 按照本发明的一些实施方案，心境障碍选自双相型障碍、抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍和进食障碍。
[0040] 按照本发明的一些实施方案，miR-135选自miR-135a或miR-135b。
[0041] 按照本发明的一些实施方案，受试者是人类受试者。
[0042] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是下面描述了示例性方法和/或材料。万一抵触，则以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，无意是必然限制性的。
[0043] 附图简述本文仅通过实例，参照附图描述了本发明的一些实施方案。下面特别提及附图详情，要强调的是，所示细节举例说明，并用于本发明的实施方案的说明性论述的目的。在这点上，随附图记录的描述使本领域技术人员明白可如何实施本发明的实施方案。
[0044] 附图中：图1A-I表示5-羟色胺(5HT)神经元中的微RNA表达。图1A是5HT神经元中差异表达的miRNA的示图。Lowess归一化值描述为对平均log强度绘制的斑点亮度的ln2倍数变化(MA图)；图1B是miR实时PCR中阵列结果的验证，表明与对照相比5HT神经元中miR-375水平升高。n = 5 5HT细胞，n = 4 非5HT。线条表示均值± s.e.m。**P=0.0071；图1C是miR实时PCR中阵列结果的验证，表明与对照相比5HT神经元中miR-135a水平降低。N = 5 5HT细胞，n = 
4 非5HT。**P=0.0075；图1D是表示用5HT微阵列结果和选用于体外测试的列举miR针对Slc6a4的交叉生物信息学预测的文氏图(van diagram)；图1E是表示用5HT微阵列结果和选用于体外测试的列举miR针对Htr1a的交叉生物信息学预测的文氏图；图1F是表示用5HT微阵列结果和选用于体外测试的列举miR针对Tph2的交叉生物信息学预测的文氏图；图1G是表示用5HT微阵列结果和选用于体外测试的列举miR针对MaoA的交叉生物信息学预测的文氏图；图1H是说明表明miR-181c和miR-27b可靶向Tph2 3'UTR的萤光素酶报道基因测定结果的图；和图1I是说明表明miR-27b可靶向Htr1a MaoA的萤光素酶报道基因测定结果的图。
[0045] 图2A-H表示Slc6a4 3'UTR (SEQ ID NO: 25)和Htr1a 3'UTR (SEQ ID NO: 27)的微RNA打靶。图2A是Slc6a4 3'UTR的miR-135a和miR-135b (分别为SEQ ID NO: 24和26)打靶的图示；图2B是Htr1a 3'UTR的miR-135a和miR-135b (分别为SEQ ID NO: 24和26)打靶的图示；图2C是说明表明miR-135a和miR-135b可靶向Slc6a4 3'UTR的萤光素酶报道基因测定结果的图。萤光素酶测定数据表示归一化至用上述基因的3’UTR和空载体或过量表达特定miR的载体转染的HEK293细胞中的共转染的萤火虫萤光素酶报道基因的活性的海肾萤光素酶(renilla luciferase)活性。线条表示均值± s.e.m。*P = 0.014，***P = 0.0002，对于miR-16 #p < 0.0535，对于miR-27 #P = 0.0967；图2D是说明萤光素酶报道基因测定结果的图，表明了miR-135a、miR-135b、miR-335、miR-181C和miR-26a可靶向Htr1a 3'UTR。***P < 0.0001，**P = 0.0029；图2E是miR-135种子匹配的slc6a4 3'UTR保守性(SEQ ID NO: 27-41)的图示；图2F是miR-135的Htr1a 3'UTR种子匹配(SEQ ID NO: 42-54)的图示，表明种子1只出现小鼠3’ UTR中，种子2是高度保守的；图2G是说明slc6a4 3'UTR中miR-135种子匹配的突变阻断miR-135a和miR-135b的阻抑物作用的图。***P < 0.0001，**P = 0.0032；
和图2H是说明Htr1a 3' UTR中的miR-135种子匹配单独和两个一起的突变的图，表明miR-
135b通过两个种子匹配靶向Htr1a，而miR-135a只通过种子2靶向Htr1a。***P < 0.0001。
[0046] 图3A-F表示不同条件下的miR-135a和miR-135b水平。图3A是说明在急性应激后在RN中miR-135a水平减量调节的图。线条表示均值± s.e.m。(0组中n=8，90分钟组中n=10，24小时组中n=9)，***P < 0.0001，*P = 0.0357；图3B是说明在急性应激后在RN中miR-135b水平减量调节的图。***P < 0.0001，**P = 0.0055；图3C是说明独立于小鼠是否暴露于社交失败在急性和慢性丙米嗪给药后在RN中miR-135a水平增量调节的图。(对照慢性盐水和对照慢性丙米嗪中n=8，急性丙米嗪n=7，社交失败慢性盐水n=11，社交失败慢性丙米嗪中n=9)，**P = 0.003；图3D是说明不依赖小鼠是否暴露于社交失败在急性和慢性丙米嗪给药后在RN中miR-135b水平增量调节的图。**P = 0.0093；图3E是说明在急性或慢性给予的SSRI而非NRI或盐水后在RN中miR-135a水平升高的图。(除急性盐水n=7以外，每组n=8) ***P < 
0.0001；图3F是说明在急性或慢性给予SSRI或NRI后在RN中miR-135b水平不改变的图。
[0047] 图4A-H表示miR-135b体内过量表达。图4A是用于过量表达miR-135b的慢病毒的示意图；图4B是说明表明成年小鼠背缝核(DRN)中miR-135b体内过量表达的实时PCR结果的柱状图。线条表示均值± s.e.m。(n=5 GFP注射，n=3 miR-135 OE)，P = 0.0032；图3C-D是通过显示注射部位的GFP染色的DRN注射部位的图示。(采用Paxinos的断面图)；图4E是说明与对照小鼠相比在RN中过量表达miR-135b的小鼠中在强迫游泳试验中不活动时间减少的柱状图。(n=9对照，n=9 miR-135)，第3分钟P = 0.0088，第4分钟P = 0.00330；图4F是说明与对照小鼠相比在RN中过量表达miR-135b的小鼠在悬尾试验中不活动时间减少的示图。P = 0.07351；图4G-H是说明与对照相比在RN中过量表达miR-135b的小鼠在养育笼运动中无差异的柱状图。
[0048] 图5表示在萤光素酶基因之后克隆的ADRb1 3'UTR。在Psicheck2质粒中的萤光素酶基因下游克隆的带有4个miR-19结合位点的完整(上部) ADRb1 3'UTR和缺乏所有4个miR-19结合位点的ADRb1 3'UTR的突变体(底部)形式的图示。
[0049] 图6A-E表示miR-19b通过其3’UTR上的种子匹配靶向ADRb1 3’UTR；图6A-B是说明在用(图6A) GFP质粒或(图6B) pre-miR-19b过量表达(OE)质粒转染后表达低水平的内源miR-19的HT22细胞中测量的归一化萤光素酶水平的柱状图；图6C-E是说明在表达高水平的内源miR-19的HEK293T细胞中测量的归一化萤光素酶水平的柱状图。用(图6C)对照质粒、(图6D) miR-19b敲减(KD)探针或杂混探针(scrambled probe)作为对照转染，和(图6E)用miR-19b miArrest质粒或对照miArrest质粒转染。*** P < 0.005。使海肾萤光素酶活性通过萤火虫萤光素酶表达水平归一化并表示为在对照治疗存在下通过Adrb1-3'UTR (Adrb1-mut)的突变体形式实现的活性比。
[0050] 图7A-D表示杏仁核(amygdale)中miRNA的差异表达。图7A-B是说明在急性应激后90分钟杏仁核中miRNA的差异表达的图示。图7A说明agilent阵列结果。图7b说明
affymetrix阵列结果。归一化值描述为对各条件(N=2，2)间的平均强度作图的斑点亮度的log2比率(应激与对照)。各miRNA的强度计算为各生物重复间的平均归一化强度。miR-15a和miR-15b用红色表示。不受应激方案影响的miR-124 (一种充分证实的神经元标志物)以白色表示；图7C说明miR-15a和miR-15b在促肾上腺皮质素释放激素1型受体3'UTR上具有半保守的种子匹配[CRHR1，改编自targetscan(dot)org]；图7D是说明在用miR-15b-EGFP过量表达质粒或GFP表达质粒和由CRFR1-3'UTR控制的萤光素酶报道基因质粒共转染的HEK293T细胞中测量的萤光素酶活性的柱状图。使海肾萤光素酶活性通过萤火虫萤光素酶表达水平归一化。
[0051] 图8是说明萤光素酶报道基因测定结果的柱状图，表明miR-182可能靶向Htr1a 3'UTR。萤光素酶测定数据表示归一化至用上述基因的3’UTR和空载体或过量表达特定miR的载体转染的HEK293细胞中共转染的萤火虫萤光素酶报道基因活性的海肾萤光素酶活性。
[0052] 图9是说明成年小鼠DRN中miR-182表达水平的实时PCR结果的柱状图，表明在慢性社交失败后表达降低的趋势。数据表示均值± SEM，n= 7只对照，社交失败组中18只小鼠，# = p = 0.1。
[0053] 图10是表示在2种算法中miR-182打靶的计算机生物信息学预测的文氏图和在该预测中出现的对正常和病理性神经元功能是高度相关的潜在靶基因的列表。
[0054] 图11A-C表示miR-182的过量表达或敲减。图11A是用于miR-182过量表达的慢病毒的示意图；图11B是说明表明N2A细胞系中体外miR-182过量表达的实时PCR结果的图示；图11C是用于miR-182敲减的慢病毒的示意图。
[0055] 图12A-D表示在NRI给药后PFC中的miR-19水平。急性(一次)或慢性(持续18天)给予NRI瑞波西汀。值得注意的是，在急性给予NRI后，miR-19a和miR-19b水平在PFC中降低(分别为图12A和图12B)，但在慢性给予NRI后升高(分别为图12C和图12D)。
[0056] 图13A-D表示经历社交失败的小鼠的PFC和杏仁核中的miR-19水平。测量取自遭受社交失败范例的小鼠杏仁核的样品中的miR-19a和miR-19b水平。值得注意的是，PFC中的miR-19a和miR-19b水平在归类为与对照小鼠相比对社交失败“敏感的”小鼠中升高(分别为图13A和图13B)。miR-19水平还在归类为与对照小鼠相比对社交失败“敏感的”的小鼠杏仁核中升高(分别为图13C和图13D)。
[0057] 图14表示靶向CB1 3’UTR的miRNA-19b。用CB1 3` UTR和过量表达miR-19b或GFP对照的质粒转染HT-22细胞导致归一化萤光素酶水平的50%降低。
[0058] 图15A-B是小鼠脑冠状面的示意图。图15A显示脑中的几种核，包括BLA (改编自Paxinos和Franklin的小鼠脑)；图15B显示脑中的CB1分布(改编自Allen Brain Atlas wwwdotmousedotbrain-mapdotorg/)。值得注意的是，BLA中富含CB1的这种分布是明显的。
[0059] 图16是基底外侧杏仁核(BLA)中记忆巩固的建议机制的示意图。皮质酮(CORT)与激活Gs-cAMP/PKA途径以诱导内源性大麻素(eCB)合成的尚未表征的膜结合的糖皮质激素受体(mbGR)结合。内源性大麻素释放到突触中，它们在其中与在γ-氨基丁酸能末稍上与CB1受体结合，抑制GABA释放。GABA释放的这种抑制解除对去甲肾上腺素(NE)释放的抑制并提高突触后β-肾上腺素受体的NE激活，增强不良情绪记忆的巩固。
[0060] 图17A-B说明RISC复合物中的Ago2。图17A是介导miRNA和mRNA之间的相互作用的RISC复合物中的Ago2的示意图；图17B说明用抗Ago2抗体进行的蛋白质印迹分析。该IP对Ago2蛋白有特异性，如当比较与Ago2抗体沉淀一次和与IgG1对照沉淀一次的全脑样品时所见。值得注意的是，对与IgG1对照沉淀的样品未检出Ago2蛋白。
[0061] 图18A-D表示社交回避试验。将小鼠单独放入迷宫3分钟使之习惯(图18A和图18B)，记录其运动并作图。在3分钟后，将新的ICR小鼠放入紧邻受测小鼠的室中(图18C和图
18D)，再次记录受测小鼠的运动并作图。
[0062] 图19A表示在阵列中增量调节的选定miRNA的热点图。
[0063] 图19B表示在阵列中减量调节的选定miRNA的热点图。
[0064] 图20A-B表示来自微阵列结果的miR-15a (图20A)和FKBP5 (图20B)的log2表达。各红色小点是指阵列的一个重复。对照组(CNT)有4个重复，“敏感的”组(SUSC)有3个重复，“适应性强的”组(RESIL)有3个重复。黑色线条表示各组中重复的均值。
[0065] 图20C表示小鼠FKBP5的3’ UTR序列(获自targetscan.org)。
[0066] 图21A-B表示在社交失败后与对照小鼠相比“敏感的”小鼠的杏仁核miR-15a (图21A)和FKBP5 (图21B)的水平。值得注意的是，在遭受社交失败并称为“敏感的”小鼠的杏仁核中miR-15a水平升高(图21A)。在遭受社交失败并称为“敏感的”小鼠的杏仁核中FKBP5水平降低(图21B)。
[0067] 图22是各带有单一miRNA-15结合位点的Stx1a、Sgk1和Adrb2的3'UTR的示意图。
[0068] 图23表示与对照小鼠相比在遭受社交失败的小鼠的杏仁核miR-181水平。值得注意的是，miR-181水平在遭受社交失败的小鼠杏仁核中升高。
[0069] 图24表示代表miR-181和谷氨酸受体的交叉生物信息学预测的文氏图。
[0070] 图25是miR-181的6个潜在靶标的完整3'UTR的示意图。
[0071] 图26表示在应激后在中缝核中miR182的表达水平。值得注意的是，如实时PCR测量的，当在应激后24小时测试时，急性30分钟制动应激导致RN中miR182的表达水平降低。**=P<0.01；各组中n=8。
[0072] 图27-29表示萤光素酶报道基因测定的结果，表明miR182靶向DSCAM、L1CAM和TSNAX 3'UTR。图27说明萤光素酶测定的数据，描述了归一化至用上述基因的3’UTR和空载体或过量表达特定miR的载体转染的N2a细胞中共转染的萤火虫萤光素酶报道基因的活性的海肾萤光素酶活性。L1cam (图28)和Tsnax (图29) 3' UTR中miR182种子匹配的突变阻断miR182的抑制作用(represoric effect)。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
[0073] 图30A-E表示体外和体内miR135 KD的验证。图30A-B说明萤光素酶报道基因测定的结果，表明Htr1a (图30A)和slc6a4 (图30B)的miR135打靶被miR135b KD构建体阻断；图30C是miR135bKD和对照病毒载体的示意图；图30D-E是DRN注射部位的图示(图30D，采用Paxinos)，图30E是用miR135 KD慢病毒感染的DRN的GFP染色。
[0074] 图31A-G表示miR135KD小鼠中焦虑样行为增加和对SSRI的反应减弱。图31A说明在旷场试验中miR135KD小鼠的行为与对照小鼠的相似；图31B说明在高架十字迷宫(elevated pulse maze)中与对照小鼠相比miR135KD小鼠中的焦虑样行为增加；图31C说明在明暗转移试验中与对照小鼠相比，miR135KD小鼠在基础应激条件下但不在急性应激后在明室花费较多时间；图31D说明与对照小鼠相比，miR135KD小鼠在基础应激条件下但不在急性应激后到访明室更多次；图31E说明与对照小鼠相比，miR135KD小鼠在基础应激条件下但不在急性应激后在明室行走较小距离；图31F说明在悬尾试验中于在基础条件下和在给予SSRI后两者中miR135KD小鼠和对照小鼠之间无差异，然而与两组的基础条件相比，在SSRI治疗后观察到不活动时间减少(图31F-G)。在两组中通过SSRI减少不活动时间，然而在试验的最后2分钟与对照相比，miR135KD小鼠中的减少减缓。=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01；***=p<0.001。~
各组中n=10-11。
[0075] 图32是miR135小鼠诱导型过量表达系统的示意图。表达在miR135a序列和GFP报道分子之前的stop两侧前加flox位点的转基因小鼠。突变体转基因小鼠只在5-HT ePet阳性细胞中表达miR135a。
[0076] 图33A-C表示在5-HT神经元中过量表达miR135的小鼠系的验证。图33A说明与对照小鼠相比在miR135OE小鼠的RN中miR135过量表达。图33B-C说明miR 135靶基因mRNA，Slc6a4 (图33B)和Htr1a (图33C)两者在miR135OE小鼠RN中减量调节。#=p<0.1 *=p<0.05；n=4 各组中。
[0077] 图34A-E表示在社交失败后在miR135OE小鼠中焦虑和抑郁样行为减少。图34A显示在旷场试验中miR135OE小鼠的焦虑样行为减少；图34B显示在明暗转移试验中与miR135OE小鼠的对照相比较少的焦虑样行为；图34C显示与对照相比miR135OE小鼠在高架十字迷宫中焦虑样行为减少；图34D显示在悬尾试验中与对照相比miR135OE小鼠趋于不活动时间减少的倾向；图34E显示中在强迫游泳试验中与对照相比miR135OE小鼠的不活动时间减少。#=p<0.1，*=p<0.05，**=p<0.01，各组中n=7-11。
[0078] 图35A-D说明5HT神经元的微RNA “指纹”。(图35A)测定5HT神经元微RNA “指纹”的实验设计的示意图。切下ePet-EYFP小鼠胚胎后脑，FACS分选成5HT-YFP阳性和YFP阴性细胞。使用Agilent微RNA微阵列比较来自2个群的miR表达；(图35B-35D)通过实时PCR对细胞表型的验证，表明了与非5HT细胞相比，YFP (图35B)和TPH2 (图35C)在5HT中显著富集，并且GAD67 (一种γ-氨基丁酸能标志物)在非5HT细胞中显著较高(图35D)。线条表示均值± s.e.m。***P<0.001。
[0079] 图36A-C说明miR-135变体的进化保守性。(图36A-C) miR-135a-1 (图36A)、miR-135a-2 (图36B)和miR-135b (图36C)在整个进化中是高度保守的，而用彩色突出显示的成熟miR序列几乎是完全保守的。数据修改自UCSC基因组浏览器(Kent WJ，2002)。
[0080] 图37A-G说明在抗抑郁药治疗后miR-135在成年小鼠RN中增量调节。(图37A)成熟miR-135a和miR-135b之间的对比表明1个核苷酸差异；(图37B)小鼠RN中miR-135a和miR-135b的表达水平；(图37C)成年小鼠RN中若干miR的表达概况表明miR-135a的丰富性是miR-
124的约1/5，是miR-16的1/2.5。线条表示均值± s.e.m；(图37D)暴露于社交失败的小鼠显示社交回避增加，除非用慢性丙米嗪治疗。互动比计算为在接近陌生小鼠地带中所花的时间除以习惯期间在同一地带所花时间乘以100。线条表示均值±s.e.m。*P<0.05；(图37E和
37F)在慢性(图37E)或急性(图37F)丙米嗪给药后miR-135a水平在RN中增量调节，并且在暴露于慢性社交失败方案后不改变。线条表示均值± s.e.m。**P<0.01；(图37G)在急性或慢性给药后，SSRI而非NRI或盐水引起RN中miR-135a水平显著升高。线条表示均值±
s.e.m。***P<0.001。
[0081] 图38A-M说明miR-135在5HT神经元中的特异性过量表达引起对社交失败的行为复原力(behavioral resiliency)。(图38A) miR-135条件性过量表达小鼠模型的示意图。使在miR-135a和GFP序列上游的转录STOP序列两侧加入loxP位点的转基因小鼠与ePet-Cre重组酶小鼠杂交。双重转基因小鼠在5HT阳性细胞中特异性过量表达miR-135a。仅携带miR-135a的转基因且无ePet-Cre转基因的同窝小鼠(littermatemice)用作对照；(图38B)与对照相比，在miR-135过量表达(OE)小鼠中，RN中的miR-135a表达水平增量调节达约2倍；(图
38C和38D)与对照同胞仔鼠相比，miR-135OE小鼠中miR-135靶基因Slc6a4 (图38C)和Htr1a (图38D) mRNA减量调节。线条表示均值± s.e.m。# P<0.1；*P<0.05；(图38E-38G)在明暗转移试验中，在“基础”应激条件下或在慢性社交失败后对miR-135OE小鼠及其对照同胞仔鼠进行了测试。在“基础”条件下在基因型间未观察到差异，然而，在慢性社交失败后miR-
135OE小鼠在光下渡过较多时间(图38E)，较频繁地到访亮光室(图38F)，并在光下行走较长距离(图38G)；miR-135OE小鼠的行为表现在社交失败方案后无显著不同。相比之下，在社交失败后在光暗试验的所有所测参数中，对照小鼠显示焦虑样行为增加。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05，***P<0.001；(图38H-38J)在高架十字迷宫试验中，与在“基础”条件下测试的对照小鼠相比，暴露于社交失败的对照小鼠在开放臂中花较少时间(图38H)，具有较少的到访次数(图38I)，且行走较小距离(图38J)。在miR-135OE组中，在“基础”和应激条件之间未观察到显著差异。线条表示均值± s.e.m。**P<0.01，***P<0.001；(图38K和38L)在强迫游泳试验中，当在“基础”应激条件测试时，组间未观察到显著差异(图38K)，然而，当在慢性社交失败后测试时，与对照同胞仔鼠相比，miR-135OE小鼠显示不活动减少(图38L)。线图表示均值± s.e.m。***p<0.001；(图38M)在miR-135OE和对照同胞仔鼠间未观察到自主活动能力(locomotor activity)的差异，通过在旷场试验中行走的总距离测量。线条表示均值± s.e.m。
[0082] 图39A-N说明成年小鼠RN中miR-135的敲减引起焦虑样行为增加和对抗抑郁药的反应减弱。(图39A) “miR-135俘获”结构的示意图；(图39B) miR-135 KD和对照病毒载体的示意图；(图39C) miR-135 KD慢病毒感染在内源表达这些基因和miR-135的RN46a细胞中提高Htr1a和Slc6a4 mRNA表达水平；(图39D)显示注射部位的脑断面图，改编自Paxinos和Franklin小鼠脑图集(Paxinos，1997) (左图)和用miR-135KD慢病毒感染的成年小鼠的DRD中的GFP免疫染色；(图39E-39H)在明暗转移试验中，与对照KD注射小鼠相比，miR-135KD小鼠在明室花较少时间(图39E)，较少到访(图39F)，并行走较小距离(图39G和39H)。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05；(图39I-39L)在高架十字迷宫试验中，miR-135KD小鼠显示在开放臂中花较少时间(图39I)、较少到访(图39J)并行走显著较小距离(图39K和39L)的倾向。线条表示均值± s.e.m。# P<0.1，*P<0.05；(图39M)在强迫游泳试验中，当在“基础”条件下测试时，miR-135KD小鼠在其不活动时间上与对照小鼠无不同，然而当在给予SSRI后30分钟测试时，miR-135KD小鼠显示不活动时间增加，表明对抗抑郁药的反应减弱。线条表示均值± s.e.m。*p<0.05；***p<0.001；(图39N)在miR-135KD和对照小鼠之间在自主活动能力方面未观察到明显差异，通过在旷场试验中行走的总距离测量。线条表示均值± s.e.m。
[0083] 图40A-O说明5HT神经元中miR-135的过量表达改变脑中的5HT水平，并阻断社交失败诱导的5HT降低。(图40A、40D、40G、40J、40M)在基础条件下或在慢性社交失败后miR-135OE 5HT和对照小鼠脑的显微切割部位的示意图。PrL—缘前皮质(prelimbic cortex)，BLA—基底外侧杏仁核，CA1V—腹侧海马CA1，DRV—中缝背核腹侧部，MnR—中缝正中核。采用自(Paxinos，1997)的断面图；(图40B、40E、40H、40K、40N)在基础应激条件下，通过HPLC测量的不同脑部位的5HT水平显示与对照相比miR-135OE小鼠的5HT水平降低。另外，与基础应激条件相比，在暴露于社交失败的对照小鼠中5HT水平减量调节，在miR-135OE 5HT小鼠中未观察到作用；(图40C、40F、40I、40L、40O)在基础应激条件下，与对照相比，计算为代谢物
5HIAA水平与5HT水平之间的比率的5HT代谢在miR-135OE 5HT小鼠中增量调节。此外，与来自相同基因型的对照小鼠相比，在暴露于慢性社交失败的miR-135OE 5HT中BLA、CA1V、DRV和MnR中的5HT代谢减弱。在PrL、DRV和MnR中，与基础条件相比，在暴露于社交失败的对照小鼠中5HT代谢增量调节。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
[0084] 图41A-E说明人类抑郁患者血液中较低的miR-135水平。(图41A)与健康对照的相比，人类抑郁患者全血中的miR-135a水平稳固下降；(图41B) miR-16血液水平在组间无明显不同。线条表示均值± s.e.m。***P<0.001；(图41C)用认知行为疗法(CBT)治疗3个月的抑郁患者显示全血miR-135a水平显著升高；(图41D) miR-16水平在所有患者组中相似。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05；(图41E)描述在正常条件(上图)、抑郁(中图)和给予抗抑郁药(下图)条件下miR-135参与调节5-羟色胺能突触组分的建议模型的图示。
[0085] 图42A-L说明在“基础”条件下和在慢性应激条件之后miR-135OE小鼠RN结构中的5HT水平。(图42A、42D、42G、42J)在基础条件下或在慢性社交失败后来自miR-135OE 5HT和对照小鼠脑的RN显微切割部位的示意图。DRD—中缝背核背侧部分，DRI—中缝背核束间部分，DRVL—中缝背核腹外侧部分，VLPAG—导水管周围灰质腹外侧；DRC—中缝背核尾侧部分。采用自(Paxinos G.，1997)的断面图；(图42B、42E、42H、42K)在基础应激条件下，与对照相比，miR-135OE-5HT小鼠中除DRVL以外所示全部脑区的5HT水平降低。另外，与基础条件相比，在暴露于社交失败的对照小鼠中5HT水平降低，在miR-135OE 5HT小鼠中作用丧失；(图
42C、42F、42I、42L)在基础应激条件下，与对照相比，miR-135OE 5HT小鼠中计算为代谢物
5HIAA水平与5HT水平间的比率的5HT代谢增强。此外，与在基础条件下测试的来自相同基因型的小鼠相比，在暴露于慢性社交失败的miR-135OE 5HT中所述全部区域的5HT代谢减弱。
线条表示均值± s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
[0086] 图43A-L说明在“基础”条件下和在慢性应激条件之后miR-135OE小鼠脑结构中的5HT水平。(图43A、43D、43G、43J)在基础条件下或在慢性社交失败后，来自miR-135OE 5HT和对照小鼠脑的显微切割部位的示意图。IL—下边缘皮质(infralimbic cortex)，BNST—终纹床核，CeA—中央杏仁核，S—下托。采用自(Paxinos G.，1997)的断面图；(图43B、43E、
43H、43K)在基础应激条件下，与对照相比，miR-135OE-5HT小鼠中所述全部脑区的5HT水平降低。另外，与基础条件相比，在暴露于社交失败的对照小鼠中5HT水平降低，在miR-135OE 
5HT小鼠中作用丧失；(图43C、43F、43I、43L)在基础应激条件下，与对照相比，在miR-135OE 
5HT小鼠中计算为代谢物5HIAA水平与5HT水平间的比率的5HT代谢增强。此外，与在基础条件下测试的来自相同基因型的小鼠相比，在暴露于慢性社交失败的miR-135OE 5HT中所述全部区域的5HT代谢减弱。线条表示均值± s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
[0087] 图44说明miR-135寡核苷酸的修饰。5’Ph说明5’磷酸化，而粗体下划线说明2’ O-甲基化。
[0088] 发明的具体实施方案的描述在其一些实施方案中，本发明涉及微RNA，更具体但并非唯一地讲涉及所述微RNA用于疾病、诊断、监测和治疗的用途。
[0089] 参照附图和附图说明，可更好地理解本发明的原理和操作。
[0090] 在详细说明至少一个本发明的实施方案之前，应该了解本发明在其申请中并不限于以下说明中所描述的细节或者实施例中所例举的细节。本发明能够有其它实施方案，或者能够以各种方式实施或实现。同样，还应了解本文所采用的措辞和术语是为了说明目的，不应视为限制。
[0091] 之前已证实了5-羟色胺能活性失调和精神障碍(例如焦虑症和抑郁症)之间的关系，但尚未完全了解在这些病理基础之上的分子机制。微RNA (miR)是调节转录后基因表达的一类小的RNA分子，并且在脑中极丰富。
[0092] 在将本发明付诸实施时，本发明人发现特定的微RNA (miR)参与5-羟色胺(5HT)神经胶质相关基因的调节，因此参与调节与异常5-羟色胺水平有关的医学病况例如精神障碍。
[0093] 如下文和随附实施例部分所示，本发明人使用miR微阵列，测定了获自5HT报道基因小鼠(ePET-YFP)的中缝核(RN)的5HT神经元中的miR表达模式(参见随附实施例部分中的表2A-B)。对获自阵列的5-羟色胺能神经元独特的miR表达概况进行生物信息学分析以鉴定推定靶向例如以下关键5-羟色胺能相关基因的miR：5-羟色胺转运蛋白(Slc6a4，图1D)、5-羟色胺自身受体(Htr1a，图1E)、色氨酸羟化酶2 (Tph2，图1F)和单胺羟化酶(MaoA，图1G)。体外进一步测试了这些基因的3'UTR的miRNA打靶，说明了特异性靶向并调节5HT神经元基因的特定miR (例如miR-135) (参见图1H-I和图2C-D)。本发明人进一步表明在急性应激后(图3A-D)和在用抗抑郁药治疗后在RN中miR-135表达水平改变(图3E-F)。成年小鼠RN中体内miR-135过量表达减少社交失败后抑郁样行为(图4A-H)。此外，本发明人表明miR-182作为神经元活性(通过Htr1a的直接抑制，图8)和精神病理学行为(图9)的调节剂和miR-15作为应激反应[通过CRH1R (图7A-B)、FK506结合蛋白5 (FKBP5) (图21A-B)和Stx1a、Sgk1和Adrb2 (图22)的直接抑制]的调节剂的活性。本发明人还表明β肾上腺素能受体(Adrb1)和大麻素受体1 (CB1)被miR-19特异性打靶。miR-19过量表达抑制Adrb1 (图6A-C)，而miR-19的敲减提高Adrb1表达(图6D-E)。miR-19过量表达还抑制CB1 (图14)。本发明人发现了miR-
181的靶标。准确地讲，本发明人表明miR-181特异性地调节谷氨酸受体(图24和25)。总之，这些结果证明miRNA或调节所述miRNA的序列(例如miR-135、miR-335、miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-15和miR-19等)作为治疗形式的用途。
[0094] 在本发明人将本发明进一步付诸实施时，本发明人发现miR135可用作强力治疗剂以治疗双相型障碍，其影响差不多4%的人。
[0095] 在本发明人将本发明进一步付诸实施时，本发明人发现miR-135在人类抑郁患者的血液中显著减量调节(与健康对照相比)，并且在患者的精神病学评分改善后增量调节。实际上，发现miR-135是负责在正常条件下维持完整5-羟色胺能健康状态(serotonergic tone)且是脑对抗抑郁药起反应所必需的必需调节成分(参见图41E中的图解模型)。
[0096] 发现miR-135的水平升高抑制Slc6a4和突触前Htr1a水平两者，引起突触间隙中的5HT增加，这与抑郁症状减少有关。本发明人进行的进一步生物信息学分析预测了与神经精神障碍(包括双相情感障碍)或锂作用有关的miR135的新靶标。这些靶标因此可用作靶向神经精神障碍的治疗性干预。
[0097] 本发明的测定法进一步提供用于针对精神病状态筛选患者和监测治疗两者的非侵入试验。总之，这些结果将miR-135归类为用于其中连续监测患者心理平衡是关键的精神病状态(例如心境障碍)的诊断和管理的关键工具。
[0098] 因此，按照本发明的一方面，提供治疗其中5-羟色胺水平的升高在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括将编码至少一种微RNA或其前体的外源多核苷酸给予受试者的细胞或在受试者的细胞中表达编码至少一种微RNA或其前体的外源多核苷酸。
[0099] 按照具体的实施方案，对于治疗其中5-羟色胺水平升高是治疗有益的医学病况，微RNA包含miR-135、miR-335、miR-26和miR-182。
[0100] 按照本发明的一方面，提供治疗有需要的受试者的双相型障碍的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的miR-135、其前体或编码miR-135或其前体的核酸分子，从而治疗双相型障碍。
[0101] 按照本发明的另一方面，提供治疗其中低的肾上腺素或去甲肾上腺素水平在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括将编码微RNA或其前体的外源多核苷酸给予受试者的细胞或在受试者的细胞中表达编码微RNA或其前体的外源多核苷酸。
[0102] 按照具体的实施方案，对于治疗其中低的肾上腺素或去甲肾上腺素水平是治疗有益的医学病况，微RNA包含miR-19。
[0103] 按照本发明的另一方面，提供治疗其中低的促肾上腺皮质素释放激素(CRH)水平在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括将编码微RNA或其前体的外源多核苷酸给予受试者的细胞或在受试者的细胞中表达编码微RNA或其前体的外源多核苷酸。
[0104] 按照具体的实施方案，对于治疗其中低的促肾上腺皮质素释放激素(CRH)水平是治疗有益的医学病况，微RNA包含miR-15。
[0105] 按照本发明的另一方面，提供治疗其中低的谷氨酸受体水平在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括将编码微RNA或其前体的外源多核苷酸给予受试者的细胞或在受试者的细胞中表达编码微RNA或其前体的外源多核苷酸。
[0106] 按照具体的实施方案，对于治疗其中低的谷氨酸受体水平是治疗有益的医学病况，微RNA包含miR-181。
[0107] 术语“治疗”是指抑制或制止疾病、病症或病况的发展和/或引起疾病、病症或病况减轻、缓解或消退或防止在可能有疾病、病症或病况的风险但尚未诊断出患有疾病、病症或病况的受试者发生疾病、病症或医学病况。本领域技术人员应了解，各种方法和测定法可用来评价疾病、病症或病况的发展，同样地，各种方法和测定法可用来评价疾病、病症或病况的减轻、缓解或消退。
[0108] 本文所用术语“受试者”或“有需要的受试者”包括哺乳动物，例如患有病理或有发生病理的风险的任何年龄的人类，男人或女人。
[0109] 本文所述短语“其中5-羟色胺水平升高是治疗有益的医学病况”是指其中5-羟色胺水平的升高可预防疾病或与之有关的医学症状的发生或终止疾病发展或与之有关的医学症状的疾病或病症(如下文进一步的详细描述)。
[0110] 本文所用术语“5-羟色胺”是指单胺神经递质[亦称为5-羟基色胺(5-HT)]。5-羟色胺例如以CAS编号50-67-9给出。
[0111] 按照一个实施方案，提供提高突触间隙中的5-羟色胺水平的方法，所述方法包括将编码至少一种微RNA或其前体的外源多核苷酸给予受试者的神经胶质细胞(例如5-羟色胺能神经元)或在所述细胞中表达。
[0112] 本文所用术语“突触间隙”是指电或化学信号通道从中穿过的2个神经元之间的区域。
[0113] “神经胶质细胞”是指神经元或神经胶质细胞(例如少突胶质细胞或星形细胞)。
[0114] 本文所用术语“5-羟色胺能神经元”是指分泌5-羟色胺或能够5-羟色胺重摄取(即通过在其细胞表面上表达的5-羟色胺转运蛋白)的神经元。
[0115] 其中5-羟色胺水平升高是治疗有益的医学病况可包括例如任何心境障碍，包括抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍、食物相关障碍(例如进食障碍)、生长障碍和生殖障碍。按照具体的实施方案，其中5-羟色胺水平升高是治疗有益的医学病况包含抑郁症。
[0116] 按照具体的实施方案，其中5-羟色胺水平升高是治疗有益的医学病况包含双相型障碍。
[0117] 本文所用术语“双相型障碍”，亦称双相情感障碍、躁狂抑郁性障碍或躁狂抑郁症，是指归类为心境障碍的心理疾病。通常，患有双相型障碍的个人经历异常高状态的一次或多次发作，临床上称为躁狂症。躁狂症可以不同的严重性水平发生。在轻微的躁狂症水平或“轻躁狂”下，个体可出现精力充沛、易激动，并且可为高产的。当躁狂症变得更严重，则个体开始行为怪异和冲动，常常因有关未来不现实的想法所致而作出不佳决定，并且可能很难入睡。在最严重的水平下，个体可能经历精神病。躁狂发作通常与抑郁的发作或症状交替，或表现躁狂症和抑郁两者的特征的混合发作。所述发作通常被正常状态时期分隔。躁狂和抑郁发作可持续几天到几个月，但在一些患者中，抑郁症和躁狂症可快速交替，称为快速循环。
[0118] 按照本发明的一些实施方案，双相型障碍包括双相型障碍的任何类型和双相型障碍的任何形式和从属形式，包括但不限于躁狂症、急性躁狂症、重度躁狂症、轻躁狂、抑郁症、中度抑郁症、精神抑郁症、重度抑郁症、躁狂症和/或抑郁症发作、精神病/精神病症状(例如幻觉、妄想)、混合双相状态、双相I型障碍、双相II型障碍、快速循环双相型障碍、循环性气质和/或未分类双相型障碍(BD-NOS)。
[0119] 按照一个实施方案，治疗双相型障碍可通过给予受试者治疗有效量的miR-135、其前体或编码miR-135或其前体的核酸分子来实现。
[0120] 按照一个实施方案，治疗双相型障碍可通过给予受试者用于治疗双相型障碍的药物来实现。
[0121] 可按照本发明的教导内容使用的用于双相型障碍治疗的示例性药物包括但不限于下文进一步详细描述的锂、抗精神病药物和情绪稳定药物。
[0122] 按照一个实施方案，提供治疗有效量的miR-135、其前体或编码miR-135或其前体的核酸分子用于制备经鉴定用于治疗有需要的受试者的双相型疾病的药物的用途。
[0123] 因此，按照一个实施方案，当医学病况是例如双相型疾病、抑郁症或焦虑症等心境障碍时，微RNA是miR-135。
[0124] 应认识到，例如双相型疾病、抑郁症或焦虑症等心境障碍可能不一定与5-羟色胺有关。
[0125] 按照一个实施方案，提供治疗其中5-羟色胺水平的升高在有需要的受试者中是治疗有益的医学病况的方法，所述方法包括给予受试者能够减量调节选自以下miR-135靶基因的活性或表达的作用剂：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1 (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；
核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶
1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a  (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)。
[0126] 按照具体的实施方案，作用剂不是miR-135。
[0127] 下面详细描述了可按照本发明的教导内容使用的作用剂(例如能够减量调节miR-135靶基因的活性或表达)。
[0128] 本文所述短语“其中低的肾上腺素或去甲肾上腺素水平是治疗有益的医学病况”是指其中降低肾上腺素或去甲肾上腺素的表达或活性可防止疾病或与之有关的医学症状的发生或终止疾病进展或与之有关的医学症状的疾病或病症(如下文进一步的详细描述)。
[0129] 本文所用术语“肾上腺素”是指激素和神经递质(亦称肾上腺素)。肾上腺素以例如CAS编号51-43-4中提供。
[0130] 本文所用术语“去甲肾上腺素”是指起激素和神经递质作用的儿茶酚胺(亦称降甲肾上腺素)。去甲肾上腺素以例如CAS编号(l) 51-41-2 (l)和138-65-8(dl)提供。
[0131] 其中低的肾上腺素或去甲肾上腺素水平是治疗有益的医学病况可包括例如应激相关障碍、焦虑症、记忆受损、心脏病况(例如心悸、心动过速和心律失常)、头痛、震颤、高血压和急性肺水肿。
[0132] 本文所述短语“其中低的促肾上腺皮质素释放激素(CRH)水平是治疗有益的医学病况”是指疾病或病症其中降低CRH的表达或活性可防止疾病或与之有关的医学症状的发生或终止疾病进展或与之有关的医学症状(如下文进一步的详细描述)。
[0133] 本文所用术语“促肾上腺皮质素释放激素(CRH)”是指多肽激素和神经递质(亦称促肾上腺皮质素释放激素(CRF)或促肾上腺皮质激素释放激素)。CRH以例如NP_000747.1中给出。
[0134] 其中低的CRH水平是治疗有益的医学病况可包括例如应激、抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、睡眠障碍、食物相关障碍、生长障碍、生殖障碍和肥胖症。
[0135] 本文所述短语“其中低的谷氨酸受体水平是治疗有益的医学病况”是指其中降低谷氨酸受体的表达或活性可防止疾病或与之有关的医学症状的发生或终止疾病进展或与之有关的医学症状的疾病或病症(如下文进一步的详细描述)。
[0136] 本文所用术语“谷氨酸受体”是指通常位于神经元细胞膜上的突触受体(例如Grm1、Grik3、Grm5、Gria2、Grik2和Grm7)。谷氨酸受体例如以NP_000822.2 [谷氨酸受体离子型红藻氨酸3 (Grik3)]；NP_000817.2、NP_001077088.1、NP_001077089.1 [谷氨酸受体离子型AMPA 2 (Gria2)]；NP_001159719.1、NP_068775.1、NP_786944.1 [谷氨酸受体离子型红藻氨酸2 (Grik2)]；NP_000833.1、NP_001137303.1 [代谢型谷氨酸受体5 (Grm5)]；NP_000835.1、NP_870989.1 [代谢型谷氨酸受体7 (Grm7)]；NP_000829.2，NP_001107801.1 [代谢型谷氨酸受体1 (Grm1)]中给出。
[0137] 其中低的谷氨酸受体水平是治疗有益的医学病况可包括例如癫痫发作(例如癫痫)、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症、脆性X综合征、广泛性焦虑障碍和癌症(例如黑素瘤)。
[0138] 本文所用术语“微RNA或其前体”是指起转录后调节剂作用的微RNA (miRNA)分子。微RNA通常从pre-miR (前微RNA前体)加工。Pre-miR是一类被RNA聚合酶III转录的、例如在转染进入培养细胞时有效加工成为功能性miRNA的前体miRNA分子。Pre-miR可用来在通常不表达这种miRNA的细胞类型中诱导特定miRNA活性，因此在“(miRNA)功能获取(gain of (miRNA) function)”实验中通过减量调节其表达来强调其靶标的功能。存在miRNA登记处所列的所有已知miRNA的Pre-miR设计，并可容易地设计用于任何研究。可将微RNA本身或由连接至核酸构建体的前体分子编码的微RNA给予细胞，如下文进一步的描述。按照一个实施方案，该术语包括微RNA的任何类型，包括5 prime (即miR)或3 prime (即miR*)及其前体。
[0139] 本文所用术语“miR-135或其前体”意指包括miR-135的任何类型，包括miR-135a和miR-135b 5 prime (即miR-135)或3 prime (即miR-135*)及其前体。示例性前体miR-135包括但不限于登录号MI0000452、ENTREZGENE 406925和SEQ ID NO: 58所示miR-135a-1；登录号MI0000453、ENTREZGENE：406926和SEQ ID NO: 59所示miR-135a-2和登录号MI0000810、ENTREZGENE：442891和SEQ ID NO: 60所示miR-135b。示例性成熟miR-135包括但不限于登录号MIMAT0000428 (SEQ ID NO: 61)所示miR-135a和登录号MIMAT0000758 (SEQ ID NO: 62)所示miR-135b。示例性成熟miR-135*包括但不限于登录号MIMAT0004595 (SEQ ID NO: 192)所示miR-135a*和登录号MIMAT0004698 (SEQ ID NO: 193)所示miR-
135b*。
[0140] 应认识到，本发明教导内容的微RNA (例如miR-135)可以结合、连接、调节、加工、干预、增加任何微RNA靶标、使之稳定和/或去稳定。这类靶标可以是任何分子，包括但不限于DNA分子、RNA分子和多肽，例如但不限于5-羟色胺相关基因，例如5-羟色胺转运蛋白(即SERT或Slc6a4)、5-羟色胺抑制性受体1a (Htr1a)、色氨酸羟化酶2 (Tph2)和单胺羟化酶(MaoA)；肾上腺素或去甲肾上腺素受体(肾上腺素能受体，例如Adr1)；腺苷酸环化酶1型(ADCY1)；CRH受体例如Crh1R；或任何其它分子，例如FK506结合蛋白5 (FKBP5)、大麻素受体1 (CB1)、唐氏综合征细胞粘附分子(Dscam)、易位蛋白相关蛋白X (Tsnax)和细胞粘附分子L1 (L1cam)；以及与应激相关神经精神障碍(例如双相型障碍)有关的其它靶标，包括下表1所列靶标。
[0141] 表1：与应激相关神经精神障碍有关的miR-135的推定靶标


续表1。
[0142] 应认识到，本发明的微RNA可通过各种数据库鉴定，包括例如微RNA登记处(wwwdotsangerdotacdotuk/Software/Rfam/mirna/indexdotshtml)。
[0143] 本发明的方法可通过给予受试者微RNA (例如miR-135)或其效应物或在受试者的细胞中表达编码微RNA (例如miR-135)或其前体的外源核酸分子(即多核苷酸)来实现。术语“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的单链或双链寡聚体或多聚体。该术语包括来源于天然存在的核酸分子(例如RNA或DNA)的多核苷酸和/或寡核苷酸；由天然存在的碱基、糖和共价核苷间键(例如骨架)组成的合成多核苷酸和/或寡核苷酸分子；以及具有非天然存在的部分(其类似地起相应的天然存在的部分的作用)的合成多核苷酸和/或寡核苷酸。这类修饰的或取代的寡核苷酸因为所需性质对于天然形式可能是优选的，所需性质例如细胞摄取增加、对核酸靶标的亲和力提高和在核酸酶存在下的稳定性提高。
[0144] 本发明的多核苷酸的长度任选为100个核苷酸或更少、任选90个核苷酸或更少、任选80个核苷酸或更少、任选70个核苷酸或更少、任选60个核苷酸或更少、任选50个核苷酸或更少、任选40个核苷酸或更少、任选30个核苷酸或更少、例如29个核苷酸、28个核苷酸、27个核苷酸、26个核苷酸、25个核苷酸、24个核苷酸、23个核苷酸、22个核苷酸、21个核苷酸、20个核苷酸、19个核苷酸、18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、15个核苷酸、任选介于12和24个核苷酸之间、任选介于5-15之间、任选介于5-25之间、更优选约20-25个核苷酸。
[0145] 按照本发明的教导内容设计的多核苷酸(包括寡核苷酸)可按照本领域已知的任何寡核苷酸合成方法产生，包括酶促合成和固相合成两者。用于执行固相合成的设备和试剂可市购获自例如Applied Biosystems。也可采用用于这类合成的任何任何其它方法；寡核苷酸的实际合成尽在本领域技术人员的能力之内，并且以下详述的已确立的方法实现，例如：Sambrook, J.和Russell, D. W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"；Ausubel, R. M.等编辑(1994, 1989), "Current Protocols in Molecular Biology," 第I-III卷, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland；Perbal, B. (1988), "A Practical Guide to Molecular Cloning," John Wiley & Sons, New York；and Gait, M. J., ed. (1984), "Oligonucleotide Synthesis"；利用固相化学，例如氰基氨基亚磷酸酯接着脱保护，脱盐，并通过例如自动化trityl-on方法或HPLC纯化。
[0146] 应认识到，可使用下文进一步描述的表达载体以生物学方法产生包含RNA分子的多核苷酸。或者，可使用天然存在的核苷酸或下述不同修饰的核苷酸，以化学方法合成包含RNA分子的多核苷酸。按照一个实施方案，本发明的多核苷酸是修饰的多核苷酸。多核苷酸可采用本领域已知的各种方法修饰。
[0147] 因此，可以合成本发明的多核苷酸以包括赋予所需特性的修饰。例如，修饰可提高稳定性、与靶核酸的杂交热力学、特定组织或细胞类型的打靶或例如通过依赖或不依赖胞吞的机制的细胞渗透性。修饰还可提高序列特异性，因此降低脱靶。下面更详细地描述了化学修饰。
[0148] 按照一个实施方案，多核苷酸包含单一修饰。按照另一个实施方案，多核苷酸包含2、3、4、5或更多个修饰。
[0149] 例如，本发明的寡核苷酸或多核苷酸可包含由以3'-至-5'磷酸二酯键键合的嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷。
[0150] 优选所用的寡核苷酸或多核苷酸是在骨架(例如糖-磷酸骨架)、核苷间键或碱基上被修饰的那些，如下文广义描述的一样。
[0151] 按照本发明这个方面使用的优选的寡核苷酸或多核苷酸的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然的核苷间键的寡核苷酸或多核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸或多核苷酸包括如以下所公开的保留骨架中的磷原子的那些：美国专利号4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,
131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,
536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050和8,017,
763以及美国专利申请号20100222413，通过引用结合到本文中。
[0152] 按照一个实施方案，多核苷酸包含在核苷酸序列的5'端或3'端的磷修饰的核苷酸间键合。
[0153] 优选的修饰寡核苷酸或多核苷酸骨架包括例如：硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯；次膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯；硫羰氨基磷酸酯；硫羰烷基膦酸酯；硫羰烷基磷酸三酯；具有正常3'-5'键的硼羰磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物和其中相邻的核苷单元对是3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接的反转极性的那些；以及硼膦酸酯。还可使用上述修饰的各种盐、混合盐和游离酸形式。
[0154] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸间键合上包含硫代磷酸酯。
[0155] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸间键合上包含硼羰磷酸酯。
[0156] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸间键合上包含甲基膦酸酯。
[0157] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸间键合上包含磷酸二酯。
[0158] 按照一个实施方案，多核苷酸包含糖修饰(例如核糖修饰)。
[0159] 按照一个实施方案，多核苷酸包含相当于核糖2位的修饰。
[0160] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸包含至少一个2'-修饰的核苷酸，例如2'-脱氧、2'-氟、2'-脱氧-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)。
[0161] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸包含至少一个2'-O-甲基-修饰的核苷酸，而在一些实施方案中，修饰的多核苷酸的所有核苷酸都包括2'-O-甲基修饰。
[0162] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸包含修饰的核苷酸间键合和糖骨架修饰。
[0163] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸包含磷修饰的核苷酸间键合和糖骨架修饰(例如2'-修饰的核苷酸)。
[0164] 示例性修饰的miR-135多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 194-209。
[0165] 或者，在其中不包括磷原子的修饰寡核苷酸或多核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的骨架和具有公开于以下美国专利号的混合N、O、S和CH2成分的其它骨架：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,
564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,
596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,
070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439。
[0166] 可按照本发明使用的其它寡核苷酸或多核苷酸是在糖和核苷间键两者中修饰的那些，即核苷酸单元的骨架被新的基团取代。碱基单元保持与多核苷酸靶标互补。这类寡核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架被含有酰胺的骨架(具体地讲氨基乙基甘氨酸骨架)置换的寡核苷酸。碱基保留，并与骨架酰胺部分的氮杂-氮原子直接或间接连接。教导PNA化合物制备的美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262；其每一个通过引用结合到本文中。可用于本发明的其它骨架修饰公开于美国专利号6,303,374。
[0167] 按照一个实施方案，本发明的多核苷酸可在与靶核酸无互补性的内部(即非末端)区域的核苷酸具有化学修饰。例如，修饰的核苷酸可掺入形成凸出的miRNA的区域中。修饰可包括例如通过接头与miRNA连接的配基。例如，修饰可生改进多核苷酸的药代动力学或稳定性，或改进多核苷酸与靶核酸杂交性质(例如杂交热力学)。
[0168] 在一些实施方案中，使掺入多核苷酸的凸出区或与之连接的修饰或配基的方向以占据凸出区的空区取向。例如，修饰可包括核酸链上修饰的碱基或糖或起嵌入剂作用的配基。这些优选位于凸出部位。嵌入剂可为芳族的，例如多环芳族或杂环芳族化合物。多环嵌入剂可具有堆码能力，并可包括具有2、3或4个稠环的系统。在一些实施方案中，使掺入多核苷酸的凸出区或与之连接的修饰或配基的方向以占据凸出区的空区取向。这种方向有利于杂交性质或多核苷酸的其它所需特性改进。
[0169] 在一个实施方案中，多核苷酸可包括氨基糖苷配基，这可使多核苷酸具有改进的杂交性质或改进的序列特异性。示例性氨基糖苷包括糖基化聚赖氨酸；半乳糖苷化聚赖氨酸；新霉素B；妥布霉素；卡那霉素A和氨基糖苷的吖啶缀合物，例如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶。吖啶类似物的使用可增加序列特异性。例如，新霉素B对RNA具有比DNA高的亲和力，但具有低的序列特异性。在一些实施方案中，氨基糖苷配基的胍类似物(胍基糖苷)与多核苷酸作用剂(polynucleotide agent)连接。在胍基糖苷中，氨基酸的胺基交换成胍基。胍类似物的连接可提高多核苷酸的细胞渗透性。
[0170] 可以设计并合成多核苷酸以包括非互补性区域(例如长为3、4、5或6个核苷酸的区域)，其两侧是充分互补性区域以与靶RNA形成双链体(例如长为7、8、9、10或11个核苷酸区域)。
[0171] 对于核酸酶抗性和/或对靶标的结合亲和力提高，本发明的多核苷酸可包括2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-氨基丙基、2'-氨基和/或硫代磷酸酯键。加入锁定核酸(LNA)，例如加入其中核糖环被连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥、亚乙基核酸(ENA)例如2'-4'-亚乙基-桥接核酸和某些核碱基修饰例如2-氨基-A、2-巯基(例如2-巯基-U)、G-夹环(G-clamp)修饰“锁定”的核酸类似物，还可增加对靶标的结合亲和力。在寡核苷酸骨架中加入吡喃糖还可降低内核分离。
[0172] 可通过包括3'阳离子基团，或通过使在末端具有3'-3'键的核苷反转，进一步修饰多核苷酸。在另一个备选方法中，3'端可用氨基烷基(例如3' C5-氨基烷基dT)封阻。其它3'缀合物可抑制3'-5'核酸外切。虽然不受理论束缚，但是3'缀合物(例如奈普生或布洛芬)可通过在空间上阻断外切核酸酶与寡核苷酸的3'端结合来抑制核酸外切。甚至小的烷基链，芳基或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)可阻断3'-5'-外切核酸酶。
[0173] 5'端可用氨基烷基(例如5'-O-烷基氨基取代基)封阻。其它5'缀合物可抑制5'-3'核酸外切。虽然不受理论束缚，但是5'缀合物(例如奈普生或布洛芬)可通过在空间上阻断外切核酸酶与寡核苷酸的5'端结合来抑制核酸外切。甚至小的烷基链、芳基或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)可阻断3'-5'-外切核酸酶。
[0174] 在一个实施方案中，多核苷酸包括改进打靶的修饰，例如本文所述打靶修饰。使单链寡核苷酸作用剂靶向特定细胞类型的修饰的实例包括糖类例如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖；维生素例如叶酸；其它配基例如RGD和RGD模拟物；和小分子包括奈普生、布洛芬或其它已知的蛋白质结合分子。
[0175] 可采用本领域已知方法，利用化学合成和/或酶促连接反应构建本发明的多核苷酸。例如，可使用天然存在的核苷酸或经设计以提高分子的生物稳定性或提高在多核苷酸和靶核酸间形成的双链体的物理稳定性的不同修饰的核苷酸，来化学合成多核苷酸，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。
[0176] 本发明的寡核苷酸或多核苷酸还可包括碱基修饰或取代。本文所用的“未修饰的”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。“修饰的”碱基包括但不限于其它合成和天然的碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-巯基尿嘧啶、2-巯基胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-巯基尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-巯基、8-巯基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤；以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其它的修饰碱基包括公开于以下的修饰碱基：美国专利号3,687,808；Kroschwitz, J. I.编辑(1990),"The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering," 第858-859页, John Wiley & Sons；Englisch等(1991), "Angewandte Chemie," 国际版, 30,613；以及Sanghvi, Y. S., "Antisense Research and Applications,"第15章, 第289-302页, S. T. Crooke和B. Lebleu编辑, CRC Press, 1993。这类修饰的碱基可特别用于提高本发明的寡聚体化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6-取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代显示提高核酸双链体稳定性达0.6-1.2℃ (Sanghvi, Y. S.等(1993), "Antisense Research and Applications," 第276-278页, CRC Press, Boca Raton)，并且是目前优选的碱基取代，甚至更特别当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
[0177] 按照一个实施方案，修饰的多核苷酸被进一步修饰，使得与经选择改进作用剂(例如胆固醇)的稳定性、分布或细胞摄取的配基连接。
[0178] 因此，多核苷酸可被修饰以包括非核苷酸部分，例如胆固醇部分。非核苷酸部分(例如胆固醇部分)可与例如多核苷酸的3'端或5'端连接。
[0179] 按照具体的实施方案，本发明的miRNA多核苷酸具有SEQ ID NO: 58-94所示核酸序列(参见表1A)。
[0180] 表1A：miRN多核苷酸序列miRNA 序列
miR-15 SEQ ID NO: 77-80
miR-19 SEQ ID NO: 72-76
miR-26 SEQ ID NO: 65-69
miR-27 SEQ ID NO: 81-84
miR-135 SEQ ID NO: 58-62
miR-181 SEQ ID NO: 85-94
miR-182 SEQ ID NO: 70-71
miR-335 SEQ ID NO: 63-64
如上文所述和随附实施例部分所示，微RNA是来源于特定前体(即pre-miRNA)的加工分子，可使用特定miRNA前体分子，实现特定miRNA功能的增量调节。
[0181] 按照具体的实施方案，miR-135包含miR-135a或miR-135b。
[0182] 按照具体的实施方案，本发明的前体miR-135多核苷酸具有SEQ ID NO: 58-60所示核酸序列。
[0183] 按照具体的实施方案，本发明的成熟miR-135多核苷酸具有SEQ ID NO: 61-62所示核酸序列。
[0184] 按照具体的实施方案，本发明的成熟miR-135*多核苷酸具有SEQ ID NO: 192-193所示核酸序列。
[0185] 还考虑了与miRNA及其前体同源的序列。同源性水平对于成熟miRNA应相对高，但是在前体水平上允许更高的自由度(例如至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或更高)，只要序列变化在发夹序列中，不在对应于成熟miR的核酸区段中。
[0186] 通常将所述前体多核苷酸作用剂作为表达构建体的一部分给予靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)。在这种情况下，多核苷酸作用剂在能够在以组成型或诱导型方式指导微RNA在靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)中表达的顺式作用调节元件(例如启动子)控制下连接在核酸构建体中。
[0187] 本发明的微RNA多核苷酸作用剂的实例包括但不限于miR-15 (例如GenBank登录号NR_029485)、miR-19 (例如GenBank登录号NR_029489.1)、miR-26 (例如GenBank登录号NR_029500和NR_029499)、miR-27 (例如GenBank登录号NR_029501)、miR-135 (例如GenBank登录号NR_029677.1、NR_029678.1，NR_029893.1)、miR-335 (例如GenBank登录号NR_029899.1)、miR-181 (例如GenBank登录号NR_029611.1)和miR-182 (例如GenBank登录号NR_029614)。
[0188] 通常将所述前体多核苷酸作用剂作为表达构建体的一部分给予靶细胞(例如神经胶质细胞、脉络丛(CP)细胞、干细胞或分化的干细胞)。在这种情况下，多核苷酸作用剂连接到在能够以组成型或诱导型方式指导微RNA在靶细胞(例如神经胶质细胞、CP细胞、干细胞或分化的干细胞)中表达的顺式作用调节元件(例如启动子)的控制下的核酸构建体中。
[0189] 神经元细胞特异性启动子的实例包括但不限于神经元特异性烯醇化酶基因启动子、突触蛋白启动子、增强型突触蛋白(enhanced synapsin)启动子、钙调蛋白启动子和Thy1启动子。
[0190] 示例性的神经胶质细胞特异性启动子包括胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子。
[0191] 脉络丛特异性启动子的实例包括但不限于2型促肾上腺皮质激素释放因子受体启动子β剪接变体(CRFR2β)、G蛋白偶联受体125 (GPR125)启动子和运甲状腺素蛋白启动子。
[0192] 按照一个实施方案，启动子序列(例如脉络丛特异性启动子)被置于核酸构建体上的多核苷酸序列(例如miR-135多核苷酸序列)的3'，使得其表达是构成型的，但是组织特异性的。
[0193] 按照另一个实施方案，使脉络丛特异性启动子序列处于与核酸构建体上的多核苷酸序列(例如miR-135多核苷酸序列)相对，使得其表达是组织特异性的，但还可以外源可调节的方式受到控制。
[0194] 为了确保目标多核苷酸即在脉络丛细胞中又以外源可控制的方式特异性地表达，可设计核酸构建体，使得其包含编码在脉络丛特异性启动子控制下的反式激活蛋白的多核苷酸。可将多核苷酸插入所述核酸构建体或其它在诱导型启动子控制下的构建体中。与诱导物组合的反式激活蛋白起调节来自诱导型启动子的表达。
[0195] 适用于本发明的诱导型启动子优选为能够指导多核苷酸序列转录的应答元件。合适的应答元件可为例如四环素应答元件(例如描述于Gossen和Bujard  (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-551, 1992)；ectysone诱导型应答元件(No D等, Proc Natl Acad Sci U S A. 93:3346-3351, 1996)；金属离子应答元件例如描述于Mayo等(Cell. 29:99-108, 19822)；Brinster等(Nature 296:39-42，1982)和Searle等(Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489, 1985)；热激应答元件例如描述于Nouer等(载于：Heat Shock Response, 编辑Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., 第167-220, 19911页)；或激素应答元件例如描述于Lee等(Nature 294:228-232，1981)；Hynes等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042, 19811)；Klock等(Nature 329:734-736，1987)；以及Israel和Kaufman (Nucl. Acids Res. 17:2589-2604, 1989)。优选应答元件为ectysone诱导型应答元件，更优选应答元件为四环素应答元件。
[0196] 心脏细胞特异性启动子的实例包括但不限于心脏NCX1启动子和α-肌球蛋白重链(αMHC)启动子。
[0197] 本发明的表达构建体还可包括使其适于在真核生物中复制和整合的其它序列(例如穿梭载体)。典型的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如多腺苷酸化信号)。本发明的表达构建体可进一步包括可与启动子序列相邻或远离并且可在从其转录中起增量调节作用的增强子。
[0198] 增强子元件可刺激来自所连接的同源或异源启动子高达1,000倍的转录。增强子当置于转录起始位点的下游或上游时是有活性的。来源于病毒的许多增强子元件具有宽泛的宿主范围，并且在多种组织中是有活性的。例如，SV40早期基因增强子适于许多细胞类型。适于本发明的其它增强子/启动子组合包括来源于多瘤病毒或人或鼠巨细胞病毒(CMV)和来自各种反转录病毒(例如鼠白血病病毒、鼠或劳斯肉瘤病毒和HIV)的长串联重复序列(LTR)的那些。参见Gluzman，Y.和Shenk，T.编辑(1983). Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，其通过引用结合到本文中。
[0199] 还可将多腺苷酸化序列加入本发明的表达构建体中以提高可检测部分表达的效率。对于准确和有效的多腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于多腺苷酸化位点下游的富集GU或U的序列和位于该位点11-30个核苷酸上游6个核苷酸的高度保守的序列，即AAUAAA。适于本发明的终止和多腺苷酸化信号包括来源于SV40的那些。
[0200] 除了已描述的实施方案以外，本发明的表达构建体通常可含有欲提高克隆核酸的表达水平或有利于携带重组DNA的细胞的鉴定的其它专门元件。例如，多种动物病毒含有促进病毒基因组在允许细胞类型中的染色体外复制的DNA序列。携带这些病毒复制子的质粒以附加体形式复制，只要质粒所携带的基因或宿主细胞基因组提供合适的因子。
[0201] 本发明的表达构建体可包括或不包括真核复制子。如果真核复制子存在，则载体能够利用合适的选择标记在真核细胞中扩增。如果构建体不包含真核复制子，则附加型扩增是不可能的。相反，重组DNA整合至工程改造细胞的基因组中，在其中启动子指导所需核酸表达。
[0202] 可使用合适的基因递送载体/方法(转染、转导等)和合适的表达系统，将核酸构建体导入本发明的靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)中。
[0203] 哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可获自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41和pNMT81；可获自Promega的pCI；可获自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可获自Clontech的pTRES；及其衍生物。
[0204] 还可使用含有来自真核生物的病毒(例如反转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括例如pSVT7和pMT2。来源于牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，来源于+
Epstein-Barr病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A 、pMTO10/A+、pMAMneo-5和杆状病毒pDSVE。
[0205] 表达构建体也可以是病毒。病毒构建体的实例包括但不限于腺病毒载体、反转录病毒载体、牛痘病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体、棒状病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。
[0206] 反转录病毒载体代表特别适用于本发明的载体类别。缺陷型反转录病毒常规用于将基因转移到哺乳动物细胞中(有关综述参见Miller, A. D. (1990). Blood 76, 271))。可采用众所周知的分子技术，构建包含本发明的多核苷酸的重组反转录病毒。可除去反转录病毒基因组的一部分以赋予反转录病毒复制机器缺陷，然后复制缺陷型反转录病毒可被包装到病毒体中，在采用标准技术的同时，可通过使用辅助病毒，将病毒体用来感染靶细胞。体外或体内用于产生重组反转录病毒和用于用病毒感染细胞的方案可参见例如Ausubel等(1994) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates, Inc. & John Wiley & Sons, Inc.)。反转录病毒已用来将多种基因导入许多不同的细胞类型中，包括神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞和骨髓细胞。
[0207] 按照一个实施方案，按照本发明的教导内容使用慢病毒载体(反转录病毒载体的一种类型)。慢病毒载体由于其整合到非分裂细胞以及分裂细胞基因组中的能力而被广泛用作载体。当病毒进入细胞时，呈RNA形式的病毒基因组被反转录以产生DNA，所述DNA然后被病毒整合酶在随机位置处插入基因组。载体(原病毒)保留在基因组中，当细胞分裂时，传代到细胞子代中。出于安全理由，慢病毒载体从不携带其复制所需的基因。为了产生慢病毒，将若干质粒转染到所谓的包装细胞系中，通常为HEK 293。一种或多种质粒，统称为包装质粒，编码病毒体蛋白，例如衣壳和逆转录酶。另一种质粒含有由载体递送的遗传物质。它被转录以产生单链RNA病毒基因组，并且以ψ (psi)序列的存在为标志。该序列用来把基因组包装到病毒体中。
[0208] 用于在神经胶质细胞或心脏细胞中引入和表达本发明的多核苷酸序列的合适慢病毒载体的具体实例是慢病毒pLKO.1载体。
[0209] 可按照本发明这个方面使用的另一种合适的表达载体是腺病毒载体。腺病毒是广泛研究且常规使用的基因转移载体。腺病毒载体的关键优势包括分裂和静息细胞相对高的转导效率、对各种上皮组织的天然向性和容易产生高滴度(Russel, W. C. (2000) J Gen Virol 81, 57-63)。腺病毒DNA被转运到核中，但不整合在其中。因此使被腺病毒载体诱变的危险被降到最低，同时短期表达特别适于治疗癌细胞。用于实验性癌症治疗的腺病毒载体描述于Seth等(1999). "Adenoviral vectors for cancer gene therapy (用于癌症基因疗法的腺病毒载体)," 第103-120页, P. Seth编辑, Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX)。
[0210] 合适的病毒表达载体还可以是将反转录病毒和腺病毒组分合并的嵌合腺病毒/反转录病毒载体。对于转导肿瘤细胞，所述载体可能比传统表达载体更有效(Pan等(2002). Cancer Letts 184, 179-188))。
[0211] 可采用各种方法将本发明的核酸构建体导入哺乳动物细胞中。所述方法一般描述于Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)；Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)；Chang等, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)；Vega等, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)；Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)和Gilboa等[Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]，包括例如用重组病毒载体稳定转染或瞬时转染、脂转染、电穿孔和感染。另外，有关阳性-阴性选择方法参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
[0212] 当通过病毒感染将本发明的表达构建体导入靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)中时，用于感染的病毒剂量为至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高pfu或病毒颗粒。
[0213] 为了克服血脑屏障，可如本文进一步的描述通过脊髓(例如通过硬膜外导管)或通过在脉络丛中表达，将本发明的构建体直接给予脑(通过脑室)、嗅球(通过鼻内给药)。
[0214] 或者，可使用基于脂质的系统将这些构建体递送至本发明的靶细胞(例如脑细胞，例如神经胶质细胞)中。
[0215] 脂质体包括由脂质双层组成的包封一定体积的任何合成的(即非天然存在的)结构。脂质体包括乳液、泡沫、微团、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片层等。脂质体可通过本领域的任何已知方法制备[Monkkonen, J.等, 1994, J. Drug Target, 2:299-308；Monkkonen, J.等, 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145；Lasic D D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (第3章)；Winterhalter M, Lasic D D, Chem Phys Lipids, 1993年9月;64(1-3):35-43]。脂质体可以是带正电荷的、中性的或带负电荷的。对于单核吞噬细胞系统(MPS)摄取，脂质体可以是疏水的，因为脂质体膜的亲水掩蔽(例如通过使用聚乙二醇连接的脂质和亲水颗粒)可能较不易于MPS摄取。任选脂质体不包含空间上被屏蔽的脂质，例如神经节苷脂-GM1和磷脂酰肌醇，因为这些脂质防止MPS摄取。
[0216] 脂质体可以是单一脂质层或可以是多层。如果治疗剂是亲水的，由于其较大的内体积所致可使用大的单层脂质体进一步改进治疗剂的递送。相反地，如果治疗剂是疏水的，则可使用多层脂质体进一步改进其递送。或者，治疗剂(例如寡核苷酸)不能够渗入脂质双层，因此可保持吸附在脂质体表面。在这种情况下，增加脂质体的表面积可进一步改进治疗剂的递送。本发明的合适的脂质体是无毒脂质体，例如由磷脂酰-胆碱磷酸甘油和胆固醇制备的那些。所使用的脂质体的直径范围可为0.1-1.0微米。然而，还可使用适于被吞噬细胞吞噬的其它大小范围。对于确定脂质体的大小，可利用匀浆化，这取决于使大的脂质体片段化成较小的脂质体的剪切能。可方便地使用的匀浆器包括由Boston，MA的Microfluidics生产的微流化器(microfluidizer)。在典型的匀浆化方法中，使脂质体通过标准乳液匀浆器再循环直到观察到所选择的脂质体。可通过常规激光束粒度识别，监测粒度分布。使脂质体通过小孔聚碳酸酯膜或非对称陶瓷膜压出是用于使脂质体大小减小到相对十分明确的大小分布的有效方法。通常，将混悬液通过膜循环一次或多次直到达到所需脂质体大小分布。可将脂质体从较小的孔膜中成功地压出以达到脂质体大小的逐步减小。
[0217] 可采用本领域已知的任何方法将微RNA多核苷酸作用剂(miR-135或其前体)掺入脂质体中。例如，可将微RNA多核苷酸作用剂(miR-135或其前体)包封在脂质体内。或者，可使其吸附在脂质体的表面。可用于将药剂掺入本发明的脂质体中的其它方法是描述于以下文献的那些：Alfonso等[The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa, 第19版, (1995)]和Kulkarni等[J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46]。
[0218] 用于本发明方法的脂质体可跨越血液屏障。因此，按照一个实施方案，本发明的脂质体在其膜部分中不包含血液屏障打靶多糖(例如甘露糖)。任选本发明的脂质体在其使脂质体靶向血液屏障上的受体的膜部分中不包含肽。所述肽的实例包括但不限于运铁蛋白、胰岛素、IGF-1、IGF-2抗运铁蛋白受体抗体、抗胰岛素受体抗体、抗IGF-1受体抗体和抗IGF-2受体抗体。
[0219] 为了确定特别适宜本发明的脂质体，可进行筛选测定法，例如美国专利申请号20040266734和美国专利申请号20040266734以及Danenberg等，Journal  of 
cardiovascular pharmacology 2003，42:671-9；Circulation 2002，106:599-605；
Circulation 2003，108:2798-804的测定法。
[0220] 可按照本发明这个方面使用的其它非脂质型载体包括但不限于聚赖氨酸、树枝状聚体(dendrimer)和Gagomers。
[0221] 不论所采用的方法或构建体如何，如上文详述，提供包含编码微RNA的核酸构建体的分离细胞。
[0222] 本文所用术语“分离的”是指至少部分从天然环境(例如人体)中分离出来。
[0223] 按照一个实施方案，提供包含表达至少一种微RNA或其前体的核酸构建体的分离细胞，其中微RNA选自在顺式作用调节元件的转录控制下的miR-135、miR-335、miR-15、miR-19、miR-26、miR-27、miR-181和miR-182。
[0224] 按照具体的实施方案，提供包含表达至少一种微RNA或其前体的核酸构建体的分离的神经胶质细胞，其中微RNA选自在顺式作用调节元件的转录控制下的miR-135、miR-335、miR-26和miR-182。
[0225] 按照具体的实施方案，提供包含表达在顺式作用调节元件的转录控制下的miR-19或其前体的核酸构建体的分离细胞。
[0226] 按照具体的实施方案，提供包含表达在顺式作用调节元件的转录控制下的miR-15或其前体的核酸构建体的分离细胞。
[0227] 按照具体的实施方案，细胞是神经胶质细胞或心脏细胞。
[0228] 按照具体的实施方案，神经胶质细胞是神经元例如5-羟色胺能神经元。
[0229] 将体内(即在生物体或受试者内)或离体(例如在组织培养中)向本发明的细胞即靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)提供微RNA或其前体。假如离体处理细胞，则所述方法优选包括将所述细胞给回个体的步骤(离体细胞疗法)。
[0230] 对于离体疗法，细胞(例如神经胶质细胞例如少突胶质细胞、CP细胞、干细胞和/或分化的干细胞)优选用本发明的作用剂(例如微RNA，例如miR-135或其前体或编码微RNA例如miR-135或其前体的多核苷酸)处理，之后将其给予有需要的受试者。
[0231] 本发明的离体处理细胞的给予可采用任何合适的引入途径实现，例如静脉内、腹膜内、肾内、胃肠道内、皮下、经皮、肌内、皮内、鞘内、硬膜外和直肠。根据目前优选的实施方案，可使用静脉内、肾内、胃肠道内和/或腹膜内给药将本发明的离体处理细胞引入个体内。
[0232] 本发明的细胞(例如神经胶质细胞例如少突胶质细胞、CP细胞、干细胞、分化的干细胞和/或心脏细胞)可来源于自体来源或同种异体来源例如人尸体或供体。因为当给予机体时非自体细胞可能引起免疫反应，所以开发了若干方法以降低非自体细胞排斥的可能性。这些包括在移植前抑制受体免疫系统或把非自体细胞包封在免疫隔离的半透膜中。
[0233] 囊化技术一般被归类 为微囊化(包括小的球形载体) 和大 囊化(macroencapsulation)，包括较大的平板和中空纤维膜(Uludag,  H.等(2000). 
Technology of mammalian cell encapsulation (哺乳动物细胞囊化的技术). Adv Drug Deliv Rev 42, 29-64)。
[0234] 制备微胶囊剂的方法是本领域已知的，包括例如公开于以下文献的那些：Lu, M. Z.等(2000). Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine) (用藻酸盐和α-苯氧基亚肉桂基-乙酰化聚(烯丙胺)的细胞囊化). Biotechnol Bioeng 70, 479-483；Chang, T. M.和Prakash, S. (2001) Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms (用于酶、细胞和基因工程的微生物的微囊化方法). Mol Biotechnol 17, 249-260；以及Lu, M. Z.等(2000). A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate) (一种使用光敏的聚(烯丙胺α-氰基亚肉桂基乙酸酯)的新的细胞囊化方法).  J 
Microencapsul 17, 245-521。
[0235] 例如，使用与2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物壳复合的改性胶原，来制备微胶囊，产生厚为2-5 μm的胶囊。所述微胶囊可用另外的2-5μm三元共聚物壳进一步囊化，以赋予带负电荷的平滑表面，并使血浆蛋白质吸收降到最低(Chia, S. M.等(2002). Multi-layered microcapsules for cell encapsulation (用于细胞囊化的多层微胶囊). Biomaterials 23, 849-856。
[0236] 其它微胶囊基于藻酸盐、海产多糖(Sambanis, A. (2003). Encapsulated islets in diabetes treatment (糖尿病治疗中的囊化小岛). Diabetes Thechnol Ther 5, 665-668)或其衍生物。例如，还可通过在氯化钙存在下聚阴离子藻酸钠和纤维素硫酸钠和聚阳离子(亚甲基-胍)盐酸盐共聚物之间的聚电解质络合，制备微胶囊。
[0237] 应认识到，当使用较小的胶囊时，细胞囊化得到改进。因此，当胶囊大小从1 mm减至400μm时，例如囊化细胞的质量控制、机械稳定性、扩散性质和体外活性改进(Canaple, L.等(2002). Improving cell encapsulation through size control (通过大小控制改进细胞囊化). J Biomater Sci Polym Ed 13, 783-96。此外，发现具有小至7 nm受严格控制的孔径、定制表面化学和精细微体系结构的纳米多孔生物胶囊成功地使细胞的微环境免疫隔离(参见：Williams, D. (1999). Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices (小则好：医学装置中的微粒子和纳米粒技术). Med Device Technol 10, 6-9；及Desai, T. A. (2002). Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation (胰腺细胞囊化的微细加工技术). Expert Opin Biol Ther 2, 633-646)。。
[0238] 可与离体治疗联合使用的免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢菌素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英利昔单抗(REMICADE.sup.R)、依那西普、TNF.α.阻滞剂、靶向炎性细胞因子的生物制剂和非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、奈普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。
[0239] 对于体内疗法，将作用剂(例如微RNA，例如miR-135、其前体或编码微RNA或其前体的多核苷酸)本身或作为药物组合物的一部分给予受试者。优选配制所述组合物以允许通过血脑屏障(BBB)。
[0240] 用于药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经外科策略(例如大脑内注射或脑室内输注)；力图开发BBB的内源转运途径之一的作用剂的分子操作(例如包含对内皮细胞表面分子有亲和力的转运肽以及本身不能够跨越BBB的作用剂的嵌合融合蛋白的产生)；被设计成提高作用剂脂溶性的药物策略(例如水溶性作用剂与脂质或胆固醇载体的缀合)；以及通过高渗破坏(产生于甘露糖醇溶液输注至颈动脉或使用生物活性剂例如血管紧张素肽)短暂破坏BBB的完整性。
[0241] 用于药物递送至BBB之后的方法包括大脑内植入(例如用针)和对流强化分布(convection-enhanced distribution)。甘露糖醇可用于绕过BBB。同样地，粘膜(例如鼻)给药可用来绕过BBB。
[0242] 可将其中与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中的本发明的微RNA多核苷酸作用剂给予生物。
[0243] 本文所用“药物组合物”是指本文所述活性成分的一种或多种与其它化学组分例如生理上合适的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是利于将化合物给予生物。
[0244] 本文术语“活性成分”是指可负责生物作用的肽(例如miroRNA，例如miR-135、其前体或编码微RNA或其前体的多核苷酸)。
[0245] 下文中，可互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物产生明显刺激性并且不会削弱所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语内。
[0246] 本文术语“赋形剂”是指加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例包括而不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
[0247] 药物的配制和给药技术可参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版本，该文献通过引用结合到本文中。
[0248] 合适的给药途径可包括例如口服、直肠、经黏膜(尤其是经鼻、经肠)或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
[0249] 或者，可以按局部方式而不是按全身方式给予药物组合物，例如通过将药物组合物直接注射到患者身体的组织区域。
[0250] 本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭(dragee-making)、研碎、乳化、包胶囊、包封或冻干步骤。
[0251] 因此可使用一种或多种生理上可接受的载体，按常规方式配制用于本发明的药物组合物，所述载体包括有助于将活性成分加工成可以药用的制剂的赋形剂和助剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
[0252] 对于注射，可以在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液(例如Hank溶液(Hank's solution)、林格液(Ringer's solution)或生理盐缓冲液)中配制本发明的活性成分。对于经黏膜给药，在剂型中使用适于穿过屏障的渗透剂。这类渗透剂一般为本领域所知。
[0253] 对于口服给药，药物组合物可容易地通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体相混合来制备。这类载体能够使药物组合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，以用于患者口服摄取。可以使用固体赋形剂，任选将所得混合物研磨，并对颗粒混合物进行加工，如有需要在加入合适的助剂之后，得到片剂或锭剂芯，从而制备口服使用的药物制剂。合适的赋形剂特别为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠。
[0254] 锭剂芯与合适的包衣材料一起提供。为此，可以使用浓糖溶液，它可任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇、二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。还可将染料或颜料加到片剂或锭剂包衣材料中以区分或鉴别活性化合物剂量的不同组合。
[0255] 可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的两节式胶囊剂(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊剂。两节式胶囊剂可含有与以下成分相混合的活性成分：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉类；润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁；以及任选稳定剂。在软胶囊剂中，可将活性成分溶于或悬浮于合适液体例如脂肪油、液状石蜡或液态聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型都应为适于所选择的给药途径的剂量。
[0256] 于口腔给药，组合物可以呈按常规方式配制的片剂或糖锭剂形式。
[0257] 对于通过经鼻吸入给药，本发明所用的活性成分适宜以气雾剂喷雾提供的形式由使用合适抛射剂的加压包装或喷雾器递送，合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在压缩气雾剂的情况下，可以通过提供阀门递送计量的用量来确定剂量单位。用于分配器的诸如明胶的胶囊和针筒，可以制成装有化合物和合适粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0258] 可以配制本文所述药物组合物用于胃肠外给药，例如通过推注注射或连续输注。用于注射的剂型可呈单位剂型，例如安瓿或多剂量容器，任选加入防腐剂。组合物可以是油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有调配剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0259] 胃肠外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成合适的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的物质供制备高度浓缩的溶液剂。
[0260] 或者，活性成分可以是粉针剂的形式，用前与合适的溶媒(例如无菌无热原水基溶液)重配。
[0261] 本发明的药物组合物还可以使用例如常用的栓剂基料(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直肠用组合物，例如栓剂或滞留型灌肠剂。
[0262] 适用于本发明这个方面的药物组合物包括这样的组合物，其中所包含的活性成分的有效量可达到预期目的。更准确地讲，治疗有效量意指活性成分(例如微RNA)的量可有效地预防、减轻或改善疾病症状(例如心境障碍例如双相型疾病)或延长待治疗的受治疗者的生存期。
[0263] 按照本发明的一个实施方案，miR-135的过量表达具有抗抑郁作用。
[0264] 治疗有效量的确定尽在本领域技术人员能力之内，尤其是根据本文所提供的详细的公开内容。
[0265] 对于用于本发明方法的任何制剂，剂量或治疗有效量可从体外实验和细胞培养实验中作出初步估计。例如，可以在动物模型中调配剂量以获得所需要的浓度或效价。可以用这类信息更准确地确定在人体中的有益剂量。
[0266] 可通过体外标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中确定本文所述活性成分的毒性和治疗功效。在调配人用剂量范围时，可以利用从这些体外实验和细胞培养实验及动物研究中获得的数据。剂量可根据所使用的剂型和所采用的给药途径而变化。确切的剂型、给药途径和剂量可由各名医师考虑患者状况后做出选择(参见例如Fingl E.等(1975), “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 第1章, 第1页)。
[0267] 可以个别调节用量和给药间隔以提供诱导或抑制生物效应的活性成分的足够血浆水平(即最低有效浓度，MEC)。各种制剂的MEC可以不同，但是可以通过体外数据估计。要达到MEC所需要的剂量将取决于个体特征和给药途径。可采用检测实验来测定血浆浓度。
[0268] 根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次给药或多次给药，其中疗程持续数天至数周，或者直到实现治愈，或者达到减轻疾病。
[0269] 待给予的组合物的量必然将取决于待治疗的受治疗者、疾病的严重程度、给药方式、处方医师的判断等等。给药的剂量和时机应响应各项变化情况的仔细和连续的监测。
[0270] 应认识到，可在人类治疗之前，测试通过本发明的作用剂存活下来的动物模型。例如，可使用例如抑郁症、应激、焦虑症的动物模型，例如习得性无助模型(LH)、慢性轻度应激(CMS)模型、社交失败应激(SDS)模型和母爱剥夺模型和睡眠剥夺模型。例如，双相型疾病动物模型包括例如具有突变体Polg (D181A)神经元特异性表达的转基因小鼠[如Kato等, Neuroscience and Biobehavioral Reviews (2007) 6 (31):832-842的教导，通过引用结合到本文中]，并且可以使用充分确定的苯丙胺诱导的活动过度[例如美国专利号6,555,585的教导]和氯胺酮诱导的活动过度[例如Ghedim等, Journal of Psychiatric 
Research (2012) 46: 1569-1575中的教导] (通过引用予以结合)的躁狂症大鼠模型。
[0271] 如有需要，本发明的组合物可以用包装或分配装置提供，例如经FDA核准的药盒，药盒可装有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可包括金属箔或塑料薄片(plastic foil)，例如泡罩包装。包装或分配装置可随附用药说明书。包装或分配装置还可随附由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定格式的批文，该批文反映出组合物的形式已获政府机构批准用于人用或兽用给药。例如，这类批文可以包括经美国食品与药物管理局(U.S. Food and Drug Administration)批准的处方药物的标识或核准药品插页的标识。还可制备包含在相容的药用载体中配制的本发明制剂的组合物，将其装入合适容器中，贴上治疗指定病况的标签，有关更多详情见上文。
[0272] 应认识到，除微RNA(例如miR-135或编码miR-135的多核苷酸)以外，本发明的治疗组合物还可包含用于抑郁症、应激、焦虑症、睡眠剥夺等治疗的其它已知药物，例如但不限于选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素能与特异性5-羟色胺能抗抑郁药(NaSSA)、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)重摄取抑制剂(NRI)、去甲肾上腺素-多巴胺重摄取抑制剂、选择性5-羟色胺重摄取增强剂、去甲肾上腺素-多巴胺去抑制剂、三环类抗抑郁药(例如丙米嗪)、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。这些药物可以单个包装或以单独包装包括在制造品中。
[0273] 按照一个实施方案，除微RNA(例如miR-135或编码miR-135的多核苷酸)以外，本发明的治疗组合物还包含用于双相型障碍治疗的药物。可按照本发明的教导内容使用用于双相型障碍治疗的任何药物或任何药物组合，包括但不限于锂(例如碳酸锂、柠檬酸锂、硫酸锂)、抗精神病药物(例如如下所述的典型抗精神病药和非典型抗精神病药)、情绪稳定药物(例如丙戊酸(VPA、丙戊酸盐)、矿物质、抗惊厥药、抗精神病药)和抗抑郁药。
[0274] 可按照本发明的教导内容使用的示例性典型抗精神病药物包括但不限于低效价药物：氯丙嗪(Largactil、Thorazine)、氯普噻吨(Truxal)、硫利达嗪(Mellaril)、美索达嗪和左美丙嗪；中效价药物：洛沙平(Loxapac、Loxitane)、吗茚酮(Moban)、奋乃静(Trilafon)和替沃噻吨(Navane)；高效价药物：氟哌啶醇(Haldol、Serenace)、氟奋乃静(Prolixin)、氟哌利多、珠氯噻醇(Clopixol)、氟哌噻吨(Depixol)、丙氯拉嗪和三氟拉嗪(Stelazine)。另外，可以使用丙氯拉嗪(Compazine、Buccastem、Stemetil)和匹莫齐特(Orap)。
[0275] 可按照本发明的教导内容使用的示例性非典型抗精神病药物(亦称为第二代抗精神病药)包括但不限于氨磺必利(Solian)、阿立哌唑(Abilify)、阿塞那平(Saphris)、布南色林(Lonasen)、Bitopertin  (RG1678)、Brexpiprazole (OPC-34712)、卡匹帕明(Prazinil)、氯卡帕明(Clofekton)、氯氮平(Clozaril)、Cariprazine (RGH-188)、伊潘立酮(Fanapt)、鲁拉西酮(Latuda)、LY2140023、美哌隆(Buronil)、莫沙帕明(Cremin)、奥氮平(Zyprexa)、帕潘立酮(Invega)、哌罗匹隆(Lullan)、Pimavanserin (ACP-103)、喹硫平(Seroquel)、瑞莫必利(Roxiam)、利培酮(Risperdal)、舍吲哚(Serdolect)、舒必利(Sulpirid)、Vabicaserin (SCA-136)、齐拉西酮(Geodon)、佐替平(Nipolept)和Zicronapine (Lu 31-130)。
[0276] 可按照本发明的教导内容使用的示例性心境稳定剂(mood stabilizer)包括但不限于矿物质(例如锂)；抗惊厥心境稳定剂包括丙戊酸(Depakine)、双丙戊酸钠(Depakote)和丙戊酸钠(Depacon、Epilim)、拉莫三嗪(Lamictal)、卡马西平(Tegretol)、奥卡西平(Trileptal)、托吡酯(Topamax)、利鲁唑(Rilutek)和加巴喷丁(Neurontin)；抗精神病药(如上所述)；和食物补充剂(例如ω-3脂肪酸)。
[0277] 可按照本发明的教导内容使用的示例性抗抑郁药包括但不限于选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI，例如西酞普兰、依他普仑、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀和舍曲林)；5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(SNRI，例如地文拉法辛、度洛西汀、米那普仑和文拉法辛)；去甲肾上腺素能与特异性5-羟色胺能抗抑郁药(例如米安色林和米氮平)；降肾上腺素(去甲肾上腺素)重摄取抑制剂(NRI，例如托莫西汀、马吲哚、瑞波西汀和维洛沙秦)；去甲肾上腺素-多巴胺重摄取抑制剂(例如安非他酮)；选择性5-羟色胺重摄取增强剂(例如噻奈普汀)；去甲肾上腺素-多巴胺去抑制剂(NDDI例如gomelatine)；三环类抗抑郁药(包括叔胺三环类抗抑郁药和仲胺三环类抗抑郁药)；及单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。
[0278] 按照一个实施方案，抗抑郁药物包含选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)。
[0279] 按照具体的实施方案，抗抑郁药物包含选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)。
[0280] 应认识到，可与本发明的教导内容联用的其它非药物治疗策略包括但不限于临床心理学、电惊厥疗法、非自愿院禁、光疗法、精神疗法、经颅磁刺激和认知行为疗法。
[0281] 本发明人表明，miR-27的过量表达导致MaoA的抑制(参见下文实施例1)；miR-135的过量表达导致Slc6a4的抑制(参见下文实施例1)；miR-135、miR-335、miR-26、miR-181或miR-182的过量表达导致Htr1a的抑制(参见下文实施例1)；miR-19的过量表达导致Adr1的抑制(参见参见下文实施例2)和CB1的抑制(参见参见下文实施例3B)；miR-15的过量表达导致Crh1R的抑制(参见参见下文实施例4)和FKBP5的抑制(参见参见下文实施例4B)。
[0282] 因此，按照本发明的一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的5-羟色胺转运蛋白(Slc6a4)基因的表达的方法，所述方法包括调节微RNA或其前体的活性或表达，其中微RNA选自miR-135和miR-335。
[0283] 本文所用术语“5-羟色胺转运蛋白(Slc6a4)”是指涉及从突触间隙中重摄取5-羟色胺的单胺转运蛋白蛋白质(亦称SERT)。NP_001036.1给出示例性的Slc6a4。
[0284] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的5-羟色胺抑制性受体1a (Htr1a)基因的表达的方法，所述方法包括调节神经胶质细胞中的微RNA或其前体的活性或表达，其中微RNA选自miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和miR-26。
[0285] 本文所用术语“5-羟色胺抑制性受体1a (Htr1a)”是指在突触前神经元中起自身受体和5-羟色胺释放介导性抑制的作用的G蛋白偶联受体。NP_000515.2给出示例性的Htr1a。
[0286] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的单胺羟化酶(MaoA)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-27或其前体的活性或表达。
[0287] 本文所用术语“单胺羟化酶(MaoA)”是指降解例如多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺等胺神经递质的酶。NP_000231.1给出示例性的MaoA。
[0288] 按照本发明的一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的色氨酸羟化酶2 (Tph2)基因的表达的方法，所述方法包括调节神经胶质细胞中的微RNA或其前体的活性或表达，其中微RNA选自miR-181和miR27。
[0289] 本文所用术语“色氨酸羟化酶2 (Tph2)”是指5-羟色胺的生物合成中催化第一和限速步骤的酶。NP_NP_775489.2给出示例性的Tph2。
[0290] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞或心脏细胞中的β肾上腺素能受体1 (Adrb1)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-19或其前体的活性或表达。
[0291] 本文所用术语“β肾上腺素能受体1 (Adrb1)”是指介导肾上腺素和去甲肾上腺素的生理作用的受体。NP_000675.1给出示例性的Adrb1。
[0292] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的β2肾上腺素能受体(Adrb2)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-15或其前体的活性或表达。
[0293] 本文所用术语“β2肾上腺素能受体(Adrb2)”是指与C类L型钙通道Ca(V)1.2直接缔合的受体。例如NP_000015.1中给出Adrb2。
[0294] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的CRH 1型受体基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-15或其前体的活性或表达。
[0295] 本文所用术语“CRH 1型”是指结合促肾上腺皮质素释放激素(CRH)的受体。例如NP_001138618.1、NP_001138619.1、NP_001138620.1和NP_004373.2中给出CRH 1型。
[0296] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的谷氨酸受体基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-181或其前体的活性或表达。
[0297] 按照另一个实施方案，谷氨酸受体基因包含上文更详细描述的代谢型谷氨酸受体1 (Grm1)、谷氨酸受体离子型红藻氨酸3 (Grik3)、代谢型谷氨酸受体5 (Grm5)、谷氨酸受体离子型红藻氨酸2 (Grik2)和代谢型谷氨酸受体7 (Grm7)。
[0298] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的唐氏综合征细胞粘附分子(Dscam)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-182或其前体的活性或表达。
[0299] 本文所用术语“唐氏综合征细胞粘附分子(Dscam)”是指在神经元自回避中起作用的细胞粘附分子。例如在NP_001380.2中给出Dscam。
[0300] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的细胞粘附分子L1 (L1cam)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-182或其前体的活性或表达。
[0301] 本文所用术语“细胞粘附分子L1 (L1cam)”是指神经元细胞粘附分子。例如在NP_000416.1、NP_001137435.1、NP_076493.1中给出L1cam。
[0302] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的易位蛋白相关蛋白X (Tsnax)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-182或其前体的活性或表达。
[0303] 本文所用术语“易位蛋白相关蛋白X (Tsnax)”是指与易位蛋白特异性相互作用的蛋白质。例如在NP_005990.1中给出Tsnax。
[0304] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的大麻素受体1 (CB1)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-19或其前体的活性或表达。
[0305] 本文所用术语“大麻素受体1 (CB1)”是指细胞膜受体(亦称CNR1)。例如在NP_001153698.1、NP_001153730.1、NP_001153731.1、NP_057167.2、NP_149421.2中给出CB1。
[0306] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的FK506结合蛋白5 (FKBP5)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-15或其前体的活性或表达。
[0307] 本文所用术语“FK506结合蛋白5 (FKBP5)”是指与免疫抑制剂FK506和雷帕霉素特异性结合的蛋白质。例如在NP_001139247.1、NP_001139248.1、NP_001139249.1、NP_004108.1中给出FKBP5。
[0308] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的突触融合蛋白1a (Stx1a)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-15或其前体的活性或表达。
[0309] 本文所用术语“突触融合蛋白1a (Stx1a)”是指神经系统特异性蛋白质。例如在NP_001159375.1、NP_004594.1中给出Stx1a。
[0310] 按照另一个实施方案，提供调节神经胶质细胞中的血清/糖皮质激素调节激酶(Sgk1)基因的表达的方法，所述方法包括调节miR-15或其前体的活性或表达。
[0311] 本文所用术语“血清/糖皮质激素调节激酶(Sgk1)”是指丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。例如在NP_001137148.1、NP_001137149.1、NP_001137150.1、NP_005618.2中给出Sgk1。
[0312] 本发明的教导内容考虑增量调节(即增加)或减量调节(即降低)前述基因的表达水平。
[0313] 本发明的教导内容的基因表达的减量调节通常通过给予靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)微RNA多核苷酸(如上文更详细的描述)或在靶细胞中表达微RNA多核苷酸来进行。
[0314] 按照具体的实施方案，当调节(regulating)包括减量调节Slc6a4基因的表达时，则调整(modulating)包括增量调节miR-135和/或miR-335。
[0315] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节Htr1a基因的表达时，则调整包括增量调节miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和/或miR-26。
[0316] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节MaoA基因的表达时，则调整包括增量调节the miR-27。
[0317] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节Adrb1基因的表达时，则调整包括增量调节miR-19。
[0318] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节CRH 1型受体基因的表达时，则调整包括增量调节miR-15。
[0319] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节CB1基因的表达时，则调整包括增量调节miR-19。
[0320] 按照具体的实施方案，当调节包括减量调节FKBP5基因的表达时，则调整包括增量调节miR-15。
[0321] 按照一个实施方案，提供减量调节神经胶质细胞中选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1  (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 
(Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6  (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1  (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；
核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；
核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含BED结构域的锌指4 (Zbed4)，所述方法包括：(a)增量调节神经胶质细胞中的miR-135或其前体的活性或表达；和(b)测量神经胶质细胞中基因的表达，从而减量调节基因的表达。
[0322] 按照具体的实施方案，减量调节基因的表达通过增量调节不是miR-135的微RNA或其前体的活性或表达来实现。
[0323] 按照具体的实施方案，减量调节miR-135靶基因的表达通过给予受试者能够减量调节miR-135靶基因的活性或表达的作用剂来实现。
[0324] 可使用干预转录和/或翻译的各种分子[例如RNA沉默剂(RNA silencing agent) (例如反义物、siRNA、shRNA、微RNA)、核酶、DNA核酶和CRISPR系统(例如CRISPR/Cas)]在基因组和/或转录物水平上，或使用例如拮抗剂、切割多肽的酶等在蛋白质水平上，实现基因(例如miR-135靶基因)或基因产物的减量调节。
[0325] 下面是能够减量调节本发明的一些实施方案的基因或基因产物的表达水平和/或活性的一系列作用剂。
[0326] 能够减量调节多肽基因产物的活性的作用剂的一个实例是能够特异性结合基因产物(即蛋白质)的抗体或抗体片段。所述抑制特别对于胞外、细胞表面或分泌的多肽是有价值的。本文所用术语“表位”是指抗体的抗原互补位与之结合的抗原上的任何抗原决定簇。
[0327] 表位决定簇通常由分子的化学活性表面群聚(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0328] 本文所用术语“抗体”是指完整的抗体分子，术语“抗体片段”是指其功能性片段，例如能够结合巨噬细胞的Fab、F(ab')2和Fv。这些功能性抗体片段如下定义：(1) Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗体产生，得到完整的轻链和一条重链的一部分；(2) Fab'，可通过用胃蛋白酶处理完整抗体后还原来获得抗体分子的这个片段，得到完整轻链和重链的一部分；每个抗体分子得到2个Fab'片段；(3) (Fab')2，可以用酶即胃蛋白酶处理完整抗体但无需随后的还原获得该抗体片段；F(ab')2是2个Fab'片段由2个二硫键连接在一起的二聚体；(4) Fv，定义为含有表达成2条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(5)单链抗体(“SCA”)，是一种基因工程分子，含有由合适的多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区作为遗传融合的单链分子。
[0329] 产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如，Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988，通过引用结合到本文中)。
[0330] 基因(例如miR-135靶基因)的减量调节也可通过RNA沉默实现。本文所用短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一类调节机制[例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压抑、共抑制和翻译抑制]，这导致相应的蛋白质编码基因的表达受抑制或“沉默”。在许多生物类型(包括植物、动物和真菌)中观察到RNA沉默。
[0331] 本文所用术语“RNA沉默剂”是指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某种实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完整加工(例如整个翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含配对链的RNA双链体，以及可从中产生这类小的非编码RNA的前体RNA。示例性RNA沉默剂包括dsRNA例如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译抑制。
[0332] 按照本发明的一个实施方案，RNA沉默剂对靶RNA (例如靶基因)有特异性，不交叉抑制或沉默与靶基因显示99%或更小整体同源性、例如与靶基因小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%整体同源性的基因或剪接变体。
[0333] RNA干扰是指由短干扰RNA (siRNA)介导的动物中的序列特异性转录后基因沉默的方法。植物中的相应方法通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中亦称为压抑。转录后基因沉默的方法被认为是用于防止外源基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且被不同的植物区系和种系(phyla)共有。在响应双链RNA (dsRNA)产生时，可产生对外源基因表达的这种防止，所述双链RNA来源于病毒感染或来源于通过特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应转座子元件随机整合到宿主基因组。
[0334] 细胞中长的dsRNA的存在刺激称为切酶的核糖核酸酶III的活性。切酶参与将dsRNA加工成短dsRNA段(称为短干扰RNA (siRNA))的过程。来源于切酶活性的短干扰RNA通常长约21-约23个核苷酸，并包含约19个碱基对双链体。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，这介导单链RNA的切割，该单链RNA具有与siRNA双链体的反义链互补的序列。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。
[0335] 因此，本发明的一些实施方案考虑使用dsRNA以减量调节来自mRNA的蛋白质表达。
[0336] 按照一个实施方案，dsRNA大于30 bp。由于认为双链RNA的这些较长区域将导致诱导干扰素和PKR反应，因此长dsRNA (即大于30 bp的dsRNA)的应用是非常有限的。然而，长dsRNA的使用可提供多个优势，因为细胞可选择最适沉默序列，这减少了对测试多种siRNA的需要；长dsRNA可允许沉默文库具有较少的复杂性，这对于siRNA将是必需的；或许最重要的是，长dsRNA当用作疗法时，可防止病毒逃逸突变。
[0337] 不同的研究表明，长dsRNA可用于使基因表达沉默而不诱导应激反应或引起显著的脱靶作用(off-target effect)—参见例如[Strat等, Nucleic Acids Research, 2006, 第34卷, 第13期3803-3810；Bhargava A等, Brain Res. Protoc. 2004;13:115-
125；Diallo M.等, Oligonucleotides. 2003;13:381-392；Paddison P.J.等, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448；Tran N.等, FEBS Lett. 2004;573:127-
134]。
[0338] 按照一些实施方案，本发明的还考虑了经特别设计不诱导用于减量调节基因表达的干扰素和PKR途径的长dsRNA的引入。例如，Shinagwa和Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345, 2003]开发了名为pDECAP的载体以由RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长双链RNA。因为pDECAP的转录物没有促进ds-RNA输出到胞质的5'-帽结构和3'-聚(A)尾两者，所以pDECAP的长ds-RNA不诱导干扰素反应。
[0339] 在哺乳动物系统中避开干扰素和PKR途径的另一种方法是通过转染或内源表达的小抑制RNA (siRNA)的引入。
[0340] 术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制RNA双链体(一般介于18-30个碱基对)。通常，siRNA作为21聚体经化学合成，具有中央19 bp双链体区和末端的不对称2-碱基3'-突出端，然而最近披露，长25-30个碱基的化学合成的RNA双链体可具有较之于相同位置的21聚体的效能的差不多100倍。据推理，观察到的在靶向RNAi时使用较长RNA获得的效能提高产生于为底物(27聚体)而非产生(21聚体)提供切酶，并且这改进siRNA双链体进入RISC的速率或效率。
[0341] 已发现3'-突出端的位置影响siRNA的效能，并且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体一般比有义链上具有3'-突出端的双链体更有效(Rose等，2005)。这可归因于加载到RISC中的不对称链，因为当靶向反义转录物时，观察到相反的功效模式。
[0342] 双链干扰RNA (例如siRNA)的链可连接形成发夹或茎环结构(例如shRNA)。因此，如所述，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂也可以是短发夹RNA (shRNA)。
[0343] 本文所用术语“shRNA”是指是这样的RNA分子：具有茎环结构，包含互补序列的第一区和第二区，互补程度和区域方向足够使得碱基配对发生在区域之间，第一区和第二区通过环区连接，环产生于环区内核苷酸(或核苷酸类似物)间缺乏碱基配对。环中核苷酸的数目是且包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11之间的数目。环的一些核苷酸可参与与环中其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T. R.等(2002) Science 296: 550)和5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D.等(2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员应认识到，所得单链寡核苷酸形成包含能够与RNAi机器相互作用的双链区的茎环或发夹结构。
[0344] 适用于本发明的一些实施方案的RNA沉默剂的合成可如下实现。首先，在AA二核苷酸序列的AUG起始密码子下游扫描靶基因mRNA序列。记录各AA和3’邻接19个核苷酸的出现为潜在的siRNA靶位点。优选从可读框选择siRNA靶位点，因为非翻译区(UTR)在调节蛋白质结合位点中更丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干预siRNA内切核酸酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。然而应认识到，指向非翻译区的siRNA也可有是有效的，如GAPDH所显示的，其中指向5’ UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA的约90%降低，并且完全消除蛋白质水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。
[0345] 其次，应用任何序列比对软件，例如可获自NCBI服务器的BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)进行比较。过滤出显示与其它编码序列有显著同源性的推定靶位点。
[0346] 选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列包括低G/C含量的序列，因为这些已被证实与G/C含量高于55%的序列相比，在介导基因沉默中更有效。优选沿靶基因的长度选出若干靶位点用于评价。为了更好地评价选出的siRNA，优选联合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选包括与siRNA相同的核苷酸组成，但与基因组没有明显的同源性。因此，优选使用siRNA的混杂核苷酸序列，条件是不显示与任何其它基因有任何显著同源性。
[0347] 应认识到，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于只含有RNA的分子，而且另包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
[0348] 在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可与细胞穿透肽功能性缔合。本文所用的“细胞穿透肽”是包含短的(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序、赋予与跨越细胞的质膜和/或核膜的透膜复合物转运有关的不依赖于能量的(即非胞吞)易位性质的肽。用于本发明的一些实施方案的透膜复合物的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能半胱氨酸残基，其是游离的或被衍化形成与为此键被修饰的双链核糖核酸形成二硫键。赋予所述性质的代表性氨基酸基序列于美国专利号6,348,185，其内容通过引用明确结合到本文中。本发明的一些实施方案的细胞穿透肽优选包括但不限于penetratin、transportan、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。
[0349] 待使用RNA沉默剂靶定的mRNA包括但不限于其表达与不需要的表型性状有关的mRNA。可靶定的示例性mRNA是编码截短蛋白即包含缺失的mRNA。因此可使本发明的一些实施方案的RNA沉默剂靶向缺失任一侧的桥接区。将这类RNA沉默剂导入细胞可引起突变蛋白质的减量调节，同时留下非突变蛋白质不受影响。
[0350] 能够减量调节基因(例如miR-135靶基因)的另一种作用剂是能够特异性切割mRNA转录物或靶基因的DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是能够切割单链和双链靶序列两者的单链多核苷酸(Breaker, R.R.和Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655；Santoro, S.W.和Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262)。提出了DNA核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23” DNA核酶15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其两侧是各为7-9个脱氧核糖核苷酸的2个底物识别结构域。这种DNA核酶类型可在嘌呤:嘧啶连接处有效切割其底物RNA (Snatoro, S.W.和Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；有关DNA核酶的综述参见Khachigian，LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。
[0351] 识别单链和双链靶切割位点的合成的工程改造的DNA核酶的构建和扩增的实例公开于Joyce等人的美国专利号6,326,174。最近观察到针对人尿激酶受体的类似设计的DNA核酶抑制尿激酶受体表达，并在体内成功地抑制结肠癌细胞转移(Itoh等, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org)。在另一个应用中，与bcr-ab1癌基因互补的DNA核酶在白血病细胞中抑制癌基因表达，并在CML和ALL的情况下在自体骨髓移植时降低复发率。
[0352] 通过使用能够与编码基因的mRNA转录物特异性杂交的反义多核苷酸，也可实现基因(例如miR-135靶基因)的减量调节。
[0353] 必须实施可用来有效减量调节基因的反义分子的设计，同时考虑对反义方法是重要的两个方面。第一方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的胞质中，而第二方面是以抑制其翻译的方式、在细胞内与指定mRNA特异性结合的寡核苷酸的设计。
[0354] 能够减量调节基因(例如miR-135靶基因)的另一种作用剂是能够特异性切割编码基因的mRNA转录物的核酶分子。核酶通过切割编码目标蛋白质的mRNA，被越来越多地用于基因表达的序列特异性抑制[Welch等, Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。设计核酶切割任何特定靶RNA的可能性使其在基础研究和治疗应用中成为有价值的工具。在治疗领域，已利用核酶以在感染性疾病、癌症中的显性癌基因和遗传紊乱中的特异性体细胞突变中靶向病毒RNA [Welch等, Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]。更值注意的是，用于HIV患者的若干核酶基因疗法方案已处于1期试验。最近，核酶已用于转基因动物研究、基因打靶验证和途径阐释。若干核酶处于临床试验的不同阶段。ANGIOZYME是在人临床试验中研究的第1个化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性地抑制VEGF-r (血管内皮生长因子受体) (血管生成途径中的一个关键组分)的形成。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.以及其它公司表明抗血管生成疗法在动物模型中的重要性。发现HEPTAZYME (一种被设计成选择性破坏丙型肝炎病毒(HCV) RNA的核酶)，在细胞培养测定法中在降低丙型肝炎病毒RNA中是有效的(Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated—WEB主页)。
[0355] 能够减量调节基因(例如miR-135靶基因)的另一种作用剂是RNA引导内切核酸酶技术例如CRISPR系统。
[0356] 本文所用术语“CRISPR系统”，亦称成簇有规间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)总的来说是指参与CRISPR相关基因的表达或指导CRISPR相关基因的活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因(例如CRISPR相关内切核酸酶9)的序列、tracr (反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或有活性的部分tracrRNA)、tracr-mate序列(包括“同向重复序列”和tracrRNA加工的部分同向重复序列)或指导序列(亦称为“间隔区”)，包括但不限于crRNA序列或sgRNA序列(即单指导RNA)。
[0357] 在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件(例如Cas)来源于包含内源CRISPR系统的特定生物，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。
[0358] 一般来说，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列(在内源CRISPR系统的情况下亦称为前间区)的位点形成CRISPR复合物的元件。
[0359] 在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”是指被设计成与之具有互补性的指导序列(即指导RNA)的序列，其中靶序列和指导序列间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不必需要完全互补性，条件是有充分的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。因此，按照一些实施方案，与靶序列的全局同源性可有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RN多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的核或胞质中。
[0360] 因此，CRISPR系统包含2种不同的组分，与靶序列杂交的指导RNA (gRNA)和核酸酶(例如II型Cas9蛋白)，其中gRNA靶向靶序列，核酸酶(例如Cas9蛋白)切割靶序列或使靶基因沉默。指导RNA可包含内源细菌crRNA和tracrRNA的组合，即gRNA使crRNA的打靶特异性与tracrRNA的支架性质(Cas9结合所需要的)结合。或者，指导RNA可包含能够直接结合Cas的单指导RNA (sgRNA)。
[0361] 通常，在内源CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并且与一个或多个Cas蛋白形成复合物的指导序列)的形成导致在靶序列中或附近(例如距之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的1条或2条链被切割。这例如通过插入或缺失，导致目标基因(即靶序列)被破坏。
[0362] 按照一个实施方案，Cas蛋白(例如Cas9)没有核酸酶活性(即无催化活性)，被称为“死” (dCas9)。无催化活性的Cas9蛋白可按照本发明的教导内容使用以与DNA结合(根据指导RNA特异性)，这通常导致RNA聚合酶结合或延伸被阻断，引起转录抑制。因此，dCas9可用于转录抑制。
[0363] 如所述，可包含野生型tracr序列(例如差不多或超过野生型tracr序列约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)的全部或部分或由其组成的tracrRNA序列，例如还可通过沿tracrRNA序列的至少一部分与同指导序列(例如crRNA)有效连接的tracr配偶序列(mate sequence)的全部或部分杂交，形成CRISPR复合物的一部分。
[0364] 在一些实施方案中，tracr序列与tracr配偶序列具有充分的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成。如同靶序列一样，不需要完全互补性，只要是足够功能性的。在一些实施方案中，当最适比对时，tracr序列沿tracr配偶序列的长度有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%序列互补性。
[0365] 可如下实现将CRISPR/Cas导入细胞：使用驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体，使得CRISPR系统元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶(一种与tracr-配偶序列连接的指导序列)和tracrRNA序列可各自与各个载体上各个调节元件有效连接。或者，从相同或不同调节元件中表达的元件的两个或更多个可在单个载体中与提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分的一个或多个其它载体组合。在单个载体中组合的CRISPR系统元件可以任何合适的方向排列，例如一个元件位于相对于第二个元件的5' (“上游”)或3' (“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二个元件的编码序列的相同或相对链，以与相同或相对方向取向。单一启动子可驱动编码CRISPR酶的转录物和指导序列的一个或多个、tracr配偶序列(任选任选与指导序列连接)和嵌在一个或多个内含子序列中的tracrRNA序列(例如各自在不同的内含子中、两个或更多个在至少一个内含子中或全部在单个内含子中)表达。
[0366] 或者，按照本发明的另一个实施方案，通过给予靶细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)能够减量调节微RNA的表达的作用剂或在靶细胞中表达能够减量调节微RNA的表达的作用剂，来实现增量调节基因表达。
[0367] 可使用上述干扰转录和/或翻译的各种分子(例如RNA沉默剂、核酶、DNA核酶和反义)，在基因组和/或转录物水平上实现微RNA的减量调节。
[0368] 减量调节微RNA表达的方法是本领域已知的。
[0369] 减量调节miR活性的核酸作用剂包括但不限于靶模拟物(target mimic)、微RNA抗性基因和miRNA抑制剂。
[0370] 假如允许一个或多个下列错配，则靶模拟物或微RNA抗性靶标(micro-RNA resistant target)与微RNA基本互补：(a) 微RNA 5'端处的核苷酸与靶模拟物或微RNA抗性靶标中的相应核苷酸序列之间的错配；
(b) 微RNA的1位-9位的任一个核苷酸与靶模拟物或微RNA抗性靶标中相应核苷酸序列之间的错配；或
(c) 微RNA的12位-21位的任一个核苷酸与靶模拟物或微RNA抗性靶标的相应核苷酸序列之间的3个错配，条件是不超过2个连续错配。
[0371] 靶模拟物RNA与经如下修饰以赋予其对miRNA诱导切割的抗性的靶RNA基本相似：例如通过修饰其序列，使得将变化引入与导致错配的miRNA的核苷酸10或11互补的靶序列的核苷酸中。
[0372] 或者，可使微RNA抗性靶标生效。因此，可将沉默突变引入靶基因的微RNA结合位点，使得可以防止微RNA结合、但蛋白质的氨基酸序列不改变的方式使DNA和所得RNA序列改变。因此，可合成新的序列替代现有结合位点，其中DNA序列改变，导致miRNA不与其靶标结合。
[0373] 按照具体的实施方案，将靶模拟物或微RNA抗性靶标与同识别靶基因的pre-miRNA天然缔合的启动子连接，并导入细胞中。这样，miRNA靶模拟物或微RNA抗性靶RNA可在相同情况下表达，因为miRNA和靶模拟物或微RNA抗性靶RNA可取代被miRNA诱导切割降解的非靶模拟物/微RNA抗性靶RNA。
[0374] 还可通过同源重组引入非功能miRNA等位基因或miRNA抗性靶基因以取代miRNA编码等位基因或miRNA敏感靶基因。
[0375] 通过将目标核酸(例如miRNA、靶基因、沉默剂等)克隆到合适启动子控制下的核酸表达构建体中，来实现重组表达。
[0376] 在本发明的其它实施方案中，合成单链核酸用作miRNA抑制剂。miRNA抑制剂的长度通常介于约17-25个核苷酸，并包含与成熟miRNA的5'-3'序列至少90%互补的5'-3'序列。在某种实施方案中，miRNA抑制剂分子长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸或其中可派生的任何范围。此外，miRNA抑制剂具与成熟miRNA  (特别是成熟的天然存在的miRNA)的5'-3'序列为或至少为90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、
99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%或其中可派生的任何范围互补的序列(5'-3')。
[0377] 在本发明的其它实施方案中，可使用能够与微RNA或与其前体特异性杂交的反义多核苷酸，实现微RNA的减量调节。
[0378] 应认识到，本发明的微RNA反义作用剂(例如抗miRNA寡聚体)还可包含化学修饰、分子修饰和/或部分例如胆固醇部分的添加(例如antagomirs)。
[0379] 可采用瞬时转染技术，使miRNA抑制剂与细胞接触。miRNA抑制剂可市购获自例如Applied Biosystems等公司。
[0380] 或者，miRNA抑制剂可为本文上述表达载体的一部分。在这种情况下，细胞可用载体瞬时或稳定转染。
[0381] 按照具体的实施方案，当调节包括增量调节的表达Tph2基因，则调整包括减量调节miR-181和/或miR-27。
[0382] 按照另一个具体的实施方案，提供增量调节神经胶质细胞中的选自以下基因的表达的方法：腺苷酸环化酶激活多肽1 (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6  (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1  (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3)  (GRIA3)；离子型谷氨酸受体红藻氨酸3 (Grik3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，5-羟基色胺(5-羟色胺)受体1A (Htr1a)；肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；
核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；溶质载体家族6 (5-羟色胺神经递质转运蛋白)成员4 (Slc6a4)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；
突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白
2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含有BED结构域4的锌指(Zbed4)，所述方法包括：(a)减量调节神经胶质细胞中的miR-135或其前体的活性或表达；和(b)测量神经胶质细胞中基因的表达，从而增量调节基因的表达。
[0383] 按照具体的实施方案，通过减量调节微RNA (例如miR-135)或其前体的活性或表达以外的方法，来实现增量调节这些基因任一个的表达。因此，增量调节基因的活性或表达可通过过量表达基因或其靶标来实现。
[0384] 按照一个实施方案，通过使用特异性结合并减量调节微RNA的表达核酸序列，实现减量调节微RNA的表达。可按照本发明使用的示例性核酸序列可购自任何生产商，例如购自Genecopoeia (miArrest，基于微RNA载体的抑制剂)。
[0385] 因此，按照另一个实施方案，提供包含用于减量调节miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-135、miR-335、miR-15和miR-19或其前体的表达的核酸序列的分离的多核苷酸。
[0386] 可按照本发明使用的减量调节miR-181的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 134-137和SEQ ID NO: 154-157给出的那些。
[0387] 可按照本发明使用的减量调节miR-182的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 138-141和SEQ ID NO: 147给出的那些。
[0388] 可按照本发明使用的减量调节miR-26的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 126-129和SEQ ID NO: 145-146给出的那些。
[0389] 可按照本发明使用的减量调节miR-27的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 130-133和SEQ ID NO: 152-153给出的那些。
[0390] 可按照本发明使用的减量调节miR-135的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 110-113和SEQ ID NO: 142-143给出的那些。
[0391] 可按照本发明使用的减量调节miR-335的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 114-117和SEQ ID NO: 144给出的那些。
[0392] 可按照本发明使用的减量调节miR-15的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 118-121和SEQ ID NO: 150-151给出的那些。
[0393] 可按照本发明使用的减量调节miR-19的表达的示例性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO: 122-125和SEQ ID NO: 148-149给出的那些。
[0394] 所述核酸序列可进一步包含在上文更详细描述的表达载体中。
[0395] 本发明另考虑在减量调节或增量调节细胞(例如神经胶质细胞或心脏细胞)中的微RNA水平后评价靶基因的表达(例如转录物或多肽)。
[0396] 因此，可使用能够与靶基因的核酸序列(例如NM_001045.4所示Slc6a4或其部分；例如NM_000524.3所示Htr1a或其部分；例如NM_000240.3或NM_001270458.1所示MaoA或其部分；例如NM_000684.2所示Adrb1或其部分；例如NM_000024.5所示Adrb2或其部分；例如NM_001145146.1、NM_001145147.1所示CRH 1型受体或其部分；例如NM_001160226.1、NM_
033181.3所示CB1或其部分；例如NM_001145775.1、NM_001145777.1所示FKBP5或其部分；例如NM_173353.3所示Tph2或其部分；例如NM_000838.3、NM_001114329.1所示Grm1或其部分；
例如NM_000831.3所示Grik3或其部分；例如NM_000842.3、NM_001143831.2所示Grm5或其部分；例如NM_001166247.1、NM_021956.4所示Grik2或其部分；例如NM_000844.3、NM_
181874.2所示Grm7或其部分；例如NM_000826.3、NM_001083619.1所示Gria2或其部分；例如NM_001389.3所示Dscam或其部分；例如NM_000425.3、NM_001143963.1、NM_024003.2所示L1cam或其部分；例如NM_005999.2所示Tsnax或其部分；例如NM_001143676.1、NM_
001143677.1、NM_001143678.1所示Sgk1或其部分和/或例如NM_001165903.1、NM_004603.3所示Stx1a或其部分；例如NM_001117.4、NM_001099733.1所示Adcyap1或其部分；例如NM_
001118.4、NM_001199635.1、NM_001199636.1、NM_001199637.1所示Adcyap1r1或其部分；例如NM_000681.3所示Adra2a或其部分；例如NM_001149.3、NM_001204403.1、NM_001204404.1或NM_020987.3所示ANK3或其部分；例如NM_015193.4所示Arc或其部分；例如NM_
001287242.1、NM_006125.2、NM_013423.2、NM_013427.2所示Arhgap6或其部分；例如NM_
001030287.3、NM_001040619.2、NM_001206484.2、NM_001206486.2、NM_001206488.2、NM_
001674.3所示Atf3或其部分；例如NM_001207048.1、NM_001207049.1、NM_012104.4、NM_
138971.3、NM_138972.3、NM_138973.3所示Bace1或其部分；例如NM_000720.3、NM_
001128839.2、NM_001128840.2所示Cacna1d或其部分；例如NM_001127173.1、NM_021189.3所示Cadm3或其部分；例如NM_006651.3所示Cplx1或其部分；例如NM_001008220.1、NM_
006650.3所示Cplx2或其部分；例如NM_033225.5所示Csmd1或其部分；例如NM_022048.3所示Csnk1g1或其部分；例如NM_000555.3、NM_001195553.1、NM_178151.2、NM_178152.2、NM_
178153.2所示Dcx或其部分；例如NM_017594.3所示Diras2或其部分；例如NM_001142699.1、NM_001142700.1、NM_001142702.1、NM_001206769.1、NM_001364.3所示Dlg2或其部分；例如NM_001114123.2、NM_001257168.1、NM_005229.4所示Elk1或其部分；例如NM_002031.2所示Frk或其部分；例如NM_006581.3所示Fut9或其部分；例如NM_000813.2、NM_021911.2所示Gabrb2或其部分；例如NM_001002295.1、NM_002051.2所示Gata3或其部分；例如NM_
004122.2、NM_198407.2所示Ghsr或其部分；例如NM_005281.3所示Gpr3或其部分；例如NM_
000828.4、NM_001256743.1、NM_007325.4所示GRIA3或其部分；例如NM_005308.2所示Grk5或其部分；例如NM_001146156.1、NM_002093.3所示GSK3B或其部分；例如NM_021072.3所示Hcn1或其部分；例如NM_001194.3所示Hcn2或其部分；例如NM_001144878.1、NM_
001144879.1、NM_005536.3所示IMPA1或其部分；例如NM_001024660.3、NM_003947.4、NM_
007064.3所示Kalrn或其部分；例如NM_001204087.1、NM_002249.5、NM_170782.2所示KCNN3或其部分；例如NM_002267.3所示Kpna3或其部分；例如NM_015025.2所示Myt1l或其部分；例如NM_006540.2所示Ncoa2或其部分；例如NM_020465.3、NM_022910.3、NM_001130487.1、NM_
001242836.1所示Ndrg4或其部分；例如NM_001126060.1、NM_001164757.1、NM_014697.2所示NOS1AP或其部分；例如NM_000901.4、NM_001166104.1所示Nr3c2或其部分；例如NM_
001113226.1、NM_001113228.1、NM_014917.2所示Ntng1或其部分；例如NM_022731.4所示Nucks1或其部分；例如NM_005019.4、NM_001003683.2、NM_001258312.1所示Pde1a或其部分；例如NM_001111307.1、NM_001111308.1、NM_001111309.1所示Pde4a或其部分；例如NM_
003719.3、NM_001029851.2、NM_001029852.2所示Pde8b或其部分；例如NM_015192.3、NM_
182734.2所示Plcb1或其部分；例如NM_000949.5、NM_001204315.1、NM_001204316.1所示Prlr或其部分；例如NM_030981.2所示Rab1b或其部分；例如NM_021033.6所示Rap2a或其部分；例如NM_006914.3所示Rorb或其部分；例如NM_001142498.1、NM_012238.4所示Sirt1或其部分；例如NM_133647.1、NM_005135.2、NM_001042495.1所示Slc12a6或其部分；例如NM_
021815.2所示Slc5a7或其部分；例如NM_138473.2、NM_003109.1、NM_001251825.1所示Sp1或其部分；例如NM_001167580.1、NM_014848.4所示Sv2b或其部分；例如NM_033071.3、NM_
182961.3所示Syne1或其部分；例如NM_001135805.1、NM_001135806.1、NM_005639.2所示Syt1或其部分；例如NM_001136504.1、NM_177402.4所示Syt2或其部分；例如NM_
001160328.1、NM_001160329.1、NM_032298.2所示Syt3或其部分；例如NM_001024847.2、NM_
003242.5所示Tgfbr2或其部分；例如NM_000461.4、NM_001128176.2、NM_001128177.1、NM_
001252634.1所示Thrb或其部分；例如NM_004621.5所示Trpc6或其部分；例如NM_014232.2所示Vamp2或其部分；例如NM_030753.4所示Wnt3或其部分和/或例如NM_014838.2所示Zbed4或其部分)杂交的分离的多核苷酸(例如多核苷酸探针、寡核苷酸探针/引物)，测定靶基因(例如Slc6a4、Htr1a、MaoA、Adrb1、Adrb2、CRH 1型受体、CB1、FKBP5、Tph2、Grm1、Grik3、Grm5、Grik2、Grm7、Gria2、Dscam、L1cam、Tsnax、Sgk1、Stx1a、Adcyap1、Adcyap1r1、Adra2a、Ank3、Arc、Arhgap6、Atf3、Bace1、Cacna1d、Cadm3、Cplx1、Cplx2、Csmd1、Csnk1g1、Dcx、Diras2、Dlg2、Elk1、Frk、Fut9、Gabrb2、Gata3、Ghsr、Gpr3、Gria3、Grk5、Gsk3b、Hcn1、Hcn2、Impa1、Kalrn、Kcnn3、Kpna3、Myt1l、Ncoa2、Ndrg4、Nos1ap、Nr3c2、Ntng1、Nucks1、Pde1a、Pde4a、Pde8b、Plcb1、Prlr、Rab1b、Rap2a、Rorb、Sirt1、Slc12a6、Slc5a7、Sp1、Sv2b、Syne1、Syt1、Syt2、Syt3、Tgfbr2、Thrb、Trpc6、Vamp2、Wnt3和/或Zbed4)核酸序列(例如转录物)的存在和/或水平。所述多核苷酸可为任何大小，例如短多核苷酸(例如具有15-200个碱基)、中等多核苷酸(例如200-2000个碱基)或2000个碱基以上的长多核苷酸。
[0397] 本发明所用的分离的多核苷酸探针可以是对本发明的靶基因RNA转录物有特异性的任何直接或间接标记的RNA分子(例如RNA寡核苷酸、体外转录的RNA分子)、DNA分子(例如寡核苷酸、cDNA分子、基因组分子)和/或其类似物[例如肽核酸(PNA)]。
[0398] 按本发明的教导内容设计的寡核苷酸可按照上文详细描述的本领域已知的任何寡核苷酸合成方法产生。
[0399] 本发明的寡核苷酸具有至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30或至少40个可与上文所述序列变化特异性杂交的碱基。
[0400] 本发明的寡核苷酸可包含由以3'-5'磷酸二酯键键合的嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷。
[0401] 优选的所用寡核苷酸是在骨架(例如糖-磷酸骨架)、核苷间键和/或碱基修饰的那些，如上文大体描述的一样。
[0402] 本发明所用的分离的多核苷酸可使用标签或标记分子直接或间接标记。所述标记可为例如荧光分子(例如荧光素或德克萨斯红)、放射性分子(例如32P-γ-ATP或32P-α-ATP)和显色底物[例如可获自(ABCAM、Cambridge、MA)的坚牢红、BCIP/INT]。可通过使标记分子与多核苷酸共价缀合(例如使用固相合成)或通过聚合掺入(例如使用体外转录反应或随机引发标记)实现直接标记。使未标记的标签分子(例如洋地黄毒苷或生物素)与多核苷酸共价缀合或掺入多核苷酸中，随后进行把多核苷酸加上能够特异性识别未标记的标签的标记分子(例如抗洋地黄毒苷抗体或链霉抗生物素)，来实现间接标记。
[0403] 可将上述多核苷酸应用于多种RNA检测方法例如RNA印迹分析、反转录PCR (RT-PCR) [例如半定量RT-PCR、使用例如Light CyclerTM (Roche)的定量RT-PCR]、RNA原位杂交(RNA-ISH)、原位RT-PCR染色[例如描述于Nuovo GJ等, 1993,  Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA (聚合酶链反应(PCR)扩增的丙型肝炎cDNA的胞内定位). Am J Surg Pathol. 17: 683-
90；以及Komminoth P等, 1994, Evaluation of methods for hepatitis C virus detection  in archival liver  biopsies.  Comparison of  histology, 
immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR (用于归档肝活检样品中的丙型肝炎病毒检测的评价方法：组织学、免疫组织化学、原位杂交、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和原位RT-PCR的比较). Pathol Res Pract., 190: 1017-25]和寡核苷酸微阵列分析[例如使用Affymetrix微阵列(Affymetrix®，Santa Clara，CA)]。
[0404] 可使用例如特异性抗体通过免疫复合物的形成[即存在于生物样品中的靶基因抗原(氨基酸序列)和特异性抗体之间形成的复合物]，来测定靶基因(例如Slc6a4、Htr1a、MaoA、Adrb1、Adrb2、CRH 1型受体、CB1、FKBP5、Tph2、Grm1、Grik3、Grm5、Grik2、Grm7、Gria2、Dscam、L1cam、Tsnax、Sgk,1 Stx1a、Adcyap1、Adcyap1r1、Adra2a、Ank3、Arc、Arhgap6、Atf3、Bace1、Cacna1d、Cadm3、Cplx1、Cplx2、Csmd1、Csnk1g1、Dcx、Diras2、Dlg2、Elk1、Frk、Fut9、Gabrb2、Gata3、Ghsr、Gpr3、Gria3、Grk5、Gsk3b、Hcn1、Hcn2、Impa1、Kalrn、Kcnn3、Kpna3、Myt1l、Ncoa2、Ndrg4、Nos1ap、Nr3c2、Ntng1、Nucks1、Pde1a、Pde4a、Pde8b、Plcb1、Prlr、Rab1b、Rap2a、Rorb、Sirt1、Slc12a6、Slc5a7、Sp1、Sv2b、Syne1、Syt1、Syt2、Syt3、Tgfbr2、Thrb、Trpc6、Vamp2、Wnt3和/或Zbed4)氨基酸序列(例如蛋白质)的存在和/或水平。
[0405] 本发明的免疫复合物可在不同的温度、盐浓度和pH值下形成，这可取决于所用的方法和生物样品，且本领域技术人员能够调节适于各种免疫复合物形成的条件。
[0406] 本发明所用术语“抗体”包括完整分子及其功能片段，例如Fab、F(ab')2、Fv或单一结构域分子例如抗原表位的VH和VL。这些功能性抗体片段如下定义：(1) Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的该片段，可通过用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗体产生，得到完整的轻链和一条重链的一部分；(2) Fab'，可通过用胃蛋白酶处理完整抗体后还原来获得抗体分子的这个片段，得到完整轻链和重链的一部分；每个抗体分子得到2个Fab'片段；(3) (Fab')2，可以用酶即胃蛋白酶处理完整抗体但无需随后的还原获得该抗体片段；F(ab')2是2个Fab'片段由2个二硫键连接在一起的二聚体；(4) Fv，定义为含有表达成2条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(5)单链抗体(“SCA”)，是一种基因工程分子，含有由合适的多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区作为遗传融合的单链分子；和(6)单域抗体由显示对抗原有足够亲和力的单一VH或VL结构域组成。
[0407] 产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988，通过引用结合到本文中)。
[0408] 可以通过抗体的蛋白水解，或者通过使编码片段的DNA在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中的表达，来制备本发明的抗体片段。可通过常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体获得抗体片段。如上所述，可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶促切割得到5S片段，从而产生(Fab’)2抗体片段。还可以使用巯基还原剂，任选使用由二硫键裂解所产生的巯基的封端基团，使该片段进行进一步裂解产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶促切割来直接产生2个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg的美国专利号4,036,945和4,331,
647和其中所包含的参考文献，所述专利通过引用以其整体结合到本文中。另参见Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]。切割抗体的其它方法，例如重链分离形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或者还可以使用其它酶技术、化学技术或遗传技术，只要该片段与被完整抗体识别的抗原结合。
[0409] Fv片段包含VH链和VL链的缔合物。该缔合物可以是非共价的，如描述于Inbar等[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)]。或者，可变链可以通过分子间的二硫键连接，或者通过化学试剂(例如戊二醛)交联。优选Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建结构基因来制备，该结构基因包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列。将该结构基因插入表达载体中，随即将表达载体导入宿主细胞(例如大肠杆菌)中。重组宿主细胞合成具有桥接2个V结构域的接头肽的单一多肽链。有关产生scFv的方法描述于例如Whitlow和Filpula，Methods, 2: 97-105, 1991；Bird等，Science 242:423-426，1988；Pack等，Bio/Technology 11:1271-77，1993；以及Ladner等，美国专利第4,946,778号，所述专利通过引用以其整体结合到本文中。
[0410] 抗体片段的另一形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目标抗体CDR的基因获得。例如，通过采用聚合酶链式反应以由产抗体细胞的RNA合成可变区，来制备这类基因。参见例如Larrick和Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]。
[0411] 还可以采用本领域已知的各种技术制备抗体，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227:381  (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。还可获得Cole等和Boerner等人的技术用于制备人单克隆抗体(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77页(1985)和Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))。同样，可通过将人免疫球蛋白基因座导入其中内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)中，来制备人抗体。在攻击时，观察到人抗体的产生，这在包括基因重排、装配和抗体库在内的所有方面都与在人体中观察到的十分相似。该方法描述于例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和下列科学出版物：Marks等, Bio/Technology 10: 779-
783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；以及Lonberg和Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 
65-93 (1995)。
[0412] 可按照本发明使用的示例性抗体包括诸如例如可获自Abnova Corporation、Abgent和MBL International的抗Slc6a4抗体；例如可获自Novus Biologicals、Acris Antibodies GmbH和Abnova  Corporation的抗Htr1a抗体；例如可获自Abnova Corporation、Proteintech Group, Inc.和Abgent的抗MaoA抗体；例如可获自Biorbyt、Abgent和在线抗体(antibodies-online)的抗Adrb1抗体；例如可获自Tocris Bioscience、Abnova Corporation和在线抗体的抗Adrb2抗体；例如可获自MyBioSource.com、Abcam和Novus Biologicals的抗CRH 1型受体抗体；例如可获自Santa Cruz Biotechnology, Inc.和Epitomics, Inc.的抗CB1抗体；例如可获自BD Biosciences和Abnova Corporation的抗FKBP5抗体；例如可获自Novus Biologicals和Acris Antibodies GmbH的抗Tph2抗体；例如可获自Novus Biologicals和Biorbyt的抗Grm1抗体；例如可获自Acris Antibodies GmbH和Atlas Antibodies的抗Grik3抗体；例如可获自Biorbyt和Acris Antibodies GmbH的抗Grm5抗体；例如可获自Proteintech Group, Inc.、Aviva Systems Biology和Abgent的抗Grik2抗体；例如可获自Acris Antibodies GmbH和在线抗体的抗Grm7抗体；例如可获自Proteintech Group, Inc.和Abnova Corporation的抗Gria2抗体；抗Dscam抗体例如可获自Novus Biologicals和R&D系统；例如可获自GeneTex、Novus Biologicals和Acris Antibodies GmbH的抗L1cam抗体；例如可获自BD Biosciences和GenWay Biotech、Inc.的抗Tsnax抗体；例如可获自Epitomics, Inc.和Acris Antibodies GmbH的抗Sgk1抗体和/或例如可获自MBL International和Spring Bioscience的抗Stx1a抗体。
[0413] 可采用各种方法以检测本发明的免疫复合物的形成，而且本领域技术人员能够确定哪一种方法适于用于诊断的各免疫复合物和/或细胞类型。
[0414] 用于本发明的免疫复合物的特异性抗体(例如抗Slc6a4抗体、抗Htr1a抗体、抗MaoA抗体、抗Adrb1抗体、抗Adrb2抗体、抗CRH 1型受体抗体、抗CB1抗体、抗FKBP5抗体、抗Tph2抗体、抗Grm1抗体、抗Grik3抗体、抗Grm5抗体、抗Grik2抗体、抗Grm7抗体、抗Gria2抗体、抗Dscam抗体、抗L1cam抗体、抗Tsnax抗体、抗Sgk1抗体和/或抗Stx1a抗体)可采用本领域已知方法标记。应认识到，标记的抗体可以是第一抗体(即其与特定抗原(例如靶基因特异性抗原)结合)或与第一抗体结合的第二抗体(例如标记的山羊抗兔抗体、标记的小鼠抗人抗体)。抗体可与标记直接缀合或可与酶缀合。
[0415] 本发明的抗体可以被荧光标记(使用与抗体缀合的荧光染料)、放射性标记(使用例如125I等放射性标记的抗体)或与酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合和与显色底物一起使用以产生比色反应。被本发明的酶缀合的抗体利用的显色底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的AEC、坚牢红、ELF-97底物[2-(5'-氯-2-磷酰基氧基苯基)-6-氯-4(3H)-喹唑啉酮]、磷酸对硝基苯酯(PNPP)、酚酞二磷酸和ELF 39-磷酸、BCIP/INT、Vector Red (VR)、橙红和品红磷酸(Avivi C.等, 1994, J Histochem. Cytochem. 1994；42: 551-4)和用于过氧化物酶的Nova Red、二氨基联苯胺(DAB)、Vector(R) SG底物、基于鲁米诺(luminol)的化学发光底物。这些酶的底物可市购获自Sigma (St Louis，MO，USA)、Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA)、Vector Laboratories Inc. (Burlingame，CA，USA)、Zymed Laboratories Inc. (San Francisco，CA，USA)、Dako Cytomation (Denmark)。
[0416] 可采用荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹和放射免疫测定(RIA)分析、免疫沉淀(IP)或通过基于分子量的方法，进行可能含有可溶性(例如分泌的、排出的)靶基因多肽的生物样品(例如血样或血清)中免疫复合物的检测。
[0417] 对于蛋白质印迹，从细胞样品中提取蛋白质，对其进行电泳(例如SDS-PAGE)，并印在膜(例如尼龙或PVDF)上。然后使膜与特异性抗体(例如抗Slc6a4抗体、抗Htr1a抗体、抗MaoA抗体、抗Adrb1抗体、抗Adrb2抗体、抗CRH 1型受体抗体、抗CB1抗体、抗FKBP5抗体、抗Tph2抗体、抗Grm1抗体、抗Grik3抗体、抗Grm5抗体、抗Grik2抗体、抗Grm7抗体、抗Gria2抗体、抗Dscam抗体、抗L1cam抗体、抗Tsnax抗体、抗Sgk1抗体和/或抗Stx1a抗体)相互作用，所述特异性抗体可直接标记或进一步经过第二标记抗体处理。检测可以是通过放射自显影、比色反应或化学发光。该方法允许根据膜上的相对位置(其表示在电泳期间在丙烯酰胺凝胶中的迁移距离)，定量测定底物的量，并确定其身份。
[0418] 在生物样品中抗原浓度低的情况下，抗原(靶基因氨基酸序列)的检测可通过免疫沉淀(IP)进行。对于免疫沉淀分析，可使特异性抗体(例如抗Slc6a4抗体、抗Htr1a抗体、抗MaoA抗体、抗Adrb1抗体、抗Adrb2抗体、抗CRH 1型受体抗体、抗CB1抗体、抗FKBP5抗体、抗Tph2抗体、抗Grm1抗体、抗Grik3抗体、抗Grm5抗体、抗Grik2抗体、抗Grm7抗体、抗Gria2抗体、抗Dscam抗体、抗L1cam抗体、抗Tsnax抗体、抗Sgk1抗体和/或抗Stx1a抗体)与包括靶基因多肽的样品(例如细胞裂解物)直接相互作用，并且可使用与珠粒缀合的第二抗体(例如如果特异性抗体是小鼠单克隆抗体，则第二抗体可以是与例如琼脂糖珠粒缀合的抗小鼠抗体)，检测所形成的复合物。然后可通过离心使珠粒沉淀，之后可使所沉淀的蛋白质(例如靶基因多肽和特异性抗体)从珠粒上脱落(例如使用在95℃下的变性)，并使用抗体进一步进行蛋白质印迹分析。或者，可将特异性抗体和珠粒缀合的第二抗体加到含有抗原(靶基因多肽)的生物样品中从而形成免疫复合物。或者，如果靶基因多肽是高度糖基化的蛋白质，则它也可使用能够结合同样可与珠粒缀合的糖基化多肽(例如Concavalin  A  (GE Healthcare Bio-Sciences，Uppsala，Sweden))的底物沉淀，接着进行上述特异性抗体的蛋白质印迹分析。
[0419] FACS分析使得能够检测存在于细胞膜上的抗原。简单地说，将上述特异性抗体与荧光团连接，通过细胞分选仪进行检测，细胞分选仪在当细胞通过光束时，读取每个细胞发射出的光波长。这种方法可以同时使用两种或更多种抗体。。
[0420] 靶基因多肽的存在和/或水平还可采用ELISA测定。简单地说，将含有靶基因抗原的样品固定在表面(例如微量滴定板的孔)上。加入与酶偶联的抗原特异性抗体(例如抗Slc6a4抗体、抗Htr1a抗体、抗MaoA抗体、抗Adrb1抗体、抗Adrb2抗体、抗CRH 1型受体抗体、抗CB1抗体、抗FKBP5抗体、抗Tph2抗体、抗Grm1抗体、抗Grik3抗体、抗Grm5抗体、抗Grik2抗体、抗Grm7抗体、抗Gria2抗体、抗Dscam抗体、抗L1cam抗体、抗Tsnax抗体、抗Sgk1抗体和/或抗Stx1a抗体)，并允许与抗原结合。然后通过利用与抗体偶联的酶的比色反应，检测抗体的存在并量化。常用于该方法的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果适当校准且在反应的线性范围内，则样品中存在的底物的量与所产生的颜色的量成比例。一般应用底物标准以改进定量准确性。
[0421] 靶基因多肽的存在和/或水平还可采用放射免疫测定(RIA)测定。在一个方案中，该方法包括所需抗原(靶基因多肽)与固定在可沉淀载体(例如琼脂糖珠粒)上的特异性抗体和放射性标记的抗体结合蛋白(例如用I125标记的蛋白A)的沉淀。在沉淀小颗粒中的清点次数与抗原的量成比例。
[0422] 在RIA的替代方案中，使用标记的抗原和未标记的抗体结合蛋白。以不同的量加入含有未知量的抗原的样品中。标记抗原沉淀计数的减少与所加样品中的抗原量成比例。
[0423] 靶基因多肽的存在和/或水平还可采用基于分子量的方法测定。因为免疫复合物显示比其组分高的分子量，所以也可采用能够检测分子量的这种变化的方法。例如，免疫复合物可通过凝胶延迟测定法检测。简单地说，非变性丙烯酰胺凝胶与样品一起加载。与其组分相比蛋白质产物的大小(分子量)的变化表明免疫复合物存在。使用非特异性蛋白质染色(例如银染或考马斯蓝染色)，可观察到这种向较高分子量的变化。
[0424] 生物样品例如组织切片(例如石蜡包埋或冷冻切片)中靶基因多肽的原位检测可采用原位检测细胞上抗体结合的免疫染色方法进行。免疫染色方法的实例包括但不限于荧光标记免疫组织化学(使用与抗体缀合的荧光染料)、放射性标记免疫组织化学(使用放射性标记的(例如125I)抗体)和免疫细胞化学[使用酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)和显色底物以产生比色反应]。应认识到，与抗体缀合的酶可利用上述各种显色底物。
[0425] 优选本发明所用免疫染色是免疫组织化学和/或免疫细胞化学。
[0426] 免疫染色优选接着使用与未染色细胞区室结合的染料，使细胞复染。例如，如果标记的抗体与细胞质中存在的抗原结合，则核染色(例如Hematoxylin -Eosin stain)是合适的对比染色。
[0427] 按照一个实施方案，所述方法包括在减量调节miR-181和/或miR-27后测量Tph2基因的表达。
[0428] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-135和/或miR-335后测量Slc6a4基因的表达。
[0429] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和/或miR-26后测量Htr1a基因的表达。
[0430] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-27后测量MaoA基因的表达。
[0431] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-19后测量Adrb1基因的表达。
[0432] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节CB1后测量CB1基因的表达。
[0433] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-15后测量CRH 1型受体基因的表达。
[0434] 按照一个实施方案，所述方法包括在增量调节miR-15后测量FKBP5基因的表达。
[0435] 如上所述，本发明人进一步认识到，患有心境障碍包括抑郁症、焦虑症、双相型障碍和应激的人类受试者血样中miR-135的水平显著减量调节(与健康人类受试者相比)，且在用抗抑郁疗法治疗的人类受试者的血样中增量调节(与开始治疗前的同一受试者或未治疗的人类受试者相比)。
[0436] 因此，提供诊断有需要的人类受试者的心境障碍的方法，所述方法包括测量人类受试者的生物样品中miR-135的表达水平，其中与健康受试者生物样品中的相比，较低的miR-135表达水平表明有心境障碍。
[0437] 任何心境障碍可按照本发明诊断，包括但不限于双相型障碍、抑郁症、重性抑郁症、焦虑症、应激、疲劳、认知功能受损、惊恐发作、强迫行为、成瘾性、社交恐怖症、精神分裂症、睡眠障碍和进食障碍(例如神经性厌食症、神经性贪食症、未分类的进食障碍、暴食障碍(BED)或异食癖障碍)。
[0438] 测量miR-135 (例如miR-135a)的表达水平通常在生物样品中进行。
[0439] 按照具体的实施方案，术语“生物样品”是指体液例如新鲜全血、分级全血、血浆、血清、脑脊液(CSF)、尿液、淋巴液和呼吸道、肠道和泌尿生殖道的各种外分泌物、眼泪、唾液、乳汁以及白细胞包括单核细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、树突细胞)。
[0440] 通常，全血和分级全血(即例如通过离心分级成为单独的组分的血样)包含血液组分的全部，包括血浆、白细胞、血小板和红细胞。血清是即无血细胞又无凝血因子的血液组分，它是其中除去了血纤蛋白原的血浆。血清包括不用于血液凝固(凝血)的蛋白质和电解质、抗体、抗原、激素和任何外源物质(例如药物和微生物)。此外，血浆包含血清组分的全部以及凝血因子。
[0441] 按照具体的实施方案，生物样品是全血样品。
[0442] 按照具体的实施方案，生物样品是血清或血浆样品。
[0443] 按照具体的实施方案，生物样品是单核细胞样品。
[0444] 按照具体的实施方案，细胞样品没有红细胞。
[0445] 按照一个具体的实施方案，生物样品为至少90%白细胞(例如至少90%单核细胞)。
[0446] 测量miR-135的表达水平可通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行，例如通过RNA印迹分析、核糖核酸酶保护测定法和PCR (例如实时PCR)。
[0447] 如所述，与健康人类受试者(即未受累于心境障碍的受试者)的生物样品中的相比，miR-135的较低表达水平表明有心境障碍。
[0448] 按照一个实施方案，与健康人类受试者的生物样品中的相比，miR-135的较低表达水平是统计学显著性的。
[0449] 患有心境障碍的人类受试者中miR-135的表达水平可低于健康人类受试者的约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
[0450] 诊断可采用金标准方法进一步评价并证实。通常，完整患者病史、身体评估和全面症状评价的至少一种有助于确诊所述障碍(包括抑郁症或双相型障碍的心境障碍)。标准化问卷可用于诊断抑郁症，例如汉密尔顿抑郁等级量表(Hamilton Rating Scale for Depression)和贝克抑郁调查表(Beck Depression Inventory)。
[0451] 可采用典型标准进一步评价双相型障碍的诊断。用于诊断双相型障的最广泛采用的标准来自美国精神病协会精神障碍诊断与统计手册(American  Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) (例如DSM-IV-TR版)和世界卫生组织疾病与有关健康问题的国际统计分类(World Health Organization's International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems) (例如ICD-10)。
[0452] 此外，可进行试验以排除内科疾病，例如甲状腺机能减退或甲状腺功能亢进、代谢紊乱、全身感染或慢性疾病和梅毒或HIV感染。可采用EEG以排除癫痫，采用头部CT扫描以排除脑损伤。
[0453] 本发明人进一步表明，在抗抑郁药疗法以后，人类受试者的血液miR-135 (例如miR-135a)的水平增量调节(参见随附实施例部分的实施例16)。
[0454] 因此，按照本发明的另一个实施方案，提供监测抗抑郁药物或治疗心境障碍(例如双相型障碍)的药物的治疗的方法，所述方法包括：(a)用抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗有需要的人类受试者；和(b)在治疗之前和之后测量人类受试者的生物样品中miR-135的表达水平，其中与在通过抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗之前miR-135的表达水平相比在通过抗抑郁药物或治疗心境障碍的药物治疗之后miR-135的较高表达水平表明有效的治疗。
[0455] 按照一个实施方案，所述方法另包括(c)当在步骤(b)中观察到较高miR-135表达水平时，则对人类受试者进行治疗以改进治疗。
[0456] 生物样品(例如新鲜全血、分级全血、血浆或血清)通常获自在用抗抑郁药物或用治疗心境障碍的药物治疗后的人类受试者，然而，血样还可获自治疗前的受试者用于miR-135水平的进一步比较。
[0457] 按照具体的实施方案，miR-135包含miR-135a。
[0458] 本文所用术语“抗抑郁药物”是指任何用于缓解例如重性抑郁症和精神抑郁症等心境障碍和例如社交焦虑障碍等焦虑障碍的药物。示例性抗抑郁药物包括但不限于选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI，例如西酞普兰、依他普仑、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀和舍曲林)；5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(SNRI，例如地文拉法辛、度洛西汀、米那普仑和文拉法辛)；去甲肾上腺素能与特异性5-羟色胺能抗抑郁药(例如米安色林和米氮平)；去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)重摄取抑制剂(NRI，例如托莫西汀、马吲哚、瑞波西汀和维洛沙秦)；去甲肾上腺素-多巴胺重摄取抑制剂(例如安非他酮)；选择性5-羟色胺重摄取增强剂(例如噻奈普汀)；去甲肾上腺素-多巴胺去抑制剂(NDDI例如gomelatine)；三环类抗抑郁药(包括叔胺三环类抗抑郁药和仲胺三环类抗抑郁药)和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。
[0459] 按照一个实施方案，抗抑郁药物包含选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)、三环类抗抑郁药或去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)。
[0460] 按照具体的实施方案，抗抑郁药物包含选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)。
[0461] 本文所用术语“治疗心境障碍的药物”是指用于治疗包括双相型障碍在内的心境障碍的任何药物或药物的任何组合。示例性药物包括但不限于锂(例如碳酸锂、柠檬酸锂、硫酸锂)、抗精神病药物(例如上文所述典型抗精神病药和非典型抗精神病药)和情绪稳定药物(例如上文所述丙戊酸(VPA、丙戊酸盐)、矿物质、抗惊厥药、抗精神病药)。
[0462] 本发明方法(单独或与上述组合)所包括的其它治疗选择包括非药物治疗策略，包括但不限于临床心理学、电惊厥疗法、非自愿院禁、光疗法、精神疗法、经颅磁刺激和认知行为疗法。
[0463] 当与治疗前的miR-135表达水平相比治疗后达到miR-135显著较高的表达水平时，确定为有效的抗抑郁/心境障碍治疗。
[0464] 治疗后受试者中miR-135的表达水平可比抗抑郁或心境障碍治疗前受试者的高约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
[0465] 还可通过评价患者的舒适感，另外或备选，对受试者进行行为试验、MRI或本领域技术人员已知的任何其它方法，来实施监测治疗。
[0466] 预期在从该申请完成的专利的使用期限内，将研发出miRNA或备选miRNA修饰的许多相关抑制剂，术语微RNA的范围欲包括所推衍的所有这类新技术。
[0467] 本文所用术语“约”是指± 10%。
[0468] 术语“包含”、“含有”、“包括”、“纳入”、“具有”及其同根词意指“包括但不限于”。
[0469] 术语“由……组成”意指“包括且限于”。
[0470] 术语“基本由……组成”意指组合物、方法或结构可包括其它成分、步骤和/或部分，但只要其它成分、步骤和/或部分不实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新的特征。
[0471] 本文所用单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
[0472] 在本申请中，本发明的不同的实施方案可以范围形式存在。应了解，范围形式的描述仅出于方便和简洁，不应解释为本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如，范围例如1-6的描述应视为具体公开了例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及该范围的各个数，例如1、2、3、4、5和6。不论范围宽度均适用。
[0473] 每当本文规定数值范围时，均意指包括该指定范围的任何引述的数值(分数或整数)。短语“介于”第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”和“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文互换使用，意指包括第一标示数字和第二标示数字和之间的所有分数和整数。
[0474] 本文所用术语“方法”是指用于完成指定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业人员已知或容易由他们从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。
[0475] 要认识到，为了清楚起见，在各个实施方案的情况下描述的本发明的某些特征，也可在单一实施方案中组合提供。相反，出于简洁起见，在单一实施方案的情况下描述的本发明的不同特征，也可单独提供或以任何合适的亚组合提供或适用于本发明的任何其它描述的实施方案。在不同实施方案的情况下描述的某些特征不视为所述实施方案的必需特征，除非该实施方案在无所述要素时是无效的。
[0476] 在下面的实施例中，提供对上文描述和随附权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施方案和方面的实验支持。实施例
[0477] 下面参照以下实施例，连同上文的描述，以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
[0478] 一般而言，本文所用命名法和用于本发明的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。参考文献中全面阐释了所述技术。参见例如"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook等(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" 第I-III卷, Ausubel, R. M.编辑(1994)；Ausubel等, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；
Watson等, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren等(编辑) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 第1-4卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,
531、5,192,659和5,272,057给出的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", 第I-III卷, Cellis, J. E.编辑(1994)；"Current Protocols in Immunology" 第I-III卷, Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等(编辑), "Basic and Clinical Immunology" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)；可获得的免疫测定法大量描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,
153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,
984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.和Higgins S. J., 编辑(1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)以及"Methods in Enzymology" 第1-317卷, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak等, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；其全部通过引用予以结合就像在本文完全阐述一样。在该整个文件中提供其它普通参考文献。本文的方法被视为是本领域众所周知的，出于方便读者而提供。其中所含全部信息通过引用予以结合。
[0479] 实施例15-羟色胺神经元中miR的差异表达
材料与实验方法
5HT神经元微RNA微阵列
培养来自ePET YFP小鼠胚期第12天的后脑细胞，分选以将5HT神经元与周围的非5HT神经元区分开来。将包括miRNA群的总RNA纯化，标记，并按照生产商说明书，在基于Sanger miRBase 12.0版的Agilent Mouse miRNA Microarray (Agilent Tech，Mississauga，ON，Canada)设计编号021828上杂交。扫描微阵列，提取数据，应用Feature Extraction Software (Agilent Technologies)处理。在扫描后，应用Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, MO)分析GeneView.txt文件的强度输出数据，使微RNA的差异性相对表达量化。对数据进行log2变换，进行分位数归一化，并按照GeneView文件中的标记“gIsGeneDetected”过滤。666种鼠miR中，在该过滤步骤时，保留198种用于进一步分析。然后通过使用1.5倍变化的阈值，以ANOVA的显著性，鉴定差异表达的miR。在ANOVA检验内计算对比度。对于假阳性降低应用Benjamini和Hochberg校正(多重检验校正)。
[0480] 将3' UTR克隆至Psicheck2萤光素酶表达质粒中从小鼠基因组DNA或总脑cDNA中PCR扩增Slc6a4、Htr1a、MaoA和Tph2的3'UTR序列。按照生产商准则，使3'UTR PCR片段与pGEM-T easy vector (Promega)连接，并进一步亚克隆至Psicheck2报道质粒(Promega)中萤光素酶3'端的单一NotI位点中。用种子匹配序列间的引物突出端合成没有miR-135种子序列的突变的3' UTR序列。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0481] 转染和萤光素酶测定使HEK293T细胞以48孔形式在聚L-赖氨酸生长至70-85%汇合，用下列质粒使用聚乙烯亚胺转染：5 ng Psicheck2-3'UTR质粒和215 ng特定miRNA的过量表达载体或空miR-vec过量表达质粒。在转染后24小时，使细胞溶解，并如前所述测定萤光素酶报道分子活性[Chen A.等, Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]。使海肾萤光素酶值归一化至对照萤火虫萤光素酶水平(从同一载体转录，但不受所测3'UTR影响)，对每个条件的6孔重复取平均。
[0482] 动物和饲养在颠倒的12小时光/暗周期下，将10周龄成年C57BL/6J雄性小鼠(Harlan，Jerusalem，Israel)关养在受控温度室(22 ± 1℃)下。食物和水可任意获得。所有实验方案均获魏茨曼科学研究所机构动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of The Weizmann Institute of Science)批准。
[0483] 急性制动应激范例在其暗周期，将成年小鼠引入50 ml通风管30分钟。
[0484] 慢性社交失败如前所述，对小鼠进行社交失败方案处理[Krishnan V.等, Cell (2007) 131: 391-
404]。简单地说，将小鼠放到攻击性ICR小鼠的养育笼中，它们在笼中在身体上互动5分钟。
在此期间，ICR小鼠攻击闯入小鼠，闯入者显露附属姿态。然后将穿孔的透明有机玻璃隔板放在动物之间，把小鼠留在同一笼中24小时以允许感官接触。然后在接下来的10天，每天用陌生ICR小鼠重复该过程。
[0485] 抗抑郁药治疗小鼠接受三环类-丙米嗪，或SSRI-氟西汀，或NRI-瑞波西汀(20 mg/kg，在盐水中)或盐水的i.p.注射。慢性注射连续进行18-21天，在显微切割前24小时进行急性注射。
[0486] 中缝核的显微切割和血浆收集在取出脑后从小鼠中缝核(RN)提取脑样品，将脑样品放在丙烯酸酯类脑基质(acryl brain matrix) (Stoelting)中。根据指定的解剖标记，使用标准刀片(GEM)取出切片。使用钝的14G注射器，从自基质取出的3 mm切片中提取RN区。另外，在含EDTA的管中收集躯干血以避免凝血。在4℃下以3,500 g离心30分钟后，分离血浆，并保持在-70℃下直到RNA纯化。
[0487] 微RNA纯化和定量RT-PCR表达分析按照生产商说明书，使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen)，从分选出的神经元、冰冻脑钻取物(brain punch)和血浆分离mRNA，包括微RNA，使用miScript反转录试剂盒miRNA处理以产生cDNA。然后在AB 7500热循环仪(Applied Biosystems)中，按照生产商准则使用SYBR®
Green PCR试剂盒(Qiagen)，分析cDNA样品。每种miR的特异性引物与商品化通用引物一同使用，同时U6 snRNA用作内部对照。
[0488] 表1B：用于实时PCR的引物序列基因 引物序列 SEQ ID NO.
miR135a TATGGCTTTTTATTCCTATGTGA 1
miR135b TATGGCTTTTCATTCCTATGTGA 2
miR375 TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA 3
U6 GATGACACGCAAATTCGTGAA 4
miR124 TAAGGCACGCGGTGAATGCC 5
表1C：用于分子克隆的引物序列


miR135b过量表达病毒载体的克隆
用加入限制性内切酶AgeI位点的引物，通过PCR从小鼠基因组DNA扩增Pre-miR-135b，然后使pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI) Slc6a4化。在pGEM-T Easy测序和pGEM-T Easy和pEGFP载体(Clontech laboratories Inc.，Mountain View，CA)两者用AgeI消化后，使成熟前miR-135b序列与pEGFP载体连接以构建表达质粒pEGFP-miR-135b。之后，用BamHI和BsrGI切割pEGFP-miR-135b，同时用相同的酶切割pCSC-E/Syn-eGFP质粒，并且使miR-
135b-eGFP序列与pCSC-E/Syn连接以构建pCSC-eSNY-pre-miR-135b-eGFP质粒，该质粒通过限制性内切核酸酶分析和DNA测序证实。
[0489] 慢病毒载体的产生如前所述，在HEK293T细胞中通过瞬时转染产生重组慢病毒[Naldini L等，Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93:11382-8]。简单地说，在转染后48和72小时收获感染性慢病毒，通过0.45 μm小孔醋酸纤维素滤器过滤，并通过超速离心浓缩。
[0490] 慢病毒的大脑内注射为了提供对立体定位手术和慢病毒递送部位的精确控制，发明人使用计算机导向立体定位仪和电动纳米注射器(motorized nanoinjector) (Angle TwoTM Stereotaxic Instrument，myNeurolab)。如前所述[Singer O.等, Nat Neurosci (2005).8, 1343-9]，将小鼠在全身麻醉下放在立体定位仪上，按照Franklin和Paxinos图集的定义确定坐标。使用与电动纳米注射器系统连接的Hamilton注射器递送慢病毒制品，以每分钟0.2 μl的速率注射溶液。在两周恢复期后，对小鼠进行行为和生理研究，之后麻醉，并用磷酸盐缓冲的4%低聚甲醛灌注。将固定脑连续切成30 μ切片，以利用免疫组织化学证实注射部位的准确性。
[0491] 免疫组织化学如前所述，进行用于免疫组织化学的方法[Chen A等, J Neurosci (2006) 26: 5500-
10]。对于GFP免疫染色，发明人使用在兔中产生的生物素化抗GFP抗体作为第一抗体(Abcam，Cambridge，UK)，链霉抗生物素缀合的Cy2作为第二抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA)。
[0492] 行为评估在每个试验之前，在习惯试验室2小时后，进行所有的行为评估。
[0493] 悬尾试验在TSE悬尾监测仪(TSE Systems, Bad Homburg, Germany)中进行悬尾试验。用带子捆住每只小鼠尾，从力传感器上悬挂10分钟。根据预设置的阈值，通过软件计算并记录不活动所花时间和挣扎所花时间。
[0494] 改良强迫游泳试验如前所述，进行悬尾试验[Krishnan V和Nestler EJ，Nature (2008) 455：894-902]。
简而言之，所用装置是塑料水桶，直径为18 cm，装入25℃水至15 cm深度。将各小鼠放入塑料水桶的中央，开始6分钟视频记录的试验阶段。采用EtoVision XT (Noldus，Wageningen，Netherlands)，在测试的2-6分钟内为不活动所花持续时间自动评分。
[0495] 自主活动能力为了控制产生于步行运动差异的行为效果的可能性，在48小时期内检查小鼠的自主活动能力，这之前习惯几天。把小鼠单只关养在专门的养育笼中，并采用InfraMot系统(TSE Systems, Bad Hamburg, Germany)测量运动。
[0496] 统计分析数据表示为均值+/-SEM。为了检验统计显著性，在其中只比较两组的情况下，例如在微阵列验证qPCR间，应用斯氏t检验。应用单因素ANOVA，对例如萤光素酶测定中不同处理间的多个组进行比较。在2个独立变量的情况下，例如在急性和慢性两个期间的SSRI NRI注射，采用两因素ANOVA。当需要显示统计显著性时，应用事后t检验。当P < 0.05时，组间的差异被视为显著。
[0497] 结果从ePET YFP胚胎的RN分离5HT神经元，使用miR微阵列，将其miR表达概况与获自同一核的非5HT神经元进行比较(图1A)。发现14种miR增量调节，且5HT神经元中27种减量调节是非
5HT神经元的2倍(参见下表2A-B)。对于在5HT神经元中增量调节的miR例如miR-375 (P=
0.0071；图1B)和减量调节的miR例如miR-135a (P=0.0075；图1C)，采用实时PCR进行了阵列结果的代表性验证。为了进一步研究miR作为5HT神经元的调节剂的作用，以假设驱动方式进行了广泛的生物信息学分析。之前显示与精神病理学有关的已知5-羟色胺相关基因的靶向预测与微阵列结果交叉。选择下列在RN的5HT神经元中表达的4种蛋白质编码靶基因用于测试：负责5HT重摄取的5-羟色胺转运蛋白(亦称SERT或Slc6a4)；5-羟色胺抑制性受体1a (亦称Htr1a)；脑中5HT合成的限速酶色氨酸羟化酶2 (Tph2)和使5HT钝化的单胺羟化酶(MaoA)。应用2种不同的基于网络的算法，进行了这些基因的微RNA靶向预测：Target Scan [www(dot)targetscan(dot)org]和Miranda [www(dot)microrna(dot)org]，并且同与非-
5RH细胞相比在5HT神经元miR阵列中变化达至少± 1.5的91种miR列表交集。根据miR阵列数据和生物信息学分析，选择8种miR用于进一步的体外研究(图1D-G)。
[0498] 表2A：与非5-羟色胺能相比在5HT神经元中增量调节的miR的列表(2倍以上)。微RNA名称 倍数变化
mmu-miR-375 20.72
mmu-miR-376c 11.73
mmu-miR-7a 4.44
mmu-miR-137 2.87
mghv-miR-M1-2 2.79
mmu-miR-709 2.61
mmu-miR-291b-5p 2.51
mmu-miR-1224 2.40
mmu-miR-1892 2.37
mmu-miR-702 2.31
mmu-miR-139-3p 2.25
mmu-miR-762 2.24
mmu-miR-671-5p 2.10
mmu-miR-483* 2.04
[0499] 表2B：与非5-羟色胺能相比在5HT神经元中减量调节的miR的列表(2倍以上)。微RNA名称 倍数变化
mmu-miR-691 -5.10
mmu-miR-466l -4.11
mmu-miR-17 -3.95
mmu-miR-376b -3.18
mmu-miR-124 -3.13
mmu-miR-218 -3.08
mmu-miR-128 -2.99
mmu-miR-140* -2.92
mmu-miR-148a -2.86
mmu-miR-340-5p -2.86
mmu-miR-181c -2.82
mmu-miR-210 -2.72
mmu-miR-135a -2.69
mmu-miR-27a -2.66
mmu-miR-452 -2.45
mmu-miR-370 -2.20
mmu-miR-300 -2.19
mmu-miR-376a -2.17
mmu-miR-127 -2.13
mmu-miR-15b -2.12
mmu-miR-101a -2.07
mmu-miR-16 -2.06
mmu-miR-324-5p -2.05
mmu-miR-434-5p -2.05
mmu-miR-92a -2.03
mmu-miR-669i -2.00
[0500] 进行了体外萤光素酶测定法以检测受测5HT相关基因的3’UTR和所预测的推定靶向它的miR之间的miR-靶标相互作用。发明人发现，Tph2 3'UTR被miR-27b (P = 0.0051)和miR-181C (P = 0.0305，图1H)轻微抑制(约20%)，MaoA 3'UTR也被miR-27b抑制(P = 0.0008，图1I)。Slc6a4 3'UTR (图2A和2C)和Htr1a 3'UTR (图2B和2D)的miR-135打靶导致这些转录物的翻译被强抑制。虽然miR-135a导致Slc6a4  (P = 0.014)和Htr1a (P < 
0.0001)约30%抑制，但miR-135b引起Slc6a4 (P = 0.0002)和Htr1a (P < 0.0001)约50%抑制。另外通过miR-335 (P<0.0001)、miR-181c (P=0.0029)和miR-26a (P<0.0001，图2D)产生Htr1a 3'UTR的显著抑制。更多的基因组方法生物信息学分析显示slc6a4 3'UTR中miR-
135种子匹配(图2E)和Htr1a 3'UTR中2个已鉴定的种子匹配之一(图2F)的强保守性。
Slc6a4转录物3’UTR中的突变(其除去了miR-135的miR种子匹配)研究显示，通过其种子匹配序列介导Slc6a4的miR-135a和miR-135b打靶两者。由miR-135诱导的抑制被Slc6a4 3'UTR的突变完全阻断(图2G)。单独或同时使Htr1a miR-135种子匹配突变显示，miR-135a通过远端且非近端的种子匹配抑制Htr1a 3'UTR，而miR-135b通过两个预测的位点起作用(图
2H)。
[0501] 发明人进一步测试了在不同的环境攻击或药物治疗后RN-miR-135表达体内的调节。在操控小鼠(即急性制动应激)后，取出RN，提取RNA，采用实时PCR测试miR-135水平。由于已知通过急性应激使5HT水平处于警戒状态，发明人测试了在急性约束应激后不同时间点的miR-135水平，并且发现在急性应激后90分钟miR-135a和miR-135b两者减量调节(P < 0.0001)。与对照小鼠相比，这些miR水平的降低在应激后24小时仍保持(对于miR-135a，P = 
0.0357，图3A；对于miR-135b，P=0.0055，图3B)。此外，由于已知在抑郁患者和在抗抑郁药施药后5HT神经元功能及Slc6a4和Htr1a表达水平受强烈影响，因此发明人测试了暴露于用于诱导抑郁样行为的环境模型(慢性社交失败模型)和三环类抗抑郁药丙米嗪的小鼠中两种miR变体的水平。引人关注的是，慢性社交失败应激不改变中缝核中的miR-135水平，然而，在受应激和未受应激的小鼠两者中，急性或慢性给予丙米嗪增加RN中的miR-135a (P=
0.003；图3C)和miR-135b (P=0.0093；图3D)表达水平。由于丙米嗪不是特异性5HT重摄取抑制剂，因此发明人进一步测试了急性和慢性选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)氟西汀和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)瑞波西汀两者的影响，并发现在急性和慢性SSRI治疗后miR-135a水平的稳固升高(P<0.0001，图3E)，但RN中的miR-135b水平则不(图3F)。
[0502] 为了进一步探索miR-135水平在整个动物背景下的重要性，发明人操作体内特别是成年小鼠RN中的miR-135水平，并测试了其对小鼠抑郁样行为的作用。为此，发明人使用也在GFP报道分子中共表达的增强型突触蛋白启动子，构建了在神经元中特异性过量表达miR-135b的重组慢病毒(参见上文的材料与实验方法部分和图4A)。发明人通过将其注射到成年小鼠的RN中，对慢病毒进行了体内测试，并与对照慢病毒注射小鼠RN中的miR-135b水平进行了比较。miR-135b水平的实时PCR分析显示与对照慢病毒注射小鼠相比的10倍诱导(P=0.0032，图4B)。将用miR-135b过量表达注射的成年小鼠暴露于慢性社交失败，以开始抑郁样行为，随后进行行为测试。在行为测试后，给小鼠灌注，针对注射部位的位置对脑进行分析(图4C-D)。RN miR-135过量表达小鼠显示在强迫游泳中(P=0.0088在第3分钟内，P=0.00330对于第4分钟；图4E)和在悬尾试验中(P=0.07356在试验的最后5分钟内，图4F)不活动时间减少，而无任何所观察到的在其养育笼运动中的变化(图4G-H)，表明了miR-135过量表达的抗抑郁作用。
[0503] 总之，本发明人测定了RN 5-羟色胺能和非5-羟色胺能神经元的特异性miR表达指纹。本发明人将该独特的数据集与5HT相关基因的miR打靶的生物信息学预测交集。本发明人采用3’UTR萤光素酶测定并且在突变研究中体外测试了Tph2、MaoA、Slc6a4和Htr1a的靶向预测，揭示了除miR-靶标相互作用以外，miR-135对Sl6a4和Htr1a 3’UTR两者的强抑制作用。最后，本发明人显示，成年小鼠RN中miR-135的位点特异性过量表达导致社交失败后抑郁样行为减少。
[0504] 实施例2miR-19特异性靶向1型β肾上腺素能受体(Adrb1)
材料与实验方法
将3' UTR克隆至Psicheck2萤光素酶表达质粒中
从小鼠基因组DNA中PCR扩增ADRb1的3'UTR序列。缺乏所有4个miR-19种子匹配的突变的3' UTR序列由Epoch Biolabs, Inc. (TX，USA)合成。按照生产商准则，使3'UTR PCR片段与pGEM-T easy载体(Promega)连接，并进一步亚克隆至Psicheck2报道质粒(Promega)中萤光素酶3'端的单一NotI位点中。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0505] 转染和萤光素酶测定使HEK293T细胞或HT22神经元细胞以48孔形式在聚L-赖氨酸上生长至70-85%汇合，并用下列质粒使用聚乙烯亚胺转染：Psicheck2-3'UTR质粒、pEGFP质粒中的前-mmu-miR-19b过量表达或仅pEGFP质粒(clontech)、miR-19b敲减(KD)质粒(Genecopoeia)或对照-KD质粒(Genecopoeia)。在转染后24小时，使细胞溶解，并如前所述测定萤光素酶报道分子活性[Chen A.等, Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]。使海肾萤光素酶值归一化至对照萤火虫萤光素酶水平(从同一载体转录，但不受所测3'UTR影响)，对每个条件的6孔重复取平均。
[0506] 结果在其3'UTR含有若干重复序列的具有不同的进化保守的miRNA靶序列的应激相关基因的生物信息学分析显示miR-19为用于1型β肾上腺素能受体(Adrb1)打靶的有力备选物，其在Adrb1 3'UTR上具有3个极保守和1个不太保守的miR-19种子匹配。Adrb1是在不同的脑区(包括杏仁核、海马和室旁核(PVN))表达的肾上腺素能受体。如前所述杏仁核的Adrb1影响焦虑样行为[Fu A等, Brain Res (2008) 1211: 85-92；Rudoy CA和Van Bockstaele EJ, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2007) 31: 1119-29]和恐惧记忆[Roozendaal B等，J Neurosci (2004) 24：8161-9；Roozendaal B等，Neuroscience (2006) 138：901-10]。引人注意的是，Adrb1存在于杏仁核的CRF阳性细胞中，并且是通过进一步激活腺苷酸环化酶(AC)的G发挥其作用的G蛋白偶联受体(GPCR)。有10个已知的编码AC的基因，即ADCY1-10。这些中的3个(ADCY1、ADCY7和ADCY9)在生物信息学上预测为被miR-19打靶。ADCY1具有脑特异性表达，并且之前显示ADCY1在小鼠前脑中的过量表达增强再认记忆和LTP [Wang H等，Nat Neurosci (2004) 7：635-42]。
[0507] 为了研究miR-19是否的确通过其在Adrb1-3'UTR或ADCY1-3’UTR上的假定靶序列调节Adrb1或ADCY1表达，将Adrb1-3'UTR (图5)或ADCY1-3’UTR的完整或突变形式克隆在Psicheck2表达质粒萤光素酶基因的下游。在ADRb1-3'UTR的突变形式中，缺乏miR-19b的全部4个种子匹配(图5)。在部分ADCY1-3'UTR的突变形式中，只是缺乏保守的种子匹配(3个之一)。
[0508] 采用萤光素酶测定法测定miR-19和Adrb1-3'UTR之间以及miR-19和ADCY1-3’UTR之间的相互作用的性质。在内源表达低水平的miR-19的HT22细胞中，在由ADRb1-3’UTR的完整或突变形式控制的萤光素酶水平间未观察到差异(图6A)。然而，当miR-19b在HT22细胞中过量表达时，萤光素酶水平在由完整形式驱动时显著(约2倍)低于ADRb1-3’UTR的突变形式(归一化萤光素酶表达的普遍的似乎非特异性降低除外) (图6B)。在内源表达高水平的miR-19b的HEK293T细胞中，受ADRb1-3’UTR调节的萤光素酶表达水平是ADRb1-3’UTR的突变形式调节时表达的1/2-1/4 (图6C)。
[0509] 采用miR敲减(KD)系统以操作HEK293T细胞中的miR-19水平。即，(1) miRCURY LNA KD探针(Exiqon，MA，USA，图6D)，和(2)基于敲减序列miArrest的质粒(Genecopoeia，Rockville，MD‏，USA，图6E)。相对于对照混杂KD探针，LNA-抗miR-19b提高在ADRb1-3’UTR的情况下调节时表达的萤光素酶水平约20%，并且对ADRb1-3’UTR的突变形式没有作用(图6D)。而基于miR-19b KD的质粒，引起相对于对照KD序列受ADRb1-3’UTR的完整形式调节而表达的萤光素酶高达2倍的提高(图6E)。由ADRb1-3’UTR的突变体形式驱动的水平，未实现萤光素酶水平的完全拯救。这可通过如下解释：探针/基因组序列的miR-19b特异性(省去(spearing) miR-19a调节)，可能难以完全减量调节的HEK293T细胞中的高miR-19水平，或可与ADRb1-3’UTR中相同种子匹配序列结合的HEK293T细胞中表达的其它可能的miRNA的作用。
[0510] 实施例3A在慢性应激后miR-19a和miR-19b在PFC和杏仁核中增量调节
材料与实验方法
动物和饲养
使miR 17 92 flx/flx小鼠[Ventura A等, Cell (2008) 7;132(5):875-86]与
~
CamKIIa-Cre小鼠[Dragatsis I等, Genesis. (2000) 26(2):133-5]杂交。在颠倒的12小时光/暗周期下，将转基因小鼠或成年C57BL/6J雄性小鼠关养在受控温度室(22 ± 1℃)中。食物和水可任意获得。所有实验方案均获魏茨曼科学研究所机构动物管理和使用委员会批准。
[0511] 产生用于成年脑中的miR-19b操作的慢病毒将miR-19b KD序列在RNA聚合酶III-H1启动子后克隆至慢病毒质粒中。另外，将Pre-miR-19b序列在神经元特异性启动子(增强型突触蛋白，ESyn)克隆到慢病毒质粒中。产生用于体内miR-19b-KD和Pre-miR-19b-过量表达(OE)实验的慢病毒。使用这些慢病毒操作靶区的miR-19b水平，发现所述靶区中的miR-19水平在行为/药物攻击后改变。
[0512] 产生前脑中没有miR-19的小鼠为了产生前脑中没有miR-19的小鼠，发明人饲养携带编码在CamKIIa启动子下的Cre重组酶的基因的小鼠与携带miR簇miR17 92的条件形式的小鼠。miR-19家族包括miR-19a和~
miR-19b。在小鼠中，基因组miR-19b具有2个相同的拷贝miR-19b-1和miR-19b-2。miR19a和miR-19b-1位于相同的miRNA簇即miR17 92中，而miR-19b-2位于不同的基因组基因座~
miR106a 363中。后者似乎在小鼠组织中几乎没有或没有表达，因此预期miR17 92簇的敲除~ ~
足以能够对前脑中的miR-19a和miR-19b表达水平产生重大作用。
[0513] 行为/药物攻击可针对ADRb1、ADCY1和其它转录物和基因产物的表达水平，对前脑中缺乏miR-17 92簇~
的小鼠，或其中miR-19被特异性操作(在特定脑区过量表达或减量调节(KD))的小鼠进行检查。还可针对焦虑样行为、自主活动能力和记忆特性，对这些动物进行测试。此外，在野生型小鼠中用去甲肾上腺素重摄取抑制剂瑞波西汀急性和慢性全身治疗后，检查了不同的目标区的miR-19a和miR-19b的表达水平(例如海马、杏仁核和前脑)。
[0514] 结果通过评价急性或慢性注射瑞波西汀(一种去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI))的小鼠额叶前皮质(PFC)中miR-19a/b的水平，研究了miRNA-19和Adrb1间的生理联系(图12A-D)。如图12A-D所示，miR-19 a/b水平在急性给予瑞波西汀后减量调节(图12A、B)，而在慢性给予瑞波西汀后增量调节(图12C、D)。
[0515] 接下来，通过测量遭受社交失败方案的小鼠PFC和杏仁核中miR-19 a和b的水平，评价了应激后miR-19的水平(图13A-D)。如图13A-D所示，miR-19 a和b的水平在慢性应激后在PFC和杏仁核两者中升高。这些结果说明，miR-19参与中枢应激反应的调节。
[0516] 实施例3BmiRNA-19和大麻素受体1 (CB1)
材料与实验方法
动物和饲养
如上文实施例3A中所述。
[0517] 产生用于成年脑中miRNA-19b操作的慢病毒如上文实施例3A中所述。
[0518] 结果CB1是脑中最丰富表达的GPCR之一，并且在皮质、杏仁核、海马、基底核和小脑中特别丰富(图15A-B) [Herkenham M.等, The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience (1991) 11:563-583；Mackie, K. Handbook of experimental pharmacology (2005) 299-325]。CB1受体在其中明确定位以调节神经传递的轴突和轴突终末中高度表达。发明人发现，CB1含有与miRNA-19相容的2种子位点。
[0519] 采用萤光素酶测定法，测定miRNA-19和CB1-3'UTR之间的相互作用的性质。当miRNA-19b在HT22细胞中与CB1的3`UTR一起过量表达时，与相同的3`UTR一起过量表达的GFP相比，萤光素酶水平显著(50%)较低(图14)，这支持miR-19在CB1水平调节中的可能作用。进行了其它突变实验以证实预测的miR-19种子序列对所观察的调节的作用(如上文对Adrb1的描述)。
[0520] 引人关注的是，之前的研究令人信服的表明，厌恶记忆的巩固被基底外侧杏仁核(BLA)中糖皮质激素、去甲肾上腺素能和大麻素信号转导间的相互作用促进[Roozendaal, B.等, Neurobiology of learning and memory (2006) 86:249-255]。由Hill和McEwen提出的模型[Hill M.N.和McEwen B.S. Proc of the Nat Acad of Sci of the USA (2009) 106:4579-4580]显示在BLA中用于记忆巩固可能的作用机制(图16)。
[0521] 如本发明结果所示，miRNA-19显得体外调节Adrb1和CB1两者。使用例如特异性递送至可能改变Adrb1和CB1水平的BLA中的慢病毒，实施了miR-19的过量表达和敲减，以及检查小鼠在暴露和未暴露于应激性攻击下的学习和记忆范例(例如恐惧条件)的行为的试验。
[0522] 实施例3C经历慢性应激的小鼠中差异表达的miRNA的鉴定
材料与实验方法
Ago2蛋白的免疫沉淀
将来自是同组(“敏感的”、“适应性强的”或对照)一部分的3只动物的3份杏仁核的合并物在补充RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和磷酸抑制剂的NP40缓冲液中匀浆。将样品在4℃下保持连续搅拌2小时。然后将样品在微量离心机中在4℃下以12,000 rpm离心20分钟，将上清液放入保持在冰上的新的管中，弃去沉淀。使磁性G蛋白珠粒(Dynabeads，Invitrogen)与Ago2单克隆抗体(WAKO)一起在室温下旋转温育10分钟。在几次洗涤后，将样品加入Ago2包被的G蛋白珠粒中，并在4℃下在搅拌中温育过夜。次日，将珠粒用PBS洗涤3次。对于RNA纯化，将珠粒在RLT缓冲液(RNeasy试剂盒，miRNA补充方案)中匀浆。对于蛋白质印迹分析，将珠粒在样品缓冲液中煮沸以从珠粒中释放蛋白质。
[0523] RNA纯化和微阵列按照Qiagen补充方案1：含有miRNA的总RNA的纯化，使用RNeasy plus试剂盒(Qiagen)，从Ago2免疫沉淀样品中分离RNA。按照生产商的建议，使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen)，从冰冻脑钻取物中分离RNA用于其它所有目的，并采用Agilent 2100生物分析仪，评价RNA完整性。在Affymetrix miRNA 2.0阵列(富集RNA方案)和Affymetrix小鼠基因1.0 ST阵列中，进一步分析了在Ago2免疫沉淀后来源于应激小鼠组织的RNA。
[0524] 结果为了鉴定和研究从经历慢性应激的小鼠范例和/或与“适应性强的”或“敏感的”行为表型有关的杏仁核中分离的差异表达的miRNA，采用社交失败方案(参见方法部分)。
[0525] 为了鉴定在社交失败范例后miRNA及其靶基因的3` UTR之间的真实联系，进行了Ago2复合物的免疫沉淀(IP)，分析了共沉淀的miRNA和mRNA群。当形成成熟的miRNA时，它掺入RISC复合物中。在RISC复合物中期间，Ago2促进特定miRNA及其靶标mRNA 3` UTR的相互作用[Meister G.等, Molecular cell (2004) 15:185-197] (图17A)。
[0526] 为了证实Ago2复合物确实可与其结合的RNA沉淀，在幼稚小鼠的杏仁核上进行了IP。使用与单克隆Ago2抗体反应的G蛋白磁珠进行IP。如图17B所示，特定的Ago2条带从NIH 3T3细胞的提取物(图17B，泳道1)或杏仁核组织的提取物(图17B，泳道2)中沉淀。
[0527] 为了证实IP的特异性，将全脑样品分成2份，其中一份与抗Ago2一起沉淀，另一份与对照IgG1非特异性抗体一起沉淀。特异性Ago2条带只存在于Ago2沉淀物中(图17B，泳道3，4)。
[0528] 因此，通过牵出Ago2复合物，并且分析沉淀物质中的miRNA以及mRNA群，有较大机会发现特定脑区中指定miRNA及其靶定mRNA 3` UTR之间的正确关系。
[0529] 从经历社交失败范例的小鼠杏仁核中分离Ago 2相关的RNA接下来，根据Ago2 IP实验的具体结果，执行相同策略以揭示经历社交失败方案的小鼠脑中的miRNA及其靶标mRNA的可能差异。
[0530] 在社交失败范例10天后，将小鼠分成3组：对照、“敏感的”和“适应性强的”。在当小鼠在社交失败范例期间遇到攻击它的来自相同品系的新的小鼠时显示社交回避时，小鼠被称为“敏感的”。如果小鼠不回避新的攻击性小鼠并且与之互动，则小鼠称为“适应性强的”。大多数经历社交失败的小鼠通常显示社交回避，因此可被归类为“敏感的”。预期实验中约仅10-20%的小鼠是“适应性强的”的。下文显示所进行的社交回避试验的实例。
[0531] 如图18A所示，把小鼠单独放入社交迷宫中习惯3分钟。摄象机跟踪整个迷宫中的小鼠运动。在图18C中，使同一小鼠暴露于放在隔板另一边的新的ICR小鼠。摄象机跟踪到远离新小鼠的位置的活动场地的最远角落的小鼠。这种反应被视为社交回避，因此这种小鼠被归类为“敏感的”。相比之下，在图18B和图18D中，小鼠不显示社交回避，因此被归类为“适应性强的”。
[0532] 40只小鼠经历社交失败范例，40只小鼠用作对照。在社交回避试验后，选择9只“适应性强的”小鼠，9只“敏感的”小鼠和12只对照小鼠用于脑显微切割。除躯干血外，在社交回避试验后8天从杏仁核、BNST、PFC、中缝背核(中缝背核)和海马中收集脑样品。
[0533] 将从3只不同小鼠获得的3个杏仁核钻取物的合并物混合，并进行与抗Ago2一起的免疫沉淀。在IP后，从沉淀的物质中提取RNA。在从各组中取出3个杏仁核后，有3个RNA样品来自“适应性强的”小鼠，有3个RNA样品来自“敏感的”小鼠，有4个RNA样品来自对照小鼠—共总10个RNA样品。在小鼠ST微阵列以及miRNA阵列(两者均为Affymetrix)中测试各个样品。检查以下2组的每个中增量或减量调节的基因和miRNA：“敏感的”或“适应性强的”相对于对照组。如果某种miRNA和靶基因之间发生相互作用，则发明人预期在其总水平上为对立关系。然而，预期存在于RISC复合物(与抗Ago2一起沉淀)中的mRNA处于高水平，因为它们尚未被切成片段，因此在评判阵列数据时，发明人检查了相对于对照样品两者均升高或减量调节的miRNA和潜在mRNA靶标，因为这表明它们在RISC复合物中相互作用。
[0534] 微阵列结果下表3说明使用常规滤器分析的初步阵列结果。
[0535] 表3A-B：在与Ago2 IP后增量调节(表3A)或减量调节(表3B)的杏仁核miRNA的列表
(表3A)

(表3B)
*对于表3A-B两者，数据表示为与对照相比“敏感的”或“适应性强的”小鼠的倍数变化。
用黑体表示的值显著改变。
[0536] 选择在“敏感的”和“适应性强的”小鼠组中显著增量调节的几个miRNA，并在热点图中说明(参见图19A-B)。
[0537] 基因表达阵列(mRNA)表4：在与Ago2 IP后增量调节的杏仁核mRNA的列表



(续表4)
*数据表示为与对照相比“敏感的”或“适应性强的”小鼠的倍数变化。用黑体表示的值显著改变。
[0538] 表5：在与Ago2 IP后减量调节的杏仁核mRNA的列表
分析了脑中几种可能的miRNA及其推定靶标。
[0539] 实施例4A作为应激反应调节剂的miR-15a和miR-15b
材料与实验方法
总RNA提取
在急性应激过程后90分钟，解剖杏仁核组织。使用miRNeasy试剂盒(Qiagen)分离总RNA以保存miRNA。将冰冻脑钻取物转移到溶解缓冲液中，立即匀浆。将神经元原代培养物或N2a细胞培养物在冰上在孔中溶解。按照生产商建议，进行了进一步处理。将RNA提取物保存在-
80℃下备用。
[0540] miRNA阵列按照生产商说明书，通过Agilent (Agilent，Santa Clara，CA，USA)或Affymetrix (Affymetrix，Santa Clara，CA，USA) miRNA微阵列测定miRNA差异表达。为了评价使用Agilent阵列的miRNA差异表达，按照生产商说明书，将每个样品(3个对照样品和2个急性应激样品) 100 ng总RNA分别标记并杂交。使用Agilent微阵列扫描仪扫描阵列。应用Agilent Feature Extraction软件v9提取数据，并应用Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, Missouri, USA)分析。对来自GeneView.txt文件的数据进行log变换和分位数归一化。为了评价使用Affymetrix阵列的miRNA差异表达，按照生产商说明书，将1 µg总RNA/样品(2个对照样品和2个急性应激样品)分别标记并杂交。使用Affymetrix微阵列扫描仪扫描阵列。应用Affymetrix扫描仪软件提取数据，并使用Affymetrix miRNAQCtool软件的默认参数(背景调节、分位数归一化、log变换和阈值确定)归一化。将来自4个文件的归一化数据输入Partek Genomics软件。滤出不存在于任何微阵列中的基因。由于miRNA分布的差异所致，选择各阵列的不同log比截断值(相当于各阵列约1标准误差)：对于Agilent为
0.2，对于Affymetrix为0.4。比较阵列之间的log比大于截断值的miRNA，报告常见的miRNA。
[0541] 将3' UTR克隆至Psicheck2萤光素酶表达质粒中从小鼠基因组DNA中PCR扩增CRFR1的3'UTR序列。按照生产商准则，使3'UTR PCR片段与pGEM-T easy载体(Promega)连接，并进一步亚克隆至Psicheck2报道质粒(Promega)中萤光素酶3'端的单一NotI位点中。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0542] 转染和萤光素酶测定使HEK293T细胞以48孔形式在聚L-赖氨酸中生长至70-85%汇合，并用下列质粒使用聚乙烯亚胺转染：Psicheck2-3'UTR质粒、pEGFP质粒中的前-mmu-miR-15过量表达或仅pEGFP质粒(clontech)。在转染后24小时，将细胞溶解，并如前所述测定萤光素酶报道分子活性[Chen A.等, Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]。使海肾萤光素酶值归一化至对照萤火虫萤光素酶水平(从同一载体转录，但不受所测3'UTR影响)，对每个条件的6孔重复取平均。
[0543] 结果在急性约束应激后90分钟，miR-15a和miR-15b显现为增量调节(图7A-B)。以生物信息学方法预测miR-15a和miR-15b靶向CRFR1-3'UTR (图7C)。HEK293T细胞中miR-15b的体外过量表达显著降低受CRFR1-3'UTR控制的萤光素酶表达的水平(图7D)。
[0544] 实施例4BmiR15对FKBP5的作用
材料与实验方法
按上文实施例4A中的说明。
[0545] 结果按照阵列结果，相对于对照组，miR-15a和FK506结合蛋白5 (亦称FKBP5)两者均在“敏感的”和“适应性强的”小鼠中增量调节(图20A-B)，这表明由于慢性应激的结果它们以RISC复合物增量调节。
[0546] 遗传研究确立了FKBP5在创伤后应激障碍、抑郁症和焦虑症中的作用。例如，发现FKBP5中的单核苷酸多态性(SNP)与儿童期创伤相互影响以预测成年创伤后应激障碍(PTSD)的严重性[Binder, E.B.等, Nature genetics (2004) 36:1319-1325]。这些研究结果表明，童年时被虐待、具有这些SNP的个体在成年时对PTSD更敏感。发现在当前患有PTSD的个体中FKBP5较少表达[Yehuda，R.等，Biological psychiatry (2009) 66:708-711]。发现FKBP5基因具有多个多腺苷酸化位点，并且与较高比率的抑郁障碍在统计上关联[Binder等，同上]。
[0547] FKBP5的3` UTR的进一步分析显示，它具有miR-15的一个保守种子匹配序列(图20C)。
[0548] 如果miR-15a的确调节FKBP5 mRNA，则预期虽然miR-15a和FKBP5两者在Ago-2沉淀物中增量调节(如微阵列结果所示，图20B)，但杏仁核样品中FKBP5的mRNA或蛋白质的总水平应下降。
[0549] 为了检查miR-15a和FKBP5之间的相互作用是否发生在杏仁核中，对获自“敏感的”和对照小鼠杏仁核的总RNA样品进行了实时PCR分析。如图21A-B所示，取自敏感小鼠的总RNA提取物中miR-15a水平升高，而FKBP5水平降低。这些结果表明，在慢性应激条件后，miR-15a抑制杏仁核中的FKBP5水平。
[0550] 进行了FKBP5的完整和突变的3` UTR形式的克隆用于萤光素酶测定分析，以找出miR-15a和FKBP5间的直接相互作用是否在体外发生。
[0551] 除FKBP5以外，miR-15可能调节参与应激反应的多个基因，包括Stx1a (突触融合蛋白1a)、Sgk1 (血清/糖皮质激素调节激酶)和Adrb2 (图22)。
[0552] 实施例4CmiR-181调节谷氨酸受体
材料与实验方法
将3' UTR克隆至Psicheck2萤光素酶表达质粒中
从小鼠基因组DNA中PCR扩增Grm1、Grik3、Grm5、Grik2和Grm7的3'UTR序列。按照生产商准则，将3'UTR PCR片段连接至pGEM-T easy载体(Promega)或pJET1.2载体(Fermentas)中，并进一步亚克隆至Psicheck2报道质粒(Promega)的萤光素酶3'端处的单个NotI或XhoI位点。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0553] 慢性社交失败如前所述，对小鼠进行社交失败方案处理[Krishnan V.等, Cell (2007) 131: 391-
404]。简单地说，将小鼠放在攻击性ICR小鼠的养育笼中，它们在笼中在身体上互动5分钟。
在此期间，ICR小鼠攻击闯入小鼠，闯入者显露附属姿态。将穿孔的透明有机玻璃隔板放在动物之间，把小鼠留在同一笼中24小时以允许感官接触。然后在接下来的10天，每天用陌生ICR小鼠重复该过程。
[0554] 结果miR-181d水平在遭受慢性应激的小鼠中显著提高(图23)。为了找出miR-181和潜在mRNA靶标间的相互作用，发明人发现miR-181可能调节谷氨酸受体的许多类型。一般来说，可将谷氨酸受体分成2组，离子型谷氨酸受体(iGluR) (当谷氨酸与受体结合时形成激活的离子通道孔)和代谢型谷氨酸受体(mGluR) (通过包括G蛋白的信号转导级联间接激活质膜上的离子通道)。
[0555] 在谷氨酸受体的许多特定亚型中，习惯上将以比谷氨酸高的选择性与之结合的化学物质称为主要亚型。然而研究仍在继续，因为鉴定出亚型，并测量了化学亲和力。几种化合物常规用于谷氨酸受体研究中，并且与受体亚型缔合：表6：归类为亚类的谷氨酸受体

如图24和25所示，在miR-181的所有保守的预测靶标中，有6种谷氨酸受体(Grm1、Grik3、Grm5、Gria2、Grik2和Grm7)。
[0556] 之前已表明，miR-181a控制Gria2在海马神经元中的表面表达[Saba. R.等, Molecular and Cellular Biology (2012) 32(3):619-32]。进行了萤光素酶测定法，以验证miRNA-mRNA相互作用。此外，使条件性miR-181 KO小鼠系与特异性cre系杂交从而获得特定脑核中miR-181的缺失。
[0557] 实施例5AmiR-182，正常神经元活性和精神病理学行为的精细调谐器
材料与实验方法
将3' UTR克隆至Psicheck2萤光素酶表达质粒中
从小鼠基因组DNA中PCR扩增Htr1a的3'UTR序列。按照生产商准则，使3'UTR PCR片段与pGEM-T easy载体(Promega)连接，并进一步亚克隆至Psicheck2报道质粒(Promega)中萤光素酶3'端的单一NotI位点中。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0558] 转染和萤光素酶测定使HEK293T细胞以48孔形式在聚L-赖氨酸上生长至70-85%汇合，并用下列质粒使用聚乙烯亚胺转染：Psicheck2-3'UTR质粒、pEGFP质粒中的前-mmu-miR-182过量表达或仅pEGFP质粒(clontech)。在转染后24小时，使细胞溶解，并如前所述测定萤光素酶报道分子活性[Chen A.等, Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]。使海肾萤光素酶值归一化至对照萤火虫萤光素酶水平(从同一载体转录，但不受所测3'UTR影响)，对每个条件的6孔重复取平均。
[0559] 慢性社交失败如前所述，对小鼠进行社交失败方案处理[Krishnan V.等, Cell (2007) 131: 391-
404]。简单地说，将小鼠放到攻击性ICR小鼠的养育笼中，它们在笼中在身体上互动5分钟。
在此期间，ICR小鼠攻击闯入小鼠，闯入者显露附属姿态。穿孔的透明有机玻璃隔板放在动物之间，把小鼠留在同一笼中24小时以允许感官接触。然后在接下来的10天，每天用陌生ICR小鼠重复该过程。
[0560] 中缝核的显微切割和血浆收集在取出脑后，从小鼠中缝核(RN)提取脑样品，将脑样品放在丙烯酸酯类脑基质
(Stoelting)中。根据指定的解剖标记，使用标准刀片(GEM)取出切片。使用钝的14G注射器，从自基质取出的3 mm切片中提取RN区。
[0561] 微RNA纯化和定量RT-PCR表达分析按照生产商说明书，使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen)，从分选出的神经元、冰冻脑钻取物和血浆中分离mRNA，包括微RNA，使用miScript反转录试剂盒miRNA处理，以产生cDNA。然后在AB 7500热循环仪(Applied Biosystems)中，按照生产商准则，使用SYBR®Green PCR试剂盒(Qiagen)，分析cDNA样品。每种miR的特异性引物与商品化通用引物一同使用，同时U6 snRNA用作内部对照。
[0562] miR182过量表达病毒载体的克隆用加入限制性内切酶AgeI位点的引物，通过PCR从小鼠基因组DNA中扩增Pre-miR-182，然后使pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI) Slc6a4化。在pGEM-T Easy测序和pGEM-T Easy和pEGFP载体(Clontech laboratories Inc.，Mountain View，CA)两者用AgeI消化后，使成熟前miR-182序列与pEGFP载体连接以构建表达质粒pEGFP-miR-182。之后，用BamHI和BsrGI切割pEGFP-miR-182，同时相同的酶切割pCSC-E/Syn-eGFP质粒，使miR-182-eGFP序列与pCSC-E/Syn连接以构建pCSC-eSNY-pre-miR-182-eGFP质粒，该质粒通过限制性内切核酸酶分析和DNA测序证实。
[0563] 慢病毒载体的产生如前所述，在HEK293T细胞中通过瞬时转染产生重组慢病毒[Naldini L等，Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93:11382-8]。简单地说，在转染后48和72小时收获感染性慢病毒，通过0.45 μm小孔醋酸纤维素滤器过滤，并通过超速离心浓缩。
[0564] 结果迄今为止，主要在癌症相关研究(例如人肺腺癌细胞、神经胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤)和DNA修复中报告了miR-182。另外，发现miR-182参与发育过程(例如内耳和视网膜发育)、在免疫系统中参与T淋巴细胞的激活，并涉及狼疮疾病。在神经系统中，在感觉器官特异性大鼠背根神经节中包含mi-R182，并且作为昼夜节律钟调节剂，同时在重性抑郁症患者中发现pre-miR-182的遗传变体间的关系[Saus E等, Hum Mol Genet. (2010) 19(20):
4017-25]。另外，miR-182在12种miR中被列为在习得性无助行为适应性强的雄性大鼠额叶前皮质中减量调节[Smalheiser NR等，Int J Neuropsychopharmacol. (2011) 1-11]。
[0565] 作为5HT miR微阵列分析一部分进行的Htr1a 3'UTR的生物信息学分析意指该基因可能被miR-182打靶。因此，发明人通过萤光素酶测定法进行了体外测试，测试显示Ht1a 3'UTR被miR-182强抑制(图8)。miR-182的2个保守种子匹配序列出现在Htr1a小鼠3' UTR中。
[0566] 调节研究表明与对照相比，暴露于慢性社交失败的成年雄性小鼠RN中miR-182表达水平减量调节的极强趋势(图9)，这表明miR-182参与对已知诱导抑郁样行为的环境刺激物的分子反应。
[0567] 针对2个数据库中的miR-182产生靶向预测的进一步的生物信息学分析显示可能靶标的长的列表，包括在正常和病理条件下与神经元活性相关的基因(图10)。
[0568] 为了进一步测试miR-182体外用于鉴定特定miR靶标相互作用并揭示miR-182在体内调节正常和病理性行为中的作用，开发了用于miR-182操作的质粒和慢病毒系统。制备了神经元特异性过量表达慢病毒(图11A)，并且在神经元细胞系N2a中进行了体外测试。这些结果显示与对照相比，在用miR-182过量表达慢病毒感染的细胞中miR-182水平提高(图11B)。购买对miR-182有特异性的名为miArrest的敲减质粒序列(Genecopoeia，Rockville，MD‏，USA，图11C)，并亚克隆至病毒构建体中(图11C)。在细胞培养物测试这些系统，并通过位点特异性注射至成年小鼠脑中。
[0569] 开发了miR-12的失效小鼠以研究miR在视网膜发育中的作用。最近，发明人获得该系的育种配对，并且在产生集落时，在行为和生理上对miR-182 KO及其野生型同胞仔鼠进行了表型确定。
[0570] 实施例6通过急性应激调节miR182表达水平
材料与实验方法
如上文实施例5A中所述。
[0571] 结果检查了急性应激对miR182水平的作用。如图26所示，在应激诱导后24小时，急性制动应激导致小鼠中缝核(RN)中miR182表达水平降低(P<0.01)。miR182显示在急性和慢性应激两者后，中缝核中的表达水平降低，表明了可能通过影响其靶基因Ht1a调节突触中的5-HT水平，在中缝核中具有调节对应激的分子反应的作用。
[0572] 用于miR182预测靶基因的miR-靶标相互作用测定法采用萤光素酶测定法，检查了在广泛生物信息学研究后选择的11个miR182的预测靶基因(图27)。体外测试了靶基因的3'UTR以检查miR182是否具有抑制作用，通过缀合的报道基因萤光素酶的活性测量。11个受测基因中的3个基因：Dscam (唐氏综合征细胞粘附分子)、L1cam (细胞粘附分子L1)和Tsnax (易位蛋白相关蛋白X)表明由miR182引起的抑制作用，按照萤光素酶测定(图27)。在测试miR182的上列靶基因的3'UTR时，在Tsnax、L1cam和Dscam中观察到miR182的保守种子匹配序列，这表明这种miR-靶标相互作用具有功能性作用(数据未显示)。
[0573] 接下来，证实了miR182对这3个基因的直接抑制作用。因此，使3'UTR突变以除去miR182种子匹配序列，并通过萤光素酶测定法体外将正常3'UTR与突变3'UTR进行了比较。当使其种子匹配序列突变时，破坏了miR182对L1cam 3'UTR的抑制作用(图28)，同样在突变的3'UTR中破坏miR182对Tsnax的作用(图29)，表明了miR182直接靶向该基因。进行了用突变的3'UTR针对Dscam和Htr1a的类似验证。
[0574] 使用没有miR182的小鼠模型以研究体内miR182及其靶基因之间的相互作用。发明人在试验中针对社交行为、学习与记忆和精神分裂症样行为检查了miR182KO小鼠的行为表型。
[0575] 实施例7miR135敲减系统的建立；克隆、慢病毒产生和体外和体内验证
材料与实验方法
miR135 KD病毒载体的克隆
miR135b KD质粒pEZX-H1-miR135KD-CMV-mCherry和对照pEZX-H1-对照KD-CMV-
mCherry购自GeneCopeia (USA)。H1启动子和KD序列使用侧接NheI位点的引物扩增，并连接至pGEM-T Easy中。在pGEM-T Easy测序和具有NheI位点的pGEM-T Easy和p156-pRRL-CMV-GFP消化后，使H1-KD miR和带切口的p156连接以产生p156-pRRL-H1-miR135bKD-CMV-GFP和p156-pRRL-H1-对照KD-CMV-GFP。
[0576] 结果为了评价RN中miR135水平降低对小鼠5-HT相关行为的作用，使用基于质粒的miR135b抑制剂，在萤光素酶测定法中测试其效率。在该测定法中，将HEK293T细胞用miR135OE、miR135KD和3'UTR质粒共转染，并测试了miR135bKD质粒阻断miR135对Slc6a4和Htr1a 3' UTR的抑制性作用的能力。Htr1a 3'UTR的miR135b抑制作用被miR135KD质粒阻断(图30A)。
同样，miR135b对Slac6a4 3'UTR的作用被miR135KD阻断(图30B)。这些结果表明，miR135KD质粒的确阻断miR135的生物活性。
[0577] 将miR135KD序列和对照序列亚克隆至病毒载体中(图30C)，并产生表达不同敲减(KD)序列的慢病毒。为了测试慢病毒感染脑组织的能力，将小鼠RN用慢病毒之一感染。实际上，感染引起GFP表达(图30D-E)，表明了miR135bKD慢病毒感染脑组织的能力。
[0578] 实施例8成年小鼠RN中miR135敲减的行为效果
材料与实验方法
行为评估
如上文实施例6所述，采用用于焦虑和抑郁样行为的试验，在行为上对小鼠进行表征。
[0579] 结果在miR135KD慢病毒的体外和体内验证后，使用慢病毒操作RN中的miR135水平，并测试其对小鼠行为的作用。给成年小鼠注射miR135KD慢病毒，或将KD对照慢病毒注射到RN中，在恢复期后测试焦虑和抑郁样行为。由于miR135抑制5-HT的负调节剂，我们预期miR135KD导致突触中5-HT水平降低，并以此导致焦虑和抑郁样行为增加。
[0580] 在旷场试验中，观察到组间无差异(图31A)，然而在高架十字迷宫试验中，miR135KD小鼠通过表明在开放臂中花较少时间(P=0.0644)和到访开放臂较少次数(P=0.0572，图31B)的倾向，显示较高的焦虑样行为。另外，miR135KD小鼠在开放臂中行走显著较小的距离(P=0.0433)，并具有在开放臂中到访较久的倾向(P=0.0124，图31B)。同样，在基础应激条件下进行的光/暗试验中，与对照相比，通过在光中花较少时间(P=0.0454，图
31C)，在明室中到访较少时间(P=0.0107，图31D)和在明室行走较短距离(P=0.0402s，图
31E)，miR135KD小鼠显示焦虑样行为显著增加。结果表明在急性应激后40分钟和24小时miR135水平降低(图30A-B)，因此，本发明的理论是当在急性应激后测试时，经应激的miR135KD小鼠在焦虑样行为方面与其对照无不同，因为对照小鼠可因应激所致具有低的miR135水平。实际上，当在明暗转移试验中再测试时，在急性应激后40分钟或24小时测试时，任何参数在组间均无差异(图31C-E)。
[0581] 即在基础条件下又在药物操作后，测试了miR135KD的抑郁样行为。由于显示miR135水平在给予SSRI后在RN升高(图31E)，因此推测miR135水平的降低可导致对SSRI反应降低。在基础水平和在SSRI给药后进行的悬尾试验中，在miR135b KD小鼠和对照KD小鼠之间在不活动时间上没有差异(图31F)，并观察到由于SSRI治疗所致不活动时间的预期减少(P<0.0008)。然而，在强迫游泳试验中，除了SSRI注射的主要作用以外(P<0.0001)，与对照KD小鼠相比，注射SSRI的miR135KD小鼠在试验的最后2分钟更不活动(P=0.0141 5分钟，P=0.0404 6分钟；图31G表明通过降低RN中的miR135水平减少SSRI抗抑郁作用)。这个结果意味着miR135是导致由SSRI引起的行为改变的内源替代的一部分。
[0582] 实施例95-HT神经元中的miR135过量表达
材料与实验方法
在miR135及其靶基因的表达水平和在行为方面，将在5-HT神经元中过量表达miR135a的小鼠与其同胞仔鼠对照进行了比较。
[0583] 结果针对焦虑和抑郁样行为，测试了在小鼠RN的5-HT神经元中特异性操作miR135水平的作用。为此，采用Cre-loxP系统，开发了一个遗传系统。准确地讲，使用在5-HT RN阳性神经元中特异性表达Cre重组酶的ePet Cre小鼠获得5-HT特异性，并通过使5-HT特异性Cre系(ePet Cre)与有条件的过量表达miR135a的转基因小鼠系杂交(图32)，来进行miR135过量表达。
[0584] 通过miR135的实时PCR，测试了在5-HT神经元中特异性过量表达miR135的小鼠(miR135OE) RN中的miR135表达水平，并与对照小鼠(对miR135有条件的过量表达等位基因阳性但对ePet CRE阴性)进行了比较。与对照小鼠相比，miR135OE小鼠显示近2倍过量表达(图33A；P<0.05)。miR135的过量表达水平类似于在给予SSRI后小鼠RN中测量的水平，表明了该小鼠系是用于研究miR135抗抑郁性质的良好模型。另外，与对照相比，miR135靶基因mRNA，Slc6a4 (图33B；P<0.05)和Htr1a (图33C；P<0.1)在miR135OE小鼠的RN中减量调节，表明其靶基因在体内被miR135抑制。
[0585] 为了测试在5-HT神经元中特异性过量表达的miR135，将miR135OE小鼠及其同胞仔鼠对照暴露于慢性社交失败范例，一种已知诱导抑郁和焦虑样行为的方法，随后测试焦虑和抑郁样行为。
[0586] 与对照同胞仔鼠相比，miR135OE小鼠显示在社交失败后焦虑样行为增加。在旷场中，根据到中心的时间和到访次数，在miR135OE小鼠中观察到焦虑加强的倾向(P<0.1，图34A)。然而在明暗转移试验中，miR 135OE小鼠在光下渡过较多时间(P<0.05，图34B)，在明室花较少时间(P<0.01，图34B)。在高架十字迷宫中观察到类似结果(P<0.05，图34B)，同时miR135OE小鼠在开放臂中花较多时间(P<0.05，图34C)，在开放臂中行走较长距离(P<0.05，图34C)。
[0587] miR135OE小鼠在社交失败后的抑郁样行为低于对照同胞仔鼠。在悬尾试验中观察到与对照相比miR135OE小鼠趋于不活动时间减少的倾向(P<0.1，图34D)，以及在强迫游泳试验中不活动时间显著减少(P<0.05，图34E)。
[0588] 用于MIR-135 SECTION的材料与实验方法5HT神经元的微RNA微阵列
如前所述(Wylie等，2010)，对来自ePet-EYFP小鼠胚期第12天的后脑细胞进行FACS分选以将5HT YFP阳性神经元与周围的非5HT YFP阴性细胞区分开来。将具有来自各细胞类型的3个生物重复序列的总RNA (包括miRNA群)纯化，标记，并按照生产商说明书在基于Sanger miRBase 12.0版的Agilent Mouse miRNA Microarray  (Agilent Tech，
Mississauga，ON，Canada)设计编号021828上杂交。扫描微阵列，提取数据，并应用Feature Extraction Software (Agilent Technologies)处理。在扫描后，应用Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, MO)，对GeneView.txt文件的强度输出数据进行分析，使微RNA的差异性相对表达量化。对数据进行log2变换，进行分位数归一化，并按照基因View文件中的标记“gIsGeneDetected”过滤。666种鼠miR中，在该过滤步骤后保留198种用于进一步的分析。然后使用1.5倍变化的阈值鉴定差异表达的miR。
[0589] 将靶转录物3' UTR克隆至psiCHEK-2萤光素酶表达质粒中从小鼠基因组DNA中PCR扩增Slc6a4和Htr1a的3' UTR序列。按照生产商准则，使3'UTR PCR片段与pGEM-T easy载体(Promega)连接，进一步亚克隆至psiCHECK-2报道质粒(Promega)的萤光素酶3'端处的单一NotI位点。用种子匹配序列间的引物突出端合成没有miR-135种子序列的突变的3' UTR序列。通过判断性切割和测序证实克隆方向。
[0590] 表7：用于克隆的寡核苷酸引物
转染和萤光素酶测定法
使HEK293T细胞在组织培养板中在聚L-赖氨酸上生长至70-85%汇合，并用下列质粒使用聚乙烯亚胺转染：含有野生型或突变的3' UTR和特定miRNA的过量表达载体(SEQ ID NO: 
210所示miR-135a或SEQ ID NO: 211所示miR-135b)的psiCHECK-2质粒或空过量表达质粒。
在转染后24小时，使细胞溶解，并如前所述测定萤光素酶报道基因活性(Kuperman等，
2011)。使海肾萤光素酶值归一化至对照萤火虫萤光素酶水平(从同一载体转录，但不受3' UTR影响)，然后测试，并在对每个条件的6孔重复取平均。
[0591] 动物和饲养将成年C57BL/6雄性小鼠(Harlan，Jerusalem，Israel)用于体内慢病毒实验。如前所述，使用在5-羟色胺能神经元中特异性表达Cre重组酶的ePet-Cre小鼠(Scott等，2005)。还使用携带用于miR-135过量表达的条件盒(conditional cassette)的转基因小鼠。在颠倒的12小时光/暗周期下，将小鼠关养在受控温度室(22 ± 1℃)中。食物和水可任意获得。所有实验方案在雄性小鼠中进行，并且均获魏茨曼科学研究所机构动物管理和使用委员会批准。
[0592] 苯丙胺诱导的活动过度大鼠模型在这些实验中，将大鼠等分到4个治疗组。用miR-135、锂、丙戊酸盐或盐水(对照)对大鼠预治疗，然后各组中一半大鼠给予苯丙胺(0.5 mg/kg皮下(s. c.))，另一半给予盐水(s. c.)。
[0593] 或者，先给予大鼠苯丙胺(0.5 mg/kg皮下(s. c.))或盐水(s. c.)，接着用miR-135、锂、丙戊酸盐或盐水(对照)治疗。
[0594] 10分钟后，将所有大鼠放在活动测量仪中，将用miR-135预治疗或治疗的大鼠的活动度与未治疗大鼠(对照组)和与用锂或用丙戊酸盐预治疗或治疗的大鼠进行比较。一周后重复该程序。
[0595] 氯胺酮诱导的活动过度大鼠模型在这些实验中，将大鼠等分到4个治疗组中：对照、锂、丙戊酸盐和miR-135治疗大鼠，并如下治疗：
将大鼠用miR-135、锂(47.5 mg/kg，i.p.，一天两次)、丙戊酸盐(200 mg/kg，i.p.，一天两次)或盐水(i.p.，一天两次)作为对照预治疗(持续14天)。在第8和14天之间，用氯胺酮(25 mg/kg，i.p.)或盐水治疗这些大鼠。
[0596] 在一个颠倒的方案中，先给予大鼠氯胺酮(25 mg/kg，i.p.)或盐水，接着给予miR-135、锂、丙戊酸盐或盐水持续7天。然后，如本文所述监测大鼠活动度。
[0597] 慢性社交失败如前所述，对小鼠进行社交失败方案处理(Elliott等，2010)。简单地说，将小鼠放到攻击性ICR小鼠的养育笼中，它们在笼中在身体上互动5分钟。在此期间，ICR小鼠攻击闯入小鼠，闯入者显露附属姿态。将穿孔的透明有机玻璃隔板放在动物之间，把小鼠留在同一笼中
24小时以允许感官接触。然后在接下来的10天，每天用陌生ICR小鼠重复该过程。
[0598] 抗抑郁药治疗小鼠接受三环类丙米嗪、SSRI氟西汀或NRI瑞波西汀(20 mg/kg，在盐水中)或盐水的i.p.注射。慢性注射连续进行18-21天，并在脑显微切割前24小时进行急性注射。对于行为测试，在试验前给小鼠i.p.注射20 mg/kg SSRI 30分钟。
[0599] 脑显微切割使用丙烯酸酯类脑基质(Stoelting)，从小鼠中缝核(RN)中获取脑样品。根据指定的解剖标记，使用标准刀片获取切片。使用钝的14G注射器从2 mm切片中提取中缝核区，将组织保持在-70℃下直到RNA纯化。
[0600] 微RNA纯化和定量实时PCR表达分析按照生产商说明书，使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen)分离mRNA，包括微RNA，使用miScript反转录试剂盒处理以产生cDNA。然后按照生产商准则，在AB 7500热循环仪(Applied Biosystems)中，使用SYBR®Green PCR试剂盒(Qiagen)分析样品。每种miR的特异性引物与商品化通用引物一同使用，同时U6 snRNA用作内部对照。对于mRNA量化，应用软件“primer express 2”设计每个转录物的特异性引物，并如前所述采用实时PCR测定表达(Haramati等，2011)。
[0601] 表8：用于微RNA实时PCR的寡核苷酸引物基因 引物序列
miR-135a TATGGCTTTTTATTCCTATGTGA (SEQ ID NO: 1)
miR-135b TATGGCTTTTCATTCCTATGTGA (SEQ ID NO: 2)
miR-375 TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA (SEQ ID NO: 3)
U6 GATGACACGCAAATTCGTGAA (SEQ ID NO: 4)
miR-124 TAAGGCACGCGGTGAATGCC (SEQ ID NO: 5)
miR-16 TAGCAGCACGTAAATATTGGCG (SEQ ID NO: 158)
表9：用于mRNA实时PCR的寡核苷酸引物

miR-135敲减慢病毒构建体的克隆、慢病毒的产生和体外验证
miR-135敲减(KD)质粒pEZX-H1-miR-135KD-CMV-mCherry和对照pEZX-H1-对照KD-CMV-mCherry购自GeneCopeia (USA)。使用含有NheI侧接位点的引物扩增H1启动子和KD序列，并连接至pGEM-T Easy载体中。使用NheI限制位点，将H1-135 KD片段亚克隆至p156-pRRL-CMV-GFP慢病毒构建体，产生p156-pRRL-H1-miR-135bKD-CMV-GFP和p156-pRRLH1-对照KD-CMV-GFP慢病毒构建体，这通过DNA测序进一步证实。如前所述，通过在HEK293T细胞中瞬时转染，来产生重组慢病毒(Tiscornia等，2006)。简单地说，在转染后48和72小时收获感染性慢病毒，通过0.45 µm小孔醋酸纤维素滤器过滤，并通过超速离心浓缩。对于miR-135 KD效率验证，将大鼠中缝核细胞系(RN46A)用miR-135 KD或对照KD慢病毒感染，48小时后收获mRNA，采用实时PCR测试Htr1a和Slc6a4的表达水平。
[0602] 慢病毒的大脑内注射对于立体定位手术和慢病毒递送，如前所述(Lebow等，2012)，使用计算机导向立体定位仪和电动纳米注射器(Angle TwoTM Stereotaxic Instrument，myNeurolab)。将小鼠在全身麻醉下放在立体定位仪上，将慢病毒制品通过Franklin和Paxinos图集定义确定的坐标递送至DR：ML 0 mm；AP -4.6 mm；DV -3.9 mm以300倾斜。注射以0.2 µl/1分钟的速率进行。
在两周恢复期后，对小鼠进行行为和生理研究。在确定表型后，使小鼠麻醉，用磷酸盐缓冲的4%低聚甲醛灌注。将固定的脑连续切成30 mm切片，使用免疫组织化学证实注射部位的位置。
[0603] 免疫组织化学用于免疫组织化学的方法如前所述(Regev等，2011)。对于GFP免疫染色，使用在山羊中产生的生物素化抗GFP抗体作为第一抗体(Abcam，Cambridge，UK)，链霉抗生物素缀合的Cy2作为第二抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA)。
[0604] 行为评估在每次试验前在习惯试验室2小时后，在暗期进行所有行为评估。对于焦虑样行为采用高架十字迷宫、光/暗转移和旷场试验，对于抑郁样行为采用强迫游泳试验，测试小鼠。
[0605] 旷场试验：旷场试验在120 lux光照、50 x 50 x 22 cm白箱中进行。把小鼠放入箱中10分钟。采用视频跟踪系统(VideoMot2；TSE Systems, Bad Hamburg, Germany)，量化箱中的小鼠运动。
[0606] 光/暗转移试验：光/暗转移试验仪器由分成黑暗室(14 x 27 x 26 cm)和相连的白光1200 lx照明室(30 x 27 x 26 cm)的聚氯乙烯箱组成。在5分钟试验内，用视频跟踪系统(VideoMot2；TSE Systems, Bad Hamburg, Germany)定量测定在明室所花时间、在光下行走的距离和光-暗转移的次数。
[0607] 高架十字迷宫试验：该试验装置具有加号形状，含有2个屏障壁和2个照明的(6 lux)开放臂。在5分钟试验内，利用视频跟踪系统(VideoMot2；TSE Systems, Bad Hamburg, Germany)，对在开放臂中的进入次数、行走距离和所花时间进行自动评分。
[0608] 改良强迫游泳试验：如前所述进行强迫游泳试验(Krishnan等，2007)。装置为直径为18 cm、装入25℃水至15 cm深度的塑料水桶。将各小鼠放入塑料水桶的中央，开始6分钟视频记录的试验阶段。采用EthoVision XT (Noldus，Wageningen，Netherlands)，对在试验的3-6分钟内不活动所花持续时间进行自动评分。
[0609] 社交回避试验：在社交回避试验中，把小鼠放入15 cm x 35 cm活动场地，其中有一个小的被隔板隔开的15 cm x 8 cm邻室，隔板上有小的开通狭缝，允许充分的感官接触。允许受测小鼠习惯活动场地3分钟，然后将陌生的ICR小鼠放入邻室又一个3分钟。使用视频跟踪通过Ethovision软件(Noldus，Wageningen，Netherlands)，定量测定靠近隔板所花时间。通过将小鼠在靠近陌生ICR的规定区域所花时间除以在习惯期间小鼠在同一区域所花时间再乘以100，计算互动比。
[0610] 显微切割、样品制备和5HT和5-HIAA浓度的HPLC-ED分析如前所述(Neufeld-Cohen等，2010a)，使用Palkovits显微切割技术(Palkovitz，
1988)，进行显微切割。采用Leica CM1950恒冷切片机(North Central Instruments, USA)，获取脑冠状切片(300 µm)。将切片装在载玻片上，在立体显微镜下使用不同内径的显微切割针在-10℃下在冷却台上显微切割。将显微切割物各放入含有100 µL乙酸盐缓冲液(3.0 g/L乙酸钠、4.3 mL/L冰醋酸；pH调节于5.0)的管中。接下来，将样品匀浆，并在4℃和
13,000 rpm下离心3分钟。沉淀用175 µL 0.2 M NaOH复溶用于蛋白质含量，并如前所述(Evans等，2008)，采用高效液相色谱法与电化学检测(HPLC-ED)，将50 µL上清液用于5HT和
5-羟基吲哚乙酸(HIAA)的检测。将样品加到使样品注入HPLC色谱系统(ESA，Chelmsford，MA，USA)的ESA 542型自动进样器中。HPLC系统还包括ESA 582型Solvent Delivery Module以将流动相(9.53 g/L磷酸二氢钾二水合物、300 mg/L辛烷磺酸、35 mg/L EDTA、920 mL/L HPLC级H2O和80 mL/L HPLC级甲醇；使用正磷酸调节pH至3.4)泵送通过色谱系统。其中发生色谱分离的固定相由整合的前置柱/柱系统(Ultrasphere-XL 3  µm Octyl Guard Cartridge，5/70 x 4.6 mm；MAC-MOD Analytical，USA)组成。电化学检测使用具有双重稳压器的ESA 5200A型Coulochem II检测器完成，所述双重稳压器与电极电位设定为0 mV的ESA 5021预处理室及通道1和通道2电极电位分别设定为25 mV和250 mV的ESA 5014B微透析室连接。对于每次行程，应用色谱分析软件(EZChrom Elite用于Windows，2.8版；Agilent Technologies，USA)测定已知浓度的5HT和5-HIAA的平均峰高，并用来计算未知样品的浓度。使5HT和5-HIAA的组织浓度标准化至蛋白质的量。
[0611] 人类样品研究病例对照研究：如(Menke等，2012)中详述的研究中，选出诊断为重性抑郁症(N=9)或双相型障碍(N=2)的17名男性患者和12名健康男性对照。简单地说，从Max-Planck Institute of Psychiatry招募患者，在因抑郁综合征住院病人入院的前5天内，针对RNA抽血。入院时平均HRDS评分为24.3 (SD：5.3，范围17-32)。利用复合性国际诊断交谈表(Composite International Diagnostic Interview, CIDI) (Wittchen HU，1999)针对不存在终身精神障碍并利用HRDS针对不存在现行精神病症状筛选对照。在6 pm禁食2小时后，使用PAXgene (PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，Switzerland)全血RNA收集管收集全血。使用PAXgene血液RNA试剂盒，以用于核酸柱纯化的Qiagen方法(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，Switzerland)，从PAXgene全血样品中分离总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)和260 nm UV吸收(Nanophotometer，Germany)，评价RNA品质、浓度和纯度。
[0612] 认知行为疗法(CBT)：该分析的患者来源于设计成鉴定认知行为疗法(CBT)缓解的神经成像和其它生物学预测因子的随机临床试验。所有患者在参与研究前提供书面知情同意。研究遵照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)及其修正案进行，并经Emory’s Institutional Review Board批准。研究设计详细描述于Dunlop等，2012。简单地说，合格的参与者是介于18和60岁的成年门诊病人，他们符合用于MDD而无精神病特征的初步诊断的Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders (精神障碍诊断与统计手册),第4版(DSM-IV)标准。患者接受16期的CBT。所提供的CBT遵循标准化协议(Beck等，1979)。使用汉密顿抑郁评定量表(Hamilton Depression Rating Scale，HRDS)，前6周每周评价所有患者的症状改变，然后剩下的6周每隔一周评价。所有患者具有随机的15分以上的HRDS评分。从该研究中，选择在基线、第2周(N = 16)和第12周抽血用于RNA的12名患者。在基线抽血时，不允许现行药物治疗。75%的患者为女性，87%为欧洲血统。CBT组的平均年龄为
42.4 (SD：9.6)岁。将全血收集在Tempus RNA管(Applied Biosystems)中，使用Tempus Spin RNA Isolation Reagent试剂盒(Applied Biosystems)提取。分别使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent  Technologies，Palo Alto，CA，USA)和光度测定方法
(Nanophotometer，Implen，Munich，Germany)测量RNA质量和数量。
[0613] 统计分析数据表示为均值+/-SEM。为了检验统计显著性，在只有比较2个组情况下，例如对于微阵列实时PCR数据验证，采用斯氏t检验。单因素ANOVA用于多组之间的比较，例如在萤光素酶测定法中不同治疗之间。在2个独立变量的情况下，例如在急性或慢性给药两者中的SSRI或NRI注射，采用双因素ANOVA。需要时采用重复测量分析。当需要显示统计显著性时，应用事后t检验。统计分析应用Jmp7软件进行，且当P < 0.05时，组间的差异被视为显著。
[0614] 实施例105HT神经元的微RNA“指纹”
从ePet-EYFP胚胎的RN中分离5HT神经元，并使用miR微阵列将其miR表达概况与获自同一脑区的非5HT细胞相比(图35A)。通过有关标志基因的mRNA表达水平，来进行细胞分选验证。YFP (ePET阳性神经元的荧光标志物)在5HT群中显著富集(图35B)；色氨酸羟化酶2 (TPH2) (5HT产生中的关键酶)在5HT细胞中稳固表达(图35C)；谷氨酸脱羧酶67 (GAD67) (在RN的非5HT神经递质中普遍的催化GABA合成的酶)在非5HT细胞中极丰富(图35D)。获自微阵列的miR “指纹”(图1A)含有14种(下表10)和27种(下表11) miR在5HT神经元中的表达分别是非5HT神经元的2倍或1/2。对于在5HT神经元例如miR-375 (图1B)中高表达的miR和在5HT神经元例如miR-135a (图1C)中以较低水平表达的miR，采用实时PCR进行阵列结果的代表性验证。
[0615] 表10：微RNA微阵列结果—在5HT神经元中的表达是小鼠RN的非5HT细胞的至少2倍的微RNA的列表微RNA名称 倍数变化
mmu-miR-375 20.72
mmu-miR-376c 11.73
mmu-miR-7a 4.44
mmu-miR-137 2.87
mghv-miR-M1-2 2.79
mmu-miR-709 2.61
mmu-miR-291b-5p 2.51
mmu-miR-1224 2.40
mmu-miR-1892 2.37
mmu-miR-702 2.31
mmu-miR-139-3p 2.25
mmu-miR-762 2.24
mmu-miR-671-5p 2.10
mmu-miR-483* 2.04
表11：微RNA微阵列结果—在5HT神经元中的表达是小鼠RN的非5HT细胞的至多1/2的微RNA列表
微RNA名称 倍数变化
mmu-miR-691 -5.10
mmu-miR-466l -4.11
mmu-miR-17 -3.95
mmu-miR-376b -3.18
mmu-miR-124 -3.13
mmu-miR-218 -3.08
mmu-miR-128 -2.99
mmu-miR-140* -2.92
mmu-miR-148a -2.86
mmu-miR-340-5p -2.86
mmu-miR-181c -2.82
mmu-miR-210 -2.72
mmu-miR-135a -2.69
mmu-miR-27a -2.66
mmu-miR-452 -2.45
mmu-miR-370 -2.20
mmu-miR-300 -2.19
mmu-miR-376a -2.17
mmu-miR-127 -2.13
mmu-miR-15b -2.12
mmu-miR-101a -2.07
mmu-miR-16 -2.06
mmu-miR-324-5p -2.05
mmu-miR-434-5p -2.05
mmu-miR-92a -2.03
mmu-miR-669i -2.00
为了进一步研究miR作为5HT神经元的调节剂的可能作用，以假设驱动的方式进行了广泛的生物信息学分析。使之前表明与精神病理学有关在5-羟色胺能神经元表达的已知5HT相关基因的靶向预测在生物信息学上与微阵列结果交集。应用2种不同的基于网络的算法，进行了这些基因的miR靶向预测：Target Scan (www(dot)targetscan(dot)org)和miRanda (www(dot)microrna(dot)org)，并且与非5HT细胞相比，与在5HT神经元miR阵列中变化达至少±1.5倍的91种miR的列表交集。选择在RN的5HT神经元中表达的2种蛋白质编码靶基因：
负责5HT重摄取的5-羟色胺转运蛋白(亦称SERT或Slc6a4)和5-羟色胺抑制性受体1a (亦称Htr1a)。根据miR阵列数据和生物信息学分析，选择7种miR用于进一步的体外验证(图1D-E)。
[0616] 实施例11miR-135靶向Htr1a和Slc6a4转录物
进行了体外萤光素酶测定法，以测试受测5HT相关基因的3’UTR和预测的推定靶向这些转录物的miR之间的miR-靶标相互作用。Slc6a4 3'UTR (图2A，2C)和Htr1a 3'UTR (图2B，
2D)的miR-135打靶导致这些转录物的翻译被强抑制。另外，Htr1a 3'UTR的显著抑制由miR-
335、miR-181c和miR-26a介导(图2D)。由于miR-135对Htr1a和Slc6a4两者的强大作用，本发明研究进一步集中在该miR-靶标相互作用。进一步的生物信息学分析揭示，miR-135具有3个高度保守的变体miR-135a-1、miR-135a-2和miR-135b (图36A-C)。另外，Slc6a4 3'UTR中的miR-135种子匹配序列是高度保守的(图2E)，并且在Htr1a 3'UTR中的2个种子匹配之一中，观察到强保守性(图2F)。其中Slc6a4转录物3’UTR上的突变研究(其中除去miR-135种子匹配序列)显示，Slc6a4的miR-135a和miR-135b打靶两者均通过其种子匹配序列介导，因为由miR-135诱导的抑制被Slc6a4 3'UTR的突变完全阻断(图2G)。单独或一起使Htr1a miR-
135种子匹配突变显示，miR-135a通过远端且非近端的种子匹配抑制Htr1a 3'UTR，而miR-
135b通过两个预测的位点起作用(图2H)。
[0617] 实施例12RN-miR-135水平被抗抑郁药增量调节
由于之前表明，Htr1a (Savitz等，2009)和Slc6a4 (Murphy等，2008)两者与抑郁和抗抑郁细胞机器有关，因此本发明人试图检查在响应抗抑郁治疗时miR-135表达的调节。成熟miR-135a和miR-135b只以1个核苷酸之差而不同(图37A)，但仍在RN中差异表达，如对获自成年野生型小鼠显微切割RN中的cDNA进行的实时PCR结果所观察的一样(图37B)。miR 135b的表达是miR-135a的约1/10，而后者是相对高表达的，仅miR-124 (脑中最丰富的miR)的1/
5，且是之前显示在控制5HT功能中起作用的miR-16的1/2.5 (图37C)。鉴于miR-135a在RN中以高于miR-135b的水平表达，并且还是在5HT微阵列中不同变化的变体，本发明人集中在对这种形式的调节研究上。接下来，在暴露于慢性社交失败模型(一种用于诱导抑郁样行为的环境模型)和用三环类抗抑郁药丙米嗪慢性治疗的小鼠中，测试了miR-135的水平。
[0618] 采用社交回避试验，证实了社交失败可引起社交回避，给予抗抑郁药可将其逆转(图37D)。实际上，只有显露社交失败并注射盐水的小鼠发生社交回避，而接受丙米嗪的小鼠不发生，如低于100%的互动比所表示的一样(图37D)。引人关注的是，慢性社交失败应激不改变RN中的miR-135a水平，然而，在应激和非应激小鼠两者中，慢性(图37E)或急性(图37F)给予的丙米嗪均显著增加RN中的miR-135a表达水平。因为丙米嗪不是特异性5HT重摄取抑制剂，所以进一步测试了急性和慢性给予选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)氟西汀和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(NRI)瑞波西汀两者的作用，发现在急性和慢性SSRI治疗两者后，RN中稳固的miR-135a水平升高，但在NRI治疗后未观察到差异(图37G)。
[0619] 实施例13在5HT神经元中特异性的miR-135过量表达减少社交失败后的焦虑和抑郁样行为
为了进一步探索体内5HT-miR-135的作用，建立了在RN的5HT神经元中特异性过量表达miR-135的小鼠模型(miR-135OE)。使在RN 5HT阳性神经元中特异性表达Cre重组酶(ePet-Cre)的小鼠与携带条件性miR-135a盒的转基因小鼠系杂交(图38A)。作为对照，使用对miR-
135过量表达转基因阴性和对ePet-Cre阴性的小鼠。在5HT神经元中特异性过量表达miR-
135a的小鼠RN中的miR-135a表达水平通过实时PCR测试，并显示较之于对照小鼠约2倍的过量表达(图38B)。该小鼠模型中miR-135的过量表达水平与在给予SSRI后小鼠RN中测量的类似。另外，与对照小鼠相比，miR-135靶转录物Slc6a4 (图38C)和Htr1a (图38D)的水平在miR-135OE小鼠RN中降低，表明了miR-135靶基因的体内抑制。
[0620] 在“基础”条件下或在慢性社交失败方案后，在焦虑和抑郁样行为的试验中在行为上对miR-135OE及其同胞仔鼠对照进行了表征。在焦虑和抑郁样行为的试验中，在“基础”条件下在miR-135OE和对照小鼠之间观察到无差异(图38E-J，左条形柱和38K)。然而，miR-135OE小鼠显示对慢性社交失败的作用的显著适应性。在光/暗转移试验中，与对照小鼠相比，暴露于社交失败的miR-135OE小鼠在光下渡过较多时间(图38E)，较频繁地到访亮光室(图38F)，并在光下行走较长距离(图38G)。miR-135OE小鼠的行为表现在社交失败方案后无显著不同。相比之下，对照小鼠显示在社交失败后在光暗试验的所有所测参数中焦虑样行为显著增加(图38E-G)。在高架十字迷宫试验中观察到类似结果，因为与在相同条件下测试的miR-135OE小鼠相比，暴露于社交失败的对照小鼠花在开放臂中较少时间(图38H)、较少到访(图38I)和行走较小距离(图38J)。在miR-135OE组中在“基础”和应激条件之间未观察到差异。在评价抑郁样行为的试验中观察到类似结果。虽然当在慢性社交失败后测试时，在“基础”条件下未观察到差异(图38K)，但与对照相比，miR-135OE小鼠在强迫游泳试验中显示显著较少的不活动时间(图38L)，这可解释为抑郁样行为减少。这些差异无法说明自主活动能力的改变，因为在旷场中行走的距离在2个基因型中是类似的(图38M)。总之，miR-135在5HT神经元中特异性过量表达保护慢性应激对焦虑和抑郁样行为的不良作用。
[0621] 实施例14成年小鼠RN中miR-135的敲减增加焦虑样行为并降低对抗抑郁药的反应
为了确定miR-135内源水平在介导在响应抗抑郁治时的抑郁样行为和在“基础”条件下的焦虑样行为的重要性，建立了基于慢病毒的系统以特异性敲减(KD)野生型小鼠RN中内源miR-135的水平。将含有miR-135抑制剂(miRNA俘获，图39A)或对照序列的表达质粒亚克隆至含有H1启动子和GFP报道分子的慢病毒构建体(图39B)中以允许miR-135俘获序列的组成型表达。通过感染内源表达Htr1a、Slc6a4两者和miR-135的RN46A细胞，体外测试了从这些构建体产生的慢病毒抑制靶基因Htr1a和Slc6a4表达的效率。与被KD对照慢病毒感染的细胞相比，被miR-135 KD慢病毒感染的RN46A细胞表达显著较高水平的Htr1a和Slc6a4 mRNA，如通过实时PCR所测(图39C)。
[0622] 野生型成年小鼠RN用miR-135KD或对照慢病毒感染，在恢复期后，采用针对焦虑和抑郁样行为的试验评价小鼠行为。随后采用GFP免疫组织化学，证实了感染准确性(图39D)。在光/暗转移试验中，与对照注射小鼠相比，miR-135KD小鼠显示焦虑样行为显著增加(图
39E-H)。miR-135 KD小鼠在照明室中花较少时间(图39E)、较少到访(图39F)和行走较短距离(图39G)。同样，在高架十字迷宫试验中，与对照注射小鼠相比，miR-135 KD小鼠显示焦虑样行为增加。miR-135 KD小鼠显示在迷宫的开放臂中花较少时间(图39I)、较少到访(图
39J)和行走显著较小距离(图39K)的倾向(图39I-L)。
[0623] 在“基础”条件下和在SSRI治疗后均测试了miR-135 KD小鼠的抑郁样行为。在强迫游泳试验中观察到在“基础”条件下组间无差异(图39M)。然而，在给予SSRI后，与对照注射小鼠相比，miR-135 KD小鼠显著更不活动(图39M)，表明了内源RN-miR-135水平在介导SSRI诱导的抗抑郁作用中的重要作用。RN中miR-135的水平降低不影响这些小鼠的自主活动能力(图39N)。
[0624] 实施例15miR-135过量表达改变5HT水平和代谢
为了评价miR-135水平的变化是否还影响中枢5HT的组织浓度及其周转，对RN细分区域和来自miR-135 OE小鼠模型和对照同胞仔鼠的受这些区域神经支配的脑区进行显微分割。
图40A-40O、图42A-L和图43A-L表示在“基础”条件下和在社交失败方案后这些小鼠中的5HT的组织浓度和5HT代谢(5HIAA/5HT比)。
[0625] 焦虑和抑郁相关神经回路内的5HT的组织浓度和5HT代谢受miR-135基因型影响，以及社交失败操作miR-135 OE降低组织5HT浓度，增加5-羟色胺代谢，一种与在涉及调节焦虑相关行为和应激复原力的以下脑区中5-羟色胺周转增加的模式：例如缘前皮质(PrL)、下边缘皮质(IL)、基底外侧杏仁核(BLA)、腹侧海马CA1区(CA1V)、下托(S)、终纹床核(BNST)、中央杏仁核(CeA)、中缝背核的背侧、腹侧、尾部和束间部分(DRD、DRV、DRC、DRI)和中缝正中核(MnR) (图40A-40O、图42A-L和图43A-L)。这些结果与在“基础”条件下miR-135 OE降低Htr1a和Slc6a4表达一致(图38C-D)，为可预期导致5-羟色胺能神经元放电速度和5-羟色胺能信号转导分别提高的作用。
[0626] 在对照小鼠中，社交失败降低焦虑相关脑区中组织5HT浓度并增加5HT代谢，一种符合5-羟色胺周转(包括PrL和BNST)提高的模式(图40A-40O和图42A-L)，与表明社交失败诱导的DRD和DRC中5-羟色胺能神经元的焦虑相关亚型活化的之前的研究一致。社交失败的这些作用在miR-135OE小鼠中被阻止，表明了在这些小鼠中观察到的对慢性应激的行为复原性的机制性解释。
[0627] 实施例16血液中的miR-135a水平在抑郁患者中被减量调节而通过疗法增量调节
因为循环miR水平显示与疾病状态相关，所以本发明人测试了人类抑郁患者中血液miR-135水平是否改变。在两组人血样中测试了miR-135和miR-16的相对水平。一组比较抑郁患者与匹配的健康对照，另一组miRNA水平在接受3个月认知行为疗法(CBT)的抑郁患者中随时间变化。与对照相比，miR-135a水平在现行的抑郁患者(平均汉密顿抑郁评定量表(HRDDS)= 24.3 (SD：5.3)，即中度到重度抑郁症状)中稳固降低(图41A)，而观察到在miR-
16中无明显变化(图41B)。比较治疗之前和治疗后3个月抑郁患者的miR-135a血液水平显示在CBT后miR-135a水平显著升高(图41C)。对于miR-16水平，在同一血样中观察到无作用(图
41D)。这些结果表明人血液中的miR-135a水平为抑郁状态和对治疗起反应的可能的生物标志物。
[0628] 实施例17miR-135在苯丙胺诱导的活动过度大鼠模型中的抗双相作用
为了临床前评价miR-135的抗双相障碍作用，使用体内苯丙胺诱导的大鼠躁狂症活动过度模型，这与双相型障碍的躁狂期有关。该模型集中在动物活动水平的诱导性提高(活动过度)作为躁狂患者活动过度的对应物。通过用药物预治疗在啮齿动物逆转诱导的活动过度表明该药物在治疗人类躁狂症时的可能功效。与锂(用于躁狂症的标准药物)最一致的研究结果是在站立减少。通过观察动物的直立活动在模型中跟踪站立。
[0629] 因此，针对双相型疾病的治疗，测试了在苯丙胺诱导的活动过度前用miR-135预治疗的大鼠。此外，针对双相型疾病的治疗，测试了在苯丙胺诱导的活动过度后用miR-135治疗的大鼠。
[0630] 将大鼠关养在12小时光/暗周期下，在光期进行行为测试。准确地讲，以基于2水平激光束和配备可清点大鼠直立运动(站立)数的计算机化系统的活动测量仪(Elvicom，Israel)跟踪大鼠活动度。对于每期记录活动持续30分钟，每30分钟报告由此而来的适当运动。
[0631] 将用miR-135预治疗或治疗的大鼠的活动度与未治疗大鼠(对照组)和用躁狂症的标准药物(即锂或丙戊酸盐)预治疗或治疗的大鼠进行了比较。在用苯丙胺攻击之前和之后跟踪大鼠。应用双因素ANOVA进行统计分析。
[0632] 实施例18miR-135在氯胺酮诱导的躁狂症大鼠模型中的抗双相作用
为了临床前评价miR-135的抗双相障碍作用，使用体内氯胺酮诱导的大鼠躁狂症活动过度模型。氯胺酮诱导经治疗大鼠的运动过度，这可如上所述监测。
[0633] 将大鼠用miR-135或躁狂症的标准药物即锂(47.5 mg/kg，i.p.，一天两次)或丙戊酸盐(200 mg/kg，i.p.，一天两次)或用盐水(i.p.，一天两次)作为对照预治疗(持续14天)。在第8和14天之间，将这些大鼠用氯胺酮(25 mg/kg，i.p.)或盐水治疗。
[0634] 在一个颠倒的方案中，大鼠首先接受氯胺酮(25 mg/kg，i.p.)或盐水接着给予miR-135、锂、丙戊酸盐或盐水为期7天。
[0635] 将用miR-135预治疗或治疗的大鼠的活动度与未治疗大鼠(对照组)和与用躁狂症的标准药物(即锂或丙戊酸盐)预治疗或治疗的大鼠进行比较。在用氯胺酮攻击之前和之后跟踪大鼠。应用双因素ANOVA进行统计分析。
[0636] 讨论在最新研究中，阐述了在“基础”和攻击条件下特定miR在调节中枢5HT系统活性中的作用。在5-羟色胺能神经元中测定了miR表达的独特“指纹”，并以生物信息学方法鉴定了若干
5HT相关的靶基因。体外萤光素酶测定法和突变研究显示，miR-135对Slc6a4和Htr1a转录物两者的强抑制作用。引人注意的是，RN中的miR-135水平在急性或慢性SSRI给药后稳固地增量调节。表达较高或较低的miR-135水平的遗传修饰的小鼠模型显示焦虑和抑郁样行为的较多交替、5HT水平和代谢和响应抗抑郁治疗时的行为。最后，提供人类抑郁患者血液中的miR-135水平和对治疗的反应。
[0637] 用于分离来自小鼠RN的5HT和非5HT细胞的ePet-EYFP小鼠模型的使用首次允许测定5-羟色胺能神经元的特定miR概况。虽然该方法是成功的和提供信息的，但是为了从小鼠RN胚期有效地分选5HT阳性神经元，使用了未成年脑组织，这意味着5HT miR概况中所提供的miR至少一部分可能与发育过程和未成年5HT神经元功能有关。然而，已知在特定发育期内5-羟色胺能信号转导影响成年焦虑表型(Gross等，2002)。引人关注的是，与对照相比，通常与胰腺β细胞分化有关的miR-375在5HT神经元中稳固表达，支持所提出的这些组织的共同发育途径。
[0638] 生物信息学分析表明，5-羟色胺受体1A (Htr1a)和5-羟色胺转运蛋白(SERT或Slc6a4) 3'UTR和在5HT微阵列中差异表达的miR之间的推定的若干miR-靶标相互作用。Htr1a和Slc6a4显示在5-羟色胺能系统功能、抑郁和焦虑障碍和在响应抗抑郁药时起重大作用(Savitz等，2009)和(Murphy等，2008)。Htr1a是抑制性G蛋白偶联受体，在产5HT的细胞中作为自身受体表达，并且突触后跨越5HT发射部位的脑。刺激Htr1a自身受体抑制5-羟色胺能神经元放电并在神经末梢释放5-羟色胺，据假设是通常报告的大多数5-羟色胺能抗抑郁药(例如SSRI)的治疗滞后的原因之一。Slc6a4是一种质膜转运蛋白，通过以钠依赖性方式使之从突触间隙到突触前神经元再循来终止5-羟色胺作用。Slc6a4是最常用的抗抑郁药的直接靶标，所述抗抑郁药为抑制不同单胺重摄取转运蛋白活性(包括Slc6a4)的前一代三环类抗抑郁药或更特异性的SSRI。可预期Slc6a4和突触前Htr1a两者的活性降低提高突触中的5HT水平，这与抗抑郁作用和抑郁症状减轻一致。萤光素酶测定法证实miR-135变体为Slc6a4和Htr1a转录物两者的重要阻抑物。突变研究进一步显示miR-135种子结合位点在Htr1a和Slc6a4 3’UTR在介导所观察的miR-135阻抑作用中的重要性。之前报告的用于这些基因人Slc6a4和Htr1a的3’UTR的单核苷酸多态性(SNP) (Piva等，2010)不在miR-135种子匹配序列内。
[0639] 据之前的报告，miR-135主要参与癌症相关病理和发育过程。已显示miR-135靶向腺瘤状结肠息肉病基因，因此促进结肠直肠癌、改进化疗抗性并在典型霍奇金淋巴瘤中调节JAK2。在巨核细胞生成、猪脑发育和在骨源性分化中通过调节mad5的矿化、BMP2成骨信号的关键转导物中显示了miR-135在发育过程中的作用。另外，表明miR-135参与通过抑制NR3C2调节血压，并且在心力衰竭中具有潜在作用。
[0640] 若干微RNA筛选研究报告了不同成年啮齿动物或大鼠脑结构中的微RNA水平受各种行为和药理学操纵影响(Kye等，2011)。使用不同的范例，显示了应激性攻击在不同的脑部位改变miR表达(Smalheiser等，2011)。本发明人最近表明miR-34参与调节焦虑样行为(Haramati等，2011)，而miR-22、miR-138-2、miR-148a和miR-488与惊恐障碍有关(Muinos-Gimeno等，2011)。现有手稿提供的使用小鼠的研究显示，在给予抗抑郁药后miR-135显然增量调节。SSRI和NRI抗抑郁药的进一步比较显示SSRI特异性和非NRI特异性作用，这进一步表明miR-135在5HT神经元生物学中的作用。虽然慢性应激与对抑郁发生的敏感性增强有关，但出乎意料的是，慢性应激条件不影响RN中的miR-135水平。据报告，慢性SSRI治疗促进Slc6a4和Htr1a蛋白质水平但非mRNA的降低[Slc6a4 (Benmansour等，2002)、Htr1a (Savitz等，2009)]，表明了转录后机制可能参与介导SSRI活性。显示了miR-16靶向Slc6a4，并且在抗抑郁反应中具有作用(Baudry等，2010)，而给予锂显示改变miR表达(Creson等，2011)。发现了重性抑郁症患者中miR-182 (Saus等，2010)和miR-30e (Xu等，2010b)的变体之间的关系，并且miR表达在患有自杀性抑郁的患者的额叶前皮质中改变(Smalheiser等，
2012)。另外，显示了miR448控制若干5HT受体的表达作为脂肪组织发育的一部分，并且5-羟色胺受体1B的多态性节制通过miR96的调节，并且与攻击性行为有关(Jensen等，2009)。最后，显示了5-羟色胺受体-3E型的miR510靶向位点在肠易激综合征中起作用。
[0641] 据报告抗抑郁治疗激活cAMP信号转导途径并促进CREB与CRE位点结合。miR-135 5’侧翼区的启动子分析鉴定出几个推定的CRE位点，表明了所观察到的miR-135被SSRI增量调节的可能机制。总之，在给予抗抑郁药后RN中miR-135表达水平的增量调节，连同显示Htr1a和Slc6a4的miR-135打靶的结果，表明了miR-135是一种内源抗抑郁药。
[0642] 为了进一步支持miR-135作为内源抗抑郁药的作用，进行了一系列实验，其中体内操纵miR-135水平，并评价了对动物行为的作用。以在抗抑郁治疗后观察到的相当的水平在5HT神经元中特异性过量表达miR-135的转基因小鼠模型显示，对慢性社交失败的不利行为效果的强保护作用。这些结果类似于在使用siRNA方法敲减Htr1a (Bortolozzi等，2012)或Slc6a4 (Thakker等，2005)时观察到的作用，表明抑郁样行为减少，或在使用精致的转基因小鼠模型提高Htr1a自身受体水平时，导致焦虑和抑郁样行为增加和对抗抑郁药的反应降低(Richardson-Jones等，2010)。相比之下，Htr1a (Savitz等，2009)和Slc6a4 (Holmes等，
2003)的发育敲除小鼠模型显示焦虑和抑郁样行为的是非而是的增加，这表明是由发育补偿性改变介导的。除Htr1a和Slc6a4以外，还很可能miR-135a影响5-羟色胺神经元中的其它基因，其可能有助于所观察到的表型。
[0643] 采用补充方法，使用慢病毒在成年野生型小鼠RN中特异性敲减miR-135的水平，并且在“基础” (非应激)条件下和在给予SSRI后评价小鼠的行为。与通过过量表达miR-135的小鼠观察到的行为形成对比，这种miR的水平降低引起焦虑样行为的稳固增加和对抗抑郁药的反应减弱。这些结果支持miR-135在维持在“基础”条件下对攻击的整个反应中的重要作用及其在抗抑郁作用和机制中的基本作用。这些研究结果与已发表的文献一致，所述文献显示Htr1a的较高水平与行为绝望加重和对抗抑郁药反应迟钝有关(Richardson-Jones等，2010)。此外，人Htr1a基因中的多态性与较高的Htr1a自身受体结合与焦虑和抑郁加重有关(Fakra等，2009)。相比之下，据报告，由于较短的启动子变体所致的较低的Slc6a4表达水平与焦虑和抑郁加重和对抗抑郁药的反应降低有关(Homberg和Lesch，2011)。
[0644] 对miR-135在5HT回路中的作用的更多支持产生于HPLC数据，该数据表明miR-135OE小鼠模型脑中5HT水平及其代谢的稳固变化。与对照相比，在其中合成5HT的中缝下核(sub-nuclei of the raphe)和对控制焦虑和抑郁样行为是重要的突出部位两者中，在“基础”应激条件下，miR-135OE小鼠的5HT水平较低，而5HT代谢较高。5HT水平和5HT代谢中的这种变化模式与miR-135OE小鼠中5-羟色胺能神经元放电增加和5-羟色胺能信号转导增加一致。这些差异可能是与来自成人期的发育的miR-135的过量表达有关的代偿性改变的结果。
然而，尽管低的“基础” 5HT水平，但小鼠在“基础”条件下仍显示正常行为，可能由于更活跃的5HT系统所致，如通过在“基础”条件下其较高的5HT代谢所述一样。令人信服地，在RN中起
5HT分泌抑制剂作用的Slc6a4和Htr1a的较低的表达水平使得小鼠能够以较低的5HT水平正常地起作用。引人关注的是，慢性应激如预期在对照小鼠一些脑区中引起5HT水平降低伴以
5HT代谢增加，而在miR-135OE小鼠中，未观察到这些作用。这些变化可提供对miR-135OE小鼠中观察到的慢性应激的行为复原性的机制性解释。
[0645] 作为病理条件的非侵入性生物标志物的循环miR的可能用途是一种增强场(rising field)，其被循环中的miR相对高的水平和稳定性促进。虽然有关胞外miR的作用和来源知之甚少，但循环miR与例如不同的癌症类型、心脏病、氧化性肺损伤、脓毒症、妊娠等病理生理状态有关。在现有的研究中，测定抑郁患者全血中miR-135的水平，并观察到与匹配对照相比，抑郁患者血液中的miR-135水平稳固降低。这些研究结果与表明miR-135是内源抗抑郁药的来自动物模型的之前的数据一致，并表明miR-135作为抑郁状态和可能对治疗起反应的可能的生物标志物。
[0646] 最后，本发明人提出，由5HT神经元表达的miR-135，是在正常条件下负责维持完整5-羟色胺能健康状态的必需调节成分，并且是脑对抗抑郁药起反应所必需的(参见图41E中的图解模型)。miR-135的水平升高抑制Slc6a4和突触前Htr1a水平两者，引起突触间隙中
5HT的增加，这与抑郁症状减轻有关。
[0647] 本发明人进行的进一步生物信息学分析预测了下列miR135靶标与应激相关神经精神障碍(包括双相情感障碍)或锂作用有关：腺苷酸环化酶激活多肽1  (Adcyap1或PACAP)；腺苷酸环化酶激活多肽1受体1 (Adcyap1r1)；肾上腺素能受体α2a (Adra2a)；锚蛋白3 (ANK3)；活性调节细胞骨架相关蛋白(Arc)；Rho GTP酶激活蛋白6 (Arhgap6)；激活转录因子3 (Atf3)；β位点APP切割酶1 (Bace1)；L型依赖电压性钙通道α1D亚基(Cacna1d)；细胞粘附分子3 (Cadm3)；复蛋白1 (Cplx1)；复蛋白2 (Cplx2)；CUB和Sushi多个结构域1 (Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1 (Csnk1g1)；双皮层蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-结合RAS样2 (Diras2)；discs大同源物2 (果蝇) (Dlg2)；ETS癌基因家族成员ELK1 (Elk1)；fyn相关激酶(Frk)；岩藻糖基转移酶9 (α(1,3)岩藻糖基转移酶) (Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受体亚基β2 (Gabrb2)；GATA结合蛋白3 (Gata3)；生长激素促分泌素受体(Ghsr)；G蛋白偶联受体3 (Gpr3)；离子型谷氨酸受体AMPA3 (α3) (GRIA3)；G蛋白偶联受体激酶5 (Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超极化激活的环核苷酸门控钾通道1 (Hcn1)，超极化激活的环核苷酸门控K+ 2 (Hcn2)，肌醇单磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；钾中/小电导钙激活通道亚家族N成员3 (KCNN3)；核周蛋白α3 (输入蛋白α4) (Kpna3)；髓鞘转录因子1样(Myt1l)；核受体共激活蛋白2 (Ncoa2)；N-Myc下游调节基因4 (Ndrg4)；一氧化氮合酶1 (神经元)衔接蛋白质(NOS1AP)；核受体亚家族3 C组成员2 (Nr3c2)；导蛋白G1 (Ntng1)；核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1 (Nucks1)；钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶1A (Pde1a)；cAMP特异性磷酸二酯酶1A  (Pde4a)；磷酸二酯酶8B (Pde8b)；磷脂酶C，β1 (Plcb1)；催乳素受体(Prlr)；RAB1B，成员RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相关蛋白Rap-2a (Rap2a)；类视黄醇相关孤儿受体β (Rorb)；sirtuin 1 (沉默交配型信息调节2同源物) 1 (Sirt1)；溶质载体家族12 (钾/氯转运蛋白)成员6 (Slc12a6)；溶质载体家族5 (胆碱转运蛋白)成员7 (Slc5a7)；反式作用转录因子1 (Sp1)；突触小泡糖蛋白2 b (Sv2b)；突触核被膜1 (编码nesprin-1) (Syne1)；突触结合蛋白I (Syt1)；突触结合蛋白II (Syt2)；突触结合蛋白III (Syt3)；转化生长因子β受体II (Tgfbr2)；甲状腺激素受体β(Thrb)；瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6 (Trpc6)；囊泡相关膜蛋白2 (Vamp2)；无翅相关MMTV整合位点3 (Wnt3)和含有BED结构域4 (Zbed4)的锌指。
[0648] 总之，这些数据表明miR-135a可在双相情感障碍的病理生理学、其治疗和诊断中起关键作用。
[0649] 尽管本发明结合其具体的实施方案加以描述，但是显然许多替换、修改和变动对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明旨在包括所有落入所附权利要求书精神和广大范围中的这些替换、修改和变动。
[0650] 本说明书所提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全部结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利或专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请中，任何参考文献的引用或标识都不得解释为承认这样的参考文献都可作为本发明的现有技术获得。就使用章节标题而言，它们不得解释为必要限制性的。
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