白蛋白结合分子及其应用
阅读：133发布：2021-02-21
专利汇可以提供白蛋白结合分子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及方便的 白蛋白 结合剂，其有效用于提高 诊断剂 或 治疗 剂的药物代谢动 力 学特性，特别是增加所述 试剂 的血液循环时间和/或组织渗透能力。本发明的分子包括式(1)表示的化合物。，下面是白蛋白结合分子及其应用专利的具体信息内容。
1.由式1表示的化合物：
(式1)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链、或环状烃基基团，所述E任选 地被至多2个杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链，非支链或环状 C1-C10烃基基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10， CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，所述环状结构包含支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中 所述烃基任选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br， I，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O， ＝S和＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其盐。
2.由式2表示的缀合物：
(式2)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链或环状烃基，所述E任选地被至 多2个杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10 烃基基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10， SR9，＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，所述环状结构包含支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中 所述烃基任选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br， I，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O， ＝S和＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y’是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团的残基；
Z包含治疗剂或诊断剂分子的残基以及任选地接头；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其药用盐。
3.权利要求1的化合物或权利要求2的缀合物，其中E包含由式3 表示的部分：
(式3)
其中R3-R8独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起，R5和R6一起，或R7和R8一起任选地独立选 自下组：＝O，＝S和＝NH。
4.权利要求1的化合物或权利要求2的缀合物，其中E包含由式4 表示的部分：
(式4)
其中R3和R4独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起任选地独立选自下组：＝O，＝S和＝NH。
5.权利要求1、3或4的化合物或权利要求2-4的缀合物，其中B包 含氨基酸残基。
6.权利要求1，或3-5的化合物或权利要求2-5的缀合物，其中B可 通过酶裂解。
7.权利要求1，或3-6的化合物或权利要求2-6的缀合物，其中D选 自下组：OPO3H，PO3H，OSO3H，SO3H和COOH，或它们的共轭碱。
8.权利要求1，或3-7的化合物或权利要求2-7的缀合物，其中所述 烃基独立地选自下组：烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基。
9.权利要求1，或3-8的化合物或权利要求2-8的缀合物，其中R1和 R2独立地选自下组：I，CH3，Br和H。
10.权利要求1，或3-9的化合物或权利要求2-9的缀合物，其中R1 位于对位，并且选自下组：I，Br和CH3，且R2是H。
11.权利要求1，或3-10的化合物或权利要求2-10的缀合物，其中R3 -R8是H。
12.权利要求1，或3-11的化合物或权利要求2-11的缀合物，其中R9 和R10是H。
13.权利要求1，或3-12的化合物，其中Y选自下组：-NH2，-SH，-OH， -CHO，-NCS，-NCO和H。
14.权利要求1，或3-13的化合物，其中B-D包含由式5表示的部分：
(式5)
15.权利要求1，或3-14的化合物，其中B-D包含由式6表示的部分：
(式6)
16.权利要求1、10或13的化合物，其由式7表示：
(式7)
17.权利要求1、10或13的化合物，其由式8表示：
(式8)
18.权利要求1或3-17的化合物，其中Y是-NH2。
19.权利要求2-12的缀合物，其中Y′选自下组：-NH-，-S-，-O-，-CO-， -NHCS-，-NHCO-和键。
20.权利要求2-12或19的缀合物，其中B包含选自下组的残基： 3-[2-(aminyl乙基)二硫代]丙酰，N-[α-马来酰亚胺-3’-基-乙酰基，N，N’-1，4- 双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-丁烷，N，N’-1，6-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷， N，N’-1，2-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-乙烷，N，N’-1，4-双-马来酰亚胺-3’，3”- 二基-2，3-二羟基丁烷，N-[β-马来酰亚胺-3’-基-丙酰，N-[β-马来酰亚胺-3’-基 -脲氨基(semicarbazyl)，N，N’-1，8-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-三甘醇， N，N’-1，11-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-四甘醇，环庚基，二甲基己二酰亚胺 基，二甲基庚二酰亚胺基(pimelimidyl)，二甲基环庚二亚胺基(suberimidyl)， 1，4-二-[3′-(2′-含硫基)-丙酰胺基]丁烷，戊二酰基，二硫代二丙酰基，酒石 酸基(tartaryl)，二甲基3，3′-二硫代二丙酰亚胺基，3，4-二硫代-N，N’-1，6-双- 马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷，乙二醇双-琥珀酰，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己 酰基，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己酰基脲氨基，N-[γ-马来酰亚胺-3’-基-丁酰基， 1，6-己烷-二-乙烯砜，N-[κ-马来酰亚胺-3’-基-十一酰，N-[κ-马来酰亚胺-3’- 基-十一酰脲氨基，4-[N-马来酰亚胺-3’基-甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己 酰基]，6-[3-巯基-]丙酰胺基己酰，间-[马来酰亚胺-3-基]-苯甲酰，4-(4-N-马 来酰亚胺-3’-基苯基)丁酰脲氨基，己二酰，3-巯基-丙酰脲氨基，N-[对-马来 酰亚胺-3-基苯基]脲基，2-巯基乙酰基，3-巯基丙酰，3-[溴乙酰氨基]丙酰，2- 碘乙酰基，4-[碘乙酰基]氨基苯甲酰，4-[N-马来酰亚胺-3’-基甲基]环己烷 -1-羧基，4-[对-马来酰亚胺-3’-基]丁酰，6-[β-马来酰亚胺-3-基-丙酰氨基]己 酰基，和对-[2-巯基乙基]苯甲酰，和4-硫代丁二酰亚胺酰胺基。
21.权利要求2-12，19或20的缀合物，其中B-D包含由式9表示的部 分：
(式9)
22.权利要求2-12，或19-21的缀合物，其中B-D包含由式10表示的 部分：
(式10)
23.权利要求2、10或19的缀合物，其包含由式11表示的部分：
(式11)
24.权利要求2、10、或19的缀合物，其包含由式12表示的部分：
(式12)
25.权利要求2-12或19-24的缀合物，其中Y′是-NH-。
26.权利要求2-12或19-25的缀合物，其中所述治疗剂或诊断剂是有 机化合物、金属有机化合物、包含放射性核素的化合物、核苷酸、核酸、 聚合物、肽、核肽(nucleopeptide)、蛋白、抗体、脂质、类固醇、或它们 任一项的衍生物或它们的组合。
27.权利要求2-12或19-26的缀合物，其中所述治疗剂分子是用于治 疗下列各项的药物：癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其 他感染，炎症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，激素 病症，葡萄糖代谢病症或糖尿病，或是用于避孕的药物。
28.权利要求2-12或19-27的缀合物，其中所述治疗剂分子是用于治 疗特征在于快速摄取白蛋白的肿瘤的药物。
29.权利要求2-12或19-28的缀合物，其中所述治疗剂分子是用于治 疗具有小于60天的倍增时间的肿瘤的药物。
30.权利要求2-12或19-29的缀合物，其中所述治疗剂分子是用于治 疗下列各项的药物：结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、胰 腺癌、胃癌、或卵巢癌、或淋巴瘤、白血病、星形细胞瘤、或肝细胞癌。
31.权利要求2-12或19-26的缀合物，其中所述诊断剂分子是用于诊 断影像学技术、基于荧光的技术、血管造影术、荧光血管造影术、超声波 检查法、基于磁共振的诊断方法、磁共振成像、X-射线成像、核医学、单 光子发射计算机化断层显象(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)的试剂。
32.权利要求2-12或19-26或31的缀合物，其中所述诊断剂分子是 用于眼科血管造影术的荧光团或用于X-射线或磁共振成像的造影剂。
33.权利要求2-12或19-26、31或32的缀合物，其中所述诊断剂分 子包括荧光素或钆(III)-二乙基三胺五乙酸(Gd-DTPA)、或其残基。
34.一种药物组合物，其包含权利要求2-12或19-33任一项所述的缀 合物。
35.权利要求2-12或19-33的缀合物，其用作药物。
36.权利要求2-12或19-33的缀合物用于制备药物的应用，所述药物 用于治疗癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染，炎 症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，激素病症，或用 于避孕。
37.权利要求1或3-18的化合物的应用，其用于使治疗剂或诊断剂分 子与白蛋白结合。
38.权利要求1或3-18的化合物的应用，其用于增加治疗剂或诊断剂 分子的血液循环时间。
39.权利要求1或3-18的化合物的应用，其用于增加治疗剂或诊断剂 分子在血管空间内的停留时间。
40.权利要求1或3-18的化合物的应用，其用于提高治疗剂或诊断剂 分子的组织渗透能力。
41.治疗疾病或病症的方法，其包括给需要所述治疗的患者施用有效 剂量的权利要求2-12或19-26的缀合物。
42.权利要求41的方法，其中所述疾病或病症包括癌症，心血管疾病， 肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染，炎症，神经病症，变性神经病症， 精神病或病症，抑郁症和激素病症。
43.权利要求1或3-18的化合物或权利要求2-33或35的缀合物用于 医学成像目的的应用。
技术领域
本发明涉及方便的白蛋白结合剂，其有效用于提高诊断剂或治疗剂的 药物代谢动力学特性，特别是增加所述试剂的血液循环时间和/或组织渗透 能力。
发明背景
药物的药物代谢动力学特性是药物在人体内发挥药物作用的主要决 定因素。在大部分情形中，药物需要在生物体内停留足够久，在适当的体 室(body compartments)内产生足够高的浓度以足以展示理想的药理学功 能(例如，药物与其受体的结合)。
在许多情形中，小药物的理想的药物代谢动力学特性是与白蛋白的特 定结合能力的结果，白蛋白是血液中最丰富的蛋白质，浓度约为600μM。 制药公司可以经验性地筛选它们的目的药物的适宜的白蛋白结合特性。然 而，该方法有有限的用途，原因在于在大部分情形中，分子的白蛋白结合 性质与负责理想的药理学作用的分子的部分密切相关。
尽管因此已知许多白蛋白结合分子，但是大部分已知的白蛋白结合剂 是不“方便的(portable)”，在这种意义上，在不丢失白蛋白结合或其它相 关的药学特性的条件下，它们不能容易地与其它生物活性部分偶联。溴酚 蓝和布洛芬，在生化和制药科学中的两种非常公知的分子，可以作为举例 说明该情形的实例。溴酚蓝是一种强白蛋白结合剂，其与白蛋白形成在通 过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时稳定的复合物。然而，溴酚蓝的相对 复杂的化学结构缺少适于使该分子与其它制药学目的分子(例如，小的有 机药物或蛋白药物)容易偶联的官能团。布洛芬，一种最广泛应用的抗炎 药，以微摩尔范围的解离常数与白蛋白结合。然而，当人们尝试修饰该分 子的羧酸基团时(例如，通过形成酰胺键)，以便使布洛芬与其它生物制 药目的部分偶联，布洛芬便失去其白蛋白-结合的亲和性。
不过，已经将白蛋白的长久的循环时间用于药物和白蛋白的直接缀 合。例如，在遗传水平上已将许多治疗多肽融合到白蛋白上(EPO、干扰 素、白介素、治疗肽)，并且已经在临床中研究了一些相应的融合蛋白[0]。
一个实例是将化疗剂直接偶联到人血清白蛋白表面上唯一的半胱氨 酸残基(Cys34)上。Kratz和同事已经利用抗癌化疗药多柔比星的伯氨基基 团或羰基基团进行该药物与人白蛋白的Cys34残基的位点-特异性偶联。 针对它们水解由此释放药理学活性多柔比星部分的能力选择用作多柔比 星和白蛋白之间的接头的化学部分[0]。作为一个代表性的实例， DOXO-EMCH的最大耐受剂量是未修饰的多柔比星的2-10倍高，并且在 荷瘤小鼠中，DOXO-EMCH可以以2-10倍于多柔比星摩尔当量的量注射， 与未缀合的多柔比星相比具有更低的毒性和更有效的治疗作用。关于预先 配制的多柔比星-HSA缀合物已经报道了相似的结果[3]。该蛋白衍生物目 前正处于临床研究中[4]。使用可以在体内关节炎部位通过基质金属蛋白酶 优先裂解的肽接头，同一小组以相似的方式将甲氨蝶呤化学偶联到白蛋白 上。相应的蛋白-药物缀合物可以视作药物前体，并且目前处于药物开发中。
然而，蛋白-药物缀合物的一个严重的常见缺点在于它们在人中可能是 免疫原性的[5]。因此，可能不考虑直接缀合作为寻找药物与白蛋白缔合并 且由此提高它们的药物特性的方式的问题的一般解决方案。一般的适用解 决方案将由方便的白蛋白结合分子提供，所述白蛋白结合分子即为一方面 具有针对白蛋白的选择亲和性且另一方面可以连接于任何目的药物上的 分子。
白蛋白的一种生理作用是作用为脂肪酸的载体。该特性已经用来使药 物与白蛋白缔合。例如，商业上公知的胰岛素衍生物特征在于通过与十四 烷酸(Levemir)形成酰胺而共价修饰胰岛素部分。这一长脂肪酸链赋予胰岛 素某些有利的性质，包括延长的血液清除，这在考虑白蛋白的脂肪酸-结合 特性时能够预测到。然而，该方法的缺点在于，它不易于适用于其它分子。 特别地，不适用于溶解性较低的蛋白或小的药物，原因在于所形成的衍生 物的不可接受的低水溶性。
近来，Genentech科学家已经报道二硫化物-限制的白蛋白-结合肽作为 方便的标记的发现和应用，其用于改变生物制药相关的蛋白(例如，抗体 片段)的药物代谢动力学性质，赋予它们在血液中长久的血液循环时间[6]。 最近，一些生物技术公司(例如，Domantis，Affibody)已经以相似的方式 通过基因融合开发了小球蛋白的突变体作为“方便的”白蛋白结合剂，以 赋予目的药物蛋白的缓慢血液清除特性[7-10]。然而，作为赋予白蛋白对 药物的亲和性的赋形剂，肽和蛋白不是理想的。肽和蛋白是可能通过消化 或变性而破坏的易变分子，并且因此特别难以口服施用。因此，通常这样 的药物必须通过注射施用，与口服途径相比，注射引起不便。
同样地，除了药物领域之外，对于控制和提高诊断剂如诊断显像剂和 造影剂的血液停留时间和组织分布也存在需要。荧光素是举例说明所述需 要的一个很好的实例。荧光素通常用在眼科学中用于荧光血管造影成像方 法，在美国和欧洲每年有超过一百万次注射。令人非常吃惊地，荧光素不 是经核准的药物试剂。在大部分情形中，在静脉内注射之前，医师必须制 备3-5ml荧光素钠水溶液(10％)。
荧光素非常快速地从血液中清除，并且因此必须以高剂量通过快速推 注(bolus injection)施用。然而，在这样高的剂量，荧光素在至多20％的患 者中引发恶心和呕吐，这取决于患者群体。在黑种人、亚洲人、华裔亚洲 人或混合种族来源的患者中，这些并发症更常见[0]。更严重的反应不常见， 但是包括荨麻疹、喉头水肿、支气管痉挛、昏厥、过敏性反应、心肌梗死 和心动停止[12]。
在注射过程中荧光素染料的外渗可能是血管造影术的一个严重并发 症。具有8-9.8的溶液pH，荧光素渗透可能是非常疼的。已经报道了在荧 光素外渗之后的皮肤蜕皮、局部坏死、皮下肉芽肿和中毒性神经炎。尽管 在血管造影术过程中威胁生命的反应是罕见的，但是它们可能出现的可能 性使得血管造影设备应该适当地装备并且准备好处理对该方法的严重反 应成为必要。
减少注射的速率可以减少副反应的危险或严重性。然而，这减弱成像 敏感性。
因此，例如存在对这样的荧光素衍生物的需要，所述荧光素衍生物更 好且更久地保持在血管空间内，并且特别地，较不易于被代谢或外渗。这 样的衍生物将允许施用更低的剂量，因此减少副作用和并发症的可能性和 严重性，并且此外将导致提高的图像质量。
相似的考虑适用于磁共振成像(MRI)造影剂。目前的细胞外MRI造影 剂受到相对短的半衰期的限制，并且也自由地外渗到背景肌肉中，其在稳 定状态成像过程中降低造影-比-噪声的比例。对于MRI和磁共振血管造影 应用中的常规临床应用，理想的是造影剂应该选择性保留在血管空间内， 并且具有延长的血液半衰期，以在1小时的成像机会中提供足够的血浆浓 度。为了促进多个身体区域成像和获得冠状动脉的长久、脉冲-门控的扫描， 延长的血液半衰期是必需的[13]。
许多小组目的是提高造影剂如Gd-DTPA的药物代谢动力 学特性，其通过将该部分偶联到方便的白蛋白结合剂上而进行。然而，这 样的白蛋白结合剂的解离常数限于100μM的量级[14]。因此，例如，为 了延长它们的半衰期并且提高它们的弛豫特性，保持对于改善造影剂如 Gd-DTPA的需求。
因此，在鉴定和开发可以用作方便的白蛋白结合部分用于偶联到宽范 围的药学目的分子(例如，小有机分子药物、蛋白药物、或诊断剂、例如， 用于各种形式的医学成像)上的小有机分子中存在大量的兴趣。然而，迄 今为止鉴定可以用作方便的白蛋白结合剂的小有机分子的尝试的成功是 有限的[15]。特别关注的领域是与白蛋白结合的强度、结合白蛋白的缀合 物的体内化学稳定性、和方便的程度(特别是，对于任何药物或药物种类， 不仅是对于某些有利的药物实例，应该理想地获得所述缀合物的良好药物 代谢动力学特性)。
为了允许开发不违反Lipinski’s五原则的药剂[16]，需要最小化方便的 白蛋白结合剂的大小。方便的白蛋白结合剂的其它理想的特性包括结合选 择性(即，区分白蛋白和其它分子)、易于合成可达性、容易与目的(生 物)药物分子缀合、良好的水溶性和不存在固有的毒性。迄今为止，提供 组合这些有利特性的白蛋白结合剂尚是不可能的。
在许多情形中，小药物的理想的药物代谢动力学特性是与白蛋白的特 定结合能力的结果，白蛋白是血液中最丰富的蛋白质，浓度约为600μM。 制药公司可以经验性地筛选它们的目的药物的适宜的白蛋白结合特性。然 而，该方法有有限的用途，原因在于在大部分情形中，分子的白蛋白结合 性质与负责理想的药理学作用的分子的部分密切相关。
尽管因此已知许多白蛋白结合分子，但是大部分已知的白蛋白结合剂 是不“方便的(portable)”，在这种意义上，在不丢失白蛋白结合或其它相 关的药学特性的条件下，它们不能容易地与其它生物活性部分偶联。溴酚 蓝和布洛芬，在生化和制药科学中的两种非常公知的分子，可以作为举例 说明该情形的实例。溴酚蓝是一种强白蛋白结合剂，其与白蛋白形成在通 过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时稳定的复合物。然而，溴酚蓝的相对 复杂的化学结构缺少适于使该分子与其它制药学目的分子(例如，小的有 机药物或蛋白药物)容易偶联的官能团。布洛芬，一种最广泛应用的抗炎 药，以微摩尔范围的解离常数与白蛋白结合。然而，当人们尝试修饰该分 子的羧酸基团时(例如，通过形成酰胺键)，以便使布洛芬与其它生物制 药目的部分偶联，布洛芬便失去其白蛋白-结合的亲和性。
不过，已经将白蛋白的长久的循环时间用于药物和白蛋白的直接缀 合。例如，在遗传水平上已将许多治疗多肽融合到白蛋白上(EPO、干扰 素、白介素、治疗肽)，并且已经在临床中研究了一些相应的融合蛋白[0]。
一个实例是将化疗剂直接偶联到人血清白蛋白表面上唯一的半胱氨 酸残基(Cys34)上。Kratz和同事已经利用抗癌化疗药多柔比星的伯氨基基 团或羰基基团进行该药物与人白蛋白的Cys34残基的位点-特异性偶联。 针对它们水解由此释放药理学活性多柔比星部分的能力选择用作多柔比 星和白蛋白之间的接头的化学部分[0]。作为一个代表性的实例， DOXO-EMCH的最大耐受剂量是未修饰的多柔比星的2-10倍高，并且在 荷瘤小鼠中，DOXO-EMCH可以以2-10倍于多柔比星摩尔当量的量注射， 与未缀合的多柔比星相比具有更低的毒性和更有效的治疗作用。关于预先 配制的多柔比星-HSA缀合物已经报道了相似的结果[3]。该蛋白衍生物目 前正处于临床研究中[4]。使用可以在体内关节炎部位通过基质金属蛋白酶 优先裂解的肽接头，同一小组以相似的方式将甲氨蝶呤化学偶联到白蛋白 上。相应的蛋白-药物缀合物可以视作药物前体，并且目前处于药物开发中。
然而，蛋白-药物缀合物的一个严重的常见缺点在于它们在人中可能是 免疫原性的[5]。因此，可能不考虑直接缀合作为寻找药物与白蛋白缔合并 且由此提高它们的药物特性的方式的问题的一般解决方案。一般的适用解 决方案将由方便的白蛋白结合分子提供，所述白蛋白结合分子即为一方面 具有针对白蛋白的选择亲和性且另一方面可以连接于任何目的药物上的 分子。
白蛋白的一种生理作用是作用为脂肪酸的载体。该特性已经用来使药 物与白蛋白缔合。例如，商业上公知的胰岛素衍生物特征在于通过与十四 烷酸(Levemir)形成酰胺而共价修饰胰岛素部分。这一长脂肪酸链赋予胰岛 素某些有利的性质，包括延长的血液清除，这在考虑白蛋白的脂肪酸-结合 特性时能够预测到。然而，该方法的缺点在于，它不易于适用于其它分子。 特别地，不适用于溶解性较低的蛋白或小的药物，原因在于所形成的衍生 物的不可接受的低水溶性。
近来，Genentech科学家已经报道二硫化物-限制的白蛋白-结合肽作为 方便的标记的发现和应用，其用于改变生物制药相关的蛋白(例如，抗体 片段)的药物代谢动力学性质，赋予它们在血液中长久的血液循环时间[6]。 最近，一些生物技术公司(例如，Domantis，Affibody)已经以相似的方式 通过基因融合开发了小球蛋白的突变体作为“方便的”白蛋白结合剂，以 赋予目的药物蛋白的缓慢血液清除特性[7-10]。然而，作为赋予白蛋白对 药物的亲和性的赋形剂，肽和蛋白不是理想的。肽和蛋白是可能通过消化 或变性而破坏的易变分子，并且因此特别难以口服施用。因此，通常这样 的药物必须通过注射施用，与口服途径相比，注射引起不便。
同样地，除了药物领域之外，对于控制和提高诊断剂如诊断显像剂和 造影剂的血液停留时间和组织分布也存在需要。荧光素是举例说明所述需 要的一个很好的实例。荧光素通常用在眼科学中用于荧光血管造影成像方 法，在美国和欧洲每年有超过一百万次注射。令人非常吃惊地，荧光素不 是经核准的药物试剂。在大部分情形中，在静脉内注射之前，医师必须制 备3-5ml荧光素钠水溶液(10％)。
荧光素非常快速地从血液中清除，并且因此必须以高剂量通过快速推 注(bolus injection)施用。然而，在这样高的剂量，荧光素在至多20％的患 者中引发恶心和呕吐，这取决于患者群体。在黑种人、亚洲人、华裔亚洲 人或混合种族来源的患者中，这些并发症更常见[0]。更严重的反应不常见， 但是包括荨麻疹、喉头水肿、支气管痉挛、昏厥、过敏性反应、心肌梗死 和心动停止[12]。
在注射过程中荧光素染料的外渗可能是血管造影术的一个严重并发 症。具有8-9.8的溶液pH，荧光素渗透可能是非常疼的。已经报道了在荧 光素外渗之后的皮肤蜕皮、局部坏死、皮下肉芽肿和中毒性神经炎。尽管 在血管造影术过程中威胁生命的反应是罕见的，但是它们可能出现的可能 性使得血管造影设备应该适当地装备并且准备好处理对该方法的严重反 应成为必要。
减少注射的速率可以减少副反应的危险或严重性。然而，这减弱成像 敏感性。
因此，例如存在对这样的荧光素衍生物的需要，所述荧光素衍生物更 好且更久地保持在血管空间内，并且特别地，较不易于被代谢或外渗。这 样的衍生物将允许施用更低的剂量，因此减少副作用和并发症的可能性和 严重性，并且此外将导致提高的图像质量。
相似的考虑适用于磁共振成像(MRI)造影剂。目前的细胞外MRI造影 剂受到相对短的半衰期的限制，并且也自由地外渗到背景肌肉中，其在稳 定状态成像过程中降低造影-比-噪声的比例。对于MRI和磁共振血管造影 应用中的常规临床应用，理想的是造影剂应该选择性保留在血管空间内， 并且具有延长的血液半衰期，以在1小时的成像机会中提供足够的血浆浓 度。为了促进多个身体区域成像和获得冠状动脉的长久、脉冲-门控的扫描， 延长的血液半衰期是必需的[13]。
许多小组目的是提高造影剂如Gd-DTPA的药物代谢动力 学特性，其通过将该部分偶联到方便的白蛋白结合剂上而进行。然而，这 样的白蛋白结合剂的解离常数限于100μM的量级[14]。因此，例如，为 了延长它们的半衰期并且提高它们的弛豫特性，保持对于改善造影剂如 Gd-DTPA的需求。
因此，在鉴定和开发可以用作方便的白蛋白结合部分用于偶联到宽范 围的药学目的分子(例如，小有机分子药物、蛋白药物、或诊断剂、例如， 用于各种形式的医学成像)上的小有机分子中存在大量的兴趣。然而，迄 今为止鉴定可以用作方便的白蛋白结合剂的小有机分子的尝试的成功是 有限的[15]。特别关注的领域是与白蛋白结合的强度、结合白蛋白的缀合 物的体内化学稳定性、和方便的程度(特别是，对于任何药物或药物种类， 不仅是对于某些有利的药物实例，应该理想地获得所述缀合物的良好药物 代谢动力学特性)。
为了允许开发不违反Lipinski’s五原则的药剂[16]，需要最小化方便的 白蛋白结合剂的大小。方便的白蛋白结合剂的其它理想的特性包括结合选 择性(即，区分白蛋白和其它分子)、易于合成可达性、容易与目的(生 物)药物分子缀合、良好的水溶性和不存在固有的毒性。迄今为止，提供 组合这些有利特性的白蛋白结合剂尚是不可能的。
发明内容
发明概述
本发明提供一种新种类的白蛋白-结合化合物及其与药学目的分子、特 别是治疗剂和/或诊断剂的缀合物。以下所述药学目的分子可以简单称为 “药剂”。按照本发明，所述化合物和缀合物能够与白蛋白结合，即，它 们具有针对白蛋白的亲和性。因此，以下本发明的化合物和缀合物可以统 称为白蛋白结合剂。优选地，本发明的白蛋白-结合化合物还选择性地与白 蛋白结合，即，具有优于其它结合配偶体的偏爱性。所述化合物容易制备， 并且通过本领域已知的化学方法可以方便地缀合(即，连接、偶联、共价结 合)到宽范围的其它分子(特别是所述药剂)上。
当与诊断剂或治疗剂缀合时，本发明的白蛋白-结合化合物有利地改变 所述药剂的药物代谢动力学特性。特别地，本发明所述的缀合增加药剂的 血液循环时间(备选地称为血液清除，或血液清除时间)，即，生理半衰 期。因为利用本发明所述的白蛋白结合部分，所述药剂将与白蛋白结合保 留在血流中，故与本发明的白蛋白-结合化合物的缀合允许药剂较不快速地 清除和/或降解。因此，当应用于，例如，快速代谢或另外清除的药剂，例 如大分子，特别是抗体片段或较小的球状结合蛋白，或对于其更有效的和 更持久的保留在血流中是理想的任何其它药剂或分子例如荧光素、荧光素 衍生物、或用于成像目的MRI或X-射线研究的造影剂如用于MRI的 Gd-DTPA时，本发明的上述方面是有利的。
按照本发明的另一个方面，本发明的白蛋白-结合化合物赋予它们与之 缀合的药剂更好的组织渗透能力。在本文中，表述“组织渗透能力”可以 一方面是指药剂的组织渗透程度，或另一方面是指药剂的组织渗透性的特 异性或选择性，或是指组织渗透性的这些方面中的二者。
为了本发明的目的，通过在不同时间点后对需要的组织内的药物/试剂 的定量而测量组织渗透性。优选地，这通过在注射之前标记分子(例如， 放射性、荧光)或通过液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)直接定量而实现。 血液半衰期和组织-渗透性是相关的，如在参考文献18中关于不同形式的 抗体和抗体片段的情形的描述，其中表明血清半衰期的增加与在肿瘤内积 聚的增加相关。
因此，当应用于，例如可以使用白蛋白作为赋形剂而靶向它们的目的 作用位点的药剂时，本发明的上述方面将是有利的。因此，抗癌药可以有 效靶向利用白蛋白作为营养的快速生长的肿瘤。
由本发明所有上述方面产生的益处是将本发明的白蛋白-结合化合物 缀合到治疗剂或诊断剂上可以允许所述药剂以较低的剂量施用给患者或 受试者。因此，本发明的这种益处降低了所述药剂的副作用、不利反应或 并发症的危险和/或严重性。
例如，当将诊断显像剂如荧光团或造影剂缀合到本发明的化合物上 时，所得到的所述药剂的缀合衍生物，其能够与白蛋白非共价结合，其特 征在于，与非衍生化的药剂相比较，更缓慢的血液清除模式，并且允许例 如，从血管获得更高的信号强度(例如，荧光、磁共振、X-射线、正电子 发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机化断层显象(SPECT)信号)，因此 允许施用较低剂量并且还产生更好质量的诊断成像(例如，血管造影片、 MRI成像、和X-射线成像或PET)。这特别是例如关于荧光素及其衍生物 的情形，以及它们在眼科血管造影中的应用。
鉴于它们的亲和性、溶解性和药物代谢动力学行为，因此，本发明的 白蛋白-结合化合物理想地适用于，例如，与造影剂如Gd-DTPA偶联，因 此延长半衰期并且提高弛豫特性(优选地，与不与本发明的白蛋白-结合化 合物偶联的造影剂相比，缩短的弛豫时间)。
本发明的白蛋白-结合化合物的一般优点在于，由于它们相对小的尺寸 和良好的溶解性，它们可以用来赋予小分子药剂以白蛋白结合亲和性，而 基本不影响所述小分子药剂的溶解性或其它药理学相关特性。
本发明的白蛋白-结合化合物的其它优点在于，它们普遍是方便的，即， 高度通用的。即，所述化合物可以缀合到任何药剂上，条件是所述要缀合 的药剂包括能够与白蛋白-结合化合物键合的官能团，即，所述官能团能够 进行反应以便所述药剂变得与所述白蛋白-结合化合物键合，或条件是可以 将所述官能团引入到所述药剂中。按照本发明，本发明的化合物用于所述 缀合的应用，形成本发明的缀合物，其中本发明的白蛋白-结合化合物的残 基可以直接或间接地与目的药剂的残基键合。
本发明还提供所述缀合物的医学、治疗和诊断应用。
发明详述
本发明所述的化合物
本发明提供由式1表示的方便的白蛋白-结合化合物种类：
(式1)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链、或环状烃基基团，其任选地被 至多2个杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1- C10烃基基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10， CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，其包括支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中所述烃基任 选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br，I，OR9， OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和 ＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其盐。
本发明还提供由式2表示的白蛋白-结合缀合物：
(式2)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多2个 杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基 基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9， ＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，其包含支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中所述烃基任 选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br，I，OR9， OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和 ＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y’是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团的残基；
Z包含治疗剂或诊断剂分子的残基以及任选地接头；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其药用盐。
按照优选实施方案，部分E包含由式3表示的部分：
(式3)
其中R3-R8独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起，R5和R6一起，或R7和R8一起任选地独立选 自下组：＝O，＝S和＝NH。
在本发明的其它优选实施方案中，部分E包括由式4表示的部分：
(式4)
其中R3和R4独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起任选地独立选自下组：＝O，＝S和＝NH。
本发明的化合物和缀合物能够结合白蛋白，即，它们具有针对白蛋白 的亲和性。它们的化合物亲和性优选是这样的，以使它们的解离常数为 100μM以下，更优选地为90，80，70，60，50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4，3， 2，或1μM以下，更优选地为90，80，70，60，50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4， 3，2，或1nM以下。
优选地，本发明的化合物和缀合物选择性与白蛋白结合。如果白蛋白 结合剂以比对备选结合配偶体更高的亲和力结合白蛋白，则认为所述白蛋 白结合剂关于备选的结合配偶体具有针对白蛋白的选择亲和性，其中关于 所述白蛋白结合剂与所述备选结合配偶体结合的解离常数是关于所述白 蛋白结合剂与白蛋白结合的解离常数的至少1.5-倍，优选地至少2-，3-，5-， 10-，15-，20-，25-，30-，35-，40-，45-，50-，60-，70-，80-，90-，100-200-，300-， 400-，500-，750-，或1000-倍。
在本发明的一个实施方案中，部分B以及基团D包含氨基酸残基。 氨基酸是包含酸和氨基官能团的任何有机分子。所述基团的一个或二者可 以任选地进行衍生化。氨基和酸性团可以相对于彼此处在任何位置，但是 氨基酸典型地包括2-氨基羧酸、3-氨基酸羧酸、4-氨基羧酸等，即，在优 选实施方案中，依据IUPAC命名习惯[0，0]，氨基基团处在编号为2，3，4，5， 6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20等的原子上。遵循本领域技 术人员已知的备选的命名习惯，所述氨基酸可以是α-，β-，γ-，δ-，ε-(等)直到 ω-氨基酸。在优选实施方案中，氨基酸可以是氨基羧酸[例如，0，0]。然而， 在其它实施方案中，氨基酸上的酸性团选自下组：-OPO3H，-PO3H， -OSO3H和-SO3H。在优选实施方案中，所述氨基酸是天然存在的氨基酸， 或其衍生物。在更优选的实施方案中，所述氨基酸是alpha(α-)氨基酸，其 中所述氨基酸可以是D-或L-氨基酸。优选地，所述氨基酸是选自下组的 氨基酸的D-或L-对映异构体：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸。最优选地， 所述氨基酸是D-赖氨酸或L-赖氨酸。在使用D-对映异构体的实施方案中， D-对映异构体的使用可以提供进一步降低新陈代谢速率并且由此减少从 血流中的清除的有益作用。
在优选实施方案中，当B或B-D包含氨基酸残基时，如本领域技术 人员应该理解的，Y可以方便地是所述氨基酸的氨基基团，最优选地是α-氨 基酸的alpha(α-)氨基基团。
按照本发明的另一个实施方案，B可在生理条件下裂解，优选地在来 源于本发明的缀合物中的治疗剂或诊断剂的部分的理想作用部位处发现 的体内条件下裂解。因此，按照一些实施方案，在所述部位发现的条件是 病理生理学条件，尽管按照其它实施方案，所述条件是在特定的组织或细 胞类型中发现的正常条件。病理生理学条件优选是在癌组织中、在肿瘤部 位、在炎症、凝固或病理斑形成(例如，动脉粥样硬化形成或淀粉样斑形 成)的部位等处发现的条件。
所述部分B优选地可通过水解裂解，更优选地通过酶的作用裂解，即， 酶促裂解。按照优选实施方案，所述裂解是通过酰胺分解或蛋白水解，即， 通过肽酶或蛋白酶作用。
按照本发明的优选实施方案，部分B因此可以通过酶裂解，即，B包 含可以作为酶的底物的裂解位点。优选地，所述酶是水解酶，更优选地是 酰胺分解酶、肽分解酶或蛋白水解酶(蛋白酶)。合适的酶裂解位点，特 别是蛋白水解位点，是本领域技术人员公知的[21]，并且包括用于由酶裂 解的位点，所述酶如金属蛋白酶(基质金属蛋白酶、或冠毛素(pappalysins) 或蛇毒蛋白酶)、丝氨酸蛋白酶(例如，凝血酶、弹性蛋白酶、凝血因子、 纤维蛋白溶酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或纤溶酶原激活物)、或半 胱氨酸蛋白酶(诸如组织蛋白酶)、羧酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或谷氨酸 蛋白酶。优选地，所述裂解位点与选自下组的酶有关：葡糖醛酸糖苷酶、 尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶、前列腺特异性抗原、人腺激 肽释放酶2、纤维蛋白溶酶，组织蛋白酶B和PSMA。
按照本发明的某些实施方案，部分B包含肽。所述肽优选地包含2个 或更多个氨基酸残基，优选为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19，20个氨基酸残基。最优选地，所述肽包含上述裂解位点[21]，即， 优选地蛋白酶裂解位点，并且其优选在特定的病理生理条件下裂解。
按照本发明的优选实施方案，当本发明化合物或缀合物的部分B不包 含可裂解的接头时，本发明所述的化合物的一般种类可以进一步通过可裂 解的接头、优选是可在体内水解的接头扩大。因此，在优选实施方案中， 可以利用可以通过蛋白酶裂解的一个或多个氨基酸接头或肽、可以在37 ℃水解的席夫碱[20]、可裂解的酯类或表现出在充分的体外稳定性与充分 的体内快速且优选选择性裂解性之间的适宜的折中(compromise)的其它化 学部分，使治疗剂或诊断剂与本发明的白蛋白-结合化合物偶联。
如上文参考式2提及的，因此接头可以任选地包含在部分Z内，所述 接头优选是可裂解的，更优选是可在体内水解的，最优选是在限定的条件 下在体内选择性裂解。其适用于本文中其中定义了Z的其它式。
基团D优选地是酸性团或其共轭碱，并且更优选地选自下组：OPO3H， PO3H，OSO3H，SO3H和COOH，优选为COOH，或其共轭碱(磷酸盐，膦酸 盐，硫酸盐，磺酸盐和羧酸盐)，其中在前述式中的氢原子H用负电荷取 代。在存在适当的质子受体(碱)的条件下，酸性团去质子化产生它们的 共轭碱。技术人员明白并且能够预测发生所述去质子化的环境。
在本发明的化合物和缀合物中的烃基或烃基残基是烃基团的残基， 即，烃链基团，其优选地独立选自下组：烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷 基。
当用于本文时，术语“烷基”包括具有1-30个碳原子的直链、支链 和环状链基团，优选具有1-20，1-15，1-10，1-8，1-6，1-4，1-3或1-2个碳原子 的直链、支链和环状链基团。烷基残基的具体实例为甲基、乙基、丙基、 异丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷 基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、 二十烷基(icosyl)、二十一烷基(henicosyl)、二十二烷基、二十三烷基、 二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基(heptacosyl)、二十八 烷基、二十九烷基或三十烷基(triacosyl)，包括其各种支链和/或环状异构 体，例如，叔-丁基或异戊基等。
当用于本文时，术语“环状”包括术语“多环”，其是指具有多于一 个环结构的结构。特别地，术语“环状”还指螺环结构，其中两个或更多 个环具有一个共用原子，和稠合多环结构，其中两个或更多个环具有至少 两个共用原子。所述稠合多环结构的优选实施方案是金刚烷或其残基(金 刚烷基基团)。
当用于本文时，术语“烯基”包括具有2-30个碳原子的直链的、支链 和环状的链基团，优选地具有2-20，2-15，2-10，2-8，2-6，2-4，或2-3个碳原 子的直链的、支链和环状的链基团，其包含至少一个碳-碳双键。“烯基” 基团的具体实例是关于烷基基团提供的那些的各种烯不饱和等价物，其根 据本领域技术人员已知的习惯[17，19]命名，取决于一个或多个碳-碳双键 的数目和位置，例如，丁二亚基，1-丙-3-亚基。“烯基”基团优选地包含 至少1个、更优选地至少2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个双 键，其中双键优选地位于烃基链的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14， 15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28或29。
当用于本文时，术语“炔基”包括具有2-30个碳原子的直链的、支链 和环状的链基团，优选地具有2-20，2-15，2-10，2-8，2-6，2-4，或2-3个碳原 子的直链的、支链和环状的链基团，包含至少一个碳-碳三键。“炔基”基 团的具体实例是关于烷基和烯基基团给出的那些的各种炔不饱和等价物， 其根据本领域技术人员已知的习惯[17，19]命名，取决于一个或多个碳-碳 三键的数目和位置。“炔基”基团优选地包含至少1个、更优选地至少2，3， 4，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个三键，其中双三键优选地位于烃 基链的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22， 23，24，25，26，27，28或29处。此外，术语“炔基”包括还包含至少一个碳 -碳双键的“炔基”基团，即，落入本文所用的“炔基”和“烯基”基团的 定义中的“炔基”基团。
当用于本文时，术语“芳基”是指具有2-30个、优选2-20个、2-10 个、更优选2-6个碳原子的单环或多环或稠合多环芳香环系统。
当用于本文时，术语″芳烷基″是指包含如本文所定义的至少一个烷基 基团和至少一个芳基基团的基团。在如本文定义的芳烷基基团中，所述芳 烷基通过烷基基团与本发明的化合物或缀合物的另一个部分键合，例如苯 甲基基团。
当用于本文时，术语“杂原子”包括N，O，S，P，优选为N和O。
在其中R1和R2连接以一起形成环结构的实施方案中，所述环结构优 选是3-10个、更优选地，3-9，3-8，3-7，3-6，3-5，3-4或4个碳原子的直链或 支链烃基链，其在式1或式2的苯环的两个位置处键合，即与所述苯环形 成两个键，以便形成与所述苯环稠合的环结构。优选地，所述两个键优选 位于所述苯环的间位(3-)和对位(4-)，位于邻位(2-)和间位或位于邻位和对 位。所述环结构任选地由至多2个、优选地1个或0个杂原子打断。所述 环结构任选地被选自下列各项的至多3个、优选地至多5，4，3，2，1或0个 基团取代：F，Cl，Br，I，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10， CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和＝NH。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述环结构是这样的C4链片段 (1，4-双自由基)，其通过其1-和4-原子与式1或式2的所述苯环连接，从 而形成与所述苯环稠合的六元环，优选地在所述苯环的间位和对位，即， 优选地形成间位-和对位-稠合的六元环，如在化合物539的苯环中(图1)， 其是一种有效用于合成本发明的化合物和缀合物的化合物。
按照本发明的优选实施方案，R1和R2独立地选自下组：I，Br，CH3，和 H。更优选地，R1位于对位，并且选自下组：I，Br和CH3，并且R2是H。
在一些优选实施方案中，R3-R8是H。独立地，在优选实施方案中， 其R9和R10也可以是H。
在本发明的白蛋白-结合化合物或在与其连接的药剂上的任一个官能 团、或多个官能团可以用来缔合所述化合物和药剂，条件是在所述化合物 和所述药剂上的官能团能够进行反应，以便所述化合物与所述化合物连 接。优选地，所述连接，即，缀合，通过共价键合，然而也考虑非共价键 合(即，氢键、离子键、范德华键)。在本说明书中，药剂与化合物的键 合、连接偶联或缀合意指所述药剂与化合物或它们的残基直接或通过其他 分子部分间接连接。
按照优选的实施方案，Y选自下组：-NH2，-SH，-OH，-CHO，-NCS， -NCO和H。优选地，Y是-NH2。当Y是-NH2时，本发明的化合物还包 括其质子化的形式(共轭酸)(NH3+)。
在本发明化合物的优选实施方案中，B(Y)-D包含由式5表示的部分：
(式5)
在本发明化合物的其他优选实施方案中，B(Y)-D包含由式6表示的 部分：
(式6)
按照其他优选实施方案，本发明的化合物由式7表示：
(式7)
按照其他优选实施方案，本发明的化合物由式8表示：
(式8)
按照优选实施方案，B包含选自下组的残基：
3-[2-(aminyl乙基)二硫代]丙酰，N-[α-马来酰亚胺-3’-基-乙酰基，N，N’-1，4- 双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-丁烷，N，N’-1，6-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷， N，N’-1，2-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-乙烷，N，N’-1，4-双-马来酰亚胺-3’，3”- 二基-2，3-二羟基丁烷，N-[β-马来酰亚胺-3’-基-丙酰，N-[β-马来酰亚胺-3’-基 -脲氨基(semicarbazyl)，N，N’-1，8-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-三甘醇， N，N’-1，11-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-四甘醇，环庚基，二甲基己二酰亚胺 基，二甲基庚二酰亚胺基(pimelimidyl)，二甲基环庚二亚胺基(suberimidyl)， 1，4-二-[3′-(2′-含硫基)-丙酰胺基]丁烷，戊二酰基，二硫代二丙酰基，酒石 酸基(tartaryl)，二甲基3，3′-二硫代二丙酰亚胺基，3，4-二硫代-N，N’-1，6-双- 马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷，乙二醇双-琥珀酰，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己 酰基，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己酰基脲氨基，N-[γ-马来酰亚胺-3’-基-丁酰基， 1，6-己烷-二-乙烯砜，N-[κ-马来酰亚胺-3’-基-十一酰，N-[κ-马来酰亚胺-3’- 基-十一酰脲氨基，4-[N-马来酰亚胺-3’基-甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己 酰基]，6-[3-巯基-]丙酰胺基己酰，间-[马来酰亚胺-3-基]-苯甲酰，4-(4-N-马 来酰亚胺-3’-基苯基)丁酰脲氨基，己二酰，3-巯基-丙酰脲氨基，N-[对-马来 酰亚胺-3-基苯基]脲基，2-巯基乙酰基，3-巯基丙酰，3-[溴乙酰氨基]丙酰，2- 碘乙酰基，4-[碘乙酰基]氨基苯甲酰，4-[N-马来酰亚胺-3’-基甲基]环己烷 -1-羧基，4-[对-马来酰亚胺-3’-基]丁酰，6-[β-马来酰亚胺-3-基-丙酰氨基]己 酰基，和对-[2-巯基乙基]苯甲酰，和4-硫代丁二酰亚胺酰胺基。
按照本发明的缀合物的优选实施方案，Y′选自下组：-NH-，-S-，-O-， -CO-，-NHCS-，-NHCO-和键。优选地，所述键是共价键。最优选地，Y′ 是-NH-。
按照本发明的缀合物的优选实施方案，B(Y′-Z)-D包含由式9表示的 部分：
(式9)
按照本发明的缀合物的其他优选实施方案，B(Y′-Z)-D包含由式10表 示的部分：
(式10)
按照本发明的特别优选的实施方案，本发明的缀合物包含由式11表 示的部分：
(式11)
按照本发明的其他优选的实施方案，本发明的缀合物包含由式12表 示的部分：
(式12)
在其他优选的实施方案中，本发明的化合物或缀合物，基团
选自由下列各项组成的组：
(式13)
(式14)
(式15)
(式16)
(式17)
(式18)
(式19)
(式20)
(式21)
(式22)
(式23)
(式24)
按照本发明，要缀合到本发明的化合物上的治疗剂或诊断剂可以是任 意类型的药剂。术语“诊断剂”包括显像剂。优选地，本发明的化合物可 以缀合到有机化合物、金属有机化合物、包括放射性核素的化合物、核苷 酸、核酸、聚合物、肽、核肽(nucleopeptide)、蛋白、脂质、类固醇、或 其任一个的衍生物或它们的组合。优选地，所述药剂选自下组：小分子、 肽、抗体、治疗性蛋白、反义寡核苷酸、和包含放射性核素的无机或有机 分子或复合物。
按照本发明，由于它们相对小的尺寸和良好的溶解性，所述白蛋白结 合剂可以用于与小分子药剂缀合，而基本上不影响，优选基本上不减少所 述小分子药剂的溶解性或其他药理学相关特征。优选地，与本发明所述的 化合物缀合的药剂的溶解性为在不缀合时所述药剂的至少1％，更优选地 至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98 ％，99％或100％。
在本文中，术语“小分子”是指具有小于约1500Da、特别是小于1200， 1000，900，800，700，600，500，400，350，300，250或200Da的分子量的分子， 优选是有机分子。
在本发明中，术语“蛋白”、“肽”或“多肽”可互换使用，并且是指 任意长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链的或支链的，它可以包 含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经天然或 通过干涉修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰 化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，诸如与标记成分缀合。所述定义还 包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(包含，例如，非天然氨基酸 等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。多肽可以作为单链或缔合链存 在，并且本发明的许多多肽(may of)可以是天然或非天然糖基化的(即， 所述多肽具有与在相对应的天然存在的多肽中发现的糖基化模式不同的 糖基化模式)。
按照本发明的优选实施方案，本发明的化合物与之缀合的、或其残基 包括在本发明所述的缀合物中的治疗剂分子是用于治疗下列各项的药物： 癌症，肿瘤，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染，炎症， 神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，激素病症，葡萄糖代 谢病症或糖尿病，或是用于避孕的药物。
在本发明中，术语“治疗(therapy)”、“治疗(treatment)”、“要治疗 (to treat)”和“治疗性的(therapeutic)”，分别包括“预防”、“防止”、“要 防止”和“预防性的”方面。
按照一些实施方案，所述治疗剂是用于治疗下列各项的药物：结肠直 肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌或卵巢癌、或淋 巴瘤、白血病、星形细胞瘤、高级星形细胞瘤、或肝细胞癌。在一个优选 实施方案中，所述药剂是用于治疗快速生长的肿瘤(优选地，具有小于120， 100，80，或60天的倍增时间的肿瘤)的药物。在本文中，术语“肿瘤倍增 时间”是指肿瘤体积加倍的时间(肿瘤体积倍增时间，参见参考文献22)， 如例如，在参考文献23中测量。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述治疗剂分子是用于治疗特征 为快速的白蛋白摄取的肿瘤的药物。
当本发明的白蛋白-结合化合物与某种药剂直接或通过其他连接部分 (接头)缀合时，并且本发明所定义的部分B或所述接头在特定条件下、 优选在病理生理条件下可裂解时，所述裂解反应的产物不再保留对白蛋白 的亲和性，或其对白蛋白的亲和性减小。按照本发明的具体实施方案。因 此本发明所述的缀合物包含在所述接头裂解后能够穿过和/或组织或细胞 的药剂或药物。按照本发明的这一方面，所述缀合物因此可以是药物前体。
按照本发明的其他优选实施方案，诊断剂分子是用于诊断影像学技 术、荧光、血管造影术、荧光血管造影术、超声波检查法、基于磁共振的 诊断方法、磁共振成像、X-射线成像、核医学、单光子发射计算机化断层 显象(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)的药剂。在特别优选的实施方案 中，所述药剂是用于眼科血管造影术的荧光团或用于X-射线或磁共振成像 的造影剂。最优选地，所述药剂包括荧光素或钆(III)-二乙基三胺五乙酸 (Gd-DTPA)、或其残基。DTPA的177Lu-复合物同样是优选的。
在优选实施方案中，所述治疗剂或诊断剂通过硫脲部分与部分B连接 (如用在化合物“428-D-Lys-FITC”中的荧光素试剂所示例；参见下文，在 “化合物的合成”(2)和实施例6中)或通过酰胺部分与部分B连接(如用 在化合物“428-D-Lys-FAM”中的荧光素试剂所示例；参见下文，在“化合 物的合成”(1)和实施例7中)。
本发明的缀合物的实例(428-Lys-FITC，428-Lys-FAM，和 428-Lys-β-Ala-DTPA-Gd)的结构显示在图7中。
制备本发明的化合物和缀合物
本发明的白蛋白-结合化合物和缀合物可以按照本领域技术人员公知 的方法合成并且偶联到携带适当的官能团的药物上，例如合成有机化学的 方法[24，特别是25]。
按照优选实施方案，本发明的化合物由图1所示的优选的化合物所示 例的羧酸前体起始合成。羧酸前体可以商购(例如，购自西格玛-奥得里奇 (SIGMA-ALDRICH)，http://www.sigmaaldrich.com，以下称为西格玛 (SIGMA)，西格玛-奥得里奇稀有化学品库(The Sigma-Aldrich Library of Rare Chemicals)，以下称为SALOR， http://cds.dl.ac.uk/cds/datasets/orgchem/isis/salor.html或Maybridge， http://www.maybridge.com)，或者可以通过本领域已知的方法合成[24]。图 1所示的优选的羧酸前体可从下述来源获得：
分子号 (参见.图1) 供应商 目录号 326 SALOR R787981 428 SIGMA(西格玛) I5634 533 SALOR S532649 535 SALOR S714461 536 SALOR S347213 539 SALOR R244996 624 Maybridge MO01273CB 622 Fluka 78250 625 Trans World Chemicals (Trans World化学品) I 1232 630 Biosynth(生物合成) M 4301 631 Fluka 65170 632 Aldrich(奥得里奇) 330339
在其中X为O且A为NH的实施方案中，部分B优选地与羧酸前体 成分的羧酸缀合，如在实施例1中关于化合物428所述，由羧酸前体成分 和赖氨酸、或7-氨基庚酸和赖氨酸作为提供部分B的成分。
在其中X为O且A为O的实施方案中，所述羧酸前体成分的羧酸基 团优选地与等摩尔量的偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)，三苯膦 (triphenylphosphane)(PPh3)和包括部分B和羟基(-OH)基团的成分反应。 在其中X为O且A为S的实施方案中，实施同样的步骤，不同的是包含 部分B的成分包含硫羟(巯基，-SH)替代羟基基团。
在其中X为O且A为CH的实施方案中，所述羧酸前体成分的羧酸 基团优选地首先通过与SOCl2和痕量的DMF反应转化成酰基氯；备选地 在CCl4中与PPh3反应。这之后是加入ZnBr-衍生物。
在其中X为S的实施方案中，在上述关于其中X为O的实施方案的 缀合反应之后，使用Lawesson试剂将C＝O基团转化为C＝S。
通常，提供部分B的分子的官能团(例如，NH2，COOH，OH，SH等)， 除了要与羧酸前体成分偶联的基团之外，优选地被保护(例如，使用Fmoc 基团保护NH2、或作为叔-丁基酯保护COOH)。去保护优选地如实施例1 中所述在纯化之前实现，或通过本领域已知的其他方法实现。
按照某些优选实施方案，对于白蛋白-结合化合物与药剂的偶联，并且 特别是对于当B包含肽时合成部分B，熟练的技术人员可以利用公知的肽 化学技术[24-29]。
在其中Y为NH2的优选实施方案中，该伯氨基基团可以用宽范围的 试剂修饰用于与目的分子缀合(偶联)。在优选的实施例中，所述白蛋白- 结合部分的所述NH2基团可以通过下列进行修饰：
1)通过在用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)/NHS(或 sulfo-NHS)，HOBt(1-羟基苯并三唑)，HBTU(O-(苯并三唑-1- 基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸酯)，HATU(O-(7-氮杂苯 并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)，TSTU(N，N，N′，N′-四 甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸酯)及其他活化后，与如琥珀 酰亚胺(NHS)酯，sulfo-NHS酯，酰基氯，酰基酐，羧酸形成酰胺键；
2)通过与异氰酸酯/异硫氰酸酯反应时形成脲/硫脲，和
3)通过与醛形成席夫碱。
在本发明的实施方案中，其中使用双官能接头增加用于连接药物与本 发明的白蛋白-结合部分的化学偶联基团的范围，特别优选引入下列各项：
1)通过与NHS-酯(例如，4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯， GMBS)缀合引入马来酰亚胺，或
2)通过Traut’s试剂或保护的硫醇引入硫羟基团。
备选地，优选使用硫羟基团的化学修饰(例如，使用马来酰亚胺基或 碘乙酰胺)使本发明的白蛋白-结合化合物与小的有机分子药物或蛋白质药 物偶联。在本发明的一个实施方案中，所述硫羟基团位于要偶联到本发明 的白蛋白-结合化合物上的药剂上。在另一个实施方案中，Y是SH，并且 硫羟基团可以直接位于本发明的白蛋白-结合化合物上。在另一个实施方案 中，SH基团可以通过上述双官能接头的方式引入或加入到所述白蛋白-结 合化合物中。
在实施例中提供用于制备本发明的代表性化合物的具体方法。
本发明所述的白蛋白-结合部分还可以通过非共价方式，例如，通过 利用核苷酸、或修饰的核苷酸、部分的碱基配对，与药物连接。
药物组合物
本发明提供本发明的白蛋白-结合缀合物或其药用盐，其用作药物。 本发明还提供包括本发明所述的白蛋白-结合缀合物或其药用盐、或本发明 的白蛋白-结合化合物与治疗剂或诊断剂结合的残基(residue)或其药用盐、 和药用载体的药物组合物。
还提供本发明的白蛋白-结合缀合物、或本发明的白蛋白-结合化合物 用于制备药物，优选地用于治疗癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、 真菌或其他感染，炎症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁 症，激素病症，或用于避孕。
药物组合物的制备是本领域技术人员公知的。本发明的白蛋白-结合 缀合物的药用盐可以通过常规方法制备，诸如通过使白蛋白-结合缀合物的 游离碱和/或酸分别与至少化学计量的理想的形成盐的酸或碱反应而制备。
本发明的白蛋白-结合缀合物的药用盐包括具有无机阳离子的盐，和 与有机碱形成的盐，所述无机阳离子诸如钠、钾、钙、镁、锌、和铵。适 当的有机碱包括N-甲基-D-葡糖胺，精氨酸，苄星青霉素(benzathine)，二乙 醇胺，乙醇胺，普鲁卡因和氨丁三醇。本发明所述的药用盐还包括源自有 机酸或无机酸的盐。适当的阴离子包括乙酸盐、己二酸盐、苯磺酸盐，溴 化物，樟脑磺酸盐(camsylate)，氯化物，柠檬酸盐，乙二磺酸盐(edisylate)， 依托酸盐，延胡索酸盐，葡庚糖酸盐，葡糖酸盐，葡糖醛酸盐，马尿酸盐， 海克酸盐，氢溴酸盐，盐酸盐，碘化物，伊西酸盐，乳酸盐，乳糖酸盐，马 来酸盐，甲磺酸盐，溴甲烷，甲基硫酸盐，萘磺酸盐，硝酸盐，油酸盐，扑 姆酸盐，磷酸盐，聚半乳糖醛酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，磺基水 杨酸盐，单宁酸盐，酒石酸盐，对苯二酸盐，甲苯磺酸盐和三乙基碘 (triethiodide)。
本发明的白蛋白-结合缀合物的药物剂型可以以即时释放、控释、缓 释、或靶向药物-递送系统提供，尽管由于存在本发明的白蛋白-结合部分， 即，包含在本发明的白蛋白-结合缀合物内的本发明所述的白蛋白-结合化 合物的残基，包含在本发明的药物组合物中的药物的药物代谢动力学特性 也受到影响。
常用剂型包括，例如，ovules，植入物，贴片，脂质体，片剂，糖衣丸， 锭剂，软或硬壳胶囊，无定形的或结晶粉末，泡腾粉剂或片剂，气雾剂，冻 干制剂，溶液和混悬液，(微-)乳液，油膏，凝胶，霜剂，糊剂，泡沫剂，栓 剂。取决于所用的施用途径，涂覆或施用药剂可能需要专门的装置，诸如， 例如，注射器和针头、吸入器、泵、注射笔、涂药器、专用瓶、或其他用 于施用的装置，其还可以植入体内。
药物剂型通常由药物、赋形剂、和容器/密闭系统组成。一种或多种赋 形剂，也称为无活性成分，可以加入到本发明的白蛋白结合剂中，以改进 或促进药物的制备、稳定性、施用和安全性，并且可以提供实现理想的药 物释放模式的方式。因此，添加到所述组合物中的赋形剂类型可以取决于 各种因素，诸如例如，药剂和/或白蛋白-结合部分的物理和化学特性，施 用途径，和制备方法。药用赋形剂在本领域内是可获得的，并且包括在各 种药典中列出的那些(参见，例如，[30，31])。
本发明的白蛋白结合剂的药物剂型可以通过本领域公知的任何方法 制备，诸如例如，通过常规混合、筛分、溶解、熔融、粒化、糖衣丸-制备、 片剂化、混悬、挤压、喷雾-干燥、研细、乳化、(纳米/微-)包封、包埋、 或冻干处理。如上所示，本发明的组合物可以包括一种或多种生理学可用 的无活性成分，其促进将活性分子加工成药用制剂。
正确的配制依赖于需要的施用途径。对于静脉内注射，例如，组合物 可以配制在水溶液中，如果需要的话，使用生理相容的缓冲剂，包括，例 如，磷酸盐、组氨酸、或柠檬酸盐，用于调节制剂pH，和使用张度剂， 诸如例如，氯化钠或葡萄糖。对于透黏膜或鼻施用，半固体、液体制剂、 或贴剂可能是优选的，可能包含渗透增强剂。这样的渗透剂通常在本领域 中是已知的。对于口服施用，所述白蛋白-结合缀合物可以配制在液体或固 体剂型中，并且配制成即时或控释/缓释制剂。适用于受试者口服的剂型包 括片剂、丸剂、糖衣丸、硬和软壳胶囊、液体、凝胶、糖浆、结晶浆液、 混悬液、和乳液。本发明所述的药物组合物还可以配制成直肠或阴道剂型， 诸如栓剂或滞留灌肠剂，例如包含熟练的技术人员已知的常规栓剂基质， 诸如可可脂、甘油酯、甘油化的明胶、去极化明胶、聚乙二醇、聚山梨酸 酯、或其他。
对于口服施用，本发明的白蛋白-结合缀合物将通常以固体剂型提供， 例如以片剂或胶囊的形式，或作为水溶液或混悬液提供。
固体口服剂型可以使用赋形剂获得，所述赋形剂可以包括惰性稀释 剂、填充剂、崩解剂、粘合剂(干的和湿的)、分解延缓剂、润滑剂、助 流剂、抗粘附剂、阳离子交换树脂、湿润剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、 增甜剂和调味剂。这些赋形剂可以是合成的或天然来源的。所述赋形剂的 实例包括纤维素衍生物、柠檬酸、磷酸二钙、明胶、碳酸镁、十二烷基硫 酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲 酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸或其盐、糖(即，葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、 滑石、西黄蓍胶浆、植物油(氢化)、和蜡。乙醇和水可以作为粒化辅助 物。在某些情形中，用例如口味掩饰膜(taste-masking film)、抗胃酸膜、或 释放延迟膜包被片剂是理想的。天然和合成的聚合物，与着色剂、糖、和 有机溶剂或水结合，通常用于包被片剂，形成糖衣丸。当与片剂相比优选 胶囊时，药物粉末、或其混悬液、溶液可以以相容的硬或软壳胶囊递送。
适当的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖。 玉米淀粉和褐藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶。润滑剂， 如果存在的话，通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用 物质如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯包被，以延迟在胃肠道中的吸 收。
口服应用的胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊，在所述硬明胶胶囊 中，活性成分与固体稀释剂混合，在所述软明胶胶囊中，活性成分与水或 油如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
对于通过皮肤或黏膜的局部施用，所述白蛋白结合剂可以配制在皮肤 贴片中，作为半固体或液体制剂，例如，凝胶、(微)乳液、油膏、溶液、 (纳米/微)混悬液、或泡沫剂。白蛋白结合剂渗透进入皮肤或黏膜以及下 面的组织可以进行调节，例如，使用渗透增强剂；亲脂、亲水、和两亲性 赋形剂的适当的选择和组合，其包括水、有机溶剂、蜡、油、合成的和天 然的聚合物、表面活性剂、乳化剂；通过pH调节；和使用络合剂。其他 技术，诸如离子导入，可以用来调节本发明的白蛋白结合剂的皮肤渗透。 透皮或局部施用将是优选的，例如，在需要具有最小系统暴露的局部递送 的情形中。
对于通过吸入施用，或施用到鼻，按照本发明使用的白蛋白结合剂便 利地以下列形式递送：溶液，混悬液，乳液，或来自加压包装或喷雾器的 半固体气雾剂，通常与推进剂如来源于甲烷和乙烷的卤化碳、二氧化碳、 或任何其他适用气体一起使用。对于局部的气雾剂，烃如丁烷、异丁烷、 和戊烷是有效的。在加压的气雾剂的情形中，适当的单位剂量可以通过提 供递送定量的阀门确定。例如，可以配制明胶胶囊和药筒以用在吸入器或 吹药器中。这些典型地包含白蛋白结合剂和适当的粉末基质如乳糖或淀粉 的粉末混合物。
配制用于通过注射进行肠胃外施用的组合物通常是无菌的，并且可以 以单位剂型存在，例如，存在于安瓿、注射器、注射笔、或多剂量容器中， 后者通常包含防腐剂。组合物可以采取这样的形式，如在油性或水性赋形 剂(vehicle)中的混悬液、溶液、或乳液，并且可以包含配方试剂，如缓 冲剂、张度剂、粘度增强剂、表面活性剂、混悬剂和分散剂、抗氧化剂、 生物相容性聚合物、螯合剂、和防腐剂。取决于注射位点，所述赋形剂可 以包含水、合成的或植物油、和/或有机共溶剂。在某些情形中，诸如使用 冻干的产物或浓缩物的情形中，所述肠胃外制剂将在施用之前重构或稀 释。长效制剂，提供本发明药剂的控释或缓释，可以包含可注射的纳米/ 微米粒子或纳米/微米或未微粉化的晶体的混悬液。不依赖由本发明所述的 白蛋白-结合部分实现的血液循环时间的增加，除了本领域已知的其他物质 之外，聚合物如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、或它们的共聚物可以作为控释 /缓释基质。其他长效制剂递送系统可以以需要切口的植入物和泵的形式存 在。
适用于静脉内注射本发明的分子的载体是本领域公知的，并且例如， 包括包含碱诸如例如氢氧化钠的基于水的溶液，以形成离子化试剂，蔗糖 或氯化钠作为张度剂。所述基于水的溶液可以包括包含磷酸盐或组氨酸的 缓冲液。可以加入共溶剂，诸如例如，聚乙二醇。这些基于水的系统有效 溶解本发明的药剂，并且在系统施用时产生低的毒性。在不破坏溶解性和 毒性特征的条件下，溶液系统成分的比例可以显著变化。此外，成分的身 份可以变化。例如，可以使用低毒性表面活性剂，诸如聚山梨酯或泊洛沙 姆，也可以使用聚乙二醇或其他共溶剂，可以加入生物相容性聚合物诸如 聚乙烯吡咯烷酮，并且其他糖和多元醇可以替代葡萄糖。
方便的白蛋白结合剂的应用/治疗方法
本发明提供本发明的白蛋白-结合化合物用于结合针对白蛋白的治疗 剂或诊断剂分子的应用，即，用于赋予所述药剂针对白蛋白的亲和性，或 用于增加所述药剂针对白蛋白的亲和性。优选地，所述药剂的亲和性增高 至少1.5倍，更优选地增高至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70， 80，90，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500， 2000，2500，3000，3500，4000，5000，7000，104，105，106，108或109倍。
本发明由此提供所述化合物用于减小所述药剂在受试者体内代谢或 降解的速率，并且由此用于增加治疗剂或诊断剂分子的血液循环时间(也 称为血液清除时间，“血液清除”，或关于生理半衰期表示)的应用。此外， 本发明因此提供所述化合物用于增加所述药剂在血管空间内的停留时间 的应用。优选地，所述血液循环时间或所述药剂在血管空间内的停留时间 增加至少1.5倍，更优选地增加至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60， 70，80，90，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500， 2000，2500，3000，3500，4000，5000，7000，104，105，106，或107倍。
此外，本发明提供所述化合物提高治疗剂或诊断剂分子的组织渗透能 力的应用。组织渗透能力的提高意味着使用本发明的缀合物导致在特定组 织中或在特定作用部位处所述缀合物和/或其中包含的或在接头部分分裂 后从其释放的治疗剂或诊断剂的更多的积累，该积累高于单独的所述治疗 剂或诊断剂，即，在不与本发明所述的白蛋白-结合化合物缀合的条件下， 所获得的积累。优选地，所述组织渗透性增加至少1.5倍，更优选地增加 至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250， 300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000， 5000，7000，104，105，106，或107倍。
此外，本发明提供治疗疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述 治疗的患者施用有效剂量的本发明所述的白蛋白-结合缀合物，或与治疗剂 或诊断剂键合的本发明的白蛋白-结合化合物。在优选实施方案中，所述疾 病或病症是癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染， 炎症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，或激素病症。
按照本发明的一个优选实施方案，所述方法包括利用与本发明的白蛋 白-结合化合物缀合而使所述药剂靶向组织或作用部位。所述部位优选包括 癌细胞，肿瘤，炎症、凝固或病理斑形成(例如动脉粥样硬化或淀粉样斑 形成)部位，或具有可以利用所述药剂治疗、显现、或诊断的生理或病理 特征的任何其他部位。
按照优选实施方案，所述组织特征在于高的白蛋白摄取速率。优选地， 所述组织是肿瘤，更优选地是结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头 颈癌、胰腺癌、胃癌或卵巢癌、或淋巴瘤、白血病、星形细胞瘤、高级星 形细胞瘤、或肝细胞癌。在一个优选实施方案中，所述组织是快速生长的 肿瘤(优选地，具有小于120，100，80，或60天的倍增时间的肿瘤)。
按照其他优选实施方案，所述方法包括通过白蛋白-结合部分，即，本 发明的白蛋白-结合化合物或其残基，使治疗剂或诊断剂和白蛋白结合的步 骤，由此使用血清白蛋白作为载体，将所述药剂递送至患者中所述药剂的 理想作用部位，或特定组织。在优选实施方案中，在所述作用部位或在所 述组织中，所述药剂从白蛋白释放。此外，优选地，药剂的释放通过化学 处理，优选地通过连接所述药剂和本发明所述的白蛋白-结合部分的可裂解 的接头的裂解实现，其中所述裂解优选地是蛋白水解裂解。按照一个实施 方案，所述药剂在所述化学处理之前被肿瘤细胞摄取。
在本发明方法的一些实施方案中，要与本发明的白蛋白-结合化合物缀 合的药剂阻滞细胞外靶标(例如，受体、细胞因子、生长因子、和血液酶)。
按照本发明的另一个方面，本发明提供所述化合物或缀合物用于医学 成像目的的应用。表述“医学成像”包括“诊断成像”或“成像诊断学”。 本发明所述的这样的应用优选地包括通过与本发明的化合物缀合而修饰 治疗剂或诊断剂，以形成本发明的缀合物。优选地，要与本发明的化合物 缀合的药剂是诊断剂。本发明所述的化合物和缀合物用于医学成像目的的 应用还优选地包括给患者施用有效剂量的本发明的缀合物。如在本说明书 其他部分描述的，所述医学成像优选地是基于荧光的方法、血管造影术、 荧光血管造影术、超声检查法、基于磁共振的诊断方法、磁共振成像、X- 射线成像、医学、单光子发射计算机化断层显象(SPECT)或正电子发射断 层扫描(PET)。
施用模式
本发明的白蛋白-结合缀合物可以直接或在包含赋形剂(见上文)的药 物组合物中递送，这是本领域中公知的。所述治疗方法包括给受试者施用 治疗有效量的本发明的白蛋白-结合化合物。
当用于本文时，术语“治疗有效量”是指治疗、改善、或预防目的疾 病病症、或表现出可检测的治疗或预防作用所需要的本发明所述的缀合物 的量。一般地，治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定或在动物模型中， 例如，在非人灵长类动物、小鼠、兔、狗、或猪中估算。动物模型还可以 用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后可以利用这些信息来确定在人 中施用的有效剂量和途径。
用于人受试者的精确的有效量应该取决于疾病状况的严重性、受试者 的一般健康、年龄、体重、和受试者的性别、日常饮食、施用的时间和频 率、药物组合、反应敏感性、和对治疗的耐受/响应。该量可以通过常规实 验确定，并且在临床医师的判断之内。通常，药剂的有效量，即，剂量， 为0.005mg/kg-50mg/kg，优选地为0.125mg/kg-20mg/kg。
本发明的优选药剂的有效治疗方案包括每天施用一次、两次或三次， 和/或每周一次、两次、三次、四次、五次或六次。因此，这些方案特别优 选地用于本发明。
本发明药剂在药物组合物(见上文)中的有效且便利的施用途径和适 当的配制还可以容易地通过常规实验确定。在本领域中许多制剂和药物递 送系统是可用的(参见，例如，[32，33])。
适当的施用途径可以包括，例如，口服、鼻(鼻内)、肺或其他黏膜、 局部、透皮、阴道、直肠、肠、眼、耳、肠胃外施用。
主要的肠胃外施用途径包括静脉内、肌内、和皮下施用。次要施用途 径包括腹膜内、动脉内、关节内、心脏内、池内(intracisteral)、皮内、病 灶内、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内、和心室内施用。待治疗的适应症、 以及药物的物理、化学和生物学特征，指示要用的制剂类型和施用途径， 以及优选局部还是系统递送。
对于有效用于本发明治疗的方法的组合物，治疗有效剂量可以最初使 用本领域公知的各种技术估算。动物研究中所用的初始剂量可以基于在细 胞培养测定中确定的有效浓度。适用于人受试者的剂量范围可以，例如， 使用从动物研究和细胞培养测定获得的数据来确定。
按照本发明，缀合物、或包含所述缀合物的药物或药物组合物的治疗 有效剂量或量，是指所述缀合物、药物或药物组合物在受试者中导致症状 改善或生存延长的量或剂量。所述缀合物、药物或药物组合物的毒性和治 疗功效可以通过标准的药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如， 通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的 剂量)。毒性与治疗效果的剂量比率是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50 比率。优选表现出高的治疗指数的缀合物、药物或药物组合物。
有效量或治疗有效量是所述缀合物、药物或药物组合物引发组织、系 统、动物或人的生物学或医学响应的量，所述生物学或医学响应是研究者、 兽医、医生、或其他临床医师所寻找的，例如，控制肿瘤生长、控制感染、 调节葡萄糖代谢、降低升高的或增加的血液葡萄糖水平、治疗或预防与改 变的葡萄糖代谢相关的病症如糖尿病、等等。
剂量优选地落入循环浓度范围内，其包括具有很少或没有毒性的 ED50。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和/或所用的施用 途径。准确的配制、施用途径、剂量、和给药时间间隔应该按照本领域已 知的方法考虑受试者病症的特殊性而选择。
可以单独调节剂量的量和时间间隔以提供足以有效实现理想的作用 的活性部分血浆水平，即，最小有效浓度(MEC)。MEC将关于每种药剂而 不同，但是可以从，例如，体外数据和动物实验估算。获得MEC所需要 的剂量将取决于个体特征和施用途径。在局部施用或选择性摄取的情形 中，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度不相关。
施用的药剂或组合物的量可以依赖于各种因素，包括被治疗的受试者 的性别、年龄、和体重、痛苦的严重性、施用方式、和开处方医师的判断。
所述组合物，如果需要，可以存在于包装或分配器装置中，其包含含 有活性成分的一个或多个单位剂型。例如，所述包装或装置可以包括金属 或塑料箔，诸如泡眼包装，或玻璃和橡胶塞，如在小瓶中。所述包装或分 配器装置可以附有施用说明书。还可以制备包括配制在相容的药物载体中 的本发明的药剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于适应病症的 治疗。
附图简述
图1显示结构单元试剂326，428，533，535，536，539，622，624，625，630， 631和632，从其起始可以合成本发明的化合物。
图2显示优选的本发明的化合物的实例延伸的白蛋白结合分子 428-ε-Lys-α-NH2(上图)和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2(下图)的结构。
图3显示428-ε-Lys-α-NHAc(A)，428-ε-Lys-α-NH-FITC(B)和428-氨基 庚酸-α-Lys-ε-NHAc(C)的等温滴定热量测定(ITC)测量。
图4显示比较荧光素(A)和428-ε-Lys-α-NH-FITC(B)获得的电迁移位 移，每种单独的(-)或用人血清白蛋白(HSA)和人血清(Serum)预温育。
图5显示428-ε-Lys-α-NH-FITC对比荧光素的药物代谢动力学模式。
图6显示关于与人血清白蛋白结合的微阵列测定的读取。
图7版A，B，C显示428-Lys-FITC，428-Lys-FAM，和428-Lys-β-Ala -DTPA-Gd的结构，其分别为本发明的缀合物的实例。
图8显示白蛋白结合的结构-活性关系研究(ITC)。
图9显示通过ITC对本发明所述的荧光素酰胺缀合物(428-D-Lys-FAM) 的Kd值的测量。
图10显示通过ITC对本发明所述的Gd-DTPA-缀合物 (428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd)的Kd值的测量。
图11显示通过荧光偏振法对Kd值的测量。
图12总结表征428-D-Lys-FAM与HSA的结合的竞争性实验。
图13显示比较荧光素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM和622-D-Lys-FITC 获得的电迁移位移，每种单独的(-)或用人血清白蛋白(HSA)和人血清 (Serum)预温育。
图14显示荧光素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM，和622-D-Lys-FAM在 小鼠中的药物代谢动力学模式。
图15显示DTPA-177Lu和428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu在小鼠中的药物代 谢动力学模式。
图16显示通过定量选择测定法(层析法白蛋白结合测定法)对白蛋白结 合特征的表征。
图17显示本发明所述的化合物(428-D-Lys-FAM)在血管造影分析中的提 高的成像性能。
图18显示本发明所述的化合物(428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu)在MRI分 析中的提高的成像性能。
实施例
实施例1制备本发明的化合物(“428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “428-ε-Lys-α-NH2”)
图1显示可能的结构单元试剂，从其起始可以合成本发明的化合物。 在加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺之前，将化合物428的羧酸(可从西 格玛(SIGMA)获得，目录号I5634)用在DMSO中的1当量的EDC和1.2 当量的NHS在30℃活化4小时。反应在30℃搅拌过夜，以生成428-氨 基庚酸。产物通过HPLC(参见实施例21，常规方法)纯化并且通过质谱法 分析。
通常，在下述实施例中合成的所有分子通过质谱法表征。
在一次制备中，428-氨基庚酸：将10μmol的428与在50μl的DMSO 中的8μmol N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和10μmol N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)在30℃搅拌3小时，然后加入在100μl 1M NaHCO3，pH 9中的20μmol 7-氨基庚酸(Bachem)。允许反应在30℃搅拌 过夜。在用过量的Trizma碱猝灭残余的试剂后，反应通过HPLC纯化， 并且通过质谱法表征。
按照本发明，为了获得“化学处理”用于与多种药剂的缀合反应同时 保留对白蛋白结合所需要的羧酸官能性的存在，通过将Fmoc-D-Lys-OH 经ε-氨基基团与428的羧酸官能团缀合，或通过将D-Lys(Fmoc)-OH经α- 氨基基团与428-氨基庚酸的游离羧基官能团缀合而引入伯氨基基团(见图 2)。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前加入大量过量的三乙胺进行 的缀合4小时后的去保护步骤。
实施例2制备本发明的化合物(“533-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “533-ε-Lys-α-NH2”)
将化合物533(可从SALOR获得，目录号S532649)的羧酸用在 DMSO中的1当量的EDC和1.2当量的NHS在30℃活化4小时，之后 加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺。反应在30℃搅拌过夜，以生成533- 氨基庚酸。产物通过HPLC纯化并且通过质谱法分析。
通过将Fmoc-D-Lys-OH经ε-氨基基团与533的羧酸官能团缀合，或通 过将D-Lys(Fmoc)-OH经α-氨基基团与533-氨基庚酸的游离羧基官能团缀 合而引入伯氨基基团。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前通过加入 大量过量的三乙胺缀合4小时后的去保护步骤。
实施例3制备本发明的化合物(“539-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “539-ε-Lys-α-NH2”)
将化合物539(可从SALOR获得，目录号R244996)的羧酸用在 DMSO中的1当量的EDC和1.2当量的NHS在30℃活化4小时，之后 加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺。反应在30℃搅拌过夜，以生成539- 氨基庚酸。产物通过HPLC纯化并且通过质谱法分析。
通过将Fmoc-D-Lys-OH经ε-氨基基团与539的羧酸官能团缀合，或通 过将D-Lys(Fmoc)-OH经α-氨基基团与539-氨基庚酸的游离羧基官能团缀 合而引入伯氨基基团。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前通过加入 大量过量的三乙胺缀合4小时后的去保护步骤。
实施例4制备化合物X-D-Lys(X＝326，428，533，535，536，539，622和 624)
在一组实验中，还按下述合成关于各种化合物“X”(X＝326，428，533， 535，536，539，622和624)的通式为X-D-Lys的分子：按在上述实施例中上 文所述进行部分X的羧酸活化。加入在100μl DMSO中的20μmol Fmoc-D-Lys(Bachem)和43μmol三乙胺(TEA)之后，反应在30℃搅拌过夜。 通过加入10μl 5M KOH并在30℃搅拌2小时而去除在α-氨基位置处的 Fmoc-保护基团。在通过在0.1％三氟乙酸梯度上的HPLC纯化后，将含有 X-D-Lys的干燥的级分重悬在DMSO中。加入5M HCl直到溶液变澄清。
实施例5对本发明的化合物的“化学处理”修饰
乙酸或丁酸分别与428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2的 氨基基团的缀合通过下列步骤实现：用等摩尔的EDC/NHS在30℃活化羧 酸3小时，并且随后向428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2中 分别加入100x摩尔过量的活化的酸，并且在30℃搅拌12小时。备选地， 分别向428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2中加入100x摩尔过 量的乙酸酐，并且在30℃搅拌12小时。
在一组制备中，由X-D-Lys(按实施例4所述制备，并且重悬在DMSO 中)合成通式为X-D-Lys-Ac(X＝326，428，533，535，536，539，和624)的分 子。在这些情形中，在通过HPLC/UV确定浓度后，使X-D-Lys与10x摩 尔过量的Ac2O在30℃反应4小时。产物通过HPLC纯化。
实施例6制备本发明的缀合物：与荧光团(FITC/硫脲衍生物)偶联
428-ε-Lys-α-NH2的α-氨基基团与荧光素-异硫氰酸酯(FITC)缀合，作 为荧光团、诊断剂、以及一般的药物样分子的实例。偶联通过将2.5μmol 428-ε-Lys-α-NH2和10μmol FITC在650mM NaH2PO4，30％DMSO，pH 7.2 中在30℃搅拌12小时而实现。产物(428-D-Lys-FITC)通过HPLC纯化并 且通过质谱法表征。
实施例7制备本发明的缀合物：与荧光团(FAM/酰胺衍生物)偶联
按下述制备428-D-Lys，622-D-Lys，以及用于比较的苯乙胺与荧光素 的酰胺缀合物(428-D-Lys-FAM，622-D-Lys-FAM和苯乙胺-FAM)：将19 μmol苯乙胺，按照上述制备的428-D-Lys，或622-D-Lys和14μmol 5-羧基 荧光素NHS酯溶解在120μl DMSO中。加入72μmol TEA。反应在避光 条件下在30℃搅拌24小时。反应通过利用醋酸三乙铵(TEAA)梯度的 HPLC进行纯化。
实施例8制备本发明的缀合物：与诊断造影剂(DTPA)偶联
在增加血液半衰期和更短的弛豫时间方面，造影剂在MRI成像方法 中的性能受益于与血清白蛋白的非共价结合。造影剂DTPA通过下述方法 与本发明的化合物缀合，以生成本发明的缀合物。
通过用在THF中的等摩尔量的偶氮二羧酸二乙酯，PPh3和二苯基磷 酰氮化物搅拌12小时首先将羟基-基团转化成叠氮化物，然后通过用在甲 醇中的Pd/C/H2搅拌12小时而将所述氨基基团还原，从而将2-(R)-羟甲基 -DTPA-五-叔-丁酯转化为2-(R)-氨基甲基-DTPA-五-叔-丁酯。为了与2-(R)- 氨基甲基-DTPA-五-叔-丁基缀合，将428-ε-Lys-α-NH2的伯氨基基团通过 与由EDC/NHS活化的二硫代乙醇酸反应并且随后用TCEP还原而转化为 硫羟基团。将2-(R)-氨基甲基-DTPA-五-叔-丁基，N-(c-马来酰亚胺基丁酰氧 基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)和428-ε-Lys-α-NH2的硫羟衍生物(比例为1∶2∶10) 在30℃搅拌12小时。用TFA去除羧酸的叔-丁基保护基团。随后，可以 将得到的428-ε-Lys-α-GMBS-DTPA缀合物用Gd负载，并且用于MRI研 究。
在一个实例中，将428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd按下述合成：按上述， 用EDC/NHS使Fmoc-β-Ala与428-D-Lys缀合，并且用5M KOH去保护。 将19μmol 428-D-Lys-β-Ala和14μmol p-SCN-Bn-DTPA(Macrocyclics)溶 解在120μl DMSO中。加入72μmol TEA。反应在30℃搅拌24小时。 反应通过利用100mM TEAA梯度的HPLC纯化。通过向1μmol 428-D-Lys-β-Ala-DTPA中加入10μmol GdCl3并且用NaOH调节为pH 10， 然而在25℃温育过夜，而进行428-D-Lys-β-Ala-DTPA和Gd3+之间的复 合物形成。通过在TEAA梯度上的HPLC进行过量Gd3+的去除。通常， 终产物通过质谱法表征。
实施例9制备本发明的缀合物：与抗癌药物(多柔比星)偶联
利用琥珀酸作为双官能接头将多柔比星通过伯氨基基团与 428-ε-Lys-α-NH2缀合。首先，多柔比星与100x摩尔过量的琥珀酸酐在30 ℃搅拌12小时，并且随后通过HPLC纯化。由此氨基基团与琥珀酸酐反 应，形成酰胺键并且释放羧酸。在加入10x过量的428-ε-Lys-α-NH2之前， 用等摩尔量的EDC/NHS在30℃活化该羧酸4小时。纯化通过HPLC进 行并且通过质谱法表征。
对于通过羰基基团缀合，将多柔比星与摩尔过量的(6-马来酰亚胺基己 酰基)酰肼在30℃搅拌12小时。通过与EDC/NHS活化的二硫代乙醇酸 反应并且随后用TCEP还原，将428-ε-Lys-α-NH2的伯氨基基团转化为硫 醇。通过与10倍过量的硫醇衍生物在30℃搅拌12小时，将多柔比星-腙 -己酰基-马来酰亚胺与428-ε-Lys-α-NH2的硫醇衍生物偶联。
实施例10制备本发明的缀合物：与癌症药物(epithilone)偶联
Epothilones是癌症治疗领域的有效药物。然而，施用epothilones的主 要限制在于它们的神经毒性。由于与血清白蛋白的结合显著减少药物渗透 血脑屏障的能力，epothilones与白蛋白-结合分子的缀合是减少副作用、允 许更高的剂量并且因此增加它们的治疗功效的有效方法。
428-ε-Lys-α-NH2与epothilones的缀合按照与实施例9中关于多柔比 星的记述相同的流程进行。首先，如实施例9中关于多柔比星所述，将 428-ε-Lys-α-NH2转化为硫醇衍生物。将epothilone，(6-马来酰亚胺基己酰 基)酰肼和428-ε-Lys-α-NH2的硫醇衍生物按1∶2∶10的摩尔比例搅拌12小 时。为了防止与epothilone的环氧化物基团的副反应，可以采用保护策略。
实施例11通过等温滴定热量测定(ITC)表征本发明的化合物和缀合物
通过等温滴定热量测定(ITC)进行结合亲和力的溶液中测量(in solution measurement)。
按照参考文献34的方法进行通过ITC的结合实验。将1×2μl，然后 是29×20μl的428-衍生物注射到1.8ml的人血清白蛋白中。所有ITC测 量均在50-100μM蛋白和0.5-1mM缀合物的浓度下在PBS，2％DMSO 中在37℃进行。实施例1的428-氨基庚酸的ITC测量揭示针对亲和性相 当的两个结合位点的解离常数Kd＝3μM。用乙酸和丁酸修饰428-氨基庚 酸-α-Lys-ε-NH2和428-ε-Lys-α-NH2中的伯氨基基团没有显著改变针对 HSA的结合亲和性(对于428-ε-Lys-α-NHAc，Kd＝3.2μM，对于 428-ε-Lys-α-NHBu，Kd＝5.5μM，对于428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NHAc，Kd＝8 μM，对于428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NHBu针对人血清白蛋白上的单一结合位 点，Kd＝8μM)(见图3)。这证实通用“化学处理”的理想特征，其可以用 于将宽范围的药剂缀合到本发明的化合物上。428-ε-Lys-α-NHAc还结合其 他物种的血清白蛋白。以相似的亲和性识别鼠血清白蛋白(在两次独立的测 量中，Kd＝3.7μM和3.6μM)，而针对大鼠血清白蛋白的亲和性低6x(Kd＝ 28μM)。
在图8所示的一系列测量中通过ITC进一步表征白蛋白结合的结构- 活性-关系。该附图显示通过ITC测量的分子X-D-Lys-Ac(X＝533，535，536， 539和624)的一般结构。表征了428-D-Lys-Ac(1)以及其他鉴定的结合分子 (其中2，3，4，5和6分别对应于结构533，535，536，539和624)与HSA的 结合。
另外，图8显示428-D-Lys针对MSA(7)的亲和性测量，其与使用HAS (1)的相应测量相当。
其他测试的与乙酰化的D-赖氨酸缀合的结合剂(X＝533，535，536，539 和624)具有微摩尔范围内的亲和性。对它们的解离常数排序发现与层析法 白蛋白结合测定中的相对保留相对应(见下文，实施例17)。
428-ε-Lys-α-NH2的α-氨基基团与FITC的缀合没有导致白蛋白-结合 亲和性的任何显著损失。在与FITC缀合后，当通过ITC确定时，针对人 血清白蛋白的结合亲和性保持相似(Kd＝6.5μM，见图3)。
此外，表征了荧光素和一些荧光素衍生物(428-D-Lys-FAM， 622-D-Lys-FAM，和苯乙胺-FAM)。通过ITC在37℃测量的 428-D-Lys-FAM针对HSA的解离常数为330nM(图9)。
此外，通过ITC确定428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd针对HSA的亲和性(Kd ＝3.3μM，图10)。如上文所解释的，DTPA(二乙烯三胺-五乙酸)是核医学 方法中常用的螯合剂，并且Gd-DTPA是MRI中最广泛使用的造影剂。
一般地，使用VP-ITC仪器(Microcal)进行等温滴定热量测定测量。将 不含脂肪酸的HSA(西格玛，A1887)或不含脂肪酸的MSA(A1056)溶解在 PBS，2％DMSO中，并且针对同样的缓冲液透析。用于实验的蛋白浓度在 30μM-1mM之间变化。实验通常通过用结合分子滴定血清白蛋白进行。 在37℃，HSA或MSA用比蛋白溶液约10倍更高的浓度的在PBS，2％ DMSO中的结合分子溶液进行滴定。典型地，滴定进行到直到达到配体与 蛋白上的结合位点为2∶1的比率。将配体溶解在透析缓冲液中。结合分子 的精确的浓度通过HPLC/UV确定。处理得到的滴定曲线，并且用Origin 7软件(Microcal)拟合，以获得Kd和ΔH值。
实施例12通过荧光偏振法表征本发明的化合物和缀合物
将100nM 428-D-Lys-FAM，622-D-Lys-FAM和，用于比较的荧光素和 苯乙胺-FAM与增加量的HSA在PBS中在25℃温育1小时。通过在485 nm激发和在535nm测量而确定荧光偏振。
这样测量的解离常数对于荧光素为76μM，对于428-D-Lys-FAM为 108nM，对于622-D-Lys-FAM为6.6μM和对于苯乙胺-FAM为17μM(见 图11)。
实施例13在竞争性实验中通过荧光偏振法表征本发明的化合物和缀合物
将500nM 428-D-Lys-FAM和HSA与在PBS中的1μM，10μM和100 μM的各种HSA-结合竞争剂在25℃温育1小时。通过在485nm激发和 在535nm测量而确定荧光偏振。
这些竞争实验表明428-D-Lys-FAM在位点II结合HSA。图12总结通 过关于428-D-Lys-FAM结合竞争的荧光偏振获得的结果。将500nM 428-D-Lys-FAM和HSA用增加量的竞争剂(左版)温育。提供关于未结 合的(无HSA)和结合的(无抑制剂)428-D-Lys-FAM的对照值(右版)。
实施例14通过电迁移位移测定法表征本发明的化合物和缀合物
按照参考文献35的一般方法进行电迁移位移测定。将在PBS缓冲液 中的10ul 10μM荧光素或10μM 428-ε-Lys-α-NH-FITC[36]分别与100μM 人血清白蛋白或人血清(1/5稀释)预先温育。测定的温育时间为30分钟。 使用20％-丙烯酰胺凝胶制备液，TBE(Tris/硼酸/EDTA)缓冲液[36]，和在 5％蔗糖中的10ul样品上样体积，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳[35，36]。运 行条件为180V/40分钟。电迁移位移测定表明428-ε-Lys-α-NH-FITC的 结合及其对HSA的特异性(图4)。
在其他系列的电迁移位移实验中(见图13)，将浓度为5μM的荧光 素、苯乙胺-FAM、428-D-Lys-FAM，和622-D-Lys-FAM与PBS、在PBS 中的HSA(50μM)和人血清(10x在PBS中稀释)温育。1小时后，将样品 上样到20％聚丙烯酰胺凝胶上，并且在Tris/硼酸/EDTA pH 8.2中在180V 运行40分钟。
实施例15评价本发明的缀合物的药物代谢动力学特性
本发明的缀合物的药物代谢动力学特征通过将所述缀合物和相对应 的未缀合的药剂(即，未通过本发明的化合物修饰的药剂)注射到小鼠中 并且随后取样所述缀合物和药剂的浓度而进行评估。缀合物和药剂浓度通 过液相色谱/质谱/质谱(LC-MS/MS)按照本领域已知的技术[37]确定。
将100μl 170μM的荧光素和428-ε-Lys-α-NH-FITC溶液注射到2对 免疫活性129SV小鼠中。单独的化合物在24小时期间的时间点取样的小 鼠血清中的浓度通过LC/MS/MS确定，这表明两种化合物显著不同的药物 代谢动力学模式。尽管荧光素很快从血清中清除(t1/2＝12.5分钟)，而 428-ε-Lys-α-NH-FITC保留在血清中显著更长的时间期间，显示出两阶段 性清除，t1/2，α＝22.5分钟和t1/2，β＝340分钟(图5)。
在进一步的体内实验中，测量并比较荧光素、苯乙胺-FAM、 428-D-Lys-FAM、和622-D-Lys-FAM的药物代谢动力学性质。关于所述4 种化合物的清除模式显然不同(图14)。尽管荧光素以单阶段模式快速清 除，并且在注射后30分钟就不再检测到，而所述衍生物表现出与它们针 对HSA的亲和性相关的两阶段清除模式(荧光素：t1/2＝4.6分钟； 428-D-Lys-FAM：t1/2，α＝27分钟，α-阶段＝90％，t1/2，β＝495分钟； 622-D-Lys-FAM：t1/2，α＝5.3分钟，α-阶段＝98％，t1/2，β＝100分钟；苯乙 胺-FAM：t1/2，α＝5分钟，α-阶段＝99.5％，t1/2，β＝53分钟)。
在des Kantons Zürich(授予Dario Neri)的方案许可 198/2005下进行药物代谢动力学分析。向129SvPas小鼠尾静脉注射溶解 在100μl的100mM Tris/HCl，105mM NaCl，pH 8.2中的20nmol的荧光 素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM，或622-D-Lys-FAM(每种2只小鼠)。 在注射后1，5，15，30，60，120，240，360，480和1440分钟，用EDTA包被的 毛细管(Sarstedt)从隐静脉采集20-30μl血液样品，并且离心。将5-10μl血 浆与40μl 0.1％三氟乙酸和200μl乙醇混合，并且在冰上温育1小时。1 小时后，离心样品以去除沉淀的蛋白质。上清在真空下干燥，并且随后重 新溶解在50μl DMSO/H2O中。将40μl注射到LC/MS/MS系统(Micromass Quattro micro API)并且在Waters XTerra MS C18柱(3.5μM，1×50mm)上 运行在0.1％HCOOH中从5％到95％的乙腈的线性梯度10分钟，同时观 察到对于荧光素，子离子m/z 287.1和202.1，母体离子333.1，对于苯乙 胺-FAM，子离子m/z 287.3和332.3，亲代离子480.2，对于 428-D-Lys-FAM，子离子m/z 287.3，377.2和505.2，母体离子777.1，对于 622-D-Lys-FAM，子离子m/z 287.3和505.4，母体离子651.3。比较用先前 利用相同的样品制备获得的荧光素和428-D-Lys-FAM在血浆中的稀释系 列的曲线下面积允许分子定量。
还利用静脉内注射到小鼠中的DTPA和428-D-Lys-βAla-DTPA的177Lu 复合物研究药物代谢动力学模式。与使用荧光素衍生物遇到的情形相似， DTPA-177Lu以单阶段模式快速清除，并且在注射后60分钟不再检测到， 而428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu表现出显著更缓慢的两阶段清除模式(图 15；428-DLys-βAla-DTPA-177Lu：t1/2，α＝22分钟，α-阶段＝90％，t1/2，β＝ 408分钟)。
DTPA复合物的形成通过将2.25nmol DTPA或428-DLys-DTPA与70 μCi的177Lu(Perkin Elmer)在25℃在250μl PBS中温育过夜而进行。完全 的复合物形成通过HPLC使用放射活性检测器(GABI Star，Raytest)利用 TEAA缓冲液验证。对129SvPas小鼠(每种2只小鼠)尾静脉注射在100μl PBS中的30μCi DTPA-177Lu，或428-D-Lys-β-Ala-DTPA-177Lu。在注射后 1，5，15，30，60，120，240，480，1440分钟按上述进行血液取样和177Lu定量。
为了测量MSA的药物代谢动力学，将75nmol MSA用DTPA标记， 标记通过与2.1μmol在PBS中的p-SCN-Bn-DTPA在4℃反应4小时然后 在PD-10柱(GE卫生保健(GE Healthcare))上纯化而进行。将50nmol MSA-DTPA用50μCi 177Lu(Perkin Elmer)标记并且在PBS平衡的PD-10柱 上纯化。将3μCi MSA-DTPA-177Lu注射到129SvPas小鼠的尾静脉(2只 小鼠)中。在注射后1，15，30，60，120，240，480，1440分钟按上述进行血液 取样。通过在Packard Cobraγ-计数仪上计数而定量在注射液和血浆中的 177Lu的量。
实施例16基于微阵列检测白蛋白-结合
下述实施例提供基于微阵列的测定法，以用于检测化合物(例如，治 疗剂或诊断剂与白蛋白-结合结构域、或任何其他分子的缀合物)是否结合 白蛋白。在该测定中，其可以便利地平行应用于大量的化合物，所述化合 物是单独且共价偶联到相似而不同的寡核苷酸上，所述寡核苷酸在5’末 端携带氨基己基部分[如在38中所述]。所有这些寡核苷酸在5’端具有相 同的序列，这允许它们与互补寡核苷酸退火，但是在6个碱基的部分中不 同。该独特的、不同的部分作用为与不同寡核苷酸偶联的每种有机化合物 的独特的“鉴定密码”。
要针对白蛋白结合进行检测的寡核苷酸-化合物缀合物的混合物(以下 为“文库”)与未修饰的24mer寡核苷酸杂交，所述未修饰的寡核苷酸与 所述寡核苷酸5’末端的恒定区互补。通过将所述寡核苷酸在94℃变性3 分钟，然后在10mM Tris/Cl，1mM MgCl2，pH 8中以终浓度为87nM的 文库和120nM的未修饰的配对寡核苷酸在50℃10分钟形成异源双链体， 实现寡核苷酸的二聚体化。在100μl的总体积中，将10μl的该装配的文 库与50μl用人血清白蛋白或作为阴性对照的Tris修饰的CNBr-琼脂糖温 育，其预先用100μg/ml hering精子DNA预温育。在用400ml 100mM NaH2PO4，1mM MgCl2，0.1％吐温20，pH 8.5在SpinX柱中的三次洗涤步 骤之后，将树脂重悬在100μl H2O中。通过使用5μl重悬的树脂进行25 个循环的指数PCR而扩增保留的寡核苷酸-化合物缀合物的密码(code)。在 用PCR纯化试剂盒(Qiagen)去除未标记的引物之后，使用Cy3-标记的引物 将所述密码线性扩增25x。将产物沉淀在乙醇中，并且重新溶解在120μL 杂交缓冲液(4x SSC，50mM HEPES，0.2％SDS，pH 7)中，并且在Tecan HS 400杂交仪中用微阵列载玻片(以五个一组展示具有与单个文库寡核苷酸 的6碱基密码特异性互补序列的19mers)在44℃温育4小时，然后使用 2x SSC/0.2％(w/v)SDS，0.2x SSC/0.2％(w/v)SDS，和0.2x SSC进行连续 的洗涤步骤。在杂交后，使用Genepix专业4200A扫描仪(λex 532nm， 100％激光功率，光电倍增管300)分析微阵列。使用Genespotter(v2.4.3)定 量并评估点强度。在减去背景后，平均值用作点信号强度(5个点的平均 值)。比较用人血清白蛋白温育后的信号强度与用Tris猝灭的树脂温育后 的信号强度，以及在温育之前的文库的信号强度，揭示要被检测的化合物 的白蛋白-结合性质(图6)。
实施例17通过定量选择测定表征白蛋白结合特性(色谱法白蛋白结合测 定)
本发明化合物和缀合物的结合特性，特别是白蛋白-结合选择性，还可 以通过下述定量选择测定法进行分析。使用γ33P-ATP和T4多核苷酸激酶， 将与寡核苷酸如实施例16的文库中的那些的恒定(“相同”)序列互补的 24mer寡核苷酸在5’端进行放射性标记。在单独的管中，所述放射标记的 寡核苷酸与所述寡核苷酸-化合物缀合物或作为阴性对照的未缀合的寡核 苷酸之一杂交。实验以100nM的双链体浓度进行。将这些寡核苷酸双链体 对的等分试样与缀合到CNBr-琼脂糖浆上的人血清白蛋白温育1小时，并且 按上述在选择步骤中洗涤。使用Beckman LS 6500闪烁计数仪，对温育和 洗涤步骤的流过液以及树脂进行33P放射性计数。放射性的计数表明所述寡 核苷酸-化合物缀合物在树脂上的保持(即，结合)的相对程度，如果存在 的话。
在一系列实验中，使用γ33P-ATP(GE卫生保健(GE Healthcare))和T4 多核苷酸激酶(USB)，按上述标记24mer寡核苷酸。在单独的管中，将所 述放射标记的寡核苷酸与所选择的寡核苷酸-化合物缀合物或作为阴性对 照的未缀合的寡核苷酸之一杂交，每种寡核苷酸浓度为100nM。将这些寡 核苷酸双链体对的等分试样与在100μl PBS中的HSA树脂温育。在温育1小 时后，使用400μl PBS进行3轮洗涤，并且使用Beckman LS 6500闪烁计数 仪，对剩余的珠以及输入物、流出液、和所有洗涤级分的等分试样进行33P 放射性计数。
图16显示在整个数次洗涤步骤中对白蛋白-结合部分选择定量的放射 性的量。
该方法有效用于结合剂的初始分类。在图16中检测的结合剂中，发现 最强的结合剂，以及它们的相对结合强度(排序)可以描述为 428＞539＞624＞535＞533＞536＞326＞其它结合分子。
实施例18从血清去除白蛋白的测定
目的化合物对白蛋白的结合以及所述针对白蛋白与血清中的其它蛋 白的结合特异性可以通过将目的化合物以及胆红素(具有纳摩尔亲和性的 天然HSA配体)偶联到氨基-标记的琼脂糖上而进行测定。
人血清白蛋白和人血清样品(或相对应的动物白蛋白和血清样品，例 如，小鼠、大鼠等等)与化合物-树脂缀合物温育，或流过用所述树脂填充 的层析柱。将1ml树脂(用比树脂上的NH2-基团100-100x倍摩尔过量的 结合分子修饰)与1ml HSA(2mg/ml)在PBS中温育30分钟。将所述树脂 负载到柱上，并且用3ml PBS洗涤。洗脱使用1ml 8M尿素或100mM三 乙胺进行。
结果在蛋白质凝胶上显现，即，血清输入物、来自树脂的流出液或洗 液以及来自树脂的洗脱液施加到聚丙烯酰胺凝胶的泳道中，所述凝胶使用 本领域已知的方法[36]进行电泳。对在凝胶上显现蛋白质条带(例如，染 色和显影)后得到的所述泳道的评价和比较[36]揭示与胆红素阳性对照相 比，各种化合物-树脂缀合物从血清样品中去除血清白蛋白的程度。特别地， 揭示所述化合物-树脂缀合物相对血清内包含的其它蛋白选择性去除(并且 因此结合)白蛋白的程度。
实施例19本发明所述的化合物的提高的成像性能(血管造影分析)
为了获得关于428-D-Lys-FAM的成像性质的功能性信息，进行视网膜 的荧光素血管造影分析。将荧光素和428-D-Lys-FAM静脉内注射到小鼠 中，并且在不同时间点拍摄眼底照片。荧光素血管造影照片证实药物代谢 动力学研究的结果。对于荧光素，即使在较早的时间点，血管染色也是弱 的，并且在20分钟后就检测不到。相反，428-D-Lys-FAM对血管的染色 持续更久并且允许显现更小的血管(0)。
使用Heidelberg视网膜血管造影(HRA I，Heidelberg Engineering，德 国)，一种共聚焦扫描-激光检眼镜，按照先前所述的步骤[参见参考文献0]， 进行扫描-激光检眼镜检查成像。简言之，将野生型C57BL/6小鼠用氯胺 酮(66.7mg/kg)和赛拉嗪(11.7mg./kg)麻醉，并且用托吡卡胺滴眼剂 (Mydriaticum Stulln，Pharma Stulln，德国)对它们的瞳孔进行散瞳。HRA特 有在短波长范围内的两种氩波长(488nm和514nm)和在长波长范围内的 两种红外二极管激光器(795nm和830nm)。488nm的激光波长用于荧光 素血管造影，屏障滤器为500nm。4只小鼠每只静脉内注射到尾部而接受 50nmol溶解在100μl的100mM Tris/HCl，105mM NaCl，pH 8.2中的荧光 素或428-DLys-FAM。使用相同的装置设置，在注射后时间点1，5，20和 60分钟，获得图像。特别地，在本研究中的亮度值固定不变，以便可以在 没有感光过度的条件下记录最亮的图像(428-D-Lys-FAM，在注射后1分 钟)。所有的检查均得到当地权威机构的核准(Anzeige v.2006年12月13 日，RP Tuebingen)并且按照动物在眼科和视觉研究中的应用的ARVO声明 进行。
实施例20本发明所述的化合物的提高的成像性能(MRI分析)
为了验证428-D-Lys作为白蛋白结合部分的方便性(portability)，将第 二造影剂，二乙烯三胺-五乙酸(DTPA)缀合到428-D-Lys上 (428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd)，并且进行评估。DTPA是核医学方法中的常 用螯合剂，并且Gd-DTPA是MRI中最广泛使用的造影剂。
在静脉内注射所述造影剂后，通过MRI成像方法，与 428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd的较慢外渗相比，DTPA-Gd快速外渗。脑部主 要血管的MRI分析(图18)揭示在注射了428-D-Lys-βAla-DTPAGd的小 鼠中信号轻度的更缓慢的减少，这与其更缓慢的清除模式(参考图15)相 一致。
所有的动物实验均严格遵守瑞士动物保护法进行。使用用于信号传送 和接收的环形低温表面线圈，在200MHz操纵的Bruker PharmaScan 47/16 MR系统(Bruker BioSpin GmbH)上进行MR测量。将小鼠使用在空气： O2(4∶1)中的1.4-1.5％异氟烷麻醉。进行检测扫描，以评估动物的解剖。 在两只C57/B16小鼠中研究两种造影剂DTPA-Gd和 428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd对纵向血液驰豫时间(T1)的缩短作用。为了这 一目的，使用下述顺序参数获得横向活动(cine)2D图像：视野(FOV)： 19×19×0.5mm3，矩阵尺寸：128×128，倾倒角：15°，TE/TR：3.0/14ms，平均 值：6，重复：50，时间分辨率(temporal resolution)：10.75s，总扫描时间：8分 57秒。通过刺激在图像平面上方(cranial to)的4mm厚的薄片(倾倒角：15°) 充满流入的血液。在20次重复的基线之后向尾静脉中注射造影剂。首先， 施用剂量1.2μmol DTPA-Gd，并且其次，在等待30分钟之后，施用剂量 1.2μmol 428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd。在大容器中分析MR信号的时程并且 与基线值标准化以用于比较。
实施例21HPLC纯化方法
HPLC纯化
所有的反应产物通过HPLC在Waters XTerra Prep RP18柱(5μM，10× 150mm)上利用从0.1％三氟乙酸到乙腈或从100mM TEAA pH 7到在80％ 乙腈中的100mM TEAA，pH 7的15分钟线性梯度进行纯化。除非特别指 明一种梯度，否则二者均可以用于纯化。在收集需要的级分之后，在真空 下去除溶剂和缓冲液。
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本发明提供一种新种类的白蛋白-结合化合物及其与药学目的分子、特 别是治疗剂和/或诊断剂的缀合物。以下所述药学目的分子可以简单称为 “药剂”。按照本发明，所述化合物和缀合物能够与白蛋白结合，即，它 们具有针对白蛋白的亲和性。因此，以下本发明的化合物和缀合物可以统 称为白蛋白结合剂。优选地，本发明的白蛋白-结合化合物还选择性地与白 蛋白结合，即，具有优于其它结合配偶体的偏爱性。所述化合物容易制备， 并且通过本领域已知的化学方法可以方便地缀合(即，连接、偶联、共价结 合)到宽范围的其它分子(特别是所述药剂)上。
当与诊断剂或治疗剂缀合时，本发明的白蛋白-结合化合物有利地改变 所述药剂的药物代谢动力学特性。特别地，本发明所述的缀合增加药剂的 血液循环时间(备选地称为血液清除，或血液清除时间)，即，生理半衰 期。因为利用本发明所述的白蛋白结合部分，所述药剂将与白蛋白结合保 留在血流中，故与本发明的白蛋白-结合化合物的缀合允许药剂较不快速地 清除和/或降解。因此，当应用于，例如，快速代谢或另外清除的药剂，例 如大分子，特别是抗体片段或较小的球状结合蛋白，或对于其更有效的和 更持久的保留在血流中是理想的任何其它药剂或分子例如荧光素、荧光素 衍生物、或用于成像目的MRI或X-射线研究的造影剂如用于MRI的 Gd-DTPA时，本发明的上述方面是有利的。
按照本发明的另一个方面，本发明的白蛋白-结合化合物赋予它们与之 缀合的药剂更好的组织渗透能力。在本文中，表述“组织渗透能力”可以 一方面是指药剂的组织渗透程度，或另一方面是指药剂的组织渗透性的特 异性或选择性，或是指组织渗透性的这些方面中的二者。
为了本发明的目的，通过在不同时间点后对需要的组织内的药物/试剂 的定量而测量组织渗透性。优选地，这通过在注射之前标记分子(例如， 放射性、荧光)或通过液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)直接定量而实现。 血液半衰期和组织-渗透性是相关的，如在参考文献18中关于不同形式的 抗体和抗体片段的情形的描述，其中表明血清半衰期的增加与在肿瘤内积 聚的增加相关。
因此，当应用于，例如可以使用白蛋白作为赋形剂而靶向它们的目的 作用位点的药剂时，本发明的上述方面将是有利的。因此，抗癌药可以有 效靶向利用白蛋白作为营养的快速生长的肿瘤。
由本发明所有上述方面产生的益处是将本发明的白蛋白-结合化合物 缀合到治疗剂或诊断剂上可以允许所述药剂以较低的剂量施用给患者或 受试者。因此，本发明的这种益处降低了所述药剂的副作用、不利反应或 并发症的危险和/或严重性。
例如，当将诊断显像剂如荧光团或造影剂缀合到本发明的化合物上 时，所得到的所述药剂的缀合衍生物，其能够与白蛋白非共价结合，其特 征在于，与非衍生化的药剂相比较，更缓慢的血液清除模式，并且允许例 如，从血管获得更高的信号强度(例如，荧光、磁共振、X-射线、正电子 发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机化断层显象(SPECT)信号)，因此 允许施用较低剂量并且还产生更好质量的诊断成像(例如，血管造影片、 MRI成像、和X-射线成像或PET)。这特别是例如关于荧光素及其衍生物 的情形，以及它们在眼科血管造影中的应用。
鉴于它们的亲和性、溶解性和药物代谢动力学行为，因此，本发明的 白蛋白-结合化合物理想地适用于，例如，与造影剂如Gd-DTPA偶联，因 此延长半衰期并且提高弛豫特性(优选地，与不与本发明的白蛋白-结合化 合物偶联的造影剂相比，缩短的弛豫时间)。
本发明的白蛋白-结合化合物的一般优点在于，由于它们相对小的尺寸 和良好的溶解性，它们可以用来赋予小分子药剂以白蛋白结合亲和性，而 基本不影响所述小分子药剂的溶解性或其它药理学相关特性。
本发明的白蛋白-结合化合物的其它优点在于，它们普遍是方便的，即， 高度通用的。即，所述化合物可以缀合到任何药剂上，条件是所述要缀合 的药剂包括能够与白蛋白-结合化合物键合的官能团，即，所述官能团能够 进行反应以便所述药剂变得与所述白蛋白-结合化合物键合，或条件是可以 将所述官能团引入到所述药剂中。按照本发明，本发明的化合物用于所述 缀合的应用，形成本发明的缀合物，其中本发明的白蛋白-结合化合物的残 基可以直接或间接地与目的药剂的残基键合。
本发明还提供所述缀合物的医学、治疗和诊断应用。
发明详述
本发明所述的化合物
本发明提供由式1表示的方便的白蛋白-结合化合物种类：
(式1)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链、或环状烃基基团，其任选地被 至多2个杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1- C10烃基基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10， CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，其包括支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中所述烃基任 选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br，I，OR9， OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和 ＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其盐。
本发明还提供由式2表示的白蛋白-结合缀合物：
(式2)
其中E是至多6个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多2个 杂原子中断，任选地被选自F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基 基团，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9， ＝O，＝S和＝NH的至多6个基团取代；
X是O或S；
A是NH，O，S或CR9R10；
D是至多10个原子的官能团，其带负电荷，或可以被去质子化以产生负 电荷；
R1和R2独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基，OR9， OCOR9，COOR9，CH2OR9，CHO，COR9，NR9R10和SR9；或者R1和R2连接形 成环状结构，其包含支链、非支链或环状C1-C10烃基(其中所述烃基任 选地被至多2个杂原子中断，并且任选地被独立地选自F，Cl，Br，I，OR9， OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和 ＝NH的至多3个基团取代)；
B包含至多30个碳原子的支链、非支链或环状烃基，任选地被至多10个 杂原子或至多20个氨基酸残基的肽链中断，其中B任选地被选自F，Cl，Br， I，＝O，OR9，OCOR9，COOR9，CN，NR9，NR9R10，＝S，和SR9的1-5个基团取 代，条件是B在基团D和基团A之间的链中包含至少3个原子；
Y’是能够与治疗剂或诊断剂分子结合的官能团的残基；
Z包含治疗剂或诊断剂分子的残基以及任选地接头；
并且R9和R10独立地选自下组：H和支链、非支链和环状C1-C10烃基， 或其药用盐。
按照优选实施方案，部分E包含由式3表示的部分：
(式3)
其中R3-R8独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起，R5和R6一起，或R7和R8一起任选地独立选 自下组：＝O，＝S和＝NH。
在本发明的其它优选实施方案中，部分E包括由式4表示的部分：
(式4)
其中R3和R4独立地选自H，F，Cl，Br，I，支链、非支链或环状C1-C10烃基， OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10，CH2NR9R10和SR9； 或者取代基对R3和R4一起任选地独立选自下组：＝O，＝S和＝NH。
本发明的化合物和缀合物能够结合白蛋白，即，它们具有针对白蛋白 的亲和性。它们的化合物亲和性优选是这样的，以使它们的解离常数为 100μM以下，更优选地为90，80，70，60，50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4，3， 2，或1μM以下，更优选地为90，80，70，60，50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4， 3，2，或1nM以下。
优选地，本发明的化合物和缀合物选择性与白蛋白结合。如果白蛋白 结合剂以比对备选结合配偶体更高的亲和力结合白蛋白，则认为所述白蛋 白结合剂关于备选的结合配偶体具有针对白蛋白的选择亲和性，其中关于 所述白蛋白结合剂与所述备选结合配偶体结合的解离常数是关于所述白 蛋白结合剂与白蛋白结合的解离常数的至少1.5-倍，优选地至少2-，3-，5-， 10-，15-，20-，25-，30-，35-，40-，45-，50-，60-，70-，80-，90-，100-200-，300-， 400-，500-，750-，或1000-倍。
在本发明的一个实施方案中，部分B以及基团D包含氨基酸残基。 氨基酸是包含酸和氨基官能团的任何有机分子。所述基团的一个或二者可 以任选地进行衍生化。氨基和酸性团可以相对于彼此处在任何位置，但是 氨基酸典型地包括2-氨基羧酸、3-氨基酸羧酸、4-氨基羧酸等，即，在优 选实施方案中，依据IUPAC命名习惯[0，0]，氨基基团处在编号为2，3，4，5， 6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20等的原子上。遵循本领域技 术人员已知的备选的命名习惯，所述氨基酸可以是α-，β-，γ-，δ-，ε-(等)直到 ω-氨基酸。在优选实施方案中，氨基酸可以是氨基羧酸[例如，0，0]。然而， 在其它实施方案中，氨基酸上的酸性团选自下组：-OPO3H，-PO3H， -OSO3H和-SO3H。在优选实施方案中，所述氨基酸是天然存在的氨基酸， 或其衍生物。在更优选的实施方案中，所述氨基酸是alpha(α-)氨基酸，其 中所述氨基酸可以是D-或L-氨基酸。优选地，所述氨基酸是选自下组的 氨基酸的D-或L-对映异构体：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸。最优选地， 所述氨基酸是D-赖氨酸或L-赖氨酸。在使用D-对映异构体的实施方案中， D-对映异构体的使用可以提供进一步降低新陈代谢速率并且由此减少从 血流中的清除的有益作用。
在优选实施方案中，当B或B-D包含氨基酸残基时，如本领域技术 人员应该理解的，Y可以方便地是所述氨基酸的氨基基团，最优选地是α-氨 基酸的alpha(α-)氨基基团。
按照本发明的另一个实施方案，B可在生理条件下裂解，优选地在来 源于本发明的缀合物中的治疗剂或诊断剂的部分的理想作用部位处发现 的体内条件下裂解。因此，按照一些实施方案，在所述部位发现的条件是 病理生理学条件，尽管按照其它实施方案，所述条件是在特定的组织或细 胞类型中发现的正常条件。病理生理学条件优选是在癌组织中、在肿瘤部 位、在炎症、凝固或病理斑形成(例如，动脉粥样硬化形成或淀粉样斑形 成)的部位等处发现的条件。
所述部分B优选地可通过水解裂解，更优选地通过酶的作用裂解，即， 酶促裂解。按照优选实施方案，所述裂解是通过酰胺分解或蛋白水解，即， 通过肽酶或蛋白酶作用。
按照本发明的优选实施方案，部分B因此可以通过酶裂解，即，B包 含可以作为酶的底物的裂解位点。优选地，所述酶是水解酶，更优选地是 酰胺分解酶、肽分解酶或蛋白水解酶(蛋白酶)。合适的酶裂解位点，特 别是蛋白水解位点，是本领域技术人员公知的[21]，并且包括用于由酶裂 解的位点，所述酶如金属蛋白酶(基质金属蛋白酶、或冠毛素(pappalysins) 或蛇毒蛋白酶)、丝氨酸蛋白酶(例如，凝血酶、弹性蛋白酶、凝血因子、 纤维蛋白溶酶、组织纤溶酶原激活物、尿激酶或纤溶酶原激活物)、或半 胱氨酸蛋白酶(诸如组织蛋白酶)、羧酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或谷氨酸 蛋白酶。优选地，所述裂解位点与选自下组的酶有关：葡糖醛酸糖苷酶、 尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶、前列腺特异性抗原、人腺激 肽释放酶2、纤维蛋白溶酶，组织蛋白酶B和PSMA。
按照本发明的某些实施方案，部分B包含肽。所述肽优选地包含2个 或更多个氨基酸残基，优选为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19，20个氨基酸残基。最优选地，所述肽包含上述裂解位点[21]，即， 优选地蛋白酶裂解位点，并且其优选在特定的病理生理条件下裂解。
按照本发明的优选实施方案，当本发明化合物或缀合物的部分B不包 含可裂解的接头时，本发明所述的化合物的一般种类可以进一步通过可裂 解的接头、优选是可在体内水解的接头扩大。因此，在优选实施方案中， 可以利用可以通过蛋白酶裂解的一个或多个氨基酸接头或肽、可以在37 ℃水解的席夫碱[20]、可裂解的酯类或表现出在充分的体外稳定性与充分 的体内快速且优选选择性裂解性之间的适宜的折中(compromise)的其它化 学部分，使治疗剂或诊断剂与本发明的白蛋白-结合化合物偶联。
如上文参考式2提及的，因此接头可以任选地包含在部分Z内，所述 接头优选是可裂解的，更优选是可在体内水解的，最优选是在限定的条件 下在体内选择性裂解。其适用于本文中其中定义了Z的其它式。
基团D优选地是酸性团或其共轭碱，并且更优选地选自下组：OPO3H， PO3H，OSO3H，SO3H和COOH，优选为COOH，或其共轭碱(磷酸盐，膦酸 盐，硫酸盐，磺酸盐和羧酸盐)，其中在前述式中的氢原子H用负电荷取 代。在存在适当的质子受体(碱)的条件下，酸性团去质子化产生它们的 共轭碱。技术人员明白并且能够预测发生所述去质子化的环境。
在本发明的化合物和缀合物中的烃基或烃基残基是烃基团的残基， 即，烃链基团，其优选地独立选自下组：烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷 基。
当用于本文时，术语“烷基”包括具有1-30个碳原子的直链、支链 和环状链基团，优选具有1-20，1-15，1-10，1-8，1-6，1-4，1-3或1-2个碳原子 的直链、支链和环状链基团。烷基残基的具体实例为甲基、乙基、丙基、 异丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷 基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、 二十烷基(icosyl)、二十一烷基(henicosyl)、二十二烷基、二十三烷基、 二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基(heptacosyl)、二十八 烷基、二十九烷基或三十烷基(triacosyl)，包括其各种支链和/或环状异构 体，例如，叔-丁基或异戊基等。
当用于本文时，术语“环状”包括术语“多环”，其是指具有多于一 个环结构的结构。特别地，术语“环状”还指螺环结构，其中两个或更多 个环具有一个共用原子，和稠合多环结构，其中两个或更多个环具有至少 两个共用原子。所述稠合多环结构的优选实施方案是金刚烷或其残基(金 刚烷基基团)。
当用于本文时，术语“烯基”包括具有2-30个碳原子的直链的、支链 和环状的链基团，优选地具有2-20，2-15，2-10，2-8，2-6，2-4，或2-3个碳原 子的直链的、支链和环状的链基团，其包含至少一个碳-碳双键。“烯基” 基团的具体实例是关于烷基基团提供的那些的各种烯不饱和等价物，其根 据本领域技术人员已知的习惯[17，19]命名，取决于一个或多个碳-碳双键 的数目和位置，例如，丁二亚基，1-丙-3-亚基。“烯基”基团优选地包含 至少1个、更优选地至少2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个双 键，其中双键优选地位于烃基链的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14， 15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28或29。
当用于本文时，术语“炔基”包括具有2-30个碳原子的直链的、支链 和环状的链基团，优选地具有2-20，2-15，2-10，2-8，2-6，2-4，或2-3个碳原 子的直链的、支链和环状的链基团，包含至少一个碳-碳三键。“炔基”基 团的具体实例是关于烷基和烯基基团给出的那些的各种炔不饱和等价物， 其根据本领域技术人员已知的习惯[17，19]命名，取决于一个或多个碳-碳 三键的数目和位置。“炔基”基团优选地包含至少1个、更优选地至少2，3， 4，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个三键，其中双三键优选地位于烃 基链的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22， 23，24，25，26，27，28或29处。此外，术语“炔基”包括还包含至少一个碳 -碳双键的“炔基”基团，即，落入本文所用的“炔基”和“烯基”基团的 定义中的“炔基”基团。
当用于本文时，术语“芳基”是指具有2-30个、优选2-20个、2-10 个、更优选2-6个碳原子的单环或多环或稠合多环芳香环系统。
当用于本文时，术语″芳烷基″是指包含如本文所定义的至少一个烷基 基团和至少一个芳基基团的基团。在如本文定义的芳烷基基团中，所述芳 烷基通过烷基基团与本发明的化合物或缀合物的另一个部分键合，例如苯 甲基基团。
当用于本文时，术语“杂原子”包括N，O，S，P，优选为N和O。
在其中R1和R2连接以一起形成环结构的实施方案中，所述环结构优 选是3-10个、更优选地，3-9，3-8，3-7，3-6，3-5，3-4或4个碳原子的直链或 支链烃基链，其在式1或式2的苯环的两个位置处键合，即与所述苯环形 成两个键，以便形成与所述苯环稠合的环结构。优选地，所述两个键优选 位于所述苯环的间位(3-)和对位(4-)，位于邻位(2-)和间位或位于邻位和对 位。所述环结构任选地由至多2个、优选地1个或0个杂原子打断。所述 环结构任选地被选自下列各项的至多3个、优选地至多5，4，3，2，1或0个 基团取代：F，Cl，Br，I，OR9，OCOR9，COOR9，CHO，COR9，CH2OR9，NR9R10， CH2NR9R10，SR9，＝O，＝S和＝NH。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述环结构是这样的C4链片段 (1，4-双自由基)，其通过其1-和4-原子与式1或式2的所述苯环连接，从 而形成与所述苯环稠合的六元环，优选地在所述苯环的间位和对位，即， 优选地形成间位-和对位-稠合的六元环，如在化合物539的苯环中(图1)， 其是一种有效用于合成本发明的化合物和缀合物的化合物。
按照本发明的优选实施方案，R1和R2独立地选自下组：I，Br，CH3，和 H。更优选地，R1位于对位，并且选自下组：I，Br和CH3，并且R2是H。
在一些优选实施方案中，R3-R8是H。独立地，在优选实施方案中， 其R9和R10也可以是H。
在本发明的白蛋白-结合化合物或在与其连接的药剂上的任一个官能 团、或多个官能团可以用来缔合所述化合物和药剂，条件是在所述化合物 和所述药剂上的官能团能够进行反应，以便所述化合物与所述化合物连 接。优选地，所述连接，即，缀合，通过共价键合，然而也考虑非共价键 合(即，氢键、离子键、范德华键)。在本说明书中，药剂与化合物的键 合、连接偶联或缀合意指所述药剂与化合物或它们的残基直接或通过其他 分子部分间接连接。
按照优选的实施方案，Y选自下组：-NH2，-SH，-OH，-CHO，-NCS， -NCO和H。优选地，Y是-NH2。当Y是-NH2时，本发明的化合物还包 括其质子化的形式(共轭酸)(NH3+)。
在本发明化合物的优选实施方案中，B(Y)-D包含由式5表示的部分：
(式5)
在本发明化合物的其他优选实施方案中，B(Y)-D包含由式6表示的 部分：
(式6)
按照其他优选实施方案，本发明的化合物由式7表示：
(式7)
按照其他优选实施方案，本发明的化合物由式8表示：
(式8)
按照优选实施方案，B包含选自下组的残基：
3-[2-(aminyl乙基)二硫代]丙酰，N-[α-马来酰亚胺-3’-基-乙酰基，N，N’-1，4- 双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-丁烷，N，N’-1，6-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷， N，N’-1，2-双-马来酰亚胺-3’，3”-二基-乙烷，N，N’-1，4-双-马来酰亚胺-3’，3”- 二基-2，3-二羟基丁烷，N-[β-马来酰亚胺-3’-基-丙酰，N-[β-马来酰亚胺-3’-基 -脲氨基(semicarbazyl)，N，N’-1，8-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-三甘醇， N，N’-1，11-双-马来酰亚胺-3’，3’-二基-四甘醇，环庚基，二甲基己二酰亚胺 基，二甲基庚二酰亚胺基(pimelimidyl)，二甲基环庚二亚胺基(suberimidyl)， 1，4-二-[3′-(2′-含硫基)-丙酰胺基]丁烷，戊二酰基，二硫代二丙酰基，酒石 酸基(tartaryl)，二甲基3，3′-二硫代二丙酰亚胺基，3，4-二硫代-N，N’-1，6-双- 马来酰亚胺-3’，3”-二基-己烷，乙二醇双-琥珀酰，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己 酰基，N-7-马来酰亚胺-3’-基-己酰基脲氨基，N-[γ-马来酰亚胺-3’-基-丁酰基， 1，6-己烷-二-乙烯砜，N-[κ-马来酰亚胺-3’-基-十一酰，N-[κ-马来酰亚胺-3’- 基-十一酰脲氨基，4-[N-马来酰亚胺-3’基-甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己 酰基]，6-[3-巯基-]丙酰胺基己酰，间-[马来酰亚胺-3-基]-苯甲酰，4-(4-N-马 来酰亚胺-3’-基苯基)丁酰脲氨基，己二酰，3-巯基-丙酰脲氨基，N-[对-马来 酰亚胺-3-基苯基]脲基，2-巯基乙酰基，3-巯基丙酰，3-[溴乙酰氨基]丙酰，2- 碘乙酰基，4-[碘乙酰基]氨基苯甲酰，4-[N-马来酰亚胺-3’-基甲基]环己烷 -1-羧基，4-[对-马来酰亚胺-3’-基]丁酰，6-[β-马来酰亚胺-3-基-丙酰氨基]己 酰基，和对-[2-巯基乙基]苯甲酰，和4-硫代丁二酰亚胺酰胺基。
按照本发明的缀合物的优选实施方案，Y′选自下组：-NH-，-S-，-O-， -CO-，-NHCS-，-NHCO-和键。优选地，所述键是共价键。最优选地，Y′ 是-NH-。
按照本发明的缀合物的优选实施方案，B(Y′-Z)-D包含由式9表示的 部分：
(式9)
按照本发明的缀合物的其他优选实施方案，B(Y′-Z)-D包含由式10表 示的部分：
(式10)
按照本发明的特别优选的实施方案，本发明的缀合物包含由式11表 示的部分：
(式11)
按照本发明的其他优选的实施方案，本发明的缀合物包含由式12表 示的部分：
(式12)
在其他优选的实施方案中，本发明的化合物或缀合物，基团
选自由下列各项组成的组：
(式13)
(式14)
(式15)
(式16)
(式17)
(式18)
(式19)
(式20)
(式21)
(式22)
(式23)
(式24)
按照本发明，要缀合到本发明的化合物上的治疗剂或诊断剂可以是任 意类型的药剂。术语“诊断剂”包括显像剂。优选地，本发明的化合物可 以缀合到有机化合物、金属有机化合物、包括放射性核素的化合物、核苷 酸、核酸、聚合物、肽、核肽(nucleopeptide)、蛋白、脂质、类固醇、或 其任一个的衍生物或它们的组合。优选地，所述药剂选自下组：小分子、 肽、抗体、治疗性蛋白、反义寡核苷酸、和包含放射性核素的无机或有机 分子或复合物。
按照本发明，由于它们相对小的尺寸和良好的溶解性，所述白蛋白结 合剂可以用于与小分子药剂缀合，而基本上不影响，优选基本上不减少所 述小分子药剂的溶解性或其他药理学相关特征。优选地，与本发明所述的 化合物缀合的药剂的溶解性为在不缀合时所述药剂的至少1％，更优选地 至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98 ％，99％或100％。
在本文中，术语“小分子”是指具有小于约1500Da、特别是小于1200， 1000，900，800，700，600，500，400，350，300，250或200Da的分子量的分子， 优选是有机分子。
在本发明中，术语“蛋白”、“肽”或“多肽”可互换使用，并且是指 任意长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链的或支链的，它可以包 含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经天然或 通过干涉修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰 化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，诸如与标记成分缀合。所述定义还 包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(包含，例如，非天然氨基酸 等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。多肽可以作为单链或缔合链存 在，并且本发明的许多多肽(may of)可以是天然或非天然糖基化的(即， 所述多肽具有与在相对应的天然存在的多肽中发现的糖基化模式不同的 糖基化模式)。
按照本发明的优选实施方案，本发明的化合物与之缀合的、或其残基 包括在本发明所述的缀合物中的治疗剂分子是用于治疗下列各项的药物： 癌症，肿瘤，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染，炎症， 神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，激素病症，葡萄糖代 谢病症或糖尿病，或是用于避孕的药物。
在本发明中，术语“治疗(therapy)”、“治疗(treatment)”、“要治疗 (to treat)”和“治疗性的(therapeutic)”，分别包括“预防”、“防止”、“要 防止”和“预防性的”方面。
按照一些实施方案，所述治疗剂是用于治疗下列各项的药物：结肠直 肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、胃癌或卵巢癌、或淋 巴瘤、白血病、星形细胞瘤、高级星形细胞瘤、或肝细胞癌。在一个优选 实施方案中，所述药剂是用于治疗快速生长的肿瘤(优选地，具有小于120， 100，80，或60天的倍增时间的肿瘤)的药物。在本文中，术语“肿瘤倍增 时间”是指肿瘤体积加倍的时间(肿瘤体积倍增时间，参见参考文献22)， 如例如，在参考文献23中测量。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述治疗剂分子是用于治疗特征 为快速的白蛋白摄取的肿瘤的药物。
当本发明的白蛋白-结合化合物与某种药剂直接或通过其他连接部分 (接头)缀合时，并且本发明所定义的部分B或所述接头在特定条件下、 优选在病理生理条件下可裂解时，所述裂解反应的产物不再保留对白蛋白 的亲和性，或其对白蛋白的亲和性减小。按照本发明的具体实施方案。因 此本发明所述的缀合物包含在所述接头裂解后能够穿过和/或组织或细胞 的药剂或药物。按照本发明的这一方面，所述缀合物因此可以是药物前体。
按照本发明的其他优选实施方案，诊断剂分子是用于诊断影像学技 术、荧光、血管造影术、荧光血管造影术、超声波检查法、基于磁共振的 诊断方法、磁共振成像、X-射线成像、核医学、单光子发射计算机化断层 显象(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)的药剂。在特别优选的实施方案 中，所述药剂是用于眼科血管造影术的荧光团或用于X-射线或磁共振成像 的造影剂。最优选地，所述药剂包括荧光素或钆(III)-二乙基三胺五乙酸 (Gd-DTPA)、或其残基。DTPA的177Lu-复合物同样是优选的。
在优选实施方案中，所述治疗剂或诊断剂通过硫脲部分与部分B连接 (如用在化合物“428-D-Lys-FITC”中的荧光素试剂所示例；参见下文，在 “化合物的合成”(2)和实施例6中)或通过酰胺部分与部分B连接(如用 在化合物“428-D-Lys-FAM”中的荧光素试剂所示例；参见下文，在“化合 物的合成”(1)和实施例7中)。
本发明的缀合物的实例(428-Lys-FITC，428-Lys-FAM，和 428-Lys-β-Ala-DTPA-Gd)的结构显示在图7中。
制备本发明的化合物和缀合物
本发明的白蛋白-结合化合物和缀合物可以按照本领域技术人员公知 的方法合成并且偶联到携带适当的官能团的药物上，例如合成有机化学的 方法[24，特别是25]。
按照优选实施方案，本发明的化合物由图1所示的优选的化合物所示 例的羧酸前体起始合成。羧酸前体可以商购(例如，购自西格玛-奥得里奇 (SIGMA-ALDRICH)，http://www.sigmaaldrich.com，以下称为西格玛 (SIGMA)，西格玛-奥得里奇稀有化学品库(The Sigma-Aldrich Library of Rare Chemicals)，以下称为SALOR， http://cds.dl.ac.uk/cds/datasets/orgchem/isis/salor.html或Maybridge， http://www.maybridge.com)，或者可以通过本领域已知的方法合成[24]。图 1所示的优选的羧酸前体可从下述来源获得：
分子号 (参见.图1) 供应商 目录号 326 SALOR R787981 428 SIGMA(西格玛) I5634 533 SALOR S532649 535 SALOR S714461 536 SALOR S347213 539 SALOR R244996 624 Maybridge MO01273CB 622 Fluka 78250 625 Trans World Chemicals (Trans World化学品) I 1232 630 Biosynth(生物合成) M 4301 631 Fluka 65170 632 Aldrich(奥得里奇) 330339
在其中X为O且A为NH的实施方案中，部分B优选地与羧酸前体 成分的羧酸缀合，如在实施例1中关于化合物428所述，由羧酸前体成分 和赖氨酸、或7-氨基庚酸和赖氨酸作为提供部分B的成分。
在其中X为O且A为O的实施方案中，所述羧酸前体成分的羧酸基 团优选地与等摩尔量的偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)，三苯膦 (triphenylphosphane)(PPh3)和包括部分B和羟基(-OH)基团的成分反应。 在其中X为O且A为S的实施方案中，实施同样的步骤，不同的是包含 部分B的成分包含硫羟(巯基，-SH)替代羟基基团。
在其中X为O且A为CH的实施方案中，所述羧酸前体成分的羧酸 基团优选地首先通过与SOCl2和痕量的DMF反应转化成酰基氯；备选地 在CCl4中与PPh3反应。这之后是加入ZnBr-衍生物。
在其中X为S的实施方案中，在上述关于其中X为O的实施方案的 缀合反应之后，使用Lawesson试剂将C＝O基团转化为C＝S。
通常，提供部分B的分子的官能团(例如，NH2，COOH，OH，SH等)， 除了要与羧酸前体成分偶联的基团之外，优选地被保护(例如，使用Fmoc 基团保护NH2、或作为叔-丁基酯保护COOH)。去保护优选地如实施例1 中所述在纯化之前实现，或通过本领域已知的其他方法实现。
按照某些优选实施方案，对于白蛋白-结合化合物与药剂的偶联，并且 特别是对于当B包含肽时合成部分B，熟练的技术人员可以利用公知的肽 化学技术[24-29]。
在其中Y为NH2的优选实施方案中，该伯氨基基团可以用宽范围的 试剂修饰用于与目的分子缀合(偶联)。在优选的实施例中，所述白蛋白- 结合部分的所述NH2基团可以通过下列进行修饰：
1)通过在用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)/NHS(或 sulfo-NHS)，HOBt(1-羟基苯并三唑)，HBTU(O-(苯并三唑-1- 基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸酯)，HATU(O-(7-氮杂苯 并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)，TSTU(N，N，N′，N′-四 甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸酯)及其他活化后，与如琥珀 酰亚胺(NHS)酯，sulfo-NHS酯，酰基氯，酰基酐，羧酸形成酰胺键；
2)通过与异氰酸酯/异硫氰酸酯反应时形成脲/硫脲，和
3)通过与醛形成席夫碱。
在本发明的实施方案中，其中使用双官能接头增加用于连接药物与本 发明的白蛋白-结合部分的化学偶联基团的范围，特别优选引入下列各项：
1)通过与NHS-酯(例如，4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯， GMBS)缀合引入马来酰亚胺，或
2)通过Traut’s试剂或保护的硫醇引入硫羟基团。
备选地，优选使用硫羟基团的化学修饰(例如，使用马来酰亚胺基或 碘乙酰胺)使本发明的白蛋白-结合化合物与小的有机分子药物或蛋白质药 物偶联。在本发明的一个实施方案中，所述硫羟基团位于要偶联到本发明 的白蛋白-结合化合物上的药剂上。在另一个实施方案中，Y是SH，并且 硫羟基团可以直接位于本发明的白蛋白-结合化合物上。在另一个实施方案 中，SH基团可以通过上述双官能接头的方式引入或加入到所述白蛋白-结 合化合物中。
在实施例中提供用于制备本发明的代表性化合物的具体方法。
本发明所述的白蛋白-结合部分还可以通过非共价方式，例如，通过 利用核苷酸、或修饰的核苷酸、部分的碱基配对，与药物连接。
药物组合物
本发明提供本发明的白蛋白-结合缀合物或其药用盐，其用作药物。 本发明还提供包括本发明所述的白蛋白-结合缀合物或其药用盐、或本发明 的白蛋白-结合化合物与治疗剂或诊断剂结合的残基(residue)或其药用盐、 和药用载体的药物组合物。
还提供本发明的白蛋白-结合缀合物、或本发明的白蛋白-结合化合物 用于制备药物，优选地用于治疗癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、 真菌或其他感染，炎症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁 症，激素病症，或用于避孕。
药物组合物的制备是本领域技术人员公知的。本发明的白蛋白-结合 缀合物的药用盐可以通过常规方法制备，诸如通过使白蛋白-结合缀合物的 游离碱和/或酸分别与至少化学计量的理想的形成盐的酸或碱反应而制备。
本发明的白蛋白-结合缀合物的药用盐包括具有无机阳离子的盐，和 与有机碱形成的盐，所述无机阳离子诸如钠、钾、钙、镁、锌、和铵。适 当的有机碱包括N-甲基-D-葡糖胺，精氨酸，苄星青霉素(benzathine)，二乙 醇胺，乙醇胺，普鲁卡因和氨丁三醇。本发明所述的药用盐还包括源自有 机酸或无机酸的盐。适当的阴离子包括乙酸盐、己二酸盐、苯磺酸盐，溴 化物，樟脑磺酸盐(camsylate)，氯化物，柠檬酸盐，乙二磺酸盐(edisylate)， 依托酸盐，延胡索酸盐，葡庚糖酸盐，葡糖酸盐，葡糖醛酸盐，马尿酸盐， 海克酸盐，氢溴酸盐，盐酸盐，碘化物，伊西酸盐，乳酸盐，乳糖酸盐，马 来酸盐，甲磺酸盐，溴甲烷，甲基硫酸盐，萘磺酸盐，硝酸盐，油酸盐，扑 姆酸盐，磷酸盐，聚半乳糖醛酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，磺基水 杨酸盐，单宁酸盐，酒石酸盐，对苯二酸盐，甲苯磺酸盐和三乙基碘 (triethiodide)。
本发明的白蛋白-结合缀合物的药物剂型可以以即时释放、控释、缓 释、或靶向药物-递送系统提供，尽管由于存在本发明的白蛋白-结合部分， 即，包含在本发明的白蛋白-结合缀合物内的本发明所述的白蛋白-结合化 合物的残基，包含在本发明的药物组合物中的药物的药物代谢动力学特性 也受到影响。
常用剂型包括，例如，ovules，植入物，贴片，脂质体，片剂，糖衣丸， 锭剂，软或硬壳胶囊，无定形的或结晶粉末，泡腾粉剂或片剂，气雾剂，冻 干制剂，溶液和混悬液，(微-)乳液，油膏，凝胶，霜剂，糊剂，泡沫剂，栓 剂。取决于所用的施用途径，涂覆或施用药剂可能需要专门的装置，诸如， 例如，注射器和针头、吸入器、泵、注射笔、涂药器、专用瓶、或其他用 于施用的装置，其还可以植入体内。
药物剂型通常由药物、赋形剂、和容器/密闭系统组成。一种或多种赋 形剂，也称为无活性成分，可以加入到本发明的白蛋白结合剂中，以改进 或促进药物的制备、稳定性、施用和安全性，并且可以提供实现理想的药 物释放模式的方式。因此，添加到所述组合物中的赋形剂类型可以取决于 各种因素，诸如例如，药剂和/或白蛋白-结合部分的物理和化学特性，施 用途径，和制备方法。药用赋形剂在本领域内是可获得的，并且包括在各 种药典中列出的那些(参见，例如，[30，31])。
本发明的白蛋白结合剂的药物剂型可以通过本领域公知的任何方法 制备，诸如例如，通过常规混合、筛分、溶解、熔融、粒化、糖衣丸-制备、 片剂化、混悬、挤压、喷雾-干燥、研细、乳化、(纳米/微-)包封、包埋、 或冻干处理。如上所示，本发明的组合物可以包括一种或多种生理学可用 的无活性成分，其促进将活性分子加工成药用制剂。
正确的配制依赖于需要的施用途径。对于静脉内注射，例如，组合物 可以配制在水溶液中，如果需要的话，使用生理相容的缓冲剂，包括，例 如，磷酸盐、组氨酸、或柠檬酸盐，用于调节制剂pH，和使用张度剂， 诸如例如，氯化钠或葡萄糖。对于透黏膜或鼻施用，半固体、液体制剂、 或贴剂可能是优选的，可能包含渗透增强剂。这样的渗透剂通常在本领域 中是已知的。对于口服施用，所述白蛋白-结合缀合物可以配制在液体或固 体剂型中，并且配制成即时或控释/缓释制剂。适用于受试者口服的剂型包 括片剂、丸剂、糖衣丸、硬和软壳胶囊、液体、凝胶、糖浆、结晶浆液、 混悬液、和乳液。本发明所述的药物组合物还可以配制成直肠或阴道剂型， 诸如栓剂或滞留灌肠剂，例如包含熟练的技术人员已知的常规栓剂基质， 诸如可可脂、甘油酯、甘油化的明胶、去极化明胶、聚乙二醇、聚山梨酸 酯、或其他。
对于口服施用，本发明的白蛋白-结合缀合物将通常以固体剂型提供， 例如以片剂或胶囊的形式，或作为水溶液或混悬液提供。
固体口服剂型可以使用赋形剂获得，所述赋形剂可以包括惰性稀释 剂、填充剂、崩解剂、粘合剂(干的和湿的)、分解延缓剂、润滑剂、助 流剂、抗粘附剂、阳离子交换树脂、湿润剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、 增甜剂和调味剂。这些赋形剂可以是合成的或天然来源的。所述赋形剂的 实例包括纤维素衍生物、柠檬酸、磷酸二钙、明胶、碳酸镁、十二烷基硫 酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲 酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸或其盐、糖(即，葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、 滑石、西黄蓍胶浆、植物油(氢化)、和蜡。乙醇和水可以作为粒化辅助 物。在某些情形中，用例如口味掩饰膜(taste-masking film)、抗胃酸膜、或 释放延迟膜包被片剂是理想的。天然和合成的聚合物，与着色剂、糖、和 有机溶剂或水结合，通常用于包被片剂，形成糖衣丸。当与片剂相比优选 胶囊时，药物粉末、或其混悬液、溶液可以以相容的硬或软壳胶囊递送。
适当的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖。 玉米淀粉和褐藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶。润滑剂， 如果存在的话，通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用 物质如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯包被，以延迟在胃肠道中的吸 收。
口服应用的胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊，在所述硬明胶胶囊 中，活性成分与固体稀释剂混合，在所述软明胶胶囊中，活性成分与水或 油如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
对于通过皮肤或黏膜的局部施用，所述白蛋白结合剂可以配制在皮肤 贴片中，作为半固体或液体制剂，例如，凝胶、(微)乳液、油膏、溶液、 (纳米/微)混悬液、或泡沫剂。白蛋白结合剂渗透进入皮肤或黏膜以及下 面的组织可以进行调节，例如，使用渗透增强剂；亲脂、亲水、和两亲性 赋形剂的适当的选择和组合，其包括水、有机溶剂、蜡、油、合成的和天 然的聚合物、表面活性剂、乳化剂；通过pH调节；和使用络合剂。其他 技术，诸如离子导入，可以用来调节本发明的白蛋白结合剂的皮肤渗透。 透皮或局部施用将是优选的，例如，在需要具有最小系统暴露的局部递送 的情形中。
对于通过吸入施用，或施用到鼻，按照本发明使用的白蛋白结合剂便 利地以下列形式递送：溶液，混悬液，乳液，或来自加压包装或喷雾器的 半固体气雾剂，通常与推进剂如来源于甲烷和乙烷的卤化碳、二氧化碳、 或任何其他适用气体一起使用。对于局部的气雾剂，烃如丁烷、异丁烷、 和戊烷是有效的。在加压的气雾剂的情形中，适当的单位剂量可以通过提 供递送定量的阀门确定。例如，可以配制明胶胶囊和药筒以用在吸入器或 吹药器中。这些典型地包含白蛋白结合剂和适当的粉末基质如乳糖或淀粉 的粉末混合物。
配制用于通过注射进行肠胃外施用的组合物通常是无菌的，并且可以 以单位剂型存在，例如，存在于安瓿、注射器、注射笔、或多剂量容器中， 后者通常包含防腐剂。组合物可以采取这样的形式，如在油性或水性赋形 剂(vehicle)中的混悬液、溶液、或乳液，并且可以包含配方试剂，如缓 冲剂、张度剂、粘度增强剂、表面活性剂、混悬剂和分散剂、抗氧化剂、 生物相容性聚合物、螯合剂、和防腐剂。取决于注射位点，所述赋形剂可 以包含水、合成的或植物油、和/或有机共溶剂。在某些情形中，诸如使用 冻干的产物或浓缩物的情形中，所述肠胃外制剂将在施用之前重构或稀 释。长效制剂，提供本发明药剂的控释或缓释，可以包含可注射的纳米/ 微米粒子或纳米/微米或未微粉化的晶体的混悬液。不依赖由本发明所述的 白蛋白-结合部分实现的血液循环时间的增加，除了本领域已知的其他物质 之外，聚合物如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、或它们的共聚物可以作为控释 /缓释基质。其他长效制剂递送系统可以以需要切口的植入物和泵的形式存 在。
适用于静脉内注射本发明的分子的载体是本领域公知的，并且例如， 包括包含碱诸如例如氢氧化钠的基于水的溶液，以形成离子化试剂，蔗糖 或氯化钠作为张度剂。所述基于水的溶液可以包括包含磷酸盐或组氨酸的 缓冲液。可以加入共溶剂，诸如例如，聚乙二醇。这些基于水的系统有效 溶解本发明的药剂，并且在系统施用时产生低的毒性。在不破坏溶解性和 毒性特征的条件下，溶液系统成分的比例可以显著变化。此外，成分的身 份可以变化。例如，可以使用低毒性表面活性剂，诸如聚山梨酯或泊洛沙 姆，也可以使用聚乙二醇或其他共溶剂，可以加入生物相容性聚合物诸如 聚乙烯吡咯烷酮，并且其他糖和多元醇可以替代葡萄糖。
方便的白蛋白结合剂的应用/治疗方法
本发明提供本发明的白蛋白-结合化合物用于结合针对白蛋白的治疗 剂或诊断剂分子的应用，即，用于赋予所述药剂针对白蛋白的亲和性，或 用于增加所述药剂针对白蛋白的亲和性。优选地，所述药剂的亲和性增高 至少1.5倍，更优选地增高至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70， 80，90，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500， 2000，2500，3000，3500，4000，5000，7000，104，105，106，108或109倍。
本发明由此提供所述化合物用于减小所述药剂在受试者体内代谢或 降解的速率，并且由此用于增加治疗剂或诊断剂分子的血液循环时间(也 称为血液清除时间，“血液清除”，或关于生理半衰期表示)的应用。此外， 本发明因此提供所述化合物用于增加所述药剂在血管空间内的停留时间 的应用。优选地，所述血液循环时间或所述药剂在血管空间内的停留时间 增加至少1.5倍，更优选地增加至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60， 70，80，90，100，150，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500， 2000，2500，3000，3500，4000，5000，7000，104，105，106，或107倍。
此外，本发明提供所述化合物提高治疗剂或诊断剂分子的组织渗透能 力的应用。组织渗透能力的提高意味着使用本发明的缀合物导致在特定组 织中或在特定作用部位处所述缀合物和/或其中包含的或在接头部分分裂 后从其释放的治疗剂或诊断剂的更多的积累，该积累高于单独的所述治疗 剂或诊断剂，即，在不与本发明所述的白蛋白-结合化合物缀合的条件下， 所获得的积累。优选地，所述组织渗透性增加至少1.5倍，更优选地增加 至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250， 300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000， 5000，7000，104，105，106，或107倍。
此外，本发明提供治疗疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述 治疗的患者施用有效剂量的本发明所述的白蛋白-结合缀合物，或与治疗剂 或诊断剂键合的本发明的白蛋白-结合化合物。在优选实施方案中，所述疾 病或病症是癌症，心血管疾病，肥胖症，病毒、细菌、真菌或其他感染， 炎症，神经病症，变性神经病症，精神病或病症，抑郁症，或激素病症。
按照本发明的一个优选实施方案，所述方法包括利用与本发明的白蛋 白-结合化合物缀合而使所述药剂靶向组织或作用部位。所述部位优选包括 癌细胞，肿瘤，炎症、凝固或病理斑形成(例如动脉粥样硬化或淀粉样斑 形成)部位，或具有可以利用所述药剂治疗、显现、或诊断的生理或病理 特征的任何其他部位。
按照优选实施方案，所述组织特征在于高的白蛋白摄取速率。优选地， 所述组织是肿瘤，更优选地是结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头 颈癌、胰腺癌、胃癌或卵巢癌、或淋巴瘤、白血病、星形细胞瘤、高级星 形细胞瘤、或肝细胞癌。在一个优选实施方案中，所述组织是快速生长的 肿瘤(优选地，具有小于120，100，80，或60天的倍增时间的肿瘤)。
按照其他优选实施方案，所述方法包括通过白蛋白-结合部分，即，本 发明的白蛋白-结合化合物或其残基，使治疗剂或诊断剂和白蛋白结合的步 骤，由此使用血清白蛋白作为载体，将所述药剂递送至患者中所述药剂的 理想作用部位，或特定组织。在优选实施方案中，在所述作用部位或在所 述组织中，所述药剂从白蛋白释放。此外，优选地，药剂的释放通过化学 处理，优选地通过连接所述药剂和本发明所述的白蛋白-结合部分的可裂解 的接头的裂解实现，其中所述裂解优选地是蛋白水解裂解。按照一个实施 方案，所述药剂在所述化学处理之前被肿瘤细胞摄取。
在本发明方法的一些实施方案中，要与本发明的白蛋白-结合化合物缀 合的药剂阻滞细胞外靶标(例如，受体、细胞因子、生长因子、和血液酶)。
按照本发明的另一个方面，本发明提供所述化合物或缀合物用于医学 成像目的的应用。表述“医学成像”包括“诊断成像”或“成像诊断学”。 本发明所述的这样的应用优选地包括通过与本发明的化合物缀合而修饰 治疗剂或诊断剂，以形成本发明的缀合物。优选地，要与本发明的化合物 缀合的药剂是诊断剂。本发明所述的化合物和缀合物用于医学成像目的的 应用还优选地包括给患者施用有效剂量的本发明的缀合物。如在本说明书 其他部分描述的，所述医学成像优选地是基于荧光的方法、血管造影术、 荧光血管造影术、超声检查法、基于磁共振的诊断方法、磁共振成像、X- 射线成像、医学、单光子发射计算机化断层显象(SPECT)或正电子发射断 层扫描(PET)。
施用模式
本发明的白蛋白-结合缀合物可以直接或在包含赋形剂(见上文)的药 物组合物中递送，这是本领域中公知的。所述治疗方法包括给受试者施用 治疗有效量的本发明的白蛋白-结合化合物。
当用于本文时，术语“治疗有效量”是指治疗、改善、或预防目的疾 病病症、或表现出可检测的治疗或预防作用所需要的本发明所述的缀合物 的量。一般地，治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定或在动物模型中， 例如，在非人灵长类动物、小鼠、兔、狗、或猪中估算。动物模型还可以 用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后可以利用这些信息来确定在人 中施用的有效剂量和途径。
用于人受试者的精确的有效量应该取决于疾病状况的严重性、受试者 的一般健康、年龄、体重、和受试者的性别、日常饮食、施用的时间和频 率、药物组合、反应敏感性、和对治疗的耐受/响应。该量可以通过常规实 验确定，并且在临床医师的判断之内。通常，药剂的有效量，即，剂量， 为0.005mg/kg-50mg/kg，优选地为0.125mg/kg-20mg/kg。
本发明的优选药剂的有效治疗方案包括每天施用一次、两次或三次， 和/或每周一次、两次、三次、四次、五次或六次。因此，这些方案特别优 选地用于本发明。
本发明药剂在药物组合物(见上文)中的有效且便利的施用途径和适 当的配制还可以容易地通过常规实验确定。在本领域中许多制剂和药物递 送系统是可用的(参见，例如，[32，33])。
适当的施用途径可以包括，例如，口服、鼻(鼻内)、肺或其他黏膜、 局部、透皮、阴道、直肠、肠、眼、耳、肠胃外施用。
主要的肠胃外施用途径包括静脉内、肌内、和皮下施用。次要施用途 径包括腹膜内、动脉内、关节内、心脏内、池内(intracisteral)、皮内、病 灶内、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内、和心室内施用。待治疗的适应症、 以及药物的物理、化学和生物学特征，指示要用的制剂类型和施用途径， 以及优选局部还是系统递送。
对于有效用于本发明治疗的方法的组合物，治疗有效剂量可以最初使 用本领域公知的各种技术估算。动物研究中所用的初始剂量可以基于在细 胞培养测定中确定的有效浓度。适用于人受试者的剂量范围可以，例如， 使用从动物研究和细胞培养测定获得的数据来确定。
按照本发明，缀合物、或包含所述缀合物的药物或药物组合物的治疗 有效剂量或量，是指所述缀合物、药物或药物组合物在受试者中导致症状 改善或生存延长的量或剂量。所述缀合物、药物或药物组合物的毒性和治 疗功效可以通过标准的药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如， 通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的 剂量)。毒性与治疗效果的剂量比率是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50 比率。优选表现出高的治疗指数的缀合物、药物或药物组合物。
有效量或治疗有效量是所述缀合物、药物或药物组合物引发组织、系 统、动物或人的生物学或医学响应的量，所述生物学或医学响应是研究者、 兽医、医生、或其他临床医师所寻找的，例如，控制肿瘤生长、控制感染、 调节葡萄糖代谢、降低升高的或增加的血液葡萄糖水平、治疗或预防与改 变的葡萄糖代谢相关的病症如糖尿病、等等。
剂量优选地落入循环浓度范围内，其包括具有很少或没有毒性的 ED50。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和/或所用的施用 途径。准确的配制、施用途径、剂量、和给药时间间隔应该按照本领域已 知的方法考虑受试者病症的特殊性而选择。
可以单独调节剂量的量和时间间隔以提供足以有效实现理想的作用 的活性部分血浆水平，即，最小有效浓度(MEC)。MEC将关于每种药剂而 不同，但是可以从，例如，体外数据和动物实验估算。获得MEC所需要 的剂量将取决于个体特征和施用途径。在局部施用或选择性摄取的情形 中，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度不相关。
施用的药剂或组合物的量可以依赖于各种因素，包括被治疗的受试者 的性别、年龄、和体重、痛苦的严重性、施用方式、和开处方医师的判断。
所述组合物，如果需要，可以存在于包装或分配器装置中，其包含含 有活性成分的一个或多个单位剂型。例如，所述包装或装置可以包括金属 或塑料箔，诸如泡眼包装，或玻璃和橡胶塞，如在小瓶中。所述包装或分 配器装置可以附有施用说明书。还可以制备包括配制在相容的药物载体中 的本发明的药剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于适应病症的 治疗。
附图简述
图1显示结构单元试剂326，428，533，535，536，539，622，624，625，630， 631和632，从其起始可以合成本发明的化合物。
图2显示优选的本发明的化合物的实例延伸的白蛋白结合分子 428-ε-Lys-α-NH2(上图)和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2(下图)的结构。
图3显示428-ε-Lys-α-NHAc(A)，428-ε-Lys-α-NH-FITC(B)和428-氨基 庚酸-α-Lys-ε-NHAc(C)的等温滴定热量测定(ITC)测量。
图4显示比较荧光素(A)和428-ε-Lys-α-NH-FITC(B)获得的电迁移位 移，每种单独的(-)或用人血清白蛋白(HSA)和人血清(Serum)预温育。
图5显示428-ε-Lys-α-NH-FITC对比荧光素的药物代谢动力学模式。
图6显示关于与人血清白蛋白结合的微阵列测定的读取。
图7版A，B，C显示428-Lys-FITC，428-Lys-FAM，和428-Lys-β-Ala -DTPA-Gd的结构，其分别为本发明的缀合物的实例。
图8显示白蛋白结合的结构-活性关系研究(ITC)。
图9显示通过ITC对本发明所述的荧光素酰胺缀合物(428-D-Lys-FAM) 的Kd值的测量。
图10显示通过ITC对本发明所述的Gd-DTPA-缀合物 (428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd)的Kd值的测量。
图11显示通过荧光偏振法对Kd值的测量。
图12总结表征428-D-Lys-FAM与HSA的结合的竞争性实验。
图13显示比较荧光素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM和622-D-Lys-FITC 获得的电迁移位移，每种单独的(-)或用人血清白蛋白(HSA)和人血清 (Serum)预温育。
图14显示荧光素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM，和622-D-Lys-FAM在 小鼠中的药物代谢动力学模式。
图15显示DTPA-177Lu和428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu在小鼠中的药物代 谢动力学模式。
图16显示通过定量选择测定法(层析法白蛋白结合测定法)对白蛋白结 合特征的表征。
图17显示本发明所述的化合物(428-D-Lys-FAM)在血管造影分析中的提 高的成像性能。
图18显示本发明所述的化合物(428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu)在MRI分 析中的提高的成像性能。
实施例
实施例1制备本发明的化合物(“428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “428-ε-Lys-α-NH2”)
图1显示可能的结构单元试剂，从其起始可以合成本发明的化合物。 在加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺之前，将化合物428的羧酸(可从西 格玛(SIGMA)获得，目录号I5634)用在DMSO中的1当量的EDC和1.2 当量的NHS在30℃活化4小时。反应在30℃搅拌过夜，以生成428-氨 基庚酸。产物通过HPLC(参见实施例21，常规方法)纯化并且通过质谱法 分析。
通常，在下述实施例中合成的所有分子通过质谱法表征。
在一次制备中，428-氨基庚酸：将10μmol的428与在50μl的DMSO 中的8μmol N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和10μmol N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)在30℃搅拌3小时，然后加入在100μl 1M NaHCO3，pH 9中的20μmol 7-氨基庚酸(Bachem)。允许反应在30℃搅拌 过夜。在用过量的Trizma碱猝灭残余的试剂后，反应通过HPLC纯化， 并且通过质谱法表征。
按照本发明，为了获得“化学处理”用于与多种药剂的缀合反应同时 保留对白蛋白结合所需要的羧酸官能性的存在，通过将Fmoc-D-Lys-OH 经ε-氨基基团与428的羧酸官能团缀合，或通过将D-Lys(Fmoc)-OH经α- 氨基基团与428-氨基庚酸的游离羧基官能团缀合而引入伯氨基基团(见图 2)。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前加入大量过量的三乙胺进行 的缀合4小时后的去保护步骤。
实施例2制备本发明的化合物(“533-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “533-ε-Lys-α-NH2”)
将化合物533(可从SALOR获得，目录号S532649)的羧酸用在 DMSO中的1当量的EDC和1.2当量的NHS在30℃活化4小时，之后 加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺。反应在30℃搅拌过夜，以生成533- 氨基庚酸。产物通过HPLC纯化并且通过质谱法分析。
通过将Fmoc-D-Lys-OH经ε-氨基基团与533的羧酸官能团缀合，或通 过将D-Lys(Fmoc)-OH经α-氨基基团与533-氨基庚酸的游离羧基官能团缀 合而引入伯氨基基团。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前通过加入 大量过量的三乙胺缀合4小时后的去保护步骤。
实施例3制备本发明的化合物(“539-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2”和 “539-ε-Lys-α-NH2”)
将化合物539(可从SALOR获得，目录号R244996)的羧酸用在 DMSO中的1当量的EDC和1.2当量的NHS在30℃活化4小时，之后 加入10当量的7-氨基庚酸和三乙胺。反应在30℃搅拌过夜，以生成539- 氨基庚酸。产物通过HPLC纯化并且通过质谱法分析。
通过将Fmoc-D-Lys-OH经ε-氨基基团与539的羧酸官能团缀合，或通 过将D-Lys(Fmoc)-OH经α-氨基基团与539-氨基庚酸的游离羧基官能团缀 合而引入伯氨基基团。合成和纯化按上述进行，包括在纯化之前通过加入 大量过量的三乙胺缀合4小时后的去保护步骤。
实施例4制备化合物X-D-Lys(X＝326，428，533，535，536，539，622和 624)
在一组实验中，还按下述合成关于各种化合物“X”(X＝326，428，533， 535，536，539，622和624)的通式为X-D-Lys的分子：按在上述实施例中上 文所述进行部分X的羧酸活化。加入在100μl DMSO中的20μmol Fmoc-D-Lys(Bachem)和43μmol三乙胺(TEA)之后，反应在30℃搅拌过夜。 通过加入10μl 5M KOH并在30℃搅拌2小时而去除在α-氨基位置处的 Fmoc-保护基团。在通过在0.1％三氟乙酸梯度上的HPLC纯化后，将含有 X-D-Lys的干燥的级分重悬在DMSO中。加入5M HCl直到溶液变澄清。
实施例5对本发明的化合物的“化学处理”修饰
乙酸或丁酸分别与428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2的 氨基基团的缀合通过下列步骤实现：用等摩尔的EDC/NHS在30℃活化羧 酸3小时，并且随后向428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2中 分别加入100x摩尔过量的活化的酸，并且在30℃搅拌12小时。备选地， 分别向428-ε-Lys-α-NH2和428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NH2中加入100x摩尔过 量的乙酸酐，并且在30℃搅拌12小时。
在一组制备中，由X-D-Lys(按实施例4所述制备，并且重悬在DMSO 中)合成通式为X-D-Lys-Ac(X＝326，428，533，535，536，539，和624)的分 子。在这些情形中，在通过HPLC/UV确定浓度后，使X-D-Lys与10x摩 尔过量的Ac2O在30℃反应4小时。产物通过HPLC纯化。
实施例6制备本发明的缀合物：与荧光团(FITC/硫脲衍生物)偶联
428-ε-Lys-α-NH2的α-氨基基团与荧光素-异硫氰酸酯(FITC)缀合，作 为荧光团、诊断剂、以及一般的药物样分子的实例。偶联通过将2.5μmol 428-ε-Lys-α-NH2和10μmol FITC在650mM NaH2PO4，30％DMSO，pH 7.2 中在30℃搅拌12小时而实现。产物(428-D-Lys-FITC)通过HPLC纯化并 且通过质谱法表征。
实施例7制备本发明的缀合物：与荧光团(FAM/酰胺衍生物)偶联
按下述制备428-D-Lys，622-D-Lys，以及用于比较的苯乙胺与荧光素 的酰胺缀合物(428-D-Lys-FAM，622-D-Lys-FAM和苯乙胺-FAM)：将19 μmol苯乙胺，按照上述制备的428-D-Lys，或622-D-Lys和14μmol 5-羧基 荧光素NHS酯溶解在120μl DMSO中。加入72μmol TEA。反应在避光 条件下在30℃搅拌24小时。反应通过利用醋酸三乙铵(TEAA)梯度的 HPLC进行纯化。
实施例8制备本发明的缀合物：与诊断造影剂(DTPA)偶联
在增加血液半衰期和更短的弛豫时间方面，造影剂在MRI成像方法 中的性能受益于与血清白蛋白的非共价结合。造影剂DTPA通过下述方法 与本发明的化合物缀合，以生成本发明的缀合物。
通过用在THF中的等摩尔量的偶氮二羧酸二乙酯，PPh3和二苯基磷 酰氮化物搅拌12小时首先将羟基-基团转化成叠氮化物，然后通过用在甲 醇中的Pd/C/H2搅拌12小时而将所述氨基基团还原，从而将2-(R)-羟甲基 -DTPA-五-叔-丁酯转化为2-(R)-氨基甲基-DTPA-五-叔-丁酯。为了与2-(R)- 氨基甲基-DTPA-五-叔-丁基缀合，将428-ε-Lys-α-NH2的伯氨基基团通过 与由EDC/NHS活化的二硫代乙醇酸反应并且随后用TCEP还原而转化为 硫羟基团。将2-(R)-氨基甲基-DTPA-五-叔-丁基，N-(c-马来酰亚胺基丁酰氧 基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)和428-ε-Lys-α-NH2的硫羟衍生物(比例为1∶2∶10) 在30℃搅拌12小时。用TFA去除羧酸的叔-丁基保护基团。随后，可以 将得到的428-ε-Lys-α-GMBS-DTPA缀合物用Gd负载，并且用于MRI研 究。
在一个实例中，将428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd按下述合成：按上述， 用EDC/NHS使Fmoc-β-Ala与428-D-Lys缀合，并且用5M KOH去保护。 将19μmol 428-D-Lys-β-Ala和14μmol p-SCN-Bn-DTPA(Macrocyclics)溶 解在120μl DMSO中。加入72μmol TEA。反应在30℃搅拌24小时。 反应通过利用100mM TEAA梯度的HPLC纯化。通过向1μmol 428-D-Lys-β-Ala-DTPA中加入10μmol GdCl3并且用NaOH调节为pH 10， 然而在25℃温育过夜，而进行428-D-Lys-β-Ala-DTPA和Gd3+之间的复 合物形成。通过在TEAA梯度上的HPLC进行过量Gd3+的去除。通常， 终产物通过质谱法表征。
实施例9制备本发明的缀合物：与抗癌药物(多柔比星)偶联
利用琥珀酸作为双官能接头将多柔比星通过伯氨基基团与 428-ε-Lys-α-NH2缀合。首先，多柔比星与100x摩尔过量的琥珀酸酐在30 ℃搅拌12小时，并且随后通过HPLC纯化。由此氨基基团与琥珀酸酐反 应，形成酰胺键并且释放羧酸。在加入10x过量的428-ε-Lys-α-NH2之前， 用等摩尔量的EDC/NHS在30℃活化该羧酸4小时。纯化通过HPLC进 行并且通过质谱法表征。
对于通过羰基基团缀合，将多柔比星与摩尔过量的(6-马来酰亚胺基己 酰基)酰肼在30℃搅拌12小时。通过与EDC/NHS活化的二硫代乙醇酸 反应并且随后用TCEP还原，将428-ε-Lys-α-NH2的伯氨基基团转化为硫 醇。通过与10倍过量的硫醇衍生物在30℃搅拌12小时，将多柔比星-腙 -己酰基-马来酰亚胺与428-ε-Lys-α-NH2的硫醇衍生物偶联。
实施例10制备本发明的缀合物：与癌症药物(epithilone)偶联
Epothilones是癌症治疗领域的有效药物。然而，施用epothilones的主 要限制在于它们的神经毒性。由于与血清白蛋白的结合显著减少药物渗透 血脑屏障的能力，epothilones与白蛋白-结合分子的缀合是减少副作用、允 许更高的剂量并且因此增加它们的治疗功效的有效方法。
428-ε-Lys-α-NH2与epothilones的缀合按照与实施例9中关于多柔比 星的记述相同的流程进行。首先，如实施例9中关于多柔比星所述，将 428-ε-Lys-α-NH2转化为硫醇衍生物。将epothilone，(6-马来酰亚胺基己酰 基)酰肼和428-ε-Lys-α-NH2的硫醇衍生物按1∶2∶10的摩尔比例搅拌12小 时。为了防止与epothilone的环氧化物基团的副反应，可以采用保护策略。
实施例11通过等温滴定热量测定(ITC)表征本发明的化合物和缀合物
通过等温滴定热量测定(ITC)进行结合亲和力的溶液中测量(in solution measurement)。
按照参考文献34的方法进行通过ITC的结合实验。将1×2μl，然后 是29×20μl的428-衍生物注射到1.8ml的人血清白蛋白中。所有ITC测 量均在50-100μM蛋白和0.5-1mM缀合物的浓度下在PBS，2％DMSO 中在37℃进行。实施例1的428-氨基庚酸的ITC测量揭示针对亲和性相 当的两个结合位点的解离常数Kd＝3μM。用乙酸和丁酸修饰428-氨基庚 酸-α-Lys-ε-NH2和428-ε-Lys-α-NH2中的伯氨基基团没有显著改变针对 HSA的结合亲和性(对于428-ε-Lys-α-NHAc，Kd＝3.2μM，对于 428-ε-Lys-α-NHBu，Kd＝5.5μM，对于428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NHAc，Kd＝8 μM，对于428-氨基庚酸-α-Lys-ε-NHBu针对人血清白蛋白上的单一结合位 点，Kd＝8μM)(见图3)。这证实通用“化学处理”的理想特征，其可以用 于将宽范围的药剂缀合到本发明的化合物上。428-ε-Lys-α-NHAc还结合其 他物种的血清白蛋白。以相似的亲和性识别鼠血清白蛋白(在两次独立的测 量中，Kd＝3.7μM和3.6μM)，而针对大鼠血清白蛋白的亲和性低6x(Kd＝ 28μM)。
在图8所示的一系列测量中通过ITC进一步表征白蛋白结合的结构- 活性-关系。该附图显示通过ITC测量的分子X-D-Lys-Ac(X＝533，535，536， 539和624)的一般结构。表征了428-D-Lys-Ac(1)以及其他鉴定的结合分子 (其中2，3，4，5和6分别对应于结构533，535，536，539和624)与HSA的 结合。
另外，图8显示428-D-Lys针对MSA(7)的亲和性测量，其与使用HAS (1)的相应测量相当。
其他测试的与乙酰化的D-赖氨酸缀合的结合剂(X＝533，535，536，539 和624)具有微摩尔范围内的亲和性。对它们的解离常数排序发现与层析法 白蛋白结合测定中的相对保留相对应(见下文，实施例17)。
428-ε-Lys-α-NH2的α-氨基基团与FITC的缀合没有导致白蛋白-结合 亲和性的任何显著损失。在与FITC缀合后，当通过ITC确定时，针对人 血清白蛋白的结合亲和性保持相似(Kd＝6.5μM，见图3)。
此外，表征了荧光素和一些荧光素衍生物(428-D-Lys-FAM， 622-D-Lys-FAM，和苯乙胺-FAM)。通过ITC在37℃测量的 428-D-Lys-FAM针对HSA的解离常数为330nM(图9)。
此外，通过ITC确定428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd针对HSA的亲和性(Kd ＝3.3μM，图10)。如上文所解释的，DTPA(二乙烯三胺-五乙酸)是核医学 方法中常用的螯合剂，并且Gd-DTPA是MRI中最广泛使用的造影剂。
一般地，使用VP-ITC仪器(Microcal)进行等温滴定热量测定测量。将 不含脂肪酸的HSA(西格玛，A1887)或不含脂肪酸的MSA(A1056)溶解在 PBS，2％DMSO中，并且针对同样的缓冲液透析。用于实验的蛋白浓度在 30μM-1mM之间变化。实验通常通过用结合分子滴定血清白蛋白进行。 在37℃，HSA或MSA用比蛋白溶液约10倍更高的浓度的在PBS，2％ DMSO中的结合分子溶液进行滴定。典型地，滴定进行到直到达到配体与 蛋白上的结合位点为2∶1的比率。将配体溶解在透析缓冲液中。结合分子 的精确的浓度通过HPLC/UV确定。处理得到的滴定曲线，并且用Origin 7软件(Microcal)拟合，以获得Kd和ΔH值。
实施例12通过荧光偏振法表征本发明的化合物和缀合物
将100nM 428-D-Lys-FAM，622-D-Lys-FAM和，用于比较的荧光素和 苯乙胺-FAM与增加量的HSA在PBS中在25℃温育1小时。通过在485 nm激发和在535nm测量而确定荧光偏振。
这样测量的解离常数对于荧光素为76μM，对于428-D-Lys-FAM为 108nM，对于622-D-Lys-FAM为6.6μM和对于苯乙胺-FAM为17μM(见 图11)。
实施例13在竞争性实验中通过荧光偏振法表征本发明的化合物和缀合物
将500nM 428-D-Lys-FAM和HSA与在PBS中的1μM，10μM和100 μM的各种HSA-结合竞争剂在25℃温育1小时。通过在485nm激发和 在535nm测量而确定荧光偏振。
这些竞争实验表明428-D-Lys-FAM在位点II结合HSA。图12总结通 过关于428-D-Lys-FAM结合竞争的荧光偏振获得的结果。将500nM 428-D-Lys-FAM和HSA用增加量的竞争剂(左版)温育。提供关于未结 合的(无HSA)和结合的(无抑制剂)428-D-Lys-FAM的对照值(右版)。
实施例14通过电迁移位移测定法表征本发明的化合物和缀合物
按照参考文献35的一般方法进行电迁移位移测定。将在PBS缓冲液 中的10ul 10μM荧光素或10μM 428-ε-Lys-α-NH-FITC[36]分别与100μM 人血清白蛋白或人血清(1/5稀释)预先温育。测定的温育时间为30分钟。 使用20％-丙烯酰胺凝胶制备液，TBE(Tris/硼酸/EDTA)缓冲液[36]，和在 5％蔗糖中的10ul样品上样体积，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳[35，36]。运 行条件为180V/40分钟。电迁移位移测定表明428-ε-Lys-α-NH-FITC的 结合及其对HSA的特异性(图4)。
在其他系列的电迁移位移实验中(见图13)，将浓度为5μM的荧光 素、苯乙胺-FAM、428-D-Lys-FAM，和622-D-Lys-FAM与PBS、在PBS 中的HSA(50μM)和人血清(10x在PBS中稀释)温育。1小时后，将样品 上样到20％聚丙烯酰胺凝胶上，并且在Tris/硼酸/EDTA pH 8.2中在180V 运行40分钟。
实施例15评价本发明的缀合物的药物代谢动力学特性
本发明的缀合物的药物代谢动力学特征通过将所述缀合物和相对应 的未缀合的药剂(即，未通过本发明的化合物修饰的药剂)注射到小鼠中 并且随后取样所述缀合物和药剂的浓度而进行评估。缀合物和药剂浓度通 过液相色谱/质谱/质谱(LC-MS/MS)按照本领域已知的技术[37]确定。
将100μl 170μM的荧光素和428-ε-Lys-α-NH-FITC溶液注射到2对 免疫活性129SV小鼠中。单独的化合物在24小时期间的时间点取样的小 鼠血清中的浓度通过LC/MS/MS确定，这表明两种化合物显著不同的药物 代谢动力学模式。尽管荧光素很快从血清中清除(t1/2＝12.5分钟)，而 428-ε-Lys-α-NH-FITC保留在血清中显著更长的时间期间，显示出两阶段 性清除，t1/2，α＝22.5分钟和t1/2，β＝340分钟(图5)。
在进一步的体内实验中，测量并比较荧光素、苯乙胺-FAM、 428-D-Lys-FAM、和622-D-Lys-FAM的药物代谢动力学性质。关于所述4 种化合物的清除模式显然不同(图14)。尽管荧光素以单阶段模式快速清 除，并且在注射后30分钟就不再检测到，而所述衍生物表现出与它们针 对HSA的亲和性相关的两阶段清除模式(荧光素：t1/2＝4.6分钟； 428-D-Lys-FAM：t1/2，α＝27分钟，α-阶段＝90％，t1/2，β＝495分钟； 622-D-Lys-FAM：t1/2，α＝5.3分钟，α-阶段＝98％，t1/2，β＝100分钟；苯乙 胺-FAM：t1/2，α＝5分钟，α-阶段＝99.5％，t1/2，β＝53分钟)。
在des Kantons Zürich(授予Dario Neri)的方案许可 198/2005下进行药物代谢动力学分析。向129SvPas小鼠尾静脉注射溶解 在100μl的100mM Tris/HCl，105mM NaCl，pH 8.2中的20nmol的荧光 素、苯乙胺-FAM，428-D-Lys-FAM，或622-D-Lys-FAM(每种2只小鼠)。 在注射后1，5，15，30，60，120，240，360，480和1440分钟，用EDTA包被的 毛细管(Sarstedt)从隐静脉采集20-30μl血液样品，并且离心。将5-10μl血 浆与40μl 0.1％三氟乙酸和200μl乙醇混合，并且在冰上温育1小时。1 小时后，离心样品以去除沉淀的蛋白质。上清在真空下干燥，并且随后重 新溶解在50μl DMSO/H2O中。将40μl注射到LC/MS/MS系统(Micromass Quattro micro API)并且在Waters XTerra MS C18柱(3.5μM，1×50mm)上 运行在0.1％HCOOH中从5％到95％的乙腈的线性梯度10分钟，同时观 察到对于荧光素，子离子m/z 287.1和202.1，母体离子333.1，对于苯乙 胺-FAM，子离子m/z 287.3和332.3，亲代离子480.2，对于 428-D-Lys-FAM，子离子m/z 287.3，377.2和505.2，母体离子777.1，对于 622-D-Lys-FAM，子离子m/z 287.3和505.4，母体离子651.3。比较用先前 利用相同的样品制备获得的荧光素和428-D-Lys-FAM在血浆中的稀释系 列的曲线下面积允许分子定量。
还利用静脉内注射到小鼠中的DTPA和428-D-Lys-βAla-DTPA的177Lu 复合物研究药物代谢动力学模式。与使用荧光素衍生物遇到的情形相似， DTPA-177Lu以单阶段模式快速清除，并且在注射后60分钟不再检测到， 而428-D-Lys-βAla-DTPA-177Lu表现出显著更缓慢的两阶段清除模式(图 15；428-DLys-βAla-DTPA-177Lu：t1/2，α＝22分钟，α-阶段＝90％，t1/2，β＝ 408分钟)。
DTPA复合物的形成通过将2.25nmol DTPA或428-DLys-DTPA与70 μCi的177Lu(Perkin Elmer)在25℃在250μl PBS中温育过夜而进行。完全 的复合物形成通过HPLC使用放射活性检测器(GABI Star，Raytest)利用 TEAA缓冲液验证。对129SvPas小鼠(每种2只小鼠)尾静脉注射在100μl PBS中的30μCi DTPA-177Lu，或428-D-Lys-β-Ala-DTPA-177Lu。在注射后 1，5，15，30，60，120，240，480，1440分钟按上述进行血液取样和177Lu定量。
为了测量MSA的药物代谢动力学，将75nmol MSA用DTPA标记， 标记通过与2.1μmol在PBS中的p-SCN-Bn-DTPA在4℃反应4小时然后 在PD-10柱(GE卫生保健(GE Healthcare))上纯化而进行。将50nmol MSA-DTPA用50μCi 177Lu(Perkin Elmer)标记并且在PBS平衡的PD-10柱 上纯化。将3μCi MSA-DTPA-177Lu注射到129SvPas小鼠的尾静脉(2只 小鼠)中。在注射后1，15，30，60，120，240，480，1440分钟按上述进行血液 取样。通过在Packard Cobraγ-计数仪上计数而定量在注射液和血浆中的 177Lu的量。
实施例16基于微阵列检测白蛋白-结合
下述实施例提供基于微阵列的测定法，以用于检测化合物(例如，治 疗剂或诊断剂与白蛋白-结合结构域、或任何其他分子的缀合物)是否结合 白蛋白。在该测定中，其可以便利地平行应用于大量的化合物，所述化合 物是单独且共价偶联到相似而不同的寡核苷酸上，所述寡核苷酸在5’末 端携带氨基己基部分[如在38中所述]。所有这些寡核苷酸在5’端具有相 同的序列，这允许它们与互补寡核苷酸退火，但是在6个碱基的部分中不 同。该独特的、不同的部分作用为与不同寡核苷酸偶联的每种有机化合物 的独特的“鉴定密码”。
要针对白蛋白结合进行检测的寡核苷酸-化合物缀合物的混合物(以下 为“文库”)与未修饰的24mer寡核苷酸杂交，所述未修饰的寡核苷酸与 所述寡核苷酸5’末端的恒定区互补。通过将所述寡核苷酸在94℃变性3 分钟，然后在10mM Tris/Cl，1mM MgCl2，pH 8中以终浓度为87nM的 文库和120nM的未修饰的配对寡核苷酸在50℃10分钟形成异源双链体， 实现寡核苷酸的二聚体化。在100μl的总体积中，将10μl的该装配的文 库与50μl用人血清白蛋白或作为阴性对照的Tris修饰的CNBr-琼脂糖温 育，其预先用100μg/ml hering精子DNA预温育。在用400ml 100mM NaH2PO4，1mM MgCl2，0.1％吐温20，pH 8.5在SpinX柱中的三次洗涤步 骤之后，将树脂重悬在100μl H2O中。通过使用5μl重悬的树脂进行25 个循环的指数PCR而扩增保留的寡核苷酸-化合物缀合物的密码(code)。在 用PCR纯化试剂盒(Qiagen)去除未标记的引物之后，使用Cy3-标记的引物 将所述密码线性扩增25x。将产物沉淀在乙醇中，并且重新溶解在120μL 杂交缓冲液(4x SSC，50mM HEPES，0.2％SDS，pH 7)中，并且在Tecan HS 400杂交仪中用微阵列载玻片(以五个一组展示具有与单个文库寡核苷酸 的6碱基密码特异性互补序列的19mers)在44℃温育4小时，然后使用 2x SSC/0.2％(w/v)SDS，0.2x SSC/0.2％(w/v)SDS，和0.2x SSC进行连续 的洗涤步骤。在杂交后，使用Genepix专业4200A扫描仪(λex 532nm， 100％激光功率，光电倍增管300)分析微阵列。使用Genespotter(v2.4.3)定 量并评估点强度。在减去背景后，平均值用作点信号强度(5个点的平均 值)。比较用人血清白蛋白温育后的信号强度与用Tris猝灭的树脂温育后 的信号强度，以及在温育之前的文库的信号强度，揭示要被检测的化合物 的白蛋白-结合性质(图6)。
实施例17通过定量选择测定表征白蛋白结合特性(色谱法白蛋白结合测 定)
本发明化合物和缀合物的结合特性，特别是白蛋白-结合选择性，还可 以通过下述定量选择测定法进行分析。使用γ33P-ATP和T4多核苷酸激酶， 将与寡核苷酸如实施例16的文库中的那些的恒定(“相同”)序列互补的 24mer寡核苷酸在5’端进行放射性标记。在单独的管中，所述放射标记的 寡核苷酸与所述寡核苷酸-化合物缀合物或作为阴性对照的未缀合的寡核 苷酸之一杂交。实验以100nM的双链体浓度进行。将这些寡核苷酸双链体 对的等分试样与缀合到CNBr-琼脂糖浆上的人血清白蛋白温育1小时，并且 按上述在选择步骤中洗涤。使用Beckman LS 6500闪烁计数仪，对温育和 洗涤步骤的流过液以及树脂进行33P放射性计数。放射性的计数表明所述寡 核苷酸-化合物缀合物在树脂上的保持(即，结合)的相对程度，如果存在 的话。
在一系列实验中，使用γ33P-ATP(GE卫生保健(GE Healthcare))和T4 多核苷酸激酶(USB)，按上述标记24mer寡核苷酸。在单独的管中，将所 述放射标记的寡核苷酸与所选择的寡核苷酸-化合物缀合物或作为阴性对 照的未缀合的寡核苷酸之一杂交，每种寡核苷酸浓度为100nM。将这些寡 核苷酸双链体对的等分试样与在100μl PBS中的HSA树脂温育。在温育1小 时后，使用400μl PBS进行3轮洗涤，并且使用Beckman LS 6500闪烁计数 仪，对剩余的珠以及输入物、流出液、和所有洗涤级分的等分试样进行33P 放射性计数。
图16显示在整个数次洗涤步骤中对白蛋白-结合部分选择定量的放射 性的量。
该方法有效用于结合剂的初始分类。在图16中检测的结合剂中，发现 最强的结合剂，以及它们的相对结合强度(排序)可以描述为 428＞539＞624＞535＞533＞536＞326＞其它结合分子。
实施例18从血清去除白蛋白的测定
目的化合物对白蛋白的结合以及所述针对白蛋白与血清中的其它蛋 白的结合特异性可以通过将目的化合物以及胆红素(具有纳摩尔亲和性的 天然HSA配体)偶联到氨基-标记的琼脂糖上而进行测定。
人血清白蛋白和人血清样品(或相对应的动物白蛋白和血清样品，例 如，小鼠、大鼠等等)与化合物-树脂缀合物温育，或流过用所述树脂填充 的层析柱。将1ml树脂(用比树脂上的NH2-基团100-100x倍摩尔过量的 结合分子修饰)与1ml HSA(2mg/ml)在PBS中温育30分钟。将所述树脂 负载到柱上，并且用3ml PBS洗涤。洗脱使用1ml 8M尿素或100mM三 乙胺进行。
结果在蛋白质凝胶上显现，即，血清输入物、来自树脂的流出液或洗 液以及来自树脂的洗脱液施加到聚丙烯酰胺凝胶的泳道中，所述凝胶使用 本领域已知的方法[36]进行电泳。对在凝胶上显现蛋白质条带(例如，染 色和显影)后得到的所述泳道的评价和比较[36]揭示与胆红素阳性对照相 比，各种化合物-树脂缀合物从血清样品中去除血清白蛋白的程度。特别地， 揭示所述化合物-树脂缀合物相对血清内包含的其它蛋白选择性去除(并且 因此结合)白蛋白的程度。
实施例19本发明所述的化合物的提高的成像性能(血管造影分析)
为了获得关于428-D-Lys-FAM的成像性质的功能性信息，进行视网膜 的荧光素血管造影分析。将荧光素和428-D-Lys-FAM静脉内注射到小鼠 中，并且在不同时间点拍摄眼底照片。荧光素血管造影照片证实药物代谢 动力学研究的结果。对于荧光素，即使在较早的时间点，血管染色也是弱 的，并且在20分钟后就检测不到。相反，428-D-Lys-FAM对血管的染色 持续更久并且允许显现更小的血管(0)。
使用Heidelberg视网膜血管造影(HRA I，Heidelberg Engineering，德 国)，一种共聚焦扫描-激光检眼镜，按照先前所述的步骤[参见参考文献0]， 进行扫描-激光检眼镜检查成像。简言之，将野生型C57BL/6小鼠用氯胺 酮(66.7mg/kg)和赛拉嗪(11.7mg./kg)麻醉，并且用托吡卡胺滴眼剂 (Mydriaticum Stulln，Pharma Stulln，德国)对它们的瞳孔进行散瞳。HRA特 有在短波长范围内的两种氩波长(488nm和514nm)和在长波长范围内的 两种红外二极管激光器(795nm和830nm)。488nm的激光波长用于荧光 素血管造影，屏障滤器为500nm。4只小鼠每只静脉内注射到尾部而接受 50nmol溶解在100μl的100mM Tris/HCl，105mM NaCl，pH 8.2中的荧光 素或428-DLys-FAM。使用相同的装置设置，在注射后时间点1，5，20和 60分钟，获得图像。特别地，在本研究中的亮度值固定不变，以便可以在 没有感光过度的条件下记录最亮的图像(428-D-Lys-FAM，在注射后1分 钟)。所有的检查均得到当地权威机构的核准(Anzeige v.2006年12月13 日，RP Tuebingen)并且按照动物在眼科和视觉研究中的应用的ARVO声明 进行。
实施例20本发明所述的化合物的提高的成像性能(MRI分析)
为了验证428-D-Lys作为白蛋白结合部分的方便性(portability)，将第 二造影剂，二乙烯三胺-五乙酸(DTPA)缀合到428-D-Lys上 (428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd)，并且进行评估。DTPA是核医学方法中的常 用螯合剂，并且Gd-DTPA是MRI中最广泛使用的造影剂。
在静脉内注射所述造影剂后，通过MRI成像方法，与 428-D-Lys-βAla-DTPA-Gd的较慢外渗相比，DTPA-Gd快速外渗。脑部主 要血管的MRI分析(图18)揭示在注射了428-D-Lys-βAla-DTPAGd的小 鼠中信号轻度的更缓慢的减少，这与其更缓慢的清除模式(参考图15)相 一致。
所有的动物实验均严格遵守瑞士动物保护法进行。使用用于信号传送 和接收的环形低温表面线圈，在200MHz操纵的Bruker PharmaScan 47/16 MR系统(Bruker BioSpin GmbH)上进行MR测量。将小鼠使用在空气： O2(4∶1)中的1.4-1.5％异氟烷麻醉。进行检测扫描，以评估动物的解剖。 在两只C57/B16小鼠中研究两种造影剂DTPA-Gd和 428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd对纵向血液驰豫时间(T1)的缩短作用。为了这 一目的，使用下述顺序参数获得横向活动(cine)2D图像：视野(FOV)： 19×19×0.5mm3，矩阵尺寸：128×128，倾倒角：15°，TE/TR：3.0/14ms，平均 值：6，重复：50，时间分辨率(temporal resolution)：10.75s，总扫描时间：8分 57秒。通过刺激在图像平面上方(cranial to)的4mm厚的薄片(倾倒角：15°) 充满流入的血液。在20次重复的基线之后向尾静脉中注射造影剂。首先， 施用剂量1.2μmol DTPA-Gd，并且其次，在等待30分钟之后，施用剂量 1.2μmol 428-D-Lys-β-Ala-DTPA-Gd。在大容器中分析MR信号的时程并且 与基线值标准化以用于比较。
实施例21HPLC纯化方法
HPLC纯化
所有的反应产物通过HPLC在Waters XTerra Prep RP18柱(5μM，10× 150mm)上利用从0.1％三氟乙酸到乙腈或从100mM TEAA pH 7到在80％ 乙腈中的100mM TEAA，pH 7的15分钟线性梯度进行纯化。除非特别指 明一种梯度，否则二者均可以用于纯化。在收集需要的级分之后，在真空 下去除溶剂和缓冲液。
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