用于治疗痴呆和前痴呆相关病症的多不饱和脂肪酸
阅读：875发布：2022-12-11
专利汇可以提供用于治疗痴呆和前痴呆相关病症的多不饱和脂肪酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 披露了用于 治疗 或 预防 痴呆和前痴呆相关病症和/或这类病症的症状或特征的组合物和方法。，下面是用于治疗痴呆和前痴呆相关病症的多不饱和脂肪酸专利的具体信息内容。
1.降低个体的淀粉状蛋白β(Aβ)肽水平的方法，包括将至少一种多不 饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以降低所述个体的Aβ肽水 平，其中所述PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、 DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6 和ARA的组合。
2.权利要求1的方法，其中所述Aβ肽为可溶性Aβ肽。
3.降低个体的τ蛋白水平的方法，包括将至少一种多不饱和脂肪酸 (PUFA)或其前体或来源给予个体，以降低所述个体的τ蛋白水平，其中所 述PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA 和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和 ARA的组合。
4.权利要求3的方法，其中所述τ蛋白为磷酸化τ蛋白。
5.降低个体的早老素-1(PS1)蛋白水平的方法，包括将至少一种多不饱 和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以降低所述个体的PS1蛋白水 平，其中所述PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、 DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6 和ARA的组合。
6.延迟个体出现突触功能障碍或降低其严重度的方法，包括将DPAn-6 或多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予所述个体，以延迟所 述个体出现突触功能障碍或降低其严重度，其中所述PUFAs的组合选自： DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的 组合
7.延迟个体出现痴呆或降低其严重度的方法，包括将DPAn-6或多不 饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟所述个体出现 痴呆或降低其严重度，其中所述PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组 合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
8.治疗或预防与淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老素-1(PS1)蛋白、磷酸化τ 蛋白或τ蛋白的量或表达增加或其引起的功能障碍相关的疾病的方法，包 括：
a)当与阴性对照个体的选自Aβ肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白、τ蛋白 及其组合的生物标志的量、表达或生物活性进行比较时，确定所述生物标 志的量、表达或生物活性增加的个体；和
b)将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予所述个体， 以减少所述Aβ肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量、表达或生物活 性，其中所述PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、 DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6 和ARA的组合。
9.治疗或预防与ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的 量减少相关的疾病的方法，包括：
a)确定ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减少的 个体；和
b)将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予所述个体，以 补偿ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减少所引起的 影响，其中所述PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA 的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
10.延迟个体出现脑功能衰退或降低其严重度的方法，包括将DPAn-6 或多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予所述个体，以延迟所 述个体出现脑功能衰退或降低其严重度，其中所述PUFAs的组合选自： DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的 组合。
11.权利要求10的方法，其中脑功能通过选自神经精神测试或认知测 试、脑成像方法(PET、SPECT、CT、MRI、fMRI)和脑电描记术(EEG)的方 法来测量。
12.延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度的方法，包括将DPAn-6或多不 饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予所述个体，以延迟所述个体 的脱髓鞘或降低其严重度，其中所述PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA 的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
13.延迟个体出现与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结或降低其严 重度的方法，包括将DPAn-6或多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的 组合给予所述个体，以延迟所述个体出现神经原纤维缠结或降低其严重度， 其中所述PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组 合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
14.使个体θ波活性稳定或正常化或减少或预防个体不正常θ波活性显 现的方法，包括：
a)确定具有不正常θ波活性或预计不正常θ波活性显现的个体；和
b)将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予所述个体， 以使个体的θ波活性稳定或正常化，或预防或减少个体的不正常θ波活性的 显现，其中所述PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸 (DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、 DPAn-6和ARA的组合。
15.权利要求1至14中任意一项的方法，其中所述个体被确定为易于 患上痴呆或前痴呆或患有痴呆或前痴呆。
16.权利要求15的方法，其中所述痴呆为阿尔茨海默病。
17.权利要求15的方法，其中所述个体通过生物标志的测量、出现痴 呆、中度认知缺损或年龄相关认知衰退的家族史而被确定为患有痴呆或前 痴呆或易于患上痴呆或前痴呆。
18.权利要求17的方法，其中所述生物标志选自APP、Aβ肽、τ蛋白、 磷酸化τ蛋白、PS1和ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源。
19.权利要求17的方法，其中测量源于所述个体的生物样品中所述生 物标志的量、表达或生物活性。
20.权利要求1至14中任意一项的方法，其中在所述给予步骤之前， 所述方法包括测量源于所述个体的生物样品中选自APP、Aβ肽、τ蛋白、 磷酸化τ蛋白和PS1蛋白的生物标志的量、表达或生物活性。
21.权利要求20的方法，还包括比较所述个体样品中所述生物标志的 量、表达或生物活性与相同类型样品中所述生物标志的基线量、表达或生 物活性，其中当与所述基线量、表达或生物活性进行比较时，所述个体样 品中所述生物标志的量、表达或生物活性的增加表明，所述个体面临患上 痴呆的危险或患有痴呆。
22.权利要求1至14中任意一项的方法，其中在所述给予步骤之前， 所述方法包括测量源于所述个体的生物样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸 (PUFA)或其前体或来源的量或生物活性。
23.权利要求22的方法，还包括比较所述个体样品中ω-3或ω-6多不 饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量或生物活性与相同类型样品中所述 ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的基线量或生物活性，其 中当与所述基线量进行比较时，所述个体样品中所述ω-3或ω-6多不饱和 脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量的变化表明，所述个体面临患上痴呆的 危险或患有痴呆。
24.权利要求20至23中任意一项的方法，其中所述测量步骤通过选自 以下的方法来进行：Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、 放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、等离子表面共振、化学发光、荧光偏振、 磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF) 质谱、微细胞计量术、微阵列、显微术、荧光激活细胞分类术(FACS)、流 式细胞计量术、毛细管电泳、蛋白质微芯片或微阵列、脂肪酸甲酯化/气相 色谱、薄层色谱、气相色谱/质谱和液相色谱/质谱。
25.权利要求20至23中任意一项的方法，其中所述生物样品选自细胞 样品、组织样品和体液样品。
26.权利要求25的方法，其中所述生物样品为脑脊液。
27.权利要求25的方法，其中所述生物样品为血液样品。
28.权利要求1至14中任意一项的方法，还包括在所述给予步骤之后， 监测所述PUFA的给予对所述个体的Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白或PS1 蛋白水平的效力至少一次。
29.权利要求1至14中任意一项的方法，还包括在所述给予步骤之后， 监测所述PUFA的给予对所述个体的ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)水 平的效力至少一次。
30.权利要求28或29的方法，还包括在随后的治疗中，基于对所述治 疗效力的监测结果，调整向所述个体给予所述PUFA。
31.权利要求1至30中任意一项的方法，其中所述PUFA包括DPAn-6 和DHA的组合。
32.权利要求1至30中任意一项的方法，其中所述PUFA包括ARA和 DHA的组合。
33.权利要求1至30中任意一项的方法，其中所述PUFA包括DPAn-6、 ARA和DHA的组合。
34.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含30％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFA处于选自以下的化学形式：甘油三 酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所述 PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的鞘 脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组 合。
35.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含40％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFAs处于选自以下的化学形式：甘油 三酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所 述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的 鞘脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其 组合。
36.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含50％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFAs处于选自以下的化学形式：甘油 三酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所 述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的 鞘脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其 组合。
37.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含60％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFAs处于选自以下的化学形式：甘油 三酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所 述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的 鞘脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其 组合。
38.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含70％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFAs处于选自以下的化学形式：甘油 三酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所 述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的 鞘脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其 组合。
39.权利要求1至33中任意一项的方法，其中所述PUFA包括含80％ 或更多所述PUFA的油，其中所述PUFAs处于选自以下的化学形式：甘油 三酯形式、包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所 述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的 鞘脂、酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其 组合。
40.权利要求1至39中任意一项的方法，其中所述PUFA包括DPAn-6 和DHA，并且其中DPAn-6与DHA的比例为约1∶1至约1∶10。
41.权利要求1至39中任意一项的方法，其中所述PUFA包括ARA和 DHA，并且其中ARA与DHA的比例为约1∶1至约1∶10。
42.权利要求1至39中任意一项的方法，其中所述PUFA包括DPAn-6、 ARA和DHA，并且其中DPAn-6与ARA与DHA的比例为约1∶1∶1至约 1∶1∶10。
43.权利要求1至42中任意一项的方法，其中所述PUFA按约50 mg 至约20,000mg/天的量来给予。
44.权利要求1至42中任意一项的方法，其中所述PUFA按约0.025mg 至约15g/天的量来给予。
45.权利要求1至42中任意一项的方法，其中所述PUFA按约0.05mg PUFA/kg体重/天至约275mg PUFA/kg体重/天的量来给予。
46.权利要求1-5、8或14中任意一项的方法，其中所述PUFA为DHA。
47.权利要求1至46中任意一项的方法，其中所述PUFA的来源选自： 鱼油、海洋微型藻类、植物油及其组合。
48.权利要求1至46中任意一项的方法，其中所述PUFA的来源为海 洋微型藻类。
49.权利要求1-5、8或14中任意一项的方法，其中所述PUFA包括 DHA，并且其中DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、 二十二碳五烯酸(DPA)和LNA、EPA或DPA的混合物。
50.权利要求1至49中任意一项的方法，其中所述PUFA通过口服来 给予所述个体。
51.权利要求1至49中任意一项的方法，其中所述PUFA以包括所述 PUFA或其前体或来源的选自以下的制剂形式来给予所述个体：咀嚼片剂、 速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、 乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊 剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、粉剂、颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、 可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏剂、局部用制剂、吸入剂、 气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮存植入剂、可吸收制剂、注 射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、谷类包衣、食物、营养性食 物、功能性食物及其组合。
52.权利要求51的方法，其中所述制剂中的所述PUFA以选自以下的 形式来提供：包括所述PUFA的高度纯化的藻油、包括所述PUFA的甘油三 酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、包 括所述PUFA的干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的鞘脂、所述PUFA 的酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
53.用于治疗或预防患有痴呆或面临患上痴呆危险的个体的痴呆的药 物组合物，包括多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合和至少一种 治疗化合物，其中所述PUFAs的组合选自DPAn-6和DHA、ARA和DHA 及DPAn-6、ARA和DHA。
54.权利要求53的组合物，其中所述PUFAs的组合包括含30％或更多 所述PUFA的油，其中所述PUFA处于选自以下的化学形式：甘油三酯形式、 包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所述PUFA的 蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的鞘脂、酯、 游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
55.权利要求53的组合物，其中所述PUFAs的组合包括含80％或更多 所述PUFA的油，其中所述PUFA处于选自以下的化学形式：甘油三酯形式、 包括所述PUFA的甘油三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所述PUFA的 蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的鞘脂、酯、 游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
56.权利要求53至55中任意一项的组合物，其中所述PUFA的来源选 自：鱼油、海洋藻类、植物油及其组合。
57.权利要求53至55中任意一项的组合物，其中所述PUFA的来源为 海洋微型藻类。
58.权利要求53至55中任意一项的组合物，其中DHA的前体选自： α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和LNA、EPA 或DPA的混合物。
59.权利要求53至58中任意一项的组合物，其中所述PUFA被提供在 选自以下的制剂中：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、酏剂、 液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、 软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、粉剂、 颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏 剂、局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮 存植入剂、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、 谷类包衣、食物、营养性食物、功能性食物及其组合。
60.权利要求59的组合物，其中所述制剂中的所述PUFA以选自以下 的形式来提供：包括所述PUFA的高度纯化的藻油、包括所述PUFA的甘油 三酯油、包括所述PUFA的磷脂、包括所述PUFA的蛋白质和磷脂的组合、 包括所述PUFA的干燥的海洋微型藻类、包括所述PUFA的鞘脂、所述PUFA 的酯、游离脂肪酸、所述PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
61.权利要求53至60中任意一项的组合物，其中所述治疗化合物选自 蛋白质、氨基酸、药物和碳水化合物。
62.权利要求53至60中任意一项的组合物，其中所述治疗化合物选自： 他克林、多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏、美金刚胺、神经妥乐平、促 智药、α-生育酚(维生素E)、司来吉兰、非甾体抗炎药(NSAIDS)、银杏内酯、 雌激素、β-分泌酶抑制剂、疫苗、复合维生素B、钙通道阻滞剂、HMG CoA 还原酶抑制剂、他汀类、甘蔗脂肪醇、贝特类、氯碘羟喹、姜黄素、木脂 素、植物雌激素、植物甾醇、烟酸和维生素补剂。至少一种多不饱和脂肪 酸(PUFA)或其前体或来源在制备组合物中的用途，其中所述PUFA选自： 二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、 DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合；
其中所述组合物用于：降低个体的淀粉状蛋白β(Aβ)肽的水平；降低个 体的τ蛋白的水平；降低个体的早老素-1(PS1)蛋白的水平；治疗或预防与 淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老素-1(PS1)蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量或表 达增加或其引起的功能障碍相关的疾病；或使个体的θ波活性稳定或正常 化，或减少或预防个体的不正常θ波活性的显现。
63.至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源在制备组合物中 的用途，其中所述PUFA选自：二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6 的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合；
其中所述组合物用于：延迟个体出现突触功能障碍或降低其严重度； 延迟个体出现痴呆或降低其严重度；治疗或预防与ω-3或ω-6多不饱和脂 肪酸(PUFA)的量减少相关的疾病；延迟个体出现脑功能衰退或降低其严重 度；延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度；延迟个体出现与阿尔茨海默病相 关的神经原纤维缠结或降低其严重度。
技术领域
本发明大体上涉及用于治疗或预防痴呆和前痴呆(pre-dementia)相关病 症和/或这类病症的症状或特征的组合物和方法。
背景技术
记忆和认知功能的衰退被认为是正常的人体老化结果。年龄相关认知 衰退是用于描述以下情况的术语：相对于其年龄段具有正常认知功能的上 年纪人的客观记忆衰退。年龄相关认知衰退不同于中度认知缺损(MCI)，后 者是较严重或较持续的，并且可能表示病症例如痴呆的早期(APA Presidential Task Force on the Assessment of Age-Consistent Memory Decline and Dementia，February 1998)。考虑到年龄相关认知衰退的高发病率，对于 55岁和更年老的许多个体，记忆丧失是主要的健康问题。
痴呆的特征为整体中枢神经系统功能的丧失，这导致不能理解简单的 概念或指示，不能记住或想起信息，并且导致行为和人格的变化。最常使 用的痴呆诊断标准是DSM-IV(精神障碍诊断和统计手册，美国精神病学联 合会(Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders，American Psychiatric Association))。按照DSM-IV，痴呆的诊断特征包括记忆缺损和以 下情况中的至少一种：语言缺损(失语症)、丧失发挥学会的运动功能的能力 (失用症)、不能认出熟悉的事物(失认症)或在发挥功能或做出决定时出现混 乱。
在美国，痴呆的最普遍形式为阿尔茨海默病(占诊断的40至60％)、血 管性痴呆(占所有诊断的10至20％)、混合型痴呆(Mixed Dementia)(占所有诊 断的10％)、路易体痴呆(Dementia with Lewy Bodies)(占所有诊断的10％)。 在美国，由药物、精神错乱或抑郁导致的继发性痴呆占所有痴呆诊断的5％ 或更少。
将阿尔茨海默病(AD)归类为带有神经变性的痴呆，其在世界范围内是 普遍的。AD的诊断特征通过尸检被确认为：淀粉状蛋白(amyloid)斑块的积 聚和神经原纤维的缠结、在大脑若干区域内的突触缺失和神经变性及脑室 的扩大。老年痴呆本身指在65岁以上的群体中出现的各种痴呆，包括AD。 然而，对引起AD发生的致病机理的认识是不够的。
在组织学上，有关AD的重要神经病理学研究成果包括：神经元内淀 粉状蛋白肽、淀粉状蛋白斑块、神经原纤维缠结、突触缺失和神经元细胞 死亡是增加的。淀粉状蛋白斑块负荷量是AD严重度的预测指标，虽然增加 的斑块负荷量与认知功能的缺损不是十分相关。Morris和Price(2001)表示， 在新皮质中广泛分布的淀粉状蛋白斑块是辨别极早期AD的最好指标。其它 AD损害，包括增加的神经原纤维缠结形成和神经元变性，似乎由淀粉状蛋 白所触发的病理过程所引起，虽然这些损害可能对痴呆的表现和严重度具 有更即时的效应。
已将个体尤其是上年纪个体的鱼类消耗与改善认知性能、减少攻击表 现和降低阿尔茨海默病和痴呆危险相关联。已显示的是，补充二十二碳六 烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的组合可改善患有或不患有痴呆的受试对 象的认知性能和视敏度(Suzuki et al(2001))。另外，对阿尔茨海默病的转基 因小鼠模型的研究表明，DHA使淀粉状蛋白水平和斑块负荷减少，其中所 述小鼠在编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的基因中具有突变。然而，在本发 明之前，尚未确定鱼类消耗或DHA或EPA消耗的影响的作用机理，尤其是 就阿尔茨海默病的病理生理学而言。
传统上，对神经病或神经损伤的治疗或预防集中在药物途径。例如， 正在不断开发神经精神药物或神经变性药物，这些药物使症状缓解，但不 能缓解神经问题的内在原因。因而，在本领域中，还需要新颖的治疗策略， 用于治疗在痴呆例如AD中出现的神经病。另外，虽然证据表明，鱼类消耗 和/或DHA和EPA的补充可减少AD相关症状，但在本领域中，需要确定 这种治疗的作用机理，从而可开发改进的配方和方案，并且可容易地确定 面临AD发生危险的个体，且在治疗最有效的时间点，具体为在出现临床症 状之前，对其进行治疗。
痴呆的特征为整体中枢神经系统功能的丧失，这导致不能理解简单的 概念或指示，不能记住或想起信息，并且导致行为和人格的变化。最常使 用的痴呆诊断标准是DSM-IV(精神障碍诊断和统计手册，美国精神病学联 合会(Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders，American Psychiatric Association))。按照DSM-IV，痴呆的诊断特征包括记忆缺损和以 下情况中的至少一种：语言缺损(失语症)、丧失发挥学会的运动功能的能力 (失用症)、不能认出熟悉的事物(失认症)或在发挥功能或做出决定时出现混 乱。
在美国，痴呆的最普遍形式为阿尔茨海默病(占诊断的40至60％)、血 管性痴呆(占所有诊断的10至20％)、混合型痴呆(Mixed Dementia)(占所有诊 断的10％)、路易体痴呆(Dementia with Lewy Bodies)(占所有诊断的10％)。 在美国，由药物、精神错乱或抑郁导致的继发性痴呆占所有痴呆诊断的5％ 或更少。
将阿尔茨海默病(AD)归类为带有神经变性的痴呆，其在世界范围内是 普遍的。AD的诊断特征通过尸检被确认为：淀粉状蛋白(amyloid)斑块的积 聚和神经原纤维的缠结、在大脑若干区域内的突触缺失和神经变性及脑室 的扩大。老年痴呆本身指在65岁以上的群体中出现的各种痴呆，包括AD。 然而，对引起AD发生的致病机理的认识是不够的。
在组织学上，有关AD的重要神经病理学研究成果包括：神经元内淀 粉状蛋白肽、淀粉状蛋白斑块、神经原纤维缠结、突触缺失和神经元细胞 死亡是增加的。淀粉状蛋白斑块负荷量是AD严重度的预测指标，虽然增加 的斑块负荷量与认知功能的缺损不是十分相关。Morris和Price(2001)表示， 在新皮质中广泛分布的淀粉状蛋白斑块是辨别极早期AD的最好指标。其它 AD损害，包括增加的神经原纤维缠结形成和神经元变性，似乎由淀粉状蛋 白所触发的病理过程所引起，虽然这些损害可能对痴呆的表现和严重度具 有更即时的效应。
已将个体尤其是上年纪个体的鱼类消耗与改善认知性能、减少攻击表 现和降低阿尔茨海默病和痴呆危险相关联。已显示的是，补充二十二碳六 烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的组合可改善患有或不患有痴呆的受试对 象的认知性能和视敏度(Suzuki et al(2001))。另外，对阿尔茨海默病的转基 因小鼠模型的研究表明，DHA使淀粉状蛋白水平和斑块负荷减少，其中所 述小鼠在编码淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的基因中具有突变。然而，在本发 明之前，尚未确定鱼类消耗或DHA或EPA消耗的影响的作用机理，尤其是 就阿尔茨海默病的病理生理学而言。
传统上，对神经病或神经损伤的治疗或预防集中在药物途径。例如， 正在不断开发神经精神药物或神经变性药物，这些药物使症状缓解，但不 能缓解神经问题的内在原因。因而，在本领域中，还需要新颖的治疗策略， 用于治疗在痴呆例如AD中出现的神经病。另外，虽然证据表明，鱼类消耗 和/或DHA和EPA的补充可减少AD相关症状，但在本领域中，需要确定 这种治疗的作用机理，从而可开发改进的配方和方案，并且可容易地确定 面临AD发生危险的个体，且在治疗最有效的时间点，具体为在出现临床症 状之前，对其进行治疗。
发明内容
本发明的一个实施方案涉及使个体的淀粉状蛋白β(Aβ)肽水平降低的 方法。该方法包括将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予 个体，以使个体的Aβ肽的水平降低，其中PUFA选自：二十二碳六烯酸 (DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生 四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。在一个方面，Aβ肽 为可溶性Aβ肽。
本发明的另一个实施方案涉及使个体的τ蛋白水平降低的方法。该方 法包括将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以使 个体的τ蛋白的水平降低，其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十 二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA) 的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。在一个方面，τ蛋白为磷酸化τ 蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及使个体的早老素-1(PS1)蛋白水平降低的 方法。该方法包括将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予 个体，以使个体的PS 1蛋白的水平降低，其中PUFA选自：二十二碳六烯 酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花 生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现突触功能障碍或降低其严 重度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方 案中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟 个体出现突触功能障碍或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6 和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现痴呆或降低其严重度的方 法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方案中，将 多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟个体出现 痴呆或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、 ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及治疗或预防与淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老 素-1(PS1)蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量或表达增加或其引起的功能障碍 相关的疾病的方法。该方法包括以下步骤：(a)当与阴性对照个体的选自Aβ 肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白、τ蛋白及其组合的生物标志的量、表达或生 物活性进行比较时，确定出现所述生物标志的量、表达或生物活性增加的 个体；和(b)将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体， 以减少Aβ肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量、表达或生物活性， 其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA 和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和 ARA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及治疗或预防与ω-3或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)或其前体或来源的量减少相关的疾病的方法。该方法包括以下步 骤：(a)确定出现ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减 少的个体；和(b)将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个 体，以补偿ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减少所 引起的影响，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和 DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现脑功能衰退或降低其严重 度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方案 中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟个 体出现脑功能衰退或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6、 DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的 组合。在一个方面，脑功能通过选自神经心理测试或认知测试、脑成像方 法(PET、SPECT、CT、MRI、fMRI)和脑电描记术(EEG)的方法来测量。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度的方 法。该方法包括将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个 体，以延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6 和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现与阿尔茨海默病相关的神 经原纤维缠结或降低其严重度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予 个体，或在优选的实施方案中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源 的组合给予个体，以延迟个体出现神经原纤维缠结或降低其严重度，其中 PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、 ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及使个体θ波活性稳定或正常化或减少或 预防个体不正常θ波活性显现的方法。该方法包括以下步骤：(a)确定具有 不正常θ波活性或预计不正常θ波活性显现的个体；和(b)将至少一种多不 饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以使个体的θ波活性稳定或 正常化，或预防或减少个体的不正常θ波活性的显现，其中PUFA选自：二 十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、 DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。
在以上任意实施方案中，在一个方面，将个体确定为易于患上或患有 痴呆或前痴呆。在一个方面，所述痴呆为阿尔茨海默病。例如，在一个方 面，通过生物标志的测量、出现痴呆、中度认知缺损或年龄相关认知衰退 的家族史，将个体确定为患有或易于患上痴呆或前痴呆。生物标志可包括 但不局限于APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1和ω-3或ω-6多不饱 和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源。在一个方面，测量源于个体的生物样品 中生物标志的量、表达或生物活性。生物样品可包括但不局限于细胞样品、 组织样品和体液样品，特别优选的样品包括脑脊液或血液样品。
在以上任意实施方案的一个方面，在给予步骤之前，该方法可包括测 量源于个体的生物样品中选自APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1 蛋白的生物标志的量、表达或生物活性。在一个方面，该方法还可包括： 比较个体样品中生物标志的量、表达或生物活性与相同类型样品中生物标 志的基线量、表达或生物活性，其中当与基线量、表达或生物活性进行比 较时，个体样品中生物标志的量、表达或生物活性的增加表明，个体面患 上临痴呆的危险或患有痴呆。
在以上任意实施方案的一个方面，在给予步骤之前，该方法可包括测 量源于个体的生物样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来 源的量或生物活性。在一个方面，该方法还可包括：比较个体样品中ω-3 或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量或生物活性与相同类型 样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的基线量或生物 活性，其中当与基线量比较时，个体样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 或其前体或来源的量的变化表明，个体面临患上痴呆的危险或患有痴呆。
测量生物标志或ω-3或ω-6 PUFA的量或活性的步骤可包括但不局限于 Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 免疫沉淀、等离子表面共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学 分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计量术、 微阵列、显微术、荧光激活细胞分类术(FACS)、流式细胞计量术、毛细管 电泳、蛋白质微芯片或微阵列、脂肪酸甲酯化/气相色谱、薄层色谱、气相 色谱/质谱和液相色谱/质谱。
上述任意实施方案还可包括：在给予步骤之后，监测PUFA的给予对 个体的Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白或PS1蛋白水平的效力至少一次。类 似地，上述任意实施方案还可包括：在给予步骤之后，监测PUFA的给予 对个体的ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)水平的效力至少一次。基于这 些监测结果，该方法还可包括在随后的治疗中，调整向个体给予PUFA。
在本发明的上述任意实施方案中，PUFA可包括含30％、40％、50％、 60％、70％、80％或更多PUFA的油，其中PUFA处于选自以下的化学形式： 甘油三酯形式、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括PUFA 的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类(marine microalgae)、包括 PUFA的鞘脂、酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及 其组合。
在本发明的上述任意实施方案中，当PUFA包括DPAn-6和DHA时， DPAn-6与DHA的比例可包括约1∶1至约1∶10的比例。在本发明的上述任 意实施方案中，当PUFA包括ARA和DHA时，ARA与DHA的比例可包 括约1∶1至约1∶10的比例。在本发明的上述任意实施方案中，当PUFA包 括DPAn-6、ARA和DHA时，DPAn-6与ARA与DHA的比例可包括约1∶1∶1 至约1∶1∶10的比例。
在本发明的上述任意实施方案中，在一个方面，PUFA可按约50mg至 约20,000mg/天的量来给予。在另一个方面，PUFA可按约0.025mg/天至约 15g/天的量来给予。在另一个方面，PUFA可按约0.05mg/kg体重/天至约 275mg/kg体重/天的量来给予。
在本发明的上述任意实施方案中，PUFA的来源可包括但不局限于鱼 油、海洋微型藻类、植物油及其组合。
在上述任意实施方案的一个方面，PUFA包括DHA，其中DHA的前体 选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)及LNA、 EPA或DPA的混合物。
在本发明的上述任意实施方案中，可通过口服将PUFA给予个体。在 一个方面，可将PUFA以包括PUFA或其前体或来源的选自以下的制剂形式 给予个体：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂(reconstitutable powder)、酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双 层片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂(caplet)、锭剂、 咀嚼锭剂(chewable lozenge)、珠子(bead)、粉剂、颗粒剂、粉粒剂、微粒剂 (microparticle)、可分散颗粒剂、扁囊剂(cachet)、灌洗剂、栓剂、乳膏剂、 局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮存植 入剂(depot implant)、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物(health bar)、 糖膏剂(confection)、谷类、谷类包衣(cereal coating)、食物、营养性食物、 功能性食物及其组合。在另一个方面，制剂中的PUFA以选自以下的形式 来提供：包括PUFA的高度纯化的藻油(algal oil)、包括PUFA的甘油三酯油、 包括PUFA的磷脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、包括PUFA的干燥 的海洋微型藻类、包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、游离脂肪酸、PUFA与 另一种生物活性分子的结合物及其组合。本发明的另一个实施方案涉及用 于治疗或预防患有痴呆或面临患上痴呆危险的个体的痴呆的药物组合物， 所述药物组合物包括DHA、DPAn-6或多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或 来源的组合和至少一种治疗化合物。PUFAs的组合选自DPAn-6和DHA、 ARA和DHA及DPAn-6、ARA和DHA。在一个方面，PUFAs的组合包括 含30％或更多或多至80％或更多所述PUFA的油，其中PUFA处于选自以 下的化学形式：甘油三酯形式、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷 脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括PUFA 的鞘脂、酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。 在一个方面，PUFA的来源选自：鱼油、海洋藻类、植物油及其组合。在一 个方面，DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二 碳五烯酸(DPA)及LNA、EPA或DPA的混合物。在一个方面，将PUFA提 供在选自以下的制剂中：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、 酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、 胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、 粉剂、颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、 乳膏剂、局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、 贮存植入剂、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、 谷类包衣、食物、营养性食物、功能性食物及其组合。在一个方面，制剂 中的PUFA以选自以下的形式来提供：包括PUFA的高度纯化的藻油、包括 PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组 合、包括PUFA的干燥的海洋微型藻类、包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、 游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
可包括在本发明组合物中的治疗化合物可包括但不局限于蛋白质、氨 基酸、药物和碳水化合物。在一个方面，治疗化合物选自：他克林、多奈 哌齐、利伐斯的明、加兰他敏、美金刚胺、神经妥乐平(neotropin)、促智药、 α-生育酚(维生素E)、司来吉兰(selegeline)、非甾体抗炎药(NSAIDS)、银杏 内酯、雌激素、β-分泌酶抑制剂、疫苗、复合维生素B、钙通道阻滞剂、 HMG CoA还原酶抑制剂、他汀类、甘蔗脂肪醇、贝特类、氯碘羟喹、姜黄 素、木脂素、植物雌激素、植物甾醇、烟酸和维生素补剂。
本发明的另一个实施方案为至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体 或来源在制备组合物中的用途，其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、 二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA) 的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。将这种组合物用于：降低个体的 淀粉状蛋白β(Aβ)肽的水平；降低个体的τ蛋白的水平；降低个体的早老素 -1(PS1)蛋白的水平；治疗或预防与淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老素-1(PS1)蛋白、 磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量或表达增加或其引起的功能障碍相关的疾病；和 /或使个体的θ波活性稳定或正常化，或减少或预防个体的不正常θ波活性 的显现。
本发明的另一个实施方案涉及至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前 体或来源在制备组合物中的用途，其中PUFA选自：二十二碳五烯酸 (DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、 DPAn-6和ARA的组合。将这种组合物用于：延迟个体出现突触功能障碍 或降低其严重度；延迟个体出现痴呆或降低其严重度；治疗或预防与ω-3 或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)的量减少相关的疾病；延迟个体出现脑功能 衰退或降低其严重度；延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度；和/或延迟个体 出现与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结或降低其严重度。
附图说明
图1A-1C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图1A，n＝6)、6个月(图1B，n＝6) 或9个月(图1C，n＝6)饮食处理之后的全脑脂肪酸分布。
图2A-2C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图2A)、6个月(图2B)或9个月 (图2C)饮食处理之后的红细胞脂肪酸分布。
图3A-3C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图3A)、6个月(图3B)或9个月 (图3C)饮食处理之后的脑磷脂酰胆碱(PC)分布。
图4A-4C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图4A)、6个月(图4B)或9个月 (图4C)饮食处理之后的脑磷脂酰乙醇胺(PE)分布。
图5A-5C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图5A)、6个月(图5B)或9个月 (图5C)饮食处理之后的脑磷脂酰丝氨酸(PS)分布。
图6A-6F显示3xTg-AD小鼠在3个月(图6A和6B，n＝6)、6个月(图 6C和6D，n＝6)和9个月(图6E和6F，n＝6)DHA饮食处理之后的可溶性Aβ 水平(图6A、6C、6E)和不溶性Aβ水平(图6B、6D、F)。
图6G-6J为数字图像，其显示在用对照饮食(图6G)、DHA/DPA饮食(图 6H)、DHA饮食(图6I)和DHA/ARA饮食(图6J)处理3个月的小鼠的40μM 切片中，用DAB染色的6E10显示Aβ样免疫反应性。
图7A-7D显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的APP片段(图7A 和7B)和IDE(图7C和7D)的稳态水平(图7A和7C)和对其蛋白印迹的定量 (图7B和7D)，将所述蛋白印迹归一化至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8A-8B显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的ADAM10和 BACE的稳态水平(图8A)和对蛋白印迹的定量(图8B)，将所述蛋白印迹归 一化至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8C-8D显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的早老素1和呆蛋 白的稳态水平(图8C)和对蛋白印迹的定量(图8D)，将所述蛋白印迹归一化 至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8E显示DHA使SHSY5Y细胞(用0.3μg/ml DHA与BSA(二者比例 为3∶1)(n＝3)处理48小时或单独用等量的BSA(n＝3)处理48小时)中的早老素 1mRNA显著减少(*，p＜0.05)。
图9A-9F显示3xTg-AD小鼠在3个月(图9A和9B)、6个月(图9C和 9D)和9个月(图9E和9F)DHA饮食处理之后的τ蛋白的稳态水平(图9A、 9C和9E)和对蛋白印迹的定量(图9B、9D和9F)，将所述蛋白印迹归一化至 作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图10A-10D为数字化图像，其显示3xTg-AD小鼠在3个月(图10A＝对 照饮食、图10B＝DHA/DPA饮食、图10C＝DHA饮食、图10D＝DHA/花生四 烯酸)饮食处理之后的构象发生变化的τ蛋白免疫反应性。
图10E为免疫印迹的数字化图像，其显示在9个月饮食处理之后的磷 酸化τ蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及使个体的τ蛋白水平降低的方法。该方 法包括将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以使 个体的τ蛋白的水平降低，其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十 二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA) 的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。在一个方面，τ蛋白为磷酸化τ 蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及使个体的早老素-1(PS1)蛋白水平降低的 方法。该方法包括将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予 个体，以使个体的PS 1蛋白的水平降低，其中PUFA选自：二十二碳六烯 酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花 生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现突触功能障碍或降低其严 重度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方 案中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟 个体出现突触功能障碍或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6 和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现痴呆或降低其严重度的方 法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方案中，将 多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟个体出现 痴呆或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、 ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及治疗或预防与淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老 素-1(PS1)蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量或表达增加或其引起的功能障碍 相关的疾病的方法。该方法包括以下步骤：(a)当与阴性对照个体的选自Aβ 肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白、τ蛋白及其组合的生物标志的量、表达或生 物活性进行比较时，确定出现所述生物标志的量、表达或生物活性增加的 个体；和(b)将至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体， 以减少Aβ肽、PS1蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量、表达或生物活性， 其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA 和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和 ARA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及治疗或预防与ω-3或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)或其前体或来源的量减少相关的疾病的方法。该方法包括以下步 骤：(a)确定出现ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减 少的个体；和(b)将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个 体，以补偿ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量减少所 引起的影响，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和 DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现脑功能衰退或降低其严重 度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予个体，或在优选的实施方案 中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个体，以延迟个 体出现脑功能衰退或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6、 DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的 组合。在一个方面，脑功能通过选自神经心理测试或认知测试、脑成像方 法(PET、SPECT、CT、MRI、fMRI)和脑电描记术(EEG)的方法来测量。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度的方 法。该方法包括将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源的组合给予个 体，以延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度，其中PUFAs的组合选自：DPAn-6 和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体出现与阿尔茨海默病相关的神 经原纤维缠结或降低其严重度的方法。该方法包括将DHA或DPAn-6给予 个体，或在优选的实施方案中，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或来源 的组合给予个体，以延迟个体出现神经原纤维缠结或降低其严重度，其中 PUFAs的组合选自：DPAn-6和DHA的组合、ARA和DHA的组合及DPAn-6、 ARA和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及使个体θ波活性稳定或正常化或减少或 预防个体不正常θ波活性显现的方法。该方法包括以下步骤：(a)确定具有 不正常θ波活性或预计不正常θ波活性显现的个体；和(b)将至少一种多不 饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源给予个体，以使个体的θ波活性稳定或 正常化，或预防或减少个体的不正常θ波活性的显现，其中PUFA选自：二 十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、 DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。
在以上任意实施方案中，在一个方面，将个体确定为易于患上或患有 痴呆或前痴呆。在一个方面，所述痴呆为阿尔茨海默病。例如，在一个方 面，通过生物标志的测量、出现痴呆、中度认知缺损或年龄相关认知衰退 的家族史，将个体确定为患有或易于患上痴呆或前痴呆。生物标志可包括 但不局限于APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1和ω-3或ω-6多不饱 和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源。在一个方面，测量源于个体的生物样品 中生物标志的量、表达或生物活性。生物样品可包括但不局限于细胞样品、 组织样品和体液样品，特别优选的样品包括脑脊液或血液样品。
在以上任意实施方案的一个方面，在给予步骤之前，该方法可包括测 量源于个体的生物样品中选自APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1 蛋白的生物标志的量、表达或生物活性。在一个方面，该方法还可包括： 比较个体样品中生物标志的量、表达或生物活性与相同类型样品中生物标 志的基线量、表达或生物活性，其中当与基线量、表达或生物活性进行比 较时，个体样品中生物标志的量、表达或生物活性的增加表明，个体面患 上临痴呆的危险或患有痴呆。
在以上任意实施方案的一个方面，在给予步骤之前，该方法可包括测 量源于个体的生物样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来 源的量或生物活性。在一个方面，该方法还可包括：比较个体样品中ω-3 或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的量或生物活性与相同类型 样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体或来源的基线量或生物 活性，其中当与基线量比较时，个体样品中ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 或其前体或来源的量的变化表明，个体面临患上痴呆的危险或患有痴呆。
测量生物标志或ω-3或ω-6 PUFA的量或活性的步骤可包括但不局限于 Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 免疫沉淀、等离子表面共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学 分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计量术、 微阵列、显微术、荧光激活细胞分类术(FACS)、流式细胞计量术、毛细管 电泳、蛋白质微芯片或微阵列、脂肪酸甲酯化/气相色谱、薄层色谱、气相 色谱/质谱和液相色谱/质谱。
上述任意实施方案还可包括：在给予步骤之后，监测PUFA的给予对 个体的Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白或PS1蛋白水平的效力至少一次。类 似地，上述任意实施方案还可包括：在给予步骤之后，监测PUFA的给予 对个体的ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)水平的效力至少一次。基于这 些监测结果，该方法还可包括在随后的治疗中，调整向个体给予PUFA。
在本发明的上述任意实施方案中，PUFA可包括含30％、40％、50％、 60％、70％、80％或更多PUFA的油，其中PUFA处于选自以下的化学形式： 甘油三酯形式、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括PUFA 的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类(marine microalgae)、包括 PUFA的鞘脂、酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及 其组合。
在本发明的上述任意实施方案中，当PUFA包括DPAn-6和DHA时， DPAn-6与DHA的比例可包括约1∶1至约1∶10的比例。在本发明的上述任 意实施方案中，当PUFA包括ARA和DHA时，ARA与DHA的比例可包 括约1∶1至约1∶10的比例。在本发明的上述任意实施方案中，当PUFA包 括DPAn-6、ARA和DHA时，DPAn-6与ARA与DHA的比例可包括约1∶1∶1 至约1∶1∶10的比例。
在本发明的上述任意实施方案中，在一个方面，PUFA可按约50mg至 约20,000mg/天的量来给予。在另一个方面，PUFA可按约0.025mg/天至约 15g/天的量来给予。在另一个方面，PUFA可按约0.05mg/kg体重/天至约 275mg/kg体重/天的量来给予。
在本发明的上述任意实施方案中，PUFA的来源可包括但不局限于鱼 油、海洋微型藻类、植物油及其组合。
在上述任意实施方案的一个方面，PUFA包括DHA，其中DHA的前体 选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)及LNA、 EPA或DPA的混合物。
在本发明的上述任意实施方案中，可通过口服将PUFA给予个体。在 一个方面，可将PUFA以包括PUFA或其前体或来源的选自以下的制剂形式 给予个体：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂(reconstitutable powder)、酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双 层片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂(caplet)、锭剂、 咀嚼锭剂(chewable lozenge)、珠子(bead)、粉剂、颗粒剂、粉粒剂、微粒剂 (microparticle)、可分散颗粒剂、扁囊剂(cachet)、灌洗剂、栓剂、乳膏剂、 局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮存植 入剂(depot implant)、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物(health bar)、 糖膏剂(confection)、谷类、谷类包衣(cereal coating)、食物、营养性食物、 功能性食物及其组合。在另一个方面，制剂中的PUFA以选自以下的形式 来提供：包括PUFA的高度纯化的藻油(algal oil)、包括PUFA的甘油三酯油、 包括PUFA的磷脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、包括PUFA的干燥 的海洋微型藻类、包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、游离脂肪酸、PUFA与 另一种生物活性分子的结合物及其组合。本发明的另一个实施方案涉及用 于治疗或预防患有痴呆或面临患上痴呆危险的个体的痴呆的药物组合物， 所述药物组合物包括DHA、DPAn-6或多不饱和脂肪酸(PUFAs)或其前体或 来源的组合和至少一种治疗化合物。PUFAs的组合选自DPAn-6和DHA、 ARA和DHA及DPAn-6、ARA和DHA。在一个方面，PUFAs的组合包括 含30％或更多或多至80％或更多所述PUFA的油，其中PUFA处于选自以 下的化学形式：甘油三酯形式、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷 脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、干燥的海洋微型藻类、包括PUFA 的鞘脂、酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。 在一个方面，PUFA的来源选自：鱼油、海洋藻类、植物油及其组合。在一 个方面，DHA的前体选自：α-亚麻酸(LNA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二 碳五烯酸(DPA)及LNA、EPA或DPA的混合物。在一个方面，将PUFA提 供在选自以下的制剂中：咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、 酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、 胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、 粉剂、颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、 乳膏剂、局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、 贮存植入剂、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、 谷类包衣、食物、营养性食物、功能性食物及其组合。在一个方面，制剂 中的PUFA以选自以下的形式来提供：包括PUFA的高度纯化的藻油、包括 PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组 合、包括PUFA的干燥的海洋微型藻类、包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、 游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分子的结合物及其组合。
可包括在本发明组合物中的治疗化合物可包括但不局限于蛋白质、氨 基酸、药物和碳水化合物。在一个方面，治疗化合物选自：他克林、多奈 哌齐、利伐斯的明、加兰他敏、美金刚胺、神经妥乐平(neotropin)、促智药、 α-生育酚(维生素E)、司来吉兰(selegeline)、非甾体抗炎药(NSAIDS)、银杏 内酯、雌激素、β-分泌酶抑制剂、疫苗、复合维生素B、钙通道阻滞剂、 HMG CoA还原酶抑制剂、他汀类、甘蔗脂肪醇、贝特类、氯碘羟喹、姜黄 素、木脂素、植物雌激素、植物甾醇、烟酸和维生素补剂。
本发明的另一个实施方案为至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前体 或来源在制备组合物中的用途，其中PUFA选自：二十二碳六烯酸(DHA)、 二十二碳五烯酸(DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA) 的组合及DHA、DPAn-6和ARA的组合。将这种组合物用于：降低个体的 淀粉状蛋白β(Aβ)肽的水平；降低个体的τ蛋白的水平；降低个体的早老素 -1(PS1)蛋白的水平；治疗或预防与淀粉状蛋白β(Aβ)肽、早老素-1(PS1)蛋白、 磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量或表达增加或其引起的功能障碍相关的疾病；和 /或使个体的θ波活性稳定或正常化，或减少或预防个体的不正常θ波活性 的显现。
本发明的另一个实施方案涉及至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)或其前 体或来源在制备组合物中的用途，其中PUFA选自：二十二碳五烯酸 (DPAn-6)、DHA和DPAn-6的组合、DHA和花生四烯酸(ARA)的组合及DHA、 DPAn-6和ARA的组合。将这种组合物用于：延迟个体出现突触功能障碍 或降低其严重度；延迟个体出现痴呆或降低其严重度；治疗或预防与ω-3 或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)的量减少相关的疾病；延迟个体出现脑功能 衰退或降低其严重度；延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度；和/或延迟个体 出现与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结或降低其严重度。
附图说明
图1A-1C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图1A，n＝6)、6个月(图1B，n＝6) 或9个月(图1C，n＝6)饮食处理之后的全脑脂肪酸分布。
图2A-2C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图2A)、6个月(图2B)或9个月 (图2C)饮食处理之后的红细胞脂肪酸分布。
图3A-3C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图3A)、6个月(图3B)或9个月 (图3C)饮食处理之后的脑磷脂酰胆碱(PC)分布。
图4A-4C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图4A)、6个月(图4B)或9个月 (图4C)饮食处理之后的脑磷脂酰乙醇胺(PE)分布。
图5A-5C显示3xTg-AD小鼠在3个月(图5A)、6个月(图5B)或9个月 (图5C)饮食处理之后的脑磷脂酰丝氨酸(PS)分布。
图6A-6F显示3xTg-AD小鼠在3个月(图6A和6B，n＝6)、6个月(图 6C和6D，n＝6)和9个月(图6E和6F，n＝6)DHA饮食处理之后的可溶性Aβ 水平(图6A、6C、6E)和不溶性Aβ水平(图6B、6D、F)。
图6G-6J为数字图像，其显示在用对照饮食(图6G)、DHA/DPA饮食(图 6H)、DHA饮食(图6I)和DHA/ARA饮食(图6J)处理3个月的小鼠的40μM 切片中，用DAB染色的6E10显示Aβ样免疫反应性。
图7A-7D显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的APP片段(图7A 和7B)和IDE(图7C和7D)的稳态水平(图7A和7C)和对其蛋白印迹的定量 (图7B和7D)，将所述蛋白印迹归一化至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8A-8B显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的ADAM10和 BACE的稳态水平(图8A)和对蛋白印迹的定量(图8B)，将所述蛋白印迹归 一化至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8C-8D显示3xTg-AD小鼠在DHA饮食处理之后的早老素1和呆蛋 白的稳态水平(图8C)和对蛋白印迹的定量(图8D)，将所述蛋白印迹归一化 至作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图8E显示DHA使SHSY5Y细胞(用0.3μg/ml DHA与BSA(二者比例 为3∶1)(n＝3)处理48小时或单独用等量的BSA(n＝3)处理48小时)中的早老素 1mRNA显著减少(*，p＜0.05)。
图9A-9F显示3xTg-AD小鼠在3个月(图9A和9B)、6个月(图9C和 9D)和9个月(图9E和9F)DHA饮食处理之后的τ蛋白的稳态水平(图9A、 9C和9E)和对蛋白印迹的定量(图9B、9D和9F)，将所述蛋白印迹归一化至 作为负荷对照的β-肌动蛋白水平。
图10A-10D为数字化图像，其显示3xTg-AD小鼠在3个月(图10A＝对 照饮食、图10B＝DHA/DPA饮食、图10C＝DHA饮食、图10D＝DHA/花生四 烯酸)饮食处理之后的构象发生变化的τ蛋白免疫反应性。
图10E为免疫印迹的数字化图像，其显示在9个月饮食处理之后的磷 酸化τ蛋白。
具体实施方式
本发明大体上涉及使用脂肪酸补充疗法优选为ω-3和/或ω-6多不饱和 脂肪酸(PUFA)补充疗法(例如DHA和DPAn-6)的方法，以延迟痴呆的出现和 /或降低其严重度和/或症状，和/或降低与痴呆(包括阿尔茨海默病(AD))发生 和/或痴呆进展相关的生物化合物(例如蛋白质)的水平。具体地，本发明涉 及以下方法：降低个体神经组织中淀粉状蛋白-β(可溶性或不溶性)、τ蛋白、 τ磷酸化蛋白和/或早老素-1(PS1)蛋白水平的方法；延迟个体的突触功能障 碍、脑功能衰退、脱髓鞘、神经原纤维缠结形成和/或痴呆或降低其严重度 的方法；治疗或预防与淀粉状蛋白-β、τ蛋白(可溶性或不溶性)、磷酸化τ 蛋白和/或早老素-1(PS1)蛋白的量增加或ω-3和/或ω-6PUFAs的量减少相关 的疾病的方法。本发明也涉及使个体θ波活性稳定或正常化或减少或预防 个体不正常θ波活性显现的方法。本发明的方法大体上包括：将一定量的 至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个 体。在某些实施方案中，PUFA包括DPAn-6和DHA的组合、DHA和ARA 的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在某些实施方案中，PUFA包括 单独的DHA和/或DPAn-6和/或ARA、DHA和/或DPAn-6和/或ARA彼此 的组合和/或DHA和/或DPAn-6和/或ARA与其它PUFAs的组合。
根据本发明，痴呆的特征为整体中枢神经系统功能的丧失，这导致不 能理解简单的概念或指示，不能记住或想起信息，并且导致行为和人格的 变化。最常使用的痴呆诊断标准是DSM-IV(精神障碍诊断和统计手册，美 国精神病学联合会)。按照DSM-IV，痴呆的诊断特征包括记忆缺损和以下 情况中的至少一种：语言缺损(失语症)、丧失发挥学会的运动功能的能力(失 用症)、不能认出熟悉的事物(失认症)或在发挥功能或做出决定时出现混乱。 阿尔茨海默病(AD)为最普遍的痴呆形式。
近来，位于欧文的加利福尼亚大学的小组已开发并且报道了阿尔茨海 默病的小鼠三元转基因模型(triple transgenic model)(Oddo et al.，2003)。这些 小鼠包含PS1M146V、APPSwe和τP301L转基因。早老素-1(PS1)为在脑细胞中产 生的蛋白质，并且与Aβ肽的量增加相关联。14号染色体上的PS1基因的 遗传突变是导致家族性阿尔茨海默病的原因。淀粉状蛋白前体蛋白(APP)为 通常在脑中发现的功能未确定的蛋白质。在阿尔茨海默病中，APP发生不 正常的降解，这导致淀粉状蛋白的形成。τ蛋白为高度不对称并且热稳定的 蛋白质，其主要在脑中表达，其中τ蛋白调节神经元、星形胶质细胞和少突 胶质细胞中微管的定向和稳定性。这些三元转基因小鼠在阿尔茨海默病相 关脑区域(海马、杏仁体和大脑皮质)中形成斑块和缠结病理。这些小鼠在缠 结形成之前，出现细胞外Aβ沉积，这与淀粉状蛋白级联假说相一致。小鼠 早在六月龄时就出现突触功能障碍。虽然在此年龄，在海马区域没有出现 任何细胞外Aβ沉积，但在此年龄，已出现Aβ肽(包括最致病的Aβ42肽)的 细胞内积聚。这种模型的研究成果表明，神经元内的Aβ是所观察到的突触 功能障碍的基础。在人类个体中，缠结形成通常开始于边缘脑结构中，且 逐步发展至皮质区域，这与在所述小鼠模型中观察到的模式相同。
发明人已使用这种与人类AD非常相像的小鼠模型，来确定PUFAs对 AD发生和进展的作用机理，并且开发用于预防和治疗AD的新颖的治疗策 略和组合物。发明人提供多组用包括一种或多种PUFAs的相当多的饮食来 源的饮食饲喂的上述小鼠。所述饮食包括富含DHA的饮食、富含DHA和 DPAn-6的饮食及富含DHA和ARA的饮食。发明人已令人惊讶地发现，在 这种动物模型中，PUFAs的给予事实上减少了可溶性Aβ的量，减少了总τ 蛋白的量，并且减少了早老素-1的量。具体地，发明人已发现，包含DHA 的饮食使可溶性Aβ的水平降低，虽然DHA的作用随时间推移而减弱，尤 其是在肾上腺酸或花生四烯酸水平提高的个体中或在DPAn-6水平降低的 个体中。随时间推移，只包含DHA的饮食是最有效的，但在更早的时间点， DHA和DPAn-6的组合也是有效的，在早的时间点，DHA和ARA组合也 是有效的。而且，发明人发现，DHA和DPAn-6的组合呈现令人惊讶的意 想不到的益处，这是因为当与只饲喂DHA的动物比较时，提供有充足的饮 食化的DHA及DPAn-6的动物在组织中具有显著提高的DPAn-6水平。具 有更高血DHA和ARA水平的动物易于使早老素-1(与APP裂解成毒性淀粉 状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少，虽然只包含DHA的饮食或包含DHA 和DPAn-6组合的饮食也使早老素-1水平降低。发明人也发现，包含DHA 的饮食使总τ蛋白水平降低，这些饮食包括只包含DHA的饮食、包含DHA 和DPAn-6的饮食或包含DHA和ARA的饮食，虽然组合饮食的作用随时间 推移而减弱，从而只有包含DHA作为主要PUFA的饮食使总τ蛋白水平降 低。然而，就磷酸化τ蛋白而言，包含DHA的饮食或包含DHA和DPAn-6 的饮食都使磷酸化τ蛋白显著减少，甚至在更晚的时间点，而DHA和DPAn-6 的组合是有效的，并且与只富含DHA的饮食相比，DHA和DPAn-6的组合 趋向于更有效。综上，发明人的结果表明，包含DHA的饮食或包含DHA 和DPAn-6的饮食在减少AD病理方面是有效的，并且所有配方中最成功的 配方为只包含DHA作为主要PUFA的饮食，虽然就至少减少磷酸化τ蛋白 而言，含有DHA和DPAn-6的饮食也是有效的。更具体地，发明人已发现， PUFAs对认知障碍例如AD的病理具有不同的作用，从而使患者可被恰当 地靶向，和/或可按优选的剂量或在优选的时间点来给予PUFAs，以更有效 地治疗疾病。具体地，发明人已发现，DHA使被认为是较早病理的淀粉状 蛋白减少，同时在减少被认为是较晚病理生物标志的τ蛋白和磷酸化τ蛋白 病理方面，DPAn-6是额外有效的。而且，由于在本发明之前，没有描述过 DPAn-6在改善AD症状或治疗AD特征中的任何作用，所以从包含DPAn-6 的饮食观察到的有益作用也是令人惊讶的。发明人的结果也提供了有力的 新标志，该新标志用于确定最有可能在疾病的多个时间点阳性响应于PUFA 补充疗法或治疗的受试对象。
因此，本发明的一个实施方案涉及在个体的神经组织中降低Aβ肽水平 的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/ 或其前体或来源给予个体，以降低个体的Aβ肽的水平。在优选的实施方案 中，所减少的Aβ肽为可溶性Aβ肽。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、 DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA 和DHA的组合。在一个实施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中， PUFA包括DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组 合。
在另一个实施方案中，本发明涉及在个体的神经组织中维持APP水平 的方法，或更优选地涉及预防或抑制在早老素-1的作用下APP(无论水平如 何)裂解成Aβ肽(具体为裂解成毒性更大的Aβ肽大小形式(size form))的方 法。该方法包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 和/或其前体或来源给予个体，以维持个体的APP的水平，或预防或抑制在 早老素-1的作用下APP裂解成Aβ肽，特别是裂解成毒性更大的Aβ肽大小 形式。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的 组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实施方案中，PUFA包括DHA。 在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为 DHA和DPAn-6的组合。
细胞外淀粉状蛋白斑块的主要成分为淀粉状蛋白(Aβ)，其为42至43 个氨基酸的肽，源于淀粉状蛋白蛋白前体(APP)的蛋白水解裂解，APP为功 能未知的I型跨膜糖蛋白。三种不同的酶使APP裂解，产生大小不同的β 淀粉状蛋白肽。α-分泌酶在位于Aβ肽序列中的一个位点(Aβ16)从APP的 C-末端进行裂解，产生83个氨基酸的C-末端片段和26个氨基酸形式的Aβ。 γ-分泌酶随后在Aβ肽的C-末端对上述83个氨基酸的肽进行裂解，释放短 的15个氨基酸的肽(p3)，p3在淀粉状蛋白发生中的作用没有很好地定义。β- 分泌酶或BACE1切割Aβ肽的N-末端，同时γ-分泌酶切割Aβ肽的C-末端， γ-分泌酶事实上可以是早老素。根据γ-分泌酶连同β-分泌酶对APP进行裂 解的确切位点，产生40或42个氨基酸的肽。与上述15个氨基酸的形式或 上述40个氨基酸的形式比较，更长的42-43个氨基酸的肽被认为是更致病 形式的Aβ。源于Aβ的可扩散配体(或ADDLs)是Aβ1-42的非原纤维聚集 性衍生物，与在阿尔茨海默斑块中发现的大的Aβ原纤维比较，这些衍生物 据报道具有更大的神经毒性。在存在丛生蛋白(Apo J)的情况下，Aβ1-42在 低聚ADDLs中的积聚增加，丛生蛋白为老年斑的蛋白质组分。Aβ1-42+丛 生蛋白在PC12培养的神经元中是高度毒性的。
已确定编码人淀粉状蛋白蛋白前体(APP)的核苷酸序列，并且可在公共 序列数据库例如National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库 中，发现APP肽的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列。例如，可在NCBI 数据库中，在登记号NM_000484(变体1)、NM_201413(变体2)和 NM_201414(变体3)下，发现人APP肽的核苷酸序列和氨基酸序列。在此将 这些数据库登记号所代表的全部信息全文引入作为参考。可通过在本领域 中已知的方法，对Aβ肽进行检测和/或测量，且以下对这些进行了详细的 讨论。
在本发明的另一个实施方案中，本发明包括在个体的神经组织中降低τ 蛋白水平的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸 (PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以降低个体的τ蛋白的水平。在优选 的实施方案中，待减少的τ蛋白为磷酸化τ蛋白或构象发生变化的τ蛋白。 在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、 DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实施方案中， PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在另一个实施 方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
τ蛋白，尤其是磷酸化τ蛋白，为在神经原纤维缠结中发现的主要蛋白， 神经原纤维缠结为在阿尔茨海默病个体中出现的较晚阶段损害。神经原纤 维缠结主要由不正常磷酸化的τ蛋白组成，所述τ蛋白为神经元专属性磷蛋 白，其为神经元微管的主要成分。在阿尔茨海默病中，在大脑皮质的神经 元中，发现神经原纤维缠结，但在颞叶区域中，尤其是在海马和杏仁体中， 神经原纤维缠结是最常见的。神经原纤维缠结的密度和模式与AD的严重度 相关。可通过在本领域中已知的方法，对τ蛋白和/或磷酸化τ蛋白进行检 测和/或测量，以下对这些进行了更充分的讨论。
因此，本发明的一个实施方案包括延迟个体神经原纤维缠结形成或降 低其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延缓个体的神经原纤维缠结形成 或降低其严重度。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。 在一个实施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括 DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
在本发明的另一个实施方案中，本发明包括在个体的神经组织中降低 早老素-1(PS1)蛋白水平的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多 不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以降低个体的PS1蛋白 的水平。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA 的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实 施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在 另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
在本领域中，早老素-1被认为对γ-分泌酶活性负责，后者使APP裂解 成β淀粉状蛋白即裂解成致病肽，或早老素-1被认为是“γ-分泌酶”活性的重 要决定因子，后者是产生β-淀粉状蛋白所必需的。已将淀粉状蛋白前体蛋 白的突变(mAPP)和早老素1的突变(mPS1)与β-淀粉状蛋白肽(Aβ)的产生增 加相关联。可通过在本领域中已知的方法，对早老素-1的表达或活性进行 检测和/或测量，以下对这些进行了更充分的讨论。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体出现突触功能障碍和/或降 低其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延迟个体出现突触功能障碍和/ 或降低其严重度。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。 在优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。突触 功能障碍为阿尔茨海默病神经病的主要表型现象，是与表征阿尔茨海默病 的记忆和认知变化最相关的现象之一。
本发明的另一个实施方案包括延迟痴呆的出现和/或降低其严重度的方 法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其 前体或来源给予个体，以延迟个体出现痴呆和/或降低其严重度。在本实施 方案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA 和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。在优选的实施方案中， PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体出现脑功能衰退和/或降低 其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸 (PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延迟个体出现脑功能衰退和/或降低 其严重度。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。 在优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度的方 法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其 前体或来源给予个体，以延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度。在本实施方 案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA 和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。在优选的实施方案中， PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。髓鞘为包覆神经轴突的白色 物质，并且使脉冲能有效地在脑和身体其它部分之间进行神经传导。髓鞘 的丧失(即脱髓鞘)或不正常的髓鞘组分可与神经处理速度或活性的降低相 关，进而与认知衰退相关。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗或预防与APP、Aβ肽、PS1蛋 白、磷酸化τ蛋白和/或τ蛋白的量增加和/或其引起的功能障碍相关的疾病 的方法。该方法包括以下步骤：(a)确定出现选自APP、Aβ肽、PS1蛋白、 磷酸化τ蛋白、τ蛋白或其组合的蛋白质或肽的量增加和/或其引起的功能障 碍的个体；和(b)将至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前 体或来源给予个体。在一个实施方案中，按被确定为足以降低Aβ肽、PS1 蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量增加或其引起的功能障碍的量来给予 PUFA。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA 的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs 包括DHA、DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
本发明也包括治疗或预防与ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/ 或其前体或来源的量减少相关的疾病的方法。该方法包括以下步骤：(a)确 定出现ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源的量减少 (例如在组织或血液中)的个体；和(b)按被确定为足以补偿ω-3和/或ω-6多 不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源的量减少所引起的影响的量，将至 少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体。 在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组 合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs 包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体的突触功能障碍、脑功能 衰退、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病或降低其严重度的方法。该方法包括以 下步骤：(a)确定出现指示突触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或 相关疾病的至少一种症状或生物标志的个体；和(b)按被确定为足以延迟突 触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病或降低其严重度的 量，将至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给 予个体。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和 DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选 的PUFAs包括DHA、DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括使以下个体的脑电图(EEG)θ波稳定 和正常化的方法，所述个体患有记忆丧失、早期阿尔茨海默病，或为任意 类型痴呆的潜在患者，并且所述个体在EEG上，尤其是在额叶的EEG上， 具有深、慢、不正常的θ活性。可使用本方法，来预防通过家族史或遗传 标志而被认为趋向于出现不正常θ波活性的个体的不正常θ波活性的显现。 该方法包括以下步骤：(a)确定具有不正常θ波活性或预计趋向于不正常θ 波活性显现的个体；和(b)按被确定为足以使个体θ波活性稳定或正常化或 足以预防或减少个体不正常θ波活性显现的量，将至少一种ω-3和/或ω-6 多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体。在本实施方案中， PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA和ARA 的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs包括DHA、DPAn-6 或DPAn-6和DHA的组合。
在本发明上述实施方案的一个方面，将个体确定为易于患上痴呆或前 痴呆。在另一个方面，已肯定地将个体诊断为患有痴呆或前痴呆。在另一 个方面，已肯定地将个体诊断为患有阿尔茨海默病。确定个体是否患有或 易于患上痴呆或前痴呆(包括阿尔茨海默病)的方法，包括测量生物标志(例 如本申请所描述的APP、Aβ肽、PS 1蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白)，或确 定出现痴呆的家族史，或检测当前的中度认知缺损，或检测年龄相关认知 衰退。
中度认知缺损(MCI)为记忆丧失的一种形式，其可能影响人们进行神经 精神检查的能力。根据规范性标准检查的分数，患有MCI的个体通常具有 缺损的记忆，但在其它类型的脑功能例如筹划或注意力方面，没有出现缺 损。这些个体在运用日常生活所需要的技能方面，没有明显的问题。患有 MCI的个体面临显著增加的患上阿尔茨海默病或其它痴呆形式的危险。
年龄相关认知衰退(ACRD)，也称为年龄相关记忆缺损(AAMI)、年龄一 致性记忆衰退(Age-Consistent Memory Decline)、良性衰老性健忘(Benign Senescent Forgetfulness，BSF)、认知衰退(年龄相关)、健忘(良性衰老性)或记 忆衰退(年龄一致性)，不被认为是疾病，虽然权威们就以下问题是有分歧的： 年龄相关认知衰退是否部分地与阿尔茨海默病和其它痴呆形式相关，或年 龄相关认知衰退是否为截然不同的事物。患有ARCD的个体在记忆和学习、 注意力和集中精神、思考、语言使用和其它精神功能方面经历恶化。
可通过各种神经病检查和认知检查来确定中度认知缺损(MCI)和年龄 相关认知衰退(ARCD)，这些检查包括但不局限于简易智力状态检查(Mini Mental State Examination，MMSE)、剑桥神经精神测试自动化套件(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery，CANTAB)、阿尔茨海默病评价认 知程度测试(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-cognitive test，ADAScog)、 淀粉状蛋白β肽或磷酸化τ蛋白在脑脊液中的存在、通过正电子发射断层扫 描术(Positron Emission Tomography，PET)或单光子发射计算机断层扫描术 (Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)确定的扩大的脑室、 通过PET或SPECT研究来检测淀粉状蛋白斑块或神经原纤维缠结在脑中的 存在、脑电图(EEG)和在一些情况下的遗传检查。MCI可通过显示以下特征 的临床检查与神经精神检查的组合来确定：记忆疾病、就年龄而言不正常 的记忆力、从事正常日常活动的能力、正常的一般认知功能、没有出现痴 呆。另外，可利用脑脊液(CSF)τ蛋白和淀粉状蛋白β肽的水平及脑成像(PET、 SPECT、磁共振成像(MRI))，来排除阿尔茨海默病或将其作为次要危险因素。
可通过多种方法来测量突触功能障碍，所述方法包括但不局限于氧和 葡萄糖利用(PET-正电子发射断层扫描术、单光子发射计算机断层扫描术 (SPECT))和功能性磁共振波谱(fMRI)、脑电图和长时程增益作用(long-term potentiation)。
脑功能可通过在本领域中已知的多种方法(包括评价信息处理速度、可 执行功能(executive function)和记忆的各种认知检查)来测量。实例包括但不 局限于简易智力状态检查(MMSE)、剑桥神经精神测试自动化套件 (CANTAB)、阿尔茨海默病评价认知程度测试(ADAScog)、威斯康星卡片分 类测试(Wisconsin Card Sorting Test)、言语和图形流畅测试(Verbal and Figural Fluency Test)和连线测试(Trail Making Test)、脑电描记术(EEG)、脑磁波描记 术(MEG)、正电子发射断层扫描术(PET)、单光子发射计算机断层扫描术 (SPECT)、磁共振成像(MRI)、功能性磁共振成像(fMRI)、计算机断层扫描 术和长时程增益作用。
EEG，即脑电活性的测量术，通过以下方法来进行：在多个标志位置， 将电极置于头皮上，并且记录大幅放大的脑信号。
MEG与EEG联用，其中MEG测量与电场相关联的磁场。利用MEG 来测量自发的脑活性，包括神经系统中的同步波(Joliot et al.，1994；Deutsch， 1998)。
PET提供对氧利用和葡萄糖代谢的测量术。在这项技术中，给予放射 性正电子发射示踪剂，脑所摄取的示踪剂与脑活性相关。这些示踪剂发射γ 射线，后者通过脑周围的传感器来检测，得到脑活性三维(3D)绘图。示踪剂 一旦被脑摄取，检测到的放射性就以局部脑血流量的函数的形式出现 (Frackowiak，1989)，并且在活动期间，可在几秒中就检测到CBF和神经葡 萄糖代谢的增加。
MRI和fMRI利用以下事实：可通过使原子核受到强磁力的作用来操纵 原子核的一种特性即原子核的自旋。当受试对象使其头部处于强磁体(磁力 为1.5至5特斯拉)中时，短波电磁波天线使磁场发生变化，与主磁场相比， 这种变化是非常小的。变化的脉冲使原子核产生共振信号，可在三维中定 量所述信号，并且使其数字化。
可使用本发明方法来治疗的个体也可通过神经精神检查、临床检查和 个体的认知功能丧失(例如主观记忆丧失(subjective memory loss))疾病来确 定。
使用本发明的方法，对优选的生物标志(例如生物样品中这些生物标志 的含量)进行评价，以确定待治疗的个体，或监测对个体的治疗，这些优选 的生物标志包括但不局限于：APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1和 /或ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)(优选为DHA、ARA和/或DPAn-6) 和/或其前体或来源。优选地，根据本发明，在给予PUFA的步骤之前，测 量个体生物样品中这些生物标志中的任意一种的表达(例如RNA或蛋白质 检测)或生物活性。在一些实施方案中，根据本发明，可在给予PUFA的步 骤之后，测量这些生物标志的量、表达或生物活性，以例如监测给定的方 法对症状或病症治疗的作用。
确定生物标志的量水平、表达水平或生物活性水平的显著性(例如确定 个体是否患有或易于患上痴呆或前痴呆，或确定给定的PUFA给药方案是 否有效)的方法，涉及比较个体样品中生物标志(也称为生物标志)的表达水 平和/或生物活性水平与对照或基线样品中生物标志的量、表达和/或生物活 性的基线水平。当与基线量比较时，个体样品中生物标志(就生物标志APP、 Aβ、APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1而言)的量出现增加，或当 与基线量比较时，ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)的量出现减少，以 上两种情况表明，个体面临突触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或前痴 呆或痴呆或相关疾病(例如阿尔茨海默病)的危险或患有所述疾病。
在本发明中，生物标志典型地通过以下方法来评价：评价得自个体的 生物样品中生物标志的量、表达和/或生物活性。生物样品可包括细胞样品、 组织样品和/或体液样品。根据本发明，术语“细胞样品”通常可用于指代待 通过本发明方法来评价的包含细胞的任意类型的样品，包括但不局限于分 离的细胞样品、组织样品和/或体液样品。根据本发明，分离的细胞样品为 通常在悬浮液中或与结缔组织(在体内结缔组织可使细胞在组织中连结)分 开的细胞样本，通过任意合适的方法，从器官、组织或流体收集细胞，从 而收集合适数量的细胞，用于通过本发明的方法来进行评价。细胞样品中 的细胞无需是相同类型的，虽然可使用纯化方法来分离细胞，优选地，对 分离的细胞进行评价。细胞可通过以下方法来得到：使组织破碎，对组织 样品进行处理，以释放单个的细胞，或从体液分离细胞。
虽然组织样品类似于分离的细胞样品，但本申请将其定义为身体器官 或身体组织的部分，所述部分通常包括若干细胞类型和/或使细胞保持在一 起的细胞骨架结构。本领域的技术人员将理解，在一些情况下，术语“组织 样品”可与“细胞样品”交换使用，虽然前者优选地用于指代比细胞样品更复 杂的结构。组织样品可通过以下方法来得到：活组织检查，例如切割、切 片或穿刺。
与组织样品相似，体液样品也可包含细胞，并且可通过适于待采样的 具体体液的任意方法来得到。适于采样的体液包括但不局限于血液、脑脊 液、粘液(mucous)、精液、唾液、乳汁、胆汁和尿液。在本发明的优选实施 方案中，生物样品为血液样品或脑脊液样品，所述血液样品包括任意血液 部分(例如全血、血浆、血清)。
通常，基于样品的可获得性和方法的目的来选择样品类型(即细胞、组 织或体液)。典型地，可通过介入性最小的方法来得到的生物样品是优选的 (例如血液)，虽然在一些实施方案中，所述方法对于得到用于评价的细胞或 组织样品是有用或必需的。个体的组织也可通过非介入性方法来评价，例 如通过成像方法。
一旦从个体得到样品，就对样品进评价，以检测样品中本申请所描述 的任意生物标志的存在、表达或生物活性，所述生物标志包括：APP、Aβ 肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1和/或ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 和/或其前体或来源。检测生物标志的“表达”通常指代检测mRNA转录或蛋 白质翻译，包括检测蛋白质或肽的翻译后加工(例如检测样品中蛋白质的 量)。检测生物标志的“存在”指代检测生物标志是否存在于样品中的任意方 法，并且在大多数情况下，“检测生物标志的存在”可与“检测表达”或“检测 量”交换使用。优选地，在个体中检测存在、量、表达或生物活性的方法与 在用于确立生物标志基线或对照水平的样品中检测存在、量、表达或生物 活性的方法相同，或在质量上与其等同。
适于检测生物标志转录的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或细 胞提取物中mRNA水平的任意合适的方法。这类方法包括但不局限于：聚 合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印迹、序 列分析、微阵列分析和报告基因检测。用于检测转录水平的这类方法在本 领域中是众所周知的，在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989和/或Glick et al.， Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA， ASM Press，1998、Sambrook et al.，ibid.和Glick et al.，ibid.中，描述了许多这 样的方法，在此将这些文献全文引入作为参考。当样品为细胞或组织样品 时，生物标志转录的测量是最合适的，因此，当样品为包含细胞或细胞提 取物的体液样品时，通常将细胞从体液分离出来，以进行表达测定。
生物标志表达可通过翻译的检测(即样品中蛋白质的检测)来确定。适于 蛋白质检测的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或细胞提取物中蛋白 质的任意合适的方法。这类方法包括但不局限于Western印迹、免疫印迹、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、等离子表面共 振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/ 电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计量术、微阵列、显微术、荧光 激活细胞分类术(FACS)、流式细胞计量术和蛋白质微芯片或微阵列、高效 液相色谱或尺寸排阻色谱。这类方法在本领域中是众所周知的。在本领域 中，已制备和描述了本申请所述生物标志的抗体，可在用于检测所述生物 标志的许多测定中使用这些抗体。
可选择地，技术人员可使用在本领域中众所周知的技术，容易地制备 与所述生物标志选择性结合的抗体。短语“选择性结合”指代一种蛋白质与另 一种蛋白质(例如抗体、其片段或结合配体(binding partner)与抗原)的特异性 结合，其中通过任意标准测定(例如免疫测定)来测量的结合水平在统计学上 显著高于测定的背景对照。例如，当进行免疫测定时，对照通常包括只包 含抗体或抗原结合片段(即不存在抗原)的反应孔/试管，其中在没有抗原情 况下的抗体或其抗原结合片段的反应性(例如与孔的非特异性结合)的程度 被视为背景。可使用本领域中的各种标准方法，包括酶免疫测定(例如 ELISA、免疫印迹测定等)，来对结合进行测量。可在测定试剂盒和本发明 方法中使用的抗体可包括多克隆和单克隆抗体、二价和一价抗体、双特异 性或多特异性抗体、包含这类抗体的血清、已纯化至各种程度的抗体和完 整抗体的任意功能性等价物(例如Fv、Fab、Fab’或F(ab)2片段)。
如上所述，可在个体中发现Aβ肽具有一种或多种不同的“大小形式”。 可检测这些“大小形式”，并且比较一种形式与另一种形式，或可将这些蛋白 质的具体大小形式与基线或对照样品中的相同残基进行比较。另外，技术 人员可检测个体生物样品中不同Aβ肽的比例或分布，或检测任意其它上述 肽的大小形式的比例或分布，并且比较所检测到的分布与基线对照的分布。 待检测的特别有用的Aβ大小形式(残基)包括长度为15个氨基酸、40个氨 基酸、42个氨基酸或43个氨基酸的APP裂解产物。可使用多种以上确定 的用于蛋白质检测的方法，来检测大小形式，并且将这些大小形式彼此区 分开来。
也可通过检测生物标志的生物活性(例如蛋白质的生物活性)，来检测样 品中的生物标志。根据本发明，“生物活性”指代本申请所述生物标志的任意 生物作用，包括但不局限于酶活性、蛋白质与另一种蛋白质的结合(例如受 体、信号蛋白、底物等)、蛋白质的活化、细胞信号传导路径的活化和作为 生物标志表达、存在或活化的结果而发生的下游生物事件。本申请所披露 的检测生物标志的生物活性的方法在本领域中是已知的，并且包括但不局 限于结合测定、酶测定和磷酸化测定。
因此，本发明的几种方法(所述方法包括以下步骤：确定个体、诊断需 治疗的个体和/或监测治疗或方案的效力)包括比较以下两类水平或结果的 步骤，一类水平或结果为：在个体中检测到的生物标志(例如APP、Aβ肽、 τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1、ω-3PUFA和/或ω-6PUFA)的表达水平或活性 水平，或与突触功能障碍、脑功能、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病相关的具 体测试的结果；另一类水平或结果为：生物标志的表达或活性的基线或对 照水平，或测试结果的基线或对照水平。根据本发明，“基线水平”为对照水 平，并且在一些实施方案中，“基线水平”为生物标志的正常表达水平或正常 活性水平(例如在没有患上痴呆或前痴呆或其相关病症的个体中发现或预期 在所述个体中发现的生物标志的水平)或测试结果的正常水平，可将生物标 志的表达或活性的测试水平(即在个体样品中的水平)或测试结果与上述正 常的表达水平、正常的活性水平或测试结果的正常水平比较。因此，当与 基线或对照水平进行比较时，可基于生物标志或测试结果的对照或基线水 平，确定待评价的样品的生物标志的表达水平或活性水平或测试结果是否 具有可测量的增加、降低或基本上没有任何变化。就基线水平而使用的术 语“阴性对照”指代，在源于就生物标志的表达或活性或具体功能测试的结果 而言被认为是正常的个体或个体群的样品中确立的基线水平。在另一个实 施方案中，基线可指示痴呆或本申请所讨论的其它病症和/或疾病的阳性诊 断。这种基线水平在本申请中也称为“阳性对照”，其指代在源于个体、另一 个个体或个体群的样品中确立的生物标志表达或活性的水平或测试结果， 其中在源于对照的样品中生物标志表达或活性的水平或源于对照的测试结 果被认为相应于指示个体功能障碍、前痴呆或痴呆的生物标志水平或测试 结果。在另一个实施方案中，可从源于所测试个体的先前样品确立基线水 平，从而可随时间监测个体的生物标志或测试结果状态。
基于样品类型、从其得到样品的组织或器官、待评价的个体的状态和 如上所讨论的测定焦点或测定目的(例如初始诊断、监测)，来选择用于确立 生物标志或测试结果的基线水平的方法。优选地，所述方法与可用于评价 样品或个体的方法相同。
在一个实施方案中，在从个体得到的自体对照样品中，确立生物标志 的量、表达或生物活性的基线水平。自体对照样品可以是分离的细胞样品、 组织样品或体液样品，优选地为体液样品(例如CSF或血液)。根据本发明， 本申请所使用的术语“自体”的意思是，样品从同一个体得到，待评价的样品 也从所述个体得到。优选地，对照样品和待评价的样品都从相同的流体、 器官或组织得到，从而使对照样品作为待评价样品的最具可行性的基线。 本实施方案经常在以下情况下使用：已确立个体的先前读取结果，作为生 物标志的阳性诊断或阴性诊断。然后，可将所述基线用于监测个体朝向或 远离疾病或病症的行进过程，或用于监测治疗的成功程度(例如PUFA补充 疗法)。在本实施方案中，定时地对新的样品进行评价(例如在每年体检时， 或按治疗个体的临床医生所确定的时间表，前者对尚未诊断患上痴呆或前 痴呆但希望对所述疾病体征进行监测的健康个体是特别有用的)，在每个点 都确定通过脂肪酸补充疗法进行的预防性或治疗性处置。对于第一次评价， 如果需要的话，可如下所述使用交替的对照，或可进行额外的测试，以就 生物标志或测试结果和前痴呆或痴呆的征候，确定初始的阴性或阳性诊断， 且可将生物标志或测试结果的这个水平用作其后的基线。这种类型的基线 对照在其它临床诊断过程中经常使用，其中“正常”水平在个体之间可能是不 同的，和/或其中在诊断时得到自体对照样品是不可能、不现实或不利的。
用于确立生物标志或测试结果的基线水平的另一种方法为，确立对照 样品中生物标志的量、表达或生物活性的基线水平，或确立对照受试对象 的测试结果，其中对照受试对象优选地为匹配的个体群。优选的是，就生 物标志的量、表达或生物活性而言，对照样品的样品类型与待评价的样品 类型相同。根据本发明，短语“匹配的个体”指代，就一个或多个适于待评价 的参数、细胞类型、组织样品或体液样品的特征而言，对照个体是匹配的。 例如，就性别、年龄、种属或任意相关的生物因素或社会因素(例如先前存 在的病症、具体物质的消耗、其它生物因素或生理因素的水平)而言，对照 个体可与待评价的个体匹配，以上这些特征可能影响对照个体的基线和待 评价的个体。例如，正常个体的血液中本申请所述生物标志的水平可能高 于给定分类的个体(例如上年纪人与青少年、女人与男人)。为了确立生物标 志的量、表达或生物活性的对照或基线水平，得到源于多个匹配个体的样 品，并且就生物标志的量、表达或生物活性进行评价。本领域技术人员可 确定匹配个体的数量，对照样品必须从这些个体得到，以确立合适的对照 水平(例如群水平)，但匹配个体的数量在统计学上应该是合适的，以确立合 适的基线，用于与待评价的个体进行比较(即测试个体)。通常，使用本领域 中用于确立这样值的标准方法，对从对照样品得到的值进行统计学处理， 以确立合适的基线水平。
基线，例如以上所描述的基线，可以是阴性对照基线，例如从明显正 常的对照个体群确立的基线。可选择地，以上所描述的这类基线可从已被 阳性诊断为出现不正常生物标志水平、生物标志功能障碍、突触功能障碍、 脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或前痴呆的个体群确立，从而可确立一个或 多个基线水平，用于在个体评价中使用。然后，将个体样品中生物标志的 量、表达或生物活性或个体的测试结果与每个基线水平比较，以确定个体 的生物标志的水平或个体的测试结果在统计学上最接近哪种类型的基线(阳 性或阴性)。应该理解，给定个体的样品可能落在基线水平之间，从而最好 的诊断是，个体可能开始出现功能障碍，这指示需要补充至少一些脂肪酸， 并且个体可能处于发展成更高阶段的过程中。本发明的目的是逆转、克服 或补偿这种进行性疾病。
本领域技术人员可理解的是，当进行测定或评价时，无需为每次测定 或评价都确立基线，但基线可通过参考某种形式的存储信息来确立，所述 存储信息是有关先前就给定对照样品而确定的基线水平，例如通过任意上 述方法确立的基线水平。这类形式的存储信息可包括但不局限于例如有关 “正常”对照(阴性对照)或阳性对照的群或个体数据的参比绘图、参比列表或 参比电子文件；从先前评价得到的个体记录数据的医用绘图；或有关可用 于待诊断或评价的个体的基线生物标志表达或活性或基线测试结果的数据 的任意其它来源。
在比较个体测试或个体样品的结果与基线对照(或多个基线对照)时，确 定测试样品的生物标志的量、表达或生物活性与基线水平相比是否具有可 测量的减少或增加，或确定在测试水平和基线水平之间是否没有任何显著 的差异。在此步骤之后，进行最后的步骤，即作出诊断、对个体进行治疗、 对个体进行监测或确定对个体的进一步治疗。
当与基线水平进行比较时，检测到APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋 白和/或PS1的量、表达或生物活性的水平出现增加；当与基线水平进行比 较时，检测到在待评价的样品(即测试样品)中APP向毒性更大的Aβ大小形 式的转化出现增加；当与基线水平进行比较时，检测到突触功能障碍、脑 功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆症状出现加重或没有出现任何减弱；当与基线 水平进行比较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs的量出现减少，以上这些事件 通常表明，当与基线样品或基线结果进行比较时，个体可能更易于患上或 患有本申请所论疾病或病症中的任意一种(例如痴呆)。如果基线样品为源于 个体(或对照群)的先前样品或先前评价，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的 阳性诊断，那么当与基线进行比较时，检测到样品中生物标志的量、表达 或生物活性出现增加；当与基线进行比较时，检测到突触功能障碍、脑功 能衰退、脱髓鞘和/或痴呆出现加重或没有出现任何减弱；当与基线进行比 较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs出现减少，以上这些事件表明，个体的病 症正在恶化，而不是正在改善，应该对治疗进行重新评价或调整。
当与基线水平进行比较时，检测到APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋 白和/或PS1的量、表达或生物活性为正常量或健康量；当与基线水平进行 比较时，检测到在待评价的样品(即测试样品)中APP转化成毒性更小的Aβ 大小形式；当与基线水平进行比较时，检测到突触功能障碍出现减少或不 再存在，脑功能衰退出现减少或不再存在，脱髓鞘出现减少，和/或痴呆症 状出现减少或不再存在；当与基线水平进行比较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs 的水平是正常或增加的，或检测到ω-3或ω-6PUFAs，以上这些事件表明， 当与基线样品进行比较时，个体可能更不易于患上或没有患上本申请所论 疾病或病症中的任意一种。如果基线样品为源于个体(或源于对照群)的先前 样品，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的阳性诊断(即阳性对照)，那么当与 基线进行比较时，检测到在样品或个体中出现上述结果，这表明，个体正 在经历本申请所论疾病或病症的改善。
最后，与基线样品的生物标志的量、表达或生物活性或基线样品的测 试结果相比，检测到的生物标志的表达或活性或测试结果在统计学上没有 显著的差异，这表明，当与基线样品进行比较时，个体中的本申请所讨论 的疾病或病症没有表现出任何差异。如果基线样品为源于个体(或源于对照 群)的先前样品，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的阳性诊断(即阳性对照)， 那么与基线相比，检测到的生物标志的表达或活性或测试结果在统计学上 没有显著的差异，这表明，个体的病症没有出现任何变化，这可向临床医 生表明，例如当前医嘱治疗不能有效地控制所述病症。
为了对相对于生物标志表达或活性的基线水平或有关测试结果的基线 水平而出现的变化作出诊断，相对于确立的基线，以在统计学上显著的量(即 至少95％的置信水平或p＜0.05)，使生物标志的表达或活性的水平或测试结 果的值发生变化。就样品中生物标志的量、表达或生物活性或测试结果的 值而言，当与基线水平进行比较时，优选地检测到至少约5％的变化，更优 选地检测到至少约10％的变化，更优选地检测到至少约20％的变化，更优 选地检测到至少约30％的变化，更优选地检测到至少约40％的变化，更优 选地检测到至少约50％的变化，在这些情况下，可作出以下诊断：在测试 样品和基线样品之间存在差异。在一个实施方案中，当与基线水平进行比 较时，样品中生物标志的量、表达或生物活性或测试结果的值出现1.5倍的 变化，更优选地检测到至少约3倍的变化，更优选地检测到至少约6倍的 变化，甚至更优选地检测到至少约12倍的变化，甚至更优选地检测到至少 约24倍的变化，在这些情况下，可作出如下诊断：当与基线样品进行比较 时，生物标志的表达或活性或测试结果的值出现显著的变化。
本发明的方法包括：在给予步骤之后，监测PUFAs的给予对个体的 APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1蛋白水平的效力至少一次，在一 些实施方案中，本发明的方法包括：在给予步骤之后，监测PUFAs的给予 对个体的ω-3PUFA和/或ω-6PUFA水平的效力至少一次。可通过一种或多 种生物标志的量和/或生物活性的变化、中度认知缺损的改善、年龄相关认 知衰退的改善和/或在本领域中已知和以上较详细讨论的任意其它方法，来 测量效力。该方法还可任选地包括：在随后的治疗中，基于治疗效力的监 测结果，调整向个体给予PUFA。
本发明的诊断和监测方法具有几种不同的用途。第一，可将方法用于 在较大的患有给定病症(例如神经病症)的个体库中，诊断和监测具有过度的 APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1表达或功能障碍的个体亚型， 以便确定最有可能通过本发明的方法来获益的个体。实际上，发明人认为， 在认知衰退的明显症状出现之前，本发明的方法在早期对痴呆和前痴呆的 发展是有效的。也可通过在个体中确定出现PUFA缺乏(例如缺乏DHA、 DPAn-6和/或ARA)或可能出现PUFA缺乏的个体，来将方法用于诊断和监 测个体。个体可以是怀疑出现PUFA缺乏的个体或假定健康但就PUFA缺乏 接受常规筛选的个体。个体也可以是先前被诊断为PUFA缺乏并且接受治 疗现在就复发性PUFA缺乏而接受常规监护的个体。
术语“诊断”及其变体指代，基于疾病或病症的体征和症状，对疾病或 病症进行确定。本申请所使用的“阳性诊断”指代，疾病或病症或患上疾病或 病症的潜能已被确定。相反地，“阴性诊断”指代，确定为没有患上疾病或病 症或不具有患上疾病或病症的潜能。在阳性诊断的情况下，可对个体进行 医嘱治疗，以逆转或消除痴呆或前痴呆的体征、PUFA的缺乏和/或APP、Aβ 肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1的不正常量、不正常表达和/或不正常 活性。在阴性诊断(即阴性评价)的情况下，通常不对个体进行任何医嘱治疗， 或可使个体接受低水平的PUFA补充疗法，但可在未来的一个或多个时间 点，对个体进行重新评价，以再次评价突触功能障碍、脑功能、脱髓鞘和/ 或痴呆症状的生物标志或指标的水平。如以下所详细讨论，本发明评价方 法的这个具体实施方案的基线水平通常基于来自与测试样品相同的身体来 源(即相同的组织、细胞或体液)的“正常”或“健康”样品。
也可将本发明的方法用于监测对已就本申请所述病症作出阴性诊断的 个体的痴呆或前痴呆或其症状或指标(例如本申请所描述的生物标志的水平) 的治疗是否成功。本实施方案使医生或护理人员可监测个体就给定病症而 正在接受的治疗(例如PUFA补充疗法)是否成功，并且可帮助医生确定是否 应该对治疗进行修改(例如PUFA补充疗法是否应该增加、减少或保持基本 上不变)。在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下额外的步骤：对个 体进行另一项治疗，所述治疗对于治疗和/或预防痴呆或前痴呆或其症状是 有用的。
根据本发明，为了调整生物标志的水平或PUFA的组织水平，或为了 延迟痴呆或前痴呆或其相关症状或病症的出现/发展或降低其严重度，给予 PUFA(或多种PUFA)，这可为健康正常的个体及可能患上痴呆或前痴呆或患 有痴呆或前痴呆的个体提供一些益处(例如治疗益处或健康益处)。同样地， 治疗益处无需是对具体疾病或病症的治愈，但优选地，所包括的结果通常 包括缓解疾病或病症、消除疾病或病症、减轻与疾病或病症相关的症状、 延迟疾病或病症的症状的出现或发展、预防或缓解由于原发性疾病或病症 的出现而引起的继发性疾病或病症和/或预防疾病或病症。本申请所使用的 短语“防止疾病”指代减轻疾病或病症的症状、减少疾病或病症的发生、延迟 疾病或病症的出现或发展和/或降低疾病或病症的严重度。同样地，防止个 体出现疾病包括：预防或延迟或减少疾病的发生(预防性处置)和对患有疾病 的个体进行治疗(治疗性处置)。本领域的技术人员或治疗个体的训练有素的 临床医生可容易地对有益的作用进行评价。术语“疾病”指代哺乳动物正常健 康状态的任意偏离，并且包括在出现疾病症状时的状态及已发生偏离但症 状尚未出现的状态。
本发明的多个实施方案包括以下步骤：将一定量的一种或多种多不饱 和脂肪酸(PUFAs)给予个体。在大多数真核生物中，多不饱和脂肪酸(PUFAs) 是膜脂质的关键化合物(Lauritzen et al.，Prog.Lipid Res.401(2001)；McConn et al.，Plant J.15，521(1998))，并且是某些激素和信号分子的前体(Heller et al.， Drugs 55，487(1998)；Creelman et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 48，355(1997))。
根据本发明，PUFAs是脂肪酸，其具有至少16个碳、更优选地为至少 18个碳、更优选地为至少20个碳、更优选地为22或更多个碳的碳链长度， 并且具有至少3或更多个、更优选地为4或更多个、更优选地为5或更多 个、甚至更优选地为6或更多个双键，其中所有双键都处于顺式构型。本 申请所指代的长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs)更具体地指代碳链长度为18 和更多个、优选地为20和更多个的包含3或更多个双键的脂肪酸。ω-6系 列的LCPUFAs 包括：γ-亚麻酸(C18:3)、二高γ-亚麻酸 (di-homo-gammalinolenic acid)(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、肾上腺酸 (也称为二十二碳四烯酸或DTA)(C22:4n-6)和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)。 ω-3系列的LCPUFAs包括：α-亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二 十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3) 和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)。LCPUFAs也包括碳数多于22个的具有4或 更多个双键的脂肪酸，包括但不局限于C28:8(n-3)。
本申请所使用的术语“脂质”包括磷脂(PL)、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、 三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、甘油磷脂(phosphatide)、 蜡(醇和脂肪酸的酯)、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如氧化类胡 萝卜素(oxycarotenoid))、碳氢化合物和本领域技术人员所已知的其它脂质。 术语“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”不仅包括游离脂肪酸形式，而且也包括其 它形式，例如TAG形式和PL形式。
在本发明的一个实施方案中，脂肪酸的混合物，尤其是ω-3脂肪酸和 ω-6脂肪酸的混合物，可在本发明的方法中使用。优选的PUFAs包括具有 三个或更多个双键的ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3PUFAs为具有聚乙烯 结构的脂肪酸，其中最末的乙烯键位于从脂肪酸末端甲基数起(包括所述甲 基)的第三个碳处，ω-3PUFAs例如包括二十二碳六烯酸C22:6(n-3)(DHA) 和ω-3二十二碳五烯酸C22:5(n-3)(DPA n-3)。ω-6PUFAs为具有聚乙烯结构 的脂肪酸，其中最末的乙烯键位于从脂肪酸末端甲基数起(包括所述甲基) 的第六个碳处，ω-6PUFAs例如包括花生四烯酸C20:4(n-6)(ARA)、 C22:4(n-6)、ω-6二十二碳五烯酸C22:5(n-6)(DPAn-6)和二高γ-亚麻酸 C20:3(n-6)(二高GLA)。
在本发明的组合物和方法中，可使用PUFA的任意来源，例如包括动 物来源、植物来源和微生物来源。优选的多不饱和脂肪酸(PUFA)来源可以 是适于在本发明中使用的PUFAs的任意来源。优选的多不饱和脂肪酸来源 包括生物质来源，例如动物来源、植物来源和/或微生物来源。
动物来源的实例包括水生动物(例如鱼类、海洋哺乳动物、甲壳动物、 轮虫等)和从动物组织提取的脂质(例如脑、肝、眼等)。植物来源的实例包 括大型藻类(macroalgae)、亚麻子、油菜子、玉米、月见草、大豆和琉璃苣。 微生物的实例包括微型藻类(microalgae)、原生生物、细菌和真菌(包括酵母)。 微生物来源例如微型藻类的使用可提供感官优点，即源于微生物来源的脂 肪酸可不具有源于鱼类来源的脂肪酸所易于出现的鱼腥味道和气味。更优 选地，长链脂肪酸来源包括微型藻类或微型藻类油。
优选地，当微生物作为长链脂肪酸的来源时，在发酵罐中，使微生物 在发酵培养基中生长。可选择地，可在光生物反应器(photobioreactor)或反 应池中，利用光合作用(photosynthetically)来培养微生物。优选地，微生物 为富含脂质的微生物，更优选地，微生物选自微型藻类、细菌、真菌和原 生生物，更优选地，微生物选自金藻、绿藻、甲藻(dinoflagellates)、酵母、 被孢霉属(Mortierella)的真菌和管毛生物界(Stramenopiles)的微生物。优选 地，微生物包括Crypthecodinium属和破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微生 物和被孢霉属的丝状真菌，更优选地，微生物选自破囊壶菌属 (Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、Ulkenia属或其混合物， 更优选地，微生物选自具有以下鉴定特征的微生物、Mortierella schmuckeri 和Mortierella alpina的菌株、对隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的菌株、源 于上述任意一种微生物的突变菌株及其混合物，所述鉴定特征为ATCC号 20888、ATCC号20889、ATCC号20890、ATCC号20891和ATCC号20892。 可在美国专利5,407,957、5,130,242和5,340,594中发现有关这些藻类的信 息，在此将这些专利全文引入作为参考。
根据本发明，术语“海洋微型藻类”包括可天然生存于海洋或盐水环境 的微型藻类。本申请所指代的海洋微型藻类包括破囊壶菌目的微生物(本申 请也将其指代为破囊壶菌(Thraustochytrids))和Labyrinthulales目的微生物 (本申请也将其指代为Labyrinthulids)。应该认识到，在完成本发明时，对破 囊壶菌的分类学进行修订，将Labyrinthuloides属置于Labyrinthulaceae科中， 并且确认将破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)和Labyrinthulaceae科置于管毛 生物界谱系中。应该注意到，有时候常常将Labyrinthulaceae科称为 labyrinthulids或labyrinthula或labyrinthuloides，常常将破囊壶菌科称为破囊 壶菌。先前将Labyrinthulaceae科的成员视为破囊壶菌目的成员，但现在将 Labyrinthulaceae科的成员视为Labyrinthulales目的成员，Labyrinthulales目 和破囊壶菌目都被视为网粘菌门(Labyrinthulomycota)的成员。因此，本申请 所使用的术语“破囊壶菌(Thraustochytrid)”指代破囊壶菌目的任意成员，所述 破囊壶菌目包括破囊壶菌科，术语“Labyrinthulid”指代Labyrinthulales目的 任意成员，所述Labyrinthulales目包括Labyrinthulaceae科。
不断的研究已导致对破囊壶菌的分类学进行频繁的修订。分类学理论 家通常将破囊壶菌与藻类或藻样原生生物放在一起。然而，由于分类学的 不确定性，出于本发明的目的，最好应该将在本发明中描述为破囊壶菌的 菌株视为包括以下生物体：目：破囊壶菌目，科：破囊壶菌科，属：破囊 壶菌属(种：arudimentale种、aureum种、benthicola种、globosum种、kinnei 种、motivum种、multirudimentale种、pachydermum种、proliferum种、roseum 种、striatum种)、Ulkenia属(先前被一些人视为破囊壶菌属的成员)(种： amoebo idea种、kerguelens is种、minuta种、profunda种、radiata种、sailens 种、sarkariana种、schizochytrops种、visurgensis种、yorkensis种)、裂殖壶 菌属(种：aggregatum种、limnaceum种、mangrovei种、minutum种、octosporum 种)、Japonochytrium属(种：marinum种)、Aplanochytrium属(种：haliotidis 种、kerguelensis种、profunda种、stocchinoi种)、Althornia属(种：crouchii 种)或Elina属(种：marisalba种、sinorifica种)。
在本发明中描述为Labyrinthulids的菌株包括以下生物体：目： Labyrinthulales目，科：Labyrinthulaceae科，属：Labyrinthula属(种：algeriensis 种、coenocystis种、chattonii种、macrocystis种、macrocystis atlantica种、 macrocystis macrocystis种、marina种、minuta种、roscoffensis种、valkanovii 种、vitellina种、vitellina pacifica种、vitellina vitellina种、zopfii种)、 Labyrinthuloides属(种：haliotidis种、yorkensis种)、Labyrinthomyxa属(种： marina种)、Diplophrys属(种：archeri种)、Pyrrhosorus属(种：marinus种)、 Sorodiplophrys属(种：stercorea种)或Chlamydomyxa属(种：labyrinthuloides 种、montana种)(虽然当前对Pyrrhosorus属、Sorodiplophrys属或 Chlamydomyxa属的确切分类学归属没有一致的意见)。
更具体地，可在本发明中使用的PUFA可包括二十二碳六烯酸(DHA， 重量百分比为至少约10％、约20％、约30％或约35％)、二十二碳五烯酸(DPA， 优选为DPAn-6，重量百分比为至少约5％、约10％、约15％或约20％)和/ 或花生四烯酸(ARA，重量百分比为至少约20％、约30％、约40％或约50％)。 其它PUFAs可包括二十碳五烯酸(EPA)。PUFAs包括游离脂肪酸和包含 PUFA残基的化合物，这些化合物包括磷脂、脂肪酸的酯、三酰基甘油、二 酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、甘油磷脂等。
磷脂的来源包括禽蛋、加料的禽蛋(enriched poultry egg)、藻类、鱼类、 鱼子和基因工程化的(GE)植物种子或微型藻类。特别优选的PUFAs(包括 DHA)来源包括但不局限于鱼油、海洋微型藻类和植物油，包括源于基因工 程化微型藻类和植物的油。所述PUFA即DHA的优选前体包括但不局限于 α-亚麻酸(LNA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)，LNA、EPA 和/或DPA的混合物。
根据本发明，在本申请所述补充疗法和治疗组合物中使用的长链脂肪 酸呈多种形式。例如，这些形式包括但不局限于：包括PUFA的高度纯化 的藻油、包括PUFA的植物油、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷 脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、包括PUFA的干燥的海洋微型藻类、 包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分 子的结合物及其组合。可例如通过对来源进行混合、纯化、富集和基因工 程化，按不同于在所述脂肪酸的天然来源中存在的量和/或比例来提供长链 脂肪酸。生物活性分子可包括任意合适的分子，包括但不局限于蛋白质、 氨基酸(例如天然存在的氨基酸，例如DHA-甘氨酸、DHA-赖氨酸或氨基酸 类似物)、药物和碳水化合物。可在高感官质量的食物配方、饮食补剂和药 用物质中，灵活地使用本申请所概述的形式。例如，当前可得到的微型藻 类油包含约40％的DHA。可将这些油转化成酯形式，然后使用例如分子蒸 馏的技术来纯化，以使DHA含量增加至70％和更高，由此提供浓缩的产品， 其可在限制尺度即小分份尺度(serving size)的产品中使用，例如在可行丸尺 度受到限制的婴儿食物或饮食补剂中使用。油和磷脂组合的使用有助于提 高微型藻类油的氧化稳定性，因此有助于提高其感官和营养质量。氧化降 解危害甘油三酯形式的PUFAs的营养和感官质量。与甘油三酯形式相比， 通过使用磷脂形式，所期望的PUFAs更稳定，并且脂肪酸的生物利用度更 高。虽然微生物油比典型的鱼油稳定，但二者都易于发生氧化降解。氧化 降解使这些脂肪酸的营养价值降低。另外，氧化的脂肪酸被认为对良好的 健康是有害的。磷脂DHA/DPA/ARA/二高-GLA即更稳定的脂肪酸体系的使 用，使这些补剂的健康和营养价值提高。与甘油三酯油相比，磷脂也是更 容易混合到水性体系中的。由于同时提供了蛋白质和脂肪酸，所以蛋白质 和磷脂组合的使用能制备更具营养的混合食物。干燥海洋微型藻类的使用 为其中的油提供高温稳定性，并且有利于制备高温烘焙的食物。
在本发明的一个实施方案中，所期望磷脂的来源包括源于蛋、植物油 和动物器官的通过Friolex方法和磷脂提取方法(PEP)(或相关方法)制备的纯 化磷脂，这些纯化磷脂用于制备富含DHA、DPA、ARA和/或二高-GLA的 营养补剂。对Friolex和PEP及相关方法的更详细描述在以下专利中：PCT 专利PCT/IB01/00841，发明名称为“Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials”，在2001年4月12日提交，在 2001年10月18日公开为WO 01/76715；PCT/IB01/00963，发明名称为 “Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol and Centrifugation”，在2001年4月12日提交，在 2001年10月18日公开为WO 01/76385；和PCT/DE95/01065，发明名称为 “Process For Extracting Native Products Which Are Not Water-Soluble From Native Substance Mixtures By Centrifugal Force”，在1995年8月12日提交， 在1996年2月22日公开为WO 96/05278；在此将以上这些专利中的每项都 全文引入作为参考。
优选地，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA和/或 DPAn-3和/或DPAn-6和/或ARA和/或二高-GLA的脂肪酸残基，所述PUFA 处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷脂的复合物、单独的磷 脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。更优选地，包括所期 望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA、ARA和/或DPAn-6的脂肪酸残 基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷脂的复 合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。更优 选地，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA和DPAn-6的脂 肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷 脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。 在另一个优选的实施方案中，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括 DHA的脂肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三 酯油与磷脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋 微型藻类。在另一个优选的实施方案中，包括所期望PUFA的高度纯化的 藻油包括DPAn-6的脂肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形 式、甘油三酯油与磷脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或 干燥的海洋微型藻类。
在一个优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6和DHA的组合。发明 人已发现，与单独给予DHA相比，PUFAs的这种组合呈现令人惊讶的意想 不到的益处。意想不到的是，与单独给予DHA或给予DHA及其它ω-6 PUFAs相比，DPAn-6和DHA的组合可特别提供许多益处。这是令人惊讶 的，因为当消耗不充足的饮食DHA时，DPAn-6在组织中的作用出现增加。 在缺乏DHA的动物的组织中，DPAn-6出现增加，这经常与亚最佳的组织 功能相关。在本实施例中，与只饲喂DHA的动物比较，提供有充足的饮食 化的DHA及DPAn-6的动物在组织中具有显著增加的DPAn-6水平和更高 的ARA水平。具有更高血DHA和ARA水平的动物易于使PS-1(与APP裂 解成毒性淀粉状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少。此外，提供有充足的饮 食化的DHA及DPAn-6的动物具有降低的磷酸化τ蛋白水平，磷酸化τ蛋 白与痴呆患者的神经原纤维缠结的发展相关。
在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含DPAn-6和DHA组合的油 或制剂，其中所述DPAn-6和DHA组合的百分比为约30％或更多、约35％ 或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、 约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多或约80％或 更多。优选地，油或制剂中DHA与DPAn-6的比例为约1∶1至约10∶1，或 为1∶1和10∶1之间的任意比例。
在另一个实施方案中，PUFA包括ARA和DHA的组合。再次地，发 明人已发现，与单独给予DHA相比，DHA和ARA的组合呈现令人惊讶的 意想不到的益处。意想不到的是，与单独给予DHA或给予DHA及其它ω-6 PUFAs(不包括ARA)相比，DHA和ARA的组合可特别提供许多益处。这是 令人惊讶的，因为在这个实施例中，具有更高血DHA和ARA水平的动物 易于使PS-1(与APP裂解成毒性淀粉状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少。
在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含ARA和DHA组合的油或 制剂，其中所述ARA和DHA组合的百分比为约30％或更多、约35％或更 多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、约60％ 或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多或约80％或更多。 优选地，DHA与ARA的比例为约1∶1至约10∶1，或为1∶1和10∶1之间的任 意比例。
在另一个实施方案中，PUFA包括DHA、ARA和DPAn-6的组合，与 单独给予DHA相比，由于以上所讨论的原因，所述组合呈现令人惊讶的意 想不到的益处。在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含DPAn-6、ARA 和DHA组合的油或制剂，其中所述DPAn-6、ARA和DHA组合的百分比 为约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％ 或更多、约55％或更多、约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、 约75％或更多或约80％或更多。优选地，DHA与ARA与DPAn-6的比例为 约1∶1∶1至约10∶1∶1，或为1∶1∶1和10∶1∶1之间的任意比例。
每日PUFA摄取量的范围优选地为每日约0.025mg至约15克，包括增 幅为0.005的在上述范围内的任意增量(例如0.025、0.030、0.035等)。在一 个实施方案中，PUFA按约0.05mg PUFA/kg个体体重至约200mg PUFA/kg 个体体重或更高的剂量来给予，包括增幅为0.01mg的在上述范围内的任意 增量(例如0.06mg、0.07mg等)，或按约50mg至约20,000mg/受试对象/ 天的剂量来给予(例如通过口服、注射、输液或完全胃肠外营养、局部使用、 腹膜内、胎盘、经皮或颅内给予)。在另一个实施方案中，PUFA按约0.45mg PUFA/kg体重/天至约275mg PUFA/kg体重/天的剂量来给予。在另一个实 施方案中，PUFA按约0.025mg PUFA/kg体重/天至约275mg PUFA/kg体重 /天的剂量来给予，包括增幅为0.005的在上述范围内的任意增量(例如 0.025、0.030、0.035等)。在另一个实施方案中，PUFA按约0.05mg PUFA/kg 体重/天至约275mg PUFA/kg体重/天的剂量来给予。例如，典型的胶囊型 DHA补剂可按每个胶囊100mg至200mg的剂量来制备，虽然本发明不受胶 囊形式或包含上述量DHA或另一种PUFA的胶囊剂的限制。
虽然脂肪酸，例如DHA，可局部给予或作为注射剂来给予，但最优选 的给予途径为口服给予。优选地以营养补剂和/或食物和/或药用制剂和/或饮 料的形式，更优选地以食物、饮料和/或营养补剂的形式，更优选地以食物 和饮料的形式，更优选地以食物的形式，将脂肪酸(例如PUFAs)给予个体。 优选的食物类型为医用食物(例如在制剂中的食物，所述制剂在医生的监督 下外来地被消耗或给予，这种食物旨在用于疾病或病症的特定饮食管理， 基于认识到的科学原理，通过医学评价来为所述疾病或病症确立有特色的 营养需要)。对于婴儿，脂肪酸作为婴儿配方(infant formula)、断奶婴儿的食 物(weaning food)、果酱化的幼儿食物(jarred baby food)和婴儿谷类(infant cereal)来给予。
生物可接受的任意剂型及其组合是本发明主旨所考虑的。这些剂型的 实例包括但不局限于咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、酏剂、 液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、 软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、粉剂、 颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏 剂、局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮 存植入剂、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、 谷类包衣、食物、营养性食物、功能性食物及其组合。对于本领域技术人 员，以上剂型的制备是众所周知的。优选地，富含所期望PUFA的食物选 自但不局限于：烘焙货品和混合料、口香糖、早餐谷类、奶酪制品、坚果 和基于坚果的制品、明胶(gelatin)、布丁、填料(filling)、冷冻的奶制品、乳 制品、奶制品类似物、软糖(soft candy)、汤和汤混合料、快餐、加工的水果 汁、加工的蔬菜汁、脂肪和油、鱼制品、植物蛋白制品、禽制品和肉制品。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗或预防患有痴呆或面临患上痴 呆危险的个体的痴呆的药物组合物，所述药物组合物包括一定量的至少一 种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源及至少一种额外 的治疗化合物，。在优选的实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6或DPAn-6 和DHA的组合，所述PUFA具有至少30％或更多的DPAn-6和DHA组合。 在另一个优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6、ARA和DHA的组合， 所述PUFA具有至少30％或更多的DPAn-6、ARA和DHA组合。在另一个 优选的实施方案中，PUFA包括ARA和DHA的组合，所述PUFA具有至少 30％或更多的ARA和DHA的组合。
适于与本发明一起使用的治疗化合物包括可用于保护个体免受本申请 所论病症或疾病中任意一种的任意治疗化合物，这些治疗化合物可包括蛋 白质、氨基酸、药物、其它天然产物和碳水化合物。就所治疗的具体疾病 或病症而言，对于本领域技术人员，这些治疗化合物是众所周知的。可包 括在本发明组合物或制剂中的一些优选的治疗化合物包括但不局限于：他 克林(COGNEX)、多奈哌齐(ARICEPT)、利伐斯的明(EXELON)、加兰他敏 (REMINYL)、美金刚胺(AKATINOL)、神经妥乐平、促智药、α-生育酚(维 生素E)、司来吉兰(ELDEPRYL)、非甾体抗炎药(NSAIDS)、银杏内酯、雌 激素、β-分泌酶抑制剂、使脑中斑块溶解的疫苗(包括脂质疫苗和基于脂质 体的疫苗)、复合维生素B、钙通道阻滞剂、HMG CoA还原酶抑制剂、他汀 类、甘蔗脂肪醇、贝特类、氯碘羟喹和其它天然产物(例如姜黄素、木脂素、 植物雌激素、植物甾醇、烟酸和维生素补剂)。
给药剂量和途径在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可确定给 药剂量和途径。
本发明也包括制备上述本发明组合物中任意一种的方法，所述组合物 例如通过以下方法来制备：使用在本领域中已知的任意合适的方法，使组 合物的组分复合到任意合适的递送形式中。
根据本发明，本发明的方法适于对以下个体使用：脊椎动物纲哺乳类 的成员，包括但不局限于灵长类、家畜类和驯养的宠物(例如伴侣动物 (companion animal))。最典型地，个体可以是人类个体。术语“个体”可与术 语“受试对象”或“患者”交换，并且指代本发明方案或方法的受试对象。因此， 个体可包括健康正常的(非疾病的)个体及患有本申请所述前痴呆或痴呆或 其症状或指标或面临患上所述疾病危险的个体。
出于解释的目的，提供以下实施例，这些实施例不是意在限制本发明 的范围。
实施例
在下述实施例中，使用以下材料和方法。
3XTg-AD小鼠的产生
在Oddo，“Triple-transgenic Model of Alzheimer’s Disease with Plaques and Tangles：Intracellular Aβand Synaptic Dysfunction”，Neuron，Vol.39， 409-21(2003)中，描述了3XTg-AD小鼠的产生。简要地，将包含Swedish 双突变(KM670/671NL)的人APP(695同工型)cDNA亚克隆到Thy1.2表达盒 的外显子3中。将包含P30IL突变的没有氨基末端插入(4R0N)的人四重复τ 蛋白也亚克隆到Thy1.2表达盒中。在限制酶切消化以释放转基因之后，每 个片段都通过蔗糖梯度分级来纯化，接下来在注射缓冲液(10mM Tris[pH 7.5]，0.25mM EDTA)中透析过夜。将等摩尔量的每种构建体共同微注射到单 细胞胚的原核中，所述单细胞胚从纯合PS1M146V敲入小鼠获得(Guo et al.， Arch.Pathol.Lab.Med.125，489-492(2001))。PS1敲入小鼠作为杂合体 129/C57BL6背景而被初始产生。如先前所描述(Sugarman et al.Natl.Acad. Sci 99，6334-6339(2002))，通过对尾DNA进行Southern印迹分析，确定了 转基因小鼠。使建立者小鼠(founder mouse)与亲本PS1敲入小鼠回交。
饮食
在这些实施例中描述的所有小鼠都在3月龄时开始接受实验饮食，在 6、9或12月龄时结束实验。饮食配方为包含5％总脂肪的AIN-76啮齿类动 物饮食。在表1中，描述了每种饮食的额定脂肪酸组合物，所述组合物通 过以下方法来得到：如表2所列，混合蔬菜和微型藻类油的组合。因为初 期以盲方式进行研究，所以如以下那样，用颜色对饮食进行编号：蓝色饮 食(玉米/大豆)、黄色饮食(DHASCO，也称为补充有DHA的饮食或富含 DHA的饮食)、绿色饮食(DHATM-S，也称为补充有DHA和DPAn-6的饮食 或富含DHA和DPAn-6的饮食)和红色饮食(DHASCO/ARASCO，也称为 补充有DHA和ARA的饮食或富含DHA和ARA的饮食)，在一些表和附图 中涉及了这种编号方式。可将包含DHASCO、DHATM-S或 DHASCO/ARASCO的饮食总称为包含微型藻类油的饮食。
DHASCO为源于对隐甲藻的包含大量二十二碳六烯酸(DHA)的油， DHASCO更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸(按占总脂肪酸的百分 比计)：肉豆蔻酸(14:0)10-20％、棕榈酸(16:0)10-20％、棕榈油酸(16:1)0-2％、 硬脂酸(18:0)0-2％、油酸(18:1)10-30％、亚油酸(18:2)0-5％、花生酸(20:0)0-1％、 山嵛酸(22:0)0-1％、二十二碳五烯酸(22:5)0-1％、二十二碳六烯酸 (22:6)(DHA)40-45％、神经酸(24:1)0-2％和其它0-3％。
DHATM-S(先前也称为DHASCO-S)为源于破囊壶菌、裂殖壶菌属种的 油，其包含大量的DHA，也包含二十二碳五烯酸(n-6)(DPAn-6)，DHATM-S 更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸(按占总脂肪酸的百分比计)：肉豆 蔻酸(14:0)8.71％、棕榈酸(16:0)22.15％、硬脂酸(18:0)0.66％、亚油酸 (18:2)0.46％、花生四烯酸(20:4)0.52％、二十碳五烯酸(20:5，n-3)1.36％、二十 二碳五烯酸(22:5，n-6)(DPAn-6)16.28％、二十二碳六烯酸(DHA)(22:6， n-3)41.14％和其它8％。
ARASCO为源于Mortierella alpina的油，其包含大量的花生四烯酸 (ARA)，ARASCO更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸：肉豆蔻酸 (14:0)0-2％、棕榈酸(16:0)3-15％、棕桐油酸(16:1)0-2％、硬脂酸(18:0)5-20％、 油酸(18:1)5-38％、亚油酸(18:2)4-15％、亚麻酸(18:3)1-5％、花生酸(20:0)0-1％、 二十碳三烯酸(20:3)1-5％、花生四烯酸(20:4)(ARA)38-44％、山嵛酸 (22:0)0-3％、二十二碳五烯酸(22:5)0-3％和木蜡酸(24:0)0-3％。
表1
小鼠饮食的n-3和n-6脂肪酸含量
表2
用于实验饮食的油混合物的组合物
所有饮食都包含50g脂肪/100g食物。和n-6与n-3脂肪酸的比例为约 10∶1的对照饮食比较，每种包含DHA的饮食都具有1.3g DHA/100g食物， 并且n-6与n-3脂肪酸的比例为约1∶1。在所有饮食中，饱和脂肪酸、单不 饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的百分比是相等的。在所有饮食中，总蛋白 质(20％)和碳水化合物(66％)及总能量(3.9千卡/克)的量也是相等的。
ELISAs和免疫印迹
基本上如先前所描述，进行AβELISAs(Suzuki et al.，Science 264， 1336-1340(1994))。对于免疫印迹，在2％SDS的H2O溶液(包含0.7mg/ml胃 酶抑素A，补充有完整的微小蛋白酶抑制剂片(Mini Protease inhibitor tablet)(Roche 1836153))中，以Dounce匀浆方式，对源于转基因小鼠和对照 小鼠的脑进行匀浆。匀浆混合物接受简短的声处理，以切断DNA，然后在 4℃，以100,000×g离心1小时。将上清液用于免疫印迹分析。蛋白质在还 原条件下，用SDS/PAGE(10％Bis-Tris，得自Invitrogen)溶解，然后转移到 硝化纤维素膜。在20℃，将膜在脱脂乳(nonfat milk)的5％溶液中孵育1小 时。在4℃，与第一抗体一起孵育过夜，之后将印迹在Tween-TBS中洗涤 20分钟，然后在20℃，与第二抗体一起孵育。将印迹在T-TBS中洗涤20 分钟，然后在20℃，与第二抗体一起孵育。将印迹在T-TBS中洗涤20分钟， 然后与Super Signal(Pierce)一起孵育5分钟。
生化标志
Aβ测量：得到了DHA对各种Aβ的作用的定量数据(例如Aβ40与 Aβ42，可溶性Aβ与不溶性Aβ)(Oddo et al.，2003)。从用DHA处理的小鼠的 脑组织，提取蛋白质，将所述蛋白质用于制备可溶性和不溶性蛋白质提取 物，通过夹心ELISA来进行分析。将Western印迹用于测量APP全蛋白、 C99/C83片段和sAPPα的稳态水平，以确定DHA对这些生物标志的作用。
τ蛋白超磷酸化：因为3xTg-AD小鼠随年龄增长而在皮质和海马中积 聚嗜银性和丝状τ免疫反应性神经元包含物(Oddo et al.，2003)，所以测量 DHA对τ蛋白超磷酸化的作用，作为功能性生物标志。这通过定量性Western 印迹用特异性识别超磷酸化τ蛋白的抗体(例如AT8、AT100或PHF1)来完 成。
将脑解剖成皮质、海马和小脑。
免疫组织化学
为了评价总斑块和缠结及小胶质细胞激活，以5μm对福尔马林固定的 包含石蜡(parafiin)的脑进行切片，将其固定在涂有硅烷的载玻片上，如所描 述的那样进行处理。使用各种Aβ形式(1-40、1-42和低聚物)和τ蛋白磷酸 化形式的各种抗体，观察斑块和缠结在脑中的位置和严重度。另外，使用 抗体，例如CD45，以就小胶质细胞激活进行染色，用于确定斑块和缠结是 否仍然触发免疫应答。使用以下抗体：抗Aβ6E10和4G8(Signet Laboratories， Dedham，MA)、抗Aβ1560(Chemicon)、A11(Kayed et al，2003)、抗APP 22C11(Chemicon)、抗τHT7、AT8、AT 180(Innogenetics)、τC 17(Santa Cruz)、 τ5(Calbiochem)、抗GFAP(Dako)和抗肌动蛋白(Sigma)。对于GFAP，以1∶3000 的稀释度应用第一抗体；对于6E10，稀释度为1∶1000；对于1560、AT8、 AT180和τ5，稀释度为1∶500；对于HT7，稀释度为1∶200。
脑总脂质提取
在分析之前，将脑保存在-80℃。将脑冷冻干燥，然后在4ml的2∶1(v/v) 氯仿∶甲醇(含有0.5％BHT，作为抗氧化剂)中，提取脂质。对混合物进行声 处理，历时10分钟，然后离心，以使固体沉淀出来。
脂肪酸分析
总脑脂质分析
对1.2mg的脑脂质提取物进行脑总脂肪酸分析。在100℃，用14％BF3/ 甲醇，将脑总脂质转化成脂肪酸甲酯(FAME)，历时30分钟(Morrison，W.R. and Smith，L.M.(1964)JLipid Res.5：600-8)。在皂化之前，添加丁羟甲苯，并 且在整个过程中，所有样品都用N2清洁，以使氧化作用最小化。在进行 FAME分析之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品，作为内标。
脑磷脂分析
使用Gilfillan等人的方法(Gilfillan et al(1983)，JLipid Res.24：1651-1656) 来分离脑磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在100℃ 烘箱中，将0.25mm厚的20×20cm K硅胶板(Whatman，Clifton，NJ)活化60 分钟。将总脑提取物的样品(0.6mg)点样于板上，在TLC展开缸中，使用氯 仿∶甲醇∶石油醚∶乙酸∶硼酸40∶20∶30∶10∶1.8(v/v/v/v/w)来展开。将板展开至距 板顶部1cm处。用醋酸铜喷射板，以使条带显现。将PC、PS和PE条带刮 到测试试管中，在100℃，用14％BF3/甲醇，将脂质转化成脂肪酸甲酯 (FAME)，历时30分钟(Morrison and Smith，1964，supra)。在皂化之前，添加 丁羟甲苯，并且在整个过程中，所有样品都用N2清洁，以使氧化作用最小 化。在进行FAME分析之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品， 作为内标。
红细胞分析
使用Bligh和Dyer的方法(Bligh，E.G.and Dyer，W.J.(1959)，Can.J. Biochem.Physiol.37：911)，从400μl浓集的红细胞(red blood cells，RBCs)提取 总脂质。在提取之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品，作为内 标。RBC脂质用0.5N氢氧化钠的甲醇溶液进行皂化，然后在100℃，用14％ BF3/甲醇，将脂肪酸转化成甲酯，历时30分钟(Morrison and Smith，1964， supra)。在皂化之前，添加丁羟甲苯，并且在整个过程中，所有样品都用 N2清洁，以使氧化作用最小化。
气相色谱分析
通过GLC，使用配备有火焰离子化检测器的Hewlett Packard 6890，对 脂肪酸甲酯(FAMEs)进行分析。在30米长的FAMEWAX毛细管色谱柱 (Restek，Bellefonte，PA，直径为0.25mm，涂层厚度为0.25mm)上，使用氦 气来分离脂肪酸甲酯，流速为2.1mL/min，分流比为48∶1和20∶1。色谱运 行参数包括：柱温箱开始温度为130℃，其以6℃/min的速率升高至225℃， 在225℃保持20分钟，之后以15℃/min的速率升高至250℃，最后保持5 分钟。进样器温度和检测器温度分别恒定在220℃和230℃。峰通过以下方 法来确定：将保留时间与得自NuCheck Prep(Elysian，MN，U.S.A)的外部脂肪 酸甲酯标准混合物进行比较。将脂肪酸分布表示成占脂肪酸总毫克数的百 分比(重量百分比)。
实施例1
下面的实施例所描述的是，对饮食性多不饱和脂肪酸(PUFAs)、二十二 碳六烯酸(DHA，22:6 n-3)、二十二碳五烯酸(DPAn-6，22:5 n-6)或花生四烯 酸(ARA，20:4 n-6)调节阿尔茨海默病新三元转基因小鼠模型(3xTg-AD)出现 疾病病理生理症状或调节其严重度的潜能进行评价。
各组的纯合3x-Tg-AD小鼠用四种饮食之一饲喂，如以上在材料和方法 中所描述(参见表1和2)，这四种饮食包含DHA、DHA和DPAn-6、DHA 和ARA或缺乏这些PUFAs的饮食(对照)。如以上所讨论(参见在材料和方法 中对饮食的讨论)，三种实验饮食包含类似量的DHA和作为n-6来源的亚油 酸、DPAn-6或ARA。在几个处理时间点之后，通过观察这些小鼠的病理发 展，来评价对照饮食和补充有PUFA的饮食的治疗益处。
具体地，3xTg-AD小鼠在3月龄时开始用在表1和2中所显示的规定 饮食饲喂，持续至12月龄。在不知道饮食中所含实验化合物水平的情况下， 每种饮食都包含参考标识，并且用颜色编号。在整个研究过程中，将贮存 的饮食保持在0℃。选择在动物3个月大时开始实验，以便当用实验饮食处 理时，在出现Aβ和τ蛋白神经病理之前，不会干扰小鼠的正常生长和发育。 在6月龄、9月龄或12月龄时，终止治疗，然后对脑和血液进行各种神经 病理评价，包括总APP、淀粉状蛋白β肽、斑块数量、斑块尺寸和APP裂 解酶的水平(α和β分泌酶、早老素-1)。也测量了脑和血液总脂肪酸和脑磷 脂。
在每个时间点，对源于至少6只小鼠的脑和脑脊液(CSF)进行完整的神 经病理学和免疫组织化学分析，以提供有效的统计学分析。收集血液，将 其处理成红细胞沉淀和血清，然后贮存在-80℃。源于每个饮食组的另外六 只小鼠被处死，将血液和脑切片冷藏运输，用于其它分析。在3个时间点， 即当小鼠为6月龄、9月龄或12月龄时，评价神经病理学和免疫组织化学。
表3显示在饲喂上述含PUF饮食3个月、6个月和9个月之后的平均 体重。
表3
如在表3中所显示，在处理了3个月、6个月或9个月时，雄性和雌性 小鼠的平均体重在各种饮食中没有出现不同。在研究过程中，各种饮食的 小鼠不断生长，并且保持健康。
脂肪酸分析结果
图1A-C显示四个饮食处理组在3个月(图1A，n＝6)、6个月(图1B， n＝6)或9个月(图1C，n＝6)饮食处理之后的全脑匀浆脂肪酸分布(将值表示成 占总脑脂肪酸的百分比)。图2A-2C显示四个饮食处理组在3个月(图2A)、 6个月(图2B)或9个月(图2C)之后的红细胞匀浆脂肪酸分布(将值表示成占 总红细胞脂肪酸的百分比)。图3A-3C显示四个饮食处理组在3个月(图3A)、 6个月(图3B)或9个月(图3C)之后的脑磷脂酰胆碱(PC)分布(将值表示成占 总脑PC脂肪酸的百分比)。图4A-4C显示四个饮食处理组在3个月(图4A)、 6个月(图4B)或9个月(图4C)之后的脑磷脂酰乙醇胺(PE)分布(将值表示成 占总脑PE脂肪酸的百分比)。图5A-5C显示四个饮食处理组在3个月(图 5A)、6个月(图5B)或9个月(图5C)之后的脑磷脂酰丝氨酸(PS)分布(将值表 示成占总脑PS脂肪酸的百分比)。在图1-5中的每幅中，将四种饮食显示为 对照(蓝色)、DHA(黄色)、DHA/DPA(绿色)和DHA/ARA(红色)。在图1-5中 的每幅中，DMA＝二甲基乙缩醛、ARA＝花生四烯酸(n-6)、DHA＝二十二碳 六烯酸(n-3)、EPA＝二十碳五烯酸(n-3)、LA＝亚油酸(n-6)、ALA＝α-亚麻酸 (n-3)、DPAn-6＝二十二碳五烯酸(n-6)、DPA n-3＝二十二碳五烯酸(n-3)和肾上 腺酸＝肾上腺酸(n-6)。
结果显示，由于富含PUFA的饮食，在6个月(3个月的饮食处理)、9 个月(6个月的饮食处理)和12个月(9个月的饮食处理)大的小鼠中，红细胞 (RBC)脂肪酸和脑脂肪酸出现变化(图1A-C和2A-C)。就所有补充有PUFA 的饮食而言，在各个时间点，RBC 22:6 n-3(DHA)重量百分比水平都比对照 水平的两倍还多。在所有补充有PUFA的饮食中，总脑22:6 n-3(DHA)水平 也增加1至3个重量百分点，但不如在RBCs中的大。就RBCs总脂质和脑 总脂质中22:6 n-3(DHA)重量百分比水平而言，用DHA(黄色)饮食饲喂的小 鼠出现最大的变化。在脑总脂质和RBC总脂质中，按脂肪酸的重量百分比 水平计，22:6 n-3(DHA)和20:4 n-6(ARA)是最大量的长链PUFAs。在脑和 RBCs中，20:5 n-3(EPA)水平是低的，通常，在脑中，22:6 n-3(DHA)重量百 分比水平比20:5 n-3(EPA)高约十五倍，在RBCs中，高约五倍。
就所有三种富含PUFA的饮食而言，与对照饮食(n-6与n-3的比例为 10∶1)比较，当DHA水平升高时，总脑脂质20:4 n-6(ARA)随之减少。在整 个补充时段内，既保持了DHA脑脂肪酸水平，也保持了ARA脑脂肪酸水 平。在RBCs中，与对照组比较，在所有时间点，DHA(黄色)饮食都使RBC 20:4 n-6(ARA)水平大幅降低了11.75个重量百分点。如所期望的那样，红色 饮食(补充有DHA和ARA)的小鼠具有最接近对照小鼠的20:4 n-6(ARA)RBC水平。
就DHA和DPAn-6(绿色)饮食而言，在所有时间点，RBCs脂质和总脑 脂质中22:5 n-6(DPAn-6)水平都比对照水平的两倍还多。在用DHA(黄色)饮 食或DHA和ARA(红色)饮食饲喂的小鼠中，脑22:5 n-6(DPA)水平和RBC 22:5 n-6(DPA)水平是非常低的，或是不能检测到的。在脑脂质和RBC脂质 中，存在极少的18:3 n-3(ALA)，对于这种长链PUFAs前体，在任一组织类 型中，都观察到非常小的脂肪酸变化。在RBCs中，18:2 n-6(LA)水平比脑 高约十五倍。就各种富含PUFA的饮食而言，在所有时间点，RBC 18:2 n-6(LA) 重量百分比水平都比对照低。这些变化反映所给予的饮食的脂肪酸组分。 在各种补充有PUFA的饮食中，甚至在这些饮食不含有可测量量的20:5 n-3(EPA)的情况下，RBC 20:5 n-3(EPA)重量百分比水平都比对照水平高。这 可表明，在血细胞中，22:6 n-3(DHA)逆向转化成20:5 n-3(EPA)。就各种补 充有PUFA的饮食而言，在整个时段内，在脑脂质中没有检测到任何可测 量量的20:5 n-3(EPA)。
在用富含PUFA的饮食饲喂的6个月(3个月的饮食处理)、9个月(6个 月的饮食处理)和12个月(9个月的饮食处理)大的小鼠中，PS、PE和PC脑 磷脂脂肪酸也发生了变化(参见图3A-3C、4A-4C和5A-5C)。按重量百分比 计，与PC(图3)部分比较，22:6 n-3(DHA)在PS(图5)部分和PE(图4)部分中 是更大量的，5倍于PC(图3)部分，并且20:4 n-6(ARA)在PE部分中是最大 量的。在脑磷脂中，20:5 n-3(EPA)水平、18:2 n-6(LA)水平和18:3 n-3(ALA) 水平是非常低的。对于所有三种磷脂，在脑磷脂22:6 n-3(DHA)重量百分比 方面，相对于对照，DHA(黄色)饮食导致最大的提高。在所有三种脑磷脂中， 与对照比较，DHA(黄色)饮食的20:4 n-6(ARA)水平出现相应的降低。如在 RBCs脂质和总脑脂质中观察到的那样，在用富含DHA和DPAn-6(绿色)的 饮食饲喂的小鼠中，各种脑磷脂部分中22:5 n-6(DPA)重量百分比水平都提 高最大。
总之，在RBC脂肪酸水平和脑脂肪酸水平方面，反映了饮食中n-6脂 肪酸组分与n-3脂肪酸组分的比例。就RBC水平和脑水平而言，在饮食中 增加22:6 n-3(DHA)含量，导致DHA水平的显著提高。在饮食中22:6 n-3(DHA)水平提高的情况下，n-6脂肪酸随之减少。当将其它脂肪酸(即DPA 和ARA)加至饮食时，其在组织中相应的脂肪酸水平也提高。总之，在整个 补充时段内，对于每种饮食，都很好地保持了脑脂肪酸水平。
生化标志分析
图6A-6J显示在3个月、6个月和9个月饮食处理之后，饮食对6个月 大3X-TG-AD小鼠的淀粉状蛋白-β(Aβ)水平的作用。如以上所描述，动物接 受以上在表1中所显示的四种饮食之一。用对Aβ1-40和Aβ1-42及总淀粉 状蛋白特异性的抗体，测量脑蛋白质提取物中的总可溶性Aβ肽(图6A、6C 和6E)和总不溶性Aβ肽(图6B、6D和6F)。如在图6A中所显示，在饲喂3 个月之后，与用玉米-大豆油饲喂的动物比较，用包含微型藻类DHA的饮 食(黄色、绿色和红色饮食)饲喂的动物具有更低水平的可溶性淀粉状蛋白β 肽。在用饮食补剂饲喂了6个月(图6C)时，与对照动物相比，用包含DHA(黄 色)或DHA和DPAn-6(绿色)的饮食饲喂的动物仍然具有水平显著更低的淀 粉状蛋白β肽，但在用包含DHA和ARA(红色)的饮食饲喂的动物中，淀粉 状蛋白β肽的水平不再与对照有显著不同。在饲喂了9个月(图6E)时，当 与对照进行比较时，只有用包含DHA(黄色)的饮食饲喂的动物具有显著减 少的Aβ。在包含玉米/大豆油的饮食和包含微型藻类油的饮食之间，就不溶 性淀粉状蛋白的总水平而言，没有观察到任何差异。图6G-6J显示动物颅切 片中细胞内总淀粉状蛋白的相对强度，所述动物用玉米/大豆(蓝色组)、 DHASCO(黄色组)、DHATM-S(绿色组)和DHASCO/ARASCO(红色组)饲 喂。在饲喂了3个月之后，与用包含DHASCO或DHATM-S的饮食饲喂的 动物相比，用玉米-大豆和DHASCO/ARASCO饮食饲喂的动物包含相对更 多的总细胞内淀粉状蛋白。
图7A和7B显示在处理了3个月之后，饮食对6个月大3x-TG AD小 鼠的APP加工的作用。用包含玉米-大豆油的饮食饲喂动物，或用包含微型 藻类油的饮食饲喂动物，在这两类动物之间，APP的总水平、C83的总水 平和C99的总水平没有显著的差异。
图7C和7D显示在处理了3个月之后，饮食对Aβ肽清除酶(胰岛素降 解酶，IDE)的作用。在用包含玉米/大豆油或各种微型藻类油的饮食饲喂的 动物中，就IDE水平而言，没有观察到任何在统计学上显著的差异。
图8A和8B显示在3个月实验饮食处理之后，饮食对6个月大3X-TG 动物的APP分泌酶的作用。在用包含玉米-大豆油或微型藻类油的饮食饲喂 的动物中，就β-分泌酶(BACE)或ADAM 10而言，没有任何显著的差异是 显而易见的。
图8C和8D显示，当与用玉米-大豆饮食饲喂的动物进行比较时，用包 含微型藻类油的饮食饲喂的动物具有显著降低的酶水平，即显著降低的早 老素1水平，但呆蛋白水平没有显著降低。
图8E显示，DHA使SHSY5Y细胞中的早老素1mRNA显著减少(*，p＜ 0.05)。
图9A-9F显示在3个月、6个月和9个月饮食处理之后，饮食对总τ 蛋白水平的作用。如在图9A和9B中所显示，与包含玉米-大豆油的饮食比 较，包含微型藻类油(其包含DHA)的饮食(黄色、绿色和红色饮食)使总τ蛋 白水平显著降低。在饲喂了6个月之后，与包含玉米-大豆油的饮食比较， 用包含DHA作为主要PUFA(黄色)的饮食或包含DHA和DPAn-6(绿色)的饮 食饲喂的动物保持显著更低的总τ蛋白水平，但当与对照进行比较时，用包 含DHA和ARA组合(红色)的饮食饲喂的动物不具有显著不同的总τ蛋白水 平。在饲喂了9个月之后，当与对照进行比较时，只有用包含DHA作为主 要PUFA(黄色)的饮食饲喂的动物具有显著降低的总τ蛋白水平。
图10A-10D显示，在饲喂了3个月之后，与其它3种饮食比较，DHA 和DPAn-6(绿色)饮食使构象发生变化的τ蛋白的表达显著减少。
如在图10E和10F中所显示，在9个月饮食处理之后，当与用包含玉 米-大豆油的饮食饲喂的动物进行比较时，在用包含DHA作为主要PUFA(黄 色)的饮食或包含DHA和DPAn-6(绿色)的饮食饲喂的动物中，磷酸化τ蛋 白显著减少。当与对照进行比较时，用包含DHA和ARA组合(红色)的饮食 饲喂的动物不具有显著不同的磷酸化τ蛋白水平。
本申请所引用的每份参考文献和出版物都作为参考文献全文引入本申 请。美国临时申请60/697,911和美国临时申请60/779,145所披露的全部内 容作为参考文献引入本申请。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但显而易见的是，对于本 领域技术人员，可对这些实施方案进行修改和调整。然而，应该明确理解 的是，如在权利要求书中所阐述，这些修改和调整在本发明的范围内。
根据本发明，痴呆的特征为整体中枢神经系统功能的丧失，这导致不 能理解简单的概念或指示，不能记住或想起信息，并且导致行为和人格的 变化。最常使用的痴呆诊断标准是DSM-IV(精神障碍诊断和统计手册，美 国精神病学联合会)。按照DSM-IV，痴呆的诊断特征包括记忆缺损和以下 情况中的至少一种：语言缺损(失语症)、丧失发挥学会的运动功能的能力(失 用症)、不能认出熟悉的事物(失认症)或在发挥功能或做出决定时出现混乱。 阿尔茨海默病(AD)为最普遍的痴呆形式。
近来，位于欧文的加利福尼亚大学的小组已开发并且报道了阿尔茨海 默病的小鼠三元转基因模型(triple transgenic model)(Oddo et al.，2003)。这些 小鼠包含PS1M146V、APPSwe和τP301L转基因。早老素-1(PS1)为在脑细胞中产 生的蛋白质，并且与Aβ肽的量增加相关联。14号染色体上的PS1基因的 遗传突变是导致家族性阿尔茨海默病的原因。淀粉状蛋白前体蛋白(APP)为 通常在脑中发现的功能未确定的蛋白质。在阿尔茨海默病中，APP发生不 正常的降解，这导致淀粉状蛋白的形成。τ蛋白为高度不对称并且热稳定的 蛋白质，其主要在脑中表达，其中τ蛋白调节神经元、星形胶质细胞和少突 胶质细胞中微管的定向和稳定性。这些三元转基因小鼠在阿尔茨海默病相 关脑区域(海马、杏仁体和大脑皮质)中形成斑块和缠结病理。这些小鼠在缠 结形成之前，出现细胞外Aβ沉积，这与淀粉状蛋白级联假说相一致。小鼠 早在六月龄时就出现突触功能障碍。虽然在此年龄，在海马区域没有出现 任何细胞外Aβ沉积，但在此年龄，已出现Aβ肽(包括最致病的Aβ42肽)的 细胞内积聚。这种模型的研究成果表明，神经元内的Aβ是所观察到的突触 功能障碍的基础。在人类个体中，缠结形成通常开始于边缘脑结构中，且 逐步发展至皮质区域，这与在所述小鼠模型中观察到的模式相同。
发明人已使用这种与人类AD非常相像的小鼠模型，来确定PUFAs对 AD发生和进展的作用机理，并且开发用于预防和治疗AD的新颖的治疗策 略和组合物。发明人提供多组用包括一种或多种PUFAs的相当多的饮食来 源的饮食饲喂的上述小鼠。所述饮食包括富含DHA的饮食、富含DHA和 DPAn-6的饮食及富含DHA和ARA的饮食。发明人已令人惊讶地发现，在 这种动物模型中，PUFAs的给予事实上减少了可溶性Aβ的量，减少了总τ 蛋白的量，并且减少了早老素-1的量。具体地，发明人已发现，包含DHA 的饮食使可溶性Aβ的水平降低，虽然DHA的作用随时间推移而减弱，尤 其是在肾上腺酸或花生四烯酸水平提高的个体中或在DPAn-6水平降低的 个体中。随时间推移，只包含DHA的饮食是最有效的，但在更早的时间点， DHA和DPAn-6的组合也是有效的，在早的时间点，DHA和ARA组合也 是有效的。而且，发明人发现，DHA和DPAn-6的组合呈现令人惊讶的意 想不到的益处，这是因为当与只饲喂DHA的动物比较时，提供有充足的饮 食化的DHA及DPAn-6的动物在组织中具有显著提高的DPAn-6水平。具 有更高血DHA和ARA水平的动物易于使早老素-1(与APP裂解成毒性淀粉 状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少，虽然只包含DHA的饮食或包含DHA 和DPAn-6组合的饮食也使早老素-1水平降低。发明人也发现，包含DHA 的饮食使总τ蛋白水平降低，这些饮食包括只包含DHA的饮食、包含DHA 和DPAn-6的饮食或包含DHA和ARA的饮食，虽然组合饮食的作用随时间 推移而减弱，从而只有包含DHA作为主要PUFA的饮食使总τ蛋白水平降 低。然而，就磷酸化τ蛋白而言，包含DHA的饮食或包含DHA和DPAn-6 的饮食都使磷酸化τ蛋白显著减少，甚至在更晚的时间点，而DHA和DPAn-6 的组合是有效的，并且与只富含DHA的饮食相比，DHA和DPAn-6的组合 趋向于更有效。综上，发明人的结果表明，包含DHA的饮食或包含DHA 和DPAn-6的饮食在减少AD病理方面是有效的，并且所有配方中最成功的 配方为只包含DHA作为主要PUFA的饮食，虽然就至少减少磷酸化τ蛋白 而言，含有DHA和DPAn-6的饮食也是有效的。更具体地，发明人已发现， PUFAs对认知障碍例如AD的病理具有不同的作用，从而使患者可被恰当 地靶向，和/或可按优选的剂量或在优选的时间点来给予PUFAs，以更有效 地治疗疾病。具体地，发明人已发现，DHA使被认为是较早病理的淀粉状 蛋白减少，同时在减少被认为是较晚病理生物标志的τ蛋白和磷酸化τ蛋白 病理方面，DPAn-6是额外有效的。而且，由于在本发明之前，没有描述过 DPAn-6在改善AD症状或治疗AD特征中的任何作用，所以从包含DPAn-6 的饮食观察到的有益作用也是令人惊讶的。发明人的结果也提供了有力的 新标志，该新标志用于确定最有可能在疾病的多个时间点阳性响应于PUFA 补充疗法或治疗的受试对象。
因此，本发明的一个实施方案涉及在个体的神经组织中降低Aβ肽水平 的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/ 或其前体或来源给予个体，以降低个体的Aβ肽的水平。在优选的实施方案 中，所减少的Aβ肽为可溶性Aβ肽。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、 DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA 和DHA的组合。在一个实施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中， PUFA包括DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组 合。
在另一个实施方案中，本发明涉及在个体的神经组织中维持APP水平 的方法，或更优选地涉及预防或抑制在早老素-1的作用下APP(无论水平如 何)裂解成Aβ肽(具体为裂解成毒性更大的Aβ肽大小形式(size form))的方 法。该方法包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 和/或其前体或来源给予个体，以维持个体的APP的水平，或预防或抑制在 早老素-1的作用下APP裂解成Aβ肽，特别是裂解成毒性更大的Aβ肽大小 形式。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的 组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实施方案中，PUFA包括DHA。 在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为 DHA和DPAn-6的组合。
细胞外淀粉状蛋白斑块的主要成分为淀粉状蛋白(Aβ)，其为42至43 个氨基酸的肽，源于淀粉状蛋白蛋白前体(APP)的蛋白水解裂解，APP为功 能未知的I型跨膜糖蛋白。三种不同的酶使APP裂解，产生大小不同的β 淀粉状蛋白肽。α-分泌酶在位于Aβ肽序列中的一个位点(Aβ16)从APP的 C-末端进行裂解，产生83个氨基酸的C-末端片段和26个氨基酸形式的Aβ。 γ-分泌酶随后在Aβ肽的C-末端对上述83个氨基酸的肽进行裂解，释放短 的15个氨基酸的肽(p3)，p3在淀粉状蛋白发生中的作用没有很好地定义。β- 分泌酶或BACE1切割Aβ肽的N-末端，同时γ-分泌酶切割Aβ肽的C-末端， γ-分泌酶事实上可以是早老素。根据γ-分泌酶连同β-分泌酶对APP进行裂 解的确切位点，产生40或42个氨基酸的肽。与上述15个氨基酸的形式或 上述40个氨基酸的形式比较，更长的42-43个氨基酸的肽被认为是更致病 形式的Aβ。源于Aβ的可扩散配体(或ADDLs)是Aβ1-42的非原纤维聚集 性衍生物，与在阿尔茨海默斑块中发现的大的Aβ原纤维比较，这些衍生物 据报道具有更大的神经毒性。在存在丛生蛋白(Apo J)的情况下，Aβ1-42在 低聚ADDLs中的积聚增加，丛生蛋白为老年斑的蛋白质组分。Aβ1-42+丛 生蛋白在PC12培养的神经元中是高度毒性的。
已确定编码人淀粉状蛋白蛋白前体(APP)的核苷酸序列，并且可在公共 序列数据库例如National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库 中，发现APP肽的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列。例如，可在NCBI 数据库中，在登记号NM_000484(变体1)、NM_201413(变体2)和 NM_201414(变体3)下，发现人APP肽的核苷酸序列和氨基酸序列。在此将 这些数据库登记号所代表的全部信息全文引入作为参考。可通过在本领域 中已知的方法，对Aβ肽进行检测和/或测量，且以下对这些进行了详细的 讨论。
在本发明的另一个实施方案中，本发明包括在个体的神经组织中降低τ 蛋白水平的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸 (PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以降低个体的τ蛋白的水平。在优选 的实施方案中，待减少的τ蛋白为磷酸化τ蛋白或构象发生变化的τ蛋白。 在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、 DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实施方案中， PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在另一个实施 方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
τ蛋白，尤其是磷酸化τ蛋白，为在神经原纤维缠结中发现的主要蛋白， 神经原纤维缠结为在阿尔茨海默病个体中出现的较晚阶段损害。神经原纤 维缠结主要由不正常磷酸化的τ蛋白组成，所述τ蛋白为神经元专属性磷蛋 白，其为神经元微管的主要成分。在阿尔茨海默病中，在大脑皮质的神经 元中，发现神经原纤维缠结，但在颞叶区域中，尤其是在海马和杏仁体中， 神经原纤维缠结是最常见的。神经原纤维缠结的密度和模式与AD的严重度 相关。可通过在本领域中已知的方法，对τ蛋白和/或磷酸化τ蛋白进行检 测和/或测量，以下对这些进行了更充分的讨论。
因此，本发明的一个实施方案包括延迟个体神经原纤维缠结形成或降 低其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延缓个体的神经原纤维缠结形成 或降低其严重度。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。 在一个实施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括 DPAn-6。在另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
在本发明的另一个实施方案中，本发明包括在个体的神经组织中降低 早老素-1(PS1)蛋白水平的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多 不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以降低个体的PS1蛋白 的水平。在某些实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA 的组合、DHA和ARA的组合或DPAn-6、ARA和DHA的组合。在一个实 施方案中，PUFA包括DHA。在一个实施方案中，PUFA包括DPAn-6。在 另一个实施方案中，PUFA为DHA和DPAn-6的组合。
在本领域中，早老素-1被认为对γ-分泌酶活性负责，后者使APP裂解 成β淀粉状蛋白即裂解成致病肽，或早老素-1被认为是“γ-分泌酶”活性的重 要决定因子，后者是产生β-淀粉状蛋白所必需的。已将淀粉状蛋白前体蛋 白的突变(mAPP)和早老素1的突变(mPS1)与β-淀粉状蛋白肽(Aβ)的产生增 加相关联。可通过在本领域中已知的方法，对早老素-1的表达或活性进行 检测和/或测量，以下对这些进行了更充分的讨论。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体出现突触功能障碍和/或降 低其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪 酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延迟个体出现突触功能障碍和/ 或降低其严重度。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。 在优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。突触 功能障碍为阿尔茨海默病神经病的主要表型现象，是与表征阿尔茨海默病 的记忆和认知变化最相关的现象之一。
本发明的另一个实施方案包括延迟痴呆的出现和/或降低其严重度的方 法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其 前体或来源给予个体，以延迟个体出现痴呆和/或降低其严重度。在本实施 方案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA 和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。在优选的实施方案中， PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体出现脑功能衰退和/或降低 其严重度的方法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸 (PUFA)和/或其前体或来源给予个体，以延迟个体出现脑功能衰退和/或降低 其严重度。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6 和DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。 在优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
本发明的另一个实施方案涉及延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度的方 法，包括将一定量的至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其 前体或来源给予个体，以延迟个体的脱髓鞘或降低其严重度。在本实施方 案中，PUFA优选地包括DHA或DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA 和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。在优选的实施方案中， PUFA包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。髓鞘为包覆神经轴突的白色 物质，并且使脉冲能有效地在脑和身体其它部分之间进行神经传导。髓鞘 的丧失(即脱髓鞘)或不正常的髓鞘组分可与神经处理速度或活性的降低相 关，进而与认知衰退相关。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗或预防与APP、Aβ肽、PS1蛋 白、磷酸化τ蛋白和/或τ蛋白的量增加和/或其引起的功能障碍相关的疾病 的方法。该方法包括以下步骤：(a)确定出现选自APP、Aβ肽、PS1蛋白、 磷酸化τ蛋白、τ蛋白或其组合的蛋白质或肽的量增加和/或其引起的功能障 碍的个体；和(b)将至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前 体或来源给予个体。在一个实施方案中，按被确定为足以降低Aβ肽、PS1 蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白的量增加或其引起的功能障碍的量来给予 PUFA。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA 的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs 包括DHA、DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
本发明也包括治疗或预防与ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/ 或其前体或来源的量减少相关的疾病的方法。该方法包括以下步骤：(a)确 定出现ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源的量减少 (例如在组织或血液中)的个体；和(b)按被确定为足以补偿ω-3和/或ω-6多 不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源的量减少所引起的影响的量，将至 少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体。 在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组 合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs 包括DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括延迟个体的突触功能障碍、脑功能 衰退、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病或降低其严重度的方法。该方法包括以 下步骤：(a)确定出现指示突触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或 相关疾病的至少一种症状或生物标志的个体；和(b)按被确定为足以延迟突 触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病或降低其严重度的 量，将至少一种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给 予个体。在本实施方案中，PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和 DHA的组合、DHA和ARA的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选 的PUFAs包括DHA、DPAn-6或DPAn-6和DHA的组合。
在另一个实施方案中，本发明包括使以下个体的脑电图(EEG)θ波稳定 和正常化的方法，所述个体患有记忆丧失、早期阿尔茨海默病，或为任意 类型痴呆的潜在患者，并且所述个体在EEG上，尤其是在额叶的EEG上， 具有深、慢、不正常的θ活性。可使用本方法，来预防通过家族史或遗传 标志而被认为趋向于出现不正常θ波活性的个体的不正常θ波活性的显现。 该方法包括以下步骤：(a)确定具有不正常θ波活性或预计趋向于不正常θ 波活性显现的个体；和(b)按被确定为足以使个体θ波活性稳定或正常化或 足以预防或减少个体不正常θ波活性显现的量，将至少一种ω-3和/或ω-6 多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源给予个体。在本实施方案中， PUFA优选地包括DHA、DPAn-6、DPAn-6和DHA的组合、DHA和ARA 的组合或DHA、DPAn-6和ARA的组合。优选的PUFAs包括DHA、DPAn-6 或DPAn-6和DHA的组合。
在本发明上述实施方案的一个方面，将个体确定为易于患上痴呆或前 痴呆。在另一个方面，已肯定地将个体诊断为患有痴呆或前痴呆。在另一 个方面，已肯定地将个体诊断为患有阿尔茨海默病。确定个体是否患有或 易于患上痴呆或前痴呆(包括阿尔茨海默病)的方法，包括测量生物标志(例 如本申请所描述的APP、Aβ肽、PS 1蛋白、磷酸化τ蛋白或τ蛋白)，或确 定出现痴呆的家族史，或检测当前的中度认知缺损，或检测年龄相关认知 衰退。
中度认知缺损(MCI)为记忆丧失的一种形式，其可能影响人们进行神经 精神检查的能力。根据规范性标准检查的分数，患有MCI的个体通常具有 缺损的记忆，但在其它类型的脑功能例如筹划或注意力方面，没有出现缺 损。这些个体在运用日常生活所需要的技能方面，没有明显的问题。患有 MCI的个体面临显著增加的患上阿尔茨海默病或其它痴呆形式的危险。
年龄相关认知衰退(ACRD)，也称为年龄相关记忆缺损(AAMI)、年龄一 致性记忆衰退(Age-Consistent Memory Decline)、良性衰老性健忘(Benign Senescent Forgetfulness，BSF)、认知衰退(年龄相关)、健忘(良性衰老性)或记 忆衰退(年龄一致性)，不被认为是疾病，虽然权威们就以下问题是有分歧的： 年龄相关认知衰退是否部分地与阿尔茨海默病和其它痴呆形式相关，或年 龄相关认知衰退是否为截然不同的事物。患有ARCD的个体在记忆和学习、 注意力和集中精神、思考、语言使用和其它精神功能方面经历恶化。
可通过各种神经病检查和认知检查来确定中度认知缺损(MCI)和年龄 相关认知衰退(ARCD)，这些检查包括但不局限于简易智力状态检查(Mini Mental State Examination，MMSE)、剑桥神经精神测试自动化套件(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery，CANTAB)、阿尔茨海默病评价认 知程度测试(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-cognitive test，ADAScog)、 淀粉状蛋白β肽或磷酸化τ蛋白在脑脊液中的存在、通过正电子发射断层扫 描术(Positron Emission Tomography，PET)或单光子发射计算机断层扫描术 (Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)确定的扩大的脑室、 通过PET或SPECT研究来检测淀粉状蛋白斑块或神经原纤维缠结在脑中的 存在、脑电图(EEG)和在一些情况下的遗传检查。MCI可通过显示以下特征 的临床检查与神经精神检查的组合来确定：记忆疾病、就年龄而言不正常 的记忆力、从事正常日常活动的能力、正常的一般认知功能、没有出现痴 呆。另外，可利用脑脊液(CSF)τ蛋白和淀粉状蛋白β肽的水平及脑成像(PET、 SPECT、磁共振成像(MRI))，来排除阿尔茨海默病或将其作为次要危险因素。
可通过多种方法来测量突触功能障碍，所述方法包括但不局限于氧和 葡萄糖利用(PET-正电子发射断层扫描术、单光子发射计算机断层扫描术 (SPECT))和功能性磁共振波谱(fMRI)、脑电图和长时程增益作用(long-term potentiation)。
脑功能可通过在本领域中已知的多种方法(包括评价信息处理速度、可 执行功能(executive function)和记忆的各种认知检查)来测量。实例包括但不 局限于简易智力状态检查(MMSE)、剑桥神经精神测试自动化套件 (CANTAB)、阿尔茨海默病评价认知程度测试(ADAScog)、威斯康星卡片分 类测试(Wisconsin Card Sorting Test)、言语和图形流畅测试(Verbal and Figural Fluency Test)和连线测试(Trail Making Test)、脑电描记术(EEG)、脑磁波描记 术(MEG)、正电子发射断层扫描术(PET)、单光子发射计算机断层扫描术 (SPECT)、磁共振成像(MRI)、功能性磁共振成像(fMRI)、计算机断层扫描 术和长时程增益作用。
EEG，即脑电活性的测量术，通过以下方法来进行：在多个标志位置， 将电极置于头皮上，并且记录大幅放大的脑信号。
MEG与EEG联用，其中MEG测量与电场相关联的磁场。利用MEG 来测量自发的脑活性，包括神经系统中的同步波(Joliot et al.，1994；Deutsch， 1998)。
PET提供对氧利用和葡萄糖代谢的测量术。在这项技术中，给予放射 性正电子发射示踪剂，脑所摄取的示踪剂与脑活性相关。这些示踪剂发射γ 射线，后者通过脑周围的传感器来检测，得到脑活性三维(3D)绘图。示踪剂 一旦被脑摄取，检测到的放射性就以局部脑血流量的函数的形式出现 (Frackowiak，1989)，并且在活动期间，可在几秒中就检测到CBF和神经葡 萄糖代谢的增加。
MRI和fMRI利用以下事实：可通过使原子核受到强磁力的作用来操纵 原子核的一种特性即原子核的自旋。当受试对象使其头部处于强磁体(磁力 为1.5至5特斯拉)中时，短波电磁波天线使磁场发生变化，与主磁场相比， 这种变化是非常小的。变化的脉冲使原子核产生共振信号，可在三维中定 量所述信号，并且使其数字化。
可使用本发明方法来治疗的个体也可通过神经精神检查、临床检查和 个体的认知功能丧失(例如主观记忆丧失(subjective memory loss))疾病来确 定。
使用本发明的方法，对优选的生物标志(例如生物样品中这些生物标志 的含量)进行评价，以确定待治疗的个体，或监测对个体的治疗，这些优选 的生物标志包括但不局限于：APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1和 /或ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)(优选为DHA、ARA和/或DPAn-6) 和/或其前体或来源。优选地，根据本发明，在给予PUFA的步骤之前，测 量个体生物样品中这些生物标志中的任意一种的表达(例如RNA或蛋白质 检测)或生物活性。在一些实施方案中，根据本发明，可在给予PUFA的步 骤之后，测量这些生物标志的量、表达或生物活性，以例如监测给定的方 法对症状或病症治疗的作用。
确定生物标志的量水平、表达水平或生物活性水平的显著性(例如确定 个体是否患有或易于患上痴呆或前痴呆，或确定给定的PUFA给药方案是 否有效)的方法，涉及比较个体样品中生物标志(也称为生物标志)的表达水 平和/或生物活性水平与对照或基线样品中生物标志的量、表达和/或生物活 性的基线水平。当与基线量比较时，个体样品中生物标志(就生物标志APP、 Aβ、APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1而言)的量出现增加，或当 与基线量比较时，ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)的量出现减少，以 上两种情况表明，个体面临突触功能障碍、脑功能衰退、脱髓鞘和/或前痴 呆或痴呆或相关疾病(例如阿尔茨海默病)的危险或患有所述疾病。
在本发明中，生物标志典型地通过以下方法来评价：评价得自个体的 生物样品中生物标志的量、表达和/或生物活性。生物样品可包括细胞样品、 组织样品和/或体液样品。根据本发明，术语“细胞样品”通常可用于指代待 通过本发明方法来评价的包含细胞的任意类型的样品，包括但不局限于分 离的细胞样品、组织样品和/或体液样品。根据本发明，分离的细胞样品为 通常在悬浮液中或与结缔组织(在体内结缔组织可使细胞在组织中连结)分 开的细胞样本，通过任意合适的方法，从器官、组织或流体收集细胞，从 而收集合适数量的细胞，用于通过本发明的方法来进行评价。细胞样品中 的细胞无需是相同类型的，虽然可使用纯化方法来分离细胞，优选地，对 分离的细胞进行评价。细胞可通过以下方法来得到：使组织破碎，对组织 样品进行处理，以释放单个的细胞，或从体液分离细胞。
虽然组织样品类似于分离的细胞样品，但本申请将其定义为身体器官 或身体组织的部分，所述部分通常包括若干细胞类型和/或使细胞保持在一 起的细胞骨架结构。本领域的技术人员将理解，在一些情况下，术语“组织 样品”可与“细胞样品”交换使用，虽然前者优选地用于指代比细胞样品更复 杂的结构。组织样品可通过以下方法来得到：活组织检查，例如切割、切 片或穿刺。
与组织样品相似，体液样品也可包含细胞，并且可通过适于待采样的 具体体液的任意方法来得到。适于采样的体液包括但不局限于血液、脑脊 液、粘液(mucous)、精液、唾液、乳汁、胆汁和尿液。在本发明的优选实施 方案中，生物样品为血液样品或脑脊液样品，所述血液样品包括任意血液 部分(例如全血、血浆、血清)。
通常，基于样品的可获得性和方法的目的来选择样品类型(即细胞、组 织或体液)。典型地，可通过介入性最小的方法来得到的生物样品是优选的 (例如血液)，虽然在一些实施方案中，所述方法对于得到用于评价的细胞或 组织样品是有用或必需的。个体的组织也可通过非介入性方法来评价，例 如通过成像方法。
一旦从个体得到样品，就对样品进评价，以检测样品中本申请所描述 的任意生物标志的存在、表达或生物活性，所述生物标志包括：APP、Aβ 肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1和/或ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA) 和/或其前体或来源。检测生物标志的“表达”通常指代检测mRNA转录或蛋 白质翻译，包括检测蛋白质或肽的翻译后加工(例如检测样品中蛋白质的 量)。检测生物标志的“存在”指代检测生物标志是否存在于样品中的任意方 法，并且在大多数情况下，“检测生物标志的存在”可与“检测表达”或“检测 量”交换使用。优选地，在个体中检测存在、量、表达或生物活性的方法与 在用于确立生物标志基线或对照水平的样品中检测存在、量、表达或生物 活性的方法相同，或在质量上与其等同。
适于检测生物标志转录的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或细 胞提取物中mRNA水平的任意合适的方法。这类方法包括但不局限于：聚 合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、原位杂交、Northern印迹、序 列分析、微阵列分析和报告基因检测。用于检测转录水平的这类方法在本 领域中是众所周知的，在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989和/或Glick et al.， Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA， ASM Press，1998、Sambrook et al.，ibid.和Glick et al.，ibid.中，描述了许多这 样的方法，在此将这些文献全文引入作为参考。当样品为细胞或组织样品 时，生物标志转录的测量是最合适的，因此，当样品为包含细胞或细胞提 取物的体液样品时，通常将细胞从体液分离出来，以进行表达测定。
生物标志表达可通过翻译的检测(即样品中蛋白质的检测)来确定。适于 蛋白质检测的方法包括用于检测和/或测量流体、细胞或细胞提取物中蛋白 质的任意合适的方法。这类方法包括但不局限于Western印迹、免疫印迹、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、等离子表面共 振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸/ 电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、微细胞计量术、微阵列、显微术、荧光 激活细胞分类术(FACS)、流式细胞计量术和蛋白质微芯片或微阵列、高效 液相色谱或尺寸排阻色谱。这类方法在本领域中是众所周知的。在本领域 中，已制备和描述了本申请所述生物标志的抗体，可在用于检测所述生物 标志的许多测定中使用这些抗体。
可选择地，技术人员可使用在本领域中众所周知的技术，容易地制备 与所述生物标志选择性结合的抗体。短语“选择性结合”指代一种蛋白质与另 一种蛋白质(例如抗体、其片段或结合配体(binding partner)与抗原)的特异性 结合，其中通过任意标准测定(例如免疫测定)来测量的结合水平在统计学上 显著高于测定的背景对照。例如，当进行免疫测定时，对照通常包括只包 含抗体或抗原结合片段(即不存在抗原)的反应孔/试管，其中在没有抗原情 况下的抗体或其抗原结合片段的反应性(例如与孔的非特异性结合)的程度 被视为背景。可使用本领域中的各种标准方法，包括酶免疫测定(例如 ELISA、免疫印迹测定等)，来对结合进行测量。可在测定试剂盒和本发明 方法中使用的抗体可包括多克隆和单克隆抗体、二价和一价抗体、双特异 性或多特异性抗体、包含这类抗体的血清、已纯化至各种程度的抗体和完 整抗体的任意功能性等价物(例如Fv、Fab、Fab’或F(ab)2片段)。
如上所述，可在个体中发现Aβ肽具有一种或多种不同的“大小形式”。 可检测这些“大小形式”，并且比较一种形式与另一种形式，或可将这些蛋白 质的具体大小形式与基线或对照样品中的相同残基进行比较。另外，技术 人员可检测个体生物样品中不同Aβ肽的比例或分布，或检测任意其它上述 肽的大小形式的比例或分布，并且比较所检测到的分布与基线对照的分布。 待检测的特别有用的Aβ大小形式(残基)包括长度为15个氨基酸、40个氨 基酸、42个氨基酸或43个氨基酸的APP裂解产物。可使用多种以上确定 的用于蛋白质检测的方法，来检测大小形式，并且将这些大小形式彼此区 分开来。
也可通过检测生物标志的生物活性(例如蛋白质的生物活性)，来检测样 品中的生物标志。根据本发明，“生物活性”指代本申请所述生物标志的任意 生物作用，包括但不局限于酶活性、蛋白质与另一种蛋白质的结合(例如受 体、信号蛋白、底物等)、蛋白质的活化、细胞信号传导路径的活化和作为 生物标志表达、存在或活化的结果而发生的下游生物事件。本申请所披露 的检测生物标志的生物活性的方法在本领域中是已知的，并且包括但不局 限于结合测定、酶测定和磷酸化测定。
因此，本发明的几种方法(所述方法包括以下步骤：确定个体、诊断需 治疗的个体和/或监测治疗或方案的效力)包括比较以下两类水平或结果的 步骤，一类水平或结果为：在个体中检测到的生物标志(例如APP、Aβ肽、 τ蛋白、磷酸化τ蛋白、PS1、ω-3PUFA和/或ω-6PUFA)的表达水平或活性 水平，或与突触功能障碍、脑功能、脱髓鞘和/或痴呆或相关疾病相关的具 体测试的结果；另一类水平或结果为：生物标志的表达或活性的基线或对 照水平，或测试结果的基线或对照水平。根据本发明，“基线水平”为对照水 平，并且在一些实施方案中，“基线水平”为生物标志的正常表达水平或正常 活性水平(例如在没有患上痴呆或前痴呆或其相关病症的个体中发现或预期 在所述个体中发现的生物标志的水平)或测试结果的正常水平，可将生物标 志的表达或活性的测试水平(即在个体样品中的水平)或测试结果与上述正 常的表达水平、正常的活性水平或测试结果的正常水平比较。因此，当与 基线或对照水平进行比较时，可基于生物标志或测试结果的对照或基线水 平，确定待评价的样品的生物标志的表达水平或活性水平或测试结果是否 具有可测量的增加、降低或基本上没有任何变化。就基线水平而使用的术 语“阴性对照”指代，在源于就生物标志的表达或活性或具体功能测试的结果 而言被认为是正常的个体或个体群的样品中确立的基线水平。在另一个实 施方案中，基线可指示痴呆或本申请所讨论的其它病症和/或疾病的阳性诊 断。这种基线水平在本申请中也称为“阳性对照”，其指代在源于个体、另一 个个体或个体群的样品中确立的生物标志表达或活性的水平或测试结果， 其中在源于对照的样品中生物标志表达或活性的水平或源于对照的测试结 果被认为相应于指示个体功能障碍、前痴呆或痴呆的生物标志水平或测试 结果。在另一个实施方案中，可从源于所测试个体的先前样品确立基线水 平，从而可随时间监测个体的生物标志或测试结果状态。
基于样品类型、从其得到样品的组织或器官、待评价的个体的状态和 如上所讨论的测定焦点或测定目的(例如初始诊断、监测)，来选择用于确立 生物标志或测试结果的基线水平的方法。优选地，所述方法与可用于评价 样品或个体的方法相同。
在一个实施方案中，在从个体得到的自体对照样品中，确立生物标志 的量、表达或生物活性的基线水平。自体对照样品可以是分离的细胞样品、 组织样品或体液样品，优选地为体液样品(例如CSF或血液)。根据本发明， 本申请所使用的术语“自体”的意思是，样品从同一个体得到，待评价的样品 也从所述个体得到。优选地，对照样品和待评价的样品都从相同的流体、 器官或组织得到，从而使对照样品作为待评价样品的最具可行性的基线。 本实施方案经常在以下情况下使用：已确立个体的先前读取结果，作为生 物标志的阳性诊断或阴性诊断。然后，可将所述基线用于监测个体朝向或 远离疾病或病症的行进过程，或用于监测治疗的成功程度(例如PUFA补充 疗法)。在本实施方案中，定时地对新的样品进行评价(例如在每年体检时， 或按治疗个体的临床医生所确定的时间表，前者对尚未诊断患上痴呆或前 痴呆但希望对所述疾病体征进行监测的健康个体是特别有用的)，在每个点 都确定通过脂肪酸补充疗法进行的预防性或治疗性处置。对于第一次评价， 如果需要的话，可如下所述使用交替的对照，或可进行额外的测试，以就 生物标志或测试结果和前痴呆或痴呆的征候，确定初始的阴性或阳性诊断， 且可将生物标志或测试结果的这个水平用作其后的基线。这种类型的基线 对照在其它临床诊断过程中经常使用，其中“正常”水平在个体之间可能是不 同的，和/或其中在诊断时得到自体对照样品是不可能、不现实或不利的。
用于确立生物标志或测试结果的基线水平的另一种方法为，确立对照 样品中生物标志的量、表达或生物活性的基线水平，或确立对照受试对象 的测试结果，其中对照受试对象优选地为匹配的个体群。优选的是，就生 物标志的量、表达或生物活性而言，对照样品的样品类型与待评价的样品 类型相同。根据本发明，短语“匹配的个体”指代，就一个或多个适于待评价 的参数、细胞类型、组织样品或体液样品的特征而言，对照个体是匹配的。 例如，就性别、年龄、种属或任意相关的生物因素或社会因素(例如先前存 在的病症、具体物质的消耗、其它生物因素或生理因素的水平)而言，对照 个体可与待评价的个体匹配，以上这些特征可能影响对照个体的基线和待 评价的个体。例如，正常个体的血液中本申请所述生物标志的水平可能高 于给定分类的个体(例如上年纪人与青少年、女人与男人)。为了确立生物标 志的量、表达或生物活性的对照或基线水平，得到源于多个匹配个体的样 品，并且就生物标志的量、表达或生物活性进行评价。本领域技术人员可 确定匹配个体的数量，对照样品必须从这些个体得到，以确立合适的对照 水平(例如群水平)，但匹配个体的数量在统计学上应该是合适的，以确立合 适的基线，用于与待评价的个体进行比较(即测试个体)。通常，使用本领域 中用于确立这样值的标准方法，对从对照样品得到的值进行统计学处理， 以确立合适的基线水平。
基线，例如以上所描述的基线，可以是阴性对照基线，例如从明显正 常的对照个体群确立的基线。可选择地，以上所描述的这类基线可从已被 阳性诊断为出现不正常生物标志水平、生物标志功能障碍、突触功能障碍、 脑功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆或前痴呆的个体群确立，从而可确立一个或 多个基线水平，用于在个体评价中使用。然后，将个体样品中生物标志的 量、表达或生物活性或个体的测试结果与每个基线水平比较，以确定个体 的生物标志的水平或个体的测试结果在统计学上最接近哪种类型的基线(阳 性或阴性)。应该理解，给定个体的样品可能落在基线水平之间，从而最好 的诊断是，个体可能开始出现功能障碍，这指示需要补充至少一些脂肪酸， 并且个体可能处于发展成更高阶段的过程中。本发明的目的是逆转、克服 或补偿这种进行性疾病。
本领域技术人员可理解的是，当进行测定或评价时，无需为每次测定 或评价都确立基线，但基线可通过参考某种形式的存储信息来确立，所述 存储信息是有关先前就给定对照样品而确定的基线水平，例如通过任意上 述方法确立的基线水平。这类形式的存储信息可包括但不局限于例如有关 “正常”对照(阴性对照)或阳性对照的群或个体数据的参比绘图、参比列表或 参比电子文件；从先前评价得到的个体记录数据的医用绘图；或有关可用 于待诊断或评价的个体的基线生物标志表达或活性或基线测试结果的数据 的任意其它来源。
在比较个体测试或个体样品的结果与基线对照(或多个基线对照)时，确 定测试样品的生物标志的量、表达或生物活性与基线水平相比是否具有可 测量的减少或增加，或确定在测试水平和基线水平之间是否没有任何显著 的差异。在此步骤之后，进行最后的步骤，即作出诊断、对个体进行治疗、 对个体进行监测或确定对个体的进一步治疗。
当与基线水平进行比较时，检测到APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋 白和/或PS1的量、表达或生物活性的水平出现增加；当与基线水平进行比 较时，检测到在待评价的样品(即测试样品)中APP向毒性更大的Aβ大小形 式的转化出现增加；当与基线水平进行比较时，检测到突触功能障碍、脑 功能衰退、脱髓鞘和/或痴呆症状出现加重或没有出现任何减弱；当与基线 水平进行比较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs的量出现减少，以上这些事件 通常表明，当与基线样品或基线结果进行比较时，个体可能更易于患上或 患有本申请所论疾病或病症中的任意一种(例如痴呆)。如果基线样品为源于 个体(或对照群)的先前样品或先前评价，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的 阳性诊断，那么当与基线进行比较时，检测到样品中生物标志的量、表达 或生物活性出现增加；当与基线进行比较时，检测到突触功能障碍、脑功 能衰退、脱髓鞘和/或痴呆出现加重或没有出现任何减弱；当与基线进行比 较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs出现减少，以上这些事件表明，个体的病 症正在恶化，而不是正在改善，应该对治疗进行重新评价或调整。
当与基线水平进行比较时，检测到APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋 白和/或PS1的量、表达或生物活性为正常量或健康量；当与基线水平进行 比较时，检测到在待评价的样品(即测试样品)中APP转化成毒性更小的Aβ 大小形式；当与基线水平进行比较时，检测到突触功能障碍出现减少或不 再存在，脑功能衰退出现减少或不再存在，脱髓鞘出现减少，和/或痴呆症 状出现减少或不再存在；当与基线水平进行比较时，检测到ω-3或ω-6PUFAs 的水平是正常或增加的，或检测到ω-3或ω-6PUFAs，以上这些事件表明， 当与基线样品进行比较时，个体可能更不易于患上或没有患上本申请所论 疾病或病症中的任意一种。如果基线样品为源于个体(或源于对照群)的先前 样品，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的阳性诊断(即阳性对照)，那么当与 基线进行比较时，检测到在样品或个体中出现上述结果，这表明，个体正 在经历本申请所论疾病或病症的改善。
最后，与基线样品的生物标志的量、表达或生物活性或基线样品的测 试结果相比，检测到的生物标志的表达或活性或测试结果在统计学上没有 显著的差异，这表明，当与基线样品进行比较时，个体中的本申请所讨论 的疾病或病症没有表现出任何差异。如果基线样品为源于个体(或源于对照 群)的先前样品，并且代表对个体的痴呆或前痴呆的阳性诊断(即阳性对照)， 那么与基线相比，检测到的生物标志的表达或活性或测试结果在统计学上 没有显著的差异，这表明，个体的病症没有出现任何变化，这可向临床医 生表明，例如当前医嘱治疗不能有效地控制所述病症。
为了对相对于生物标志表达或活性的基线水平或有关测试结果的基线 水平而出现的变化作出诊断，相对于确立的基线，以在统计学上显著的量(即 至少95％的置信水平或p＜0.05)，使生物标志的表达或活性的水平或测试结 果的值发生变化。就样品中生物标志的量、表达或生物活性或测试结果的 值而言，当与基线水平进行比较时，优选地检测到至少约5％的变化，更优 选地检测到至少约10％的变化，更优选地检测到至少约20％的变化，更优 选地检测到至少约30％的变化，更优选地检测到至少约40％的变化，更优 选地检测到至少约50％的变化，在这些情况下，可作出以下诊断：在测试 样品和基线样品之间存在差异。在一个实施方案中，当与基线水平进行比 较时，样品中生物标志的量、表达或生物活性或测试结果的值出现1.5倍的 变化，更优选地检测到至少约3倍的变化，更优选地检测到至少约6倍的 变化，甚至更优选地检测到至少约12倍的变化，甚至更优选地检测到至少 约24倍的变化，在这些情况下，可作出如下诊断：当与基线样品进行比较 时，生物标志的表达或活性或测试结果的值出现显著的变化。
本发明的方法包括：在给予步骤之后，监测PUFAs的给予对个体的 APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和PS1蛋白水平的效力至少一次，在一 些实施方案中，本发明的方法包括：在给予步骤之后，监测PUFAs的给予 对个体的ω-3PUFA和/或ω-6PUFA水平的效力至少一次。可通过一种或多 种生物标志的量和/或生物活性的变化、中度认知缺损的改善、年龄相关认 知衰退的改善和/或在本领域中已知和以上较详细讨论的任意其它方法，来 测量效力。该方法还可任选地包括：在随后的治疗中，基于治疗效力的监 测结果，调整向个体给予PUFA。
本发明的诊断和监测方法具有几种不同的用途。第一，可将方法用于 在较大的患有给定病症(例如神经病症)的个体库中，诊断和监测具有过度的 APP、Aβ肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1表达或功能障碍的个体亚型， 以便确定最有可能通过本发明的方法来获益的个体。实际上，发明人认为， 在认知衰退的明显症状出现之前，本发明的方法在早期对痴呆和前痴呆的 发展是有效的。也可通过在个体中确定出现PUFA缺乏(例如缺乏DHA、 DPAn-6和/或ARA)或可能出现PUFA缺乏的个体，来将方法用于诊断和监 测个体。个体可以是怀疑出现PUFA缺乏的个体或假定健康但就PUFA缺乏 接受常规筛选的个体。个体也可以是先前被诊断为PUFA缺乏并且接受治 疗现在就复发性PUFA缺乏而接受常规监护的个体。
术语“诊断”及其变体指代，基于疾病或病症的体征和症状，对疾病或 病症进行确定。本申请所使用的“阳性诊断”指代，疾病或病症或患上疾病或 病症的潜能已被确定。相反地，“阴性诊断”指代，确定为没有患上疾病或病 症或不具有患上疾病或病症的潜能。在阳性诊断的情况下，可对个体进行 医嘱治疗，以逆转或消除痴呆或前痴呆的体征、PUFA的缺乏和/或APP、Aβ 肽、τ蛋白、磷酸化τ蛋白和/或PS1的不正常量、不正常表达和/或不正常 活性。在阴性诊断(即阴性评价)的情况下，通常不对个体进行任何医嘱治疗， 或可使个体接受低水平的PUFA补充疗法，但可在未来的一个或多个时间 点，对个体进行重新评价，以再次评价突触功能障碍、脑功能、脱髓鞘和/ 或痴呆症状的生物标志或指标的水平。如以下所详细讨论，本发明评价方 法的这个具体实施方案的基线水平通常基于来自与测试样品相同的身体来 源(即相同的组织、细胞或体液)的“正常”或“健康”样品。
也可将本发明的方法用于监测对已就本申请所述病症作出阴性诊断的 个体的痴呆或前痴呆或其症状或指标(例如本申请所描述的生物标志的水平) 的治疗是否成功。本实施方案使医生或护理人员可监测个体就给定病症而 正在接受的治疗(例如PUFA补充疗法)是否成功，并且可帮助医生确定是否 应该对治疗进行修改(例如PUFA补充疗法是否应该增加、减少或保持基本 上不变)。在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下额外的步骤：对个 体进行另一项治疗，所述治疗对于治疗和/或预防痴呆或前痴呆或其症状是 有用的。
根据本发明，为了调整生物标志的水平或PUFA的组织水平，或为了 延迟痴呆或前痴呆或其相关症状或病症的出现/发展或降低其严重度，给予 PUFA(或多种PUFA)，这可为健康正常的个体及可能患上痴呆或前痴呆或患 有痴呆或前痴呆的个体提供一些益处(例如治疗益处或健康益处)。同样地， 治疗益处无需是对具体疾病或病症的治愈，但优选地，所包括的结果通常 包括缓解疾病或病症、消除疾病或病症、减轻与疾病或病症相关的症状、 延迟疾病或病症的症状的出现或发展、预防或缓解由于原发性疾病或病症 的出现而引起的继发性疾病或病症和/或预防疾病或病症。本申请所使用的 短语“防止疾病”指代减轻疾病或病症的症状、减少疾病或病症的发生、延迟 疾病或病症的出现或发展和/或降低疾病或病症的严重度。同样地，防止个 体出现疾病包括：预防或延迟或减少疾病的发生(预防性处置)和对患有疾病 的个体进行治疗(治疗性处置)。本领域的技术人员或治疗个体的训练有素的 临床医生可容易地对有益的作用进行评价。术语“疾病”指代哺乳动物正常健 康状态的任意偏离，并且包括在出现疾病症状时的状态及已发生偏离但症 状尚未出现的状态。
本发明的多个实施方案包括以下步骤：将一定量的一种或多种多不饱 和脂肪酸(PUFAs)给予个体。在大多数真核生物中，多不饱和脂肪酸(PUFAs) 是膜脂质的关键化合物(Lauritzen et al.，Prog.Lipid Res.401(2001)；McConn et al.，Plant J.15，521(1998))，并且是某些激素和信号分子的前体(Heller et al.， Drugs 55，487(1998)；Creelman et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 48，355(1997))。
根据本发明，PUFAs是脂肪酸，其具有至少16个碳、更优选地为至少 18个碳、更优选地为至少20个碳、更优选地为22或更多个碳的碳链长度， 并且具有至少3或更多个、更优选地为4或更多个、更优选地为5或更多 个、甚至更优选地为6或更多个双键，其中所有双键都处于顺式构型。本 申请所指代的长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs)更具体地指代碳链长度为18 和更多个、优选地为20和更多个的包含3或更多个双键的脂肪酸。ω-6系 列的LCPUFAs 包括：γ-亚麻酸(C18:3)、二高γ-亚麻酸 (di-homo-gammalinolenic acid)(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、肾上腺酸 (也称为二十二碳四烯酸或DTA)(C22:4n-6)和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)。 ω-3系列的LCPUFAs包括：α-亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二 十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3) 和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)。LCPUFAs也包括碳数多于22个的具有4或 更多个双键的脂肪酸，包括但不局限于C28:8(n-3)。
本申请所使用的术语“脂质”包括磷脂(PL)、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、 三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、甘油磷脂(phosphatide)、 蜡(醇和脂肪酸的酯)、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如氧化类胡 萝卜素(oxycarotenoid))、碳氢化合物和本领域技术人员所已知的其它脂质。 术语“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”不仅包括游离脂肪酸形式，而且也包括其 它形式，例如TAG形式和PL形式。
在本发明的一个实施方案中，脂肪酸的混合物，尤其是ω-3脂肪酸和 ω-6脂肪酸的混合物，可在本发明的方法中使用。优选的PUFAs包括具有 三个或更多个双键的ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3PUFAs为具有聚乙烯 结构的脂肪酸，其中最末的乙烯键位于从脂肪酸末端甲基数起(包括所述甲 基)的第三个碳处，ω-3PUFAs例如包括二十二碳六烯酸C22:6(n-3)(DHA) 和ω-3二十二碳五烯酸C22:5(n-3)(DPA n-3)。ω-6PUFAs为具有聚乙烯结构 的脂肪酸，其中最末的乙烯键位于从脂肪酸末端甲基数起(包括所述甲基) 的第六个碳处，ω-6PUFAs例如包括花生四烯酸C20:4(n-6)(ARA)、 C22:4(n-6)、ω-6二十二碳五烯酸C22:5(n-6)(DPAn-6)和二高γ-亚麻酸 C20:3(n-6)(二高GLA)。
在本发明的组合物和方法中，可使用PUFA的任意来源，例如包括动 物来源、植物来源和微生物来源。优选的多不饱和脂肪酸(PUFA)来源可以 是适于在本发明中使用的PUFAs的任意来源。优选的多不饱和脂肪酸来源 包括生物质来源，例如动物来源、植物来源和/或微生物来源。
动物来源的实例包括水生动物(例如鱼类、海洋哺乳动物、甲壳动物、 轮虫等)和从动物组织提取的脂质(例如脑、肝、眼等)。植物来源的实例包 括大型藻类(macroalgae)、亚麻子、油菜子、玉米、月见草、大豆和琉璃苣。 微生物的实例包括微型藻类(microalgae)、原生生物、细菌和真菌(包括酵母)。 微生物来源例如微型藻类的使用可提供感官优点，即源于微生物来源的脂 肪酸可不具有源于鱼类来源的脂肪酸所易于出现的鱼腥味道和气味。更优 选地，长链脂肪酸来源包括微型藻类或微型藻类油。
优选地，当微生物作为长链脂肪酸的来源时，在发酵罐中，使微生物 在发酵培养基中生长。可选择地，可在光生物反应器(photobioreactor)或反 应池中，利用光合作用(photosynthetically)来培养微生物。优选地，微生物 为富含脂质的微生物，更优选地，微生物选自微型藻类、细菌、真菌和原 生生物，更优选地，微生物选自金藻、绿藻、甲藻(dinoflagellates)、酵母、 被孢霉属(Mortierella)的真菌和管毛生物界(Stramenopiles)的微生物。优选 地，微生物包括Crypthecodinium属和破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微生 物和被孢霉属的丝状真菌，更优选地，微生物选自破囊壶菌属 (Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、Ulkenia属或其混合物， 更优选地，微生物选自具有以下鉴定特征的微生物、Mortierella schmuckeri 和Mortierella alpina的菌株、对隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的菌株、源 于上述任意一种微生物的突变菌株及其混合物，所述鉴定特征为ATCC号 20888、ATCC号20889、ATCC号20890、ATCC号20891和ATCC号20892。 可在美国专利5,407,957、5,130,242和5,340,594中发现有关这些藻类的信 息，在此将这些专利全文引入作为参考。
根据本发明，术语“海洋微型藻类”包括可天然生存于海洋或盐水环境 的微型藻类。本申请所指代的海洋微型藻类包括破囊壶菌目的微生物(本申 请也将其指代为破囊壶菌(Thraustochytrids))和Labyrinthulales目的微生物 (本申请也将其指代为Labyrinthulids)。应该认识到，在完成本发明时，对破 囊壶菌的分类学进行修订，将Labyrinthuloides属置于Labyrinthulaceae科中， 并且确认将破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)和Labyrinthulaceae科置于管毛 生物界谱系中。应该注意到，有时候常常将Labyrinthulaceae科称为 labyrinthulids或labyrinthula或labyrinthuloides，常常将破囊壶菌科称为破囊 壶菌。先前将Labyrinthulaceae科的成员视为破囊壶菌目的成员，但现在将 Labyrinthulaceae科的成员视为Labyrinthulales目的成员，Labyrinthulales目 和破囊壶菌目都被视为网粘菌门(Labyrinthulomycota)的成员。因此，本申请 所使用的术语“破囊壶菌(Thraustochytrid)”指代破囊壶菌目的任意成员，所述 破囊壶菌目包括破囊壶菌科，术语“Labyrinthulid”指代Labyrinthulales目的 任意成员，所述Labyrinthulales目包括Labyrinthulaceae科。
不断的研究已导致对破囊壶菌的分类学进行频繁的修订。分类学理论 家通常将破囊壶菌与藻类或藻样原生生物放在一起。然而，由于分类学的 不确定性，出于本发明的目的，最好应该将在本发明中描述为破囊壶菌的 菌株视为包括以下生物体：目：破囊壶菌目，科：破囊壶菌科，属：破囊 壶菌属(种：arudimentale种、aureum种、benthicola种、globosum种、kinnei 种、motivum种、multirudimentale种、pachydermum种、proliferum种、roseum 种、striatum种)、Ulkenia属(先前被一些人视为破囊壶菌属的成员)(种： amoebo idea种、kerguelens is种、minuta种、profunda种、radiata种、sailens 种、sarkariana种、schizochytrops种、visurgensis种、yorkensis种)、裂殖壶 菌属(种：aggregatum种、limnaceum种、mangrovei种、minutum种、octosporum 种)、Japonochytrium属(种：marinum种)、Aplanochytrium属(种：haliotidis 种、kerguelensis种、profunda种、stocchinoi种)、Althornia属(种：crouchii 种)或Elina属(种：marisalba种、sinorifica种)。
在本发明中描述为Labyrinthulids的菌株包括以下生物体：目： Labyrinthulales目，科：Labyrinthulaceae科，属：Labyrinthula属(种：algeriensis 种、coenocystis种、chattonii种、macrocystis种、macrocystis atlantica种、 macrocystis macrocystis种、marina种、minuta种、roscoffensis种、valkanovii 种、vitellina种、vitellina pacifica种、vitellina vitellina种、zopfii种)、 Labyrinthuloides属(种：haliotidis种、yorkensis种)、Labyrinthomyxa属(种： marina种)、Diplophrys属(种：archeri种)、Pyrrhosorus属(种：marinus种)、 Sorodiplophrys属(种：stercorea种)或Chlamydomyxa属(种：labyrinthuloides 种、montana种)(虽然当前对Pyrrhosorus属、Sorodiplophrys属或 Chlamydomyxa属的确切分类学归属没有一致的意见)。
更具体地，可在本发明中使用的PUFA可包括二十二碳六烯酸(DHA， 重量百分比为至少约10％、约20％、约30％或约35％)、二十二碳五烯酸(DPA， 优选为DPAn-6，重量百分比为至少约5％、约10％、约15％或约20％)和/ 或花生四烯酸(ARA，重量百分比为至少约20％、约30％、约40％或约50％)。 其它PUFAs可包括二十碳五烯酸(EPA)。PUFAs包括游离脂肪酸和包含 PUFA残基的化合物，这些化合物包括磷脂、脂肪酸的酯、三酰基甘油、二 酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、甘油磷脂等。
磷脂的来源包括禽蛋、加料的禽蛋(enriched poultry egg)、藻类、鱼类、 鱼子和基因工程化的(GE)植物种子或微型藻类。特别优选的PUFAs(包括 DHA)来源包括但不局限于鱼油、海洋微型藻类和植物油，包括源于基因工 程化微型藻类和植物的油。所述PUFA即DHA的优选前体包括但不局限于 α-亚麻酸(LNA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)，LNA、EPA 和/或DPA的混合物。
根据本发明，在本申请所述补充疗法和治疗组合物中使用的长链脂肪 酸呈多种形式。例如，这些形式包括但不局限于：包括PUFA的高度纯化 的藻油、包括PUFA的植物油、包括PUFA的甘油三酯油、包括PUFA的磷 脂、包括PUFA的蛋白质和磷脂的组合、包括PUFA的干燥的海洋微型藻类、 包括PUFA的鞘脂、PUFA的酯、游离脂肪酸、PUFA与另一种生物活性分 子的结合物及其组合。可例如通过对来源进行混合、纯化、富集和基因工 程化，按不同于在所述脂肪酸的天然来源中存在的量和/或比例来提供长链 脂肪酸。生物活性分子可包括任意合适的分子，包括但不局限于蛋白质、 氨基酸(例如天然存在的氨基酸，例如DHA-甘氨酸、DHA-赖氨酸或氨基酸 类似物)、药物和碳水化合物。可在高感官质量的食物配方、饮食补剂和药 用物质中，灵活地使用本申请所概述的形式。例如，当前可得到的微型藻 类油包含约40％的DHA。可将这些油转化成酯形式，然后使用例如分子蒸 馏的技术来纯化，以使DHA含量增加至70％和更高，由此提供浓缩的产品， 其可在限制尺度即小分份尺度(serving size)的产品中使用，例如在可行丸尺 度受到限制的婴儿食物或饮食补剂中使用。油和磷脂组合的使用有助于提 高微型藻类油的氧化稳定性，因此有助于提高其感官和营养质量。氧化降 解危害甘油三酯形式的PUFAs的营养和感官质量。与甘油三酯形式相比， 通过使用磷脂形式，所期望的PUFAs更稳定，并且脂肪酸的生物利用度更 高。虽然微生物油比典型的鱼油稳定，但二者都易于发生氧化降解。氧化 降解使这些脂肪酸的营养价值降低。另外，氧化的脂肪酸被认为对良好的 健康是有害的。磷脂DHA/DPA/ARA/二高-GLA即更稳定的脂肪酸体系的使 用，使这些补剂的健康和营养价值提高。与甘油三酯油相比，磷脂也是更 容易混合到水性体系中的。由于同时提供了蛋白质和脂肪酸，所以蛋白质 和磷脂组合的使用能制备更具营养的混合食物。干燥海洋微型藻类的使用 为其中的油提供高温稳定性，并且有利于制备高温烘焙的食物。
在本发明的一个实施方案中，所期望磷脂的来源包括源于蛋、植物油 和动物器官的通过Friolex方法和磷脂提取方法(PEP)(或相关方法)制备的纯 化磷脂，这些纯化磷脂用于制备富含DHA、DPA、ARA和/或二高-GLA的 营养补剂。对Friolex和PEP及相关方法的更详细描述在以下专利中：PCT 专利PCT/IB01/00841，发明名称为“Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials”，在2001年4月12日提交，在 2001年10月18日公开为WO 01/76715；PCT/IB01/00963，发明名称为 “Method for the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol and Centrifugation”，在2001年4月12日提交，在 2001年10月18日公开为WO 01/76385；和PCT/DE95/01065，发明名称为 “Process For Extracting Native Products Which Are Not Water-Soluble From Native Substance Mixtures By Centrifugal Force”，在1995年8月12日提交， 在1996年2月22日公开为WO 96/05278；在此将以上这些专利中的每项都 全文引入作为参考。
优选地，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA和/或 DPAn-3和/或DPAn-6和/或ARA和/或二高-GLA的脂肪酸残基，所述PUFA 处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷脂的复合物、单独的磷 脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。更优选地，包括所期 望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA、ARA和/或DPAn-6的脂肪酸残 基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷脂的复 合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。更优 选地，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括选自DHA和DPAn-6的脂 肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三酯油与磷 脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋微型藻类。 在另一个优选的实施方案中，包括所期望PUFA的高度纯化的藻油包括 DHA的脂肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形式、甘油三 酯油与磷脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或干燥的海洋 微型藻类。在另一个优选的实施方案中，包括所期望PUFA的高度纯化的 藻油包括DPAn-6的脂肪酸残基，所述PUFA处于以下形式中：甘油三酯形 式、甘油三酯油与磷脂的复合物、单独的磷脂、蛋白质和磷脂的复合物或 干燥的海洋微型藻类。
在一个优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6和DHA的组合。发明 人已发现，与单独给予DHA相比，PUFAs的这种组合呈现令人惊讶的意想 不到的益处。意想不到的是，与单独给予DHA或给予DHA及其它ω-6 PUFAs相比，DPAn-6和DHA的组合可特别提供许多益处。这是令人惊讶 的，因为当消耗不充足的饮食DHA时，DPAn-6在组织中的作用出现增加。 在缺乏DHA的动物的组织中，DPAn-6出现增加，这经常与亚最佳的组织 功能相关。在本实施例中，与只饲喂DHA的动物比较，提供有充足的饮食 化的DHA及DPAn-6的动物在组织中具有显著增加的DPAn-6水平和更高 的ARA水平。具有更高血DHA和ARA水平的动物易于使PS-1(与APP裂 解成毒性淀粉状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少。此外，提供有充足的饮 食化的DHA及DPAn-6的动物具有降低的磷酸化τ蛋白水平，磷酸化τ蛋 白与痴呆患者的神经原纤维缠结的发展相关。
在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含DPAn-6和DHA组合的油 或制剂，其中所述DPAn-6和DHA组合的百分比为约30％或更多、约35％ 或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、 约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多或约80％或 更多。优选地，油或制剂中DHA与DPAn-6的比例为约1∶1至约10∶1，或 为1∶1和10∶1之间的任意比例。
在另一个实施方案中，PUFA包括ARA和DHA的组合。再次地，发 明人已发现，与单独给予DHA相比，DHA和ARA的组合呈现令人惊讶的 意想不到的益处。意想不到的是，与单独给予DHA或给予DHA及其它ω-6 PUFAs(不包括ARA)相比，DHA和ARA的组合可特别提供许多益处。这是 令人惊讶的，因为在这个实施例中，具有更高血DHA和ARA水平的动物 易于使PS-1(与APP裂解成毒性淀粉状蛋白肽相关的蛋白质)更多地减少。
在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含ARA和DHA组合的油或 制剂，其中所述ARA和DHA组合的百分比为约30％或更多、约35％或更 多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、约60％ 或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多或约80％或更多。 优选地，DHA与ARA的比例为约1∶1至约10∶1，或为1∶1和10∶1之间的任 意比例。
在另一个实施方案中，PUFA包括DHA、ARA和DPAn-6的组合，与 单独给予DHA相比，由于以上所讨论的原因，所述组合呈现令人惊讶的意 想不到的益处。在另一个优选的实施方案中，PUFA包括含DPAn-6、ARA 和DHA组合的油或制剂，其中所述DPAn-6、ARA和DHA组合的百分比 为约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％ 或更多、约55％或更多、约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、 约75％或更多或约80％或更多。优选地，DHA与ARA与DPAn-6的比例为 约1∶1∶1至约10∶1∶1，或为1∶1∶1和10∶1∶1之间的任意比例。
每日PUFA摄取量的范围优选地为每日约0.025mg至约15克，包括增 幅为0.005的在上述范围内的任意增量(例如0.025、0.030、0.035等)。在一 个实施方案中，PUFA按约0.05mg PUFA/kg个体体重至约200mg PUFA/kg 个体体重或更高的剂量来给予，包括增幅为0.01mg的在上述范围内的任意 增量(例如0.06mg、0.07mg等)，或按约50mg至约20,000mg/受试对象/ 天的剂量来给予(例如通过口服、注射、输液或完全胃肠外营养、局部使用、 腹膜内、胎盘、经皮或颅内给予)。在另一个实施方案中，PUFA按约0.45mg PUFA/kg体重/天至约275mg PUFA/kg体重/天的剂量来给予。在另一个实 施方案中，PUFA按约0.025mg PUFA/kg体重/天至约275mg PUFA/kg体重 /天的剂量来给予，包括增幅为0.005的在上述范围内的任意增量(例如 0.025、0.030、0.035等)。在另一个实施方案中，PUFA按约0.05mg PUFA/kg 体重/天至约275mg PUFA/kg体重/天的剂量来给予。例如，典型的胶囊型 DHA补剂可按每个胶囊100mg至200mg的剂量来制备，虽然本发明不受胶 囊形式或包含上述量DHA或另一种PUFA的胶囊剂的限制。
虽然脂肪酸，例如DHA，可局部给予或作为注射剂来给予，但最优选 的给予途径为口服给予。优选地以营养补剂和/或食物和/或药用制剂和/或饮 料的形式，更优选地以食物、饮料和/或营养补剂的形式，更优选地以食物 和饮料的形式，更优选地以食物的形式，将脂肪酸(例如PUFAs)给予个体。 优选的食物类型为医用食物(例如在制剂中的食物，所述制剂在医生的监督 下外来地被消耗或给予，这种食物旨在用于疾病或病症的特定饮食管理， 基于认识到的科学原理，通过医学评价来为所述疾病或病症确立有特色的 营养需要)。对于婴儿，脂肪酸作为婴儿配方(infant formula)、断奶婴儿的食 物(weaning food)、果酱化的幼儿食物(jarred baby food)和婴儿谷类(infant cereal)来给予。
生物可接受的任意剂型及其组合是本发明主旨所考虑的。这些剂型的 实例包括但不局限于咀嚼片剂、速溶片剂、泡腾片剂、可重构粉剂、酏剂、 液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、 软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、囊片剂、锭剂、咀嚼锭剂、珠子、粉剂、 颗粒剂、粉粒剂、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、灌洗剂、栓剂、乳膏 剂、局部用制剂、吸入剂、气雾吸入剂、贴剂、颗粒吸入剂、植入剂、贮 存植入剂、可吸收制剂、注射剂、输液剂、保健条状物、糖膏剂、谷类、 谷类包衣、食物、营养性食物、功能性食物及其组合。对于本领域技术人 员，以上剂型的制备是众所周知的。优选地，富含所期望PUFA的食物选 自但不局限于：烘焙货品和混合料、口香糖、早餐谷类、奶酪制品、坚果 和基于坚果的制品、明胶(gelatin)、布丁、填料(filling)、冷冻的奶制品、乳 制品、奶制品类似物、软糖(soft candy)、汤和汤混合料、快餐、加工的水果 汁、加工的蔬菜汁、脂肪和油、鱼制品、植物蛋白制品、禽制品和肉制品。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗或预防患有痴呆或面临患上痴 呆危险的个体的痴呆的药物组合物，所述药物组合物包括一定量的至少一 种ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其前体或来源及至少一种额外 的治疗化合物，。在优选的实施方案中，PUFA包括DHA、DPAn-6或DPAn-6 和DHA的组合，所述PUFA具有至少30％或更多的DPAn-6和DHA组合。 在另一个优选的实施方案中，PUFA包括DPAn-6、ARA和DHA的组合， 所述PUFA具有至少30％或更多的DPAn-6、ARA和DHA组合。在另一个 优选的实施方案中，PUFA包括ARA和DHA的组合，所述PUFA具有至少 30％或更多的ARA和DHA的组合。
适于与本发明一起使用的治疗化合物包括可用于保护个体免受本申请 所论病症或疾病中任意一种的任意治疗化合物，这些治疗化合物可包括蛋 白质、氨基酸、药物、其它天然产物和碳水化合物。就所治疗的具体疾病 或病症而言，对于本领域技术人员，这些治疗化合物是众所周知的。可包 括在本发明组合物或制剂中的一些优选的治疗化合物包括但不局限于：他 克林(COGNEX)、多奈哌齐(ARICEPT)、利伐斯的明(EXELON)、加兰他敏 (REMINYL)、美金刚胺(AKATINOL)、神经妥乐平、促智药、α-生育酚(维 生素E)、司来吉兰(ELDEPRYL)、非甾体抗炎药(NSAIDS)、银杏内酯、雌 激素、β-分泌酶抑制剂、使脑中斑块溶解的疫苗(包括脂质疫苗和基于脂质 体的疫苗)、复合维生素B、钙通道阻滞剂、HMG CoA还原酶抑制剂、他汀 类、甘蔗脂肪醇、贝特类、氯碘羟喹和其它天然产物(例如姜黄素、木脂素、 植物雌激素、植物甾醇、烟酸和维生素补剂)。
给药剂量和途径在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可确定给 药剂量和途径。
本发明也包括制备上述本发明组合物中任意一种的方法，所述组合物 例如通过以下方法来制备：使用在本领域中已知的任意合适的方法，使组 合物的组分复合到任意合适的递送形式中。
根据本发明，本发明的方法适于对以下个体使用：脊椎动物纲哺乳类 的成员，包括但不局限于灵长类、家畜类和驯养的宠物(例如伴侣动物 (companion animal))。最典型地，个体可以是人类个体。术语“个体”可与术 语“受试对象”或“患者”交换，并且指代本发明方案或方法的受试对象。因此， 个体可包括健康正常的(非疾病的)个体及患有本申请所述前痴呆或痴呆或 其症状或指标或面临患上所述疾病危险的个体。
出于解释的目的，提供以下实施例，这些实施例不是意在限制本发明 的范围。
实施例
在下述实施例中，使用以下材料和方法。
3XTg-AD小鼠的产生
在Oddo，“Triple-transgenic Model of Alzheimer’s Disease with Plaques and Tangles：Intracellular Aβand Synaptic Dysfunction”，Neuron，Vol.39， 409-21(2003)中，描述了3XTg-AD小鼠的产生。简要地，将包含Swedish 双突变(KM670/671NL)的人APP(695同工型)cDNA亚克隆到Thy1.2表达盒 的外显子3中。将包含P30IL突变的没有氨基末端插入(4R0N)的人四重复τ 蛋白也亚克隆到Thy1.2表达盒中。在限制酶切消化以释放转基因之后，每 个片段都通过蔗糖梯度分级来纯化，接下来在注射缓冲液(10mM Tris[pH 7.5]，0.25mM EDTA)中透析过夜。将等摩尔量的每种构建体共同微注射到单 细胞胚的原核中，所述单细胞胚从纯合PS1M146V敲入小鼠获得(Guo et al.， Arch.Pathol.Lab.Med.125，489-492(2001))。PS1敲入小鼠作为杂合体 129/C57BL6背景而被初始产生。如先前所描述(Sugarman et al.Natl.Acad. Sci 99，6334-6339(2002))，通过对尾DNA进行Southern印迹分析，确定了 转基因小鼠。使建立者小鼠(founder mouse)与亲本PS1敲入小鼠回交。
饮食
在这些实施例中描述的所有小鼠都在3月龄时开始接受实验饮食，在 6、9或12月龄时结束实验。饮食配方为包含5％总脂肪的AIN-76啮齿类动 物饮食。在表1中，描述了每种饮食的额定脂肪酸组合物，所述组合物通 过以下方法来得到：如表2所列，混合蔬菜和微型藻类油的组合。因为初 期以盲方式进行研究，所以如以下那样，用颜色对饮食进行编号：蓝色饮 食(玉米/大豆)、黄色饮食(DHASCO，也称为补充有DHA的饮食或富含 DHA的饮食)、绿色饮食(DHATM-S，也称为补充有DHA和DPAn-6的饮食 或富含DHA和DPAn-6的饮食)和红色饮食(DHASCO/ARASCO，也称为 补充有DHA和ARA的饮食或富含DHA和ARA的饮食)，在一些表和附图 中涉及了这种编号方式。可将包含DHASCO、DHATM-S或 DHASCO/ARASCO的饮食总称为包含微型藻类油的饮食。
DHASCO为源于对隐甲藻的包含大量二十二碳六烯酸(DHA)的油， DHASCO更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸(按占总脂肪酸的百分 比计)：肉豆蔻酸(14:0)10-20％、棕榈酸(16:0)10-20％、棕榈油酸(16:1)0-2％、 硬脂酸(18:0)0-2％、油酸(18:1)10-30％、亚油酸(18:2)0-5％、花生酸(20:0)0-1％、 山嵛酸(22:0)0-1％、二十二碳五烯酸(22:5)0-1％、二十二碳六烯酸 (22:6)(DHA)40-45％、神经酸(24:1)0-2％和其它0-3％。
DHATM-S(先前也称为DHASCO-S)为源于破囊壶菌、裂殖壶菌属种的 油，其包含大量的DHA，也包含二十二碳五烯酸(n-6)(DPAn-6)，DHATM-S 更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸(按占总脂肪酸的百分比计)：肉豆 蔻酸(14:0)8.71％、棕榈酸(16:0)22.15％、硬脂酸(18:0)0.66％、亚油酸 (18:2)0.46％、花生四烯酸(20:4)0.52％、二十碳五烯酸(20:5，n-3)1.36％、二十 二碳五烯酸(22:5，n-6)(DPAn-6)16.28％、二十二碳六烯酸(DHA)(22:6， n-3)41.14％和其它8％。
ARASCO为源于Mortierella alpina的油，其包含大量的花生四烯酸 (ARA)，ARASCO更具体地包含以下示范性大概量的脂肪酸：肉豆蔻酸 (14:0)0-2％、棕榈酸(16:0)3-15％、棕桐油酸(16:1)0-2％、硬脂酸(18:0)5-20％、 油酸(18:1)5-38％、亚油酸(18:2)4-15％、亚麻酸(18:3)1-5％、花生酸(20:0)0-1％、 二十碳三烯酸(20:3)1-5％、花生四烯酸(20:4)(ARA)38-44％、山嵛酸 (22:0)0-3％、二十二碳五烯酸(22:5)0-3％和木蜡酸(24:0)0-3％。
表1
小鼠饮食的n-3和n-6脂肪酸含量
表2
用于实验饮食的油混合物的组合物
所有饮食都包含50g脂肪/100g食物。和n-6与n-3脂肪酸的比例为约 10∶1的对照饮食比较，每种包含DHA的饮食都具有1.3g DHA/100g食物， 并且n-6与n-3脂肪酸的比例为约1∶1。在所有饮食中，饱和脂肪酸、单不 饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的百分比是相等的。在所有饮食中，总蛋白 质(20％)和碳水化合物(66％)及总能量(3.9千卡/克)的量也是相等的。
ELISAs和免疫印迹
基本上如先前所描述，进行AβELISAs(Suzuki et al.，Science 264， 1336-1340(1994))。对于免疫印迹，在2％SDS的H2O溶液(包含0.7mg/ml胃 酶抑素A，补充有完整的微小蛋白酶抑制剂片(Mini Protease inhibitor tablet)(Roche 1836153))中，以Dounce匀浆方式，对源于转基因小鼠和对照 小鼠的脑进行匀浆。匀浆混合物接受简短的声处理，以切断DNA，然后在 4℃，以100,000×g离心1小时。将上清液用于免疫印迹分析。蛋白质在还 原条件下，用SDS/PAGE(10％Bis-Tris，得自Invitrogen)溶解，然后转移到 硝化纤维素膜。在20℃，将膜在脱脂乳(nonfat milk)的5％溶液中孵育1小 时。在4℃，与第一抗体一起孵育过夜，之后将印迹在Tween-TBS中洗涤 20分钟，然后在20℃，与第二抗体一起孵育。将印迹在T-TBS中洗涤20 分钟，然后在20℃，与第二抗体一起孵育。将印迹在T-TBS中洗涤20分钟， 然后与Super Signal(Pierce)一起孵育5分钟。
生化标志
Aβ测量：得到了DHA对各种Aβ的作用的定量数据(例如Aβ40与 Aβ42，可溶性Aβ与不溶性Aβ)(Oddo et al.，2003)。从用DHA处理的小鼠的 脑组织，提取蛋白质，将所述蛋白质用于制备可溶性和不溶性蛋白质提取 物，通过夹心ELISA来进行分析。将Western印迹用于测量APP全蛋白、 C99/C83片段和sAPPα的稳态水平，以确定DHA对这些生物标志的作用。
τ蛋白超磷酸化：因为3xTg-AD小鼠随年龄增长而在皮质和海马中积 聚嗜银性和丝状τ免疫反应性神经元包含物(Oddo et al.，2003)，所以测量 DHA对τ蛋白超磷酸化的作用，作为功能性生物标志。这通过定量性Western 印迹用特异性识别超磷酸化τ蛋白的抗体(例如AT8、AT100或PHF1)来完 成。
将脑解剖成皮质、海马和小脑。
免疫组织化学
为了评价总斑块和缠结及小胶质细胞激活，以5μm对福尔马林固定的 包含石蜡(parafiin)的脑进行切片，将其固定在涂有硅烷的载玻片上，如所描 述的那样进行处理。使用各种Aβ形式(1-40、1-42和低聚物)和τ蛋白磷酸 化形式的各种抗体，观察斑块和缠结在脑中的位置和严重度。另外，使用 抗体，例如CD45，以就小胶质细胞激活进行染色，用于确定斑块和缠结是 否仍然触发免疫应答。使用以下抗体：抗Aβ6E10和4G8(Signet Laboratories， Dedham，MA)、抗Aβ1560(Chemicon)、A11(Kayed et al，2003)、抗APP 22C11(Chemicon)、抗τHT7、AT8、AT 180(Innogenetics)、τC 17(Santa Cruz)、 τ5(Calbiochem)、抗GFAP(Dako)和抗肌动蛋白(Sigma)。对于GFAP，以1∶3000 的稀释度应用第一抗体；对于6E10，稀释度为1∶1000；对于1560、AT8、 AT180和τ5，稀释度为1∶500；对于HT7，稀释度为1∶200。
脑总脂质提取
在分析之前，将脑保存在-80℃。将脑冷冻干燥，然后在4ml的2∶1(v/v) 氯仿∶甲醇(含有0.5％BHT，作为抗氧化剂)中，提取脂质。对混合物进行声 处理，历时10分钟，然后离心，以使固体沉淀出来。
脂肪酸分析
总脑脂质分析
对1.2mg的脑脂质提取物进行脑总脂肪酸分析。在100℃，用14％BF3/ 甲醇，将脑总脂质转化成脂肪酸甲酯(FAME)，历时30分钟(Morrison，W.R. and Smith，L.M.(1964)JLipid Res.5：600-8)。在皂化之前，添加丁羟甲苯，并 且在整个过程中，所有样品都用N2清洁，以使氧化作用最小化。在进行 FAME分析之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品，作为内标。
脑磷脂分析
使用Gilfillan等人的方法(Gilfillan et al(1983)，JLipid Res.24：1651-1656) 来分离脑磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在100℃ 烘箱中，将0.25mm厚的20×20cm K硅胶板(Whatman，Clifton，NJ)活化60 分钟。将总脑提取物的样品(0.6mg)点样于板上，在TLC展开缸中，使用氯 仿∶甲醇∶石油醚∶乙酸∶硼酸40∶20∶30∶10∶1.8(v/v/v/v/w)来展开。将板展开至距 板顶部1cm处。用醋酸铜喷射板，以使条带显现。将PC、PS和PE条带刮 到测试试管中，在100℃，用14％BF3/甲醇，将脂质转化成脂肪酸甲酯 (FAME)，历时30分钟(Morrison and Smith，1964，supra)。在皂化之前，添加 丁羟甲苯，并且在整个过程中，所有样品都用N2清洁，以使氧化作用最小 化。在进行FAME分析之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品， 作为内标。
红细胞分析
使用Bligh和Dyer的方法(Bligh，E.G.and Dyer，W.J.(1959)，Can.J. Biochem.Physiol.37：911)，从400μl浓集的红细胞(red blood cells，RBCs)提取 总脂质。在提取之前，将二十三碳游离脂肪酸(23:0)加至每个样品，作为内 标。RBC脂质用0.5N氢氧化钠的甲醇溶液进行皂化，然后在100℃，用14％ BF3/甲醇，将脂肪酸转化成甲酯，历时30分钟(Morrison and Smith，1964， supra)。在皂化之前，添加丁羟甲苯，并且在整个过程中，所有样品都用 N2清洁，以使氧化作用最小化。
气相色谱分析
通过GLC，使用配备有火焰离子化检测器的Hewlett Packard 6890，对 脂肪酸甲酯(FAMEs)进行分析。在30米长的FAMEWAX毛细管色谱柱 (Restek，Bellefonte，PA，直径为0.25mm，涂层厚度为0.25mm)上，使用氦 气来分离脂肪酸甲酯，流速为2.1mL/min，分流比为48∶1和20∶1。色谱运 行参数包括：柱温箱开始温度为130℃，其以6℃/min的速率升高至225℃， 在225℃保持20分钟，之后以15℃/min的速率升高至250℃，最后保持5 分钟。进样器温度和检测器温度分别恒定在220℃和230℃。峰通过以下方 法来确定：将保留时间与得自NuCheck Prep(Elysian，MN，U.S.A)的外部脂肪 酸甲酯标准混合物进行比较。将脂肪酸分布表示成占脂肪酸总毫克数的百 分比(重量百分比)。
实施例1
下面的实施例所描述的是，对饮食性多不饱和脂肪酸(PUFAs)、二十二 碳六烯酸(DHA，22:6 n-3)、二十二碳五烯酸(DPAn-6，22:5 n-6)或花生四烯 酸(ARA，20:4 n-6)调节阿尔茨海默病新三元转基因小鼠模型(3xTg-AD)出现 疾病病理生理症状或调节其严重度的潜能进行评价。
各组的纯合3x-Tg-AD小鼠用四种饮食之一饲喂，如以上在材料和方法 中所描述(参见表1和2)，这四种饮食包含DHA、DHA和DPAn-6、DHA 和ARA或缺乏这些PUFAs的饮食(对照)。如以上所讨论(参见在材料和方法 中对饮食的讨论)，三种实验饮食包含类似量的DHA和作为n-6来源的亚油 酸、DPAn-6或ARA。在几个处理时间点之后，通过观察这些小鼠的病理发 展，来评价对照饮食和补充有PUFA的饮食的治疗益处。
具体地，3xTg-AD小鼠在3月龄时开始用在表1和2中所显示的规定 饮食饲喂，持续至12月龄。在不知道饮食中所含实验化合物水平的情况下， 每种饮食都包含参考标识，并且用颜色编号。在整个研究过程中，将贮存 的饮食保持在0℃。选择在动物3个月大时开始实验，以便当用实验饮食处 理时，在出现Aβ和τ蛋白神经病理之前，不会干扰小鼠的正常生长和发育。 在6月龄、9月龄或12月龄时，终止治疗，然后对脑和血液进行各种神经 病理评价，包括总APP、淀粉状蛋白β肽、斑块数量、斑块尺寸和APP裂 解酶的水平(α和β分泌酶、早老素-1)。也测量了脑和血液总脂肪酸和脑磷 脂。
在每个时间点，对源于至少6只小鼠的脑和脑脊液(CSF)进行完整的神 经病理学和免疫组织化学分析，以提供有效的统计学分析。收集血液，将 其处理成红细胞沉淀和血清，然后贮存在-80℃。源于每个饮食组的另外六 只小鼠被处死，将血液和脑切片冷藏运输，用于其它分析。在3个时间点， 即当小鼠为6月龄、9月龄或12月龄时，评价神经病理学和免疫组织化学。
表3显示在饲喂上述含PUF饮食3个月、6个月和9个月之后的平均 体重。
表3
如在表3中所显示，在处理了3个月、6个月或9个月时，雄性和雌性 小鼠的平均体重在各种饮食中没有出现不同。在研究过程中，各种饮食的 小鼠不断生长，并且保持健康。
脂肪酸分析结果
图1A-C显示四个饮食处理组在3个月(图1A，n＝6)、6个月(图1B， n＝6)或9个月(图1C，n＝6)饮食处理之后的全脑匀浆脂肪酸分布(将值表示成 占总脑脂肪酸的百分比)。图2A-2C显示四个饮食处理组在3个月(图2A)、 6个月(图2B)或9个月(图2C)之后的红细胞匀浆脂肪酸分布(将值表示成占 总红细胞脂肪酸的百分比)。图3A-3C显示四个饮食处理组在3个月(图3A)、 6个月(图3B)或9个月(图3C)之后的脑磷脂酰胆碱(PC)分布(将值表示成占 总脑PC脂肪酸的百分比)。图4A-4C显示四个饮食处理组在3个月(图4A)、 6个月(图4B)或9个月(图4C)之后的脑磷脂酰乙醇胺(PE)分布(将值表示成 占总脑PE脂肪酸的百分比)。图5A-5C显示四个饮食处理组在3个月(图 5A)、6个月(图5B)或9个月(图5C)之后的脑磷脂酰丝氨酸(PS)分布(将值表 示成占总脑PS脂肪酸的百分比)。在图1-5中的每幅中，将四种饮食显示为 对照(蓝色)、DHA(黄色)、DHA/DPA(绿色)和DHA/ARA(红色)。在图1-5中 的每幅中，DMA＝二甲基乙缩醛、ARA＝花生四烯酸(n-6)、DHA＝二十二碳 六烯酸(n-3)、EPA＝二十碳五烯酸(n-3)、LA＝亚油酸(n-6)、ALA＝α-亚麻酸 (n-3)、DPAn-6＝二十二碳五烯酸(n-6)、DPA n-3＝二十二碳五烯酸(n-3)和肾上 腺酸＝肾上腺酸(n-6)。
结果显示，由于富含PUFA的饮食，在6个月(3个月的饮食处理)、9 个月(6个月的饮食处理)和12个月(9个月的饮食处理)大的小鼠中，红细胞 (RBC)脂肪酸和脑脂肪酸出现变化(图1A-C和2A-C)。就所有补充有PUFA 的饮食而言，在各个时间点，RBC 22:6 n-3(DHA)重量百分比水平都比对照 水平的两倍还多。在所有补充有PUFA的饮食中，总脑22:6 n-3(DHA)水平 也增加1至3个重量百分点，但不如在RBCs中的大。就RBCs总脂质和脑 总脂质中22:6 n-3(DHA)重量百分比水平而言，用DHA(黄色)饮食饲喂的小 鼠出现最大的变化。在脑总脂质和RBC总脂质中，按脂肪酸的重量百分比 水平计，22:6 n-3(DHA)和20:4 n-6(ARA)是最大量的长链PUFAs。在脑和 RBCs中，20:5 n-3(EPA)水平是低的，通常，在脑中，22:6 n-3(DHA)重量百 分比水平比20:5 n-3(EPA)高约十五倍，在RBCs中，高约五倍。
就所有三种富含PUFA的饮食而言，与对照饮食(n-6与n-3的比例为 10∶1)比较，当DHA水平升高时，总脑脂质20:4 n-6(ARA)随之减少。在整 个补充时段内，既保持了DHA脑脂肪酸水平，也保持了ARA脑脂肪酸水 平。在RBCs中，与对照组比较，在所有时间点，DHA(黄色)饮食都使RBC 20:4 n-6(ARA)水平大幅降低了11.75个重量百分点。如所期望的那样，红色 饮食(补充有DHA和ARA)的小鼠具有最接近对照小鼠的20:4 n-6(ARA)RBC水平。
就DHA和DPAn-6(绿色)饮食而言，在所有时间点，RBCs脂质和总脑 脂质中22:5 n-6(DPAn-6)水平都比对照水平的两倍还多。在用DHA(黄色)饮 食或DHA和ARA(红色)饮食饲喂的小鼠中，脑22:5 n-6(DPA)水平和RBC 22:5 n-6(DPA)水平是非常低的，或是不能检测到的。在脑脂质和RBC脂质 中，存在极少的18:3 n-3(ALA)，对于这种长链PUFAs前体，在任一组织类 型中，都观察到非常小的脂肪酸变化。在RBCs中，18:2 n-6(LA)水平比脑 高约十五倍。就各种富含PUFA的饮食而言，在所有时间点，RBC 18:2 n-6(LA) 重量百分比水平都比对照低。这些变化反映所给予的饮食的脂肪酸组分。 在各种补充有PUFA的饮食中，甚至在这些饮食不含有可测量量的20:5 n-3(EPA)的情况下，RBC 20:5 n-3(EPA)重量百分比水平都比对照水平高。这 可表明，在血细胞中，22:6 n-3(DHA)逆向转化成20:5 n-3(EPA)。就各种补 充有PUFA的饮食而言，在整个时段内，在脑脂质中没有检测到任何可测 量量的20:5 n-3(EPA)。
在用富含PUFA的饮食饲喂的6个月(3个月的饮食处理)、9个月(6个 月的饮食处理)和12个月(9个月的饮食处理)大的小鼠中，PS、PE和PC脑 磷脂脂肪酸也发生了变化(参见图3A-3C、4A-4C和5A-5C)。按重量百分比 计，与PC(图3)部分比较，22:6 n-3(DHA)在PS(图5)部分和PE(图4)部分中 是更大量的，5倍于PC(图3)部分，并且20:4 n-6(ARA)在PE部分中是最大 量的。在脑磷脂中，20:5 n-3(EPA)水平、18:2 n-6(LA)水平和18:3 n-3(ALA) 水平是非常低的。对于所有三种磷脂，在脑磷脂22:6 n-3(DHA)重量百分比 方面，相对于对照，DHA(黄色)饮食导致最大的提高。在所有三种脑磷脂中， 与对照比较，DHA(黄色)饮食的20:4 n-6(ARA)水平出现相应的降低。如在 RBCs脂质和总脑脂质中观察到的那样，在用富含DHA和DPAn-6(绿色)的 饮食饲喂的小鼠中，各种脑磷脂部分中22:5 n-6(DPA)重量百分比水平都提 高最大。
总之，在RBC脂肪酸水平和脑脂肪酸水平方面，反映了饮食中n-6脂 肪酸组分与n-3脂肪酸组分的比例。就RBC水平和脑水平而言，在饮食中 增加22:6 n-3(DHA)含量，导致DHA水平的显著提高。在饮食中22:6 n-3(DHA)水平提高的情况下，n-6脂肪酸随之减少。当将其它脂肪酸(即DPA 和ARA)加至饮食时，其在组织中相应的脂肪酸水平也提高。总之，在整个 补充时段内，对于每种饮食，都很好地保持了脑脂肪酸水平。
生化标志分析
图6A-6J显示在3个月、6个月和9个月饮食处理之后，饮食对6个月 大3X-TG-AD小鼠的淀粉状蛋白-β(Aβ)水平的作用。如以上所描述，动物接 受以上在表1中所显示的四种饮食之一。用对Aβ1-40和Aβ1-42及总淀粉 状蛋白特异性的抗体，测量脑蛋白质提取物中的总可溶性Aβ肽(图6A、6C 和6E)和总不溶性Aβ肽(图6B、6D和6F)。如在图6A中所显示，在饲喂3 个月之后，与用玉米-大豆油饲喂的动物比较，用包含微型藻类DHA的饮 食(黄色、绿色和红色饮食)饲喂的动物具有更低水平的可溶性淀粉状蛋白β 肽。在用饮食补剂饲喂了6个月(图6C)时，与对照动物相比，用包含DHA(黄 色)或DHA和DPAn-6(绿色)的饮食饲喂的动物仍然具有水平显著更低的淀 粉状蛋白β肽，但在用包含DHA和ARA(红色)的饮食饲喂的动物中，淀粉 状蛋白β肽的水平不再与对照有显著不同。在饲喂了9个月(图6E)时，当 与对照进行比较时，只有用包含DHA(黄色)的饮食饲喂的动物具有显著减 少的Aβ。在包含玉米/大豆油的饮食和包含微型藻类油的饮食之间，就不溶 性淀粉状蛋白的总水平而言，没有观察到任何差异。图6G-6J显示动物颅切 片中细胞内总淀粉状蛋白的相对强度，所述动物用玉米/大豆(蓝色组)、 DHASCO(黄色组)、DHATM-S(绿色组)和DHASCO/ARASCO(红色组)饲 喂。在饲喂了3个月之后，与用包含DHASCO或DHATM-S的饮食饲喂的 动物相比，用玉米-大豆和DHASCO/ARASCO饮食饲喂的动物包含相对更 多的总细胞内淀粉状蛋白。
图7A和7B显示在处理了3个月之后，饮食对6个月大3x-TG AD小 鼠的APP加工的作用。用包含玉米-大豆油的饮食饲喂动物，或用包含微型 藻类油的饮食饲喂动物，在这两类动物之间，APP的总水平、C83的总水 平和C99的总水平没有显著的差异。
图7C和7D显示在处理了3个月之后，饮食对Aβ肽清除酶(胰岛素降 解酶，IDE)的作用。在用包含玉米/大豆油或各种微型藻类油的饮食饲喂的 动物中，就IDE水平而言，没有观察到任何在统计学上显著的差异。
图8A和8B显示在3个月实验饮食处理之后，饮食对6个月大3X-TG 动物的APP分泌酶的作用。在用包含玉米-大豆油或微型藻类油的饮食饲喂 的动物中，就β-分泌酶(BACE)或ADAM 10而言，没有任何显著的差异是 显而易见的。
图8C和8D显示，当与用玉米-大豆饮食饲喂的动物进行比较时，用包 含微型藻类油的饮食饲喂的动物具有显著降低的酶水平，即显著降低的早 老素1水平，但呆蛋白水平没有显著降低。
图8E显示，DHA使SHSY5Y细胞中的早老素1mRNA显著减少(*，p＜ 0.05)。
图9A-9F显示在3个月、6个月和9个月饮食处理之后，饮食对总τ 蛋白水平的作用。如在图9A和9B中所显示，与包含玉米-大豆油的饮食比 较，包含微型藻类油(其包含DHA)的饮食(黄色、绿色和红色饮食)使总τ蛋 白水平显著降低。在饲喂了6个月之后，与包含玉米-大豆油的饮食比较， 用包含DHA作为主要PUFA(黄色)的饮食或包含DHA和DPAn-6(绿色)的饮 食饲喂的动物保持显著更低的总τ蛋白水平，但当与对照进行比较时，用包 含DHA和ARA组合(红色)的饮食饲喂的动物不具有显著不同的总τ蛋白水 平。在饲喂了9个月之后，当与对照进行比较时，只有用包含DHA作为主 要PUFA(黄色)的饮食饲喂的动物具有显著降低的总τ蛋白水平。
图10A-10D显示，在饲喂了3个月之后，与其它3种饮食比较，DHA 和DPAn-6(绿色)饮食使构象发生变化的τ蛋白的表达显著减少。
如在图10E和10F中所显示，在9个月饮食处理之后，当与用包含玉 米-大豆油的饮食饲喂的动物进行比较时，在用包含DHA作为主要PUFA(黄 色)的饮食或包含DHA和DPAn-6(绿色)的饮食饲喂的动物中，磷酸化τ蛋 白显著减少。当与对照进行比较时，用包含DHA和ARA组合(红色)的饮食 饲喂的动物不具有显著不同的磷酸化τ蛋白水平。
本申请所引用的每份参考文献和出版物都作为参考文献全文引入本申 请。美国临时申请60/697,911和美国临时申请60/779,145所披露的全部内 容作为参考文献引入本申请。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但显而易见的是，对于本 领域技术人员，可对这些实施方案进行修改和调整。然而，应该明确理解 的是，如在权利要求书中所阐述，这些修改和调整在本发明的范围内。
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